JPH10100A

JPH10100A - 神経学的機能に関連した遺伝子のスプライシング変種についての新規診断マーカー

Info

Publication number: JPH10100A
Application number: JP9037546A
Authority: JP
Inventors: Amanda Barton; アマンダ・バートン; Alison M Goate; アリソン・エム・ゴート; John Hardy; ジョン・ハーディ
Original assignee: University of Washington; University of South Florida; Washington University in St Louis WUSTL; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: University of Washington; University of South Florida; Washington University in St Louis WUSTL; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-21
Publication date: 1998-01-06
Also published as: EP0791660A1

Abstract

(57)【要約】【課題】神経学的疾病に関連した遺伝子のスプライシ
ング変種についての診断マーカーおよび診断方法を提供
する。【解決手段】神経学的疾病にかかりやすい個体から遺
伝学的試料を用意し、次いで、遺伝学的材料の試料中の
ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡ転写物またはそれ
によりコードされる蛋白における配列ＶＲＸＱを含む別
のスプライス部位の存在を検出することを含む神経学的
疾病にかかりやすい個体の同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、疾病の診断、詳細
には、神経学的疾病に関連した遺伝子のスプライシング
変種についての診断マーカーおよび診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】真核生物において、ゲノムＤＮＡのＲＮ
Ａへの最初の転写は核において進行し、連続した全長の
相補的ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）である１次転写物
を生じる。ｈｎＲＮＡは、最終ｍＲＮＡにはならない
「介在」ヌクレオチド配列（イントロン）により分断さ
れた最終ｍＲＮＡになるヌクレオチド配列の領域または
一連のブロック（エキソン）を含む。アデニリルメチル
化およびポリアデニル化のほかに、ＲＮＡの「スプライ
シング」に関する過程においてこれらのｈｎＲＮＡは種
々の修飾を受ける。その際、つながっていないエキソン
がつなぎ合わされ、介在イントロンは、最終成熟ｍＲＮ
ＡからＲＮＡ「輪なわ（lariat）」として正確に欠失さ
れる（B.Rushkin et al.Cell 1984,38:317；R.A.Padget
t et al.Science 1984,225:898）。ＲＮＡスプライシン
グは複雑な工程であり、スプライソソーム（spliceosom
es）と呼ばれる大型の蛋白−ＲＮＡ集合体が関与してお
り、スプライソソームは協奏的な切断および連結を調節
してイントロン不含ｍＲＮＡを生成する（M.M.Konarska
and P.A.Sharp Cell 1987,49:763；R.Reid et al.Cell
1988,53:949；T.A.Steitz Sci.Am.1988,258:56）。

【０００３】正常なＲＮＡプロセッシングにおいて、得
られるｍＲＮＡはｈｎＲＮＡにおけるエキソンの方向を
反映している。しかしながら、すべてのエキソンが最終
転写物となるとは限らない。それよりもむしろ、生じた
ｍＲＮＡのいくつかは、「別途スプライシングされた」
ｈｎＲＮＡから生じた特定のエキソンのみを有する。そ
の場合、不連続なエキソン−イントロン接合部がスプラ
イシングされて、例えば、エキソン１およびエキソン２
が並置されるのでなくエキソン１およびエキソン４が並
置されることとなる。それゆえ、いくつかのｍＲＮＡ配
列が１つの遺伝子またはｈｎＲＮＡから生じることとな
る。通常には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび蛋白の分析に
よると、エキソンの可能な組み合わせのすべてが１つの
ｈｎＲＮＡから生じる実際のｍＲＮＡプールに現れると
は限らない。３個のエキソンに関する例として（図
１）、７つの組み合わせ（エキソン１−エキソン２−エ
キソン３、エキソン１−エキソン２、エキソン１−エキ
ソン３、エキソン２−エキソン３、エキソン１、エキソ
ン２またはエキソン３）が可能であるが、おそらく、実
際には２種のみ（エキソン１−エキソン２−エキソン３
およびエキソン１−エキソン３）が生じ、認識可能なレ
ベルで発現されるであろう。あるいは、これらのスプラ
イシングされた転写物は、時々、「変種」とも呼ばれ
る。しかしながら、本発明の目的からすると、スプライ
ス「変種」を、その時までは未出現または未発現である
ｍＲＮＡといい、それらは別途スプライシングされる可
能性のあるスプライス部位から生じる。かかる別のスプ
ライス部位は、このようなスプライシングが起こるよう
にｈｎＲＮＡ構造を変化させるゲノム変異により生じ
る。

【０００４】対応ゲノムＤＮＡ配列を、対応成熟ｍＲＮ
Ａをコピーすることにより調製されたｃＤＮＡ配列と比
較することにより、ｈｎＲＮＡ初期転写物中のスプライ
シング部位の位置を決定することができる。ゲノムＤＮ
ＡとｃＤＮＡとの不連続性はエキソン−イントロン境界
をマークするものである。多くの異なったＲＮＡに関す
るかかる分析により、プレ−ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮ
Ａ）におけるイントロン−エキソン境界における中程度
−短い「コンセンサス」配列および３'スプライス接合
部のすぐ上流のピリミジン豊富領域の存在傾向が決定さ
れる（図２）。ＡＧが５'エキソン末端に、最初のＧが
３'エキソンに存在する傾向があるが、イントロンにお
いては普遍的に保存されたヌクレオチドは最初の２つ
（ＧＵ）および最後の２つ（ＡＧ）のみである（図
２）。イントロンの中央部分の３０〜４０個のヌクレオ
チドのみが効果的なスプライシングに必要である。ま
た、イントロンのピリミジン豊富領域（図２）中に保存
されたＡが存在し（..PyrPyrPurAPyrnAG、式中Pyrはピ
リミジンヌクレオチド、Purはプリンヌクレオチド）、
それは開裂された５'エキソン−イントロンランクショ
ンループが元に戻って「輪なわ」中間体を形成する分岐
点である（Padgett et al.Science 1984,225:898）。こ
れらのイントロンヌクレオチド（５'ＧＵ、３'ＡＧまた
は分岐点のＡ）を欠失または変化させる遺伝学的点突然
変異はこれらのスプライシ接合部を除去し、正常なスプ
ライシングを妨げ、異常に切断された転写物またはこの
エキソンが欠失され通常には組み入れられない別の下流
エキソンがスプライシングにより組み入れられた転写物
を生じる。

【０００５】ＧＵまたはＡＧジヌクレオチドモチーフが
それぞれ５'エキソン−イントロンまたは３'イントロン
−エキソン境界のコンセンサスイントロンスプライス領
域近傍に存在する場合、スプライス変種に関する最終的
な機構が出現し、スプライシング系は、時々、正しいス
プライシング部位を認識できず、別の蛋白産物を生じ、
そのいくつかは無機能または異常である可能性がある。

【０００６】スプライス変種についての多数の例が存在
し、それらの多くは疾病または関連障害に関係してい
る。以前の遺伝学的連環に関する研究により、ライソソ
ームの酸性リパーゼをコードしている遺伝子のエキソン
８の３'スプライス接合部におけるＧのＡへの変異が示
された。この遺伝子の欠陥はコレステロールエステル貯
蔵についての疾病に関連しており、早期アテローム性動
脈硬化、肝臓肥大およびＬＤＬコレステロール増加を引
き起こす（U.Seedorf et al.Arterioscler.Throb.Vasc.
Biol.1995,15:773-778）。エキソン１／イントロン１境
界における２つの変異は、ヒト・ヒドロキシメチルビラ
ンシンターゼ（ヘム生合成経路における第３の酵素）遺
伝子の肝臓での特異的スプライシングを変化させ、酵素
活性を正常の半分にする（K.H.Astrin Human Mutat.199
4,4:243-252）。この酵素活性の欠乏は、常染色体優性
の先天的代謝異常である急性間欠性ポルフィリア（ＡＩ
Ｐ）を引き起こす。この疾病においては、最終的に、環
境遺伝学的因子により生命を脅かす発作が引き起こされ
る。ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの分子クローニングに
より、徴候が出る前にこれらの遺伝子の欠陥を検出でき
るプローブが提供された。メンケ病（Menke's diseas
e）においては、遺伝子中央部のスプライスドナー部位
の−２エキソン位置での点突然変異によりエキソンが飛
ばされ、潜在的なアクセプター部位の活性化が引き起こ
される（S.G.Kaler et al.Nat.Genet.1994,8:195-20
2）。エキソン１９全体が飛ばされることは、イントロ
ン１９の５'ドナー部位におけるＧからＡへの点突然変
異により起こり、筋肉ホスホフラクトキナーゼ欠乏症を
引き起こす（T.Taniguchi Biochem.Biophys.Res.Comm.1
994,202:444-449）。インターロイキン−２受容体ガン
マ（ｇＩＬ２−Ｒ）の遺伝子におけるスプライス部位突
然変異により起こる異常なＲＮＡスプライシングは、小
規模なイントロン挿入を含む無機能ｇＩＬ２−Ｒを豊富
に発生させ、さらにアフィニティーが５分の１である第
２の変異形態を生じる（J.P.DiSanto et al.Proc.Natl.
Acad.Sci.1994,91:9466-9470）。これらのイソ形態は、
異常な形態のＸ染色体が関連した重症合併免疫不全疾病
を引き起こす。

【０００７】スプライス変種の存在を遺伝学的変異に関
連した疾病の診断マーカーして用いることができる。例
えば、細胞付着分子ＣＤ４４のエキソン６のスプライス
変種（ｖ６）の発現は腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３の
発現に相関関係がある。両方とも、結腸直腸ガンの腫瘍
進行のマーカーであることが示されている（J.W.Mulder
et al.Gut 1995,36:76-80；Y.Matsumura Lancet 1992,
340:1053-1058。インビトロＤＮＡ増幅、次いで、標的
配列の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドへのハイブ
リダイゼーションを用いて、エキソン１／イントロン１
境界におけるＣＧのＣＴへのトランスバージョンを含む
変異対立遺伝子を同定することによって無徴候急性間欠
性ポルフィリアのキャリアが同定された。

【０００８】したがって、スプライシング変種はいくつ
かの遺伝子座およびいくつかの疾病において観察され
る。これらの変種の同定は、無徴候キャリアの診断およ
び検出に有用であることがわかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に
鑑み、疾病に関する遺伝子、詳細には、神経学的疾病に
関連した遺伝子のスプライシング変種についての診断マ
ーカーおよび診断方法を提供するものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、潜在的またはあ
まりり好ましくないスプライスドナー部位の変異あるい
は別の利用により生じる新規挿入モチーフを同定し、本
発明を完成した。これらのスプライシング変種は、正常
蛋白配列中の４つのアミノ酸（バリン−アルギニン−Ｘ
−グルタミン（ＶＲＸＱ）、式中Ｘは親水性アミノ酸）
のインフレーム挿入を引き起こす。このモチーフは、正
常な神経学的機能発現に関与している受容体、酵素およ
び推定上のチャンネル蛋白のスプライス変種において同
定された。このモチーフの同定は、スプライス変種に関
しての遺伝子および遺伝子産物のスクリーニングを可能
にする。

【００１１】特異的抗血清、ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を用いるin vitroまたはin situにおけ
る発現蛋白中のこのモチーフの検出方法が本発明により
提供される。標準的なハイブリダイゼーションに基づく
検出法を用いた、選択オリゴヌクレオチドを用いる対立
遺伝子に特異的な遺伝学的変異の検出方法も本発明によ
り提供される。ＶＲＸＱ挿入を有する転写物またはそれ
によりコードされる蛋白のレベルの相違を検出すること
によるアルツハイマー病（ＡＤ）の診断方法も本発明に
より提供される。ＡＤ検出のためのかかる方法の好まし
い具体例は、家族性成人アルツハイマー病（ＦＡＤ）の
検出を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】プレセニリン（本明細書では「Ｐ
Ｓ−１」という）遺伝子は、古典的な７種のトランスメ
ンブラン蛋白であると予想される神経ペプチドをコード
している（Sherrington et al Nature 1995,375:754-76
0）。この遺伝子中のミスセンス変異は、早発性アルツ
ハイマー病を示すいくつかの家族において見いだされ
た。ゲノム分析により、ｈｎＲＮＡのイントロン−エキ
ソン境界が明らかとなった。イントロン３'からエキソ
ン９までの中に位置する共通の多型性が早発性アルツハ
イマー病患者において同定された。また、この多型性
は、典型的な遅発性ＡＤ家族の存在と強い関連を示し
た。この特定の変異はコーディング配列の変化を生じな
かったが、別途スプライシングされた蛋白を生じる変種
に典型的な変化である。

【００１３】ＰＳ−１遺伝子の異なるイントロン中にお
いて他の変異が同定されている。これらは、やはり、別
途スプライシングされた変種を生じる。ヒト・小脳ｃＤ
ＮＡライブラリーから単離されたＰＳ−１蛋白の１の新
規変種はコドン２６および２７の間に４個のアミノ酸挿
入（ＶＲＳＱ）を含む（図３）。この変種は、エキソン
３／イントロン３境界の５'エキソンドナー部位の別の
利用により生じ、いくつかの潜在的ホスホリレーション
部位の損失を引き起こす。異常なスプライシングにより
生じる同様のモチーフ（ＶＲＸＱ、式中Ｘは親水性アミ
ノ酸）も、やはりいくつかの他の神経学的蛋白における
別のスプライシングのために生じる。

【００１４】例えば、カテコールイミン合成における律
速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼに関するｍＲＮ
Ａは、別のスプライシングを受けていくつかの異なるイ
ソ形態を生じる（Kobayashi et al.J.Biochem.1988,103
(6) 907-912；Lewis et al.Neuroscience 1993,54(2) 4
77-492）。同定された変種は配列ＶＲＧＱをコードする
１２ｂｐの挿入を含んでいる。ＶＲＧＱ挿入を含むイソ
形態は、ＭＡＰキナーゼによるホスホリレーションにお
ける変化を示すことも見いだされている（Sutherland e
t al.Eur J Biochem.1993,217(2) 715-722）。さらにそ
のうえ、この挿入を含むチロシンヒドロキシラーゼ変種
はパーキンソン病にも関与している。

【００１５】もう１つの神経ペプチドであるガンマ−ア
ミノ酪酸Ａ（ＧＡＢＡＡ）受容体は、別のスプライシン
グを受けて多くの転写物を生じる（Whiting et al.P.N.
A.S.1990,87(24) 9966-9970；Lasham et al.Biochem.So
c.Trans.1991,19(1)9S）。ＧＡＢＡ受容体は多サブユニ
ットリガンドによりゲートが開閉されるイオンチャンネ
ルであり、ＧＡＢＡＡによる神経の阻害を伝達し、少な
くとも４つのサブユニットタイプ（アルファ、ベータ、
ガンマおよびデルタ）からなっている。ベータ４サブユ
ニットは、トランスメンブランドメインＭ３およびＭ４
の間にある推定上の細胞内ループをコードしている領域
中の１２ｂｐの配列により分離されている２つの５'−
ドナースプライス部位において別のスプライシングを受
ける可能性がある。該１２ｂｐの配列の挿入はＶＲＥＱ
モチーフの付加を生じる（Bateson et al.J.Neurochem
1991,56(4) 1437-1440）。

【００１６】本発明においては、ポリアデニル化メッセ
ンジャーＲＮＡ転写物（ポリＡｍＲＮＡ）および結果
発現される蛋白中、またはこれらのＲＮＡから生じるｃ
ＤＮＡ中のＶＲＸＱモチーフの存在の検出方法が提供さ
れる（式中、Ｖはバリン、Ｒはアルギニン、Ｘは親水性
アミノ酸残基、Ｑはグルタミン）。ＶＲＸＱモチーフを
コードしている転写物およびＶＲＸＱモチーフを有する
蛋白の定量方法も提供される。各コドンの３番目の塩基
の位置に縮重位置を有するＶＲＸＱモチーフに結合した
アンチコドン配列を有するオリゴヌクレオチドをｍＲＮ
Ａの検出および定量に用いることができる。さらに、こ
れらのオリゴヌクレオチドはコドン配列に結合していて
もよく、ｃＤＮＡの検出およびｃＤＮＡが誘導される転
写物の定量に用いることができる。例えば、ＶＲＮＱに
ついてのコドンおよびアンチコドンオリゴヌクレオチド
はＧＵ（Ｎ）ＡＧ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ｃ／Ｕ）ＣＡ（Ａ／
Ｇ）およびその逆の相補配列を含む。放射活性または蛍
光で標識されたオリゴヌクレオチドを用いる当業者によ
く知られた方法により、適当なオリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションを直接的に検出し定量することが
できる。ビオチン化オリゴヌクレオチド／ストレプトア
ビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、増強され
た化学発光の検出、または蛍光タグを付したストレプト
アビジンのごとき間接的検出および定量法（これらの方
法に限らない）を行うこともできる。

【００１７】ＶＲＸＱモチーフに対する特異的抗体を該
モチーフの検出および該モチーフを有する蛋白の定量に
使用することもできる。当該分野において知られている
種々の方法をかかる抗体の製造に使用することができ
る。

【００１８】例えば、動物、好ましくは非ヒトへのＶＲ
ＸＱを含むポリペプチドの直接注射によりこれらの抗体
を得ることができる。次いで、そのようにして得られた
抗体を用いてこのモチーフを含むポリペプチドを組織か
ら単離し定量することができる。

【００１９】モノクローナル抗体の調製については、連
続した細胞系の培養により製造される抗体を提供する方
法を用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Ko
hlerand Milstein,Nature 1975,256:495-497）、トリオ
ーマ法、ヒト・Ｂ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et
al.,Immunology Today 1983,4:72）、およびヒト・モノ
クローナル抗体の製造のためのＥＢＶ−ハイブリドーマ
法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan
R.Liss,Inc.,1985,77-96頁、Coleら）を包含する。

【００２０】１本鎖抗体の製造について記載された方法
（米国特許第４,９４６,７７８号）を適用して本発明の
免疫学的モチーフに対する１本鎖抗体を得ることができ
る。また、トランスジェニックマウスを用いて、このモ
チーフを含むポリペプチドに対するヒト化抗体を発現さ
せることもできる。

【００２１】標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）法により一次抗体−抗原反応を可視化し、次い
で、定量することができる。まず、ＥＬＩＳＡアッセイ
は、ＶＲＸＱモチーフに特異的な抗体、好ましくはモノ
クローナル抗体を調製することを含む。さらに、そのモ
ノクローナル抗体に対するレポーター抗体を調製する。
セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼのごとき検出可能試
薬をレポーター抗体に結合する。次いで、試料を宿主か
ら取り、試料中の蛋白が結合する固体支持体、例えば、
ポリスチレンディッシュ上でインキュベーションする。
次いで、ＢＳＡのごとき非特異的蛋白とともにインキュ
ベーションすることによりディッシュ上の遊離の蛋白結
合部位を被覆する。次いで、モノクローナル抗体をディ
ッシュ中でインキュベーションし、その間にモノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合したＶＲＸ
Ｑ含有蛋白に結合する。すべての未結合モノクローナル
抗体をバッファーで洗浄除去する。次いで、セイヨウワ
サビ・ペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体をデ
ィッシュ中に入れ、ＶＲＸＱモチーフ含有蛋白に結合し
たモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合を起こ
させる。次いで、未結合レポーター抗体を洗浄除去す
る。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに添加
する。蛋白検出および定量用標準曲線と比較した場合、
一定時間の発色量が一定体積の患者試料中に存在するＶ
ＲＸＱ含有蛋白量の測定値となる。使用可能な他の検出
可能試薬の例はルシフェラーゼおよび蛍光または放射性
タグを付した第２の抗体を包含するが、これらに限らな
い。細胞表面上のＶＲＸＱエピトープに対する抗体を発
現する細胞であって、脱顆粒反応またはヒスタミンのご
とき細胞内容物の放出により応答する免疫細胞またはキ
メラ細胞（例えば、ハイブリドーマ）の特定の集団も有
用である。その検出を、機能的に、あるいはクロムのご
とき放射性標識された金属を前以て導入することにより
行うことができる。

【００２２】本発明具体例を用いて、神経変性疾病、詳
細には頭部傷害およびＡＤに関連した神経変性疾病、よ
り詳細には染色体１４ＦＡＤであると予想される場合
のＰＳ−１変種の発現の変化を検出し、比較することが
できる。特に好ましい具体例において、本発明プローブ
および方法を用いてＶＲＳＱモチーフをコードしている
ＰＳ−１転写物の発現低下を検出することができる。該
モチーフは本発明による染色体１４ＦＡＤの診断マー
カーであり、その低下したレベルは染色体１４ＦＡＤに
関連している。本発明の好ましい具体例は、ＶＲＳＱ領
域を含む変種とそれを欠く変種との比較を提供し、Ａ
Ｄ、詳細には染色体１４ＦＡＤの診断を可能にする。

【００２３】ＰＳ−１ポリヌクレオチド配列、ＰＳ−１
発現レベルおよび遺伝子発現産物の検出および定量のた
めの本発明方法、詳細には免疫学的方法およびオリゴヌ
クレオチドを用いる方法を、個体由来の体組織および体
液に関して用いることができる。本発明方法に関して好
ましい体組織および体液は血液細胞、血漿、皮膚細胞、
および脳細胞、詳細には神経細胞、グリア細胞、および
星状細胞を包含するが、これらに限らない。

【００２４】

【実施例】下記実施例は本発明の説明のためだけのもの
であって、本発明を限定するものではない。実施例１ Sherrington et al.Nature 1995,375:754-760により記
載されたＰＳ−１遺伝子の新規スプライス変種をヒト・
小脳およびヒト・線維芽細胞ライブラリーから単離し
た。この新規スプライス変種には４個のアミノ酸（ＶＲ
ＳＱ）の欠失がコドン２６〜２７に存在する。これは、
エキソン３／イントロン３境界（ヌクレオチド−５２か
ら７５）における５'エキソンドナー部位の別の利用に
より生じる。ＶＲＳＱモチーフのエキソン３の最後のＧ
ｌｎコドンの...ＣＡＧ／ｇｔａ...境界は５'エキソン
ＡＧドナー部位およびＧＴイントロンコンセンサス５'
境界を提供し、このスプライス部位の利用はＶＲＳＱモ
チーフをコードしている１２個のヌクレオチドの挿入を
生じる。上流のＴｈｒ−Ｖａｌコドンの...ＡＣＴ／Ｇ
ＴＡ...境界は、ＧＴ５'イントロンに対するあまり好ま
しくないＣＴ（ＡＧが好ましい）５'エキソン境界を提
供し、この部位でのスプライシングはＶＲＳＱモチーフ
を除去するであろう。興味深いことに、Sherrington et
al.Nature 1995,375:754-760のＰＳ−１蛋白において
は、これが唯一観察された生成物であり、点突然変異が
他の場所に散在している。

【００２５】実施例２ＧＡＢＡ受容体４サブユニットにおいて、別のスプライ
シングはＶＲＥＱモチーフを付加する（Bateson et al.
J.Neurochem 1991,56(4) 1437-1440）。高い厳密性の条
件下でニワトリ・ゲノムｃＤＮＡライブラリーをニワト
リ・ベータ−４'サブユニットｃＤＮＡに関してスクリ
ーニングした。ｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いるサザンブロット分析、次いで、
制限マッピングにより、ベータ−４サブユニット遺伝子
のコーディング領域を含む重複ＤＮＡフラグメントが同
定された。これらのフラグメントをpBluescript中にサ
ブクローンし、配列決定した。クローンの１つについて
の完全な配列決定により、細胞内ループをコードしてい
る部分における１２ｂｐの存在（アミノ酸残基３３５−
３３８）が明らかとなった。ベータ−４サブユニット遺
伝子の分析により、２つの変種をコードしている異なる
転写物（１２ｂｐのループの存在または不存在）が２つ
の５'ドナースプライス部位（当該１２ｂｐの配列のす
ぐ３'側のイントロンに存在）の一方の利用により生じ
ることが明らかとなった。

【００２６】実施例３２つのＰＳ−１ｍＲＮＡ転写物（１つはＶＲＳＱモチ
ーフを含み（ＰＳ−１−長という）、もう１つはＶＲＳ
Ｑモチーフを欠く（ＰＳ−１−短という）の発現を、早
発性ＦＡＤ患者の脳において分析した。in situハイブ
リダイゼーション（ＩＳＨ）を用いて、早発性ＦＡＤケ
ース（おそらく染色体１４に関連した）の脳におけるＰ
Ｓ−１ｍＲＮＡの発現の定性的および定量的パターン
を調べた。患者由来の脳を、遅発性ＡＤ患者および正常
個体の脳と比較した。

【００２７】in situハイブリダイゼーション４つの正常対照ケース、６つの遅発性ＡＤケースおよび
３つの早発性ＦＡＤケースにおいてＰＳ−１ｍＲＮＡ
発現を試験した。遅発性ケースは、家族歴がなく、平均
死亡年齢が８１.２才（７９−８４才の範囲）であった
ことから散発性であると考えられた。それらは平均死後
遅延８.３時間を有していた。早発性ＦＡＤケースは、
発症年齢、家族歴、染色体１４関連ＦＡＤに典型的な臨
床的症状および組織病理学的所見から、染色体１４に関
連していると推定された。これらの平均死亡年齢は４５
才（４４−４６才の範囲）であり、平均死後遅延は４
１．７時間であった。標準的な病理学的判断基準（Ｋｈ
ａｃｈａｔｕｒｉａｎ，１９８５，ｒｃｈｉｖｅｓｏ
ｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２：１０９７−１１０５）
に従ってすべてのＡＤケースを診断した。対照は平均死
亡年齢６８.８才（５７−８５才の範囲）であり、平均
死後遅延は１１.８時間であった。試験した脳部位は海
馬、側頭皮質および前頭皮質（ＡＤにひどく罹患してい
る領域）、視覚皮質（比較的罹患していない領域である
が、死亡時に疾病進行の初期段階にある可能性のある領
域）および小脳（古典的なＡＤ病理からすると罹患して
おらず、臨床的にも関連ない領域）であった。

【００２８】３種の異なるオリゴプローブを選択し、合
成した（図４）。１つはＰＳ−１−長を検出するための
ものであり、もう１つはＰＳ−１−短を、さらにもう１
つは両方のＰＳ−１転写物、すなわちＰＳ−１−両を検
出するためのものであった。これらのプローブは、染色
体１上にある密接に関連した遺伝子プレセニリン−２
（Rogaev,et al.,1995,Nature 376:775-778）の転写物
を検出するとは予想されない。

【００２９】ＩＳＨ方法論は当該分野においてよく知ら
れており、詳細に説明されている（Najlerahim et al.,
1990,FEBS Letters 7:317-333）。ＩＳＨ分析のため
に、１０個のクリオスタット組織切片を用いた。NEN Du
Pont 3'末端標識システムを用いて３'末端において³⁵Ｓ
−ｄＡＴＰでプローブを標識した。種々のプローブのハ
イブリダイゼーションおよび洗浄温度を図４に示す。ハ
イブリダイゼーションした部分をトリチウム感受性フィ
ルムに対して配置してオートラジオグラムを得た。隣接
部分におけるセンス方向でのＰＳ−１とのハイブリダイ
ゼーションを用いて非特異的バックグラウンドの対照と
した。イメージアナライザー（Seescan）を用いてオー
トラジオグラムのフィルムのシグナルを定量した。大部
分の組織切片上の典型的な部位を測定した。例えば、海
馬においては異なる下位領域を別個に定量しなかった。
バックグラウンドシグナル（センス鎖ハイブリダイゼー
ション）をアンチセンスシグナルから差し引いた。よく
知られたtwo-tailedスチューデントt試験を用いてデー
タの統計学的分析を行った。

【００３０】ノーザン分析多くの異なるヒト・脳領域由来のポリＡ付加ｍＲＮＡを
含有するNorthern blot（Clontech カタログ番号7750-
1）に対し、ＰＳ−１−両プローブを用いてノーザン分
析を行った。プローブは、ターミナルトランスフェラー
ゼを用いて³²Ｐ−ｄＡＴＰ標識した３'末端であり、標
準的条件下（Clontech データシート）でハイブリダイ
ゼーションを行った。

【００３１】ＦＡＤの診断方法および試薬３種すべてのプローブを用いるin situハイブリダイゼ
ーションにより、ＰＳ−１ｍＲＮＡが試験した脳領域
すべての存在することが明らかとなった。センス鎖対照
プローブとのハイブリダイゼーションは非常に低いバッ
クグラウンドシグナルを生じた。大脳皮質（３部位）に
おいて、灰白質および白質の両方において、白質におい
て高頻度に、しかも同様の強度でシグナルが検出され
た。灰白質においては層状というよりもむしろ分散した
パターンが観察され、海馬においては異なる下位領域は
描写容易でなかった（のこぎり状の回が時々見られ
た）。小脳においては、顆粒状の細胞層が大部分の標識
を含んでいた。これらのデータは、ニューロンおよびグ
リアの両方におけるＰＳ−１ｍＲＮＡ発現と矛盾しな
い。

【００３２】ノーザン分析により、ＰＳ−１−両オリゴ
プローブが、ＰＳ−１ｍＲＮＡに関する正しいサイズ
のヒト・脳中の主要転写物を検出したことが確認された
（Sherrington et al,1995,Nature 375:754-760に従っ
て）。すべての脳部位において約３.４の主要バンドが
検出され、ＰＳ−１ｍＲＮＡの脳中の広範な分布が示
された。脳梁におけるＰＳ−１ｍＲＮＡの観察結果
は、ＰＳ−１がグリアにおいて発現されるという我々の
ＩＳＨデータからの解釈と矛盾しない。

【００３３】各領域において、ＰＳ−１−長およびＰＳ
−１−短の両転写物に関して、ＩＳＨにより同様の解剖
学的パターンが見られた。それにもかかわらず、脳部位
によって転写物発現レベルに相違があるように思われ、
例えば、ＰＳ−１−短は小脳においてはあまり豊富でな
かった（図５）。

【００３４】ハイブリダイゼーションパターンは対照、
特発性ＡＤおよびＦＡＤケースについて同様であった。
散発性ＡＤケースと比較すると、ＦＡＤの海馬および前
頭皮質における統計学的に有意なＰＳ−１量の減少がオ
ートラジオグラムのフィルムの定量により明らかとなっ
た（図５；それぞれｐ＝０.００３およびｐ＝０.０１
４）。小脳においては、対照、特発性ＡＤおよびＦＡＤ
の間に有意な相違はなかった。ＰＳ−１−長の減少は特
別なものであると思われる。なぜなら、３種の異なる群
において調査した脳のいずれの部位においてもＰＳ−１
−短ｍＲＮＡの発現レベルに変化がなかったからであ
る（図５）。そのことは合理的なデータの整合性を示す
ものである。

【００３５】

【配列表】

【００３６】（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ユニバーシティ・オブ・サウス・フロリ
ダ、ワシントン・ユニバーシティおよびスミスクライン
・ビーチャム・コーポレイション（ｉｉ）発明の名称：神経学的機能に関連した遺伝子の
スプライシング変種についての
新規診断マーカー（ｉｉｉ）配列の数：５（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形式：（Ａ）媒体形態：３.５インチディスケット、容量１.４
４Ｍｂ（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ４８６（Ｃ）操作システム：WINDOWS FOR WORKGROUPS （Ｄ）ソフトウェア：WORDPERFECT 5.1 （ｖ）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：未定（Ｂ）出願日：これに伴う（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先の出願データ：（Ａ）出願番号：６０／０１２,０７７（Ｂ）出願日：１９９６年２月２２日（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：（Ａ）氏名：ウィリアム・ティー・ハン（Ｂ）登録番号：３４,３４４（Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０００３（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０２４（Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０

【００３７】配列番号：１配列の長さ：１９１４塩基対配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列 CCGTACGTAG CCGCGGCGGC AGCGGGGCGG CGGGGAAGCG TATGCATACA AATTTATTAG 60 CATGCAGACT GGGAGAACCA CAAGACCTAA TCTGGGAGCC TGCAAGTGAC AACAGCCTTT 120 GCGGTCCTTA GACAGCTTGG CCTGGAGGAG AACACATGAA AGAAAGAACC TCAAGAGGCT 180 TTGTTTTCTG TGAAACAGTA TTTCTATACA GTTGCTCCAA TGACAGAGTT ACCTGCACCG 240 TTGTCCTACT TCCAGAATGC ACAGATGTCT GAGGACAACC ACCTGAGCAA TACTAATGAC 300 AATAGAGAAC GGCAGGAGCA CAACGACAGA CGGAGCCTTG GCCACCCTGA GCCATTATCT 360 AATGGACGAC CCCAGGGTAA CTCCCGGCAG GTGGTGGAGC AAGATGAGGA AGAAGATGAG 420 GAGCTGACAT TGAAATATGG CGCCAAGCAT GTGATCATGC TCTTTGTCCC TGTGACTCTC 480 TGCATGGTGG TGGTCGTGGC TACCATTAAG TCAGTCAGCT TTTATACCCG GAAGGATGGG 540 CAGCTAATCT ATACCCCATT CACAGAAGAT ACCGAGACTG TGGGCCAGAG AGCCCTGCAC 600 TCAATTCTGA ATGCTGCCAT CATGATCAGT GTCATTGTTG TCATGACTAT CCTCCTGGTG 660 GTTCTGTATA AATACAGGTG CTATAAGGTC ATCCATGCCT GGCTTATTAT ATCATCTCTA 720 TTGTTGCTGT TCTTTTTTTC ATTCATTTAC TTGGGGGAAG TGTTTAAAAC CTATAACGTT 780 GCTGTGGACT ACATTACTGT TGCACTCCTG ATCTGGAATT TTGGTGTGGT GGGAATGATT 840 TCCATTCACT GGAAAGGTCC ACTTCGACTC CAGCAGGCAT ATCTCATTAT GATTAGTGCC 900 CTCATGGCCC TGGTGTTTAT CAAGTACCTC CCTGAATGGA CTGCGTGGCT CATCTTGGCT 960 GTGATTTCAG TATATGATTT AGTGGCTGTT TTGTGTCCGA AAGGTCCACT TCGTATGCTG 1020 GTTGAAACAG CTCAGGAGAG AGATGAAACG CTTTTTCCAG CTCTCATTTA CTCCTCAACA 1080 ATGGTGTGGT TGGTGAATAT GGCAGAAGGA GACCCGGAAG CTCAAAGGAG AGTATCCAAA 1140 AATTCCAAGT ATAATGCAGA AAGCACAGAA AGGGAGTCAC AAGACACTGT TGCAGAGAAT 1200 GATGATGGCG GGTTCAGTGA GGAATGGGAA GCCCAGAGGG ACAGTCATCT AGGGCCTCAT 1260 CGCTCTACAC CTGAGTCACG AGCTGCTGTC CAGGAACTTT CCAGCAGTAT CCTCGCTGGT 1320 GAAGACCCAG AGGAAAGGGG AGTAAAACTT GGATTGGGAG ATTTCATTTT CTACAGTGTT 1380 CTGGTTGGTA AAGCCTCAGC AACAGCCAGT GGAGACTGGA ACACAACCAT AGCCTGTTTC 1440 GTAGCCATAT TAATTGGTTT GTGCCTTACA TTATTACTCC TTGCCATTTT CAAGAAAGCA 1500 TTGCCAGCTC TTCCAATCTC CATCACCTTT GGGCTTGTTT TCTACTTTGC CACAGATTAT 1560 CTTGTACAGC CTTTTATGGA CCAATTAGCA TTCCATCAAT TTTATATCTA GCATATTTGC 1620 GGTTAGAATC CCATGGATGT TTCTTCTTTG ACTATAACAA AATCTGGGGA GGACAAAGGT 1680 GRTTTTCCTG TGTCCCACAT CTAACAAAGT CAAGATTCCC GKCTGGACTT TTGCAGCTTC 1740 CTKCCAAGTC TTCCTGACCA CCTTGCACTW TTGGACTTTG GARGGAGGTG CCTAKAGAAA 1800 ACGRTTTTGA MCATACTTCA TCGCAGTGGA CTGTGTCCCT CGGTGCAGAA ACTACCAGAT 1860 TTGAGGGACG AGGTCAAGGA GATATGATAG GCCCGGAAGT TGCTGTGCCC ATCA 1914

【００３８】配列番号２：配列の長さ：４６３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列 MET THR GLU LEU PRO ALA PRO LEU SER TYR PHE GLN ASN ALA GLN 1 5 10 15 MET SER GLU ASP ASN HIS LEU SER ASN THR ASN ASP ASN ARG GLU 20 25 30 ARG GLN GLU HIS ASN ASP ARG ARG SER LEU GLY HIS PRO GLU PRO 35 40 45 LEU SER ASN GLY ARG PRO GLN GLY ASN SER ARG GLN VAL VAL GLU 50 55 60 GLN ASP GLU GLU GLU ASP GLU GLU LEU THR LEU LYS TYR GLY ALA 65 70 75 LYS HIS VAL ILE MET LEU PHE VAL PRO VAL THR LEU CYS MET VAL 80 85 90 VAL VAL VAL ALA THR ILE LYS SER VAL SER PHE TYR THR ARG LYS 95 100 105 ASP GLY GLN LEU ILE TYR THR PRO PHE THR GLU ASP THR GLU THR 110 115 120 VAL GLY GLN ARG ALA LEU HIS SER ILE LEU ASN ALA ALA ILE MET 125 130 135 ILE SER VAL ILE VAL VAL MET THR ILE LEU LEU VAL VAL LEU TYR 140 145 150 LYS TYR ARG CYS TYR LYS VAL ILE HIS ALA TRP LEU ILE ILE SER 155 160 165 SER LEU LEU LEU LEU PHE GLU GLU SER PHE ILE TYR LEU GLY GLU 170 175 180 VAL PHE LYS THR TYR ASN VAL ALA VAL ASP TYR ILE THR VAL ALA 185 190 195 LEU LEU ILE TRP ASN PHE GLY VAL VAL GLY MET ILE SER ILE HIS 200 205 210 TRP LYS GLY PRO LEU ARG LEU GLN GLN ALA TYR LEU ILE MET ILE 215 220 225 SER ALA LEU MET ALA LEU VAL PHE ILE LYS TYR LEU PRO GLU TRP 230 235 240 THR ALA TRP LEU ILE LEU ALA VAL ILE SER VAL TYR ASP LEU VAL 245 250 255 ALA VAL LEU CYS PRO LYS GLY PRO LEU ARG MET LEU VAL GLU THR 260 265 270 ALA GLN GLU ARG ASP GLU THR LEU PHE PRO ALA LEU ILE TYR SER 275 280 285 SER THR MET VAL TRP LEU VAL ASN MET ALA GLU GLY ASP PRO GLU 290 295 300 ALA GLN ARG ARG VAL SER LYS ASN SER LYS TYR ASN ALA GLU SER 305 310 315 THR GLU ARG GLU SER GLN ASP THR VAL ALA GLU ASN ASP ASP GLY 320 325 330 GLY PHE SER GLU GLU TRP GLU ALA GLN ARG ASP SER HIS LEU GLY 335 340 345 PRO HIS ARG SER THR PRO GLU SER ARG ALA ALA VAL GLN GLU LEU 350 355 360 SER SER SER ILE LEU ALA GLY GLU ASP PRO GLU GLU ARG GLY VAL 365 370 375 LYS LEU GLY LEU GLY ASP PHE ILE PHE TYR SER VAL LEU VAL GLY 380 385 390 LYS ALA SER ALA THR ALA SER GLY ASP TRP ASN THR THR ILE ALA 395 400 405 CYS PHE VAL ALA ILE LEU ILE GLY LEU CYS LEU THR LEU LEU LEU 410 415 420 LEU ALA ILE PHE LYS LYS ALA LEU PRO ALA LEU PRO ILE SER ILE 425 430 435 THR PHE GLY LEU VAL PHE TYR PHE ALA THR ASP TYR LEU VAL GLN 440 445 450 PRO PHE MET ASP GLN LEU ALA PHE HIS GLN PHE TYR ILE 455 460

【００３９】配列番号：３配列の長さ：３０塩基対配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GCACTCAATT CTGAATGCTG CCATCATGAT 30

【００４０】配列番号：４配列の長さ：３０塩基対配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 AGCAATACTG TACGTAGCCA GAATGACAAT 30

【００４１】配列番号：５配列の長さ：２９塩基対配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 CACCTGAGCA ATACWATGAC AATAGAGAA 29

【図面の簡単な説明】

【図１】３つのエキソンおよび４つのイントロンにつ
いて起こり得る別のスプライシングのスキーム図であ
る。

【図２】コンセンサスエキソン−イントロン−エキソ
ン構造および配列のスキーム図である。

【図３】配列番号：１および２のプレセニリン１遺伝
子のＶＲＳＱ変種の配列を示す図である。

【図４】配列番号：１および２のプレセニリン１遺伝
子のＶＲＳＱ変種の配列を示す図である。

【図５】配列番号：１および２のプレセニリン１遺伝
子のＶＲＳＱ変種の配列を示す図である。

【図６】配列番号：１および２のプレセニリン１遺伝
子のＶＲＳＱ変種の配列を示す図である。

【図７】配列番号：３ないし５のＰＳ−１オリゴヌク
レオチドプローブを示す。

【図８】ヒト・脳におけるＰＳ−１−長およびＰＳ−
１−短ｍＲＮＡについてのＩＳＨシグナルの定量結果
を表にしたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/566 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 597029653 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙアメリカ合衆国63110ミズーリ州セント・ルイス、サウス・ユークリッド・アベニュー724番 (71)出願人 597024762 ユニバーシティ・オブ・サウス・フロリダＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｏｕｔｈＦｌｏｒｉｄａアメリカ合衆国33620フロリダ州タンパ、イースト・フラワー・アベニュー4204番 (72)発明者アマンダ・バートンイギリス、イーエヌ10・７エルユー、ハーツ、ブロックスボウエン、ハイ・ストリート24番 (72)発明者アリソン・エム・ゴートアメリカ合衆国63117ミズーリ州リッチモンド・ハイツ、クレイトニア・テラス1177 番 (72)発明者ジョン・ハーディアメリカ合衆国32084フロリダ州セント・オーガスティン、ウォーター・ストリート 48番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経学的疾病に罹病性のある個体から遺
伝学的試料を用意し、次いで、遺伝学的材料の試料中の
ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡ転写物またはそれ
によりコードされる蛋白中に存する配列ＶＲＸＱ（式
中、Ｖはバリン、Ｒはアルギニン、Ｘは疎水性アミノ酸
残基、Ｑはグルタミン）を含む別のスプライス部位の存
在を検出することを含む神経学的疾病に罹病性のある個
体の同定方法。
【請求項２】３番目の塩基位置に縮重位置を有する配
列ＶＲＸＱに結合したアンチコドン配列を含む選択オリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて配列ＶＲＸＱが検出さ
れる請求項１の方法。
【請求項３】さらに該オリゴヌクレオチドをコドン配
列に結合し、ｃＤＮＡを検出することを含む請求項２の
方法。
【請求項４】配列ＶＲＸＱを含むポリペプチドに対す
る抗体を用いて配列ＶＲＸＱが検出される請求項１の方
法。
【請求項５】神経学的疾病がアルツハイマー病を含
み、ｍＲＮＡまたは蛋白がプレセニリン１遺伝子により
コードされているものである請求項１の方法。
【請求項６】配列が遺伝子のコドン２６および２７の
間における４個のアミノ酸の挿入からなるものであり、
該配列がＶＲＳＱである請求項５の方法。
【請求項７】ｍＲＮＡまたは蛋白がガンマ−アミノ酪
酸Ａ受容体遺伝子によりコードされており、配列がＶＲ
ＥＱよりなるものである請求項１の方法。
【請求項８】ｍＲＮＡまたは蛋白がチロシンヒドロキ
シラーゼ遺伝子によりコードされており、配列がＶＲＧ
Ｑよりなるものである請求項１の方法。
【請求項９】遺伝学的材料の試料中の配列ＶＲＸＱ
（式中、Ｖはバリン、Ｒはアルギニン、Ｘは疎水性アミ
ノ酸残基、Ｑはグルタミン）を含むポリアデニル化メッ
センジャーＲＮＡ転写物またはそれによりコードされる
蛋白のレベルを調べることを含む神経学的疾病の診断方
法。
【請求項１０】神経学的疾病がアルツハイマー病を含
み、ｍＲＮＡまたは蛋白がプレセニリン１遺伝子により
コードされているものである請求項９の方法。
【請求項１１】配列が遺伝子のコドン２６および２７
の間における４個のアミノ酸の挿入よりなるものであ
り、該配列がＶＲＳＱである請求項１０の方法。
【請求項１２】ｍＲＮＡまたは蛋白がガンマ−アミノ
酪酸Ａ受容体遺伝子によりコードされており、配列がＶ
ＲＥＱよりなるものである請求項９の方法。
【請求項１３】ｍＲＮＡまたは蛋白がチロシンヒドロ
キシラーゼ遺伝子によりコードされており、配列がＶＲ
ＧＱよりなるものである請求項９の方法。