JPH0975088A - オゾンで誘導される木本植物の１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸合成酵素遺伝子群 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 オゾンで誘発される木本植物の１−アミノシ
クロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）合成酵素遺伝
子群の提供。 【解決手段】 例えばポプラ植物から、オゾン暴露によ
り誘導されるｍＲＮＡに対するｃＤＮＡであって、ＡＣ
Ｃ合成酵素をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、大気汚染物質であ
るオゾンにより引き起こされる木本植物の障害の発生に
関与しており、植物のオゾン耐性や浄化能力の向上に寄
与していると考えられるオゾンで誘導される植物のＡＣ
Ｃ合成酵素遺伝子に関する。さらに詳細にはポプラ属植
物のオゾンで誘導されるＡＣＣ合成酵素遺伝子に関し、
大気汚染物質であるオゾンに対する耐性の高い植物およ
び大気中のオゾン浄化能力の優れた植物の分子育種に有
効であると期待される。光化学オキシダントによる農作
物等の植物被害の発生が報告されているので（環境庁委
託業務結果報告書、１９８２）、光化学オキシダントの
主成分であるオゾンに対する植物の耐性を向上すること
が可能になれば、農作物の収穫量の増大等に役立てるこ
とも可能となる。

【０００２】

【従来の技術】これまでにオゾンに対する植物の耐性を
付与するために分子育種で幾つかの研究がなされてい
る。いずれの研究もオゾンによって植物体で発生する活
性酵素を消去させようとしたものであり、スーパーオキ
シドジスムターゼ遺伝子やグルタチオンレダクターゼ遺
伝子を植物に導入してオゾン耐性を付与しようとしてい
るが、実質的には成功しているとは言えない〔Pitcher,
L. H. et. al., Plant Physiol., 97：452-455 (199
1)、佐治ら、植物細胞工学、５：291-297 (1993)〕。

【０００３】また、オゾンによって植物においてエチレ
ンが誘導されることは知られている。このエチレンの発
生はオゾン障害の結果として起こると考えられていた
が、近年、ＡＣＣ合成酵素の阻害剤アミノエトキシビニ
ルグリシン（ＡＶＧ）を用いてオゾン暴露時にエチレン
生成を抑制すると植物に現れる障害の程度が軽減される
ことが明らかになった。この結果から、エチレンが植物
の障害の発生と深い関連があると考えられ、オゾンによ
って発生するエチレンを抑制することによって植物のオ
ゾン耐性を向上させることが可能になると期待される。
そこで本発明者らはオゾン耐性とエチレンの代謝につい
て鋭意検討し、オゾン暴露によって誘導される植物のＡ
ＣＣ合成酵素の完全な遺伝子を取得することができ、本
発明の完成に至った。

【０００４】ＡＣＣ合成酵素はＰＬＰ酵素群に属し、Ｓ
−アデノシルメチオニンを基質としてＡＣＣを生成する
酵素である。ＡＣＣ合成酵素は植物界に広く分布してお
り、植物ホルモンであるエチレンの生成系の鍵酵素であ
る。ＡＣＣ合成酵素には多くのアイソザイムが存在する
ことが知られている。エチレンは果実の成熟、落葉、耐
病性の誘導などさまざまな植物の生理現象に関連してお
り、それぞれの生理現象に異なるＡＣＣ合成酵素のアイ
ソザイムが関与していると考えられている。

【０００５】これまでにLycopersicon esculentum Der
S. et al. Proc. Natul. Acad. Sci. U.S.A. 87：4859
−4863 (1990), Olson D. C. et al. Proc. Natul. Aca
d. Sci. U.S.A. 88：5340−5344 (1991), Rottmann W.
H. et al. J. Mol. Biol. 222：937-961 (1991), Yip
W. K. et al. Proc. Natul. Acad. Sci. U.S.A. 89：24
75−2479 (1992), Lincoln J. E. et al. J. Biol. Che
m. 268：19422-19430(1993), Li N. et al. J. Biol. C
hem. 269：6908−6917 (1994), Cucurbita maxima Nak
ajima N. et al. Plant Cell Physiol. 31：1021−102
9 (1990), Imazeki H. et al. Plant Cell Physiol. 3
2：1153−1163 (1991), Cucurbita pepo Huang P. et a
l. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88：7021-7025 (19
91), Sato T. J. Biol. Chem. 266：3752−3759, Oryza
Sativa：Zarembinski T. I. etal. Mol. Biol. Cell
4：363-373 (1993), Vigna radiata：Botella J. R. e
tal. Plant Mol. Biol. 18：793-797 (1992), Botella
J. R. et al. Plant Mol. Biol. 20：425-436 (1992),
Botella J. R. Gene 123：249-253 (1993), Arabidopsi
s thaliana Der Straeten D. et al. Proc. Natul. Aca
d. Sci. U.S.A.89：9969−9973 (1992), Liang X. et a
l. Proc. Natul. Acad. Sci. U.S.A. 89：11046-11050
(1992), Ncotiana tabacum Bailey B. A. et al. Plant
Physiol. 100：1515−1616 (1993), Brassica olerac
ea Pogson B. J. et al unpublished (1994), Solanum
tuberosum Van Montagu et al. unpublished (1994), P
runus persica Bonghi C. et al. unpublished (1993),
Malus sylvestris Dong J. G. et al. Planta 185：38
−45 (1991), Dianthus caryopkyllus Park K. Y.et a
l. Plant Mol. Biol. 18：377-386 (1992), Petunia hy
brida Micheal M. Zet al. unpublised (1992), Glycin
e max Liu. D. et al unpublished (1992)など多数の植
物から遺伝子がクローニングされており、発現調節の機
構が研究されつつある。

【０００６】また、カボチャの傷害誘導型ＡＣＣ合成酵
素遺伝子に関する特許出願がされている（特開平０４−
１６９１８３）。また、植物のエチレンレベルを遺伝子
組み換えにより減少させる技術に関する特許出願がされ
ている（特表平４−５０６６０２、特表平５−５０６３
５８）。しかし、これらのＡＣＣ合成酵素遺伝子群は傷
害や成熟に関与するものがほとんどであり、オゾン耐性
については関係を示すデータはない。ただし、最近、ジ
ャガイモにおいてオゾンで発現が増加するＡＣＣ合成酵
素ｃＤＮＡの一部が単離され〔Schlagnhaufer CD et a
l. Plant Mol. Biol. 28 : 93−103, (1995) 〕、この
遺伝子とオゾン耐性との関係が示唆されている。しか
し、このｃＤＮＡはアミノ酸に変換して考えた場合、Ｎ
末端側が３０残基ほどが欠けており完全長ではない。さ
らに、樹木を起源とするオゾンで誘導されるＡＣＣ合成
酵素に関する遺伝子について研究は皆無である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】オゾンで誘導されるＡ
ＣＣ合成酵素遺伝子を単離し、その構造を解析すれば、
アンチセンス技術によってオゾン暴露時に発生するエチ
レンを抑えた植物の作製が可能となるため、オゾンに弱
い植物の耐性を増強し、植物のオゾン浄化能力を向上さ
せることが可能となると期待される。従って本発明の目
的は、オゾンで誘導される木本植物の完全なＡＣＣ合成
酵素遺伝子を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】大気汚染ガスの吸収能力
の高いがオゾン耐性に劣るポプラ属植物を材料に用い
て、オゾン暴露した葉のｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡから作
成したｃＤＮＡライブラリー中からオゾンで誘導される
ＡＣＣ合成酵素ｃＤＮＡ群をクローニングし、発現ベク
ターを構築してその酵素活性を測定し、さらにノーザン
解析によって該遺伝子群の発現がオゾンで誘導されるこ
とを確認することによって本発明を完成した。

【０００９】従って本発明はオゾンで誘導される木本植
物の完全なＡＣＣ合成酵素遺伝子群を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は木本植物のオゾンで誘導
されるＡＣＣ合成酵素遺伝子を含む。一例としてポプラ
属のオゾンで誘導されるＡＣＣ合成酵素遺伝子を示し
た。これまでにジャガイモでオゾンで誘導されるＡＣＣ
合成酵素ｃＤＮＡが単離されているが完全長ではない
（Schlagnhaufer CD et al. Plant Mol. Biol. 28 : 93
−103, 1995)。本発明はオゾンで誘導されるＡＣＣ合成
酵素の完全なｃＤＮＡ配列を明らかにした最初の報告で
あるといえる。本発明の提供する２種類のＡＣＣ合成酵
素ｃＤＮＡについてジャガイモで単離されたオゾンで誘
導されるＡＣＣ合成酵素遺伝子とアミノ酸配列を比較す
るとその間の相同性は配列番号：１のＡＣＣ合成酵素で
は６４％、配列番号：２に示すＡＣＣ合成酵素では６６
％であった。

【００１１】本発明のポプラ属ＡＣＣ合成酵素群は配列
番号：１及び配列番号：２に示したアミノ酸配列からな
る。しかし、ポプラ属植物間でも品種等によって多少の
アミノ酸配列の相違はあり得る。また、同一植物品種で
あっても突然変異等によってアミノ酸配列が変化する場
合がある。よって、本発明では、配列番号：１又は配列
番号：２に示すアミノ酸配列に対して、少数個例えば１
〜１５個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個のアミノ
酸が、置換、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列
を有し、ＡＣＣ合成酵素活性を保持している酵素を包含
する。

【００１２】本発明は、配列番号：１又は配列番号：
２、に示したＡＣＣ合成酵素群をコードする遺伝子を提
供する。典型的には配列番号：１、配列番号：２に示す
塩基配列を有する遺伝子であるが、これに限定されず、
配列番号：１、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコー
ドするすべての遺伝子を含む。また、本発明において
は、配列番号：１、配列番号：２にしめすアミノ酸配列
に対して少数個例えば１〜１５個、例えば１〜１０個、
例えば１〜５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または付
加されたアミノ酸配列を有し、ＡＣＣ合成酵素活性を保
持している酵素をコードするすべての遺伝子を含む。

【００１３】本発明の遺伝子はオゾンに暴露したポプラ
属植物から抽出したｍＲＮＡに対するｃＤＮＡから作成
したライブラリーからクローニングできる。オゾン暴露
法については、実施例１に記載する。ｍＲＮＡの抽出、
ｃＤＮＡライブラリーの作成は定法に従って行うことが
できる。実施例２及び実施例３にその具体例を示した。

【００１４】ｃＤＮＡライブラリーからの全長をコード
する該遺伝子の取得は以下のように行うことができる。
ｃＤＮＡからＰＣＲ法によりＡＣＣ合成酵素の一部をコ
ードするｃＤＮＡをクローニングし、そのｃＤＮＡ断片
をプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることによって、該酵素の全長をコードするｃＤＮ
Ａを取得できる。なお、ＰＣＲ法に用いる２種類のプラ
イマーには他の植物のＡＣＣ合成酵素間で相同性の高い
部分に対応するオリゴヌクレオチドを使用することがで
きる。

【００１５】一つの例として、本発明においては、Kend
e らの報告(Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bi
ol. 44：283-307 (1993)) にあるＡＣＣ合成酵素の保存
領域をもとに作製した。トマト由来の酵素のアミノ酸配
列のアミノ酸４９〜５７の配列、及びアミノ酸２０６〜
２１３の配列に対応する、配列番号：３及び配列番号：
４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。

【００１６】プローブの作成、ｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニング方法は実施例４及び実施例５に詳細に記
載する。本発明の方法は本発明で使用したポプラ属植物
のみならず、他のポプラ属植物、例えば、Ｐｏｐｕｌｕ
ｓ ａｌｂａ，Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅ，Ｐ
ｏｐｕｌｕｓ ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚｉｉ，Ｐｏｐｕｌ
ｕｓ ｓｉｅｂｏｌｉｉ Ｍｉｇにも適用して、ＡＣＣ
合成酵素をクローニングすることができる。

【００１７】本発明により、ＡＣＣ合成酵素をコードす
る塩基配列が示されたことから、該遺伝子に対するＤＮ
Ａ、及び、その一部の塩基配列を変更したＤＮＡを化学
的に合成することができる。また、クローニングされた
ｃＤＮＡクローンを基にＰＣＲ法や、部位特定変異誘発
等によってＡＣＣ合成酵素をコードする修飾されたＤＮ
Ａを合成することができる。

【００１８】こうして調整されたＡＣＣ合成酵素をコー
ドするＤＮＡは、定法に従って、発現ベクターに挿入し
た後、宿主細胞に形質転換し、これらの宿主細胞を培養
することにより、ＡＣＣ合成酵素を製造することができ
る。実施例７に具体例を記載する。本発明の目的はオゾ
ンによって誘導されるＡＣＣ合成酵素遺伝子を取得する
ことである。従って、本発明において所得したｃＤＮＡ
クローンについてオゾンによってその発現が誘導される
かどうか確認する必要があるが、発現誘導はノーザン解
析によって確認することができる。上記方法で取得した
ＡＣＣ合成酵素遺伝子群はいずれもオゾンによって発現
が誘導されるものであった。その具体的方法については
実施例８に記載する。

【００１９】本発明のＡＣＣ合成酵素及びそれをコード
するＤＮＡにおいて、ＡＣＣ合成酵素のアミノ酸配列は
配列番号：１及び２に示すもののほか、前記のごとき１
〜少数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によっ
て修飾されていてもよい。このような修飾は当該アミノ
酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を常用の例えば部
位特定変異誘発等により変更することにより行うことが
できる。

【００２０】本発明の重要な用途は、本発明により取得
したｃＤＮＡをアンチセンス方向に植物に導入し、エチ
レン生成を抑えた植物を作成し、植物のオゾン耐性を強
化することである。例えばオゾンに弱い木本植物、例え
ばポプラ属植物などにアンチセンス方向に導入すること
によって、大気汚染物質であるオゾン耐性が強化されオ
ゾン浄化能力の向上した樹木を作出できる。

【００２１】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるもので
はない。実施例１． ポプラ植物へのオゾン暴露 暴露時の環境条件は温度２５℃、相対湿度７０％、照度
３０klx 、風速３０cm／ｓに設定した。光源にはハイド
ロメタルランプ（陽光ランプＤ−４００Ｎ型：東芝）を
使用した。また、鉢植えにして５０cm程度に生育させた
イタリアポプラポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｕｒａ
Ｌ．）を植物を１時間以上に上記の条件で馴化した
後、０．１ppm のオゾンガスに６時間暴露した。

【００２２】実施例２． オゾン暴露したポプラ葉ｍＲ
ＮＡの抽出、精製及びｃＤＮＡの合成 ＲＮＡの抽出はＳＤＳフェノール法 (Brawerman et al.
Anal. Biochem. 72：413-427 (1974), Watanabe et a
l. Proc. Natl. Acad Sci USA 79：6034−6308(1982))
によって行った。約２０ｇのオゾン暴露処理したポプラ
葉を材料に用いた。１００mlの１％ＳＤＳ／５０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＬ（pH８．５）と１００mlの水飽和フェノ
ールを添加しブレンダーとポリトロンを用いてポプラ葉
を破砕した。１５分撹拌した後、３５００rpm で１０分
遠心して上清を採取した。上清に５０mlの水飽和フェノ
ールと５０mlのクロロフォルムを加え１５分撹拌し、３
５００rpm で１０分遠心した。続いて上清を採取し１０
０mlのクロロフォルムを添加し再び１５分撹拌した後３
５００rpm で１０分遠心してｍＲＮＡを含む核酸溶液を
得た。

【００２３】この核酸溶液に酢酸を滴下しpH５．０に調
整した後、核酸溶液の１／２０量の４Ｍ ＮａＣｌと
０．６倍量のイソプロパノールを加え−２０℃に一昼夜
おいた。１３０００rpm 、０℃で１０分遠心して核酸の
沈殿を回収し、これを１０mlの滅菌水に溶解した。０．
６mlの６Ｍ ＬｉＣＬと２５mlのエタノールを加え３時
間氷冷し、１３０００rpm 、０℃で１０分遠心した。沈
殿を再び１０mlの滅菌水に溶解し同様のリチウム沈殿に
よるＲＮＡの精製をもう一度行った。得られた沈殿を７
０％エタノールで洗浄し、少量の滅菌水に溶解しトータ
ルＲＮＡ溶液を得た。最終的に１８mgのＲＮＡが得ら
れ、滅菌水で希釈して濃度４mg／mlに調整した。

【００２４】トータルＲＮＡからｍＲＮＡの精製は(Ban
tle et al. Method in Enzymol. 30：605-612 (1976))
によりｏｌｉｇｏ−（ｄＴ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラ
ムを用いておこなった。その結果、１０mgのトータルＲ
ＮＡから２２０μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡが得られ
た。このうち５μｇを用いて法によってｃＤＮＡの合成
を行った。ｃＤＮＡ合成した後、フェノール抽出してか
らゲル濾過（ＣＬＯＮＴＥＣＨ：ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩ
Ｎ−１００ Ｃｏｌｕｍｕｓ）を行った。最終的に約８
μｇのｃＤＮＡが得られた。

【００２５】実施例３． ポプラｃＤＮＡライブラリー
の作製 合成したｃＤＮＡ５μｇをライゲーションキット（タカ
ラ）をもちいてＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）を連結した。６５℃で１０分熱処理
後、ＡＴＰを加えＴ４カイネースで３７℃、３０分イン
キュベートしてリン酸化を行った。６５℃で１０分熱処
理後、フェノール抽出を行い続いてゲル濾過（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ：Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ ＨＲ−４００ Ｃ
ｏｌｕｍｕｓ）を行った。この様にしてアダプターを連
結したｃＤＮＡ１００ngをベクターλｇｔ１０アーム１
μｇに連結し、この反応液８μｌのうち４μｌをＧｉｇ
ａｐａｃｋ II Ｇｏｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘ
ｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってλファー
ジにパッケージングした。Ｅ．Ｃｏｌｉ ＮＭ５１４株
に感染させてタイターを調べたところ、ライブラリーの
大きさは８×１０⁵pfu ／mlであった。

【００２６】実施例４． １−アミノシクロプロパン−
１−カルボン酸合成酵素ｃＤＮＡをクローニングするた
めのプローブの作製 実施例２で合成した５０ngのｃＤＮＡをテンプレートと
して、配列番号：３及び配列番号：４に示したオリゴヌ
クレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。反応
溶液の組成は終濃度０．２mM ｄＮＴＰｓ／１０mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌpH８．３／５０mM ＫＣｌ／１．５mM
ＭｇＣｌ／０．００１％ゼラチン／１μＭ プライマー
（配列番号：３）／１μＭ プライマー（配列番号：
４）とした。ＰＣＲの反応条件は（１）９４℃で１分、
（２）５５℃で２分、（３）７２℃で３分のサイクルを
５０サイクル行った。これにより約０．５kbのＤＮＡ断
片を増幅することができた。

【００２７】ベクターＰＣＲ^TM II（ｉｎｖｉｔｏｒｏ
ｇｅｎｅ）にサブクローニングしたのち、自動蛍光シ
ークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：ＡＬＦ ｒｅｄ
ＤＮＡシーケンサー）を用いて塩基配列の決定を行っ
た。その結果、２種類のｃＤＮＡ断片が存在し、どちら
も他の植物のＡＣＣ合成酵素のアミノ酸配列と約７０％
の相同性があり、ポプラのＡＣＣ合成酵素であることが
確認できた。また、２種類のｃＤＮＡ断片のお互いの相
同性は約７６％であった。これらのｃＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いることにした。

【００２８】実施例５． ｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニング 作成したｃＤＮＡライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ
Ｍ５１４株に感染させ、プラークを形成させた。角形プ
レート上に約８千個のプラークを形成させた後、ナイロ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍ：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）をプレート
に１分間密着させてファージＤＮＡを写し取った。この
ナイロン膜を変性液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ
ＮａＯＨ）で５分間処理し、続いて中和液（１．５Ｍ
ＮａＣｌ／０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０）で
５分処理した後、濾紙上で風乾した。風乾後、このナイ
ロン膜に５分間紫外線照射を行いＤＮＡを固定し、ハイ
ブリダイゼーションに用いた。

【００２９】スクリーニングに用いるプローブはＰＣＲ
によって取得した２種類のｃＤＮＡ断片をもとにマルチ
プライムＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をも
ちいてα−³²Ｐ ｄＣＴＰにより標識することによって
作成した。スクリーニングの際にはこの２種類のプロー
ブを混合してハイブリダイゼーションを行った。準備し
たファージＤＮＡを写し取ったナイロンメンブレンをハ
イブリダイゼーション溶液（５０％ ｆｏｒｍａｍｉｄ
ｅ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ／５×ＳＳＰＥ／０．１
％ ＳＤＳ／１００μｇ／ml ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｃ
ａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ ＤＮＡ／１μｇ／ml ｐｏｌｙ
Ａ）で４２℃、３時間プレハイブリダイゼーションを行
った。

【００３０】次に、ハイブリダイゼーション液を交換
後、直前に熱変性したα−³²Ｐ ｄＣＴＰで標識した混
合プローブを添加し４２℃で振とうしながら一晩インキ
ュベートした。次いでこのナイロン膜を１×ＳＳＰＥ／
０．１％ ＳＤＳで室温、１０分、２回洗浄し、さら
に、０．１×ＳＳＰＥ／０．１％ ＳＤＳで６５℃、１
５分、２回洗浄した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィル
ムに１昼夜露光させシグナルの検出を行った。

【００３１】この結果、約４０万個のプラークをスクリ
ーニングし、２１個の陽性プラークを取得できた。次
に、２１個の陽性プラークを用いて、準備した２種類の
プローブそれぞれについて２次スクリーニングを行った
ところ、配列番号：３のプローブについては１個の陽性
ファージクローン、配列番号：４のプローブについては
７個の陽性ファージクローンを得ることができた。

【００３２】実施例６． 塩基配列の決定 得られたファージクローンそれぞれについて、ファージ
のクローニングサイト部分の塩基配列をもとにインサー
トＤＮＡを挟むように設計したプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行い、インサートＤＮＡの長さを確認した。その結
果、配列番号：３のプローブから得られたファージクロ
ーンは約２kbp のインサートを有することが確認でき、
ほぼ全長をコードしているだろうことが予想された。配
列番号：４のプローブから得られた７個のファージクロ
ーン中３個のファージクローンが２kbp のインサートを
有することがわかり、同様にこれらについては全長をコ
ードしていると予想された。これらについて制限酵素地
図を作成したところ同一であったので、このうちの１つ
をプラスミドにサブクローニングすることとした。

【００３３】２つのλファージクローンからλ−ＴＲＡ
Ｐ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてファージＤＮＡを調整
した。これらのファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して
アガロースゲル電気泳動によって確認したところ、どち
らのファージＤＮＡも、インサートＤＮＡが単一バンド
で検出でき、内部にＥｃｏＲＩサイトがないだろうと予
想された。そこで、これらのインサートＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで切り出して、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩサイトに
サブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に形
質転換した。ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミ
ドをそれぞれｐＰＮＡＣＣＳ１、及びｐＰＮＡＣＣＳ２
と名付けた。

【００３４】シークエンスに用いるプラスミドの調整は
アルカリＳＤＳ法によって行った。調整したプラスミド
は滅菌水に溶解した後、ＲＮａｓｅ処理、ＰＥＧ沈殿を
行ない精製したものを用いた。シークエンスの反応はＡ
ｕｔｏ Ｒｏａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｔ７ＤＮＡポリメレースによ
って行い、塩基配列の決定はこのサンプルを自動蛍光シ
ークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：ＡＬＦｒｅｄ Ｄ
ＮＡシーケンサー）で泳動することによって行った。ｕ
ｎｉｖｅｒｓａｌプライマーとｒｅｖｅｓｅプライマー
を用いてこれら２種類のｃＤＮＡクローンの両端の塩基
配列を決定したところ、どちらのｃＤＮＡもＡＣＣ合成
酵素の全長を有していることが判明した。

【００３５】ついで、Ｋｉｒｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋ
ｉｔ（タカラ）によりこれらのプラスミドのデリーショ
ンクローンを作製して全塩基配列を決定した。その結
果、ＰＮＡＣＣＳ１は配列番号：１で、ＰＮＡＣＣＳ２
は配列番号：２をしめす配列を有し、他の植物のＡＣＣ
合成酵素遺伝子とアミノ酸レベルで約７０％程度のホモ
ロジーがあることから当該遺伝子をコードするｃＤＮＡ
であることがわかった。

【００３６】実施例７． ＡＣＣ合成酵素活性の測定 取得した２種類のｃＤＮＡは他の植物の遺伝子とのホモ
ロジーからＡＣＣ合成酵素のｃＤＮＡであると判断でき
るが、実際にｃＤＮＡがコードする蛋白質がＡＣＣ合成
酵素活性を有するかどうか、発現ベクターを構築し、大
腸菌で発現させ、その酵素活性を測定する事により確認
を行った。

【００３７】発現ベクターとしてはｐＵＣ１１８を用い
て、フレームが一致するように制限酵素で消化しサブク
ローニングした。配列番号：１のｃＤＮＡについてはＳ
ｓｐＩで消化しＡＣＣ合成酵素をコードする部分を、ｐ
ＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングし
た。また、配列番号：２のｃＤＮＡについてはＤｒａＩ
で消化し、ＡＣＣ合成酵素をコードする部分をｐＵＣ１
１８のＳｍａＩサイトにサブクローニングした。また、
各クローンそれぞれについてセンス、アンチセンス方向
に組み込んだものを作成し、それぞれ、ｐＰＮＡＣＣＳ
１Ｓ，ｐＰＮＡＣＣＳ１Ａ，ｐＰＮＡＣＣＳ２Ｓ、及び
ｐＰＮＡＣＣＳ２Ａと名付けた。これらのプラスミドは
大腸菌に形質転換し、ＩＰＴＧで誘導をかけることによ
って、Ｎ末端に数個の余分な配列が付与されるもののＡ
ＣＣ合成酵素を発現させることができる。

【００３８】これらの４種類のプラスミドを用いて酵素
活性の確認を行った。これらのプラスミドを大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に形質転換し、６６０nmの吸光
度が１．０になるまで培養した。これにＩＰＴＧを添加
し３７℃で２時間更に培養した。また、コントロールと
してはＩＰＴＧを加えないものを用いた。集菌後、菌体
を１mlの１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．５／１０
mM ＥＤＴＡ／１００mM ＮａＣｌ／０．１mM ＰＭＳ
Ｆ／０．２％ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ
に菌体を懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。

【００３９】５０００RPM で遠心し、その上清を１００
mM Ｂｉｃｉｎ−ＫＯＨ pH８．０／１０mM ＰＬＰ
（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５′−ｐｈｏｓｐｈｒｓａｒｕ
ｎｅ）で平衡化したゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ：ＮＡＰ−５）に通した。０．５mlの１００mM Ｂｉ
ｃｉｎ−ＫＯＨ pH８．０／１０mM ＰＬＰでタンパク
質を漏出させた。採取した蛋白質溶液を１００mM Ｂｉ
ｃｉｎ−ＫＯＨ pH８．０／１０mM ＰＬＰで２mlに希
釈してこのうち１．２mlを酵素活性の測定に用い、０．
１ml用いて蛋白質の定量を行った。

【００４０】酵素活性の測定は(Concepcion et al. Ana
lytical Biochem. 100：140-145 (1979)) の方法に準じ
て行った。上記の方法で準備した酵素抽出液を各サンプ
ルにつき０．６mlずつ４mlのバイアル瓶に分注した。バ
イアル瓶の一方には１２．５mMの基質であるＳ−アデノ
シルメチオニンを２４μｌ加え、シリコン栓をして、３
０℃で３０分間インキュベートした。これに氷上でシリ
ンジを用いて０．３mlの１０mMのＨｇＣｌ２を加え酵素
反応を停止させ、更に０．１mlの（飽和ＮａＯＨ：次亜
塩素酸ナトリウム＝２：１）を注入し、氷上に２時間お
いて、精製したＡＣＣよりエチレンを発生させた。

【００４１】また、もう一方はコントロールとして２４
μｌの１２．５mM Ｓ−アデノシルメチオニンと０．３
mlのＨｇＣｌ₂ を加え、３０分、３０℃でインキュベー
トしたものを準備した。次いで、それぞれのバイアル瓶
中のガスを１mlづつ採取し、２mlの活性アルミナカラム
を用いてＦＩＤガスクロマトグラフィー（島津製作所）
によってエチレン発生量を定量し、両者の差からＡＣＣ
合成酵素活性をもとめた。また、エチレン発生量からＡ
ＣＣ生成量を算出するためにＡＣＣ希釈系列から検量線
を作成した。最終的にタンパク量当たりのＡＣＣ合成酵
素活性を求めた。その結果を表１に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】表１で示すようにセンス方向にｃＤＮＡを
組み込んだものでエチレンの発生があり、また、ＩＰＴ
Ｇによる誘導も認められたことから取得した２種類のｃ
ＤＮＡはＡＣＣ合成酵素活性を有することがわかった。実施例８． オゾンによる発現誘導の確認 取得した２種類のＡＣＣ合成酵素遺伝子がオゾンによっ
て誘導されるかどうか、ノーザンハイブリダイゼーショ
ンによって確認した。前述の方法によって、オゾン暴露
した葉と、オゾン暴露してない葉からｐｏｌｙ（Ａ）⁺
ＲＮＡを精製し、それぞれ１０μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺
ＲＮＡをアガロースした。これをナイロン膜（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）にブロティングし、５分
間ＵＶ照射しナイロン膜上にＲＮＡを固定しハイブリダ
イゼーションに用いた。

【００４４】プローブの作成、及び、ハイブリダイゼー
ションは前項（５）に記述した方法で行った。ハイブリ
ダイゼーション終了後、ナイロン膜を洗浄したのち、風
乾した。サランラップに包んで、ＩＰプレート（富士フ
イルム）に１週間露光し、ｂａｓ２０００（富士フイル
ム）によってシグナルの解析をおこなった。その結果、
図１で示したように、今回取得した２種類のＡＣＣ合成
酵素遺伝子がオゾンによって発現が誘導されることが明
らかになった。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、植物のオゾンで誘導され
るＡＣＣ合成酵素の遺伝子が提供される。該遺伝子はオ
ゾン耐性及び浄化植物の開発に有用である。

【００４６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８４６ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇａｒ Ｌ． 配列の特徴： １９４−１６３６ ポプラＡＣＣ合成酵素 配列：

【００４７】 AACCTTGCAT AAAGCTTGTC TCTATTAGTT TATCAATCCT TAACATACGT CTACATATTC 60 GCGCAAGCAA TTACTGCATC AAAAGTCAAG CTCGGTGTAA ATATTTGCTC TCTCAAAACA 120 AATCTTTTTG CTGTGTTTTT TGGTTACAAA TATCTTTGTG AATAAATTTG AAGAAACATT 180 CACGCACAAA AAA ATG GTT TTC AAG TTG AAT AGC CAC TTG TTG TCT AGG 229 Met Val Phe Lys Leu Asn Ser His Leu Leu Ser Arg 1 5 10 ATA GCA AGC AGC GAT GGA CAC GGT GAA GAT TCC CCA TAT TTC GAT GGC 277 Ile Ala Ser Ser Asp Gly His Gly Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Asp Gly 15 20 25 TGG AAA GCC TAT GAC AGT GAT CCC CAT CAT CCC ACG GAC AAT CCA AAT 325 Trp Lys Ala Tyr Asp Ser Asp Pro His His Pro Thr Asp Asn Pro Asn 30 35 40 GGA GTT ATC CAG ATG GGT CTT GCA GAG AAT CAG CTG TGC TTT GAT TTG 373 Gly Val Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Leu Cys Phe Asp Leu 45 50 55 60 ATT CAA GAC TGG CTC AAG AAG AAT CCA AAA GCC TCC ATT TGC AGT CCT 421 Ile Gln Asp Trp Leu Lys Lys Asn Pro Lys Ala Ser Ile Cys Ser Pro 65 70 75 GAA GGA TTA AAT GAG TTC AGA GAG ATA GCC ATC TTT CAA GAC TAT CAT 469 Glu Gly Leu Asn Glu Phe Arg Glu Ile Ala Ile Phe Gln Asp Tyr His 80 85 90 GGC TTG CCG GAA TTT AGA AAT GCT GTA GCA AAC TTC ATG GAA AAA GTG 517 Gly Leu Pro Glu Phe Arg Asn Ala Val Ala Asn Phe Met Glu Lys Val 95 100 105 AGG GGA AAT AGG GTT ACA TTT GAT CCT GAC CGC ATT GTT ATG AGT GGA 565 Arg Gly Asn Arg Val Thr Phe Asp Pro Asp Arg Ile Val Met Ser Gly 110 115 120 GGA GCT ACC GGA GCT CAT GAA ACA ATT GCG TTT TGC TTG GCG GAT CCC 613 Gly Ala Thr Gly Ala His Glu Thr Ile Ala Phe Cys Leu Ala Asp Pro 125 130 135 140 GGC GAG GCA TTT TTG GTT CCT ACT CCT TAT TAT CCA GGA TTT GAT CGA 661 Gly Glu Ala Phe Leu Val Pro Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg 145 150 155 GAT TTG AGA TGG AGA ACA GGG GTT AAA CTC ATT CCA GTT GAC TCT GAT 709 Asp Leu Arg Trp Arg Thr Gly Val Lys Leu Ile Pro Val Asp Ser Asp 160 165 170 AGC TCT AAC AAC TTC ATG GTT ACA AGA GAA GCC TTG GAA AAT GCC TAT 757 Ser Ser Asn Asn Phe Met Val Thr Arg Glu Ala Leu Glu Asn Ala Tyr 175 180 185 GAG AAG GCA CAG TTA GAC AAC ATT AAA GTA AAG GGC TTG CTC ATA ACA 805 Glu Lys Ala Gln Leu Asp Asn Ile Lys Val Lys Gly Leu Leu Ile Thr 190 195 200 AAC CCA TCA AAT CCG TTG GGT ACC ATC CTA GAC AGG GAA ACT CTA CGA 853 Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly Thr Ile Leu Asp Arg Glu Thr Leu Arg 205 210 215 220 AGC ATT GTG AGA TTC ATC AAT GAA AAG AAC ATC CAT TTA GTC TGT GAT 901 Ser Ile Val Arg Phe Ile Asn Glu Lys Asn Ile His Leu Val Cys Asp 225 230 235 GAG ATT TAT GCA GCC ACA GTT TTC AGC CAG CCT GAT TTC ATT AGC GTA 949 Glu Ile Tyr Ala Ala Thr Val Phe Ser Gln Pro Asp Phe Ile Ser Val 240 245 250 CGG AGG ATA CTA CAG GAA GAT ATT GAA TGC AAT CTT GAT CTT GTA CAC 997 Arg Arg Ile Leu Gln Glu Asp Ile Glu Cys Asn Leu Asp Leu Val His 255 260 265 ATT GTT TAC AGT CTC TCA AAG GAC ATG GGC TTC CCT GGC CTC AGG GTT 1045 Ile Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Met Gly Phe Pro Gly Leu Arg Val 270 275 280 GGC ATT ATC TAT TCT TAC AAT GAT GCA GTT GTG AGT TGC GCC CGC AAG 1093 Gly Ile Ile Tyr Ser Tyr Asn Asp Ala Val Val Ser Cys Ala Arg Lys 285 290 295 300 ATG TCA AGC TTC GGA TTG GTA TCC ACA CAA ACT CAG TAC CTG ATA GCA 1141 Met Ser Ser Phe Gly Leu Val Ser Thr Gln Thr Gln Tyr Leu Ile Ala 305 310 315 TCA ATG CTA TCG GAT AAT GAA TTT GTG GAG ATG TTC ATT AGG GAA AGC 1189 Ser Met Leu Ser Asp Asn Glu Phe Val Glu Met Phe Ile Arg Glu Ser 320 325 330 AAA AGG AGA TTA GCC GCA AGG TAT AGA GTC TTC ACT CGT GGA CTT GAT 1237 Lys Arg Arg Leu Ala Ala Arg Tyr Arg Val Phe Thr Arg Gly Leu Asp 335 340 345 CAA GTA GGC ATT GAG TGT TTG AAG ACA AGT AAT GCT GGC CTG TTT TTG 1285 Gln Val Gly Ile Glu Cys Leu Lys Thr Ser Asn Ala Gly Leu Phe Leu 350 355 360 TGG ATG GAT TTG AGT AGA CTC CTC AAA CAG CAG ACA TTT AAA GCT GAA 1333 Trp Met Asp Leu Ser Arg Leu Leu Lys Gln Gln Thr Phe Lys Ala Glu 365 370 375 380 ATG GAA CTA TGG CGA GTT ATA ATC CAT GAA GTC AAG CTC AAC GTT TCG 1381 Met Glu Leu Trp Arg Val Ile Ile His Glu Val Lys Leu Asn Val Ser 385 390 395 CCG GGT TGC TCT TTT CAT TGC TTG AAG CCA GGG TGG TTT AGG GTT TGT 1429 Pro Gly Cys Ser Phe His Cys Leu Lys Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys 400 405 410 TTT GCC AAC ATG GAT GAC GAG ACC ATG CAA GTA GCT TTG TCA AGA ATT 1477 Phe Ala Asn Met Asp Asp Glu Thr Met Gln Val Ala Leu Ser Arg Ile 415 420 425 AAA ACA TTT GTC AAT AAA GAG GCG GAC ACC AAG AAG TCT AGG AAG AAC 1525 Lys Thr Phe Val Asn Lys Glu Ala Asp Thr Lys Lys Ser Arg Lys Asn 430 435 440 TTG CGC TGG CAA GGC AGT CTT AAA CTG CTC AAC TCT CCT CGA ATA TAC 1573 Leu Arg Trp Gln Gly Ser Leu Lys Leu Leu Asn Ser Pro Arg Ile Tyr 445 450 455 460 GAT GAT TTC ATC AAT TCT CCA CAC TCT CCT ATA CCT CAA TCA CCT CTT 1621 Asp Asp Phe Ile Asn Ser Pro His Ser Pro Ile Pro Gln Ser Pro Leu 465 470 475 GTT CGA GCA AGG AAT TAGATGGGGC TCAGATGAAG ATTTATTGTT TAATTCTTAA 1676 Val Arg Ala Arg Asn 480 TTTCCTAGCT CAGGATAGGT ATTCAACTAA GTCCCCCCCC CCCCCCCCCC CAAATATTCA 1736 TCTAATTCAT GTTAAAATGG AACATTTTTT TTTAGGGAAA GTATAATATT GTAGTTGATA 1796 ATAAGAAAAA CAAGTTAAAT AAGGGATAAT TAAAAAAAAA TCTCCTTATT TTATTTCAAA 1856 AAAAAAAA 1864

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：１８６８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇａｒ Ｌ． 配列の特徴： １１９−１５７６ ポプラＡＣＣ合成酵素 配列：

【００４９】 AATTCTCTAG CAGCTACTAT TCCTGGCTAG CTAGCAAGCT CCTTGTGAAA ATTTCTCATA 60 CAAGTTACAC GAAGGTATAT TAATACTTGC TATAGCTAGA TCTTTTAAAG ACAGAGAA 118 ATG GAG AGG CAG CAC CAA CTT TTG TCC AAG ATT GCA ACG AAT GAT AGA 166 Met Glu Arg Gln His Gln Leu Leu Ser Lys Ile Ala Thr Asn Asp Arg 1 5 10 15 CAT GGA GAG AAC TCC CCA TAT TTT GAT GGA TGG AAA GCT TAC GAT AAA 214 His Gly Glu Asn Ser Pro Tyr Phe Asp Gly Trp Lys Ala Tyr Asp Lys 20 25 30 AAC CCT TTT CAC CCT ACT GAC AAC CCC GAT GGA GTA ATA CAA ATG GGT 262 Asn Pro Phe His Pro Thr Asp Asn Pro Asp Gly Val Ile Gln Met Gly 35 40 45 CTA GCA GAA AAT CAG CTT TCC GCT GAT TCG ATT ATA GAC TGG ATC AAG 310 Leu Ala Glu Asn Gln Leu Ser Ala Asp Ser Ile Ile Asp Trp Ile Lys 50 55 60 AAA CAT CCC AAA GCC TCC ATT TGC AAT CCT GAA GGA GTT CAT ATG TTC 358 Lys His Pro Lys Ala Ser Ile Cys Asn Pro Glu Gly Val His Met Phe 65 70 75 80 AAG GAT ATT GCT AAC TTT CAG GAT TAT CAT GGC CTG CCA GAG TTT CGA 406 Lys Asp Ile Ala Asn Phe Gln Asp Tyr His Gly Leu Pro Glu Phe Arg 85 90 95 CAG GCT ATT GCG AAG TTT ATG GGG AGA GTT AGA GGA GGA AGG GTG ACA 454 Gln Ala Ile Ala Lys Phe Met Gly Arg Val Arg Gly Gly Arg Val Thr 100 105 110 TTT GAT CCA GAT CGC ATA GTC ATG AGC GGT GGA GCA ACT GGA GCA AAC 502 Phe Asp Pro Asp Arg Ile Val Met Ser Gly Gly Ala Thr Gly Ala Asn 115 120 125 GAG CTG ATC ATG TTT TGC CTG GCC GAT CCC GGG GAT GCT TTC CTT GTT 550 Glu Leu Ile Met Phe Cys Leu Ala Asp Pro Gly Asp Ala Phe Leu Val 130 135 140 CCT TCT CCT TAC TAT CCT GCA TTC TAT CGA GAC CTT GGA TGG CGC ACT 598 Pro Ser Pro Tyr Tyr Pro Ala Phe Tyr Arg Asp Leu Gly Trp Arg Thr 145 150 155 160 GGG GTC CAG ATT GTT CCA GTT GAC TGC GAT AGC TCA AAC AAT TTC CAG 646 Gly Val Gln Ile Val Pro Val Asp Cys Asp Ser Ser Asn Asn Phe Gln 165 170 175 ATC ACA AAA GTA GCG CTG GAA GCA GCA TAT GAT AAG GCA CAA CAG GAT 694 Ile Thr Lys Val Ala Leu Glu Ala Ala Tyr Asp Lys Ala Gln Gln Asp 180 185 190 GGC ATC AAT GTC AAA GGC TTA ATC ATA ACA AAC CCA TCA AAT CCA CTT 742 Gly Ile Asn Val Lys Gly Leu Ile Ile Thr Asn Pro Ser Asn Pro Leu 195 200 205 GGC ACC ACC TTG GAC AGA GAG ACA CTA AAG TGC CTC TTG AGC TTC ATC 790 Gly Thr Thr Leu Asp Arg Glu Thr Leu Lys Cys Leu Leu Ser Phe Ile 210 215 220 AAT GAG AAA AAC ATA CAC ATA GTC TGC GAT GAA ATT TAT GCT GCG ACC 838 Asn Glu Lys Asn Ile His Ile Val Cys Asp Glu Ile Tyr Ala Ala Thr 225 230 235 240 ATC TTC AGC TCC CAG AAT TTC GTA AGC GTT TCT GAG GTT ATA GAA GAG 886 Ile Phe Ser Ser Gln Asn Phe Val Ser Val Ser Glu Val Ile Glu Glu 245 250 255 GTC ATG GAT TGC AAC CGT GAC CTC ATT CAC ATT GTT TAC AGT CTG TCC 934 Val Met Asp Cys Asn Arg Asp Leu Ile His Ile Val Tyr Ser Leu Ser 260 265 270 AAG GAC ATG GGA CTC CCT GGC TTC AGA GTT GGA ATT GTT TAC TCA TAC 982 Lys Asp Met Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly Ile Val Tyr Ser Tyr 275 280 285 AAC GAT GCA GTT GTT AAT TGC GGC CGA AAG ATG TCA AGT TTT GGT CTG 1030 Asn Asp Ala Val Val Asn Cys Gly Arg Lys Met Ser Ser Phe Gly Leu 290 295 300 GTC TCC TCA CAA ACT CAA TAT TTA CTT GCT TCA ATG CTT TCT GAT GAA 1078 Val Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Leu Leu Ala Ser Met Leu Ser Asp Glu 305 310 315 320 GAG TTT GTC GAG GAT TTC CTA GCC GAG AGC TCG AAG AGG CTA AAG AAA 1126 Glu Phe Val Glu Asp Phe Leu Ala Glu Ser Ser Lys Arg Leu Lys Lys 325 330 335 AGG CAC GGT ATT TTC ACA AAG GGA TTG GAA CAA ATT GGG ATC AGT TGT 1174 Arg His Gly Ile Phe Thr Lys Gly Leu Glu Gln Ile Gly Ile Ser Cys 340 345 350 TTG GAA AGC AAA GCC GGT CTC TTT GTT TGG ATG AAT TTG CGC CAT CTC 1222 Leu Glu Ser Lys Ala Gly Leu Phe Val Trp Met Asn Leu Arg His Leu 355 360 365 CTT AAG GAA CAA ACA AAT GAT GGT GAA ATG GAA CTG TGG CGT GTG ATC 1270 Leu Lys Glu Gln Thr Asn Asp Gly Glu Met Glu Leu Trp Arg Val Ile 370 375 380 GTT AAT GAC GTG AAG CTA AAT GTT TCG CCA GGC TCT TCC TTC CAT TGC 1318 Val Asn Asp Val Lys Leu Asn Val Ser Pro Gly Ser Ser Phe His Cys 385 390 395 400 GTT GAG CCT GGT TGG TTT AGG GTC TGC TTC GCC AAT ATG GAT GAT GAA 1366 Val Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala Asn Met Asp Asp Glu 405 410 415 ACT CTG GAA GTT GCA CTG AAA AGA ATA CAC GCA TTT GTC GGT GAA CAA 1414 Thr Leu Glu Val Ala Leu Lys Arg Ile His Ala Phe Val Gly Glu Gln 420 425 430 AAG GAA AGG GAG ACA TTG TCA ACG AAA ACC AAG GAT ATG CCA TCA AAG 1462 Lys Glu Arg Glu Thr Leu Ser Thr Lys Thr Lys Asp Met Pro Ser Lys 435 440 445 ACC AAG TGC TGG AAG AAG AAT CTT CGG CTC AGC TTC TCA TCT CGT ATA 1510 Thr Lys Cys Trp Lys Lys Asn Leu Arg Leu Ser Phe Ser Ser Arg Ile 450 455 460 TTT GAA GAG GGT ATC GGA TCT CCA ATT GCG ATG TCT CCT CAC TCG CCG 1558 Phe Glu Glu Gly Ile Gly Ser Pro Ile Ala Met Ser Pro His Ser Pro 465 470 475 480 CTT GTT CGA GCA AGG ACT TAATTAAATC CGTAAATTGC ATAGAGTTCT 1606 Leu Val Arg Ala Arg Thr 485 AATCAACTCT ACTGCTAGGT GCTAGCTAGC TACTTGAATA ATGAAATAAG ATTCTTTCGT 1666 CACAGGGAAG GGGCAGTTAA CATTTTTTTC CCATTAATTC AGTAAATGTT TAGAAGTGAA 1726 GGCTGGATGA ACAGCCAATT AATATTCGAA ATTCAATTTA ATGATGTCAA TTTGAAATTC 1786 AAGTGATAAT TGTTCTCCTC CTTTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1846 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1868

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴： １−２６ ｐｒｉｍｅｒ ６，１３，２１，２４ 混合物 配列： ATICARATGG GIYTIGCIGA RAAYCA 26

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴： １−２３ ｐｒｉｍｅｒ ８，１２，２１ 混合物 配列： GTICCIARIG GRTTIGAIGG RTT 23

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＡＣＣ合成酵素遺伝子が０．１ppm オ
ゾン６時間暴露によって発現誘導されることを示すノー
ザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動図で
あり、図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オゾンで誘導される木本植物の１−アミ
   ノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）合成酵素
   遺伝子群。
2. 【請求項２】 配列番号：１又は配列番号：２に示すア
   ミノ酸配列あるいはこのアミノ酸配列に対して１〜少数
   個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾さ
   れているアミノ酸配列を有するオゾンで発現が誘導され
   るポプラ属植物のＡＣＣ合成酵素をコードする遺伝子
   群。
3. 【請求項３】 配列番号：１又は配列番号：２に示す塩
   基配列を有する請求項１に記載の遺伝子群。
4. 【請求項４】 配列番号：１又は配列番号：２に示すア
   ミノ酸配列あるいはこのアミノ酸配列に対して１〜少数
   個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾さ
   れているアミノ酸配列を有するＡＣＣ合成酵素群。