JPH0959296A - New tetrapeptide and angiotensin converting enzyme inhibitory agent - Google Patents

New tetrapeptide and angiotensin converting enzyme inhibitory agent

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JPH0959296A
JPH0959296A JP7237516A JP23751695A JPH0959296A JP H0959296 A JPH0959296 A JP H0959296A JP 7237516 A JP7237516 A JP 7237516A JP 23751695 A JP23751695 A JP 23751695A JP H0959296 A JPH0959296 A JP H0959296A
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tetrapeptide
peptide
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angiotensin converting
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new tetrapeptide having angiotensin converting enzyme inhibiting activity from the treated liquid of laver protein catabolic enzyme. SOLUTION: This peptide is produced by treating laver with a protein catabolic enzyme, this new peptide has the sequence of Pro-Gly-Val-Ala and angiotensin converting enzyme inhibiting activity, antihypertensive effect and extremely small toxic effect.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用性を有
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するテト
ラペプチドならびにそのテトラペプチドを有効成分とす
るアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。 Pro−Gly−Val−Ala (式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。)
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a tetrapeptide having a peptide structure having the following amino acid sequence, which has utility as a medicine, and an angiotensin converting enzyme inhibitor containing the tetrapeptide as an active ingredient. Pro-Gly-Val-Ala (In the formula, each symbol representing an amino acid residue is based on a conventional notation in amino acid chemistry.)

【0002】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】レニン
−アンジオテンシン系が生体の水・電解質および血液の
調節に重要な役割をはたしていることはよく知られてい
る。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテン
シン変換酵素(以下ACEと略記する。)が存在し、ア
ンジオテンシンIはACEによってアンジオテンシンI
Iに変換される。アンジオテンシンIIは強力な昇圧物
質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系ならびに末
梢神経系にはたらいて血圧上昇を促す。また、ACE
は、生体内降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活
性化する作用を有し、昇圧系に関与している。したがっ
て、ACEの活性を阻害することによって血圧を降下さ
せることが可能であり、また、そのことは臨床的に高血
圧症の子防、治療に有効であると考えられている。この
目的のためプロリン誘導体であるカプトプリルが合成さ
れ、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造
研究に基づく種々のACE阻害物質の合成研究が盛んに
行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリ
ル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、
ACE阻害剤は、本態性高血圧症、症候性高血圧症を問
わず、また、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高
血圧症の第1次選択の治療薬中に加えられ、多くの優れ
た点を有することが見出されている。一方、ACE阻害
物質の新しい応用として心不全治療薬としての研究も進
んでいる。ACE阻害物質の作用機序としては、アンジ
オテンシンIIの産生抑制によるアルドステロンやバソ
ブレツシンの分泌抑制、また、腎動脈収縮の解除による
ナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、A
CE阻害物質については、それが、カクレイン−キニン
系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活さ
せることにより末梢血管拡張やナトリウムおよび水の排
泄をさらに促進させると考えられており、心不全の悪循
環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。と
ころで、ACE阻害物質としては、上記の合成品の他に
天然物または天然物由来の物質として蛇毒由来のブラジ
キニン増強因子(C末端がPro)〔S.H.Ferr
eia.et ai/:Biochemistry.
9.3583(1970)〕ゼラチンのコラゲナーゼ消
化由来の6種類のペプチド(いずれもC末端がAla−
Hyp)〔G.Oshima,et al.:Bioc
him.Biophys.Acta.,556,128
(1979)〕、牛カゼインのトリプシン消化物由来の
ペプチド(C末端がGly−Lys)〔S.Maruy
ama,et al.:Agric.Biol.Che
m.,46,1393(1982)〕等が知られている
が、これらのペプチド物質は、いずれも静脈内投与での
効果が確認されているのみであり、経口投与による薬理
効果は、全く不明であり、発見されてから長期間経過し
ているが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報
告はない。
BACKGROUND OF THE INVENTION It is well known that the renin-angiotensin system plays an important role in regulating water / electrolytes and blood in the living body. Angiotensin converting enzyme (hereinafter abbreviated as ACE) exists in this renin-angiotensin system, and angiotensin I is angiotensin I by ACE.
Converted to I. Angiotensin II is a potent pressor substance, which acts on not only blood vessels and adrenal cortex but also central and peripheral nervous systems to promote an increase in blood pressure. Also, ACE
Has an action of degrading and inactivating bradykinin which is an antihypertensive substance in vivo, and is involved in the pressor system. Therefore, it is possible to lower the blood pressure by inhibiting the activity of ACE, and it is considered to be clinically effective in preventing and treating hypertension. For this purpose, the proline derivative captopril was synthesized, and since its antihypertensive effect was confirmed, various ACE inhibitors based on the structure study of captopril have been actively researched, and recently, enarabril maleate, aracebryl and the like. Substances are being offered to clinical sites one after another. Current,
ACE inhibitors are widely used regardless of essential hypertension, symptomatic hypertension, mild or severe, and are added to the first-line treatment of hypertension, and many excellent It has been found to have points. On the other hand, research is also progressing as a therapeutic agent for heart failure as a new application of ACE inhibitors. As the mechanism of action of the ACE inhibitor, suppression of the secretion of aldosterone and vasobretuscin by suppressing the production of angiotensin II, and promotion of excretion of sodium and water by releasing the contraction of renal arteries are considered. Furthermore, A
Regarding CE inhibitors, it is considered that they suppress the inactivation of the kakrein-kinin system and activate the prostaglandin system to further promote peripheral vasodilation and excretion of sodium and water. It is expected as a purposeful therapeutic drug for breaking the vicious circle of. By the way, as the ACE inhibitor, in addition to the above-mentioned synthetic products, as a substance derived from a natural product or a natural product, a snake venom-derived bradykinin enhancing factor (C-terminal is Pro) [S. H. Ferr
eia. et ai /: Biochemistry.
9.3583 (1970)] 6 kinds of peptides derived from collagenase digestion of gelatin (all have C-terminal Ala-
Hyp) [G. Oshima, et al. : Bioc
him. Biophys. Acta. , 556,128
(1979)], a peptide derived from a tryptic digest of bovine casein (C-terminal is Gly-Lys) [S. Maruy
ama, et al. : Agric. Biol. Che
m. , 46, 1393 (1982)], etc., but all of these peptide substances have been confirmed to be effective by intravenous administration, and the pharmacological effect by oral administration is completely unknown. Although it has been a long time since its discovery, there is no report that it is still being developed as a drug.

【0003】[0003]

【課題を解決するための手段】本発明者は、海苔のタン
パク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検
索し、新規なテトラペプチドが強いアンジオテンシン変
換酵素阻害作用を有することを見出した。そして、この
テトラペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭
意行った。その結果、このテトラペプチドが血圧降下作
用を有し、天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害
剤としての有用性を見い出した。本発明は係る知見に基
づくものである。以下に、本発明を詳細に説明する。本
発明に係る新規なテトラペプチドは、次式 Pro−Gly−Val−Ala で示されるL体のアミノ酸の配列を有する新規なテトラ
ペプチドであり、常温における性状は白色の粉末であ
る。
Means for Solving the Problems The present inventor has searched for a substance having a pharmacological action from a decomposition solution of proteolytic enzyme of seaweed and found that a novel tetrapeptide has a strong angiotensin converting enzyme inhibitory action. Then, they have earnestly conducted research to put this tetrapeptide into practical use as a medicine. As a result, they have found that this tetrapeptide has a hypotensive action and is useful as an angiotensin converting enzyme inhibitor derived from a natural product. The present invention is based on such findings. The present invention will be described in detail below. The novel tetrapeptide according to the present invention is a novel tetrapeptide having an L-amino acid sequence represented by the following formula: Pro-Gly-Val-Ala, and is a white powder at room temperature.

【0004】前記のテトラペプチドは、化学的に合成す
る方法または海苔のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新
規なテトラペプチドを化学的に合成する場合には、液相
法または固相法等の通常のペプチド合成方法によって行
うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマ
ー性の固相支持体へテトラペプチドのC末端(カルボキ
シル末端側)からそのアミノ酸残基に対応したL体のア
ミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのがよ
い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、
トリフルオロメタンスルホン酸、フツ化水素等を用いて
ポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖
の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー(以下、HPLCと略記する。)等を
用いた通常の方法で精製すことができる。
The above-mentioned tetrapeptide can be chemically synthesized or separated and purified from a decomposed solution of seaweed proteolytic enzyme. In the case of chemically synthesizing the novel tetrapeptide according to the present invention, it can be carried out by an ordinary peptide synthesis method such as a liquid phase method or a solid phase method, but preferably, a solid polymer method is used by the solid phase method. It is preferable that the L-amino acid corresponding to the amino acid residue is sequentially bound to the phase support from the C-terminal (carboxyl terminal side) of the tetrapeptide by a peptide bond. And the synthetic peptide thus obtained is
After cleaving from the polymeric solid-phase support using trifluoromethanesulfonic acid, hydrogen fluoride, etc., the protecting group of the amino acid side chain was removed, and high-performance liquid chromatography (hereinafter, HPLC) using a reversed-phase column was used. It is abbreviated.) And the like.

【0005】上記したように、本発明に係る新規なテト
ラペプチドは海苔のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製することができるが、その場合には、例えば、以
下のようにして行うことができる。上記の新規なテトラ
ペプチドを含有している海苔部分を取り出し加水分解す
る。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等
のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、海苔を必
要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適値に調整
し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応
じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。そ
の加水分解液を濾紙および/またはセライト等を用いて
瀘過することによって不溶性成分を除去し、得られた濾
液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒(例え
ば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衡液
等)中で十分に透折し、その濾液中の成分で半透膜を通
過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂(例え
ば、ダウケミカル社製のDowex 50W等)にか
け、その吸着溶出画分からACE(アンジオテンシン変
換酵素)阻害活性を有する成分を含有する画分を得、得
られたACE阻害活性画分をゲル濾過(例えば,ファル
マシア製の Sephadex G−25等)によって
分画し、得らたACE阻害活性画分を陽イオン交換ゲル
瀘過(例えば、ファルマシア社製の SP−Sepha
dex C−25等)によって分画し、得られたACE
阻害活性画分を更に逆相HPLCによって分画する。
As described above, the novel tetrapeptide according to the present invention can be separated and purified from the degradation solution of proteolytic enzyme of seaweed. In that case, for example, it can be performed as follows. . The seaweed portion containing the novel tetrapeptide is taken out and hydrolyzed. Hydrolysis is performed according to a conventional method. For example, when hydrolyzing with a proteolytic enzyme such as pepsin, the seaweed is further hydrolyzed if necessary, then adjusted to the optimum value of the enzyme, and the enzyme is added and incubated. Then, after neutralizing as necessary, the enzyme is deactivated to obtain a hydrolyzed solution. The hydrolyzed solution is filtered with filter paper and / or Celite to remove insoluble components, and the obtained filtrate is filtered with a semipermeable membrane such as cellophane to obtain a suitable solvent (eg, Tris-hydrochloric acid buffer solution). , A buffer solution containing a neutral buffer solution, etc.) and a solution containing the components of the filtrate that have passed through the semipermeable membrane are treated with a strongly acidic cation exchange resin (eg, Dow Chemical). Dowex 50W, etc.) to obtain a fraction containing a component having an ACE (angiotensin converting enzyme) inhibitory activity from the adsorbed and eluted fraction, and the obtained ACE inhibitory activity fraction is subjected to gel filtration (for example, manufactured by Pharmacia). Sephadex G-25, etc.), and the resulting ACE inhibitory activity fraction is filtered through a cation exchange gel (for example, SP-Sepha manufactured by Pharmacia).
ACE obtained by fractionation by dex C-25 etc.)
The inhibitory activity fraction is further fractionated by reverse phase HPLC.

【0006】この新規なテトラペプチドは、静脈内への
繰返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフ
イラキシーショックを起こさない。また、このテトラペ
プチドはL−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与
後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為,
毒性は極めて低く安全性は極めて高い(LD50>50
00mg/Kg:ラット経口投与)。本発明に係る新規
なテトラペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物
を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に
調整することができる。投与法としては、通常は、AC
Eを有している哺乳類(例えば、ヒト、イヌ、ラット
等)に注射すること、あるいは経口投与することがあげ
られる。投与量は、例えば、動物体重1kg当りこのテ
トラペプチドを0.01〜10mgの量である。投与回
数は、通常、日1〜4回程度であるが、投与経路によっ
て、適宜、調整することができる。上記の各種製剤にお
いて用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に
限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるい
はカプセル剤に用いられるものを使用することができ
る。
This novel tetrapeptide does not induce antibody production or anaphylactic shock when it is repeatedly administered intravenously. In addition, since this tetrapeptide has a sequence structure of only L-amino acids and is gradually decomposed by in vivo protease after administration,
Very low toxicity and very high safety (LD 50 > 50
00 mg / Kg: Rat oral administration). The novel tetrapeptide according to the present invention can be prepared into injections, tablets, capsules, granules, powders and the like using additives such as commonly used excipients. The administration method is usually AC
Examples include injection into a mammal having E (eg, human, dog, rat, etc.) or oral administration. The dosage is, for example, 0.01 to 10 mg of this tetrapeptide per 1 kg of animal body weight. The frequency of administration is usually about 1 to 4 times a day, but it can be appropriately adjusted depending on the administration route. The kinds of excipients, binders and lubricants used in the above-mentioned various preparations are not particularly limited, and those used for ordinary injections, powders, granules, tablets or capsules can be used. .

【0007】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等;結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等;崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカリウム塩類;滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要
に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の
矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、
常法により、本発明に係る新規なテトラペプチドを、注
射用水、生理食塩液およびキシリトールやマンニトール
などの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポ
リエチレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁
させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防
腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができ
る。本発明の新規なテトラペプチドを含有する製剤は凍
結乾燥品または乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解
剤、例えば水または生理食塩液にて溶解して用いること
もできる。
The following may be mentioned as additives used for tablets, capsules, granules and powders. Excipients include sugars such as crystalline cellulose, sugar alcohols such as mannitol, starches, anhydrous calcium phosphate and the like; binders such as starch and hydroxypropylmethylcellulose; disintegrants carboxymethylcellulose and its potassium salts; lubricants. Examples of the lubricant include stearic acid and its salts, talc, and waxes. In preparation of the preparation, menthol, citric acid and salts thereof, and flavoring agents such as fragrances can be used if necessary. The sterile composition for injection is
By a conventional method, the novel tetrapeptide according to the present invention is dissolved or suspended in water for injection, physiological saline, sugar alcohol injection such as xylitol or mannitol, or glycol such as propylene glycol or polyethylene glycol to give an injection. be able to. At this time, buffers, preservatives, antioxidants and the like can be added as necessary. The preparation containing the novel tetrapeptide of the present invention may be in the form of a lyophilized product or a dry powder, and may be dissolved in an ordinary solubilizer such as water or physiological saline before use.

【0008】本発明に係る新規なテトラペプチドは、優
れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降
下作用、ブラジキニン不活性抑制作用を示す。したがっ
て、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血
圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病
態において用いられる血圧降下剤として有用であり、更
にうつ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後
の改善(延命効果)作用を有し、心不全の治療剤として
有用である。
The novel tetrapeptide according to the present invention has an excellent angiotensin converting enzyme inhibitory action, and exhibits a blood pressure lowering action and a bradykinin inactivity suppressing action. Therefore, essential hypertension, renal hypertension, prophylactic and therapeutic agents for hypertension such as adrenal hypertension, useful as a diagnostic agent for these diseases and as a blood pressure lowering agent used in various pathological conditions, and further for organs for congestive heart failure. It has normalization of circulation and improvement of long-term prognosis (life extension effect), and is useful as a therapeutic agent for heart failure.

【0009】[0009]

【実施例】以下に実施例として、製造例及び試験例を記
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例1 風乾した新鮮海苔50gに脱イオン水2lを加えてホモ
ジナイズした。得られた海苔ホモジネイトにペプシン
1.5gを加え、pH2.0に調整して37℃で20時
間インキュベイトした。このようにして調製した海苔ホ
モジネイトのペプシン分解液をDiaflow膜(アミ
コン社製、YM10型膜、分画分子量1万)を用いて限
外濾過した。得られ濾過液をDowex 50WX4
(H)を充填したカラムを用いてクロマトグラフ処理
した。脱イオン水で水洗し、溶出は2N−NHOHで
行い溶出液を濃縮した。この濃縮液をSephadex
G−25カラムによりカラムクロマトグラフ処理して
ペプチド画分(分画番号25〜45番)を分離した。そ
のカラムクロマトグラムを図1に示した。このペプチド
画分を濃縮して海苔ペプチド液を得た。さらにこのペプ
チド液をSP−Sephadex C−25(H)カ
ラムによりカラムクロマトグラム処理して各ペプチド画
分としてSP−1画分(分画番号10〜28番)、SP
−2画分(分画番号29〜40番)およびSP−3画分
(分画番号41〜55番)を分離した。そのカラムクロ
マトグラムを図2に示した。これらペプチド画分を凍結
乾燥してペプチドパウダー(以下、海苔ペプチドと称
す。)として、SP−1画分2.2g(IC50値0.
91mg/ml)、SP−2画分4.5g(IC
501.5mg/ml)およびSP−3画分7.3g
(IC50値10.2mg/ml)を得た。このように
して分画した海苔ペプチドの中で、ACE阻害活性の高
いSP−1画分のペプチドパウダーを脱イオン水に溶解
した後HPLCを行った。条件はカラムとして野村化学
(株)製Develosil ODS−5(φ4.6m
mIDX25cm L)を使用し、移動相として0.0
5%トリフルオロ酢酸(以下、TFAと略記する。)か
ら25%アセトニトリル/0.05%TFAの濃度勾配
法により、流速1.0ml/min、検出波長220n
mでクロマトグラフ処理し、溶出時間48.192分に
強いACE阻害作用を有するペプチドフラグメントを得
た。その結果は図3に示すとおりである。このようにし
て得られたACE阻害作用を有するペプチドのアミノ酸
配列は、アプライドバイオシステム(ABI)社製のプ
ロテインシーケンサー477A型を用いて決定された。
その結果、次式 Pro−Gly−Val−Ala で示されるL体のアミノ酸残基からなる配列を有するテ
トラペプチドであることが確認さた。なお本発明におい
て、SP−Sephadex C−25(H)カラム
クロマトグラフ中の各ペプチド画分(SP画分)のペプ
チド含量(希釈率で表す。)とACE阻害率%との関係
としては図4のような結果が得られた。又、各ペプチド
画分(SP画分)のアミノ酸組成比%として図5のよう
な結果が得られた。本発明に係わる海苔ペプチドをAC
E阻害剤として例えば錠剤に製剤する場合には、常法に
したがって例えば次のように処理すればよい:(1)ペ
プチド13g、(2)乳糖87g、(3)コーンスター
チ29g、(4)ステアリン酸マグネシウム1gを原料
とし、先ず(1)、(2)及び17gのコーンスターチ
を混和し、7gのコーンスターチから作ったペーストと
ともに顆粒化し、この顆粒に5gのコーンスターチと
(4)とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠
し、錠剤1000個を製造する。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail by describing production examples and test examples as examples. Production Example 1 2 l of deionized water was added to 50 g of air-dried fresh seaweed and homogenized. 1.5 g of pepsin was added to the obtained seaweed homogenate to adjust the pH to 2.0, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 20 hours. The pepsin-decomposed solution of the seaweed homogenate thus prepared was subjected to ultrafiltration using a Diaflow membrane (YM10 type membrane manufactured by Amicon, fractionated molecular weight 10,000). The resulting filtrate is Dowex 50WX4
Chromatography was performed using a column packed with (H + ). After washing with deionized water, elution was performed with 2N-NH 4 OH and the eluate was concentrated. This concentrate is Sephadex
Column chromatography was performed on a G-25 column to separate peptide fractions (fraction numbers 25 to 45). The column chromatogram is shown in FIG. This peptide fraction was concentrated to obtain a laver peptide solution. Further, this peptide solution was subjected to column chromatogram treatment with an SP-Sephadex C-25 (H + ) column to give SP-1 fractions (fraction numbers 10 to 28) and SP as respective peptide fractions.
-2 fraction (fraction number 29-40) and SP-3 fraction (fraction number 41-55) were separated. The column chromatogram is shown in FIG. These peptide fractions were freeze-dried to give 2.2 g of SP-1 fraction (IC 50 value of 0.50) as peptide powder (hereinafter referred to as laver peptide).
91 mg / ml), SP-2 fraction 4.5 g (IC
50 1.5 mg / ml) and SP-3 fraction 7.3 g
(IC 50 value 10.2 mg / ml) was obtained. Among the seaweed peptides thus fractionated, the peptide powder of the SP-1 fraction having high ACE inhibitory activity was dissolved in deionized water and then subjected to HPLC. The conditions are as a column, Develosil ODS-5 (φ4.6 m, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.
mIDX 25 cm L) and 0.0 as the mobile phase
By a concentration gradient method of 5% trifluoroacetic acid (hereinafter abbreviated as TFA) to 25% acetonitrile / 0.05% TFA, flow rate 1.0 ml / min, detection wavelength 220 n
Chromatographic treatment with m gave a peptide fragment having a strong ACE inhibitory action at an elution time of 48.192 minutes. The result is as shown in FIG. The amino acid sequence of the thus obtained peptide having an ACE inhibitory action was determined using a protein sequencer type 477A manufactured by Applied Biosystems (ABI).
As a result, it was confirmed to be a tetrapeptide having a sequence consisting of L-form amino acid residues represented by the following formula: Pro-Gly-Val-Ala. In the present invention, the relationship between the peptide content (represented by the dilution rate) of each peptide fraction (SP fraction) in the SP-Sephadex C-25 (H + ) column chromatograph and the ACE inhibition rate% is shown. A result like 4 was obtained. Further, the results as shown in FIG. 5 were obtained as the amino acid composition ratio% of each peptide fraction (SP fraction). The laver peptide according to the present invention is AC
When a tablet is prepared as an E inhibitor, for example, it may be treated according to a conventional method as follows: (1) Peptide 13 g, (2) Lactose 87 g, (3) Corn starch 29 g, (4) Stearic acid Using 1 g of magnesium as a raw material, first, (1), (2) and 17 g of corn starch were mixed, and granulated with a paste made from 7 g of corn starch, and 5 g of corn starch and (4) were added to this granule to obtain The mixture is compressed on a compression tableting machine to produce 1000 tablets.

【00010】製造例2 本例は、合成法による製造例である。 Pro−Gly−Val−Alaの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
430A型を用いた固相法によって当該テトラペプチド
を合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体(ポリスチレン樹脂)をクロロメチル化
した樹脂を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミ
ノ酸配列に従って、常法どおり、そのC末端側Proか
らクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得
た。このときのアミノ酸は、t−ブトキシカルボニル
(以下t−Bocと略記す。)基で保護されたt−Bo
cアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエ
タンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁
し、室温で10分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸
を加え、さらに10分間撹拌した。この混合液にトリフ
ルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で30分間撹拌
した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて
分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、
減圧下で乾燥した。このようにして得られた末精製の合
成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムC
18(5μ)を用いたHPLCにより精製した。移動相
として(A)0.1%TFA含有蒸留水、(B)0.1
%TFA含有アセトニトリル溶液を使用し、(A)液が
20分間で97%→77%の濃度勾配法により流速1.
5ml/minでクロマトグラフィーを行った。紫外部
波長215nmで検出し、最大の吸収を示した溶出画分
を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする
合成テトラペプチドを得た。
Production Example 2 This example is an example of production by a synthetic method. Pro-Gly-Val-Ala Synthesis Method The tetrapeptide was synthesized by a solid phase method using an automated peptide synthesizer model 430A manufactured by Applied Biosystems. As the solid support, a resin obtained by chloromethylating a styrene-divinylbenzene copolymer (polystyrene resin) was used. First, according to the amino acid sequence of the tetrapeptide, a C-terminal side Pro was reacted with a chloromethyl resin according to a conventional method to obtain a peptide-bonded resin. The amino acid at this time is t-Bo protected with a t-butoxycarbonyl (hereinafter abbreviated as t-Boc) group.
c amino acid was used. Next, the peptide-bonded resin was suspended in a mixed solution of ethanedithiol and thioanisole, stirred at room temperature for 10 minutes, trifluoroacetic acid was added under ice cooling, and the mixture was further stirred for 10 minutes. Trifluoromethanesulfonic acid was added dropwise to this mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, anhydrous ether was added to precipitate and separate the product, and the precipitate was washed several times with anhydrous ether.
Dry under reduced pressure. The thus-purified synthetic peptide thus obtained was dissolved in distilled water and then subjected to reverse phase column C.
Purified by HPLC using 18 (5μ). As a mobile phase, (A) 0.1% TFA-containing distilled water, (B) 0.1
% TFA-containing acetonitrile solution was used, and the solution (A) had a flow rate of 1.% by a gradient method of 97% → 77% in 20 minutes.
Chromatography was performed at 5 ml / min. The elution fraction showing the maximum absorption, which was detected at an ultraviolet wavelength of 215 nm, was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic tetrapeptide.

【0011】この合成テトラペプチドをマススペクトル
により分折した結果、次式 Pro−Gly−Val−Ala なるアミノ酸配列構造を有するテトラペプチドであるこ
とが確認された。このマススペクトルの結果は図6に示
すとおりである。合成によって得られた本発明のテトラ
ペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認さ
れた。
As a result of mass spectrometry of this synthetic tetrapeptide, it was confirmed to be a tetrapeptide having an amino acid sequence structure represented by the following formula: Pro-Gly-Val-Ala. The result of the mass spectrum is as shown in FIG. The pharmacological effect of the tetrapeptide of the present invention obtained by synthesis was confirmed by the following tests.

【0012】試験例1 (アンジオテンシン変換酵素阻害活性)ACE(シグマ
社製、酵素番号 EC3.4.15.1)2.5mU、
合成基質Hippuryl−L−histidyl−L
−leucine(ペプチド研究所製)12.5mMを
用いLiebermanの測定方法を改良した山本等の
方法[日胸疾会誌,18,297−302(198
9)]に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を
酢酸エチルにて抽出し、225nmの吸光度で測定し
た。被検液での吸光度をEs、被検液の代わりに緩衝液
を加えた時の値をEc、予め反応停止液を加えて反応さ
せた時の値をEbとして次式から阻害率を求めた。 阻害率(%)=(Ec−Es)/(Ec−Eb)×10
0 ACE阻害剤の阻害活性IC50値は、ACEの酵素活
性を50%(阻害率)阻害するために必要な試料の濃度
(M)で示した。本発明に係る新規なテトラペプチドの
牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性
IC50値は9.5×10−7Mである。
Test Example 1 (Angiotensin converting enzyme inhibitory activity) 2.5 mU of ACE (manufactured by Sigma, enzyme number EC3.4.5.1)
Synthetic substrate Hippuryl-L-histidyl-L
-Leucine (manufactured by Peptide Institute) 12.5 mM and improved method of Lieberman measurement [Yamamoto et al., 18, 297-302 (198)
9)]. That is, the produced hippuric acid was extracted with ethyl acetate and the absorbance was measured at 225 nm. The absorbance in the test solution was Es, the value when the buffer solution was added instead of the test solution was Ec, and the value when the reaction stop solution was added in advance and the reaction was Eb, and the inhibition rate was calculated from the following equation. . Inhibition rate (%) = (Ec−Es) / (Ec−Eb) × 10
0 The inhibitory activity IC 50 value of the ACE inhibitor was shown as the concentration (M) of the sample required to inhibit the enzyme activity of ACE by 50% (inhibition rate). The inhibitory activity IC 50 value of the novel tetrapeptide of the present invention against angiotensin converting enzyme of bovine lung serum is 9.5 × 10 −7 M.

【0013】試験例2 (ラットへ投与時の降圧効果)実験動物は日本チャール
ズ・リバー(株)より15週令雄性高血圧自然発症ラッ
ト(SHR)を購入し、1週間の予備飼育後、収縮期血
圧が160mmHg以上(体重280〜330g)の動
物3匹1群として用いた。血圧は非観血的尾動脈血圧測
定装置(株)理研開発製、PS−100)を用いtai
l−cuff法により、投与前、投与後1時間、2時
間、4時間、5時間のSHR尾動脈の収縮期血圧(SB
P)、平均血圧(MBP)および拡張期血圧(DBP)
の測定を測定時間毎に5回おこない、得られた測定値の
最高値と最低値を棄却し、3回の平均値をもって各時間
の測定値とした。それぞれの変動値は、投与直前の平均
値を0時間の測定値とし、各時間の平均値より0時間の
平均値を減じその差を求めて算出した。合成テトラペプ
チド10mg/kgをSHRに経口投与した時の血圧値
への作用についての結果は、図7に示すとおりである。
以上の試験の結果、本発明に係るテトラペプチドはアン
ジオテンシン変換酵素害活性を有し、in vivo
(生体内)においても有意な血圧降下作用を示すことが
確認された。したがって、本発明に係るテトラペプチド
は高血圧症の治療または予防薬として有用である。な
お、本発明に係るテトラペプチドは、構造的にそのアミ
ノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に
採用することもできる。
Test Example 2 (Hypotensive effect when administered to rats) As a test animal, 15-week-old male spontaneously hypertensive rats (SHR) were purchased from Japan Charles River Co., Ltd. The animals were used as a group of 3 animals having a blood pressure of 160 mmHg or more (body weight 280 to 330 g). Blood pressure was measured using a non-invasive caudal artery blood pressure measuring device, PS-100, manufactured by Riken Development Co., Ltd.
By the l-cuff method, the systolic blood pressure (SB) of the SHR tail artery before administration and 1 hour, 2 hours, 4 hours, and 5 hours after administration.
P), mean blood pressure (MBP) and diastolic blood pressure (DBP)
Was measured 5 times every measurement time, the highest value and the lowest value of the obtained measurement values were rejected, and the average value of 3 times was taken as the measurement value of each time. Each variation value was calculated by taking the average value immediately before administration as the measured value at 0 hours, subtracting the average value at 0 hours from the average value at each time, and calculating the difference. The results on the effect on blood pressure when orally administering 10 mg / kg of synthetic tetrapeptide to SHR are as shown in FIG. 7.
As a result of the above test, the tetrapeptide according to the present invention has angiotensin converting enzyme harmful activity and
It was confirmed that (in vivo) also shows a significant blood pressure lowering effect. Therefore, the tetrapeptide according to the present invention is useful as a therapeutic or prophylactic drug for hypertension. The tetrapeptide according to the present invention can also be employed in the structure of a peptide having a partial structure of its amino acid sequence structurally.

【0014】[0014]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】本発明に係わる海苔ペプシン分解液の、製造例
1におけるSepadexG−25カラムクロマトグラ
フィーによるACE阻害ペプチドの分離精製の結果を示
す図である。尚、図中マーカーとして分子量200万の
ブルーデキストラン、分子量1335のビタミンB12
を用いた。
FIG. 1 is a view showing the results of separation and purification of an ACE-inhibiting peptide by Sepadex G-25 column chromatography in Production Example 1 of a seaweed pepsin degradation solution according to the present invention. In addition, as a marker in the figure, blue dextran having a molecular weight of 2 million and vitamin B 12 having a molecular weight of 1335 are used.
Was used.

【図2】本発明に係る海苔ペプチドの、製造例1におけ
るSP−Sephadex C−25(H)カラムク
ロマトグラフィーによるACE阻害ペプチドの分離精製
の結果を示す図である。
FIG. 2 is a diagram showing the results of separation and purification of the seaweed peptide of the present invention by SP-Sephadex C-25 (H + ) column chromatography in Production Example 1.

【図3】本発明に係わるテトラペプチドの、製造例1に
おける逆相HPLCによるACE阻害ペプチドフラグメ
ントの分離精製の結果を示す図である。
FIG. 3 is a diagram showing the results of separation and purification of an ACE-inhibiting peptide fragment of the tetrapeptide according to the present invention by reverse phase HPLC in Production Example 1.

【図4】本発明に係わる海苔ペプチドの、製造例1にお
けるSP画分のペプチド含量(希釈率)とACE阻害率
%との関係を示す図である。
FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the peptide content (dilution rate) of the SP fraction in Production Example 1 and the ACE inhibition rate% of the laver peptide according to the present invention.

【図5】本発明に係わる海苔ペプチドの、製造例1にお
けるSP画分のアミノ酸組成比%を示す図である。
FIG. 5 is a view showing the amino acid composition ratio% of the SP fraction in Production Example 1 of the laver peptide according to the present invention.

【図6】本発明に係わるテトラペプチドの、製造例2で
得られた合成テトラペプチドのマススペクトルを示す図
である。
FIG. 6 is a diagram showing a mass spectrum of the synthetic tetrapeptide obtained in Production Example 2 of the tetrapeptide according to the present invention.

【図7】製造例2で得られた合成テトラペプチド10m
g/kgを、SHRに経口投与した場合の血圧値(収縮
期血圧、平均血圧および拡張期血圧)の経時的変化を示
す図である。
FIG. 7: Synthetic tetrapeptide 10m obtained in Production Example 2
It is a figure which shows the time-dependent change of the blood pressure value (systolic blood pressure, average blood pressure, and diastolic blood pressure) when g / kg is orally administered to SHR.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 次式;Pro−Gly−Val−A
la で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチド。
1. The following formula: Pro-Gly-Val-A
A novel tetrapeptide having a peptide structure consisting of the L-amino acid sequence represented by la.
【請求項2】 次式;Pro−Gly−Val−A
la で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
2. The following formula: Pro-Gly-Val-A
An angiotensin-converting enzyme inhibitor, which comprises, as an active ingredient, a novel tetrapeptide having a peptide structure represented by the L-amino acid sequence represented by la.
JP7237516A 1995-08-11 1995-08-11 Novel tetrapeptide and angiotensin converting enzyme inhibitors Expired - Lifetime JP2678180B2 (en)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004244359A (en) * 2003-02-13 2004-09-02 Shirako:Kk Vasodilative pharmaceutical and health food composition
CN102495169A (en) * 2011-11-16 2012-06-13 江南大学 Purifying and analyzing identification method for anti-oxidative peptide after controlled-enzymatic hydrolysis of laver

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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