JPH09512427A

JPH09512427A - Cardiotrophin and its use

Info

Publication number: JPH09512427A
Application number: JP7527676A
Authority: JP
Inventors: ベイカー，ジョフレ; チェン，ケネス; キング，キャスリーン; ペニカ，ダイアン; ウッド・ウィリアム
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-06
Publication date: 1997-12-16
Anticipated expiration: 2022-04-18
Also published as: US5679545A; AU2635395A; US5624806A; DE69535221D1; CA2188017A1; US5723585A; ES2276393T3; US5627073A; DK0755446T3; AU697165B2; DE69535221T2; EP0755446B1; JP3906314B2; MX9604985A; CA2188017C; US5571675A; WO1995029237A1; EP0755446A1; ATE339503T1

Abstract

Isolated CHF, isolated DNA encoding cardiac hypertrophy factor (CHF), and recombinant or synthetic methods of preparing CHF are disclosed. These CHF molecules are shown to influence hypertrophic activity and neurological activity. Accordingly, these compounds or their antagonists may be used for treatment of heart failure, arrhythmic disorders, inotropic disorders, and neurological disorders.

Description

【発明の詳細な説明】カルジオトロフィンおよびその使用発明の分野この発明は心不全の処置における心機能調節および神経学的疾患の処置における神経機能調節のための心臓肥大因子（カルジオトリフィンとも呼ばれる）に関する。発明の背景心不全は約３００万人の米国人が罹患し、毎年約４０万人に発症している。最近ではこれが米国における主な入院診断の一つである。急性心筋梗塞を含む急性心臓病の管理における最近の進歩は結局慢性心臓病に進行する患者人口の拡大を招いている。心不全の最近の療法は一次的にはアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿剤の使用を指向している。ＡＣＥ阻害剤は心不全における生存を延長する一方、最終段階心不全に向けた進行を遅らせ、ＡＣＥ阻害剤を投与されている患者の多数が機能的に第１１１級心不全を持っている。さらに、ＡＣＥ阻害剤は心不全患者の６０％以上では症状緩和ができず、心不全による死亡の約１５〜２０％しか減少しないことが確実と思われる。心移植はドナー心臓の入手可能性により限定される。さらに、ジゴキシンを除いて、筋変力作用陽性剤の長期的投与には、たとえば不整脈惹起、突然死、その他の有害副作用のような生存に関わる副作用を伴わない有用な薬剤はない。これら現用療法の欠陥は別の治療的手法に対する必要性を示唆する。広範なデータは心不全初期における病理学的心筋肥大は心室の拡張、壁張力／ストレスの増加、心筋細胞の長さ対幅の増加、および随伴する心臓の性能および機能の減弱に特徴付けられて、有害であり得ることを示唆する。研究によれば、生理学的または代償性肥大の活性化は心不全には有益であり得る。実際、ＡＣＥ阻害剤の効果は心臓の負荷を除くことを意図するのみでなく、心筋層内の局所的レニン−アンギオテンシン系に関連すると予想される病理学的肥大性反応を阻止することも意図されている。分子生物学的水準では心臓は筋細胞および周囲の非筋細胞と呼ばれる支持細胞の合胞体として機能する。非筋細胞は本質的に線維芽細胞／間葉細胞であるが、それらは内皮細胞および平滑筋細胞も包含する。実際、筋細胞は成人心筋層量の殆どを構成するが、心臓中に存在する細胞数全体の約３０％であるに過ぎない。生体内で心筋細胞と近接した関係の故に、非筋細胞は筋細胞成長および／または発育に影響を与えることができる。この相互作用は細胞−細胞接触を通じて直接にまたはパラクリン因子の生産を経て間接に介在しうる。このような生体内での関係は、非筋細胞数とそれによって相互作用している細胞外マトリックスとの双方が心筋層肥大においておよび損傷および梗塞に反応して増加するので重要である。これらの変化は異常な心筋層機能に関連している。心臓の筋細胞は出生直後から分割不能である。それ以上の成長は各細胞の肥大を通じて起きる。筋細胞肥大の細胞培養モデルが開発されて心臓筋細胞肥大の機序に対する理解を深めた。Ｓｉｍｐｓｏｎなど、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、５１巻：７８７〜８０１頁（１９８２年）；Ｃｈｉｅｎなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、５巻：３０３７〜３０４６頁（１９９１年）。培養心臓筋細胞の研究は殆どが非筋細胞の夾雑を最小化するように設計されている。例えば、ＳｉｍｐｓｏｎとＳａｖｉｏｎ、Ｃｉｒｃ．ＣＲｅｓ．、５０巻：１０１〜１１６頁（１９８２年）；Ｌｉｂｂｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１６巻：８０３〜８１１頁（１９８４年）；Ｉｗａｋｉなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１３８０９〜１３８１７頁（１９９０年）参照。Ｓｈｕｂａｉｔａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：２０５５５〜２０５６２頁（１９９０年）は肥大反応を活性化できる、たとえばエンドセリン −１のような、ペプチド由来成長因子を確認するための培養モデルの有用性を記載した。Ｌｏｎｇなど、Ｃｅｌｌ・Ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ、２巻：１０８１〜１０９５頁（１９９１年）は心臓筋細胞の培養中での成長に関する心臓非筋細胞の影響を研究した。筋細胞肥大性成長は非筋細胞数を漸増した高密度培養においておよび非筋細胞数を漸増した共培養において促進された。筋細胞の寸法に及ぼす非筋細胞のこの効果は非筋細胞培養物により調整された血漿不含培地によって再現できた。この培養物中の主な筋細胞成長促進活性はヘパリン結合性であった。この成長因子の諸性質を心筋層に存在することが知られている線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、およびトランスフォーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１）を包含する種々の成長因子と比較した。Ｌｏｎｇなどの成長因子は他の公知成長因子よりも大きく、およびＰＤＧＦを除くこれら成長因子全部のものとは異なるヘパリン−セファロース溶離特性を持つことが見出された。さらに、これはＰＤＧＦ特異性抗体によっては中和されなかった。著者はこれが心臓筋肉細胞の成長および発達に重要なパラクリン関係を規定することを提唱した。欝血性心不全のような心不全治療改善への要求があるのみでなく、神経学的疾患に有効な処置を提供することにも要求がある。インスリン様成長因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、および毛様体神経栄養因子のような神経栄養因子がニューロンの生存を強化する、例えば筋萎縮性軸索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、および末梢性神経障害のような神経変性病のようなものの処置のための潜在的方法として提唱されている。これらの目的に別の療法を加えて提供することは望ましいものである。それ故、本発明の目的の一つは欝血性心不全のような心不全の予防および／または処置、殊に生理学的な型の肥大の促進または病理学的な型の肥大の阻止、および末梢性神経障害のような神経学的疾患の予防および／または処置のための改善された療法を提供することである。このような療法で使用するための心臓肥大因子ポリペプチドおよびそれに対する拮抗剤の新規な群を確認することが別の目的の一つである。このようなポリペプチドをコードする核酸を提供し、この核酸を組換え細胞培養物中でポリペプチドを生産するために使用することがさらに別の目的である。さらに別の目的はそれらのアミノ酸配列変異体および共有結合誘導体を含む、このようなポリペプチドの誘導体および修飾型を提供することである。別の目的の一つはこのようなポリペプチドに対する抗体を作成するための抗原を製造し、ならびにそれらと結合することのできる抗体を得ることである。例えば発現クローニングおよびそのポリペプチドの精製において、発現クローニングから分離されたクローンの評価において、およびそのようなポリペプチドに対する拮抗剤の確認において、使用できる新規肥大性検定法を提供することがさらに別の目的である。本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の全体を考慮すれば当業者には明白である。発明の要約本明細書に開示する心臓肥大因子（ＣＨＦ）の発現クローニングおよび蛋白質精製を可能にする試験管内新生児ラット心臓肥大性検定法を開発した。毎週１０００個の試料処理能力を持ち、試料必要量が１００μＬまたはそれ以下と小さいこの検定法は今までに公表されている方法を使用しては不可能だったと思われる発現クローニングと蛋白質精製とを可能にした。それ故、態様の一つでは本発明は：（イ）インスリン、トランスフェリン、およびアプロチニンを含むダルベッコの修正イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）／Ｆ−１２培地のｍＬ当り約７.５×１０⁴細胞密度の筋細胞懸濁液を９６ウェルプレートにプレーティング（植え付ける）すること；（ロ）細胞を培養すること；（ハ）被験試料（ＣＨＦを含むと推測されるような）を培養した細胞に添加すること；（ニ）細胞を被験試料とともに培養すること；および（ホ）被験試料が肥大性活性を持つかどうか決定することを含む被験試料を肥大性活性について検定する方法を提供する。この検定法とは別に、本発明は、ラットＣＨＦポリペプチドを除く、分離したＣＨＦポリペプチドを提供する。このＣＨＦポリペプチドは好ましくは実質的に均一であって、グリコシル化体でも非グリコシル化体であってもよく、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体ポリペプチド、およびキメラ体ポリペプチドから構成される群から選択しうる。これに加えて、ＣＨＦポリペプチドは哺乳類から分離されたポリペプチド、組換え手法で作ったポリペプチド、および合成的手法で作ったポリペプチドから構成される群から選択しうる。さらにこのＣＨＦポリペプチドはヒトのものであるポリペプチドおよびヒト中で非免疫原性であるポリペプチドから構成される群から選択しうる。別の側面では、分離されたＣＨＦポリペプチドは図１に示す翻訳ＣＨＦ配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を共有する。別の側面では、このポリペプチドは成熟ヒトＣＨＦであって図５に示す翻訳ＣＨＦ配列を持つ。さらに別の側面では、本発明は中程度にストリンジェントな条件下に図１に提供する核酸配列とハイブリッド形成をする配列を持つ核酸がコードする分離されたポリペプチドを提供する。好ましくはこのポリペプチドは生物学的に活性である。その他の側面では、本発明は異種ポリペプチドに融合したＣＨＦからなるキメラ体を提供する。さらに別の側面では、本発明は生物学的に活性なＣＨＦと医薬的に許容しうる担体とを含むか、または免疫原性ポリペプチドに融合した生物学的に活性なＣＨＦを含む組成物を提供する。その他の側面では、本発明はＣＨＦに結合することのできる分離された抗体、およびこの抗体をＣＨＦを含有することが推測される試料または細胞と接触させることおよびもし結合が起きたらＥＬＩＳＡのようなもので検出することを含む試験管内または生体内でＣＨＦを検出する方法を提供する。さらに別の側面では、本発明は抗体を結合したカラムにＣＨＦの混合物を通過させ、ＣＨＦを含む画分を回収することを含むＣＨＦの精製法を提供する。他の側面では、本発明はＣＨＦをコードする分離された核酸分子、この核酸分子を含むベクター、好ましくはこのベクターで形質転換された宿主細胞が認識する制御配列に作動可能に結合する核酸分子を含む発現ベクター、哺乳類および細菌の宿主細胞を含むこの核酸分子を含む宿主細胞、およびこの核酸分子を含む宿主細胞を培養することによってＣＨＦを生産するためにＣＨＦをコードする核酸分子を使用する方法を包含する。好ましくは、宿主細胞に遺伝子移入してＣＨＦ核酸を発現させてＣＨＦを宿主細胞培養物から回収するか、もしも分泌されていれば、培養培地から回収する。さらに別の側面では、本発明は図１または図５に示す読み取り枠の核酸配列を含む分離された核酸分子を提供する。本発明はラットＣＨＦを除外した分離された核酸分子であって、（イ）図１または図５に示すＣＨＦ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン；（ロ）（イ）のクローンとストリンジェントな条件下にハイブリッド形成をすることのできるＤＮＡ配列；および（ハ）天然ＣＨＦポリペプチドの生物学的性質を持つポリペプチドをコードする（イ）または（ロ）のＤＮＡ配列のうちのいずれかの遺伝子変異体から構成される群から選択したものも提供する。本発明は図１または図５に提供するＤＮＡ配列に中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成することのできる配列を持つ分離されたＤＮＡ分子であって、ラットＣＨＦを除く生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドをコードするものも提供する。さらに別の側面ではＣＨＦ核酸分子を被験試料と接触させることおよびハイブリッド形成が起きたかどうか決定することを含むか、またはＣＨＦ核酸分子を被験試料核酸にハイブリッド形成することおよびＣＨＦ核酸の存在を決定することを含む、被験試料中のＣＨＦ核酸分子の存在を決定する方法を提供する。さらに別の側面では、本発明はＣＨＦ核酸分子と被験試料との核酸ポリメラーゼ連鎖反応をプライムすることを含む核酸被験試料を増幅する方法を提供する。さらに別の側面では、本発明はＣＨＦ拮抗剤および前記肥大性検定法における被験試料として細胞上清液を使用することおよびこの検定法が示すＣＨＦの肥大性活性に拮抗する分子を検索することを含むその拮抗剤の確認法を提供する。さらに別の側面では、本発明はこのような処置を要する哺乳類に治療的有効量の、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤を医薬的に許容される担体中に含む、医薬的組成物を投与することを含む心不全、筋変力疾患または不整脈疾患に罹患しているかその危険を持つ哺乳類を処置する方法を提供する。本発明はまたこのような処置を必要とする哺乳類に医薬的に許容される担体中のＣＨＦを含む治療的有効量の医薬組成物を投与することを含む神経学的疾患に罹患しているか、その危険を持つ哺乳類を処置する方法を提供する。付加的な態様において、本発明は標識ＣＨＦ、好ましくは放射能標識ＣＨＦ、を細胞受容体検定法中で使用すること、細胞にＣＨＦを結合させること、または標識ＣＨＦを使用して受容体を含む細胞を濃縮すること、を含むＣＨＦに対する受容体を確認する方法を提供する。図面の簡単な説明図１Ａおよび１ＢはマウスＣＨＦ・ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（センスおよびアンチセンス鎖）（配列番号：１および２）および演繹されたアミノ酸配列（配列番号３）を描写する。２７位にある下線の相補ヌクレオチドは全長クローンを得るために使用したもう一つのマウスＣＨＦクローンの開始点を示す。図２はマウスＣＨＦクローン（ｃｈｆ．７８１）の翻訳アミノ酸配列（配列番号３）とヒト毛様体神経栄養因子（ｈｕｍｃｎｔｆ）のアミノ酸配列（配列番号４）を並列比較して配列同一性の程度を示す。図３は新生児心臓肥大検定法によるフェニルエフリン（標準曲線）および２９３細胞遺伝子移入に対する心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出のグラフを示す。図４はＣＮＴＦ標準（円）、ＣＨＦ・ＤＮＡ遺伝子移入２９３細胞からの培地（三角）、および対照ＤＮＡ遺伝子移入２９３細胞からの培地（四角）を使用する毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）標準（ｎｇ／ｍＬ）または遺伝子移入２９３細胞調整培地（検定容積の逆数）の関数として毛様体神経節ニューロンの生存（細胞数で測定）のグラフを示す。図５Ａおよび５ＢはヒトＣＨＦ・ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（センスおよびアンチセンス鎖）（配列番号６および７）および演繹したアミノ酸配列（配列番号８）を示す。図６はヒトＣＨＦクローンの翻訳されたアミノ酸配列（ｈｕｍｃｔ１）（配列番号８）をマウスＣＨＦクローンの翻訳されたアミノ酸配列（ｃｈｆ．７８１）（配列番号３）と並列して配列同一性の程度を示す。好適な態様の詳細な記載Ｉ．定義一般に、下記の語句は発明の詳細な説明、実施例および請求項で使用するときには指摘する定義を持つ。「ＣＨＦ」（または「心臓肥大性因子」または「カルジオトロフィン」または「カルジオトロフィン−１」）は本明細書では図１のポリペプチド配列または図５に示すヒトの均等物を含む天然起源ポリペプチドの生物学的性質（下記）の少なくとも一つを有するポリペプチド配列であると定義する。これにはラットのＣＨＦ同族体、すなわちラット種からのＣＨＦは包含しない。この定義は本明細書記載のマウス胚様体のような天然ＣＨＦ源からまたは、ラットを除き、ヒトを含む別の動物種のような別の源から分離したポリペプチドのみならず、組換え法または合成法で製造したポリペプチドにも及ぶ。これにはその機能的誘導体、アレル、アイソフォーム、および同族体を含む変異体型も包含する。「ＣＨＦ断片」は天然起源成熟全長ＣＨＦ配列の一部であって、アミノ酸残基または炭水化物ユニット１個またはそれ以上を欠失させたものである。除去するアミノ酸残基はポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端または中間を含むいかなる場所にあってもよい。断片はＣＨＦと共通の生物学的性質の少なくとも１種を共有する。典型的には、ＣＨＦ断片はアミノ酸残基少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０個の、マウス胚様体から分離されたＣＨＦまたはヒトＣＨＦを含む、哺乳類から分離されたＣＨＦの配列と同一の逐次的配列を持つ。本明細書で定義する「ＣＨＦ変異体」または「ＣＨＦ配列変異体」は組換え細胞培養物からまたは図１に記載する演繹された配列を持つマウス胚様体から得たＣＨＦ、または図５に記載するヒト均等物と１００％以下の配列同一性を持つ以下に定義する生物学的に活性なＣＨＦを意味する。通常、生物学的に活性なＣＨＦ変異体はマウス胚様体から分離したＣＨＦまたは成熟ヒトＣＨＦ（図１および図５参照）のアミノ酸配列との間に少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは約８５％、もっと好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を持つ。「キメラＣＨＦ」は全長ＣＨＦまたはその断片１個またはそれ以上が第２の蛋白質またはその断片１個またはそれ以上に融合または結合したものを含むポリペプチドである。このキメラは生物学的性質の少なくとも１つをＣＨＦと共有する。第二の蛋白質は典型的にはサイトカイン、成長因子、または成長ホルモンのようなホルモン、ＩＧＦ−Ｉ、またはたとえばＣＮＴＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、その他のような神経栄養因子である。「分離されたＣＨＦ」、「高度に精製されたＣＨＦ」および「実質的に均質なＣＨＦ」は互換的に使用され、ＣＨＦ源から精製したか、組換えまたは合成的方法で製造したＣＨＦであって、（１）スピニングカップ配列決定装置または商業的入手可能な最高のアミノ酸配列決定装置またはこの出願の出願日において公表されている方法により修飾したものを使用して、Ｎ−末端または中間のアミノ酸配列のアミノ酸残基少なくとも１５および好ましくは２０アミノ酸残基を得るため、または（２）クーマジーブルーまたは好ましくは銀染色を使用する非還元または還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで、夾雑ペプチドまたは蛋白質が不含となっているＣＨＦを意味する。ここでは、均質性は他の源泉蛋白質の約５％より少ない夾雑を意味する。「生物学的性質」は「ＣＨＦ」または「分離されたＣＨＦ」いずれかと関連して使用する時は、心筋層肥大、筋変力作用、抗不整脈、または神経栄養活性を持つか、または直接または間接にＣＨＦ（天然または変性の立体配座に関わらず）またはその断片に起因しまたはそれが機能する生体内効果器または抗原機能または活性を持つことを意味する。この効果器機能には受容体結合および担体結合活性、ＣＨＦの作動または拮抗、特に複製、ＤＮＡ制御機能、他種成長因子の生物学的活性の調節、受容体活性化、不活化、アップ−およびダウンレギュレーション、細胞成長または分化、その他の増殖シグナルの伝達を包含する。しかしながら、効果器機能には天然ＣＨＦに対して作成される抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の保有は含まない。「抗原機能」は図１に示す配列を持つか、図５に示す配列を持つヒトの相同体を含む他種哺乳類天然ＣＨＦである、天然ＣＨＦに対して作成される抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の保有を意味する。ＣＨＦポリペプチドの主な抗原機能はマウス胚様体から分離したＣＨＦまたはそのヒト相同体に対して作成した抗体に少なくとも約１０⁶Ｌ／モルの親和性をもって結合することである。通常、このポリペプチドは親和性少なくとも約１０⁷Ｌ／モルで結合する。最も好ましくは、抗原的に活性なＣＨＦポリペプチドは前記効果器機能の一つを持つＣＨＦに対して作成された抗体に結合するポリペプチドである。「生物学的活性」を定義するために使用する抗体はフロインドの完全アジュバント中の組換え細胞培養または胚様体から分離したＣＨＦを製剤化し、この製剤を皮下注射し、抗ＣＨＦ抗体の力価が安定するまでこの製剤を腹腔内注射して免疫反応をブースト（追加免疫）して作成したウサギのポリクローナル抗体である。「生物学的に活性」は「ＣＨＦ」または「分離したＣＨＦ」に関連して使用する時は、ＣＨＦポリペプチドが肥大性、筋変力作用、抗不整脈、または神経栄養活性を示すか、またはマウス胚様体から分離したかまたは本明細書記載の組換え細胞培養により製造したＣＨＦの効果器機能を共有するもの、およびそれに加えて抗原機能を持ちうる（必須ではない）ことを意味する。本明細書のＣＨＦまたはＣＨＦポリペプチドの主な効果器機能は、たとえば、特異なプレーティング培地および密度を使用し、好ましくはクリスタルバイオレット染色を読取るために使用する本明細書記載の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出により、または筋細胞肥大検定により測定される心臓の成長または肥大活性に影響を与えることである。ＣＨＦ（またはＣＨＦ拮抗剤）の所期の機能は生理学的肥大型（有益）を増加させ、病理学的肥大を減少させることである。これに加え、本明細書のＣＨＦは、より正常な電気生理学的表現型を促進することによって、抗不整脈機能を発揮することが期待される。本明細書ＣＨＦまたはＣＨＦポリペプチドの他の主な効果器機能はＣＮＴＦ活性に関する検定でのニワトリ毛様体神経節ニューロンの増殖刺激である。抗原的に活性のＣＨＦはＣＨＦの抗原的機能を有し、およびそれに加えて効果器機能を持っていてもよい（必須ではない）ポリペプチドとして定義する。好適な態様において、抗原的に活性なＣＨＦはＣＨＦに結合することのできる抗体に少なくとも約１０⁶Ｌ／モルの親和性で結合するポリペプチドである。通常、このポリペプチドは少なくとも約１０⁷Ｌ／モルの親和性で結合する。ＣＨＦに結合することのできる分離された抗体はそれが存在しうる天然環境の成分に確認され、分離された抗体である。最も好ましくは、抗原的に活性なＣＨＦは天然の立体配座においてＣＨＦに結合することのできる抗体に結合するポリペプチドである。天然立体配座におけるＣＨＦは天然に発見されるＣＨＦであって、例えば非還元的、非変性的サイジングゲル上での移動によって測定するとＣＨＦの三次元的構造を実質的に修飾するカオトロープ剤、熱またはその他の処理によって変性されていないものである。この測定で使用する抗体はフロイントの完全アジュバント中の非−ウサギ種からの天然ＣＨＦを製剤化し、この製剤を皮下注射し、抗−ＣＨＦ抗体力価が安定化するまでこの製剤を腹腔内注射することにより免疫反応をブーストして作成したウサギのポリクローナル抗体である。ＣＨＦ配列に関する「アミノ酸配列同一性百分率」はここでは、各配列を並列比較し、配列同一性百分率を最大にするために必要なら間隔を導入し、配列同一性の部分として如何なる保存的置換をも考慮せずに、図１に記載する演繹アミノ酸配列を持つマウス胚様体から分離したＣＨＦ配列中または図５に記載する演繹ヒトＣＨＦアミノ酸配列中の残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義する。ＣＨＦ配列へのＮ−末端、Ｃ−末端または中間での延長、欠失、または挿入は配列同一性または相同性に影響を与えないものと解釈すべきである。かくして、同一配列を持つと考えられる生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドの例にはプレプロ−ＣＨＦ、プロ−ＣＨＦおよび成熟ＣＨＦを包含する。「ＣＨＦの微量配列決定」は適当な標準的操作法のいずれによってもその操作法が十分に敏感であれば達成しうる。この方法の一つにおいて、ＳＤＳゲルまたは最終的なＨＰＬＣ段階から得られる高度に精製したポリペプチドは１２０Ａフェニルヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析装置を装着した４７０Ａ型Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の気相配列決定装置を使用する直接的自動エドマン分解（フェニルイソチオシアネート）法によって配列決定される。これに加えて化学的（たとえば、ＣＮＢｒ、ヒドロキシルアミン、または２−ニトロ−５ −チオシアノ安息香酸）または酵素的（たとえば、トリプシン、クロストリパイン、またはスタフィロコッカスのプロテアーゼ）な消化およびそれに続く断片の精製（たとえば、ＨＰＬＣ）によって得られるＣＨＦ断片は同様にして配列決定しうる。ＰＴＨアミノ酸はＣｈｒｏｍＰｅｒｆｅｃｔ（商品名）データシステム（Ｊｕｓｔｉｃｅ・Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、パロアルト、ＣＡ）を使用して分析される。配列の解釈はＶＡＸ１１／７８５Ｄｉｇｉｔａｌ・Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社の電算機上でＨｅｎｚｅｌなど、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４０４巻：４１〜５２頁（１９８７年）に記載のようにして実行される。要すればＨＰＬＣ画分を５〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、ＡＩＢ、フォスター市、ＣＡ）上に電気転写し、クーマジーブリリアントブルーで染色しうる。Ｍａｔｓｕｒｄｉａｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻：１００３５〜１００３８頁（１９８７年）。この染色で確認される特定の蛋白質をブロットから切り出し、前記気相配列決定機によりＮ−末端配列決定を行う。中間の蛋白質配列については、ＨＰＬＣ画分を真空下に乾燥し（ＳｐｅｅｄＶａｃ）、適当な緩衝液に再懸濁し、シアノーゲンブロミド、Ｌｙｓ特異的な酵素Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、リッチモンド、ＶＡ）またはＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、ＩＮ）で消化する。消化後、得られたペプチドを混合物としてまたはＣ４カラム上で０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中プロパノール勾配で溶離するＨＰＬＣ分割の後に気相配列決定する。「分離されたＣＨＦ核酸」は逐次的ヌクレオチド塩基１６個またはそれ以上、好ましくは２０個またはそれ以上を含むＲＮＡまたはＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＦまたはその断片をコードするものであって、このＲＮＡまたはＤＮＡに相補的であるか、このＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリッド形成し、中程度にストリンジェントな条件下に安定して結合するものである。このＲＮＡまたはＤＮＡは通常は天然起源中では共存する汚染源核酸少なくとも一種を含有せず、好ましくは他のいかなる哺乳類ＲＮＡまたはＤＮＡも実質的に含まない。「通常は天然起源中では共存する汚染源核酸少なくとも一種を含有せず」という用語はその核酸が起源または天然細胞内に存在するが、異なる染色体部位にあるか、またはそうでなければ起源細胞内に正常には存在しない核酸配列に結合している場合をも包含する。分離されたＣＨＦ核酸の例はマウスＣＨＦまたはヒトＣＨＦとは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％の配列同一性を共有し、生物学的に活性なＣＨＦをコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。「制御配列」は発現に関する時には、特定の宿主生物中でコード配列に作動可能に結合する、配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物について適切である制御配列は、例えばプロモーター、要すればオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらくまだ不十分にしか理解されていない他の配列を含む。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。「作動可能に結合」は核酸に関して言及する時にはその核酸が他の核酸配列と機能的な関係に位置することを意味する。例えば、もしそのポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるなら、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡがポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に結合しており、もしそれが配列の転写に影響を与えるならプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に結合しており；または、もし翻訳を促進するように配置されているなら、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に結合している。一般的に、「作動可能に結合」は結合されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接し、かつ読み枠内にある。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。結合は好都合な制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しなければ、常法に従って合成的オリゴヌクレオチド・アダプターまたはリンカーを使用する。「外来性」は要素について言及する時には、その細胞にとって外来であるか、または細胞にとって相同的ではあるが宿主細胞核酸内では通常は存在しない位置にある核酸配列を意味する。「細胞」、「細胞系列」および「細胞培養物」はここでは互換的に使用され、この記載はその細胞または細胞系列の全プロゲニー（子孫）を包含する。そこで、例えば「形質転換体」および「形質転換された細胞」のような用語は初代の対象細胞および継代数にかかわらずそれから誘導した培養物を包含する。全プロゲニーは意識的あるいは不作為的な突然変異に起因して、ＤＮＡ含量について正確に同一でなくてもよいことも理解されている。最初に形質転換した細胞で検定したものと同じ機能または生物学的活性を持つ突然変異プロゲニーは包含される。別の意味を意図する場合には、その前後の文章で明らかとなろう。「プラスミド」は自律的に複製し、独立の複製開始点を有する環状ＤＮＡ分子であって、ここでは小文字「ｐ」を先行し、および／または大文字および／または数字を続けて命名する。ここでは出発プラスミドは商業的に入手可能か、限定なく公共的に入手可能であるか、またはこれらの入手可能なプラスミドから公表された操作に従って構築できる。これに加えて、他の均等なプラスミドが当分野では公知であって、当業者には明白であろう。「制限酵素消化」はＤＮＡについて言及する時には、ＤＮＡ内部のホスホジエステル結合のＤＮＡ配列中のある位置または部位のみに作用する酵素による触媒的切断を意味する。このような酵素は「制限エンドヌクレアーゼ」と呼称される。各制限エンドヌクレアーゼは二重鎖の対称を示す「制限部位」と呼ばれる特定のＤＮＡ配列を認識する。本明細書で使用する種々の制限酵素は商業的に入手可能であって、酵素供給者が確立したそれらの反応条件、補助因子、およびその他の要件を使用する。制限酵素は通常、最初に各制限酵素を得た微生物を表す大文字に続いて他の字からなる略号、次に特定の酵素を示す数字によって命名する。一般に、プラスミドまたはＤＮＡ断片約１μｇを酵素約１〜２単位とともに緩衝液約２０μＬ中で使用する。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質量は製造者が指定している。３７℃で約１時間のインキュベーションを通常用いるが、供給者の指示書に従って変化させうる。インキュベーションの後に、フェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質またはポリペプチドを除去し、消化した核酸をエタノールでの沈殿によって水性画分から回収する。制限酵素による消化に続いて、末端５’−ホスフェートの細菌アルカリホスファターゼ加水分解をしてＤＮＡ断片の制限分解末端２個が「環化」または制限部位での他種ＤＮＡ断片の挿入を妨げる閉鎖環形成を防止する。別段の言及がない限り、プラスミドの消化の後で５’−末端脱燐酸化は行わない。Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｎｕａｌ）（ニューヨーク、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓs社、１９８９年）の１．５６〜１．６１章に記載のように脱燐酸化の操作および試薬は常法のものである。制限消化からの特定ＤＮＡ断片の「回収」または「分離」は消化物のポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上での電気泳動による分離、既知分子量のマーカーＤＮＡ断片と易動度を比較する所望断片の確認、所望の断片を含むゲル部位の取り出し、およびＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この操作は一般に公知である。例えばＬａｗｎなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：６１０３〜６１１４頁（１９８１年）およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）参照。「サザン分析」または「サザンブロッティング」は公知の標識オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片へのハイブリッド形成によって確認するＤＮＡまたはＤＮＡ含有組成物制限エンドヌクレアーゼ消化物中のＤＮＡ配列存在確認法の一つである。サザン分析は典型的にはＤＮＡ消化物のアガロースゲルでの電気泳動的分離、電気泳動的分離後のＤＮＡの変性、および前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの９．３７〜９．５２章に記載のような放射能標識、ビオチン化、または酵素標識プローブでの分析のためにするニトロセルロース、ナイロンまたはその他の適当な膜担体へのＤＮＡの転写を含む。「ノーザン分析」または「ノーザンブロッティング」は、たとえばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡまたはその断片、またはＲＮＡ断片のような、既知プローブにハイブリッド形成するＲＮＡ配列を確認するために使用する方法である。このプローブは³³Ｐのような放射性同位元素、またはビオチン化、または酵素により標識する。分析すべきＲＮＡは通常アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース、ナイロンまたはその他の適当な膜に移し、前記Ｓambrookらの７．３９〜７．５２章に記載のような当分野でよく公知の標準的技術を使用してプローブでハイブリッド形成する。「連結」は核酸断片２個の間にホスホジエステル結合を形成する工程である。断片２個の連結のためには、両断片の末端を互いに適合させなければならない。ある場合には、両末端をエンドヌクレアーゼ消化後に直接的に適合させる。しかしながら、まず最初にエンドヌクレアーゼ消化後に共通に生成する互い違い切断末端を平滑末端に転換して、それらを連結に適合させる必要もありうる。両末端を平滑にするためには、ＤＮＡを適当な緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片またはＴ４・ＤＮＡポリメラーゼ約１０単位と共にデオキシリボヌクレオチド三燐酸４種の存在下に１５℃で少なくとも１５分間処理する。このＤＮＡを次にフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製する。相互に連結すべきＤＮＡ断片のおよそ等モル量を溶液中に入れる。溶液にもまたＡＴＰ、連結緩衝液、およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼをＤＮＡ０．５ μｇ当り約１０単位含有させる。もしそのＤＮＡを連結してベクターとするならば、そのベクターをまず適当な制限エンドヌクレアーゼで消化してリネアライズ（線状化）する。線状化した断片を次に細菌アルカリホスファターゼまたは子ウシ小腸ホスファターゼで処理して連結段階での自己連結を防止する。細胞からのＤＮＡの「調製」は宿主細胞の培養物からプラスミドＤＮＡを分離することを意味する。ＤＮＡ調製のために通常に使用する方法は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．２５〜１．３３章に記載のようなプラスミドの大量−および少量生産法である。ＤＮＡの調製後、たとえば前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．４０章に記載のような当分野でよく公知の方法により精製できる。「オリゴヌクレオチド」は、たとえば１９８８年５月４日に発行された欧州特許２６６０３２またはＦｒｏｅｈｌｅｒなど、、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：５３９９〜５４０７頁（１９８６年）に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスフォネート中間体を経由するような固相技術を使用する、たとえばホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイト化学のような公知法により化学的に合成した短い、単鎖または二重鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらに別の方法は次に記載するポリメラーゼ連鎖反応およびその他の自動プライマー法および固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成を包含する。これらの方法は全てＥｎｇｅｌｓなど、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁（１９８９年）に記載がある。これらの方法はその遺伝子の全核酸配列が既知であるか、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が入手できれば使用される。そうでなければ、もし標的アミノ酸配列が公知であれば、各アミノ酸残基に対する公知で好適なコード残基を使用して可能性のある核酸配列を推測しうる。オリゴヌクレオチドは次にポリアクリルアミドゲルで精製される。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の微量な断片を１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４６８３１９５号に記載のようにして増幅する操作または技術を示す。一般に、所望の領域の両末端からの配列またはそれを越える配列情報がオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに必要であり、これらのプライマーは増幅すべき鋳型の反対側の鎖に対して配列が同一であるかまたは類似する。両プライマーの５’−末端ヌクレオチドは増幅される物質の末端と一致しうる。ＰＣＲを使用すれば特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列その他を増幅できる。一般的に、Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１巻：２６３頁（１９８７年）；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ技術（ＰＣＲ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ出版社、ＮＹ、１９８９年）参照。ここで使用するＰＣＲは核酸被験試料の増幅のための核酸ポリメラーゼ反応法の一つであって、プライマーとして既知の核酸および核酸ポリメラーゼを増幅のためまたは核酸の特定の切片を発生するための使用を含むものであるが、しかし唯一の例ではないものであると考えられる。「ストリンジェント条件」は（１）例えば０．０１５Ｍ−ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ−クエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄（ＳＤＳ）を５０℃で使用するような低イオン強度および高温度を洗浄のために採用するか、または（２）ハイブリッド形成の間に、例えば０．１％ウシ血清アルブミン含有５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ−ＮａＣｌを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭ−クエン酸ナトリウムを４２℃で使用する、ホルムアミドのような変性剤を採用するものである。他例の一つは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ−クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸の４２℃での使用と０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃での洗浄の使用である。「中程度にストリンジェント条件」は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されており、前記のストリンジェント条件よりもストリンジェントの弱い洗浄溶液およびハイブリッド形成条件（たとえば温度、イオン強度、およびＳＤＳ％）の使用を包含する。中程度にストリンジェント条件の一例は、たとえば、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１５ｍＭ−クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ｍｇ／ｍＬ切断変性鮭精子ＤＮＡからなる溶液中で３７ ℃で一夜インキュベーションし、続いてフィルターを１×ＳＳＣ中で約３７〜５０℃で洗浄するような条件である。熟練した当業者はプローブ長などのような因子に応じて必要となる温度、イオン強度、その他を調節する方法を認識するものである。「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同一の構造的特徴を持つ糖蛋白質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を持たない抗体その他の抗体様分子も含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低濃度で、また、骨髄腫によって高濃度で生産される。「天然の抗体および免疫グロブリン」は通常約１５００００ダルトンのヘテロ四量体の糖蛋白質であって、同一の軽鎖（Ｌ）２個および重鎖（Ｈ）２個から構成されている。各軽鎖は重鎖に共有ジスルフィド結合１個によって結合するが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間ではジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は規則的間隔のある鎖内ジスルフィド橋複数を持つ。各重鎖は一端では可変ドメイン（Ｖ_H）とそれに続く多数の定常ドメインを持つ。各軽鎖は一端に可変ドメイン（Ｖ_L）と他端に定常ドメインを持つ；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインに並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインに並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の中間面（インターフェイス）を形成していると信じられている（Ｃｌｏｔｈｉａなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６巻：６５１〜６６３頁［１９８５年］；ＮｏｖｏｔｎｙとＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：４５９２〜４５９６頁［１９８５年］）。用語「可変」は抗体間で可変ドメインのある部分の配列が顕著に相違し、特定の抗体のその特定の抗原に対する結合と特異性とに利用される事実を示す。しかしながら、この可変性は抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているのではない。これは軽鎖および重鎖双方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれるセグメント３個に集中している。可変ドメインの中でより高度に保存された部分は枠組領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々ＦＲ領域４個を含み、主としてβ−シート立体構造をとっており、ＣＤＲ３個を結合して、場合によりβ−シート構造の一部を形成してβ− シート構造を結合するループを形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接して維持され、他鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位形成に寄与する（Ｋａｂａｔなど、「免疫学的に重要な蛋白質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・ｏｆ・Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、ＭＤ［１９９１年］参照）。定常ドメインは直接的には抗体を抗原に結合することには関与しないが、しかし、たとえば抗体依存性細胞障害性への抗体の関与のような、種々の効果器機能を示す。抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の抗原結合断片２個および容易に結晶化する性能を反映する名称で呼ばれる残りの「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理では抗原結合部位２個を持ち、まだ抗原と交差結合することのできるＦ（ａｂ’）₂断片を与える。「Ｆｖ」は完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は重鎖１個および軽鎖１個の可変ドメインの強固な非共有結合的な会合により構成される二量体から構成される。各可変ドメインのＣＤＲ３個が相互に作用して抗原結合部位をＶ_H−Ｖ_L二量体の表面に決定するのはこの立体配置である。結局、ＣＤＲ６個が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりも親和性は低いが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲ３個のみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識し、結合する性能を持つ。Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体のヒンジ領域からのシステイン１個またはそれ以上を含む少数の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは相違する。本明細書でＦａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を示す記号である。Ｆ（ａｂ’）₂ 抗体断片は最初は相互の間にヒンジシステインを持つ一対のＦａｂ’断片として製造された。抗体断片のその他の化学的結合も知られている。いずれかの種の脊椎動物から得た抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」はそれらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる明瞭に区別される２種のタイプのいずれか一方に分類される。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して免疫グロブリンは数種に分類できる。免疫グロブリンには主な５種類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあって、これらの中でいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）：たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２、に分類される。免疫グロブリンの種類に対応する重鎖定常ドメインは各々α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの各クラスのサブユニット構造および３次元的立体構造はよく知られている。用語「抗体」は最広義に使用し、単一のモノクローナル抗体（作動性および拮抗性抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物も包含する。用語「モノクローナル抗体」はここでは実質的に均質な抗体の集団、すなわち微量に含まれる可能性のありうる天然起源突然変異を例外としてその集団を構成する各抗体が同一であるもの、から得た抗体を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらにその上に、典型的には種々の決定基（エピトープ）を指向する種々の抗体を含有する通常の（ポリクローナル）抗体製品とは対照的に、モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンを夾雑物として含まない点が有利である。ここに、モノクローナル抗体は、起源の種または免疫グロブリンのクラス、またはサブクラス分類、ならびに抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖ）に関わらず、それらが所望の生物学的活性を示す範囲内において、定常ドメイン（たとえば、「ヒト化」抗体）を持つ抗ＣＨＦ抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）をスプライスすること、または重鎖を持つ軽鎖、または他種からの鎖を持つ１種の鎖、または異種蛋白質との融合、によって製造されたハイブリッドおよび組換え抗体を含む。［たとえばＣａｂｉｌｌｙなど、米国特許第４８１６５６７；ＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、「モノクローナル抗体生産技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」中、７９〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８７年）参照］。そこで、修飾語「モノクローナル」は実質的に均質な抗体集団から得た抗体の性質を示すものであり、その抗体の生産に特定の方法を必要とすると解釈すべきものではない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがＮａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）に最初に記載したハイブリドーマ法によっても、または組換えＤＮＡ法（前記Ｃａｂｉｌｌｙなど）によっても生産しうる。本明細書のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体分類またはサブ分類に属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、一方、鎖の残りの部分は他の種に由来するかまたは他の抗体分類またはサブ分類に属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である抗体、ならびにそのような抗体の断片であって、所期の生物学的活性を持つもの（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出；Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁［１９８４年］）である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する。非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」型は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（たとえばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、その他抗体の抗原結合サブ配列のような）である。殆どの部分でヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相同性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所期の特異性、親和性および性能を持つ、たとえばマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置換されているものである。ある例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組残基を対応する非ヒト残基に置換する。さらにその上、ヒト化抗体はレシピエントの抗体にも導入されたＣＤＲまたは枠組配列にも存在しない残基を含みうる。これらの修正は抗体の性能を調整して最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的に少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメイン全てを含むものであって、そこにおいてはＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒトの免疫グロブリンのコンセンサス配列である。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部分を含む。さらに詳細な事項はＪｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照。「ヒトに非免疫原的」は、医薬的に許容しうる担体中の医薬的有効量のそのポリペプチドをヒトの適当な組織と接触した時に、適当な潜在期間（たとえば８から１４日）の後にそのポリペプチドの第二の投与に際して、そのポリペプチドに対する過敏性または耐性が証明されないことを意味する。「神経学的疾患」は末梢性ニューロンおよび中枢神経系からのニューロンの双方を含むニューロンの疾患を示す。このような疾患の例は、たとえば末梢性神経障害（運動および感覚）、筋萎縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、ハンチントン病、てんかん、のような神経変性疾患のすべて、およびたとえば糖尿病性網膜炎、網膜ジストロフィー、および乳児期悪性大理石骨病、セロイド−脂褐素沈着症、または胆汁欝滞に起因する網膜変性、または光変性、外傷、軸索切断、神経毒性−興奮性変性または虚血性ニューロン変性に起因する網膜変性のような網膜に関する眼科学的疾患を含む。「末梢性神経障害」は末梢神経系に影響する疾患を示し、最も多くは運動、感覚運動、または自律神経機能不全の一つまたは組合せとして現れる。末梢性神経障害により現れる広範な形態学的変化は同様に広範な原因数に独特に由来する。例えば、末梢性神経障害は遺伝的に獲得し、全身病から由来し、または毒薬により導入できる。これに限定するものではないが、例としては四肢感覚運動神経障害または、たとえば胃腸管運動性低下または膀胱アトニーのような自律神経障害を包含する。全身性疾患に起因する神経障害の例にはポリオ後症候群を含み、遺伝的神経障害の例はシャルコット−マリー−トゥース病、レフスム病、無β−リポ蛋白血症、タンジェ病、クラッベ病、異染色性白質萎縮症、ファブリー病、およびデジェリン−ソッタ症候群を含み；および毒薬に起因する神経障害の例はビンクリスチンのような化学療法剤による処置に起因するものを包含する。「心不全」とは心臓が代謝している組織の要求に必要な速度で血液を送らない心機能の異常性を示す。心不全は、たとえば欝血性心不全、心筋梗塞、および頻脈性不整脈のような広範な病的状態を包含する。「処置」は治療的処置および予防的または防止的手段の両方を示す。処置を要するものは既にその病気を持つものならびにその病気になる傾向があるかまたはその病気を予防すべきものを包含する。治療の目的である「哺乳類」は哺乳類に分類される動物全てを示し、ヒトまたは、たとえばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、その他のような家畜および農場の動物、および動物園、スポーツ、ペットの動物を包含する。好ましくは、本明細書の哺乳類はヒトである。ここで使用する「ＡＣＥ阻害剤」はアンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩへの転換を妨げるアンギオテンシン転換酵素阻害性薬剤を示す。ＡＣＥ阻害剤は全身性の血管抵抗を低下させ、循環の欝血を軽減するので欝血性心不全に有効でありうる。ＡＣＥ阻害剤はこれらに限定するものではないが、商品名アクプリル（キナプリル）、アルテース（ラミプリル）、カポテン（カプトプリル）、ロンテシン（ベナゼプリル）、モノプリル（フォシノプリル）、プリニビル（リシノプリル）、バソテック（エナラプリル）およびゼストリル（リシノプリル）を包含する。ＡＣＥ阻害剤の一例は商標カポテンの下に販売されている。一般名でカプトプリルと呼ばれるこのＡＣＥ阻害剤は、化学的には１−［（２Ｓ）−３ −メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリンと命名されている。ＩＩ．本発明の実施態様１．ＣＨＦポリペプチドこの発明の好適なポリペプチドは筋細胞肥大性およびＣＮＴＦ検定法でニワトリ毛様体ニューロンの発育を促進する生物学的性質を持つ実質的に均質なＣＨＦポリペプチドである。さらに好適なＣＨＦは肥大性、抗不整脈、筋変力作用および神経学的活性を持つ分離された哺乳類蛋白質である。この発明の最も好適なポリペプチドは肥大性、抗不整脈、筋変力作用、および神経学的活性を持つマウスおよびヒトのＣＨＦであってそれらの断片も包含する。要すれば、これらマウスおよびヒトＣＨＦはグリコシル化を欠く。この発明の別の好適ポリペプチドは生物学的に活性なＣＨＦ変異体であって、図１のマウスＣＨＦとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％（すなわち、各々７０〜１００％、７５％〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％および９５〜１００％配列同一性）のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。それとは別に、好適な生物学的に活性なＣＨＦ変異体は図５のヒトＣＨＦとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％（すなわち、各々７０〜１００％、７５％〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％および９５〜１００％配列同一性）のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。マウス胚様体からクローニングしたＣＨＦは次の性質を持つ。（１）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると分子量約２１〜２３ｋＤを持つ。（２）ＣＮＴＦニワトリ毛様体ニューロン検定および筋細胞肥大性およびＡＮＰ放出肥大性検定において陽性の活性を示す。さらに好適なＣＨＦポリペプチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡがコードするもので、図１に記載したマウスＣＨＦのアミノ酸配列または図５に記載したヒトＣＨＦのアミノ酸配列を持つものである。この発明のその他の好適な天然起源の生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドはプレプロ−ＣＨＦ、プロ−ＣＨＦ、プレ−ＣＨＦ、成熟ＣＨＦ、およびそのグリコシル化変異体を包含する。さらに別の好適なこの発明のポリペプチドにはＣＨＦ配列変異体およびキメラＣＨＦを包含する。通常は、好適なＣＨＦ配列変異体は生物学的に活性なＣＨＦ変異体であって、ヒトまたはマウスのＣＨＦと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。好適なＣＨＦ変異体の例はＣ−末端ドメインでのＣＨＦ変異体であって、塩基性または二塩基性アミノ酸残基（たとえば、ＲまたはＫ）の１個またはそれ以上が非塩基性アミノ酸残基（たとえば親水性、中性、酸性、芳香性、ｇｌｙ、ｐｒｏその他）で置換されたものである。他の例示的好適ＣＨＦ配列変異体の一つは「ドメインキメラ」であって、Ｎ− 末端残基がおよそ図２に示すように並んでいるヒトのＣＮＴＦ残基の全部ではないが、１個またはそれ以上で置換されているものである。この態様では、ＣＨＦキメラは図２に示す並列に対応する位置においてＣＨＦ配列にヒトＣＮＴＦ配列からの個々の残基または残基のブロックが付加するか、置換している。例えば、ＣＨＦの対応するセグメントに相同的でないＣＮＴＦのセグメント１個またはそれ以上が置換することができる。この「ＣＨＦ−ＣＮＴＦドメインキメラ」には肥大性／抗不整脈／筋変力作用／神経栄養的を混合した生物学的活性を持つことが意図されている。この発明のその他の好適なポリペプチドにはマウス胚様体から分離したＣＨＦの配列または対応するヒトＣＨＦの配列と同一な少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０アミノ酸残基、好ましくは約１０〜１５０残基の逐次的配列を持つＣＨＦ断片を包含する。他の好適なＣＨＦ断片は精製ＣＨＦの化学的または酵素的な加水分解または消化の結果として生産されたものを包含する。本発明の別の側面の一つはＣＨＦ分子の精製法であって、精製すべきＣＨＦ分子を含有するＣＨＦ源と固定化した受容体または抗体ポリペプチドとを精製すべきＣＨＦ分子が固定化した受容体または抗体ポリペプチドに選択的に吸着する条件下に接触させ、固定化担体を洗浄して非吸着物質を除き、および精製すべき分子を吸着している固定化した受容体または抗体ポリペプチドから溶離緩衝液で溶離することを含む。ＣＨＦを含有する源は胚様体細胞懸濁液でありうる。あるいは、ＣＨＦを含有する源は組換え細胞培養物であって、この場合、培養培地または細胞分解物のいずれかの中のＣＨＦ濃度は一般に原形質またはその他天然源中におけるよりも高濃度である。この場合、前記の免疫親和性法は、使用はできるが、普通は必要ではなく、この分野で公知のさらに慣例的な蛋白質精製法を採用しうる。略述すれば、実質的に均質なＣＨＦを提供するための好適な精製法は：粒状破砕物を、例えば遠心分離または限外濾過などで除去し；要すれば蛋白質プールを商業的に入手できる蛋白質濃縮濾過装置で濃縮し；およびその後に夾雑している可溶性蛋白質およびポリペプチドからＣＨＦを適当な精製手段の例である次の操作法：免疫親和性またはイオン交換カラム上の分画；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；たとえばＤＥＡＥのようなシリカまたはカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＭＯＮＯ−ＱまたはＭＯＮＯ−Ｓクロマトグラフィー；例えばセファデックスＧ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧのような夾雑物質を除去するためのＣＨＦを結合するカラムおよびプロテインＡセファロースカラム上のクロマトグラフィー、で精製することからなる。天然および組換えＣＨＦ双方のための好適な精製方式はＢｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに続いて、ＭＯＮ−Ｑカラムおよび逆相Ｃ４カラムを以下に記載のように使用する。他の好適な態様において、この発明はＣＨＦに結合することのできる分離された抗体を提供する。好適な分離された抗ＣＨＦ抗体はモノクローナルである（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁［１９７５年］；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、「生化学および分子生物学における実験技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ｉｎ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ・ａｎｄ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｂｕｒｄｏｎら編、１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム［１９８５年］；およびＨｕｓｅなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁［１９８９年］）。分離された好適な抗ＣＨＦ抗体は少なくとも約１０⁶Ｌ／モルの親和性でＣＨＦに結合するものである。より好ましくは、この抗体は少なくとも約１０⁷Ｌ／モルの親和性でＣＨＦに結合するものである。最も好ましくは、この抗体は前記効果器機能の一つを持つＣＨＦに対して作成される。ＣＨＦに結合することのできる分離された抗体は、要すれば第２のポリペプチドに融合しうるし、またその抗体またはその融合物は固定化したＣＨＦポリペプチドについて前記した源からＣＨＦを分離し、精製するために使用しうる。この発明態様のさらに好適な側面では、本発明は抗体をＣＨＦを含有すると推測される試料、好ましくは血清試料、と接触させること、および結合が起きたかどうかを検出することからなる試験管内または生体内でＣＨＦを検出する方法を提供する。本発明はさらにＣＨＦまたはその断片をコードする分離された核酸分子であって、その核酸分子が検出可能な構造で標識されていても無標識でもよいもの、およびＣＨＦをコードする配列を持つ核酸分子に相補的な、またはストリンジェント条件または中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成する配列を持つ核酸分子を提供する。好適なＣＨＦ核酸は生物学的に活性なＣＨＦをコードするＲＮＡまたはＤＮＡであって、マウスまたはヒトのＣＨＦとの間に少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を持つ。さらに好適な分離された核酸分子は（イ）哺乳類ＣＨＦ遺伝子のコード領域に基づくＤＮＡ（たとえば、図１または図５に提供するヌクレオチド配列またはその断片からなるＤＮＡ）；（ロ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下に（イ）のＤＮＡにハイブリッド形成することのできるＤＮＡ；および（ハ）遺伝子コードの縮重性の結果として（イ）または（ロ）に規定するＤＮＡに対して縮重関係にあるＤＮＡ；から選択した生物学的に活性なＣＨＦをコードするＤＮＡ配列である。ここに記載する新ＣＨＦはそのＤＮＡが図１または図５のＤＮＡ（またはその断片）と低ストリンジェント度ないし中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成しうる、適切な配列同一性を持つ一群のリガンドの一員でありうることが意図されている。そこで、この発明の別の側面は低度ないし中程度にストリンジェントな条件下にＣＨＦポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡを包含する。好ましくは、この核酸分子はＣＨＦをコードするｃＤＮＡであり、さらに、ベクターで形質転換した宿主が認識する制御配列にこのｃＤＮＡが作動可能に結合しているものである複製可能なベクターを包含する。この側面は、さらにこのベクターで形質転換した宿主細胞および、ＣＨＦをコードするｃＤＮＡを形質転換宿主細胞の培養物中に発現させることおよび宿主細胞培養物からＣＨＦを回収することを含む、ＣＨＦ製造のためのｃＤＮＡの使用法も包含する。この様式で製造したＣＨＦは好ましくは実質的に均一なマウスまたはヒトＣＨＦである。本発明はさらに、哺乳類に治療的有効量のＣＨＦを投与することを含む、心不全、不整脈、筋変力性、または神経学的疾患を持つ哺乳類を処置する好適な方法を包含する。要すれば、このＣＨＦは、欝血性心不全の場合にはたとえばカプトプリルのようなＡＣＥ阻害剤と、または、その他の型の心不全または心臓疾患の場合にはその他の心筋栄養、抗不整脈、または筋変力剤と、または神経学的疾患の場合には、たとえば、ＩＧＦ−Ｉ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＮＤＦ、ＮＴ−４、ＮＴ−５などのような神経栄養性分子と、組合せて投与される。２．天然配列ＣＨＦおよび変異体の調製以下の議論は殆どＣＨＦ核酸を含むベクターで形質転換した細胞を培養して、細胞培養物からこのポリペプチドを回収することによるＣＨＦの生産に関する。さらに、１９９１年５月１６日に発行されたＷＯ９１／０６６６７に提供されるようにこの発明のＣＨＦが相同的組換えにより生産しうることも概観する。略述すれば、この方法は内在性ＣＨＦ遺伝子を含む初代哺乳類細胞（たとえば、もし所期のＣＨＦがヒトのものであればヒトの細胞）を増幅可能な遺伝子（たとえばジヒドロ葉酸還元酵素［ＤＨＦＲ］または下記のその他のもの）およびＣＨＦ遺伝子の増幅を提供するためのＣＨＦ遺伝子のコード領域の座におけるＤＮＡ配列と相同的な少なくとも１５０ｂｐの長さのフランキング領域少なくとも１個を含む構築物（すなわちベクター）で形質転換することを包含する。この増幅可能な遺伝子はＣＨＦ遺伝子の発現を妨害しない部位になければならない。この形質転換は構築物が相同的に初代細胞のゲノムに組込まれて増幅可能領域が決定するように実行される。構築物を含有する初代細胞を次に構築物中に存在する増幅可能遺伝子または他のマーカーによって選択する。マーカー遺伝子の存在により宿主ゲノム中への構築物組込と存在を確認する。第二宿主で選択するので、初代細胞をこれ以上に選択することは不要である。所望なら、相同的組換えの存在をＰＣＲを利用して得た増幅ＤＮＡ配列を配列決定するか、または正確な相同的組込体からのＤＮＡが存在し、このような断片を含有する細胞のみを展開する時には、適当な長さのＰＣＲ断片を測定することにより決定することができる。また、所望ならば、選択した細胞を、この時点で細胞に適当な増幅剤（増幅遺伝子がＤＨＦＲであればメトトレキセートのようなもの）でストレスをかけることにより標的遺伝子の多重コピーが得われる様に増幅してもよい。しかしながら、下記の第二の形質転換後まで増幅段階を行わないのが好ましい。選択段階後、全増幅可能領域を含むのに十分な大きさがあるゲノムＤＮＡ部分を選択した初代細胞から分離する。第二の哺乳類発現宿主細胞を次にこれらゲノムＤＮＡ部分で形質転換し、クローニングし、および増幅可能な領域を含むクローンを選択する。初代細胞の中で増幅してなければ、増幅可能領域を次に増幅剤によって増幅する。最後に、ＣＨＦを含む増幅可能領域の多重コピーを含有する第二の発現宿主細胞を成育させて遺伝子を発現させ、蛋白を調製する。Ａ．ＣＨＦをコードするＤＮＡの分離ＣＨＦをコードするＤＮＡはＣＨＦｍＲＮＡを有し、それを検出可能な濃度で発現すると信じられる組織から製造したｃＤＮＡライブラリーから調製しうる。このｍＲＮＡは、例えば、７日間分化した胚様体から適切に調製する。ＣＨＦ遺伝子はゲノムライブラリーから、または完全なヌクレオチドまたはアミノ酸配列が既知であると仮定して前記の試験管内オリゴヌクレオチド合成によって得ることができる。目的遺伝子またはそれがコードする蛋白質を確認するように設計したプローブでライブラリーを検索する。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについて適切なプローブは、たとえば：ＣＨＦを認識して特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同一または相違する種からのＣＨＦｃＤＮＡの既知のまたは推測上の部分をコードする長さの約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド；および／または同一または類似の遺伝子をコードする相補的または相同的ｃＤＮＡまたはその断片など、を包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーを検索するのに適当なプローブは、これに限定するものではないが、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、または同一または類似の遺伝子をコードするその断片、および／または相同的ゲノムＤＮＡまたはその断片、を包含する。選択したプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの検索は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１０〜１２章に記載のような標準的操作を使用して実施しうる。ＣＨＦをコードする遺伝子を分離するための別法の一つは前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１４章に記載のようなＰＣＲ法を使用することである。この方法はＣＨＦにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択方針を次に記載する。この発明を実施する好適な方法は様々な組織、好ましくは哺乳類の分化した胚様体および胎盤、心臓、および脳細胞系列の組織、からのｃＤＮＡライブラリーを検索するために注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用するものである。さらに好ましくは、ヒト胚様体、胎盤、心臓および脳のｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブで検索する。プローブとして選択するオリゴヌクレオチド配列は十分な長さを持ち、十分に明確であって、偽陽性を最小にするものであるべきである。実際のヌクレオチド配列は通常保存性または高度に相同性のヌクレオチド配列に基づく。オリゴヌクレオチドは１個所またはそれ以上の個所で縮重していてもよい。優先的コドンの使用が知られていない種からのライブラリーを検索する場合には、縮重オリゴヌクレオチドの使用は殊に重要なものでありうる。このオリゴヌクレオチドは検索すべきライブラリー中のＤＮＡにハイブリッド形成した際に検出できるように標識しなければならない。標識の好適な方法は当分野でよく知られているポリヌクレオチドキナーゼで³²Ｐ−標識ＡＴＰを使用してオリゴヌクレオチドを放射能標識するものである。しかしながら、オリゴヌクレオチドを標識するにはこれに限定するものではないがビオチン化または酵素標識を包含する他の方法も使用しうる。殊に興味深いものは全長ポリペプチドをコードするＣＨＦ核酸である。好適な数種の態様において、この核酸配列は天然のＣＨＦシグナル配列を包含する。全蛋白質コード配列を持つ核酸は選択したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、最初は本明細書に記載する演繹されたアミノ酸配列を使用して検索し、また、要すれば前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの７．７９章に記載のような通常のプライマー延長法を使用して前駆体を検出し、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの中間体をプロセッシングすることによって得られる。Ｂ．天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体は適切なヌクレオチド変化を天然ＣＨＦのＤＮＡに導入するか、または所期ＣＨＦポリペプチドの試験管内合成によって調製される。このような変異体には、例えばマウスＣＨＦについて図１に、またヒトＣＨＦについて図５に示したアミノ酸配列内の残基からの欠失、挿入または置換を包含する。欠失、挿入および置換の組合せはいずれも所望の性質を有する最終構築物に到達するために行う。この発明の範囲からはＣＨＦのラット同族体であるＣＨＦ変異体またはポリペプチド配列が除外される。アミノ酸変化は、たとえばグリコシル化部位の位置数を変更するような、天然ＣＨＦの翻訳後過程も変更しうる。天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体の設計では、突然変異部位および突然変異の性質は修正すべきＣＨＦの性質に依存する。例えばＣＨＦ拮抗剤または超作動剤の候補は最初はＣＨＦおよび成長ホルモン（ＧＨ）／サイトカイン受容体ファミリーの一員、特にＣＮＴＦおよび白血病阻害因子（ＬＩＦ）に結合する他のリガンド中の同一または高度に保存性である部位に配置することによって選択する。この突然変異のための部位は個々にまたは一連のものとして修飾できる。たとえば（１）最初に保存性アミノ酸を選択し、次に達成した結果に依存してさらに選択を進めて置換すること、（２）標的残基を除去すること、（３）同一または異なる分類の残基を存在する部位の隣に挿入すること、または１〜３の組合せ。突然変異誘発のための好適な位置である天然ＣＨＦポリペプチドのある残基または領域を確認するための有用な方法の一つは「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれ、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年）が記載している。ここで一残基または標的残基群を確認し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、中性またはマイナス荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換して細胞の中または外側の周囲の水性環境とアミノ酸との相互作用に影響を与える。置換に対して機能的な感受性を示したドメインを次にその置換部位でまたはそれに向けてさらにまたは別の変異を導入することによって改良する。そこで、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定する一方、突然変異の性質そのものは予備的に決める必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の様式を最適化するために、アラニン走査またはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは標的領域で行い、生成したＣＨＦ変異体を所期活性の最適な組合せについて検索する。アミノ酸配列変異体の構築での主たる基本的変化には：突然変異部位の位置と突然変異の性質との２種がある。図１または図５の配列からの変異体があり、これらは天然に存在するアレル（これは天然のＣＨＦＤＮＡを操作する必要がない）か、あるいは天然に存在しないアレルまたは変異体に到達するためにこのＤＮＡを突然変異することによって製造した予定した突然変異体である。一般に、選択した突然変異の位置と性質は修飾すべきＣＨＦの性質に依存する。アミノ酸配列欠失は一般に約１から３０残基にわたり、より好ましくは約１から１０残基であり、通常隣接するものである。隣接する欠失は通常は偶数の残基について行われるが、単数または奇数の欠失もこの範囲内である。ＣＨＦの活性を修飾するための欠失はＣＨＦとヒトＣＨＦアミノ酸配列に対する配列同一性の殆どを共有するＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに結合するその他のリガンドとの間で相同性の低い領域に導入しうる。ＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに結合する他のリガンドの受容体結合部位の一つと実質的相同性領域内のＣＨＦからの欠失はＣＨＦの生物学的活性をより顕著に修飾する可能性があるらしく思われる。逐次的欠失の数は影響されるドメイン、たとえばベータプリーツシートまたはアルファ螺旋などＣＨＦ三次構造を保存するように選択する。アミノ酸配列挿入は長さ１残基から１００残基またはそれ以上を含むポリペプチドの範囲にわたるアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに単数または複数アミノ酸残基の配列内部挿入を含む。配列内部挿入（すなわち、成熟ＣＨＦ配列内部への挿入）は一般に約１から１０残基、より好ましくは１から５、最も好ましくは１から３残基にわたりうる。挿入は好ましくは残基偶数について行うが、しかしこれは必須ではない。末端挿入の例はＮ−末端メチオニル残基を持つ成熟ＣＨＦ、組換え細胞培養での成熟ＣＨＦ直接生産の人工生成物、および組換え宿主から成熟ＣＨＦの分泌を促進するための異種Ｎ−末端シグナル配列の成熟ＣＨＦ分子のＮ−末端への融合を包含する。このようなシグナル配列は一般に意図する宿主細胞種から得られ、それ故、それに同種的である。適当な配列には大腸菌ではＳＴＩＩまたはｌｐｐ、酵母についてはアルファ因子、および哺乳類細胞についてはヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルを包含する。天然ＣＨＦ分子のその他の挿入変異体にはたとえばβ−ラクタマーゼのような細菌ポリペプチドなど免疫原ポリペプチドまたは大腸菌ｔｒｐ座がコードする酵素または酵母蛋白質の、天然ＣＨＦのＮ−またはＣ−末端への融合、および１９８９年４月６日発行のＷＯ８９／０２９２２に記載のような、たとえば免疫グロブリン定常領域（またはその他免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチンのような半減期の長い蛋白質とのＣ−末端融合を包含する。変異体の第３群はアミノ酸置換変異体である。この変異体は天然ＣＨＦ分子のアミノ酸残基少なくとも１個が除去され、その場所に異なる残基を挿入したものである。置換的突然変異誘発のために最大の興味がある部位は天然ＣＨＦの活性部位として知られる部位および既知の同族体中に見られるアミノ酸が側鎖の嵩高さ、電荷、または親水性の面で実質的に異なるが、しかし種々の動物ＣＨＦ種内の選択した部位において高度な配列同一性がある部位か、あるいはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーおよび新規ＣＨＦに結合する既知リガンドに見られるアミノ酸が嵩高さ、電荷、または親水性の面で実質的に異なるが、しかし種々の動物リガンド同族体（たとえば、全動物ＣＮＴＦ分子間）の選択した部位において高度な配列同一性があるものである。この解析は心臓肥大、抗不整脈、筋変力作用、および神経栄養因子の活性の分化に関与する残基を目立たせ、これらの部位における変異体は活性に影響を与えるものとなろう。興味あるその他の部位は種々の種から得られるＣＨＦの特定の残基において全動物種のＣＨＦおよび他のＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー分子に結合するリガンドの間で同一のものであって、これらの酵素に共通の生物学的活性を達成するための重要性をこの一致の程度が示唆する。これらの部位、特に少なくとも３個の同様に保存された部位の配列内にあるもの、は比較的保存性のある様式で置換される。このような保存性のある置換は好適な置換との表題の下に表１に列記する。もしそのような置換が生物学的活性の変化を招くなら、さらに表１の例示的置換に割付けたもの、またはアミノ酸のクラスに関連して以下に記載するような実質的な変化を導入して生成物を検索する。天然ＣＨＦの機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は（イ）置換の領域内においてポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたはラセン立体配座、（ロ）標的部位における分子の電荷または親水性、または（ハ）側鎖の嵩高さの維持に及ぼす効果において顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然起源の残基はその側鎖に共通な性質に基づいて数群に分類される：（１）親水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。非保存置換はこれら分類の構成員一つを他のものに交換する必要がある。このような置換残基も保存置換部位または、より好ましくは残余の（非保存）部位に導入しうる。本発明の一態様において、分子中に存在するプロテアーゼ切断部位を不活性化するのが好ましい。これらの部位はコードされたアミノ酸配列を観察することによって特定でき、トリプシンの場合は、たとえばアルギニルまたはリジニル残基に変換する。プロテアーゼ切断部位が決まったら、標的残基を他の残基、好ましくはたとえばグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような親水性残基に置換することによって；またはその残基を欠失することによって；またはその残基の直後にプロリル残基を挿入することによって；これらを蛋白分解的切断に対して不活性化する。別の態様では開始シグナル配列のメチオニル残基以外のいずれかのメチオニル残基またはそれらメチオニル残基から約３残基Ｎ−またはＣ−末端側に存在するいずれかの残基を他の残基に（好ましくは表１に従って）置換するかまたは除去する。あるいは、その部位に隣接して約１〜３残基を挿入する。天然ＣＨＦの固有の立体配座の維持に関与しないどのシステイン残基も一般にはセリンに置換して分子の酸化に対する安定性を改善し、また異常な交差結合を防止する。天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当業界で公知の様々な方法によって製造される。これらの方法は、これに限定するものではないが、天然源からの分離（天然起源アミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および以前に調製した変異体または天然ＣＨＦの非変異体版のカセット突然変異誘発を包含する。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は天然ＣＨＦＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体の調製には好適な方法である。この技術はＡｄｅｌｍａｎなど、ＤＮＡ、２巻：１８３頁（１９８３年）に記載のように当分野でよく公知である。略述すれば、ＣＨＦの無変化または天然ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの単鎖型であるＤＮＡ鋳型に所期の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成することによって、天然ＣＨＦＤＮＡを変更する。ハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドプライマーを挿入し、天然ＣＨＦＤＮＡに選択した変化をコードする鋳型の第２相補鎖全体を合成する。一般に、長さ少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは突然変異をコードするヌクレオチドの両側に鋳型に全く相補的な１２から１５ヌクレオチドを持つ。これはオリゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリッド形成することを保証する。このオリゴヌクレオチドはＣｒｅａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻：５７６５頁（１９７８年）が記載するような当業界で公知の技術を使用して容易に合成される。このＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（商業的に入手可能なＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９が適当である）か、またはＶｉｅｒａなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：３頁（１９８７年）が記載する単鎖ファージ複製開始点を含むベクターかから誘導したベクターによって作成できる。そこで、突然変異すべきＤＮＡをこれらベクターに挿入して単鎖鋳型を作成しうる。単鎖鋳型の調製法は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの４．２１〜４．４１章に記載がある。あるいは、単鎖ＤＮＡ鋳型は２重鎖プラスミド（またはその他の）ＤＮＡを標準的技術を使用して変性することによって作成できる。天然ＤＮＡ配列の変更（例えば、アミノ酸配列変異体を作成するため）には、オリゴヌクレオチドを単鎖鋳型に適当な条件下にハイブリッド形成する。次に、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片であるＤＮＡ重合酵素を添加し、オリゴヌクレオチドを合成用プライマーとして使用して鋳型の相補鎖を合成する。こうして、ＤＮＡ鎖の一つが天然ＣＨＦの突然変異型をコードし、他の鎖（元来の鋳型）が天然の変更のないＣＨＦ配列をコードするように形成したヘテロ二重ラセン分子を形成する。このヘテロ二重ラセン分子を次に通常はたとえば大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物である適当な宿主細胞に形質転換する。細胞が成長した後、それらをアガロース板に置き、³²Ｐで放射能標識したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して検索して突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを検出する。突然変異した領域を取り、一般に適当な宿主の形質転換に典型的に採用する型の発現ベクターである、適当なベクターに入れて蛋白質を生産する。直前に記載した方法はプラスミドの両鎖が突然変異を含むものであるホモ二重ラセン分子が形成されるようにも修正しうる。この修正法は以下の通りである：単鎖オリゴヌクレオチドをアニールして前記のような単鎖鋳型とする。デオキシリボヌクレオチド３種、すなわちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物をｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修正チオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社から入手できる）と混合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一なＤＮＡ鎖が作成される。これに加えて、このＤＮＡの新鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する。この二重鎖へテロ二重ラセンの鋳型鎖を適当な制限酵素でニックした後に鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼで消化して、突然変異誘発すべき部位を含む領域をパストできる。この反応を次に停止して部分的に単鎖である分子を残す。次にＤＮＡポリメラーゼをデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート４種全部、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下に使用して完全な二重鎖ＤＮＡホモ二重ラセンを形成する。このホモ二重ラセン分子で次に前記大腸菌ＪＭ１０１のような適当な宿主細胞を形質転換する。置換するアミノ酸１個またはそれ以上を持つ天然ＣＨＦのＤＮＡでコードした突然変異体は数種の方法の一つで作成する。もしアミノ酸がポリペプチド鎖内で互いに近接して存在するなら、それらは所期のアミノ酸置換全部をコードするオリゴヌクレオチド１個を使用して同時に突然変異しうる。しかしながら、もしもアミノ酸が互いにある距離をおいて位置する（約１０アミノ酸またはそれ以上離れている）なら、所期の変化全部をコードする単一なオリゴヌクレオチドを作成するのはより困難である。その代わりに、別の二法の一つを採用しうる。第一の方法では置換すべきアミノ酸のための別のオリゴヌクレオチドを作成する。これらオリゴヌクレオチドを次に同時に単鎖鋳型ＤＮＡにアニールすれば、鋳型から合成された第二の鎖は所期のアミノ酸置換全部をコードする。もう一つの方法は所期の突然変異体を生産するために二回またはそれ以上の突然変異誘発を含む。第一回は単一突然変異体について記載したものである：野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所期アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールして、ヘテロ二重ラセンＤＮＡ分子を作成する。突然変異誘発の第二回では第一回の突然変異誘発で製造した突然変異体ＤＮＡを鋳型として使用する。こうして、この鋳型は既に突然変異１個またはそれ以上を含有する。次に、付加的な所期アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、得られる第１および第二回突然変異誘発の双方をコードするＤＮＡの鎖を得る。得られたこのＤＮＡを第三回の突然変異誘発では鋳型とし、さらに反復して使用できる。ＰＣＲ突然変異誘発も天然ＣＨＦのアミノ酸変異体を作るために適当である。下記の議論はＤＮＡについて行うが、この技術はＲＮＡへも応用できると理解される。ＰＣＲ技術は一般に次の操作を示す（前記Ｅｒｌｉｃｈ、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉによる章、６１〜７０頁参照）：ＰＣＲで微量の鋳型ＤＮＡを使用する時には、鋳型ＤＮＡの対応する領域とは配列がすこし異なるプライマーを使用して鋳型とはプライマーが鋳型とは異なる位置のみで配列が異なっている鋳型とは異なる比較的多量の特定のＤＮＡ断片を生産する。プラスミドＤＮＡへの突然変異の導入には、プライマーの一つを突然変異の位置を重複するように、また突然変異を含有するように設計する；他のプライマーの配列はプラスミドの対立鎖配列の延長と同一でなければならないが、しかしこの配列はプラスミドＤＮＡに沿うどの場所に配置することもできる。しかしながら、最後にプライマーによって結合されたＤＮＡの全増幅領域を容易に配列決定できるように第二のプライマーの配列が第一のものから２００ヌクレオチド以内に配置することが望ましい。前記のようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅はプライマーが特定する突然変異の位置および、鋳型コピーはいくらか誤差を伴うので可能性としては他の位置でも、相違するＤＮＡ断片の集団を与える。もし鋳型対生成物物質の比率が極端に低ければ、大多数の生成物ＤＮＡ断片は所期の突然変異を含有している。この生成物質を使用してプラスミド内の対応する領域を置換し、これを標準的ＤＮＡ技術を使用するＰＣＲの鋳型として役立てる。離れた位置での突然変異は第二突然変異プライマーを使用するか、または異なる突然変異プライマーでの第２ＰＣＲを行い、得られるＰＣＲ断片２種をベクターに三（またはそれ以上）部分ライゲーションで同時に結合することによって導入する。ＰＣＲ突然変異誘発の特定の実施例では、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を増幅すべき領域外のプラスミドＤＮＡ内に独特な認識部位を持つ制限エンドヌクレアーゼで消化することによってリネアライズする。この物質の１００ｎｇをデオキシヌクレオチドトリ燐酸４種を含むＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社、ノーウォーク、ＣＴおよびエマリービル、ＣＡから入手）に入れて、各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌに加えて最終容積５０μＬとした。反応混合物に３５μＬの鉱物油を重積した。反応混合物を１００℃で５分間変性し、氷上に暫時置き、次にＴｈｅｒｍｕｓ・ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社）を油層の下に添加した。次に反応混合物を次のように設定したＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社から購入）に注入した：５５℃２分間、７２℃３０秒間、次に下記を１９サイクル：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、および７２℃３０秒間。プログラムの最後に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水層を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容）で抽出し、エタノール沈降し、ＤＮＡを標準的操作によって回収する。続いて、この物質をベクターに挿入するための適当な処理を行う。変異体を調製するもう一つの方法はカセット突然変異誘発であってＷｅｌｌｓなど、Ｇｅｎｅ、３４巻、３１５頁（１９８５年）に記載の技術に基づく。出発物質はプラスミド（またはその他のベクター）であって、突然変異すべき天然ＣＨＦＤＮＡを含有する。突然変異すべき天然ＣＨＦＤＮＡ中のコドンを確認する。確認された突然変異部位の各末端には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しなければ、前記オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を使用して、それらを天然ＣＨＦＤＮＡ中の適当な位置に導入しうる。制限部位をプラスミドに導入した後、そのプラスミドをこれらの部位で切断してリネアライズする。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが、所期の突然変異を含有する二重鎖オリゴヌクレオチドを標準的操作を使用して合成する。この鎖２個を別々に合成し、次に標準的技術を使用してハイブリダイズする。この二重鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼称する。このカセットはプラスミドに直接連結できるようにリネアライズしたプラスミドの両端と適合する３’および５’末端を持つように設計される。このプラスミドはここで天然ＣＨＦから突然変異したＣＨＦＤＮＡ配列を含有する。Ｃ．複製可能なベクターへの核酸の挿入ＣＨＦをコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を複製可能なベクターに挿入してさらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現を行う。多数のベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は１）増幅またはＤＮＡ発現に使用するかどうか、２）そのベクターに挿入すべき核酸の大きさ、および３）そのベクターで形質転換すべき宿主細胞、に依存する。各ベクターはその機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。このベクター成分は一般にこれに限定するわけではないが次の１個またはそれ以上を含有する：シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。（ｉ）シグナル配列成分この発明のＣＨＦは直接的に製造されうるのみでなく、異種ポリペプチド、好ましくは成熟蛋白質またはポリペプチドのＮ−末端において特異的な切断部位を持つシグナル配列またはその他ポリペプチドであるもの、との融合物としても製造しうる。一般に、このシグナル配列はベクターの成分でありうるが、ベクターに挿入されたＣＨＦＤＮＡの一部でもありうる。選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであるべきである。天然ＣＨＦシグナル配列を認識も処理もしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は原核生物シグナル配列、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーから構成される群から選択したもの、によって置換される。酵母分泌については、天然シグナル配列は、たとえば酵母インベルターゼリーダー、酵母アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクライベロマイセスα −因子リーダを含む；後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許第５０１０１８２に記載されている）、酵母酸性ホスファターゼリーダー、マウス唾液腺アミラーゼリーダー、カルボキシペプチダーゼリーダー、酵母ＢＡＲ１リーダー、Ｈｕｍｉｃｏｌａ・ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行の欧州特許３６２１７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルでありうる。哺乳類細胞発現においては天然ヒトシグナル配列（すなわち、生体内で正常にはヒト細胞からの天然ＣＨＦの分泌を指向するＣＨＦプレ配列）が満足すべきものであるが、たとえば他種動物ＣＨＦからのシグナル配列、他のＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーの構成員に結合するリガンドからの配列、および同一または関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびに、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーのような他の哺乳類シグナル配列も適当でありうる。このような前駆体領域のためのＤＮＡは読み取り枠内で成熟ＣＨＦをコードするＤＮＡに連結させる。（ｉｉ）複製開始点成分発現およびクローニングベクターは双方とも選択した宿主細胞１種またはそれ以上においてベクターに複製を可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいてはこの配列はベクターに宿主の染色体ＤＮＡとは独立な複製を可能にするが、複製開始および自律的複製配列を包含する。そのような配列は様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく公知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は殆どのグラム陰性細菌に対して適切であり、２μプラスミドの開始点は酵母に対して適切であり、また種々のウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳類細胞中のクローニングベター用に有用である。一般に、複製開始点成分は哺乳類の発現ベクターには不要である（ＳＶ４０の開始点が典型的に使用されうるが、この理由は早期プロモーターを含有することのみによる）。殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクター、すなわち、それらは少なくとも１群の生物内で複製できるが、発現用に他生物への遺伝子移入もできる。例えば、大腸菌内である種のベクターをクローニングすると、同じベクターを、宿主細胞の染色体から独立して複製することができないにもかかわらず、発現のために酵母または哺乳類の細胞に遺伝子移入できる。ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによっても増幅しうる。これは、例えばバチルスのゲノムＤＮＡに見られる配列に相補的なＤＮＡ配列をベクターに導入することによって、宿主としてバチルス属菌を使用して容易に達成される。このベクターによるバシラス菌の遺伝子移入はゲノムとの相同的な組換えおよびＣＨＦＤＮＡの挿入を招く。しかしながら、ＣＨＦをコードするゲノムＤＮＡの回収には、ＣＨＦＤＮＡを切断するに要する制限酵素消化が必要なので、外因的に複製したベクターのそれよりも複雑である。（ｉｉｉ）選択遺伝子成分発現およびクローニングベクターは選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むべきである。この遺伝子は選択培養培地内に生育する形質転換宿主細胞の生存または生育に必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞はこの培養培地内では生存しない。典型的な選択遺伝子は（イ）たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他毒物に対する耐性を与える、（ロ）栄養要求性欠如を与える、または（ハ）たとえば、バシラス菌に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子など、複合培地から得られない限界的栄養を供給する、蛋白質をコードする。選択様式の一例は宿主細胞の生長を休止する薬剤を使用する。これらの細胞は異種遺伝子で成功裏に形質転換されれば薬剤耐性を与える蛋白質を生産するので選択状況下で生存する。そのような主たる選択の例では薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１巻：３２７頁［１９８２年］）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２頁［１９８０年］）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：４１０〜４１３頁［１９８５年］）を使用する。これら３例は真核生物制御下に細菌遺伝子を採用し、適当な薬剤、各々Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える。哺乳類細胞に対する適当な選択可能マーカーの別の例は、たとえばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのようなＣＨＦ核酸を摂取する能力のある細胞の確認を可能にするものである。哺乳類細胞形質転換体をマーカーを摂取することにより形質転換体のみが独特に生存に適応する選択圧下に置く。選択圧は培地中の選択剤の濃度を十分に変化させて、そこで選択遺伝子とＣＨＦをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導くような条件にして形質転換体を培養することによって与える。増幅は生育に必須な蛋白質の生産用に要求の大きい遺伝子が組換え細胞の逐次的世代の染色体の中で直列に反復することによる過程である。増幅されたＤＮＡからのＣＨＦ合成量は増加する。遺伝子増幅のその他の例はメタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを包含する。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞はまず形質転換体全部をＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地内で培養して確認する。野生型ＤＨＦＲを採用する時は適当な宿主細胞はＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年）に記載されたように調製され、培養されたＤＨＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列である。次に濃度を変えてメトトレキセートを形質転換した細胞と接触させる。これでＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーの合成および、同時にＣＨＦをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他種ＤＮＡの多重コピーを招来する。この増幅技術はたとえばＡＴＣＣ・ＣＣＬ６１・ＣＨＯ−Ｋ１のようなそうでなければ適当な宿主について例えば、もしＭｔｘに高度に耐性のある突然変異ＤＨＦＲ遺伝子が採用されれば（欧州特許第１１７０６０）内在性ＤＨＦＲが存在しても使用できる。あるいは、ＣＨＦ、野生型ＤＨＦＲ蛋白質、および、たとえばアミノグリコシド・３−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のようなもう一つの選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換したか共形質転換した宿主細胞（殊に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などアミノグリコシド抗生物質のような選択マーカー用選択剤を含有する培地内での細胞生育により選択できる。米国特許第４９６５１９９参照。酵母中で使用するために適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：３９頁［１９７９年］；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど、Ｇｅｎｅ、７巻：１４１頁［１９７９年］；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒなど、Ｇｅｎｅ、１０巻：１５７頁［１９８０年］）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５巻：１２頁［１９７７年］）トリプトファン中で生長する能力を欠いている酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在はトリプトファン不在下での生育による形質転換の検出に対して有効な環境を提供する。同様にＬｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はＬｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補充される。これに加えて、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターはクライベロマイセス酵母の形質転換に使用できる。Ｂｉａｎｃｈｉなど、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：１８５頁（１９８７年）。最近、ウシ組換えキモシンの大量生産用発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓについて報告された。Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：１３５頁（１９９０年）。クライベロマイセス工業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多重コピー発現ベターも開示されている。Ｆｌｅｅｒなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁（１９９１年）。（ｉｖ）プロモーター成分発現およびクローニングベクターは通常宿主生物により認識され、ＣＨＦ核酸に作動可能に結合するプロモーターを含有する。プロモーターは構造遺伝子の出発コドンから上流（５’）（一般に約１００から１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配列であって、たとえばＣＨＦ核酸配列のような作動可能に結合している特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する。そのようなプロモーターは典型的には誘導可能および構成的の２種に分類される。誘導プロモーターはそれが制御するＤＮＡからの転写レベルの向上をある種の培養条件、たとえば栄養の存在または不在または温度変化など、に反応して開始するプロモーターである。現在、様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、源泉ＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取り、分離したプロモーター配列をベクターに挿入することによりＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に結合させる。天然ＣＨＦプロモーター配列および異種プロモーター多数の双方ともＣＨＦＤＮＡの増幅および／または発現を指向して使用しうる。しかしながら、一般に天然ＣＨＦプロモーターと比較して組換え的に製造したＣＨＦのより大きい転写とより高い収率を与えるので、異種プロモーターが好適である。原核生物宿主に使用する適当なプロモーターにはβ−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７５巻：６１５［１９７８年］；およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：５４４頁［１９７９年］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁［１９８０年］および欧州特許３６７７６）、および、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］）を包含する。しかしながら、他の既知細菌プロモーターも適当である。それらヌクレオチド配列は公表され、リンカーまたはアダプターを使用して必要な制限部位を供給して、熟練した研究者がそれらをＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に連結することを可能にしている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔなど、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁［１９８０年］）。細菌系での使用のためのプロモーターもＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に結合するシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。真核生物に対するプロモーターは公知である。真核生物遺伝子はほとんど全てが転写が開始する部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を持つ。多数の遺伝子の転写開始点から７０から８０塩基上流に見られるもう一つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域であって、ここにＸは如何なるヌクレオチドでもありうる。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これはコード配列の３’末端へのポリＡテイル付加のシグナルでありうる。これら配列は全てが真核生物発現ベクターに適切に挿入される。酵母宿主での使用のために適当なプロモーター配列の例には３−ホスホグリセレートキナーゼ用プロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻：２０７３頁［１９８０年］）またはその他の、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、焦性ブドウ酸脱カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような解糖酵素（Ｈｅｓｓなど、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ・Ｒｅｇ．、７巻：１４９頁［１９６８年］；およびＨｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７巻：４９００頁［１９７８年］）を包含する。生長条件により制御される転写に付加的な利点を持つ誘導プロモーターであるその他の酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用を司る酵素プロモーター領域である。酵母発現で使用するために適当なベクターおよびプロモーターはさらにＨｉｔｚｍａｎなど、欧州特許７３６５７に記載がある。酵母のエンハンサーも酵母プロモーターと共に用いるのが有利である。哺乳類宿主細胞のベクターからのＣＨＦ転写は、宿主細胞系に適合するプロモーターである限り、たとえばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日発行の英国特許第２２１１５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、トリザルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなどから、熱ショックプロモーターから、および正常にはＣＨＦ配列に関連するプロモーターから、得られたプロモーターによって制御される。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０の制限断片として容易に得られ、これにはＳＶ４０ウイルス複製開始点も含む。Ｆｉｅｒｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（１９７８年）；ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２〜１４２７頁（１９８０年）；Ｐａｖｌａｋｉｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：７３９８〜７４０２頁（１９８１年）。ヒトのサイトメガロウイルス即時型プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として容易に取得できる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙなど、Ｇｅｎｅ、１８巻：３５５〜３６０頁（１９８０年）。ウシのパピローマウイルスをベクターとして使用する哺乳類宿主中での発現ＤＮＡ系は米国特許第４４１９４４６に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８に記載がある。サル細胞内での免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現についてはＧｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９５巻：５０３〜５０８頁（１９８２年）；単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーター制御下におけるマウス細胞内でのヒトの β−インターフェロンｃＤＮＡ発現についてはＲｅｙｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）；マウスおよびウサギ細胞培養中でのヒトのインターフェロン−β１遺伝子の発現についてはＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：５１６６〜５１７０頁（１９８２年）；およびプロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長末端反復を使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニースハムスター卵巣細胞、ヒラ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞内での細菌ＣＡＴ配列の発現についてはＧｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：６７７７〜６７８１頁（１９８２年）を参照。（ｖ）エンハンサーエレメント成分高等真核生物によるこの発明のＣＨＦをコードするＤＮＡの転写は、しばしばベクターにエンハンサーを挿入することによって増大する。エンハンサーは転写を増大すべきプロモーターに作用する通常は約１０から３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは相対的に方向および位置に依存せず、転写ユニットの５’（Ｌａｉｍｉｎｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：９９３頁［１９８１年］）および３’（Ｌｕｓｋｙなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、３巻：１１０８頁［１９８３年］）、イントロンの中（Ｂａｎｅｒｊｉなど、Ｃｅｌｌ、３３巻：７２９頁［１９８３年］）、ならびにコード配列自体の内部（Ｏｓｂｏｒｎｅなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、４巻：１２９３頁［１９８４年］）に見出されている。哺乳類遺伝子には多数のエンハンサー配列が今では公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、通常真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。この例には複製開始点後期側ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点後期側ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化用エンハンサーエレメントに関してはＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照。エンハンサーはベクターにＣＨＦコード配列の５’または３ ’位でスプライスしうるが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置させる。（ｖｉ）転写終結成分真核生物宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、その他の多細胞生物からの有核細胞）中で使用する発現ベクターは転写の終結とｍＲＮＡ安定化に必要な配列も包含する。このような配列は通常真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５’、時には３’から入手できる。これらの領域はＣＨＦをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを包含する。（ｖｉｉ）ベクターの構築および分析前記の成分１個またはそれ以上を含む適当なベクターの構築には標準的な連結技術を採用する。必要なプラスミドを作成するように、分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、および所期の型に再連結する。構築したプラスミド中の正確な配列を確認する分析のために、連結混合物を用いて大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、適当ならば成功した形質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析するか、および／またはＭｅｓｓｉｎｇなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年）の方法またはＭａｘａｍなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５巻：４９９頁（１９８０年）の方法によって配列決定する。（ｖｉｉｉ）一時的発現ベクターＣＨＦをコードするＤＮＡの哺乳類細胞で一時的発現を提供する発現ベクターはこの発明の実施において殊に有用である。一般に、一時的発現ではその宿主細胞が発現ベクターのコピー多数を蓄積するように宿主細胞中で効果的に複製でき、次に、その発現ベクターがコードする所期ポリペプチドを高濃度で合成することのできる発現ベクターを使用する。前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１６．１７〜１６．２２。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一時的発現系は、クローニングしたＤＮＡがコードするポリペプチドの好都合な陽性確認法ならびにそのようなポリペプチドの所期の生物学的または生理学的性質についての迅速な検索法を与える。こうして、一時的発現系は生物学的に活性な天然ＣＨＦの同族体および変異体の確認の目的のために、本発明には殊に有用である。（ｉｘ）脊椎動物細胞ベクターの適例組換え脊椎動物細胞培養中でＣＨＦの合成への適応に適するその他の方法、ベクター、および宿主細胞についてはＧｅｔｈｉｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）；Ｍａｎｔｅｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：４０〜４６頁（１９７９年）；欧州特許１１７０６０；および欧州特許１１７０５８に記載がある。ＣＨＦの哺乳類細胞培養生産のために殊に有用なプラスミドはｐＲＫ５（欧州特許３０７２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＷＯ９１／０８２９１）である。ｐＲＫ５の誘導体ｐＲＫ５Ｂ（Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：１２７８〜１２８０［１９９１年］）はこのような発現に殊に適当である。Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換ここで、ベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞は前記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために適当な原核生物はたとえばグラム陰性またはグラム陽性生物のようなユーバクテリア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシェラ、プロテウスなどエシェリチア属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ・ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどサルモネラ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ・ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのようなセラチア属およびシゲラ属のような腸内細菌科ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（たとえば１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に開示のＢ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ・４１Ｐ）のようなバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、およびストレプトマイセス属を包含する。好適な大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌ＤＨ５α、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）も適当である。これらの例は例示であって、限定的なものではない。Ｗ３１１０株は組換えＤＮＡ生成物発酵用の普通の宿主株なので、殊に好適な宿主または親宿主である。宿主細胞は蛋白質分解酵素の分泌が最低であるのが好ましい。例えば、Ｗ３１１０株を修正して宿主内在性の蛋白質をコードするする遺伝子について遺伝子的突然変異を行いうるが、そのような宿主の例は完全遺伝子型ｔｏｎＡΔを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・１Ａ２株、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔ・ｐｔｒ３を持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・９Ｅ４株、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔ・ｐｔｒ３・ｐｈｏＡΔＥ１５・Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９・ΔｄｅｇＰ・ΔｏｍｐＴ・ｋａｎ^rを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・２７Ｃ７株（ＡＴＣＣ５５２４４）、完全遺伝子型ｔｏｎＡ・ｐｔｒ３・ｐｈｏＡΔ Ｅ１５・Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９・ΔｄｅｇＰ・ΔｏｍｐＴ・Δｒｂｓ７・ｉｌｖＧ・ｋａｎ^rを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・３７Ｄ６株、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異３７Ｄ６株であるＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・４０Ｂ４株、および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４９４６７８３に開示の周縁プロテアーゼ突然変異体を持つＥ．ｃｏｌｉ株を包含する。これとは別に、試験管内クローニング法、たとえばＰＣＲまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。原核生物に加えて糸状菌または酵母のような真核生物微生物もＣＨＦをコードするベクター用の適当なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはパン酵母は下等真核生物宿主微生物の中で最も普通に使用される。しかしながら、他の属、種、および株の多数が同様に利用でき、本発明に有用であり、たとえばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：１４０頁［１９８１年］；１９８５年５月２日発行の欧州特許１３９３８３）；クライベロミセス属宿主（米国特許第４９４３５２９；Ｆｌｅｅｒなど、前出）たとえばＫ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔなど、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７３７頁［１９８３年］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６９０６；Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇなど、前出）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２２２６）；Ｐｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許１８３０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａなど、Ｊ．Ｂａｓｉｃ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻：２６５〜２７８頁［１９８８年］）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ・ｒｅｅｓｉａ（欧州特許２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ・ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：５２５９〜５２６３頁［１９７９年］）；シュワニオミセス属たとえばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ・ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許３９４５３８）；および糸状菌たとえばノイロスポラ、ペニシリウム、トリポクラシウム（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）、およびアスペルギルス属宿主たとえばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２巻：２８４〜２８９頁［１９８３年］；Ｔｉｌｂｕｒｎなど、Ｇｅｎｅ、２６巻：２０５〜２２１頁［１９８３年］；Ｙｅｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：１４７０〜１４７４頁［１９８４年］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ・Ｊ．、４巻：４７５〜４７９頁［１９８５年］）を包含する。ＣＨＦ生産用に適当な宿主細胞は多細胞生物に由来する。そのような宿主細胞には複雑な処理ができ、グリコシル化活性がある。原理的には、脊椎動物または無脊椎動物のいずれからであっても、高等真核生物細胞培養は使用可能である。無脊椎生物細胞の例には植物および昆虫細胞を包含する。たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ・ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ・ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ・ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉのようなバキュロウイルス科の株と変種および対応する複製できる昆虫宿主細胞が確認されている。たとえばＬｕｃｋｏｗなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：４７〜５５頁（１９８８年）；Ｍｉｌｌｅｒなど、「遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．など編、８巻：（Ｐｌｅｎｕｍ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９８６年）、２７７〜２７９頁；およびＭａｅｄａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻：５９２〜５９４頁（１９８５年）参照。遺伝子移入用にたとえば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ・ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ・ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉ・ＮＰＶのＢｍ−５株などの種々のウイルス株が公共的に入手可能で、これらウイルスは、殊にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の遺伝子移入用に本発明用ウイルスとして使用しうる。綿、トウモロコシ、馬鈴薯、大豆、ペチュニア、トマト、および煙草の植物細胞培養は宿主として使用できる。典型的には、予めＣＨＦＤＮＡを含ませるように処理した細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株とインキュベーションすることによって植物細胞に遺伝子移入する。植物細胞培養物のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとのインキュベーションの間に、ＣＨＦをコードするＤＮＡは植物細胞宿主に移行して遺伝子移入し、適当な条件下でＣＨＦＤＮＡを発現する。これに加え、たとえばノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞に適合する制御およびシグナル配列も入手可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１巻：５６１頁（１９８２年）。これに加え、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流から分離したＤＮＡセグメントは組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写水準を活性化または向上することができる。１９８９年７月２１日発行の欧州特許３２１１９６。しかしながら、最も注目を引くのは脊椎動物細胞であって、培養中での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は近年では日常的操作になっている（「組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編［１９７３年］）。有用な哺乳類宿主細胞系列の例はＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞系列（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓系列（２９３または懸濁培養での生育用にサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁［１９７７年］）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁［１９８０年］）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１５７８）；ヒト頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ・Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、Ａｎｎａｌｓ・ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁［１９８２年］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系列（Ｈｅｐ・Ｇ２）である。宿主細胞にこの発明の前記発現またはクローニングベクターを遺伝子移入して好適に形質転換し、プロモーターを誘発するために適当なように修正した通常の栄養培地中で培養し、形質転換体を選択し、または所期配列をコードする遺伝子を増幅する。遺伝子移入は宿主細胞が発現ベクターを取り込むことであって、いずれかのコード配列が実際に発現するかどうかには関わらない。当業者には、たとえばＣａＰＯ₄および電気穿孔法など、多数の遺伝子移入法が公知である。遺伝子移入の成功は一般に宿主細胞でこのベクターが作動した兆候が起きた時に認識される。形質転換は生物体へのＤＮＡの導入であって、そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体への挿入によって複製可能であることを意味する。使用する宿主に応じ、形質転換はその細胞に適する標準的技術を使用して行う。実質的細胞壁障壁を持つ原核生物その他の細胞には前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．８２章に記載の塩化カルシウムを採用するカルシウム処理または電気穿孔法が一般的に使用される。ある種の植物細胞の形質転換用にはＳｈａｗなど、Ｇｅｎｅ、２３巻：３１５頁（１９８３年）および１９８９年６月２９日発行のＷＯ８９／０５８５９に記載のようにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染が使用される。これに加え、１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５８に記載のように植物は超音波処理を使用して遺伝子移入しうる。このような細胞壁を持たない哺乳類細胞ではＧｒａｈａｍとｖａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７８年）の燐酸カルシウム沈降法が好適である。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面はＡｘｅｌが１９８３年８月１６日発行の米国特許第４３９９２１６に記載している。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ・Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．（ＵＳＡ）、７６巻．３８２９頁（１９７９年）の方法に従って実施される。しかしながらＤＮＡを細胞に導入するその他の方法、たとえば核微注入法、電気穿孔法、無傷細胞との細菌原形質融合、ポリブレン、ポリオルニチンなどポリカチオン、などのようなものも使用しうる。哺乳類細胞を形質転換するための種々の技術についてはＫｅｏｗｎなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻：５２７〜５３７頁（１９９０年）およびＭａｎｓｏｕｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻：３４８〜３５２頁（１９８８年）を参照。Ｅ．宿主細胞の培養この発明のＣＨＦポリペプチドを生産するために使用する原核生物細胞は一般的にＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、が記載のような適当な培地中で培養する。この発明のＣＨＦを生産するために使用する哺乳類宿主細胞は種々の培地中で培養しうる。たとえばＨａｍのＦ−１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコの修正イーグル培地（［Ｄ−ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、およびＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ）のような商業的に入手可能な培地は宿主細胞を培養するために適当である。これに加え、例えばＨａｍとＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５８巻：４４頁（１９７７年）；ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）；米国特許第４７６７７０４；４６５７８６６；４９２７７６２；５１２２４６９；または４５６０６５５；米国再発行特許第３０９８５；ＷＯ９０／０３４３０；またはＷＯ８７／００１９５に記載された培地のいずれも宿主細胞用の培養培地として使用しうる。これら培地はいずれも必要に応じてホルモンおよび／またはその他の成長因子（たとえばインスリン、トランスフェリン、アプロチニン、および／または内皮成長因子［ＥＧＦ］のような）、塩（たとえば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩のような）、緩衝液（ＨＥＰＥＳのような）、ヌクレオシド（たとえばアデノシンおよびチミジンのような）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬剤のような）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびブドー糖または均等なエネルギー源を添加しうる。その他の必要な添加物も当業者公知の適当な濃度で含有しうる。たとえば温度、ｐＨ、その他のような培養条件は発現用に選択した宿主細胞について前に使用されたもので、通常の当業者には明白である。一般に、哺乳類細胞培養物の試験管内生産性を最大にするための原理、実験計画および実用技術は「哺乳類細胞バイオテクノロジー：実用的手法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ・Ｐｒａｃｔｉｃａｌ・Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、（ＩＲＬ・Ｐｒｅｓｓ社、１９９１年）に見出すことができる。本開示に示す宿主細胞は試験管内培養中ならびに宿主動物内の細胞も含む。Ｆ．遺伝子増幅／発現の検出遺伝子増幅および／または発現は、例えば本明細書が提供する配列に基づいて常用のサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：５２０１〜５２０５頁［１９８０年］）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、または適当に標識したプローブを使用する原位置ハイブリッド形成、などによって試料中で直接に測定しうる。種々の標識、最も通常には放射性同位元素、殊に³²Ｐ、を採用しうる。しかしながら、たとえばポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを使用するようなその他の技術も採用しうる。次にビオチンはアビジンまたは抗体への結合部位として役立ち、たとえばこれを放射性核種、螢光基、酵素、その他のような広範な標識でラベルしうる。これとは別にＤＮＡ二重ラセン、ＲＮＡ二重ラセンおよびＤＮＡ−ＲＮＡ二重ラセンまたはＤＮＡ−蛋白質二重ラセンを含む特定の二重ラセンを認識できる抗体を採用しうる。次に抗体を標識し、表面に二重ラセンが形成すればその二重ラセンに結合する抗体の存在が検出できるようにして、二重ラセンが表面に結合するところでの検定を実施する。遺伝子発現は、これとは別に、たとえば組織切片の免疫組織化学的染色および遺伝子生産物発現を直接的に定量するための細胞培養物または体液の検定のような免疫学的方法により測定しうる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成し、続いて結合する遺伝子生産物に特異的な標識抗体と反応させる。通常この標識は、たとえば酵素標識、螢光標識、化学発光標識、その他のように可視的に検出可能なものである。本発明での使用に適当な、殊に高感度の染色技術はＨｓｕなど、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、７５巻：７３４〜７３８頁（１９８０年）に記載されている。免疫組織化学染色および／または試料液の検定用に有用な抗体はモノクローナルかポリクローナルかであって、哺乳類体内で産生しうる。抗体は天然ＣＨＦポリペプチドに対してまたは本明細書第４章記載のＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して好都合に作成しうる。Ｇ．ＣＨＦポリペプチドの精製ＣＨＦは好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナルなしに直接生産した時には宿主細胞溶菌液からも回収しうる。ヒト起源以外の組換え細胞内でＣＨＦを産生する時には、ＣＨＦはヒト起源蛋白質またはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、ＣＨＦに関して実質的に均質な製品を得るための細胞蛋白質またはポリペプチドからＣＨＦを精製することが必要である。第一段階で、宿主細胞または溶菌断片のいずれもの粒状破砕物を、例えば遠心分離または限外濾過などにより除去し；要すれば蛋白質を商業的に入手可能な蛋白質濃縮濾過で蛋白質を濃縮し；続いて、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（たとえば、ＤＡＥＡまたはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含むマトリックス上の）、ブルーセファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、コンＡ−セファロース、Ｅｔｈｅｒ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ・ＴｏｙｏｐｅａｒｌまたはプロテインＡセファロース上のクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（たとえば脂肪族基付加シリカゲル）、たとえばセファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用するゲル濾過、ＣＨＦを選択的に結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈降から選択した工程１回またはそれ以上によってＣＨＦをその他不純物から分離する。前記工程のいずれにもプロテアーゼ阻害剤を添加してプロテイン分解を防止しうる。適当なプロテアーゼ阻害剤の例にはフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リューコペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩−ベスタチン、キモスタチン、およびベンズアミジンを包含する。好適な精製方式は関連クローンを遺伝子移入した細胞の培養培地を１．５Ｍ− ＮａＣｌに調整し、Ｂｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商品名）カラムに装填することを含む。このカラムをＮａＣｌ含有トリス［ヒドロキシメチルアミノ］メタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５で洗浄し、活性を１０ｍＭ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商品名）３〜１０界面活性剤を含むＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶離する。活性の極大を１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に調整してＭＯＮＯ−Ｑ迅速フローカラムに入れる。このカラムをＮａＣｌおよびオクチルグルコシドを含むＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄する。活性は流過した画分中に見られる。活性物質は次に０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル中の逆相Ｃ４カラムに入れ、０．１％ＴＦＡから８０％までの勾配で溶離する。活性はゲル濾過カラム上で約１５〜３０ｋＤａに分画される。分割と回収にはグアニジン−ＨＣｌのようなカオトロープ剤が必要であると予期される。残基が欠失、挿入、または置換したＣＨＦ変異体は天然ＣＨＦと同様な方式でその変異によって起きる実質的な変化を配慮して回収される。例えばＣＨＦと、たとえば細菌またはウイルスの抗原など、その他のプロテインまたはポリペプチドとの融合物の製造は精製を促進する；この抗原に対する抗体を含む免疫親和性カラムを融合ポリペプチドを吸着するために使用できる。たとえばウサギのポリクローナル抗−ＣＨＦカラムのような免疫親和性カラムをそれに残りの免疫エピトープ少なくとも１個に結合することによってＣＨＦ変異体を吸着するために採用できる。前記定義のプロテアーゼ阻害剤も精製の間のプロテイン分解を防止するために有用でありうるし、また、抗生物質も偶発的な夾雑物の生育を防止するために添加しうる。熟練した当業者は天然ＣＨＦに対して適当な精製法は、組換え細胞培養中での生産に際してＣＨＦまたはその変異体の性質における変化に起因する修正が必要でありうることを認識するものである。Ｈ．ＣＨＦポリペプチドの共有結合修飾体ＣＨＦポリペプチドの共有結合修飾体はこの発明の範囲に含まれる。天然ＣＨＦと天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体との双方とも共有結合的に修飾しうる。この発明の範囲内にある共有結合的修飾の−型は変異体ＣＨＦ断片の製品である。４０アミノ酸残基までの変異体ＣＨＦ断片は化学合成または全長または変異体ＣＨＦポリペプチドの酵素的または化学的切断によって好都合に産生できる。ＣＨＦまたはその断片の他の型の共有結合的修飾は分子にＣＨＦまたはその断片の標的アミノ酸残基を選択した側鎖またはＮ−またはＣ−末端残基と反応することのできる有機誘導化試薬と反応させることにより導入される。システイニル残基は最も普通には、たとえばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのような、α−ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジサルファイド、メチル・２−ピリジルジサルファイド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても、誘導体化される。ヒスチジル残基はｐＨ５．５〜７．０でピロ炭酸ジエチルとの反応で誘導体化される。この試薬は相対的にヒスチジル側鎖に特異的である。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍ−ナトリウムカコジレート中で行う。リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその他カルボン酸の無水物と反応する。これら試薬での誘導体化にはリジニル残基の荷電を逆転する効果がある。α−アミノ−含有残基用のその他の適当な試薬は、たとえばメチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、水素化クロロボロン、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンおよびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ− 触媒反応を包含する。アルギニル残基は常用の試薬１種または数種との反応で修飾され、その中にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫ_aが高いため、反応をアルカリ性条件中で行うことが必要である。さらに、これら試薬はリジン基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基とも反応しうる。チロジル残基の特異的修飾はチロジル残基にスペクトル標識を導入する特異的な関心から芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって行われうる。最も通常には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用してＯ−アセチルチロジル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロジル残基を¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを使用して放射能免疫検定用の標識蛋白質を製造するためにヨード化するが、前記クロラミンＴ法が適当である。カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ− Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。ここに、ＲおよびＲ’ はたとえば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのように異なるアルキル基である。さらにその上、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。双官能性試薬での誘導体化は抗−ＣＨＦ抗体を精製するための方法またはその逆の方法で使用するために、ＣＨＦを水不溶性支持マトリックスまたは表面に交差結合するために有用である。通常使用する交差結合剤には、たとえば、１，１ −ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）のようなジサクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、などを包含する。メチル −３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導化試薬は光活性化可能な中間体を与え、それは光の存在下に交差結合を形成することができる。その他に、反応性の非水溶性マトリックス、たとえばシアノーゲンブロミド活性化炭水化物および米国特許第３９６９２８７；３６９１０１６；４１９５１２８；４２４７６４２；４２２９５３７；および４３３０４４０に記載の反応性基質は蛋白質固定化に利用される。グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱アミノ化されておのおの対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となる。これらの残基は中性または塩基性条件下に脱アミノ化される。これら残基の脱アミド化型はこの発明の範囲内に含まれる。その他の修飾はプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基にあるヒドロキシル基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖にあるα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「蛋白質：構造および分子の性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ・ａｎｄ・Ｍｅｏｌｅｕｌａｒ・Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、サンフランシスコ、７９〜８６頁［１９８３年］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化を包含する。この発明の範囲内に含まれるＣＨＦポリペプチドのもう一つの型の共有結合的修飾にはこのポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。ここに、変更は天然ＣＨＦに見られる炭水化物基１個またはそれ以上を除去し、および／または天然ＣＨＦには存在しないグリコシル化部位１個またはそれ以上を追加することを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ−結合かまたはＯ−結合である。Ｎ−結合は炭水化物基がアスパラギン残基の側鎖に付加することを示す。トリペプチド配列：アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここにＸはプロリン以外のアミノ酸である）はアスパラギン側鎖への炭水化物基の酵素的付加のための認識配列である。そこで、これらトリペプチド配列のいずれかのポリペプチドにおける存在はグリコシル化の可能性ある部位を構成する。Ｏ−結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つが、最も普通にはセリンまたはスレオニンであるヒドロキシアミノ酸に結合することを示すけれども５−ヒドロキシプロリンまたは５ −ヒドロキシリジンも使用しうる。ＣＨＦポリペプチドへのグリコシル化部位の結合は、前記のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位のための）１個またはそれ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成される。この変更は天然ＣＨＦ配列にセリンまたはスレオニン残基１個またはそれ以上の付加または置換（Ｏ−グリコシル化部位への）することによっても行いうる。容易にするには天然ＣＨＦアミノ酸配列を好ましくはＤＮＡ水準で、殊に天然ＣＨＦポリペプチドをコードするＤＮＡを所期アミノ酸に翻訳されるコドンを作成するように予め選択した塩基で突然変異することによって変更する。ＤＮＡ突然変異は２Ｂ項に前記した方法を用いて行いうる。ＣＨＦポリペプチド上の炭水化物基の数を増加する別の方法の一つはグリコシドの化学的または酵素的なポリペプチドへの結合である。これらの操作はＮ−またはＯ−結合グリコシル化について、グリコシル化性能を持つ宿主細胞内でポリペプチドの生産を要しない点で有利である。使用する結合様式に依存して、糖は（イ）アルギニンおよびヒスチジン、（ロ）遊離カルボキシル基、（ハ）システインにあるような遊離スルフヒドリル基、（ニ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンにあるような遊離ヒドロキシル基、（ホ）フェニルアラニン、チロジンまたはトリプトファンにあるような芳香族基、または（ヘ）グルタミンのアミド基、に付加しうる。これらの方法は１９８７年９月１１日発行ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ・Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載がある。ＣＨＦポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は化学的または酵素的に達成しうる。化学的脱グリコシル化にはトリフルオロメタンスルホン酸化合物または均等な化合物とポリペプチドとの接触を要する。この処理では結合糖（Ｎ− アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どまたは全ての糖を切断するが、ポリペプチドは無傷のままに残す。化学的脱グリコシル化はＨａｋｉｍｕｄｄｉｎなど、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁（１９８７年）およびＥｄｇｅなど、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁（１９８１年）に記載がある。ポリペプチド上の炭水化物基の酵素的切断はＴｈｏｔａｋｕｒａなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁（１９８７年）に記載のように種々のエンド−およびエキソ −グリコシダーゼの使用により達成できる。可能性あるグリコシル化部位でのグリコシル化はＤｕｓｋｉｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻：３１０５頁（１９８２年）に記載のようにツニカマイシン化合物の使用で防止しうる。ツニカマイシンは蛋白質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻害する。ＣＨＦの共有結合修飾の他の型は、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９；４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２または４１７９３３７にある様式で、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、種々の非蛋白質ポリマーへのＣＨＦポリペプチドの結合を含む。ＣＨＦはまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンミクロカプセルおよびポリ［メチルメタクリレート］マイクロカプセル）により、コロイド性薬剤送達系中（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に製造したマイクロカプセル中に捕捉しうる。このような技術は「レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編、（１９８０年）に開示されている。ＣＨＦ製剤はまた放射性ヨード、酵素、フルオロフォア、スピン標識、その他で標識した時にはＣＨＦのための検定（たとえば放射免疫検定、酵素結合免疫検定、または放射能受容体検定における標準品として使用するためにＣＨＦを標識することによって）における標準品としての抗体の作成において、親和性精製技術において、および競合型受容体結合検定において有用である。変異体ＣＨＦの性質を予測するのは困難なことが多いので、最適変異体を選択するためには得られる変異体の検索は意義があるものである。心臓肥大、抗不整脈、筋変力作用、または神経栄養性の強化、ＣＨＦ拮抗作用の存在、発現水準の向上、酸化安定性、高濃度分泌性能、その他を検索できる。例えば、所与抗体への親和性のようなＣＨＦ分子の免疫学的性質の変化、たとえばは競合型免疫検定法により測定される。変異体はその肥大性、抗不整脈性、筋変力性、および神経栄養性の活性が同じ検定で天然ＣＨＦで観察される対応する活性（例えば、下記実施例中に記載する肥大および神経栄養性の検定を使用して）と比較することによって低下または強化における変化を検定する。たとえば酸化還元性または熱安定性、親水性、プロテイン分解の受け易さ、またはキャリアーとのまたは多重体への会合性向のような、蛋白質またはポリペプチドの性質の潜在的修飾の他のものは当分野でよく公知の方法によって検定される。Ｉ．ＣＨＦ拮抗剤ＣＨＦへの拮抗剤はＣＨＦのための予測される受容体ファミリー（ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、およびオンコスタチンＭ受容体サブファミリーを包含するＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー）を使用することによって製造できる。即ち、受容体をファミリーから発現用にクローニングし；次に受容体の可溶性型を、細胞外ドメインを確認し膜貫通ドメインから切断することによって製造できる。可溶性型受容体を次に拮抗剤として使用するか、または受容体を使用してＣＨＦ活性に拮抗する小さい分子を検索できる。これとは別に、図１に示すマウス配列または図５に示すヒト配列を使用して、拮抗剤として作用する天然ＣＨＦの変異体を製造する。ＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーはリガンド上に結合部位２個を持つことが知られているのでＣＨＦの受容体結合部位は結合性研究で決定でき、また、分子が拮抗剤として作用するようにそれらの一つを標準技術（欠失またはラジカル置換）で除去することができる。本明細書記載の拮抗作用は肥大性および神経栄養性を含む数種の方法によって決定できる。Ｊ．肥大性検定肥大性活性を検定するためには、好ましくは縮小検定を使用する。この検定法では使用する培地は細胞を血清不含の低密度プレーティングで生存させる。この培地に直接プレーティングすると、少数細胞が除けるように洗浄段階を省略できる。プレーティング密度は重要である：少数細胞の多くとその生存率が減少し；多数細胞の多くおよび筋細胞が自己誘導肥大を開始する。これに含まれる段階は：（イ）９６ウェルのプレートに、少なくともインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニンを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の筋細胞懸濁液を、細胞密度約７．５×１０⁴細胞／ｍＬでプレーティングする；（ロ）細胞を培養する；（ハ）検定すべき物質（ＣＨＦを含むと推測されるような）を添加する；（ニ）細胞を物質とともに培養する；および（ホ）肥大性を測定する。この培地には別の要素、たとえば細胞の長期生存を確保するＥＧＦのようなものを添加できるが、しかしそのような添加は必須ではない。Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地はＧｉｂｃｏ・ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手でき、下記培地の一つからなる：好適な肥大性検定法は次の通り：（イ）ウシ血清を含む培地、好ましくは４％ウシ胎児血清添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ −１２培地を、好ましくはウェルをこの培地と約８時間３７℃でインキュベーションした、９６−ウェル組織培養プレートにプレコートする；（ロ）培地を除く；（ハ）７.５×１０⁴細胞／ｍＬのインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニン添加Ｄ−ＭＥＭ−／Ｆ−１２培地の筋細胞懸濁液を内側の６０ウェルにプレーティングする；（ニ）筋細胞を少なくとも２４時間培養する；（ホ）被験物質を添加する；（ヘ）細胞を被験物質とともに培養する（好ましくは約２４〜７２時間、より好ましくは約４８時間）；次いで（ト）肥大を、好ましくはクリスタルバイオレット染色で、測定する。好ましくは段階（ハ）で使用する培地は血清不含であって、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）およびグルタミンを含有する。最も好ましくは、この培地はＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２を１００ｍＬ、トランスフェリン１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）、インスリン２０μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）、アプロチニン５０μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを１ｍＬ（ＪＲＨ・Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ・Ｎｏ．５９６０２−７７Ｐ）、Ｌ−グルタミン１ｍＬ（２００ｍＭ）を含有する。試料必要量が１００μＬまたはそれ以下と小さく、１週間１０００試料の検定性能が発現クローニングおよび蛋白質精製を可能にするが、これは現在までの方法を使用しては実現不能であろう。肥大性用の検定法の別の一つは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出をラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ融合蛋白質への¹²⁵Ｉ-ラットＡＮＰの結合に対する競合を測定する検定法によって測定することを含む。使用に適するこの方法はＣｈａｍｏｗなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９８８５〜９８９１頁（１９９０年）が記載したＣＤ４−ＩｇＧ融合蛋白質を使用してｇｐ１２０を測定するために使用した方法と類似している。Ｋ．神経栄養性検定ここではＬｅｕｎｇ、Ｎｅｕｒｏｎ、８巻：１０４５〜１０５３頁（１９９２年）に記載された毛様体神経節神経栄養性活性用検定法が適当である。略述すれば、毛様体神経節をＥ７−Ｅ８ニワトリ胚から切り出し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ１５４００−１３）中で解離し、３７℃で１５分間燐酸塩緩衝食塩水で１０倍に希釈する。神経節をトリプシンがなくなるまで成育培地（１０％ウシ胎児血漿、１．５ｍＭ−グルタミン、ペニシリン１００μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ添加高グルコースＤ−ＭＥＭ）で３回洗浄し、次に成育培地１ｍＬ中で緩やかにかきまぜて単一細胞懸濁液とする。成育培地５ｍＬ中のこの細胞混合物を１００ｍｍ組織培養皿に入れ、４時間３７℃の孵卵器中でインキュベーションしてニューロンを濃縮する。この時間の間に非ニューロン性細胞は優先的に皿に付着し、インキュベーションの終期にはニューロンは浮遊して緩やかに洗浄できる。濃縮したニューロンを次に予めコラーゲンで被覆した９６−ウェルのプレートに入れてプレーティングする。各ウェルに細胞１０００〜２０００個をプレーティングして、試験すべきＣＨＦ希釈物とともに最終容積を１００から２５０μＬとする。３７℃で２〜４日インキュベーションした後に、生存細胞を生体色素メタロチオネイン（ＭＴＴ）を用いて染色して生体細胞数を評価する。ウェルに５分の１容のＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ・Ｍ２１２８）５ｍｇ／ｍＬを添加する。３７℃で２〜４時間インキュベーション後、生存細胞（濃紫色沈殿物で満たされたもの）を倍率１００×の位相顕微鏡によって計数する。３．ＣＨＦの使用および治療的組成物および投与ＣＨＦには生体内で、心不全、不整脈または筋変力疾患および／または末梢性神経障害およびその他の運動ニューロンまたはＣＮＴＦが活性なニューロンに関連する神経学的疾患を持つ哺乳類（動物またはヒト）の処置のための薬剤として用途があると信じられる。例えば、ＣＨＦは、ＡＣＥ阻害剤が採用できないか、または有効でない症例で欝血性心不全の処置に有用でありうる。場合によってはＣＨＦをＡＣＥ阻害剤を含む他剤と組合せるか、協同して欝血性心不全を治療するために投与する。投与すべきＡＣＥ阻害剤の有効量は、もし採用するなら、医師または獣医師の裁量による。薬剤の投与および調節は欝血性心不全の最適管理を達成するように行われ、および理想的には利尿剤またはジギタリスの使用および低血圧および腎障害のような状態を考慮に入れる。用量はさらに使用する阻害剤の型および処置すべき特定患者のような因子に依存する。典型的には採用する量はＡＣＥ阻害剤がＣＨＦなしに投与される時に使用される用量と同じ用量とする。そこで、例えばエナラプリルの試験用量を５ｍｇとし、患者が許容するなら、次にこれを１日１回用量１０〜２０ｍｇに上げる。他の例として、カプトプリルはヒトの患者に最初は試験用量６．２５ｍｇを経口投与し、次にこの用量を患者が許容するなら、２５ｍｇ１日２回（ＢＩＤ）または１日３回（ＴＩＤ）まで、後に５０ｍｇＢＩＤまたはＴＩＤまで増量しうる。許容水準は血圧の低下が低血圧の徴候を伴うかどうかを決定して評価する。もし処方するなら、用量は１００ｍｇＢＩＤまたはＴＩＤまで増加しうる。カプトプリルは活性成分としてヒドロクロロサイアザイドと組合せてカプトプリルが腸に達するまで保護する腸溶または遅延放出被覆を持つｐＨ安定化コアとして製剤化される。カプトプリルは錠剤またはカプセル剤として投与用に入手できる。カプトプリルその他のＡＣＥ阻害剤に関する用量、投与、処方、および配合禁忌についての議論は「医師卓上便覧（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ．Ｄｅｓｋ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」、Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ・Ｄａｔａ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ社、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ．２３１４−２３２０頁（１９９４年）に見出すことができる。ＣＨＦはまた天然または腫瘍壊死因子誘導死に対して膠突起神経膠細胞を保護する試験管内での膠突起神経膠細胞の発生、成熟および生存の点で、星状神経膠細胞の生存および分化および２型星状神経膠細胞誘導の点で、およびラット中枢神経系（ＣＮＳ）の小神経膠細胞による低親和性神経成長因子およびＣＤ−４の組換え生産の刺激の点で潜在的に有用である。ＣＨＦはまた脱神経した骨格筋に栄養効果を与える点で潜在的に有用である。これに加え、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、および毛様体神経栄養因子に対する低親和性受容体を遺伝子移入した造血細胞の増殖反応および結合性を持つこと、インターロイキン−６受容体に結合することによって肝実質細胞中のフィブリノーゲン遺伝子発現を制御すること、マウス胚癌細胞に栄養作用を持つこと、内因性熱発物質になること、およびヒトのＩＭＲ３２神経芽細胞腫に有糸分裂促進剤効果を持つことが期待される。これに加え、ＣＨＦは培養ラット交感神経ニューロンの神経成長因子への反応を強化すること、発育中のラットにおいて運動ニューロンとその標的筋肉を維持すること、生体内で運動神経ニューロンの発芽を誘導すること、試験管内で新生児ラットの皮質脊髄ニューロンの生存を促進すること、生体内で成熟ラットの黒質ドパミン作動性ニューロンの変性を防止すること、海馬錐体ニューロンの興奮毒性損傷に対する感受性の閾値を変化すること、成熟ラットＣＮＳでニューロンの変性を防止し、低親和性ＮＧＦ受容体の生産を促進すること、および胎児ラット海馬培養物中のニューロン生存を強化することが期待される。これらの活性はＣＨＦによる末梢神経障害（運動および感覚）、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、ハンチントン病、および、例えば網膜に関する眼科疾患を含む全神経変性疾患の治療に翻訳される。ＣＨＦは、たとえば、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、およびＮＴ−％のような神経栄養因子とともに神経学的疾患の付随的治療としても有用でありうる。ＣＨＦをコードする核酸は組織特異的型分類の診断剤として有用でありうる。例えば、切片上ハイブリッド形成、ノーザンおよびサザンブロティング、およびＰＣＲ分析のような操作はＣＨＦをコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡが評価すべき細胞型内に存在するかどうかを決定するために使用できる。分離したＣＨＦポリペプチドは未知量のＣＨＦを含む試料に対する標準または対照として定量的診断検定法で使用しうる。心不全および神経学的疾患の処置のためのＣＨＦ治療剤は貯蔵のためには所期純度を持つＣＨＦを、要すれば生理学的に許容される担体、添加剤、または安定化剤（前記レミントンの薬剤科学）と混合して、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形に製造される。許容される担体、添加剤または安定化剤は採用する用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であって、燐酸塩、クエン酸、その他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基以下）；血漿アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、その他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。生体内投与に使用するＣＨＦは無菌でなければならない。これは凍結乾燥および再構築の前または後に無菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。通常ではＣＨＦは凍結乾燥型または溶液中に貯蔵する。治療用ＣＨＦ組成物は一般に無菌アクセスポートを持つ容器、例えば皮下注射針によって穴あけできる蓋を持つ静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れる。ＣＨＦまたはＣＨＦ抗体投与経路はたとえば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路など、または下記の持続放出系による注射または点滴など、既知の方法に従うものである。ＣＨＦは点滴するかまとめた注射で連続的に投与される。ＣＨＦ抗体は同様に投与するか、または血流またはリンパに投与する。持続放出製剤の適例はこの蛋白質を含む固体親水性ポリマーの半透性マトリックスであって、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルに成形したものを包含する。持続放出マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、Ｌａｎｇｅｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５巻：１６７〜２７７頁［１９８１年］およびＬａｎｇｅｒなど、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２巻、９８〜１０５頁［１９８２年］に記載のあるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９、欧州特許５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎなど、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻：５４７〜５５６頁［１９８３年］）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒなど、前出）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、たとえばルプロンデポ（商品名）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロライドの注射用微小球）など、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許１３３９８８）を包含する。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒトロゲルは蛋白質をもっと短期間放出する。カプセル化された時、蛋白質は体内に長期間残存し、３７℃で湿気に接触する結果として変性または凝集して生物学的活性損失および免疫原性の変化が起こりうる。合理的な方策は関与する機序に依存した蛋白質安定化について工夫できる。例えば、もし凝集機序が分子間チオ−ジスルフィド交換によるＳ−Ｓ結合形成にあることが発見されれば、安定化はスルフヒドリル残基修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含湿量制御、適当な添加剤の使用、および特定ポリマーマトリックス組成物の開発により達成される。持続放出ＣＨＦ組成物はリポソーム捕捉ＣＨＦも包含する。ＣＨＦを含有するリポソームはそれ自体公知の方法：ＤＥ３２１８１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４０３０〜４０３４頁（１９８０年）；欧州特許５２３２２；欧州特許３６６７６；欧州特許８８０４６；欧州特許１４３９４９；欧州特許１４２６４１；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許第４４８５０４５および４５４４５４５；および欧州特許１０２３２４；で製造する。正常にはリポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型でリピド含量はコレステロール約３０モル％より大であって、選択する比率は最適ＣＨＦ療法に適合させる。治療に採用すべきＣＨＦの有効量は、例えば治療対象、投与経路、および患者の条件などに依存する。それ故、治療者にとって薬剤を力価検定して、最適な治療効果を得るに必要なように投与経路を修正することが必要となる。典型的な日用量は前記因子に依存して１日当り約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ患者体重またはそれ以上までの範囲にわたり、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的には臨床医は用量が心臓または神経不全の治療に所望の効果を達成するまでＣＨＦを投与する。例えば、この量は心室収縮力を増大し、末梢性血管抵抗を減弱し、心不全患者における同様に重大な状態を軽快または処置する。この療法の進捗は通常の検定法で容易に監視される。４．ＣＨＦ抗体の製造（ｉ）出発物質および製法免疫グロブリン（Ｉｇ）およびそのある種の変異体は公知であり、多くは組換え細胞培養によって調製されてきた。例えば、米国特許第４７４５０５５；欧州特許２５６６５４；欧州特許１２０６９４；欧州特許１２５０２３；欧州特許２５５６９４；欧州特許２６６６６３；ＷＯ８８／０３５５９；Ｆａｕｌｋｎｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９８巻：２８６頁（１９８２年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１２３巻：７９３頁（１９７９年）；Ｋｏｅｈｌｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：２１９７頁（１９８０年）；Ｒａｓｏなど、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４１巻：２０７３頁（１９８１年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２３９頁（１９８４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：１２０２頁（１９８５年）；およびＭｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁（１９８４年）；を参照。再結合免疫グロブリン鎖も公知である。例えば米国特許第４４４４８７８；ＷＯ８８／０３５６５；および欧州特許６８７６３および記載の文献参照。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ、から得られうるが、好ましくはＩｇＧ−１、またはＩｇＧ−３から得る。（ｉｉ）ポリクローナル抗体ＣＨＦポリペプチドまたはＣＨＦ断片へのポリクローナル抗体は一般にＣＨＦまたはＣＨＦ断片およびアジュバントの皮下（ｓｃ）または腹腔内への多回注射によって動物中に作成する。ＣＨＦまたは標的アミノ酸配列を含む断片を免疫すべき種に免疫原性である蛋白質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などに双官能または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステル（システイン残基経由の複合）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（リジン残基経由）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここにＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である）などを使用して複合させることは有用でありうる。ＣＨＦポリペプチドまたはＣＨＦ断片、免疫原性複合体、または誘導体に対して動物を免疫するには、ペプチドまたは複合体（各々ウサギまたはマウス）１ｍｇまたは１μｇをフロインドの完全アジュバント３容と混合し、その溶液を多部位に皮内注射する。１月後、初回量の１／５から１／１０量のフロインド完全アジュバント中のペプチドまたは複合体を多部位に皮下注射して動物をブースト（追加免疫）する。７から１４日後、動物から採血し、血清をＣＨＦまたはＣＨＦ断片抗体力価について検定する。動物を力価が安定するまでブーストする。好ましくは、同じＣＨＦまたはＣＨＦ断片の複合体であるが異なる蛋白質におよび／または異なる交差結合試薬により複合した複合体で動物をブーストする。複合体は融合蛋白質として組換え細胞培養物中でも製造できる。明礬のような凝集剤も免疫反応を強化するために適切に使用される。（ｉｉｉ）モノクローナル抗体モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が微量に存在するかも知れない天然起源の突然変異を除いて一致しているもの、から得られる。そこで、修飾語「モノクローナル」は異なる抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。例えば、本発明のＣＨＦモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）が最初に記載したハイブリドーマ法を使用するか、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出）により製造しうる。ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのようなその他の適当な宿主動物を前記のように免疫して免疫に使用したＣＳＦまたはＣＳＦ断片に特異的に結合する抗体を製造するか、製造することができるリンパ球を作成する。あるいは、リンパ球は試験管内で免疫しうる。次にポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ・ａｎｄ・Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３頁［Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）］。こうして製造したハイブリドーマ細胞を好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻止する物質１種またはそれ以上を含有する適当な培養培地中に接種し、成育させる。例えば、もし親骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失するなら、典型的にはハイブリドーマ用の培養培地にはＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加する（ＨＡＴ培地）。好適な骨髄腫細胞は効率的に融合し、選択した抗体産生細胞の安定な高水準の抗体産生を維持し、およびＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。これらの中で、好適な骨髄腫細胞系列は、たとえばＳａｌｋ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・Ｃｅｌｌ・Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ・Ｃｅｎｔｅｒ、サンジエゴ、カリホルニア州、米国、から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州、米国から入手可能なＳＰ− ２細胞のようなマウス骨髄腫系列である。ハイブリドーマ細胞を成育させる培養培地はＣＨＦに対するモノクローナル抗体の生産について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降反応または、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような試験管内結合検定法により決定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎとＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などによって決定できる。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および／または活性を持つ抗体を生産することを確認した後、クローンを制限希釈法によりサブクローニングして標準法によって成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ、前出）。この目的に適当な培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＭＰＩ−１６４０培地を包含する。これに加えて、ハイブリドーマ細胞は動物中で生体内腹水腫瘍としても成長させうる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を培養培地、腹水液、または血清から常法による免疫グロブリン精製操作、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような操作、により適切に分離する。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは常法操作（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に分離し、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞はこのＤＮＡの好適な源として役立つ。一旦分離すれば、このＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを、たとえば普通は免疫グロブリン蛋白質を生産しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など宿主細胞に遺伝子移入して組換え宿主細胞内にモノクローナル抗体を合成させる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する綜説文献にはＳｋｅｒｒａなど、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）を包含する。ＤＮＡは、例えば相同的なマウス配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換するか（Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁［１９８４年］）、または免疫グロブリンのコード配列に非−免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列全部または一部を共有結合的に結合することによって修飾しうる。このような様式で、本発明の抗−ＣＨＦモノクローナル抗体の結合特異性を持つ「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を製造する。典型的にはそのような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、またはそれらを本発明抗体の抗原結合部位の一つの可変ドメインの代わりに置換してＣＨＦに特異性を持つ抗原結合部位１個および異なる抗原に対する特異性を持つ別の抗原結合部位を含有するキメラ二価抗体を作成する。キメラまたはハイブリッド抗体はまた試験管内で交差結合剤が関与するものを含む合成蛋白質化学の既知方法を使用しても製造しうる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成してイムノトキシンを構築しうる。この目的の適当な試薬の例にはイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを包含する。診断的応用のためには、本発明の抗体を典型的には検出可能な基で標識する。この検出可能な基は直接的または間接的に検出可能なシグナルを作ることのできるものであることができる。例えば、検出可能な基は³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉのような放射性同位元素；たとえばフルオレッセインイソチオシアネート、ロダミン、またはルシフェリンのような螢光または化学発光化合物；たとえば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³Ｈなどの放射性同位元素標識；たとえばアルカリホスファターゼ、ベーターガラクトシダーゼ、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素でありうる。Ｈｕｎｔｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：１０１４頁（１９７４年）；Ｐａｉｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０巻：２１９頁（１９８１年）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ・Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７頁（１９８２年）に記載された方法を包含する検出可能な基に対する抗体を別々に複合するための当分野の公知方法を採用しうる。本発明の抗体は、たとえば競合的結合検定法、直接的または間接的なサンドウィッチ検定法および免疫沈降検定法のような、いずれの公知検定法にも採用しうる。Ｚｏｌａ、「モノクローナル抗体：技術便覧（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ・Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年）。競合的結合検定法は被験試料被分析物（ＣＨＦ）と競合して所定量の抗体と結合する標識標準（ＣＨＦまたはその免疫学的に反応性の部分でありうる）の性能に依存する。被験試料中のＣＨＦの量は抗体に結合することになる標準品の量に逆比例する。結合してくる標準品の量を迅速に決定するためには、一般に、抗体に結合する標準品および被分析物を結合せずに残っている標準品と被分析物から分離しうるように、抗体を競合の前または後に固定化する。サンドウィッチ検定法は検出すべき蛋白質（ＣＨＦ）の異なる免疫原部分またはエピトープに結合することのできる抗体２個の使用を含む。サンドウィッチ検定法では、被験試料被分析物を固体担体上に固定化された第一の抗体に結合し、その後に、第二の抗体を被分析物に結合して不溶性の三成分複合体を形成する。ＤａｖｉｄとＧｒｅｅｎｅ、米国特許第４３７６１１０。第二抗体自体を検出可能な基で標識する（直接サンドウィッチ検定）か、または検出可能な基で標識した抗免疫グロブリン抗体を使用して測定（間接サンドウィッチ検定）しうる。例えば、サンドウィッチ検定法の一型はＥＬＩＳＡ検定法であって、ここでは検出可能な基は酵素（たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）である。（ｉｖ）ヒト化抗体非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野でよく公知である。一般に、ヒト化抗体は非ヒト起源から導入されたアミノ酸残基１個またはそれ以上を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的にＷｉｎｔｅｒおよびその協力者の方法（Ｊｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁［１９８６年］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁［１９８８年］；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁［１９８８年］）に従って、囓歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒトの抗体の対応する配列に置換することによって実行できる。それ故に、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出）、そこでは実質的に無傷のヒト可変ドメインより小さいものが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際的に、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であって、そこではＣＤＲ残基のいくつかおよびおそらくＦＲ残基のいくつかが囓歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されている。ヒト化抗体を作成するために使用すべきヒト可変ドメインの選択は軽鎖および重鎖の双方とも抗原性を削減するためには非常に重要である。いわゆる「最適」法に従って、囓歯類抗体の可変ドメインの配列を公知ヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して検索する。囓歯類のものに最近似のヒト配列を次にヒト化抗体用のヒトのフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁［１９９３年］；ＣｌｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁［１９８７年］）。別法の一つは軽鎖または重鎖にある特定のサブグループに属するヒト抗体全部のコンセンサス配列から誘導した特殊なフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用しうる（Ｃａｒｔｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁［１９９２年］；Ｐｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁［１９９３年］）。抗体を抗原への高親和性その他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化することはさらに重要である。この目的を達するため、好適な方法に従えば、ヒト化抗体は親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化生成物の分析の過程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは普通に入手可能で、当業者は精通している。選択した免疫グロブリン配列候補の推測上の三次元立体配座構造を描写し、表示するコンピュータープログラムが入手できる。これらの画像を検討すると免疫グロブリン配列候補の官能性における残基の推測上の役割、すなわち抗原に結合する免疫グロブリン候補の性能に影響を与える残基の解析、を分析できる。こうして、ＦＲ残基をコンセンサスおよび輸入配列から選択して結合して標的抗原への親和性向上のような抗体の所期特性に到達するようにする。一般に、ＣＤＲ残基は直接的におよび最も実質的に抗原結合に与える影響に関与している。（ｖ）ヒトの抗体ヒトのモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成できる。ヒトのモノクローナル抗体生産のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系列は、例えばＫｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒなど、「モノクローナル抗体製造技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｃｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６〜９５頁（１９９１年）に記載がある。今日では免疫によって内因性免疫グロブリン生産なしにヒト抗体の全レパートリーを作成することのできるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）も生産できる。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝子の同型接合欠失が内在性抗体生産の完全阻害を招くことが報告されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配置をそのような生殖系列突然変異マウスに移転すると抗原チャレンジに際してヒト抗体を生産を招くであろう。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎなど、Ｙｅａｒ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）参照。これとは別に、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ・ｄｉｓｐｌａｙ）技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５３頁［１９９０年］）もヒト抗体および抗体断片を試験管内で非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ）遺伝子レパートリーから産生するため使用できる。この技術に従えば、抗体のＶドメイン遺伝子を、たとえばＭ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージの主または微量コート蛋白質いずれかの遺伝子にフレーム内クローニングして、ファージ粒子表面上の機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づく選択はこれらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択を招来する。こうしてファージはＢ−細胞の性質をいくつか模倣することになる。ファージのディスプレーは種々の様式で行われる；これに関する綜説については、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ・Ｋｅｖｉｎ・Ｓ．とＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ・Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ・ＯＰｉｎｉｏｎ・ｉｎ・Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照。Ｖ遺伝子セグメントの起源数種をファージディスプレーに使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）は免疫マウスの脾臓から誘導したＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーから得た抗オキサゾロン抗体の多数のアレイを分離した。非免疫ヒトドナーからＶ遺伝子レパートリーを構築でき、そして抗原（自己抗原を含む）のアレイ多数に対する抗体を本質的には、Ｍａｒｋｓなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）またはＧｒｉｆｆｉｔｈなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）が記載した技術に従って分離できる。天然の免疫反応においては抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞高突然変異）。導入される変化のいくつかは高親和性を与え、高親和性表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は次の抗原チャレンジまでの間に優先的に複製され、分化する。この天然の過程を「連鎖シャッフリング」（Ｍａｒｋｓなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁［１９９２年］）として知られる技術を採用して模倣できる。この方法ではファージディスプレーによって得られる「プライマリー」なヒト抗体の親和性を重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を非免疫ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然起源変異体（レパートリー）のレパートリーと逐次交換することによって改善できる。この技術でｎＭ範囲の親和性を持つ抗体または抗体断片を産生できる。非常に大きいファージ抗体レパートリーを作成する方策がＷａｔｅｒｈｏｕｓｅなど、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載されている。ヒトの抗体が囓歯類の抗体と類似の親和性および特異性を持っている時は、遺伝子シャッフリングを囓歯類抗体からヒト抗体を誘導するためにも使用できる。「エピトープインプリント法（ｅｐｉｔｏｐｅ・ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）」とも呼ばれるこの方法に従えば、ファージディスプレー技術によって得た囓歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子レパートリーと交換して囓歯類−ヒトキメラを作成する。抗原についての選択で機能的抗原結合部位、すなわち結合相手選択を支配（ｉｍｐｒｉｎｔ）するエピトープ、を復元できるヒト可変が分離される。この過程を反復して残りの囓歯類ドメイン置換すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日発行のＰＣＴ・ＷＯ９３／０６２１３）。従来のＣＤＲ移植による囓歯類抗体のヒト化とは相違して、この技術は囓歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を持たない完全なヒト抗体を提供する。（ｖｉ）双特異性抗体双特異性抗体は好ましくはヒトのまたはヒト化モノクローナル抗体であって、抗原少なくとも２種に対する結合特異性を持つ。本件の場合、結合特異性の一つはＣＨＦに対するもので、他の一つは他のいずれかの抗原、好ましくはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー構成員に結合する他のリガンド、に対する。例えば、ＣＨＦおよび神経栄養因子または異なる二型のＣＨＦポリペプチドに特異的に結合する双特異性抗体は本発明の範囲内にある。双特異性抗体の製法は当業界では公知である。伝統的に、双特異性抗体の組換え製造は重鎖２種が異なる特異性を持つ免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア２種の共発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁［１９８３年］）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類の故に、これらハイブリドーマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）は異なる抗体分子１０種の混合物を生産する可能性があり、その中で１種のみが正しい双特異性構造を持つ。通常親和性クロマトグラフィー工程で行う正しい分子の精製はかなり面倒で、生成物の収率が低い。同様な操作法が１９９３年５月１３日発行のＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。別の好ましい手法に従えば、所期の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、好ましくは少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を包含する免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。軽鎖結合に必要な部位を含む重鎖第一定常領域（ＣＨ１）を融合物の一つに存在させることは好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、所望ならば、免疫グロブリン軽鎖、をコードするＤＮＡを別の発現ベクターに挿入して適当な宿主生物中に共遺伝子移入する。これで構築で使用するポリペプチド３種の不均等な比率が最適収率を与える態様においてポリペプチド断片３種の相互比率を調製するために大きな柔軟性が提供される。しかしながら、ポリペプチド少なくとも２種の等比率産生が高収率を与える時または比率が別段の意味を持たない時には発現ベクターの一つへのポリペプチド鎖２種または全３種のコード配列を挿入することも可能である。この手法の好適な態様では、双特異性抗体は一方のアームに第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖および別のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造は双特異性分子の半分だけにある免疫グロブリン軽鎖の存在が迅速な分離方法を提供するので、所期の双特異性化合物を望まない免疫グロブリン鎖結合物から分離し易くすることが見出されている。双特異性抗体作製についてさらに詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻：２１０頁（１９８６年）参照。（ｖｉｉ）ヘテロ複合抗体ヘテロ複合抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は共有結合的に結合した抗体２個から構成される。このような抗体は、例えば望まない細胞を免疫系細胞のターゲットにするため（米国特許第４６７６９８０）およびＨＩＶ感染症の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；および欧州特許０３０８９）提案されている。ヘテロ複合抗体は好都合な交差結合法を使用して製造される。適当な交差結合剤は当業界でよく知られており、米国特許第４６７６９８０に多数の交差結合技術とともに開示されている。５．ＣＨＦ抗体の使用ＣＨＦ抗体はＣＨＦに対する診断検定、たとえば特定の細胞、組織または血清中での生産など、において有用である。抗体は前記ＣＨＦにおけると同じ様式で標識し、および／または不溶解性マトリックス上に固定化する。受容体結合検定法の一態様において、ＣＨＦ全部または選択したＣＨＦ複数に結合する抗体組成物を不溶性マトリックスに固定化し、被験試料を固定化抗体組成物に接触させてＣＨＦ全部を吸着し、次に固定化したＣＨＦを予め決めたＣＨＦに対して特異的であるように個々に別個の螢光団その他のような独特の標識によって認識される各ＣＨＦに特異的な抗体複数と接触させる。各独特の標識の存在および／または量を決定することのよって、各ＣＨＦの相対的比率および量を決定できる。本発明の抗体は患者を受動的に免疫するためにも有用である。ＣＨＦ抗体は組換え細胞培養物または天然起源からＣＨＦを親和性精製するためにも有用である。ラットＣＨＦと検出可能に交差反応しないＣＨＦ抗体はＣＨＦをこの蛋白質不含まで精製できる。ＣＨＦおよびその抗体を診断的に検定する適当な方法それ自体はよく公知である。下記実施例に記載する候補ＣＨＦを試験してそれが肥大性、抗不整脈、筋変力作用または神経栄養活性を持つかどうかを見るための生物検定法に加えて、競合的、サンドウィッチおよび立体的阻害免疫検定技術も有用である。競合的およびサンドウィッチ法は相分離工程を方法の肝要な部分として採用し、一方では立体的阻害検定は単一反応混合物中で行う。検定すべき物質の分子量によってはある種の方法が好ましいが、基本的には同じ操作を使用してＣＨＦおよびＣＨＦ結合性物質を検定する。それ故、抗原か抗体かの状態にかかわりなく、ここに試験すべき物質を被分析物と称し、被分析物に結合する蛋白質は、それらが抗体、細胞表面受容体または抗原のいずれでも結合相手と名付ける。ＣＨＦまたはその抗体のに対する分析法は全て次の試薬１種またはそれ以上を使用する：標識被分析物類似体、固定化被分析物類似体、標識結合相手、固定化結合相手、および立体的複合体。標識した試薬は「トレーサー」とも呼ばれる。使用する標識（これはプローブとして使用するためのＣＨＦ核酸を標識するためにも有用である）は被分析物およびその結合相手との結合を妨害せずに検出を可能とする機能である。免疫検定で使用するための標識多数が公知で、その例には直接検出できる、たとえばフルオロクローム、化学発光、および放射能標識のようなもの、ならびに、たとえば検出のためには反応するか誘導されなければならない酵素のようなものを包含する。このような標識の例には放射性同位体元素³² Ｐ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、¹³¹Ｉ；希土類キレートまたはフルオレッセインとその誘導体のような螢光団；ロダミンとその誘導体；ダンシル；ウンベリフェロン；たとえばホタルおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６）；ルシフェリン；２，３−ジヒドロフタラジンジオン；マレエート脱水素酵素；ウレアーゼ；セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；グルコアミラーゼ；リゾチーム；たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素のようなサッカライドオキシダーゼ；色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する、たとえばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペロキシダーゼのような、酵素と共にウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのようなヘテロ環オキシダーゼ；ビオチン／アビジン；スピン標識；バクテリオファージ標識；安定な遊離ラジカル；その他を包含する。当業者は本発明に採用されうる適当な他の標識を知ることとなろう。ＣＨＦ、その抗体または断片の結合は、当業者に普通に知られている標準的技術を使用して達成される。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミデート、ビスジアゾ化ベンジジン、その他の結合試薬は前記の螢光、化学発光および酵素標識でポリペプチドに目印を付けるために使用しうる。例えば米国特許第３９４０４５７（螢光分析）および第３６４５０９０（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、１３巻：１０１４〜１０２１頁（１９７４年）；Ｐａｉｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４０巻：２１９〜２３０頁（１９８１年）；Ｎｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ・Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７〜４１２頁（１９８２年）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎなど、「酵素免疫検定での使用のための酵素−抗体複合の製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ・ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ・ｆｏｒ・Ｕｓｅ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｅ・Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｊ．Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅとＨ．ｖａｎ・Ｖｕｎａｋｉｓ編「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、７３巻中、１４７〜１６６頁（Ａｃａｄｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、ＮＹ、１９８１年）；Ｋｅｎｎｅｄｙなど、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、７０巻：１〜３１頁（１９７６年）；およびＳｃｈｕｒｓなど、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、８１巻：１〜４０頁（１９７０年）を参照。最後の文献に記載の結合技術はグルタルアルデヒド法、過ヨード酸法、ジマレイミド法、およびｍ− マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル法である。本発明の実施においては、酵素標識は好適な態様である。全ての着想可能な検定法での標識として使用するためにある一つの酵素が理想的であることはない。その代わり、特定の検定系にはどの酵素が適するかを決定しなければならない。酵素選択に重要な判断基準は純粋な酵素のターンオーバー数（単位時間毎に酵素当り生成物に転換される基質分子の数）、酵素製品の純度、生成物検出感度、酵素反応検出の容易さと速度、試験液中妨害因子および酵素様活性の不在、酵素およびその複合の安定性、酵素とその複合体の入手可能性および経費、その他である。本発明の検定法における好適な標識として使用される酵素に包含されるものの中には、アルカリホスファターゼ、ＨＲＰ、ベーターガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、マレエート脱水素酵素、およびグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素がある。ウレアーゼがさらに好適な酵素標識の中にあるのは、殊に容易にその活性が裸眼で見える発色団ｐＨ指示薬の故である。ある種の検定法には試薬の固定化が必要である。固定化は結合相手を溶液内に遊離して溶存している被分析物から分離することを意図する。この便利さは結合相手または被分析物類似体のどちらかを検定操作の前に水不溶性のマトリックスまたは表面に吸着することにより（Ｂｅｎｎｉｃｈなど、米国特許第３７２０７６０）、共有結合することにより（例えば、グルタルアルデヒド交差結合を使用して）、または相手または類似体を後に、たとえば免疫沈降することによって不溶化することにより達成される。別の検定法で競合的またはサンドウィッチ検定と呼ばれるものはよく確立されて商業的診断企業では広く使用されている。競合的検定はトレーサー類似体が共通の結合相手にある限定された数の結合部位で被験試料被分析物と競合する性能に依存する。結合相手は一般に競合前または後に不溶化され次にその結合相手に結合したトレーサーと被分析物を非結合トレーサーおよび被分析物から分離する。この分離はデカンテーションにより（結合相手を予め不溶化した時）、または遠心分離により（結合相手を競合反応後に沈降した時）達成する。被験試料被分析物の量はマーカー物質の量により測定した結合トレーサーの量に対して逆比例する。被分析物既知量での用量−作用曲線を作製して試験結果と比較して被験試料内に存在する被分析物の量を定量的に決定する。マーカーとして検出可能な酵素を使用する時、これら検定法はＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。「均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」検定と呼ばれる別種の競合的検定法は相分離を要しない。ここでは、酵素と被分析物との複合体を形成し、抗被分析物が被分析物に結合すると、抗被分析物の存在が酵素活性が変わるように使用する。この場合、ＣＨＦまたはその免疫学的に活性な断片を有機的双官能的架橋でペルオキシデースのような酵素に複合する。抗ＣＨＦの結合が標識の酵素活性を阻害または強化するようにして複合物を抗ＣＨＦと共に使用するように選択する。この方法自体はＥＭＩＴの名で広く実用されている。立体的複合体は均質検定の立体障害法で使用する。この複合体はハプテンに対する抗体が抗被分析物と同時には複合体と結合することができないようにして、低分子量ハプテンを小さい被分析物と共有結合的に結合することによって合成する。この検定操作では被験試料中に存在する被分析物は抗被分析物と結合し、その際、抗ハプテンを複合体に結合して、たとえばハプテンが螢光物質である時には螢光の変化など、複合体ハプテンの性質を変化させる。サンドウィッチ検定はＣＨＦまたはＣＨＦ抗体の測定では、殊に有用である。逐次的なサンドウィッチ検定法において、固定化した結合相手を使用して被験試料被分析物を吸着し、被験試料を洗浄により除去し、結合した被分析物を使用して標識した合相手を吸着し、および結合した物質を次に残余のトレーサーから分離する。結合したトレーサー量は被験試料被分析物に直接的に比例する。「同時的」サンドウィッチ検定では、被験試料は標識した結合相手を添加する前には分離しない。抗ＣＨＦモノクローナル抗体を抗体の一つとして、およびポリクローナル抗ＣＨＦ抗体を他方として使用する逐次的サンドウィッチ検定はＣＨＦ活性について試験するために有用である。以上は単なる例示的なＣＨＦおよび抗体の診断的検定法である。これらの被分析物の測定について現在または今後開発される他の方法は前記生物検定法を含めて本範囲内に包含する。次の実施例は例示のために記載するものであって、限定のためではない。明細書中の引用文献は全て参考のために明示的に引用したものである。実施例ＩＣＨＦの確認および試験管内活性Ａ．発現クローニングした物質のための検定肥大性について使用する検定法は、一般的には次の通りに記載される新生児ラット心臓肥大性の試験管内検定法である。：１．筋細胞懸濁液の調製筋細胞懸濁液の製造はＣｈｉｅｎなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７５巻：１７７０〜１７８０頁（１９８５年）およびＩｗａｋｉなど、前出に略記された方法に基づく。生後１〜２日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット仔心臓から得た心室を取り、三分割した。細断した心室を一連のコラゲナーゼ処理により消化した。得られた単一細胞懸濁液を非連続的Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上で精製して９５％純度の筋細胞懸濁液を得た。２．筋細胞のプレーティングおよび培養発表されている筋細胞のプレーティングと培養方法２種は次の通り：（１）Ｌｏｎｇなど（前出）は細胞懸濁液をＭＥＭ／５％ウシ血清中で３０分間、前プレーティングした。次に、付着しなかった筋細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＢｒｄＵ、およびウシ血清アルブミン添加血清不含ＭＥＭ中、３５ｍｍ組織培養皿にｍＬ当り７．５×１０⁴細胞の密度でプレーティングした。（２）Ｉｗａｋｉなど（前出）はＤ−ＭＥＭ／１９９／５％ウマ血清／５％ウシ胎児血清中の細胞懸濁液を１０ｃｍ組織培養皿にｍＬ当り３×１０⁵細胞でプレーティングした。２４時間培養後、細胞を洗浄して血清不含Ｄ−ＭＥＭ／１９９中でインキュベーションした。この発明では、小型検定での試験性能を増大するためにこれらの細胞をプレーティングし、培養するため異なるプロトコールを開発した。９６ウェル組織培養プレートをＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２／４％ウシ胎児血清と３７℃で８時間プレコートする。この培地を去り、細胞懸濁液を内側のウェル６０個中にインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニン添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１ｍＬ当り７．５×１０⁴細胞でプレーティングする。この培地は典型的にはペニシリン／ストレプトマイシンのような抗生物質およびグルタミンを含有させる。この培地はこれら細胞を血清不含のこの低プレーティング密度で生存させる。細胞を２４時間培養した後に、試験物質を直接ウェルに添加する。３．肥大性の読取りアルファアドレナリン作動剤またはエンドテリンで刺激後、培養物中の新生児ラットの心筋層細胞は生体内での欝血性心不全で見られる細胞サイズが増大することおよび個々の収縮蛋白質集合体が増加して組織化された収縮単位を形成することを含む心筋層細胞肥大性の特徴のいくつかを示す。Ｃｈｉｅｎなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、前出。これらの変化は逆位相顕微鏡で目視でき、肥大性の程度を任意尺度７から０で記録した。７は完全に肥大した細胞で、３は刺激されていない細胞である。この３および７の段階はＳｉｍｐｓｏｎなど、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻：７８７〜８０１頁（１９８２年）の図２、ＡおよびＢに各々見られる。９６ウェル培養物の顕微鏡読取を促進し、永続的記録を作成するために、筋細胞を固定し、適当な試験時間後にクリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色した。クリスタルバイオレットは培養細胞の蛋白質染色に普通に使用される。これに加えて９６ウェルプレートから適量を取り、ＡＮＦまたはＡＮＰの放出のような反応の蛋白質マーカー発現を監視した。Ｂ．発現クローニングポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを７日マウス胚様体から分離した（ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９巻：１４０８〜１４１２頁［１９７２年］；Ｃａｔｈａｌａなど、ＤＮＡ、２巻：３２９〜３３５頁［１９８３年］）。胚様体は多能胚幹細胞（ＥＳ）の分化により形成される（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、８７巻：２７〜４５頁［１９８５年］）。この胚幹細胞系列ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１９３４）をＬＩＦ（Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻：６８４〜６８７頁［１９８８年］）を含む培地中では非分化状態に維持する。この培地はＤ−ＭＥＭ（高グルコース）、１％グルタミン、０．１ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ペニシリン−ストレプトマイシン、１５％熱不活化ウシ胎児血清および１５ｎｇ／ｍＬマウスＬＩＦを含有していた。これらの細胞をＬＩＦ不含で２０％熱不活化ウシ胎児血清を含有する同じ培地中の懸濁培養液中に入れると（０日）、それらは凝集し、胚様体と呼ばれる多細胞構造に分化した。培養８日目までに搏動する原基心臓様構造を構造の一部に形成する。分化しつつあるＥＳ細胞を血清不含培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、１％グルタミン、ペニシリン− ストレプトマイシン、０．０３％ウシ血清アルブミン添加）に変えて２４時間蓄積させることによってこの胚様体をＣＨＦ活性の産生について評価した。検定の前に調整した培地を３−Ｋ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）で１０倍濃縮し、検定培地に対して透析した。３日目から開始して２４時間調整した培地は肥大性スコア４．５〜５．５を示し、６日目から開始すると５．５〜７．５を示した。プラスミド発現ベクターｐＲＫ５Ｂ（Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：１２７８〜１２８０頁［１９９１年］）のｃＤＮＡライブラリーをベクタープライミング手法（Ｓｔｒａｔｈｄｅｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：７６３〜７６７頁［１９９２年］）に従って作製した。ベクターｐＲＫ５ＢをＮｏｔＩ部位でリネアライズし、アルカリホスファターゼで処理し、配列：を持つ単鎖オリゴヌクレオチドｏｃｄｌ．１．３に連結した。連結生成物を次にＢｓｔＸＩで切断し、４７００ｂｐのベクター断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。ベクターはオリゴｄＡクロマトグラフィーでさらに精製した。発現ライブラリーはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ１μｇ、ベクタープライマー５μｇ、およびＡｍｅｒｓｈａｍ社の試薬を使用して構築した。第一および第二鎖合成およびＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ充填反応後、ゲル電気泳動によって５００ｂｐより大きい挿入について物質をサイジングし、リンカーを付加しない平滑末端連結法により環化した。連結物を使用して大腸菌ＤＨ５αを電気穿孔法により形質転換した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ１μｇから二重鎖ｃＤＮＡ４９９ｎｇを作成した。ｃＤＮＡ１７ｎｇを連結し、３．３ｎｇを形質転換して７８００００クローンを得たが、その８３％が平均サイズ１４７０ｂｐを持つ挿入物を持っていた。７５〜１５０００クローンのプールからＤＮＡを分離し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ・ｔｒａｎｓｆｅｃｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社）によって、ヒト胎児腎臓２９３細胞に遺伝子移入した。ＤＮＡ２μｇを使用して６ウェル皿の〜２０００００細胞に遺伝子移入した。細胞を血清不含検定培地２ｍＬ中で４日間インキュベーションした。この培地は１００ｍＬのＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、トランスフェリン１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、インスリン（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、アプロチニン（２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ＪＲＨ・Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ・Ｎｏ．５９６０２−７７Ｐ）１ｍＬ、およびＬ −グルタミン（２００ｍＭ）１ｍＬから構成されていた。遺伝子移入および発現の効率はアルカリホスファターゼの分泌型を発現するプラスミドのＤＮＡ０．２ μｇを加えて観察した（Ｔａｔｅなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、４巻：２２７〜２３１頁［１９９０年］）。各遺伝子移入プールからの調整培養培地１００μＬを最終容積２００μＬ中で肥大性について検定した。あるプールでは調整培地を検定前にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ・３・ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（商品名：Ａｍｉｃｏｎ社）で４〜５倍濃縮した。１００００〜１５０００クローンの１９プール、１０００〜５８００クローンの３５９プール、および７５〜７００クローンの７２３プールを遺伝子移入し、肥大性活性を検定した。これらの１１７２プールの中で２個が陽性であった。プール４３７（１８７クローンのプール）およびプール７８１（７００クローンのプール）はスコア４を与えた。プール４３７からの純粋クローン（ｐｃｈｆ．４３７．４８と命名）を徐々に減数する陽性プールのクローンを単一クローンが得られるまで反復する再遺伝子移入によって分離した。プール７８１からの純粋クローン（ｐｃｈｆ．７８１と命名）はクローンｐｃｈｆ．４３７．４８からの挿入物へのコロニーハイブリッド形成法によって分離した。クローンｐｃｈｆ．７８１の挿入物の配列は図１（配列番号１、２、および３：それぞれヌクレオチド鎖２個およびアミノ酸配列）に示す。クローンｐｃｈｆ．４３７．４８の挿入物の配列は塩基２７（下線部分）から開始するクローン７８１に一致する。クローンｐｃｈｆ．７８１の第一読み取り枠（図１の翻訳参照）はアミノ酸（ＭＷ＝２１．５ｋＤａと翻訳される）２０３個の蛋白質をコードする。この蛋白質はシステイン残基１個およびＮ−結合グリコシル化可能部位１個を含むが、親水性Ｎ−末端分泌シグナル配列はない。クローンｐｃｈｆ．７８１の３’−非翻訳領域はｂ１（ｂｐ〜８９５〜１０１５）と称される通常のマウス反復配列を包含する。７日目の胚様体ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとのクローンｐｃｈｆ．７８１からのプローブとのハイブリッド形成は〜１．４ｋｂの単一バンドを示し、これはｃＤＮＡクローンからの挿入物のサイズが大体同じである。コードされた配列はＤａｙｈｏｆｆデータベース中の既知蛋白質配列のいずれとも高度（＞３５％アミノ酸同一性）な類似はない。しかしながら、これは、ＣＮＴＦ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ− １１）、ＬＩＦおよびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｂａｚａｎ、Ｎｅｕｒｏｎ、７巻：１９７〜２０８頁［１９９１年］）を含む遠い関連性のある蛋白質のファミリーに対して程度の低い類似性を示す。マウスＣＨＦはマウスＬＩＦにアミノ酸同一性２４％を持ち（ＲｏｓｅとＴｏｄａｒｏ、ＷＯ９３／０５１６９）、ヒトＣＮＴＦにアミノ酸同一性２１％（ＭｃＤｏｎａｌｄなど、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９０巻：７０〜８０頁［１９９１年］）を持つ。マウスＣＨＦとヒトＣＮＴＦとの配列比較については図２参照。ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、およびＯＳＭはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに属するｇｐ１３０を含む関連受容体シグナル蛋白質を使用する（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏなど、Ｃｅｌｌ、７６巻：２５３〜２６２頁［１９９４年］）。ＣＨＦと同様にＣＮＴＦはＮ−末端分泌シグナル配列を持たない。Ｃ．クローンの性質および活性クローンｐｃｈｆ．７８１がＣＨＦをコードすることを証明するために、２９３細胞の遺伝子移入と試験管内ＳＰ６転写／翻訳結合系の使用との双方によって発現研究を行った。ｐｃｈｆ．７８１−遺伝子移入２９３細胞によって産生した蛋白質の³²Ｓ−メチオニンおよびシステイン標識（ベクター遺伝子移入細胞と比較）は調整培地は約２１．８ｋＤａの標識蛋白質を含み、細胞抽出物は２２．５ｋＤａの蛋白質を示した。これら遺伝子移入からの調整培地は１：４の希釈率で前記検定法を使用する心臓肥大性についてスコア６を示した。非標識遺伝子移入からの調整培地は１：１希釈率で形態学的スコア５．５〜６．５を示した。これら検定は心臓肥大性−ＡＮＰ放出の第二測定も陽性であった。図３参照。この検定は¹²⁵Ｉ−ラットＡＮＰのラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ融合蛋白質への結合についての競合の測定によって行った。この方法はＣＤ４−ＩｇＧ融合蛋白質を使用するｇｐ１２０の測定（Ｃｈａｍｏｗなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９８８５〜９８９１頁［１９９０年］）と類似している。略述すれば、マイクロタイタープレートの各ウェルをラット抗ヒトＩｇＧ抗体（２μｇ／ｍＬ）１００μＬで一夜４℃で被覆した。０．５％ウシ血清アルブミン添加燐酸塩緩衝食塩水で洗浄後、ウェルを３ｎｇ／ｍＬラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ１００μＬ（ヒトＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ（Ｂｅｎｎｅｔｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２３０６０〜２３０６７頁［１９９１年］）と同様な方法で製造し、精製したもの）と２４℃で１時間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、ラットＡＮＰ標準品または試料５０μＬとともに２４℃で１時間インキュベーションした。次に¹²⁵Ｉ−ラットＡＮＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）５０μ Ｌを添加してさらに１時間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、計数して結合競合の程度を測定した。試料中のＡＮＰ濃度をラットＡＮＰ標準曲線と比較して決定した。クローンｐｃｈｆ．７８１のＳＰ６−結合試験管内転写／翻訳（Ｐｒｏｍｅｇａ社からの物質）で行った蛋白質の³⁵Ｓ−メチオニン標識は２２．４ｋＤａの標識蛋白質を示した。この標識翻訳生成物は１：２００の希釈率で心臓肥大性検定で陽性（形態学的スコア５〜６）であった。この２２．４ｋＤａ標識バンドが肥大性活性の原因であることを証明するために、標識翻訳生成物を逆相Ｃ４カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ・ＲＯ−４−４０００）を１０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中で平衡させ、アセトニトリル勾配で溶離した。標識蛋白質のピークと肥大性活性のピークとはこのカラムから〜５５％アセトニトリルで同時的に溶離した。心臓筋細胞肥大性活性は既にラット心線維芽細胞から部分的に精製されて報告されている。Ｌｏｎｇなど、前出。さらに本明細書のＣＨＦの性質を研究するため、ラット心臓線維芽細胞を培養した。初代培養からの調整培地は本発明の試験管内新生児ラット心臓肥大性検定で心臓肥大性活性を持つ。クローンｐｃｈｆ．７８１のコード領域断片でプローブ（ハイブリッド形成は５×ＳＳＣ、２０％ホルムアミド、４２℃で最終洗浄は０．２×ＳＳＣ、５０℃）した時、これら培養物から分離したラット線維芽細胞ｍＲＮＡのブロットハイブリッド形成では１．４ｋｂに明瞭なバンドを示した。Ｄ．因子の精製クローンｐｃｈｆ．７８１またはヒトのクローンで遺伝子移入した細胞によって調整した培養培地を１．５Ｍ−ＮａＣｌに調節し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商品名）Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍカラムに入れる。このカラムを１０ｍＭ−ＴＲＩＳ− ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ−ＮａＣｌで洗浄し、１０ｍＭ−ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商品名）３−１０で活性を溶離する。活性のピークを１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に調節し、ＭＯＮＯ −Ｑ・Ｆａｓｔ・Ｆｌｏｗカラムに入れる。このカラムを１０ｍＭ−ＴＲＩＳ− ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％オクチルグルコシドで洗浄すると、活性は流過画分に見出される。次に活性物質を０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル中の逆相Ｃ４カラムに入れ、０．１％ＴＦＡから８０％までの勾配で溶離する。活性はゲル濾過カラム上で約１５〜３０ｋＤａに分画される。分別と回収のためにはグアニジン−ＨＣｌのようなカオトロープ剤が必要であると予期される。実施例ＩＩ生体内肥大活性試験Ａ．正常ラット実施例Ｉの精製ＣＨＦがたとえば血圧、心拍数、全身血管抵抗、収縮性、心拍力、集中または遅延肥大、左心室収縮期圧、左心室平均圧、左心室拡張終期圧、心拍出量、拍動係数、組織学的パラメーター、心室サイズ、壁圧、その他のような循環器パラメーターに及ぼす効果を正常ラットで観察するために試験する。Ｂ．圧過負荷マウスモデル精製ＣＨＦを肺動脈を狭窄して右心室不全を起こした圧過負荷マウスモデルでも試験する。Ｃ．ＲＶネズミ機能不全モデル心室機能不全のレトロウイルスマウスモデルを精製ＣＨＦを試験するために使用でき、ｄＰ／ｄｔ、駆出率および容量を前記肥大性検定法で検定できる。このモデルでは、マウスの肺動脈を狭窄して肺肥大および肺不全を作成する。Ｄ．トランスジェニックマウスモデル筋肉アクチンプロモーター−ＩＧＦ−Ｉ融合遺伝子を持つトランスジェニックマウスは筋障害または心不全の兆候なしに心筋および骨格筋の肥大を示す。さらに、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子標的マウスは心室筋肉収縮蛋白質遺伝子の顕著な発現低下を含む心臓（ならびに骨格）筋肉発生欠陥を示す。これらモデル２種で精製ＣＨＦを試験する。この他に壊死を伴わない拡張心筋障害および心機能障害の遺伝子起因モデルをトランスジェニックおよび遺伝子標的マウス（ＭＬＣ−ｒａｓマウス；異型接合ＩＧＦ−Ｉ−欠損マウスの大動脈バンディング）で開発できる。Ｅ．ラットの心筋梗塞後モデルナトリウム利尿ペプチド産生においてヒト欝血性心不全の予報であるラットの心筋梗塞後モデルで精製ＣＨＦを試験する。特定的には雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ・Ｒｉｖｅｒ・Ｂｒｅｅｄｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、８週齢）を術前少なくとも１週間装置に順化する。ラットは粒状のラット餌および水を自由摂取させ、明るい温度制御室内で飼育する。１．冠状動脈結紮心筋梗塞をＧｒｅｅｎｅｎなど、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９１巻：９２〜９６頁（１９８７年）およびＢｕｔｔｒｉｃｋなど、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６０巻：１１４７３〜１１４７９頁（１９９１年）に記載のようにして左冠状動脈の結紮により発生させる。ラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、気管切開で挿管し、人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ・Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、モデル６８３）で通気する。左側開胸後、左冠状動脈の根元から約２ｍｍのところを７−０絹縫合糸で結紮する。シャム動物に縫合糸を冠状動脈の下を通過させ、次に除去する以外は同じ操作を行う。ラットは全て米国心臓協会によって１９８４年１１月１１日に採用された「研究用動物の使用に関する米国心臓協会の立場」に準拠して取扱う。結紮の４から６週後、ラットの心筋梗塞は心不全まで進行する。臨床的患者では、心筋梗塞または冠状動脈疾患は心不全の最も普通の原因である。このモデルにおける欝血性心不全はヒトの患者多数における欝血性心不全に合理的に類似している。２．心電図術後１週間目に、梗塞の進行を記録するために軽度のメトファン麻酔下に心電図を取る。この研究の結紮ラットを前胸部導線を通る病的Ｑ波の深さと持続に従ってサブグループに群分けする。Ｂｕｔｔｒｉｃｋなど、前出；Ｋｌｏｎｅｒなど、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ・Ｊ．、５１巻：１００９〜１０１３頁（１９８３年）。これで梗塞寸法の大体の推測値を与え、大小の梗塞の分布がＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤および基剤で処置した結紮ラットの間で相違しないことを保証する。精密な梗塞サイズ測定で確認する。３．ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与術後４週間目に、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤（１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１５日間）または食塩水基剤を結紮ラットおよびシャム対照に皮下注射する。処置の間、１週２回体重を測定する。ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤は基剤としての食塩水または水に溶かして投与する。４．カテーテル装着ＣＨＦ、ＣＨＦ拮抗剤、または基剤で１３日間処置後、ラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔する。カテーテル（ＰＥ５０と結合したＰＥ１０）にヘパリン−食塩水溶液（５０／Ｕ／ｍＬ）を満たし、右大腿動脈を通して動脈圧および心拍数を測定するために腹部大動脈に入れる。第２のカテーテル（ＰＥ５０）を右頚静脈を通して右心房圧の測定および食塩水注入のために右心房に挿入する。左心室圧および収縮性（ｄＰ／ｄｔ）測定のために、第３カテーテル（ＰＥ５０）を右頚動脈を通して左心室に挿入する。温度希釈法による心排出量測定のために、サーミスターカテーテル（Ｌｙｏｎｓ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｌｍａｒ、ＣＡ）を大動脈弓に挿入する。全カテーテルを頚の後ろで皮下を通るステンレス鋼線でまとめて、次に固定する。カテーテル挿入に続いて、ラット全部を個室に入れる。５．血行力学的測定カテーテル装着１日後、サーミスターカテーテルをマイクロコンピューター系（Ｌｙｏｎｓ・Ｍｅｄｉａｌ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）で操作して心排出量を測定し、他のカテーテル３個をＧｒａｓｓ・Ｍｏｄｅｌ・７ポリグラフ（Ｇｒａｓｓ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、クインシー、ＭＡ）を装着したＣＰ−１０型圧力伝達器（Ｃｅｎｔｕｒｙ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、クインシー、ＭＡ）に連結する。平均動脈圧（ＭＡＰ）、心収縮器圧（ＳＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、右心房圧（ＲＡＰ）、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、左心室平均圧（ＬＶＭＰ）、左心室拡張後期圧（ＬＶＥＰ）、および左心室最高（ｄＰ／ｄｔ）を意識下の非拘束ラットで測定する。心排出量の測定には室温で等張食塩水０．１ｍＬを頚静脈カテーテルを通して一時に注入する。温度希釈曲線をＶＲ−１６ｓｉｍｕｌｔｒａｃｅ記録器（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ社、ＮＹ）で監視、心排出量（ＣＯ）計数値をマイクロコンピューターによって得る。拍動容積（ＳＶ）＝ＣＯ／ＨＲ；心指数（ＣＩ）＝ＣＯ／ＢＷ；全身血管抵抗（ＳＶＲ）＝ＭＡＰ／ＣＩ。これらの血行力学的パラメーターの測定後、血液１ｍＬを動脈カテーテルを通して採取する。血清を分離し、−７０℃で貯蔵してＣＨＦ濃度および所望ならば種々の生化学的パラメーターを測定する。この実験の最後にラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＫＣｌ（１Ｍ）の心房内注射により心臓を拡張期で停止させる。心臓を取出し、心室から心房と大管を切取る。心室を重量測定して１０％緩衝ホルマリン中に固定する。実験操作は全部研究開始前にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の実験動物管理および使用委員会の承認を受ける。６．梗塞寸法の測定右心室の壁を左心室から切離す。左心室を頂部から底部に向けて４つに分断する。５μｍ切片を取り、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム染剤で染色して装着する。梗塞および非梗塞左心室の心内膜および心外膜の周縁をＤｉｇｉｔａｌ・Ｉｍａｇｅ・Ａｎａｌｙｚｅｒのプラニメーターで測定する。スライス全４個の梗塞した周縁および左心室周縁を心外膜および心内膜表面各々別々に集計し、合計値を各表面について梗塞した周縁の左心室周縁に対する比率として表示する。これら比率２個を平均して梗塞サイズ百分率として表示する。７．統計的分析結果は平均値±標準誤差として表現する。変動の二元および一元分析（ＡＮＯＶＡ）を行って群間でのパラメーターにおける相違を評価する。次に差の有意性をＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法を使用してｐｏｓｔ・ｈｏｃ分析する。ｐ＜０．０５を有意とする。８．結果ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤または基剤で処置する前および後の平均体重は実験群の間で相違するとは期待されない。結紮ラットの梗塞寸法は基剤処置群とＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤処置群との間で異なるとは期待されない。結紮ラットに対するＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の前記用量における投与は基剤処置シャム対照と結紮ラット対照とで観察されるものよりも心室収縮の増大と末梢血管抵抗の低下によって心臓肥大を改善すると期待される。この期待される結果はＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与は欝血性心不全での心機能を改善することを証明する。しかしながら、シャムラットではＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤投与はおそらく動脈圧および末梢性血管抵抗をわずかに低下させる以外はこの用量では心機能を有意に変化させるとは期待されない。本明細書のラットのデータはウマ、ウシ、ヒト、その他の哺乳類に認められた獣医学的および臨床的手法に従って哺乳類の体重について補正すれば外挿しうるものと期待するのは合理的である。標準的実験計画および手法を使用して、獣医または臨床医は処置すべき哺乳類に最高の効果を達成するためにＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の用量、投与の計画および形態を調節することができる。ヒトもこの方式で反応するものと信じられる。実施例ＩＩＩ拡張心筋症の臨床処置案Ａ．処置方針ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤初期用量１０〜１５０μｇ／ｋｇ／日の患者自己投与を提案する。副作用があれば用量を削減する。再評価時に有益な結果がなくて限定する副作用がなければ、用量を増加する。同時的投薬（たとえばＡＣＥ阻害剤としてのカプトプリルおよび利尿剤）は研究医師の裁量により調節する。最大用量を８週間投与後、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与を停止し、類似の無処理期間後（またはプラセボ）に再評価を行う。Ｂ．編入判断基準もし次の判断基準に適合すれば患者を考慮の対照とする： −拡張心筋症（ＤＣＭ）。コントラスト心室造影術または２Ｄ超音波心臓検査術で左心室（ＬＶ）の無動症／運動障害の孤立領域を含まない特発性ＤＣＭ、または虚血性ＤＣＭ。ＬＶ拡張終期ディメンジョン（ＥＤＤ）＞３．２ｃｍ／ｍ²ＢＳＡまたは２Ｄ超音波心臓検査法でＥＤＶ＞８２ｍＬ／ｍ²、超音波心臓検査法でＬＶの部分的短縮＜２８％、または排出率（コントラスト心室造影または放射核種血管造影）＜０．４９を含む収縮期機能障害の証拠。 −兆候。ジゴキシン、利尿剤および血管拡張剤（ＡＣＥ阻害剤）に少なくとも１ケ月安定なニューヨーク心臓協会のＩＩＩ級または最高運動ＶＯ₂＜１６ｍＬ／ｋｇ／分（年齢で調整）。 −現在ＡＣＥ阻害剤治療中。 −左心室容積と重量を推測できる適当な超音波心臓検査の「ウインドウ」。 −投薬計画に従ってＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤を自己投与し、信頼性をもって追跡評価のために戻ってくる能力。 −患者およびその初診医師の参加への同意。 −除外判断基準適合の不在。Ｃ．除外判断基準次のいずれかの理由があれば患者を考慮の対照から除外する。 −心臓弁疾患に由来する拡張心筋症（手術可否にかかわらない）、特定の処置可能病因（脱離が試みられていないアルコールを含む）、または手術可能な冠状動脈疾患。 −特定の腰痛または閉塞性末梢性血管症による運動制限。 −慢性閉塞性肺疾患。 −糖尿病またはグルコース許容性の障害。 −手根トンネル症候群の症歴、または検査でのティネル徴候陽性の証拠。 −腎臓結石の病歴。 −変形性関節症の徴候。 −侵襲性の血行力学的監視を伴う一連の自転車エルゴメトリー（下記のような）への同意または参加の不能。 −活性な悪性腫瘍。Ｄ．患者評価１）主な評価点：ベースライン；ピーク後安定なＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤用量を８週間継続；投薬停止後のアフターイコール期。 −患者は実際の処理開始後２日から３日入院させ、毎日体重および電解質、燐、ＢＵＮ、クレアチニン、およびグルコースを含む試験データを採集することになる。これに続いて臨床検査センターの階でさらに２日か３日毎日観察を受ける。ｉ．体力測定。ｉｉ．徴候評価点数（Ｋｅｌｌｙなど、Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ・Ｊ．、１１９巻：１１１１頁［１９９０年］）。ｉｉｉ．臨床検査項目：ＣＢＣ；電解質（Ｍｇ⁺²およびＣａ⁺²を含む）；ＢＵＮ；クレアチニン；燐；空腹時グルコースおよび脂質特性（全コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリド）；肝機能検査（ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、全ビリルビン）；全蛋白質；アルブミン；尿酸；およびＣＨＦ。ｉｖ．２Ｄ、Ｍ−モード、およびドップラー超音波心臓検査：乳頭筋の水準における拡張期および収縮期のディメンジョン；先端２室および４室視点からの面積測定で評価した拍出率推測値、Ｓｉｍｐｓｏｎ則の方法による収縮期および拡張期推測容積、および推測上の左心室量；僧帽弁流入特性（ＩＶＲＴ、ピークＥ、ピークＡ、徐脈時間、Ａ波時間）、および肺静脈流動プロファイル（収縮期流動面積、拡張期流動面積、逆時間、および速度）のドップラー評価；を含む。ｖ．休息および運動時血行力学および経皮挿入した肺動脈および動脈カテーテルでの自転車エルゴメトリーを使用する酸素消費測定。感知した運動水準をＢｏｒｇスケールで記録し、肺動脈の収縮期、拡張期および平均圧ならびに動脈圧および肺毛細管ウエッジ圧を運動負荷の段階毎に、動脈および混合静脈酸素含有量とともに測定して心排出量を算出する。ｖｉ．脂肪および脂肪のない身体量ならびに骨格筋強度と持久力の評価。２）中間評価点：毎週ｉ．体力測定。ｉｉ．徴候点のスコア。ｉｉｉ．臨床検査データ：電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、燐、空腹時グルコース、ソマトメジン−Ｃ、およびＣＨＦ。Ｅ．可能性のある利点１）満足状態感覚の改善。２）運動許容の増加。３）筋力および脂肪のない身体量の増加。４）全身血管抵抗の減少。５）心臓性能の強化。６）相補的心筋肥大の強化。実施例ＩＶ試験管内神経栄養活性の試験毛様体神経節神経栄養活性用の検定をＬｅｕｎｇ、Ｎｅｕｒｏｎ、８巻：１０４５〜１０５３頁（１９９２年）にしたがって実行した。略述すれば、Ｅ７−Ｅ８ニワトリ胚から毛様体神経節を切離し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ・１５４００−０１３）で分離し、燐酸緩衝食塩水中で３７℃で１５分間１０倍に希釈した。神経節をトリプシン不含になるまで生育培地（１０％ウシ胎児血清、１．５ｍＭ−グルタミン、ペニシリン１００μｇ／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ添加高グルコースＤ−ＭＥＭ）で３回洗浄し、次に生育培地１ｍＬ中で緩やかにかきまぜて単一細胞懸濁液とした。生育培地５ｍＬ中のこの細胞混合物を１００ｍｍ組織培養皿上にプレーティングし、３７℃で４時間組織培養インキュベーターに置いてニューロンを濃縮した。この間に非ニューロン細胞は優先的に皿に付着し、インキュベーション終期にはニューロンは緩やかに洗浄される。濃縮されたニューロンを次に予めコラーゲンで被覆した９６ウェルプレートにプレーティングした。各ウェルに細胞１０００から２０００個を入れ、実施例Ｉのｐｃｈｆ．７８１−遺伝子移入２９３細胞からの調整培地で希釈して最終容積１００から２５０μＬとした。細胞を対照としての遺伝子移入２９３調整培地とともに、および比較としてのＣＮＴＦ標準とともに入れた。３７℃で２〜４日間のインキュベーション後に、生体色素メタロチオネイン（ＭＴＴ）を使用して生存細胞を染色して生存細胞数を評価した。ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ・Ｍ２１２８）５ｍｇ／ｍＬの５分の１容をウェルに添加した。３７℃で２〜４時間インキュベーション後に、生存細胞（濃紫色沈降物で満ちている）を１００×の位相差顕微鏡で計数した。この検定結果を図４に示す。ｐｃｈｆ．７８１遺伝子移入（三角）は遺伝子移入２９３調整培地の検定容積の逆数の増加と共にニューロンの生存（細胞数で測定）を増加することを認識できる。これはＣＮＴＦ標準（円）のパターンと類似し、調整培地の検定容積の関数としては生存数の増加を示さない対照遺伝子移入（四角）とは対照的である。これはＣＨＦはＣＮＴＦで観察されるものと同様な効果を持ち、神経栄養剤として有用であることを示す。実施例ＶヒトＣＨＦ（ヒトのカルジオトロフィン−１［ＣＴ−１］とも呼ばれる）をコードするｍＲＮＡの源泉をマウスＣＨＦ・ｃＤＮＡクローンからのプローブで成人組織数種からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを検索して確認した。心臓、骨格筋、結腸、卵巣、および前立腺は２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃で１８０ｂｐのマウスＣＨＦプローブ（１９ｂｐ５’の開始ＡＴＧからアミノ酸５０まで）でブロットハイブリッド形成させ、０．２５×ＳＳＣ、５２℃で最終洗浄すると１．８ｋｂバンドを示した。同じプローブおよび条件（最終洗浄５５℃）でヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を検索することによってヒトのＣＴ−１をコードするクローンを分離した。クローン１１個を１００万個から選択した。このクローン数種のＥｃｏＲＩ挿入物をプラスミドベクターにサブクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定した。クローンｈ５からのＤＮＡ配列（配列番号６および配列番号７：センスおよびアンチセンス鎖）を図５に示すが、これはコード領域全部を包含する。クローンｈ５（ｐＢＳＳＫ＋．ｈｕ．ＣＴ１．ｈ５）は１９９４年７月２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ第７５８４１として寄託された。ｈ６と命名された他のクローンのＤＮＡ配列はクローンｈ５のものと重複領域内では一致した。クローンｈ６はクローンｈ５の塩基４７から始まり、さらにクローンｈ５の３’に５２１塩基まで伸長する。図６から明らかなように、ヒトＣＴ−１（配列番号８）のコードする蛋白質に配列はマウスＣＨＦ配列（配列番号３）に７９％同一であって、前者を「ｈｕｍｃｔ１」、後者を「ｃｈｆ．７８１」と命名する。クローンｈ５がコードするヒトＣＴ−１が、生物学的に活性であることを証明するために、ＥｃｏＲＩ断片を哺乳類発現ベクターｐＲＫ５（欧州特許３０７２４７）の独特なＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＲＫ５．ｈｕ．ＣＴ１を得た。このプラスミドをヒト２９３細胞に遺伝子移入し、細胞を血清不含培地に３〜４日間維持した。この培地を次に心臓筋細胞肥大性に対してマウスＣＨＦについて前記したようにして検定した。遺伝子移入した２９３調整培地はこの検定で明らかに活性であった（１：２０希釈で肥大性スコア５．５）。材料の寄託次のプラスミドをＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１・Ｐａｒｋｌａｗｎ・Ｄｒｉｖｅ、ロックビル、ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）に寄託した。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびその下にある諸規則（ブダペスト条約）に従って行われた。これは寄託物の増殖可能培養物の維持を寄託日から３０年間保証する。この寄託物は関連する米国特許の発行または米国または外国特許の公開のいずれか早い方が行われた後には、ＡＴＣＣはブダペスト条約の規定およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社とＡＴＣＣとの契約の下に寄託物培養物の子孫について公共に対する永続的な無限定な入手可能性を保証し、米国特許法１２２条および特許商標庁長官の規則（米国特許庁公報８８６巻６３８項を参照する３７ＣＦＲ１．１４条を含む）に従って米国特許商標庁長官が決定する者に対する寄託物の子孫の入手可能性を保証する。本出願の譲受者はもし寄託したプラスミドの培養物が適当な条件下に培養した時に死滅するか、紛失するか破壊されたら、通告があればプラスミドを同じプラスミドの別物と迅速に交換することに合意している。寄託プラスミドの入手可能性を各政府がその特許法による権限で与える権利を侵害する本発明の実施を承諾するものと理解してはならない。前記明細書は当業者に本発明を実施させるに十分であると考えるものである。寄託した態様は本発明のある側面の単なる一例示であり、機能的に均等な構築物はいずれもこの発明の範囲内にあることが意図されているので、本発明は寄託された構築物による範囲に限定されるものではない。本材料を寄託したことは本明細書記載がその最適態様を含む本発明のいずれかの側面を実施するために不適当であるとの告白を構成するものではなく、またそれが提示する特定の例示に請求項の範囲を限定すると理解してはならない。実際、本開示および記載に加えて当業者にとって本発明の種々の修飾は前記記載から明白であり、本発明の種々の修飾は添付する請求項の範囲内に入るものである。 Detailed Description of the Invention Cardiotrophin and its useField of the invention This invention relates to the regulation of cardiac function in the treatment of heart failure and the treatment of neurological disorders. Related to cardiac hypertrophy factor (also called cardiotrifin) I do.Background of the Invention Heart failure affects about 3 million Americans and affects about 400,000 people each year. Most This is now one of the major hospitalization diagnoses in the United States. Acute including acute myocardial infarction Recent advances in the management of heart disease eventually lead to an expansion of the patient population who progress to chronic heart disease. Invited. Recent therapies for heart failure are primarily angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors And is directed to the use of diuretics. ACE inhibitors prolong survival in heart failure On the other hand, patients who have progressed toward the final stage heart failure and who are receiving ACE inhibitors Many of them are functionally with class 111 heart failure. In addition, ACE inhibitors More than 60% of patients with failure cannot relieve symptoms, and about 15 to 20 deaths due to heart failure It seems certain that it will only decrease by%. Heart transplantation depends on the availability of donor hearts. Limited. In addition, except for digoxin, long-term administration of positive inotropic agents Is a survival-related side effect such as arrhythmia, sudden death, and other adverse side effects. There is no useful drug without action. These deficiencies in current therapy address other therapeutic approaches. Suggest the need to do so. Extensive data show that pathological myocardial hypertrophy in early heart failure is ventricular dilation, wall tension / Increased stress, increased cardiomyocyte length vs. width, and associated cardiac performance and Characterized by diminished function, suggesting that it may be harmful. According to research Activation of physiological or compensatory hypertrophy may be beneficial for heart failure. In fact, ACE The effect of the inhibitor is not only intended to remove the load on the heart, Prevents pathological hypertrophic responses predicted to be associated with the renin-angiotensin system It is also intended to be. At the molecular biology level, the heart is a supporting cell called myocyte and surrounding non-myocyte Function as a syncytium. Non-muscle cells are essentially fibroblast / mesenchymal cells, They also include endothelial cells and smooth muscle cells. In fact, muscle cells It makes up most, but only about 30% of the total number of cells present in the heart. Due to their close relationship with cardiomyocytes in vivo, non-muscle cells are able to grow and / or Can affect development. This interaction is direct through cell-cell contact Or indirectly through the production of paracrine factors. In vivo like this The relationship is the relationship between the number of non-muscle cells and the extracellular matrix with which they interact. More important in myocardial hypertrophy and in response to injury and infarction You. These changes are associated with abnormal myocardial function. Myocytes in the heart are indivisible immediately after birth. Further growth is hypertrophy of each cell Get up through. A cell culture model of myocyte hypertrophy was developed and a mechanism of cardiac myocyte hypertrophy was developed. I deepened my understanding of the introduction. Simpson et al., Circ. Res. , Volume 51: 787-801 (1982); Chien et al., FASEB J .; Volume 5: Pages 3037-3046 (1991). Most studies of cultured cardiac muscle cells are non-muscle cells Designed to minimize contamination. For example, Simpson and Savi on, Circ. CRes. 50: 101-116 (1982); Li bby, J. et al. Mol. Cell. Cardiol. , 16: 803-811 (1984); Iwaki et al. Biol. Chem. 265: 13 Pp. 809-13817 (1990). Shubaita et al. Biol. Chem. Volume 265: 20555 20562 (1990) can activate the hypertrophic response, for example endothelin Describe the usefulness of culture models to identify peptide-derived growth factors, such as -1. Posted. Long, Cell / Regulation, Volume 2: 1081-1 P. 095 (1991) describes the development of cardiac non-muscle cells in culture. Studied the impact. Myocyte hypertrophic growth in high density cultures with increasing numbers of non-myocytes And enhanced in co-cultures with increasing numbers of non-myocytes. Affects muscle cell size This effect of non-muscle cells is reconstituted by plasma-free medium conditioned by non-muscle cell cultures. It was able to appear. The major muscle cell growth promoting activity in this culture was heparin binding. Fibroblast growth factor known to exist in myocardium due to various properties of this growth factor Offspring (FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), tumor necrosis factor-alpha (T NF-α), and transforming growth factor-beta1 (TGF-β1). Was compared with various growth factors including. Growth factors such as Long are other known growth factors Greater than the factors and different from all of these growth factors except PDGF It was found to have heparin-sepharose elution characteristics. Furthermore, this is PD It was not neutralized by the GF-specific antibody. The author says this is cardiac muscle cell growth And to define paracrine relationships that are important for development. Not only is there a need to improve the treatment of heart failure such as congestive heart failure, but also neurological disorders. There is also a need to provide effective treatment for the patient. Insulin-like growth factor, nervous system Long factor, brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3, -4, -5, and hair Neurotrophic factors, such as neurotrophic factor, enhance survival of neurons, for example Amyotrophic axosclerosis, Alzheimer's disease, seizures, epilepsy, Huntington's disease, pa -For the treatment of such things as Kinson's disease, and neurodegenerative diseases such as peripheral neuropathy Has been proposed as a potential method for. Provide additional therapies for these purposes To do is desirable. Therefore, one of the objects of the present invention is the prevention and / or prevention of heart failure such as congestive heart failure. Or treatment, especially the promotion of physiological types of hypertrophy or the inhibition of pathological types of hypertrophy, And prevention for the treatment and / or treatment of neurological disorders such as peripheral neuropathy It is to provide good therapy. Cardiac hypertrophic factor polypeptides and their use for use in such therapies Another purpose is to identify a new group of antagonists. A nucleic acid encoding such a polypeptide is provided and the nucleic acid is used for recombinant cell culture. It is yet another purpose to use to produce the polypeptide in a nutrient. Yet another object includes amino acid sequence variants and covalent derivatives thereof, It is to provide derivatives and modified forms of such polypeptides. One of the other purposes is an antigen for producing antibodies against such polypeptides. To obtain antibodies capable of binding to them. For example, in expression cloning and purification of its polypeptide, In the evaluation of clones isolated from S. To provide a new hypertrophic assay that can be used to identify antagonists against Yet another purpose. These and other objects of the invention will be apparent to those of ordinary skill in the art in view of the entire specification. It's obvious. Summary of the Invention Expression cloning and protein of cardiac hypertrophy factor (CHF) disclosed herein An in vitro neonatal rat cardiac hypertrophic assay was developed to allow purification. 10 every week It has a processing capacity of 00 samples and requires a small sample volume of 100 μL or less. This assay would not have been possible using previously published methods It enabled expression cloning and protein purification. Therefore, in one aspect, the invention Is: (a) Dalbe containing insulin, transferrin, and aprotinin Approximately 7.5 x 1 per mL of the modified Eagle's medium (D-MEM) / F-12 medium of Akko 0^FourPlate the myocyte suspension at cell density in a 96-well plate To do; (B) culturing the cells; (C) Add a test sample (as suspected to contain CHF) to the cultured cells That; (D) culturing the cells with a test sample; and (E) Determining whether the test sample has hypertrophic activity There is provided a method of assaying a test sample containing a. For hypertrophic activity. Apart from this assay, the present invention excludes rat CHF polypeptide, isolated. A CHF polypeptide is provided. The CHF polypeptide is preferably substantially Homogeneous, which may be glycosylated or non-glycosylated, with the native sequence Polypeptides, polypeptide fragments, variant polypeptides, and chimeric polypeptides It may be selected from the group consisting of peptides. In addition to this, the CHF polypeptide A polypeptide isolated from a mammal, a recombinantly produced polypeptide, and It may be selected from the group consisting of polypeptides produced synthetically. Furthermore this CHF polypeptides are human and non-immunogenic in humans May be selected from the group consisting of: In another aspect, the isolated CHF polypeptide has the translated CHF sequence shown in FIG. Share at least 75% amino acid sequence identity. In another aspect, this polype The peptide is mature human CHF and has the translated CHF sequence shown in FIG. In yet another aspect, the present invention provides the method shown in Figure 1 under moderately stringent conditions. A nucleic acid that has a sequence that hybridizes to the nucleic acid sequence Polypeptides are provided. Preferably the polypeptide is biologically active You. In another aspect, the invention features a texture comprising CHF fused to a heterologous polypeptide. Provide the La body. In yet another aspect, the invention is pharmaceutically acceptable with biologically active CHF. Biologically active CH, including a carrier or fused to an immunogenic polypeptide A composition comprising F is provided. In another aspect, the invention provides an isolated antibody capable of binding CHF, And contacting the antibody with a sample or cells suspected of containing CHF And detecting if binding occurs with something like an ELISA A method for detecting CHF in vitro or in vivo is provided. In yet another aspect, the invention involves passing a mixture of CHF through an antibody-bound column. And a method for purifying CHF, which comprises recovering a fraction containing CHF. In another aspect, the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding CHF, the nucleic acid component Recognized by a vector containing the offspring, preferably a host cell transformed with this vector. Expression vectors, mammals and cells containing nucleic acid molecules that are operably linked to regulatory sequences that Host cells containing this nucleic acid molecule, including fungal host cells, and host cells containing this nucleic acid molecule Nucleic acid encoding CHF for producing CHF by culturing main cells Including methods of using the molecule. Preferably, CHF is obtained by gene transfer into a host cell. The nucleic acid is expressed to recover CHF from the host cell culture, or if it is secreted. If so, it is recovered from the culture medium. In yet another aspect, the present invention provides the open reading frame nucleic acid sequences shown in FIG. 1 or FIG. Provided is an isolated nucleic acid molecule. The present invention is isolated except rat CHF A nucleic acid molecule, (A) The nucleotide sequence of the coding region of the CHF gene shown in FIG. 1 or FIG. A cDNA clone containing; (B) Hybridizes with clone (a) under stringent conditions A DNA sequence capable of (C) Encodes a polypeptide having the biological properties of natural CHF polypeptide Gene mutant of any of the DNA sequences of (a) or (b) A selection from the group consisting of is also provided. The present invention is moderately stringent in the DNA sequences provided in Figure 1 or Figure 5. An isolated DNA molecule with a sequence capable of hybridizing under conditions And encodes a biologically active CHF polypeptide except rat CHF. Also provide things. In yet another aspect, contacting the CHF nucleic acid molecule with a test sample and hive Determining whether lid formation has occurred, or the CHF nucleic acid molecule is Hybridizing to test sample nucleic acid and determining the presence of CHF nucleic acid And a method of determining the presence of a CHF nucleic acid molecule in a test sample. In yet another aspect, the invention provides a nucleic acid polymer of a CHF nucleic acid molecule and a test sample. Provided is a method of amplifying a nucleic acid test sample that comprises priming a ze chain reaction. In yet another aspect, the invention provides a CHF antagonist and the hypertrophic assay. Use of cell supernatant as test sample and CHF hypertrophy as demonstrated by this assay Provided is a method of identifying an antagonist that involves searching for a molecule that antagonizes sexual activity. In yet another aspect, the invention provides a therapeutically effective amount for mammals in need of such treatment. Of a CHF or CHF antagonist in a pharmaceutically acceptable carrier Suffering from heart failure, muscle inotropic disease or arrhythmia disease including administration of Methods of treating mammals at risk are provided. The present invention also provides a pharmaceutically acceptable carrier for mammals in need of such treatment. To a neurological disease comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising CHF Provided are methods of treating a mammal afflicted or at risk. In an additional aspect, the invention provides labeled CHF, preferably radiolabeled CHF, In a cell receptor assay, binding CHF to cells, or Enriching cells containing the receptor using labeled CHF, comprising CHF A method of identifying a receptor is provided. Brief description of the drawings 1A and 1B show the nucleotide sequence of mouse CHF DNA clone And antisense strands) (SEQ ID NOs: 1 and 2) and deduced amino acids The sequence (SEQ ID NO: 3) is depicted. The underlined complementary nucleotide at position 27 is The starting point of another mouse CHF clone used to obtain the loan is shown. Figure 2 shows the translated amino acid sequence of mouse CHF clone (chf.781). No. 3) and the amino acid sequence of human ciliary neurotrophic factor (humcntf) (SEQ ID NO: 4) is compared in parallel to show the degree of sequence identity. Figure 3 shows phenylephrine (standard curve) and 29 by neonatal cardiac hypertrophy assay. A graph of atrial natriuretic peptide (ANP) release upon 3-cell gene transfer. Shows Fig. 4 is a medium from CNTF standard (circle), CHF / DNA gene transfer 293 cells. (Triangles) and medium from control DNA gene transfer 293 cells (squares) are used. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) standard (ng / mL) or gene transfer 293 Survival of ciliary ganglion neurons as a function of cell conditioned medium (reciprocal of assay volume) ( (Measured by the number of cells). 5A and 5B show the nucleotide sequence of human CHF DNA clone (sense). And the antisense strand) (SEQ ID NOS: 6 and 7) and the deduced amino acid sequence ( Distribution Column number 8) is shown. FIG. 6 shows the translated amino acid sequence of human CHF clone (humct1) (sequence No. 8) is the translated amino acid sequence of the mouse CHF clone (chf.781). The degree of sequence identity is shown in parallel with (SEQ ID NO: 3). Detailed Description of the Preferred Embodiments I. Definition In general, the following terms when used in the detailed description of the invention, examples and claims: Has a definition to point out. "CHF" (or "cardiac hypertrophic factor" or "cardiotrophin" or “Cardiotrophin-1” is herein referred to as the polypeptide sequence of FIG. 5. The biological properties (below) of naturally occurring polypeptides, including the human equivalent shown in 5, are less than It is defined as a polypeptide sequence having at least one. This includes rat C HF homologues, CHF from rat species are not included. This definition is here From natural CHF sources such as the mouse embryoid bodies described, or excluding rats, including humans. Polypeptides isolated from other sources, such as different animal species, as well as recombinant methods. Or synthetically produced polypeptides. This includes its functional derivative, Variant forms, including amino acids, isoforms and homologues. A "CHF fragment" is a portion of a naturally occurring mature full-length CHF sequence that comprises amino acid residues Alternatively, one or more carbohydrate units have been deleted. Remove Whether the amino acid residue comprises the N-terminus or C-terminus or the middle of the polypeptide It may be in a different place. Fragments share at least one biological property in common with CHF Share. Typically, CHF fragments will have at least 10, 15, 20 amino acid residues. , 25, 30, or 40 CHF or humans isolated from mouse embryoid bodies It has a sequential sequence identical to that of CHF isolated from mammals, including CHF. A “CHF variant” or “CHF sequence variant” as defined herein is a recombinant cell. Obtained from cell cultures or from mouse embryoid bodies with the deduced sequences described in Figure 1. CHF or the human equivalent shown in FIG. 5 has 100% or less sequence identity. By biologically active CHF is defined below. Normally biologically active CH The F mutant was either CHF isolated from mouse embryoid bodies or mature human CHF (Fig. 1 and 5)) with at least about 70%, and preferably at least about 70% 75%, more preferably at least about 80%, even more preferably about 85% , More preferably at least about 90%, and most preferably at least about 9% It has 5% amino acid sequence identity. A “chimeric CHF” is a full-length CHF or one or more fragments thereof as a second protein. Polype containing fused or combined white matter or one or more fragments thereof It is Petit. This chimera shares at least one of its biological properties with CHF . The second protein is typically a cytokine, growth factor, or growth hormone. Eel hormone, IGF-I, or eg CNTF, nerve growth factor (NGF) , Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), d Neurotrophin-4 (NT-4), Neurotrophin-5 (NT-5), Is a neurotrophic factor like the others. "Separated CHF", "highly purified CHF" and "substantially homogeneous" CHF "is used interchangeably and may be purified from a CHF source, recombinant or synthetic. CHF produced by the method of (1) spinning cup sequencing device or commercial Most commercially available amino acid sequencer or published on the filing date of this application N-terminal or intermediate amino acid using a modified amino acid To obtain at least 15 and preferably 20 amino acid residues of the sequence Or (2) non-reducing using Coomassie blue or preferably silver stain. Or homogeneity by SDS-PAGE under reducing conditions, contaminating peptides or proteins It means CHF of which quality is not included. Here, homogeneity is that of other source proteins. It means less than about 5% contamination. "Biological property" refers to either "CHF" or "isolated CHF" When used with a Or directly or indirectly CHF (whether in native or modified conformation) Or in vivo effector or antigenic function or Means to have activity. This effector function has receptor and carrier binding activity. , CHF activation or antagonism, especially replication, DNA regulatory function, organisms of other growth factors Of biological activity, receptor activation, inactivation, up- and down-regulation Cell, cell growth or differentiation, and the transmission of other proliferative signals. However Et al., Because the effector function cross-reacts with antibodies raised against natural CHF. It does not include possession of a potential epitope or antigenic site. “Antigen function” has a sequence shown in FIG. 1 or a human homologue having a sequence shown in FIG. Cross-linked with antibodies raised against natural CHF, which is the natural CHF of other mammals including It means possession of an epitope or antigenic site capable of reacting. CHF poly The main antigenic function of the peptide is CHF isolated from mouse embryoid bodies or its human homologue. At least about 10 antibodies to the body⁶Bind with L / mole affinity Is Rukoto. Usually, the polypeptide has an affinity of at least about 10.⁷In L / mol Join. Most preferably, the antigenically active CHF polypeptide is said effector machinery. It is a polypeptide that binds to an antibody produced against CHF having one of the functions. The antibody used to define "biological activity" is Freund's complete adjuvant. CHF isolated from recombinant cell culture or embryoid bodies in Subcutaneous injection, intraperitoneal injection of this preparation until the titer of anti-CHF antibody becomes stable This is a rabbit polyclonal antibody prepared by boosting (boosting) the reaction. "Biologically active" is used in the context of "CHF" or "separated CHF". CHF polypeptide may induce hypertrophic, inotropic, antiarrhythmic, or neurotrophic Recombinant active or isolated from mouse embryoid bodies or as described herein What shares the effector function of CHF produced by cell culture, and Means that it can have an antigen function (but is not essential). CHF in this specification The main effector functions of CHF polypeptides are, for example, unique plating media. Use the ground and density, preferably to read the crystal violet stain By using atrial natriuretic peptide (ANP) release as described herein for use, Or affects cardiac growth or hypertrophic activity as measured by the myocyte hypertrophy assay Is Rukoto. The intended function of CHF (or CHF antagonist) is physiological hypertrophy ( Beneficial) and reduce pathological hypertrophy. In addition to this, the present specification book CHF promotes a more normal electrophysiological phenotype, resulting in antiarrhythmia It is expected to exert its function. Of CHF or CHF polypeptides herein The other major effector function is chicken ciliary ganglion neutrophil in an assay for CNTF activity. It is a growth stimulus for lon. Antigenically active CHF has the antigenic function of CHF and, in addition, effects It is defined as a polypeptide that may have a functional function (but is not essential). In a preferred embodiment, the antigenically active CHF is capable of binding CHF. At least about 10 for antibodies⁶A polypeptide that binds with an affinity of L / mole. Through Usually, the polypeptide is at least about 10⁷It binds with an affinity of L / mole. CH An isolated antibody that can bind to F is a component of the natural environment in which it may reside. It is a confirmed and isolated antibody. Most preferably, the antigenically active CHF is Polypeptide binding to an antibody capable of binding CHF in its native conformation Is. CHF in its native conformation is a CHF found in nature, eg For example, CHF was measured by migration on a non-reducing, non-denaturing sizing gel. By chaotropic agents, heat or other treatments that substantially modify the three-dimensional structure. It has not been modified. The antibody used in this assay is Freund's complete antibody. Formulating natural CHF from a non-rabbit species in a juvant and injecting this formulation subcutaneously By intraperitoneal injection of this formulation until the anti-CHF antibody titer stabilizes This is a rabbit polyclonal antibody prepared by boosting the immune reaction. The "percentage of amino acid sequence identity" with respect to a CHF sequence is used herein to refer to each sequence in parallel. Compare and introduce spacing, if necessary, to maximize percent sequence identity and sequence identity Without considering any conservative substitution as a sex part, the deductive amino acid described in FIG. In the CHF sequence isolated from the mouse embryoid body having an acid sequence, or the deduction described in FIG. Percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to residues in the human CHF amino acid sequence Define as. Extension, deletion at the N-terminus, C-terminus or intermediate to the CHF sequence , Or insertion should not be construed as affecting sequence identity or homology. You. Thus, biologically active CHF polypeptides which are believed to have the same sequence. Examples of peptides include prepro-CHF, pro-CHF and mature CHF. "CHF microsequencing" may be performed by any suitable standard procedure. It can be achieved if the law is sensitive enough. In one of the methods, SDS gel or Is a highly purified polypeptide obtained from the final HPLC step at 120 A 470A type Appl equipped with phenylhydantoin (PTH) amino acid analyzer Direct automated Ed using a gas phase sequencer from ied Biosystems Sequenced by Mann's decomposition (phenylisothiocyanate) method. In addition to this Chemically (eg CNBr, hydroxylamine, or 2-nitro-5 -Thiocyanobenzoic acid) or enzymatically (eg trypsin, clostripai) Or Staphylococcus protease) and subsequent fragment digestion CHF fragments obtained by purification (eg, HPLC) were similarly sequenced. You can. PTH amino acid is ChromPerfect (trade name) data system (Justice Innovations, Palo Alto, CA) Will be analyzed. Sequence interpretation is VAX11 / 785Digital • Equipme Henzel et al., J. Chromatography, 4 04: 41-52 (1987). If necessary The HPLC fraction was electrophoresed on 5-20% SDS-PAGE and the PVDF membrane (Pr oBlott, AIB, Foster City, CA) and electro-transferred to Coomassie Buri It can be stained with liant blue. Matsurdiara, J .; Biol. Che m. 262: 10035-10038 (1987). Confirmed by this dyeing The specific protein to be excised was excised from the blot and the N-terminal was analyzed by the gas phase sequencer. Perform sequencing. For intermediate protein sequences, the HPLC fraction was dried under vacuum. (SpeedVac), resuspended in an appropriate buffer, cyanogen bromide, Ly s-specific enzyme Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) or Asp-N (Boehringer Mannheim, Indy) Digest with Annapolis, IN). After digestion, the resulting peptides are mixed again Is a propanol gradient in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) on a C4 column. Gas phase sequencing after separation by HPLC resolution. An "isolated CHF nucleic acid" is 16 consecutive nucleotide bases or more, RNA or DNA containing preferably 20 or more, which is biological Which encodes an active CHF or a fragment thereof, which comprises RNA or D Moderately complementary to NA or hybridized to this RNA or DNA It binds stably under stringent conditions. This RNA or DNA normally does not contain at least one source nucleic acid that is present in the natural source, It is preferably substantially free of any other mammalian RNA or DNA. "Normal Does not contain at least one contaminating source nucleic acid in its natural origin. " The nucleic acid exists in the origin or natural cell but is at a different chromosomal site, or Or otherwise bound to nucleic acid sequences that are not normally present in the cell of origin. It also includes the case. Examples of isolated CHF nucleic acids are mouse CHF or human CHF Is at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably 85 %, Even more preferably 90%, and most preferably 95% sequence identity. An RNA or DNA encoding a shared, biologically active CHF. A "regulatory sequence" is an expression sequence that is operable in a particular host organism when it relates to expression. Operably refers to a DNA sequence required for expression of the sequence. Suitable for prokaryotes Off control sequences are, for example, promoters, operator sequences if necessary, Site-binding sites, and possibly other sequences that are still poorly understood. No. Eukaryotic cells contain promoters, polyadenylation signals and enhancers Is known to take advantage of. "Operably linked" when referring to a nucleic acid refers to that nucleic acid to which it is attached. It means being located in a functional relationship. For example, if the polypeptide is secreted Is expressed as a preprotein involved in The DNA for the polypeptide is operably linked to the DNA for the polypeptide, and Promoter or enhancer is the coding sequence if it affects the transcription of the sequence. Operably linked to; or if arranged to promote translation Then, the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence. Typically, "Operably linked" means that the DNA sequences to be linked are contiguous and If they are close, they are close to each other and within the reading frame. However, the enhancers are in close proximity It is not necessary. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction sites. Like that Synthetic oligonucleotide adapter according to standard method Or use a linker. “Foreign” when referring to an element is foreign to the cell, Or positions that are homologous to the cell but are not normally present in the host cell nucleic acid Means a nucleic acid sequence according to "Cell", "cell line" and "cell culture" are used interchangeably herein, This description includes all progeny of the cell or cell line. Therefore , Terms such as "transformants" and "transformed cells" refer to the original pair. Elephant cells and cultures derived therefrom regardless of passage number. All proge Knee is accurate in DNA content due to conscious or random mutations It is also understood that they need not be identical. Assay with the first transformed cells Mutant progeny having the same function or biological activity as those included are included. If another meaning is intended, it will be clear in the surrounding text. A "plasmid" is a circular DNA molecule that replicates autonomously and has an independent origin of replication. Where a lowercase "p" precedes and / or an uppercase and / or Names the numbers consecutively. Where the starting plasmid is commercially available or limited Publicly available or published from these available plasmids It can be constructed according to the operation. In addition to this, other equivalent plasmids are known in the art. Are known and will be apparent to those skilled in the art. "Restriction enzyme digestion", when referring to DNA, refers to the phosphodiester inside the DNA. Catalysis by enzymes that act only on certain positions or sites in the DNA sequence of stell bond It means a target disconnection. Such enzymes are called "restriction endonucleases" . Each restriction endonuclease is uniquely called a "restriction site" that exhibits duplex symmetry. Recognizes the DNA sequence of Various restriction enzymes used herein are commercially available And their reaction conditions, cofactors, and others established by the enzyme supplier. Use the requirements of. Restriction enzymes are usually large letters that represent the microorganism that first obtained each restriction enzyme. They are named by letters followed by abbreviations consisting of other letters, followed by a number indicating the particular enzyme. one Generally, about 1 μg of plasmid or DNA fragment is buffered with about 1-2 units of enzyme. Use in about 20 μL. The appropriate buffer and substrate mass for a particular restriction enzyme is Specified by the manufacturer. Incubation at 37 ° C for about 1 hour is normally used, , Can be changed according to the supplier's instructions. After incubation, pheno Protein and polypeptide to remove by digestion Nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. Digestion with restriction enzymes Followed by bacterial alkaline phosphatase hydrolysis of the terminal 5'-phosphate. Restriction fragmentation of a DNA fragment "Cyclization" of two ends of the DNA fragment To prevent the formation of a closed ring that hinders the insertion of Unless stated otherwise, plasmid deletion No 5'-terminal dephosphorylation is carried out after oxidization. Molecular clones such as Sambrook Ng: Laboratory Manual (Molecular Cloning: A. Labo rally / Manual (New York, Cold / Spring / H) 1.56 from Arbor Laboratories Press 1989) The procedures and reagents for dephosphorylation as described in section 1.61 are conventional. "Recovery" or "separation" of specific DNA fragments from restriction digestion is the Separation by electrophoresis on rilamide or agarose gel, mer of known molecular weight Confirmation of desired fragment by comparing mobility with car DNA fragment, gel site containing desired fragment And separating the gel from the DNA. This operation is general Is known to For example, Lawn et al., Nucleic / Acids / Res. , 9: 6103-6114 (1981) and Goeddel et al., Nuc. leic / Acids / Res. 8: 4057 (1980). "Southern analysis" or "Southern blotting" refers to known labeled oligonucleosides. DNA or DN identified by hybridization to tide or DNA fragments One of the methods for confirming the presence of a DNA sequence in a digestion product of A-containing composition restriction endonuclease is there. Southern analysis typically involves electrophoretic separation of DNA digests on an agarose gel. Separation, denaturation of DNA after electrophoretic separation, and 9.3 of Sambrook et al., Supra. Radiolabelled, biotinylated, or enzyme labeled probe as described in Sections 7-9.52. Nitrocellulose, nylon or other suitable membrane support for analysis Includes transcription of DNA into the body. "Northern analysis" or "Northern blotting" refers to, for example, oligonuc Such as leotide, DNA fragment, cDNA or fragment thereof, or RNA fragment, Methods used to identify RNA sequences that hybridize to known probes It is. This probe³³Radioisotope such as P, or biotinylated, Is labeled with an enzyme. RNA to be analyzed is usually agarose or polyacryl Electrophoretically separated on amide gels, nitrocellulose, nylon or other To a suitable membrane of the present invention, and transfer to a suitable membrane as described in Sambrook et al. Hybridize with the probe using standard techniques well known in the art. "Ligation" is the process of forming a phosphodiester bond between two nucleic acid fragments. For the ligation of the two fragments, the ends of both fragments must match each other. In some cases, both ends are directly adapted after endonuclease digestion. Only While first, staggered cuts commonly generated after endonuclease digestion It may also be necessary to convert the ends to blunt ends and adapt them for ligation. Both ends To smooth the DNA, the DNA is cleaved with DNA polymerase I in an appropriate buffer. Deoxyribonucleus with about 10 units of Nof fragment or T4 DNA polymerase Treat in the presence of 4 octide triphosphates at 15 ° C. for at least 15 minutes. This DNA Is then purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. phase Approximately equimolar amounts of DNA fragments to be ligated to each other are placed in the solution. A for solution TP, ligation buffer, and a ligase such as T4 DNA ligase was added to DNA 0.5 Include about 10 units per μg. If the DNA is ligated into a vector For example, first digest the vector with an appropriate restriction endonuclease to linearize it. (Linearize). The linearized fragment was then digested with bacterial alkaline phosphatase or Treatment with chick small intestine phosphatase prevents self-ligation at the ligation step. "Preparation" of DNA from cells separates plasmid DNA from cultures of host cells Means to do. Methods commonly used for DNA preparation are described in Sambr Large and small amounts of plasmid as described in ook et al., Chapters 1.25-1.33. It is a production method. After preparation of the DNA, see, eg, Sambrook et al. Can be purified by methods well known in the art such as those described in. “Oligonucleotide” is, for example, a European-specific product issued on May 4, 1988. Xu 266032 or Froehler, Nucleic Acids Res. , 14: 5399-5407 (1986). Using solid phase techniques such as via the reoside H-phosphonate intermediate, Such as phosphotriester, phosphite or phosphoramidite chemistry Short, single-chain or double-chain polydeoxynucleosides chemically synthesized by known methods It is a tide. Yet another method is the polymerase chain reaction and others described below. Automated primer method and oligonucleotide synthesis on a solid support. All of these methods are described in Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 28: 716-734 (1989). these The method is that the entire nucleic acid sequence of the gene is known or the nucleic acid complementary to the coding strand. Will be used if an array of is available. Otherwise, if the target amino acid sequence is public If known, possible using known and preferred coding residues for each amino acid residue Certain nucleic acid sequences can be inferred. The oligonucleotide is then polyacrylamide gel Refined with "Polymerase chain reaction" or "PCR" refers to nucleic acid, RNA and / or D Specific minor fragments of NA are disclosed in US Pat. No. 468, issued July 28, 1987. Operation or technique for amplification as described in 3195 is provided. Generally, the desired Sequence information from both ends of the region or more sequence information is These primers are necessary for designing the The sequences are identical or similar to the side chains. 5'-end of both primers Nucleotides can correspond to the ends of the material to be amplified. Specific using PCR RNA sequences, specific DNA sequences from total genomic DNA, and transcribed from total cellular RNA. Amplified cDNA, bacteriophage or plasmid sequences, etc. You. In general, such as Mullis, Cold / Spring / Harbor / S ymp. Quant. Biol. 51: 263 (1987); Erli ch edition, PCR technology (PCR / Technology), (Stockton) See the publisher, NY, 1989). The PCR used here is for amplification of a nucleic acid test sample. Nucleic acid polymerase reaction method for And the use of nucleic acid polymerases for amplification or for generating specific sections of nucleic acid. It is considered to be an example, but not the only example. "Stringent conditions" include (1) 0.015 M-NaCl / 0.00, for example. 15M-sodium citrate / 0.1% NaDodSO_Four(SDS) at 50 ° C Adopt low ionic strength and high temperature for cleaning as used, or ( 2) During hybridization, for example, containing 50% of 0.1% bovine serum albumin ( v / v) formamide / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 750 mM-NaCl containing 50 mM 50 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 Solution, 75 mM-using sodium citrate at 42 ° C, such as formamide It uses a modifier. Another example is 50% formamide, 5 × SSC ( 0.75M-NaCl, 0.075M-sodium citrate), 50 mM-phosphoric acid Sodium (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 x Denhardt's solution , Sonicated salmon sperm DNA (50 μg / mL), 0.1% SDS, and 10% Use of dextran sulphate at 42 ° C and in 0.2 x SSC and 0.1% SDS Use of a wash at 42 ° C. “Moderately stringent conditions” are described in Sambrook et al., Supra. And a washing solution that is less stringent than the above stringent conditions and Use of hybridization conditions (eg temperature, ionic strength, and SDS%) Include. An example of moderately stringent conditions is, for example, 20% formua. Mid, 5 × SSC (150 mM-NaCl, 15 mM-trisodium citrate) , 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10% Dext. 37 in a solution consisting of stran sulfate and 20 mg / mL cleaved denatured salmon sperm DNA Incubate overnight at 0 ° C, then filter to approximately 37-5 in 1xSSC. The conditions are such that washing is performed at 0 ° C. Those skilled in the art will appreciate factors such as probe length and the like. Recognize how to adjust the temperature, ionic strength, etc. needed for each child It is. "Antibodies" (Abs) and "immunoglobulins" (Igs) have the same structural characteristics It is a glycoprotein with. Antibodies show binding specificity for a particular antigen, but Roblin also includes antibodies and other antibody-like molecules that have no antigenic specificity. rear Polypeptides of different types are present in low concentrations, for example in the lymphatic system, and in myeloma. Is produced in high concentration. "Natural antibodies and immunoglobulins" are usually heterologous to about 150,000 daltons. A tetrameric glycoprotein composed of two identical light chains (L) and two heavy chains (H). Has been established. Each light chain is attached to the heavy chain by one covalent disulfide bond, The number of disulfide bonds varies between heavy chains of different immunoglobulin isotypes. You. Each heavy and light chain has multiple regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each weight The chain has a variable domain (V_H) Followed by a number of constant domains. each The light chain has a variable domain (V_L) And the constant domain at the other end; the constant domain of the light chain The main is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the variable domain of the light chain is the variable domain of the heavy chain. They are lined up at the inn. The specific interface between the light and heavy chain variable domains Is believed to form the (interface) (such as Clothia, J. Mol. Biol. 186: 651-663 [1985]; Nov. otny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 Volume: 4592-4596 [1985]). The term “variable” refers to a significant difference in the sequences of certain The fact that it is used for the binding and specificity of the antibody of the above for its specific antigen. Only However, this variability may not be evenly distributed throughout the variable domain of the antibody. Yes. It contains the complementarity determining regions (CDRs) in the variable domains of both the light and heavy chains. Or, it is concentrated in three segments called hypervariable regions. Within the variable domain The more highly conserved parts are called the framework regions (FR). Of natural heavy and light chains The variable domains each contain four FR regions, mainly in the β-sheet conformation. The three CDRs, optionally forming part of the β-sheet structure to form β- Form a loop that joins the sheet structures. The CDRs of each chain are closer to the FR region And contributes to the formation of the antigen-binding site of the antibody together with the CDR of the other chain (Kab At, etc., “sequences of immunologically important proteins (Sequences of Pr "Oteins of of Immunological Interest)", No. 5th edition, National Institute, of Health, Bethesda , MD [1991]). The constant domain directly binds the antibody to the antigen But not involved in, for example, antibody's involvement in antibody-dependent cellular cytotoxicity Various effector functions, such as Papain digestion of antibodies is termed "Fab" fragments, each with a single antigen binding site. It is called with a name that reflects two identical antigen-binding fragments and the ability to crystallize easily. It produces the remaining "Fc" fragment that is struck. Pepsin treatment has two antigen-binding sites F (ab ') that can still cross-link with the antigen₂Give a piece. "Fv" is the minimum antibody fragment that contains a complete antigen recognition and binding site. You. This region is a strong, non-covalent association of the variable domains of one heavy and one light chain. It is composed of dimers that are assembled by association. 3 CDRs of each variable domain Interact with each other to form V_H-V_LIt is this configuration that determines the surface of the dimer. It is. Ultimately, the six CDRs confer on the antibody the antigen binding specificity. However, the conclusion Has a lower affinity than the entire binding site, but a single variable domain (or antigen-specific Even half the Fv containing only 3 CDRs) has the ability to recognize and bind antigen. The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. contains. The Fab 'fragment contains the antibody hinge at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain. The addition of a small number of residues containing one or more cysteines from the region And is different from the Fab fragment. Fab'-SH is used herein to refer to the system of constant domains. It is a symbol showing Fab 'in which the in residue has a free thiol group. F (ab ')₂ The antibody fragments are initially a pair of Fab 'fragments with hinge cysteines between them. produced. Other chemical couplings of antibody fragments are also known. "Light chains" of antibodies (immunoglobulins) obtained from vertebrates of any species Based on the amino acid sequence of the constant domain of kappa (κ) and lambda (λ) It is classified as one of two distinct types called distinctions. Immunoglobulins are classified into several types depending on the amino acid sequence of the constant domain of the heavy chain. Wear. There are five main types of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and There are IgMs, some of which are further subclasses (isotypes): For example, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 and And IgA-2. Heavy chain constant domain corresponding to immunoglobulin type Are called α, δ, ε, γ and μ, respectively. Subclasses of each class of immunoglobulin The unit structure and three-dimensional structure are well known. The term "antibody" is used in its broadest sense to refer to a single monoclonal antibody (agonist and antagonist). (Including anti-antibodies) and polyepitopic specific antibody compositions. The term "monoclonal antibody" is used herein to mean a substantially homogeneous population of antibodies, ie Organize the population with the exception of naturally occurring mutations that may be contained in trace amounts The antibodies obtained from the same antibodies are shown. Advanced monoclonal antibodies Specific for and directs a single antigenic site. Furthermore, typically a variety Conventional (polycloner) containing various antibodies directed against determinants (epitope) of Monoclonal antibodies, in contrast to antibody products, target a single determinant on the antigen I do. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are hybridized by hybridoma culture. And is free of other immunoglobulins as contaminants. Monoclonal antibody here refers to the species of origin or class of immunoglobulin, or Or subclass classification, as well as antibody fragments (eg, Fab, F (ab '))₂, And Fv), within the range in which they exhibit the desired biological activity, Variable domains of anti-CHF antibodies with constant domains (eg, "humanized" antibodies) Splicing (including hypervariable domains), or light chains with heavy chains, or Is produced by fusion of one chain with chains from another species, or with a heterologous protein Hybrid and recombinant antibodies. [For example, Cabilly, USA Patent No. 4816567; Mage and Lamoyi, "Monoclonal Antibody Production Technology Surgery and application (Monoclonal, Antibody, Productio n ・ Techniques ・ and ・ Applications) ”, 79- 97 (Marcel Dekker, New York, 1987)]. Thus, the modifier "monoclonal" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. It is characteristic and should be construed as requiring a specific method for producing the antibody. Not something. For example, the monoclonal antibodies used in the present invention are Kohler and Milstein first in Nature, 256: 495 (1975). Also by the described hybridoma method or by the recombinant DNA method (said Cabyl can also be produced. The monoclonal antibodies herein include a portion of the heavy and / or light chains The corresponding distribution of antibodies from a species or belonging to a particular antibody class or subclass. Identical or homologous to the row, while the rest of the chain is from another species Is identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to another antibody class or subclass Antibodies, as well as fragments of such antibodies, which possess the desired biological activity. Tsumono (Cabilly et al., Supra; Morrison et al., Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 [1984]. ) Is a "chimeric" antibody (immunoglobulin). "Humanized" forms of non-human (eg, murine) antibodies are derived from non-human immunoglobulin A specific chimeric immunoglobulin, immunoglobulin chain or Is a fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fab ', F (ab'))₂, Other antibody Antigen-binding subsequences). For the most part, humanized antibodies are human immunoglobins. Phosphorus (recipient antibody), the homology determining region (CDR) of the recipient Residues with the desired specificity, affinity and performance, eg mouse, rat , Or a residue from a CDR of a non-human species (donor antibody) such as rabbit It is what In one example, the corresponding Fv framework residues of human immunoglobulin are Substitute with a non-human residue. Furthermore, humanized antibodies also direct the antibody of the recipient. It may include residues that are also absent from the entered CDR or framework sequences. These fixes This is done to adjust and optimize antibody performance. Generally, a humanized antibody is substantially Contains at least one, and typically all two variable domains, In this case, all or substantially all of the CDR regions are non-human immunoglobulin. Correspondingly, all or substantially all of the FR region is a human immunoglobulin sequence. C It is an array of sensors. Humanized antibodies are optimally immunoglobulin constant regions (Fc), Typified by human immunoglobulins. More detailed Matters, Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986). Year); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 ( 1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2: pp. 593-596 (1992). "Non-immunogenic in humans" means a pharmaceutically effective amount of the po in a pharmaceutically acceptable carrier. When the polypeptide is contacted with a suitable human tissue, it has a suitable latency (eg 8 14 days) to the second administration of the polypeptide It means that there is no evidence of hypersensitivity or resistance to it. "Neurologic disease" refers to the combination of peripheral neurons and neurons from the central nervous system. It shows a disease of neurons including the one. Examples of such diseases are eg peripheral nerves. Disorders (motor and sensory), amyotrophic axosclerosis (ALS), Alzheimer's disease, Neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease, seizures, Huntington's disease, epilepsy, All, and for example diabetic retinitis, retinal dystrophy, and malignancy in infancy Retinal degeneration due to osteopetrosis, ceroid-lipophyllosis, or cholestasis, or Or photodegeneration, trauma, axotomy, neurotoxicity-excitatory degeneration or ischemic neuronal degeneration. Includes ophthalmological diseases of the retina such as sex-induced retinal degeneration. “Peripheral neuropathy” refers to a disease that affects the peripheral nervous system, most often exercise or feeling. Appear as one or a combination of sensory movements or autonomic dysfunction. Peripheral nerve The widespread morphological changes manifested by the disorder are also uniquely derived from a wide range of causes. For example, peripheral neuropathy is genetically acquired, derived from a systemic disease, or caused by toxic drugs. Can be introduced. Examples include, but are not limited to, extremity sensorimotor dysfunction. Harm or autonomic disorders such as gastrointestinal motility or bladder atony Includes. Examples of neuropathy due to systemic disease include post-polio syndrome, Examples of conductive neuropathy include Charcot-Marie-Tooth disease, Refusum disease, and β-li-free. Poproteinemia, Tanger disease, Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Fabry disease, And Degerin-Sotta syndrome; and examples of neuropathy caused by poisons Includes those that result from treatment with chemotherapeutic agents such as ncristine. "Heart failure" means that the heart does not pump blood at the rate required by the tissues it is metabolizing. Shows abnormalities of cardiac function. Heart failure includes, for example, congestive heart failure, myocardial infarction, and frequent It encompasses a wide range of pathological conditions such as arrhythmias. "Treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Requires treatment Those who already have the disease as well as being prone to the disease, or It includes what should prevent the disease. The term "mammal" for purposes of treatment refers to all animals classified as mammals, including humans and Means domestic and farm animals, such as dogs, horses, cats, cows, etc., And includes zoo, sports and pet animals. Preferably, the Mammals are humans. As used herein, "ACE inhibitor" refers to angiotensin I to angiotensin. 2 shows angiotensin converting enzyme inhibitory agents that prevent conversion to II. ACE inhibition The drug reduces systemic vascular resistance and reduces circulatory congestion, so it is effective in congestive heart failure. Can be effective. ACE inhibitors include, but are not limited to Lil (quinapril), Artes (ramipril), Capoten (captopril), Ronthecin (benazepril), Monopril (fosinopril), Purinivir (li) Sinopril), bathotec (enalapril) and zestril (lisinopril) Includes. One example of an ACE inhibitor is sold under the trademark Capoten. common name This ACE inhibitor, which is called captopril in Chemically, is chemically 1-[(2S) -3 -Mercapto-2-methylpropionyl] -L-proline. II. Embodiment of the present invention 1. CHF polypeptide The preferred polypeptides of this invention are myocytes in myocyte hypertrophy and the CNTF assay. Substantially homogeneous CHF with biological properties that promote growth of ciliary neurons It is a polypeptide. More preferred CHF is hypertrophic, antiarrhythmic, muscle inotropic and And isolated mammalian proteins with neurological activity. The most suitable port of this invention Lipeptides have hypertrophic, antiarrhythmic, muscle inotropic, and neurological activity in mice And human CHF, including fragments thereof. If necessary, these mice And human CHF lacks glycosylation. Another preferred polypeptide of this invention is a biologically active CHF variant, At least 70%, preferably at least 75%, with the mouse CHF of FIG. More preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, Even more preferably at least 90%, most preferably 95% (ie 70-100%, 75% -100%, 80-100%, 85-100%, 9 respectively 0-100% and 95-100% sequence identity). Has a amino acid sequence. Alternatively, a suitable biologically active CHF variant is shown in FIG. At least 70%, preferably at least 75%, with human CHF, Preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, More preferably at least 90%, most preferably 95% (ie 7 each 0-100%, 75% -100%, 80-100%, 85-100%, 90-1 Amino acids showing amino acid sequence identity (00% and 95-100% sequence identity) Has an array. CHF cloned from mouse embryoid bodies has the following properties. (1) It has a molecular weight of about 21 to 23 kD as measured by reducing SDS-PAGE. (2) CNTF chicken ciliary neuron assay and myocyte hypertrophy and AN Shows positive activity in P-release hypertrophic assay. Further preferred CHF polypeptides are encoded by genomic DNA or cDNA The amino acid sequence of mouse CHF shown in FIG. 1 or human shown in FIG. It has a CHF amino acid sequence. Other suitable naturally occurring biologically active CHF polypeptides of this invention are: Prepro-CHF, pro-CHF, pre-CHF, mature CHF, and its gly Includes cosylated variants. Still other suitable polypeptides of the invention include CHF sequence variants and chimeras. Includes CHF. Usually, a preferred CHF sequence variant will be a biologically active CHF. A variant which is at least 70% and preferably less than human or mouse CHF. At least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably less. At least 85%, even more preferably at least 90%, most preferably 9 It has an amino acid sequence showing 5% amino acid sequence identity. Examples of suitable CHF variants Is a CHF variant in the C-terminal domain, which is a basic or dibasic amino acid One or more of the residues (eg, R or K) is a non-basic amino acid residue ( Eg substituted with hydrophilic, neutral, acidic, aromatic, gly, pro etc.) Of. One of the other exemplary preferred CHF sequence variants is a "domain chimera", which is N- Not all of the human CNTF residues whose terminal residues are aligned as shown in Figure 2. However, they are substituted with one or more. In this aspect, CHF The chimera has a human CNTF sequence at the CHF sequence at the position corresponding to the alignment shown in FIG. Individual residues or blocks of residues from are added or replaced. For example, A segment of CNTF that is not homologous to the corresponding segment of CHF or its More than this can be replaced. In this "CHF-CNTF domain chimera" Hypertrophic / antiarrhythmic / muscular inotropic / neurotrophic mixed biological activity Is intended. Other preferred polypeptides of this invention include CHF isolated from mouse embryoid bodies. Or at least 10, 15, 20, identical to the sequence of human CHF Sequential 25, 30, or 40 amino acid residues, preferably about 10 to 150 residues CHF fragments with sequences are included. Other suitable CHF fragments are the chemicals of purified CHF. Alternatively, those produced as a result of enzymatic hydrolysis or digestion are included. Another aspect of the present invention is a method for purifying a CHF molecule, which comprises a CHF component to be purified. The CHF source containing the offspring and the immobilized receptor or antibody polypeptide should be purified. CHF molecule selectively adsorbs to immobilized receptor or antibody polypeptide Contacting the cells, washing the immobilized carrier to remove non-adsorbed substances, and Dissolve the immobilized receptor or antibody polypeptide adsorbing the offspring in elution buffer. Including releasing. The source containing CHF can be an embryoid somatic cell suspension. Alternatively, the source containing CHF is a recombinant cell culture, in which case the culture CHF concentrations in either media or cell lysates are generally protoplast or other Higher than in natural sources. In this case, the immunoaffinity method described above Yes, but usually not necessary, and more conventional protein purification known in the art. The law can be adopted. Briefly, a suitable purification for providing substantially homogeneous CHF. The manufacturing method is: removing the granular debris by, for example, centrifugation or ultrafiltration; Concentrating the protein pool with a commercially available protein concentrating filtration device; and thereafter CHF from soluble proteins and polypeptides contaminated with An example procedure is as follows: Fractionation on immunoaffinity or ion exchange column; ethanol Settling; reverse phase HPLC; silica or cation exchange resins such as DEAE Chromatography on top; Chromatofocusing; SDS-PAGE; Mmonium precipitation; Toyopearl and MONO-Q or MONO-S Chromatography; gel filtration using eg Sephadex G-75; IgG CHF-binding column and protein A for removing contaminants such as Purification by chromatography on a Sepharose column. Natural The preferred purification method for both and recombinant CHF is Butyl / Toyopearl 1 column followed by a MON-Q column and a reverse phase C4 column as described below. To use. In another preferred embodiment, the present invention provides a separated, capable of binding CHF. Antibodies are provided. The preferred isolated anti-CHF antibody is monoclonal (K Ohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 [ 1975]; Campbell, "Experimental techniques in biochemistry and molecular biology. (Laboratory ・ Techniques ・ in ・ Biochemist ry · and · Molecular · Biology) ”, edited by Burdon et al., Volume 13, Elsevier, Science, Publishers, Amste Redham [1985]; and Huse et al., Science, 246: 12. 75-1281 [1989]). At least few suitable anti-CHF antibodies have been isolated Also about 10⁶It binds to CHF with an affinity of L / mole. More preferably, This antibody is at least about 10⁷Binds CHF with an affinity of L / mole . Most preferred Preferably, this antibody is raised against CHF which has one of the effector functions. The isolated antibody capable of binding to CHF is optionally conjugated to a second polypeptide. And the antibody or fusion thereof is immobilized CHF polypeptide. CHF may be used to separate and purify CHF from the sources described above for tide. this In a further preferred aspect of the invention aspect, the invention contemplates that the antibody contains CHF. Contact with a sample, preferably a serum sample, and whether binding has occurred A method for detecting CHF in vitro or in vivo, which comprises detecting You. The invention further comprises an isolated nucleic acid molecule encoding CHF or a fragment thereof. The nucleic acid molecule may or may not be labeled with a detectable structure, Complementary to a nucleic acid molecule having a sequence encoding CHF and CHF, or stringen Sequences that hybridize under moderate or moderately stringent conditions. A nucleic acid molecule having. Preferred CHF nucleic acids encode biologically active CHF RNA or DNA that interacts with the mouse or human CHF 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85% %, Even more preferably at least 90% and most preferably 95% sequence identity Have sex. More preferable isolated nucleic acid molecule is (a) in the coding region of mammalian CHF gene. Based DNA (eg, the nucleotide sequence provided in FIG. 1 or FIG. DNA consisting of the fragments of;) (b) At least moderately stringent conditions A DNA capable of hybridizing to the DNA of (a); For the DNA specified in (a) or (b) as a result of the degeneracy of the gene code DNA encoding a biologically active CHF selected from degenerate DNA; It is the A array. The new CHF described here has the DNA as shown in FIG. 1 or FIG. (Or a fragment thereof) and low to moderately stringent A group of ligands with suitable sequence identity that can hybridize under conditions It is intended to be a member. Therefore, another aspect of the present invention is DNA encoding a CHF polypeptide under moderately stringent conditions It includes hybridizing DNA. Preferably, this nucleic acid molecule is a cDNA encoding CHF, and This cDNA is operably linked to a control sequence recognized by the host transformed with the vector. It includes a replicable vector that is This aspect is The host cell transformed with the vector and the cDNA encoding CHF Expression in host cell cultures and recovery of CHF from host cell cultures The use of the cDNA for the production of CHF, including Made in this manner The CHF produced is preferably substantially homogeneous mouse or human CHF. The present invention further comprises administering to a mammal a therapeutically effective amount of CHF. Suitable methods of treating mammals with total, arrhythmia, inotropic, or neurological disorders Includes. If necessary, this CHF is, for example, capto in the case of congestive heart failure. Of ACE inhibitors such as prills, or of other types of heart failure or heart disease In some cases with other myocardial nutrition, antiarrhythmics, or myotropic agents, or neurological disorders In the case of, for example, IGF-I, CNTF, NGF, NT-3, BNDF, It is administered in combination with neurotrophic molecules such as NT-4, NT-5 and the like.2. Preparation of native sequence CHF and variants The following discussion is to culture cells transformed with a vector containing mostly CHF nucleic acid, It concerns the production of CHF by recovering this polypeptide from cell culture. Further provided in WO 91/06667 issued May 16, 1991. It is thus also overviewed that the CHF of this invention can be produced by homologous recombination. Summary If this is the case, then the method may be used for primary mammalian cells containing an endogenous CHF gene (eg, if If the desired CHF is human, a gene capable of amplifying human cells (for example, Dihydrofolate reductase [DHFR] or other below) and CHF DNA sequence at the locus of the coding region of the CHF gene to provide gene amplification Contains at least one flanking region homologous to at least 150 bp in length. Transforming the construct (i.e., the vector). This amplifiable The gene must be in a site that does not interfere with the expression of the CHF gene. This transformation In other words, the construct will homologously integrate into the genome of the primary cell to determine the amplifiable region. Is executed. The primary cells containing the construct are then transferred to the amplifiable gene or other present in the construct. Select by the marker. The presence of the marker gene allows the organization in the host genome. Check the built-in structure and existence. Since the cells are selected by the second host, more primary cells can be selected. It is not necessary to choose. If desired, the presence of homologous recombination can be obtained using PCR. The amplified DNA sequence was sequenced, or the DNA from the correct homologous When only cells that are present and contain such fragments are developed, P of appropriate length is used. It can be determined by measuring the CR fragment. Also, if desired, select At this point, the amplified cells are treated with an amplification agent suitable for the cells (if the amplification gene is DHFR, Multiplexing of target genes by applying stress (like totrexate) It may be amplified so that a copy is obtained. However, after the second transformation below It is preferred that no amplification step be performed. A portion of genomic DNA that is large enough to contain the entire amplifiable region after the selection step Are separated from the selected primary cells. A second mammalian expression host cell is then used to Of the genomic DNA portion, cloned, and cloned containing the amplifiable region. Select a chain. If not amplified in primary cells, the amplifiable region is then expanded Amplify by. Finally, it contains multiple copies of the amplifiable region containing CHF A second expression host cell is grown to express the gene and prepare the protein. A. Separation of DNA encoding CHF The DNA encoding CHF has CHF mRNA, which can be detected at a detectable concentration. It can be prepared from a cDNA library prepared from tissues believed to express. This mRNA is appropriately prepared from, for example, an embryoid body differentiated for 7 days. CHF remains The gene can be from a genomic library or the complete nucleotide or amino acid sequence. Are known to be obtained by in vitro oligonucleotide synthesis as described above. Can be. A probe designed to identify the gene of interest or the protein it encodes Search the library with. Suitable probes for cDNA expression libraries Is, for example: a monoclonal or polychrome that recognizes and specifically binds CHF. Ronal antibody; known or inferred CHF cDNA from the same or different species An oligonucleotide of about 20-80 bases in length encoding the upper part; and / Or a complementary or homologous cDNA encoding the same or a similar gene, or The fragment etc. are included. Suitable for searching genomic DNA libraries Lobes include, but are not limited to, oligonucleotides, cDNAs, or lobes. Or a fragment thereof encoding the same or a similar gene, and / or a homologous geno DNA or fragments thereof. CDNA from selected probe or Search of the genomic library is described in Chapters 10 to 12 of Sambrook et al. Such standard procedures may be used. One of the alternative methods for isolating the gene encoding CHF is the above Sambrook. using the PCR method as described in Chapter 14 of K. et al. This method is CHF Requires the use of oligonucleotide probes that hybridize to Orient The gonucleotide selection policy is described below. The preferred method of practicing this invention is in different tissues, preferably mammalian differentiated embryos. CDNA libraries from body and placenta, heart, and brain cell lineage tissues Using carefully selected oligonucleotide sequences to search for You. More preferably, human embryoid body, placenta, heart and brain cDNA libraries Probe with an oligonucleotide probe. The oligonucleotide sequence selected as a probe should be of sufficient length and It should be clear and should minimize false positives. The actual nucleotide Sequences are usually based on conserved or highly homologous nucleotide sequences. Oligonuku The leotide may be degenerate at one or more points. Of preferred codons If you are searching a library from a species that you do not know to use, use degenerate oligonucleotides. The use of cleotide can be of particular importance. This oligonucleotide hybridizes to the DNA in the library to be searched. It must be detectably labeled when formed. The preferred method of labeling is A well-known polynucleotide kinase³²Using P-labeled ATP Radiolabeling the oligonucleotide. However, Oligonuk Labeling leotide includes, but is not limited to, biotinylation or enzyme labeling. Other methods involving knowledge may also be used. Of particular interest are CHF nucleic acids that encode full length polypeptides. Suitable In some embodiments, the nucleic acid sequence comprises the native CHF signal sequence. all Nucleic acids with protein coding sequences are selected from cDNA or genomic libraries, Initially a search was performed using the deduced amino acid sequence described herein, and the Ordinary primer extension as described in Sambrook et al., Chapter 7.79. Precursor was detected using the long method and the intermediate mRNA that was not reverse transcribed into cDNA Obtained by processing the body. B. Amino acid sequence variants of natural CHF Amino acid sequence variants of naturally occurring CHF have appropriate nucleotide changes that result in D of naturally occurring CHF. Prepared by introduction into NA or in vitro synthesis of the desired CHF polypeptide Is done. Such variants include, for example, mouse CHF in FIG. 1 and human CHF. Deletion, insertion or substitution from residues within the amino acid sequence shown in Figure 5 for CHF Includes. Any combination of deletions, insertions and substitutions has the desired properties Do to reach the structure. Within the scope of this invention is a rat homologue of CHF. CHF variant or polypeptide sequences are excluded. Amino acid changes Alter post-translational processes of natural CHF, such as altering the number of glycosylation sites You can. The design of amino acid sequence variants of native CHF involves mutation site and mutation The nature depends on the nature of the CHF to be modified. For example CHF antagonists or hyperagonists First candidates for CHF and growth hormone (GH) / cytokine receptor familie Members of Lee, especially CNTF and other Riga that bind leukemia inhibitory factor (LIF) Selection by placement at the same or highly conserved sites in the band. The sites for this mutation can be modified individually or as a series. for example (1) Select conservative amino acids first, and then further select depending on the results achieved. Substitution, (2) removal of the target residue, (3) identical or different Inserting a class of residues next to an existing site, or a combination of 1-3. Some residues of the native CHF polypeptide that are suitable positions for mutagenesis. Or a useful method to identify regions is "alanine scanning mutagenesis". Called, Cunningham and Wells, Science, 244: 10 81 to 1085 (1989). Where one residue or target residue Confirm the group (eg, arg, asp, his, lys and glu, Charged residues), neutral or negatively charged amino acids (most preferably alanine or Polyalanine) to replace amino acids with the aqueous environment inside or outside the cell Influence the interaction. The domains that showed functional sensitivity to the substitution are By introducing further or another mutation at or towards that substitution site To improve. Therefore, the site for introducing the amino acid sequence mutation should be determined in advance. On the other hand, it is not necessary to preliminarily determine the nature of mutation. For example, a predetermined part Alanine scans or random abruptions to optimize the mode of mutation in Mutagenesis is performed at the target codon or target region, and the resulting CHF mutant is expected to be active Search for the optimal combination of. The main fundamental changes in the construction of amino acid sequence variants are: the position of the mutation site and There are two types of mutations. There are variants from the sequence of FIG. 1 or FIG. These are naturally occurring alleles (which do not require manipulation of native CHF DNA ) Or to reach this non-naturally occurring allele or variant It is a planned mutant produced by mutating A. In general, The location and nature of the mutation chosen will depend on the nature of the CHF to be modified. Amino acid sequence deletions generally range from about 1 to 30 residues, more preferably about 1 10 residues, which are usually adjacent to each other. Adjacent deletions are usually even residues , But single or odd deletions are also within this range. CHF activity To modify the sequence of CHF and the sequence identity to the human CHF amino acid sequence Other ligans that bind to the most shared GH / cytokine receptor family It can be introduced into a region having low homology with the nucleotide sequence. GH / cytokine receptor family CH in a region of substantial homology with one of the receptor binding sites of other ligands that bind to It seems that the deletion from F may more significantly modify the biological activity of CHF. Seem. The number of sequential deletions affects the affected domain, eg beta-pleated. Choosing to preserve CHF tertiary structure, such as the alpha or alpha helix. Amino acid sequence insertions include polypep tides containing 1 to 100 residues or more in length. Amino- and / or carboxyl-terminal fusions spanning a range of tides, and Includes sequence internal insertions of single or multiple amino acid residues. Array internal insertion (ie Insertions within the mature CHF sequence) are generally about 1 to 10 residues, more preferably 1 Etc., most preferably 1 to 3 residues. Insertions are preferably at even residues You do this, but this is not required. An example of terminal insertion is N-terminal methionyl Mature CHF with residues, an artificial product of direct production of mature CHF in recombinant cell culture, And a heterologous N-terminal signal to promote secretion of mature CHF from recombinant host Including fusion of the sequence to the N-terminus of the mature CHF molecule. Such a signal sequence Is generally obtained from the intended host cell type and is therefore homologous to it. Appropriate Sequences include STII or lpp for E. coli, alpha factor for yeast, and And mammalian cells include viral signals such as herpes gD. Other insertional variants of the natural CHF molecule include, for example, β-lactamase. An immunogenic polypeptide such as a bacterial polypeptide or an enzyme encoded by the Escherichia coli trp locus. A native or yeast protein to the N- or C-terminus of native CHF, and 19 For example, as described in WO 89/02922 issued on April 6, 1989, for example, immunoglobin. Brine constant region (or other immunoglobulin region), albumin, or feline Includes C-terminal fusions with long half-life proteins such as littin. The third group of variants are amino acid substitution variants. This variant is a natural CHF molecule At least one amino acid residue removed and a different residue inserted in its place It is. The site of greatest interest for substitutional mutagenesis is the activity of native CHF Amino acids found in sites known as sites and known homologues have bulky side chains Substantially different in terms of size, charge, or hydrophilicity, but within various animal CHF species Site with a high degree of sequence identity or selected GH / site It is found in known ligands that bind to the Cain receptor family and novel CHF. Mino acids differ substantially in bulkiness, charge, or hydrophilicity, but with different dynamics. At a selected site in a product ligand homologue (eg, between all animal CNTF molecules) It has a high degree of sequence identity. This analysis is based on cardiac hypertrophy, antiarrhythmia, myodynamics. And the residues involved in the differentiation of neurotrophic factor activity Variants in will affect activity. Other sites of interest are found at specific residues in CHF from various species. Binds CHF and other GH / cytokine receptor family molecules in animal species Identical among ligands, achieving common biological activity for these enzymes The degree of this consensus suggests the importance of doing so. These sites, especially at least Those within the sequence of three similarly conserved sites are in a relatively conservative manner. Will be replaced. Such conservative substitutions are listed in Table 1 under the heading Suitable substitutions. Write down. If such substitution results in a change in biological activity, then further examples in Table 1 Assigned to an explicit substitution, or described below in relation to the class of amino acids. Search for products by introducing such substantial changes. Substantial modification in the function or immunological identity of native CHF is due to (a) substitution The structure of the polypeptide backbone within a region, such as a sheet or helical conformation, (B) the charge or hydrophilicity of the molecule at the target site, or (c) the bulkiness of the side chain This is achieved by choosing substitutions that differ significantly in their effect on maintenance. Naturally occurring residues are divided into several groups based on the properties common to their side chains: (1) Hydrophilicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile, (2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr, (3) Acidic: asp, glu, (4) Basicity: asn, gln, his, lys, arg, (5) Residues affecting chain orientation: gly, pro, and (6) Fragrance: trp, tyr, phe. Non-conservative substitutions require the exchange of one member of these classes for another. this Such substituted residues also occur at conservative substitution sites or, more preferably, at residual (non-conserved) sites. Can be introduced. In one aspect of the invention, the protease cleavage site present in the molecule is inactivated. Is preferred. These sites are responsible for observing the encoded amino acid sequence. Therefore, in the case of trypsin, for example, an arginyl or lysinyl residue Convert to. Once the protease cleavage site has been determined, the target residue can be To basic residues such as glutamine or hydrophilic residues such as serine. By substitution; or by deleting that residue; or the rest By inserting a prolyl residue immediately after the group; these are paired for proteolytic cleavage. And deactivate. In another embodiment, any methionyl other than the methionyl residue of the initiation signal sequence. Residues or about 3 residues from their methionyl residues on the N- or C-terminal side Substitution or removal of any residue for another (preferably according to Table 1) I do. Alternatively, insert about 1-3 residues adjacent to that site. Any cysteine residue that is not involved in maintaining the native CHF conformation is generally Replaces serine to improve the oxidative stability of the molecule and also to prevent abnormal cross-linking. To prevent. Nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of naturally occurring CHF can be variously known in the art. Manufactured by various methods. These methods include, but are not limited to, Separation from natural sources (in the case of naturally occurring amino acid sequence variants), or oligonucleotides Otide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR mutagenesis, and previously Incorporating cassette mutagenesis of mutant or non-mutant versions of native CHF prepared in I do. Oligonucleotide-mediated mutagenesis involves the substitution, deletion and deletion of native CHF DNA. It is a suitable method for preparing insertion mutants. This technology is based on Adelman et al. A, 2, 183 (1983), and are well known in the art. Abbreviation As stated, a plasmid or a vector containing the unchanged or native DNA sequence of CHF. An oligonucleic acid encoding a desired mutation in a DNA template that is a single-chain form of lyophage Alter native CHF DNA by hybridizing cleotide . After hybridization, an oligonucleotide probe was prepared using DNA polymerase. A second complement of the template that inserts the imer and encodes the selected change in the native CHF DNA. Synthesize the entire chain. Generally, oligonucleotides of at least 25 nucleotides in length are used. Optimal oligonucleotides are templated on either side of the nucleotide encoding the mutation. It has 12 to 15 nucleotides that are completely complementary. This is a single oligonucleotide Ensures proper hybridization to the strand DNA template molecule. This oligonu Cleotide is described in Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978), using techniques known in the art. And easily synthesized. This DNA template is a bacteriophage M13 vector (commercially available M 13mp18 and M13mp19 are suitable), or Viera, etc., Meth. Enzymol. , 153: 3 (1987). It can be prepared by a vector derived from a vector containing an origin of replication. Therefore, insert the DNA to be mutated into these vectors to create a single-stranded template. You. A method for preparing a single-chain template is described in Sambrook et al., Chapters 4.21 to 4.41. There is. Alternatively, the single-stranded DNA template is labeled with double-stranded plasmid (or other) DNA. It can be made by denaturing using ancillary techniques. Altering the natural DNA sequence (eg, to create amino acid sequence variants) includes The oligonucleotide is hybridized to the single-stranded template under appropriate conditions. next, Normally, DNA polymerase, which is Klenov fragment of DNA polymerase I, is added to The complementary strand of the template is synthesized using the lygonucleotide as a primer for synthesis. Thus, one of the DNA strands encodes a mutant form of native CHF and the other strand (originally Heteroduplex formed so as to encode the CHF sequence without any alteration. Form a helical molecule. This heteroduplex molecule is then commonly used in, for example, E. coli. Transform into a suitable prokaryotic host cell such as JM101. Cells grow After that, place them on the agarose plate,³²Oligonucleotide labeled with P Search using Doprimer to detect bacterial colonies containing mutated DNA I do. The mutated region is taken and generally is typically employed for transformation of suitable hosts. The protein is produced by inserting it into an appropriate vector, which is an expression vector of different types. The method just described is a homoduplex in which both strands of the plasmid contain mutations. It can also be modified so that helical molecules are formed. The modification is as follows: The single stranded oligonucleotide is annealed to a single stranded template as described above. Deoxy Three ribonucleotides, namely deoxyriboadenosine (dATP) and deoxy. Mixing siriboguanosine (dGTP) and deoxyribothymidine (dTTP) The modified thiodeoxyribocytosine (Amers) called dCTP- (aS) (available from ham). This mixture is template-oligonucleotide Add to complex. Addition of DNA polymerase to this mixture caused mutations A DNA strand identical to the template is prepared except for the bases. In addition to this, The new chain contains dCTP- (aS) instead of dCTP, and is a restriction endonuclease. Protect from digestion. After nicking the double-stranded heterodouble-helical template strand with an appropriate restriction enzyme, Digest the strands with ExoIII nuclease or other suitable nuclease and suddenly The region containing the site to be mutagenized can be pasted. This reaction is then stopped and partially Leave a molecule that is a single chain at. Next, DNA polymerase is deoxyribonucleotide Using all four triphosphates in the presence of ATP and DNA ligase Form a complete double stranded DNA homoduplex. With this homo-double helix molecule A suitable host cell such as E. coli JM101 is transformed. Encoded in natural CHF DNA with one or more amino acids to replace Mutants are created in one of several ways. If the amino acid is in the polypeptide chain If they are in close proximity to each other, they code for all desired amino acid substitutions. One lygonucleotide can be used to mutate at the same time. However, if Amino acids are located some distance from each other (about 10 amino acids or more apart If so, create a single oligonucleotide that encodes all desired changes. Is more difficult to do. Instead, one of the other two methods can be adopted. The first method creates another oligonucleotide for the amino acid to be replaced. You. If these oligonucleotides are then simultaneously annealed to the single-stranded template DNA, The second strand synthesized from the template encodes all desired amino acid substitutions. Another method is to perform two or more bumps to produce the desired mutant. Including mutagenesis. The first round describes a single mutant: wild. -Type DNA used as a template to encode the first desired amino acid substitution Tide is annealed to this template to create a heteroduplex helix DNA molecule. suddenly In the second mutagenesis, the mutant DNA produced in the first mutagenesis was used as a template. Use as Thus, this template already contains one or more mutations I do. Next, oligonucleotides encoding additional desired amino acid substitutions are Annealed to template and encodes both the resulting first and second rounds of mutagenesis. Obtain a strand of DNA. The obtained DNA was used as a template in the third mutagenesis, It can be used repeatedly. PCR mutagenesis is also suitable for making amino acid variants of native CHF. Although the discussion below is on DNA, it is understood that this technique can also be applied to RNA. It is. PCR technology generally exhibits the following operations (Erich, R. Higuuc, supra): hi, pp. 61-70): when using trace amounts of template DNA in PCR Is prepared using a primer whose sequence is slightly different from the corresponding region of the template DNA. The type differs from the template in that the primer has a different sequence only at a position different from the template. It produces a relatively large amount of a specific DNA fragment. Of mutation to plasmid DNA For the introduction, one of the primers should be Is designed to contain the other primer sequences; Must be identical to the extension, but this sequence is It can also be placed in place. However, finally bound by the primer Of the second primer so that the entire amplified region of the amplified DNA can be easily sequenced. It is desirable to place the columns within 200 nucleotides of the first. The above PCR amplification using a primer pair such as Positions and template copies are somewhat error-prone, so possibly at other positions, Gives a population of different DNA fragments. If the ratio of template to product material is extremely low, the majority of product DNA fragments will Contains the desired mutation. This product is used to Regions that serve as templates for PCR using standard DNA techniques. You. Mutations at distant positions use a second mutation primer or 2nd PCR with the mutagenesis primer By simultaneously binding three (or more) partial ligations to Introduce. In a particular example of PCR mutagenesis, template plasmid DNA (1 μg) was added. A restriction endonuclease with a unique recognition site in the plasmid DNA outside the region to be amplified Linearize by digesting with Rase. 100ng of this substance Addition to PCR mix containing PCR buffer containing 4 oxynucleotide triphosphates GeneAmp ™ Kit (Perkin-Elmer Cetus) , Norwalk, CT and Emaryville, CA) The final volume was 50 μL in addition to 25 pmol of the nucleotide primer. Reaction mixture The mixture was overlaid with 35 μL of mineral oil. The reaction mixture was denatured at 100 ° C for 5 minutes and iced. Place it on the surface for a while, then the Thermus aquaticus (Taq) DNA poly Melase (5 units / mL, Perkin-E1mer Cetus) was added to the oil layer. Added below. Then the reaction mixture was set up as follows with a DNA thermal cycler (Purchased from Perkin-Elmer Cetus): 55 ° C for 2 minutes, 72 ℃ 30 seconds, Then the following 19 cycles: 94 ℃ 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. At the end of the program, remove the reaction vials from the thermal cycler and remove the aqueous layer. Transfer to a new vial and extract with phenol / chloroform (50:50 volume), Ethanol precipitate and recover DNA by standard procedures. Then, this substance Perform appropriate processing for insertion into the vector. Another method for preparing mutants is cassette mutagenesis in Wells Et al., Gene, 34, 315 (1985). Departure The substance is a plasmid (or other vector), the natural C to be mutated Contains HF DNA. Identify codons in natural CHF DNA to be mutated . There is a unique restriction endonuclease site at each end of the identified mutation site. Must be present. If no such restriction site exists, the oligo Using the reotide-mediated mutagenesis method, they were cloned into the appropriate CHF DNA Can be introduced in position. After introducing the restriction sites into the plasmid, Cut at these sites and linearize. Encodes the sequence of DNA between the restriction sites But using standard procedures with double-stranded oligonucleotides containing the desired mutations And synthesize. The two strands were synthesized separately and then hybridized using standard techniques. Soy. This double-stranded oligonucleotide is called a cassette. This cassette Fits into both ends of the linearized plasmid so that it can be directly ligated into the plasmid. Designed to have matching 3'and 5'ends. This plasmid is here However, it contains mutated CHF DNA sequences from CHF. C. Insertion of nucleic acids into replicable vectors Can replicate CHF-encoding nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) It is inserted into a vector for further cloning (amplification of DNA) or expression. Many A number of vectors are available, selection of the appropriate vector is 1) amplification or DNA Whether to use for expression, 2) the size of the nucleic acid to be inserted into the vector, and 3) Dependent on the host cell to be transformed with the vector. Each vector is its machine Activity (amplification of DNA or expression of DNA) and a compatible host cell. Contains ingredients. This vector component generally includes, but is not limited to Contains one or more: signal sequence, origin of replication, marker gene 1 One or more, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences. (I) Signal sequence component The CHF of this invention can be produced directly as well as heterologous polypeptides, Preferably, a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide is Also produced as a fusion with a signal sequence or other polypeptide Can be made. Generally, the signal sequence may be a component of the vector, but the vector It can also be part of the CHF DNA inserted in The selected heterologous signal sequence is Recognized and processed by the host cell (ie, by the signal peptidase Be cut off). Recognize and process native CHF signal sequences For prokaryotic host cells, the signal sequence is a prokaryotic signal sequence, eg For example, alkaline phosphatase, penicillinase, lpp, or thermostable entero. Replaced by a member selected from the group consisting of toxin II leaders . For yeast secretion, the natural signal sequence may be, for example, the yeast invertase enzyme. , Yeast alpha factor leader (Saccharomyces and Kleiberomyces α -Includes a factor reader; the latter is US Patent No. 50101 issued April 23, 1991. 82), yeast acid phosphatase leader, mouse salivary gland ami Lase leader, carboxypeptidase leader, yeast BAR1 leader, H umicola lanuginosa lipase leader, C.I. albican s Glucoamylase leader (European Patent No. 362179, issued April 4, 1990) ), Or the CIGNA described in WO 90/13646, published November 15, 1990. Can be le. In mammalian cell expression, the natural human signal sequence (ie The CHF pre-sequence that normally directs the secretion of natural CHF from human cells in the body Satisfactory, for example signal sequences from other species CHF, other G Sequences from ligands that bind to members of the H / cytokine receptor family, And signal sequences from secreted polypeptides of the same or related species, and Others such as viral secretory leaders such as the herpes simplex virus gD signal Mammalian signal sequences may also be suitable. The DNA for such precursor region encodes mature CHF in open reading frame. Ligated to the DNA. (Ii) Replication start point component The expression and cloning vectors are both selected from one or more selected host cells. In the above, the vector contains a nucleic acid sequence enabling replication. Generally kroni In the vector, this sequence is a vector that is independent of the host chromosomal DNA. Production, but includes origin of replication and autonomously replicating sequences. Such an array Are well known for various bacteria, yeasts and viruses. Plasmid pBR The origin of replication from 322 is suitable for most Gram-negative bacteria and The start of the Smid is suitable for yeast and also the start of various viruses (SV 40, polyoma, adenovirus, VSV, or BPV) in mammalian cells Useful for cloning better. Generally, the origin of replication component is a mammalian expression vector. Is not necessary for the actor (the starting point of SV40 can typically be used, for this reason Is only due to containing an early promoter). Most expression vectors are "shuttle" vectors, that is, they are at least It can replicate within a group of organisms, but can also be transferred into another organism for expression. For example When cloning a certain vector in E. coli, the same vector For expression, despite being unable to replicate independently of the cell's chromosome It can be transferred into yeast or mammalian cells. DNA can also be amplified by inserting it into the host genome. This is, for example, Introduce into the vector a DNA sequence complementary to the sequence found in the genomic DNA of C. This is easily achieved by using Bacillus as the host. This Gene transfer of Bacillus strains by H. Induces DNA insertion. However, for the recovery of genomic DNA encoding CHF Exogenously replicates because it requires restriction enzyme digestion to cleave CHF DNA. It is more complex than that of the vector. (Iii) Selection gene component Expression and cloning vectors contain a selection gene, also termed a selectable marker. Should be. This gene survives transformed host cells grown in selective culture media. Alternatively, it encodes a protein required for growth. Traits with a vector containing the selection gene Untransformed host cells do not survive in this culture medium. Typical selective inheritance The offspring are (a) for example, ampicillin, neomycin, methotrexate or te. Provides resistance to antibiotics and other toxic substances such as tracycline, (b) Deficient auxotrophy, or (c) D-ara against, for example, Bacillus. Limiting nutrients that cannot be obtained from complex media such as the gene encoding ninracemase Supply, code for proteins. One example of a selection mode uses agents that arrest the growth of host cells. These cells Successful transformation with a heterologous gene produces a protein that confers drug resistance. Survive under selected circumstances. An example of such a primary choice is the drug neomycin (So Other et al., J. Am. Molec. Appl. Genet. Volume 1: 327 pages [1982]), mycophenolic acid (Mulligan et al., Science) , 209: 1422 [1980]) or hygromycin (Sugd). en, Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 [1985 Year]). These three cases adopted bacterial genes under eukaryotic control and Drugs, G418 or neomycin (geneticin), xgpt (mycopheno, respectively) Acid) or hygromycin. Another example of a suitable selectable marker for mammalian cells is, for example, DHFR or Or cells capable of ingesting CHF nucleic acid such as thymidine kinase can be identified. To make it work. By transforming mammalian cell transformants by ingesting markers Only the transformants are placed under selective pressure, which is uniquely adapted to survival. Selective pressure is the selective agent in the medium Of the selection gene and the CHF-encoding DNA It is provided by culturing the transformant under conditions that lead to both amplifications. Amplification is a sequential requirement of recombinant cells for genes that are required for the production of essential proteins for growth. It is the process of repeating in series in the chromosomes of the generation. Amplified DNA The amount of CHF synthesized from them increases. Another example of gene amplification is metallothionein-I. And -II, preferably the primate metallothionein gene, adenosine deami Nase, ornithine decarboxylase and the like. For example, for cells transformed with the DHFR selection gene, first, all transformants were DH In a culture medium containing methotrexate (Mtx), a competitive antagonist of FR Confirm by culturing. A suitable host cell is Urlau when employing wild-type DHFR. b and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 77: DHFR activity prepared and cultured as described on page 4216 (1980). It is a sex-deficient Chinese hamster ovary (CHO) cell line. Next concentration And contact the transformed cells with methotrexate. With this, DHFR remains Synthesis of multiple copies of the gene and simultaneous DNA-like expression encoding CHF This leads to multiple copies of DNA of other species, including vectors. This amplification technique is, for example, A For otherwise suitable hosts such as TCC / CCL61 / CHO-K1 For example, if a mutant DHFR gene that is highly resistant to Mtx is adopted (European Patent No. 117060) Can also be used in the presence of endogenous DHFR. Alternatively, CHF, wild-type DHFR protein, and, for example, aminoglycosyl Another selectable marker such as de-3-phosphotransferase (APH) Host cells transformed or co-transformed with a DNA sequence encoding DHFR-comprising wild-type host) can be, for example, kanamycin, neomycin, or Contains selection agents for selectable markers such as aminoglycoside antibiotics such as G418 It can be selected by growing cells in a culture medium. See U.S. Pat. No. 4,965,199. A selection gene suitable for use in yeast is present in the yeast plasmid YRp7. Trpl gene (see Stinchcomb et al., Nature, 282). Volume: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141. [1979]; or Tschemper et al., Gene, 10: 157. [1980]). The trp1 gene is, for example, ATCC44076 or PEP. 4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]) A selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in putophan. Offer. The presence of the trp1 lesion in the yeast host cell genome is deficient in tryptophan. It provides an effective environment for detecting transformation by growth in the presence. Similarly Le The u2-deficient yeast strain (ATCC 20622 or 38626) contains the Leu2 gene. It is supplemented with a known plasmid. In addition to this, the vector derived from the 1.6 μm circular plasmid pKD1 It can be used for transformation of Kleiberomyces yeast. Cur, such as Bianchi r. Genet. 12: 185 (1987). Recently, bovine recombinant Kimoshi The expression system for mass production of K. lactis was reported. Van den ・ Berg, Bio / Technology, 8: 135 (1990). Ku Safety for secretion of mature recombinant human serum albumin by Liberomyces industrial strains Certain multicopy expression vectors have also been disclosed. Bio / Tec such as Fleer hology, 9: 968-975 (1991). (Iv) Promoter component Expression and cloning vectors are usually recognized by the host organism and contain CHF nucleic acid. Contains a promoter operably linked to. The promoter is a structural gene Located upstream (5 ') from the calling codon (generally within about 100 to 1000 bp) Untranslated sequence, operably linked, eg, CHF nucleic acid sequence Controls transcription and translation of specific nucleic acid sequences. Such promoters are typically There are two types of inducible and constitutive. Inducible promoters regulate it Increasing the level of transcription from DNA can be enhanced by certain culture conditions such as the presence of nutrients or It is a promoter that starts in response to absence or temperature change. Currently various Many promoters that are recognized by various potential host cells are well known. These promoters are derived from source DNA by digestion with restriction enzymes. CHF is encoded by inserting the separated promoter sequence into the vector. Operably linked to the DNA to be read. Native CHF promoter sequence and heterologous Both of the many promoters direct the amplification and / or expression of CHF DNA Can be used. However, it is generally recombinant as compared to the native CHF promoter. Heterologous promotion because it gives greater transcription and higher yield of CHF produced in Is preferred. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include β-lactamase and lactose. Promoter system (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978] Year]; and Goeddel et al., Nature, 281: 544 [197]. 9 years]), alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057. [1980] and European Patent 367776) and the tac promoter Una hybrid promoter (deBoer et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). I However, other known bacterial promoters are also suitable. Those nucleotide sequences Has been published, using linkers or adapters to supply the necessary restriction sites, Skilled researchers operably linking them to the DNA encoding CHF (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 [ 1980]). The promoter for use in bacterial systems also encodes CHF D It contains a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to NA. Promoters for eukaryotes are known. Almost all eukaryotic genes AT-rich region located approximately 25 to 30 bases upstream from the transcription initiation site have. Another found 70 to 80 bases upstream from the transcription start point of many genes One sequence is the CXCAAT region, where X is any nucleotide. Possible. Most eukaryotic genes have an AATAAA sequence at the 3'end, This could be a signal for the addition of a poly A tail at the 3'end of the coding sequence. this All of these sequences are properly inserted into the eukaryotic expression vector. An example of a suitable promoter sequence for use in a yeast host is 3-phosphoglyce Promoters for rate kinases (such as Hitzeman, J. Biol. Che m. 255: 2073 [1980]) or others, such as Enola. , Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyrogrape Acid decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomer Enzyme, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triose Sulfate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucoquiner Glycolytic enzymes (such as Hess, J. Adv. Enzyme Reg., 7 Volume: 149 [1968]; and Holland, Biochemistr. y, 17: 4900 [1978]). Is an inducible promoter with additional benefits for transcription controlled by growth conditions Other yeast promoters include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid Phosphatase, nitrogen metabolism-related degrading enzyme, metallothionein, glyceraldehyde Controls the use of hydr-3-phosphate dehydrogenase and maltose and galactose This is the enzyme promoter region. A vector suitable for use in yeast expression and Promoters are further described in Hitzman et al., EP 73657. Advantageously, yeast enhancers also are used with yeast promoters. CHF transcription from a mammalian host cell vector is compatible with host cell line compatible promoters. As long as it is a cultivator, for example, polyoma virus, fowlpox virus Patent No. 2211504 issued on May 5, adenovirus (adenovirus 2 , Bovine papilloma virus, avian monkey comb virus, cytomegalo Virus, retrovirus, hepatitis B virus, and most preferably salui From the genome of viruses such as Rus40 (SV40), heterologous mammalian promoters, For example, from the actin promoter or immunoglobulin promoter, Promoters from shock promoters and normally associated with CHF sequences Is controlled by the obtained promoter. SV40 virus early and And the late promoter are readily obtained as a restriction fragment of SV40, which includes SV4 0 virus origin of replication is also included. Fiers et al., Nature, 273: 11 Page 3 (1978); Mulligan and Berg, Science, 209. : 1422-1427 (1980); Pavlacis et al., Proc. N atl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 (1981). Year). Human cytomegalovirus immediate early promoter is HindIIIE restricted It can be easily obtained as a fragment. Greenaway, etc., Gene, 18: 3. 55-360 (1980). Using bovine papillomavirus as a vector Expression DNA systems in mammalian hosts for use are disclosed in US Pat. No. 4,419,446. I have. A modification of this system is described in US Pat. No. 4,601,978. In monkey cells For expression of cDNA encoding immune interferon, see Gray et al., N. ature, 295: 503-508 (1982); herpes simplex virus. From mouse cells under the control of thymidine kinase promoter For β-interferon cDNA expression, see Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982); in mouse and rabbit cell culture. On the expression of human interferon-β1 gene in rg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 79: 5166-5 170 (1982); and the long end of Rous sarcoma virus as a promoter. CV-1 monkey kidney cells using terminal repeats, chicken embryo fibroblasts, China Bacterial C in hamster ovary cells, giller cells, and mouse NIH-3T3 cells For expression of AT sequences, see Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 67777-6781 (1982). (V) Enhancer element component Transcription of the CHF-encoding DNA of this invention by higher eukaryotes is often It is increased by inserting an enhancer into the vector. Enhancer transcription Of a DNA sequence of about 10 to 300 bp that normally acts on a promoter to increase It is a functional element. Enhancers are relatively orientation and position independent , 5'of the transcription unit (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981]) and 3 '(Lusky. Do, Mol. Cell Bio. Volume 3: 1108 [1983]), Into In Ron (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]) , And inside the coding sequence itself (Osborne et al., Mol. Cell B). io. 4: 1293 [1984]). In mammalian genes Numerous enhancer sequences are now known (globin, elastase, Bumin, α-fetoprotein and insulin). However, usually eukaryotic The enhancer from the product cell virus is used. In this example, the replication start point is on the late side S. V40 enhancer (bp 100-270), cytomegalovirus early promoter Enhancer, late replication origin polyoma enhancer and adenovirus Includes the Ils enhancer. Enhancer for activation of eukaryotic promoters Regarding elements, Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1 See also 982). The enhancer is a vector 5'or 3'of the CHF coding sequence. It may be spliced at the 'position, but is preferably located 5'from the promoter. You. (Vi) transcription termination component Eukaryotic host cells (yeast, mold, insect, plant, animal, human, other multicellular organisms The expression vector used in the nucleated cells) is used to terminate transcription and stabilize mRNA. It also includes the necessary sequences. Such sequences are usually found in eukaryotic or viral DNAs. Alternatively, it is available from the 5'and sometimes 3'of the untranslated region of the cDNA. These areas are Transcribed as a polyadenylated fragment within the untranslated portion of the mRNA encoding CHF. Included nucleotide segments. (Vii) Vector construction and analysis Standard ligation for the construction of suitable vectors containing one or more of the above components Adopt technology. To create the required plasmid, separate plasmids or Cleaves DNA fragments, tailoring them, and religating them to the desired form. Use the ligation mixture for analysis to confirm the correct sequence in the constructed plasmid. And transforming E. coli K12 strain 294 (ATCC31446). Select successful transformants by resistance to ampicillin or tetracycline You. Prepare plasmids from transformants and digest by restriction endonuclease digestion. Nucleic Acid, including analysis and / or Messing s Res. 9: 309 (1981) or Maxam et al., M. eth. Enzymol. , 65: 499 (1980). Determine the column. (Viii) Transient expression vector Expression vector providing transient expression in mammalian cells of DNA encoding CHF Are particularly useful in the practice of this invention. In general, transient expression requires that the host cell be Cells can replicate effectively in the host cell so that the cell accumulates multiple copies of the expression vector. Then, the desired polypeptide encoded by the expression vector can be synthesized at high concentration. An expression vector capable of 16.17-1 of Sambrook et al. 6.22. Transient expression systems, including appropriate expression vectors and host cells, may be cloned. Convenient method for positive confirmation of polypeptide encoded by cloned DNA and A rapid search method for the desired biological or physiological properties of eel polypeptides. give. Thus, the transient expression system provides a biologically active homologue of native CHF and And is particularly useful in the present invention for the purpose of identifying variants. (Ix) Suitable examples of vertebrate cell vector Other methods suitable for adaptation to CHF synthesis in recombinant vertebrate cell culture, And, for host cells, Geting et al., Nature, 293. Volume: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 28. Volume 1: 40-46 (1979); European Patent 117060; and European Patent 1. 17058. A particularly useful plasmid for mammalian cell culture production of CHF. Smid is either pRK5 (European Patent 307247) or pSVI6B (6991 1991). WO 91/08291) issued on the 13th of March. Derivative of pRK5 pRK5B ( Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 [1991. Year]) is particularly suitable for such manifestations. D. Host cell selection and transformation Here, suitable host cells for cloning or expression of the vector are described above. Prokaryote, yeast or higher eukaryote cell. Prokaryotes suitable for this purpose The object may be a Eubacterium, such as a Gram-negative or Gram-positive organism, for example Escherichia coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, etc. Genus Salmonella such as Salmonella and typhimurium And Serratia spp., Serratia marcescens Enterobacteriaceae as well as B. subtilis and B. lichenif ormis (for example, B disclosed in DD266710, issued on April 12, 1989). . Bacillus such as Licheniformis 41P), such as Pseudomonas aeruginosa It includes Pseudomonas and Streptomyces. Suitable E. coli One of the learning hosts is E. coli 294 (ATCC31446), but E. coli B , E. coli X1776 (ATCC31537), E. coli DH5α, and E. coli W 3110 (ATCC 27325) is also suitable. These examples are illustrative and It's not constant. W3110 strain is an ordinary host strain for recombinant DNA product fermentation Therefore, it is a particularly suitable host or parent host. Host cells secrete proteolytic enzymes Is preferably the lowest. For example, by modifying W3110 strain, a protein endogenous to the host Genetic mutations can be made to the quality-encoding gene, such as Host An example of E. coli having the complete genotype tonAΔ. E. coli W3110 / 1A2 strain, complete E. coli having the genotype tonAΔ · ptr3. E. coli W3110-9E4 strain, complete Genotype tonAΔ · ptr3 · phoAΔE15 · Δ (argF-lac) 1 69 / ΔdegP / ΔompT / kan^rWith E. coli W3110 ・ 27 C7 strain (ATCC55244), complete genotype tonA / ptr3 / phoAΔ E15 ・ Δ (argF-lac) 169 ・ ΔdegP ・ ΔompT ・ Δrbs7 ・ IlvG ・ kan^rWith E. coli W3110.37D6 strain, non-Kanamai E. coli which is a sine-resistant degP deletion mutant 37D6 strain. coli W3110 ・ 40 Opened in B4 strain and U.S. Pat. No. 4,946,783 issued Aug. 7, 1990. E. coli with the indicated peripheral protease mutant. E. coli strains. Different from this In vitro cloning methods such as PCR or other nucleic acid polymerases The reaction is suitable. In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast also encode CHF A suitable cloning or expression host for the vector. Saccharo myces cerevisiae or baker's yeast is a lower eukaryotic host microorganism Most commonly used of all. However, many of the other genera, species, and strains are similar And is useful in the present invention, for example Schizosaccharomy ces · pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 14 P. 0 [1981]; European Patent 139383 issued May 2, 1985); Iberomyces host (US Pat. No. 4,943,529; Fleer et al., Supra) For example, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Lo Uvencourt et al. Bacteriol. , P. 737 [1983] ), K. fragilis (ATCC 12424), K .; bulgaricus (ATCC16045), K.K. wickeramii (ATCC24178), K. Waltii (ATCC 56500), K.S. drosophilarum ( ATCC36906; Van.den.Berg et al., Supra), K.K. therm Otolerans and K.K. marxianus; yarrowia Xu 402226); Pichia pastoris (European Patent 183070) ; S reekrishna, et al. Basic / Microbiol. , Volume 28: 265-278 [1988]); genus Candida; Trichoderma · r eesia (European patent 244234); Neurospora crassa ( Case etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 76:52 59-5263 [1979]); genus Schwanniomyces, eg Schwan. niomyces occidentalis (issued October 31, 1990) European Patent 394538); and filamentous fungi such as Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO91 / 00357 issued January 10, 1991), and And Aspergillus hosts such as A. nidulans (Ballance etc.) Biochem. Biophys. Res. Commun. , Volume 112: 28 4-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205. ~ 221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and A. niger (Kelly and Hynes, EMBO. J., 4: 475-479. Page [1985]). Suitable host cells for producing CHF are derived from multicellular organisms. Such host cells Is capable of complex processing and has glycosylation activity. In principle, vertebrates or Higher eukaryotic cell cultures from any of the invertebrates can be used. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. For example, Spodop tera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti ( Mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila me vacuus like lanogaster and Bombyx mori Strains and variants of the Roviridae and corresponding replicable insect host cells have been identified. You. For example, Luckow et al., Bio / Technology, Volume 6: 47- 55 (1988); Miller et al., “Genetic Engineering (Genetic E Nineering) ", Setlow, J .; K. Etc., Volume 8: (Plen um Publishing, 1986) pp. 277-279; and Ma. See eda et al., Nature, 315: 592-594 (1985). gene For transfer, for example, Autographa californica NPV L-1 mutants and various Bm-5 strains of Bombyx. Mori. Strains of virus are publicly available and these viruses are notably Spodopter. used as a virus of the present invention for gene transfer of a. frugiperda cells sell. Cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, and tobacco plants Cell cultures can be used as hosts. Typically, include CHF DNA beforehand With bacteria treated with Agrobacterium tumefaciens Gene transfer into plant cells by cubation. Plant cell culture A. encodes CHF during incubation with tumefaciens DNA is transferred to a plant cell host and transferred into a gene, and CHFDNA is transferred under appropriate conditions. Is expressed. In addition to this, for example, nopaline synthase promoter and polyamine It also contains plant cell compatible control and signal sequences, such as denylation signal sequences. It is possible. Depicker et al. Mol. Appl. Gen. Volume 1 : 561 (1982). In addition to this, the T-DNA780 gene was separated from the upstream. Transcription of plant-expressed genes in recombinant DNA-containing plant tissues The level can be activated or increased. European special issue of July 21, 1989 Xu 3211196. However, most notable is vertebrate cells, which Proliferation of tissue cells (tissue culture) has become a routine operation in recent years (“Tissue culture (T issue, Culture) ", Academic Press, Krus e and Patterson [1973]). Examples of useful mammalian host cell lines are Monkey kidney CV1 cell line transformed with SV40 (COS-7, ATCC CR L1651); human embryonic kidney line (293 or subcloned for growth in suspension culture) 293 cells, Graham et al. Gen. Virol. , 36 volumes : 59 [1977]); juvenile hamster kidney cells (BHK, ATCC / CC). L10); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlau b and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 77: 4216 [1980]); mouse Sertoli cells (TM4, Mother, Biol. Reprod. , 23: 243-251 [1980]); monkeys Kidney cells (CV1, ATCC / CCL70); African green monkey kidney cells (V ERO-76, ATCC CRL1578); human cervical cancer cells (HELA, AT CC / CCL2); dog kidney cells (MDCK, ATCC / CCL34); buff Arrawat liver cells (BRL3A, ATCC / CRL1442); human lung cells (W138, ATCC / CCL75); human hepatocytes (Hep / G2, HB806) 5); mouse breast cancer cells (MMT060562, ATCC CRL51); TRI Cells (Mother et al., Annals NY. Acad. Sci., 383 vol. : 44-68 [1982]); MRC5 cells; FS4 cells; and human liver cancer. It is a series (Hep G2). Transfecting the expression or cloning vector of the invention into a host cell Suitable transformants, modified as appropriate to induce the promoter A gene that encodes a desired sequence by culturing in nutrient medium, selecting transformants To amplify. Gene transfer is the uptake of an expression vector by a host cell, either It does not matter whether the sequence is actually expressed. One of ordinary skill in the art would appreciate, for example, Ca PO_FourAnd a number of gene transfer methods are known, including electroporation. Gene transfer Success is generally recognized when there is an indication that the vector is working in the host cell. Transformation is the introduction of DNA into an organism, which DNA serves as an extrachromosomal element. Or by insertion into the chromosome. Host to use Depending on the transformation, transformation is performed using standard techniques appropriate to the cell. Substantial cell wall For prokaryotes and other cells with barriers, see Sambrook et al., Chapter 1.82. Commonly used calcium treatments or electroporation methods that employ the listed calcium chloride Is done. For transformation of certain plant cells, Shaw et al., Gene, 23: Pp. 315 (1983) and WO89 / 0585 issued June 29, 1989. By Agrobacterium tumefaciens as described in 9. Infection is used. In addition to this, WO 91/003 issued January 10, 1991 Plants can be introgressed using sonication as described in 58. In mammalian cells that do not have such cell walls, Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) calcium phosphate. The sium precipitation method is preferred. Axel is a general aspect of mammalian cell host system transformation. In U.S. Pat. No. 4,399,216 issued Aug. 16, 1983. yeast Transformation into E. coli is typically described by Van Solingen et al. Bact. 1 30: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Scl. (USA), Vol. 76. According to the method of page 3829 (1979) Will be implemented. However, other methods of introducing DNA into cells, such as Microinjection, electroporation, bacterial cytoplasmic fusion with intact cells, polybrene, polyol Polycations such as nitin, and the like may also be used. Transforming mammalian cells For various technologies to exchange, such as Keown et al., Methods in E nzymology, 185: 527-537 (1990) and Man. Sour et al., Nature, 336: 348-352 (1988). Teru. E. FIG. Culturing host cells Prokaryotic cells used to produce the CHF polypeptides of this invention are generally Specifically, the cells are cultured in a suitable medium as described in Sambrook et al., Supra. The mammalian host cells used to produce the CHFs of this invention can be in various media. Can be cultured. For example, Ham's F-10 (Sigma) and F-12 (Sigma) ), Minimum essential medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) a), Dulbecco's modified Eagle's medium ([D-MEM], Sigma), and Commercially available media such as D-MEM / F-12 (Gibco BRL) Are suitable for culturing host cells. In addition to this, for example, Ham and Wall ace, Methods in Enzyme, 58:44 (19 1977); Barnes and Sato, Anal. Biochem. , Volume 102: 255 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 492. 7762; 5122469; or 4560655; US Reissue Patent No. 3098. 5; WO90 / 03430; or the medium described in WO87 / 00195 Gap Can also be used as a culture medium for host cells. Any of these media can be Hormones and / or other growth factors (eg insulin, transfection Phosphorus, aprotinin, and / or endothelial growth factor [EGF]), salts (such as Such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphates) , Buffers (such as HEPES), nucleosides (eg adenosine and thiocyanate) Antibiotics (such as Gentamicin ™ drug), trace elements Elementary (usually defined as an inorganic compound present at a final concentration in the micromolar range), And budo sugar or an equivalent energy source may be added. Other necessary additives It may be contained at an appropriate concentration known to those skilled in the art. For example, temperature, pH, etc. The nutrient conditions are those previously used for the host cell selected for expression and are those of ordinary skill in the art. It is obvious to the person. In general, principles and experimental procedures for maximizing in vitro productivity of mammalian cell cultures. Drawing and practical technology are described in "Mammalian Cell Biotechnology: Practical Method (Mamma) lian ・ Cell ・ Biotechnology: a ・ Practical ・ Approach) ", M.A. Butler, (IRL Press, 199 Can be found in 1 year). The host cells referred to in this disclosure include cells in vitro as well as in host animals. F. Gene amplification / expression detection Gene amplification and / or expression is based on, for example, the sequences provided herein. Conventional Southern blot, Northern blot to quantify mRNA transcription (Thom as, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 77: 5201-5 205 [1980]), dot blot (DNA analysis), or suitable labeling Directly in the sample by in situ hybridization using It can be measured. Various labels, most commonly radioisotopes, especially³²Let's adopt P You. However, biotin modified nucleic acids, for example for introduction into polynucleotides Other techniques, such as using cleotide, may also be employed. Next is biotin Or as a binding site for an antibody, such as a radionuclide, a fluorescent group, It can be labeled with a wide range of labels such as enzymes and the like. Separately from this, DNA double race , RNA double helix and DNA-RNA double helix or DNA-protein double Antibodies capable of recognizing specific double helices, including heavy helices, may be employed. Then add the antibody If a double helix is formed on the surface, the presence of an antibody that binds to the double helix is detected. The assay is performed where the double helix binds to the surface, allowing it to exit. Gene expression can be determined separately by, for example, immunohistochemical staining of tissue sections and As in cell culture or body fluid assays for direct quantification of gene product expression Can be measured by various immunological methods. Immunohistochemical staining techniques typically require Cell samples prepared by water and fixation, followed by specific gene product binding React with labeled antibody. Usually this label is, for example, an enzyme label, a fluorescent label or a chemical label. It is a visually detectable one, such as a light label. Suitable for use in the present invention In particular, highly sensitive dyeing techniques are described in Hsu et al., Am. J. Clin. Path. , 7 5: 734-738 (1980). Monocloners are useful antibodies for immunohistochemical staining and / or assay of sample solutions. It can be produced in the mammalian body. Antibodies are natural CHF Synthetic peptides for polypeptides or based on the DNA sequences described in Chapter 4 herein It can be created conveniently for G. Purification of CHF polypeptide Although CHF is preferably recovered as a secreted polypeptide from the culture medium, it is secreted. When directly produced without signal, it can be recovered from the host cell lysate. When CHF is produced in a recombinant cell of non-human origin, CHF is of human origin. Contains no white matter or polypeptides. However, for CHF CHF from cellular proteins or polypeptides to obtain highly homogeneous products It is necessary. Granular disruption of either host cells or lysed fragments in the first step Substances are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration; if necessary, commercial protein The protein is concentrated by commercially available protein concentration filtration; followed by immunoaffinity chromatography. Chromatography, ion exchange column fractionation (eg DAEA or carboxymethyi) Blue or Sepharose, C) M blue-sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectin-se Fallose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether To yopearl, Butyl / Toyopearl, Phenyl / Toyoop Chromatography on earl or Protein A Sepharose, SDS-P AGE chromatography, silica chromatography, chromatofocuser Reverse phase HPLC (eg silica gel with aliphatic groups), eg Sephadex Gel filtration using molecular sieves or size exclusion chromatography, selecting CHF Chromatography on columns that selectively bind, and ethanol or sulfate CHF can be treated with one or more steps selected from ammonium precipitation. Separate from pure. Protease inhibitors were added to all of the above steps for protection. In decomposition can be prevented. An example of a suitable protease inhibitor is phenylmethyl sulphate. Honyl fluoride (PMSF), leukopeptin, pepstatin, aprotini 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride-Vesta Includes tin, chymostatin, and benzamidine. The preferred purification method is 1.5 M- Adjust to NaCl and load onto a Butyl / Toyopearl (trade name) column Including that. This column is loaded with NaCl-containing tris [hydroxymethylamino] medium. Wash with tan hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, activity 10 mM-Zw ittergent (trade name) 3 to 10 TRIS-HCl containing a surfactant, p Elute with H7.5. The maximum activity was adjusted to 150 mM-NaCl, pH 8.0. The MONO-Q rapid flow column. This column is loaded with NaCl and Wash with TRIS-HCl, pH 8.0 containing luglucoside. Activity has passed Seen in fractions. The active substance is then dissolved in 0.1% TFA, 10% acetonitrile Load on a reverse phase C4 column and elute with a gradient from 0.1% TFA to 80%. Activity Is fractionated on a gel filtration column to approximately 15-30 kDa. Guani for splitting and recovery It is expected that a chaotropic agent such as gin-HCl will be needed. CHF variants with residues deleted, inserted, or substituted in a manner similar to native CHF It is recovered in consideration of the substantial change caused by the mutation. For example, CHF, Other proteins or polypeptides such as bacterial or viral antigens Production of fusions with the enzyme facilitates purification; immunoaffinity including antibodies to this antigen The column can be used to adsorb the fusion polypeptide. For example, rabbit poly An immunoaffinity column, such as a clonal anti-CHF column, is applied to the remaining immunoepitope. Collected to adsorb CHF variants by binding to at least one tope. Can be used. The protease inhibitors defined above also prevent proteolysis during purification Can also be useful, and antibiotics also prevent accidental contaminant growth Can be added for. Those skilled in the art will appreciate that suitable purification methods for natural CHF are recombinant. Induced by changes in the properties of CHF or its variants during production in cell culture. Recognize that modifications due to this may be necessary. H. Covalent modification of CHF polypeptide Covalent modifications of CHF polypeptides are included within the scope of this invention. Natural CH Both F and native CHF amino acid sequence variants can be covalently modified. This -Forms of covalent modifications within the scope of the invention are products of variant CHF fragments. Variant CHF fragments up to 40 amino acid residues can be chemically synthesized or full length or variant C It can be conveniently produced by enzymatic or chemical cleavage of HF polypeptides. CH Another type of covalent modification of F or a fragment thereof is to mark the molecule with CHF or a fragment thereof. Of reactive amino acid residues with selected side chains or N- or C-terminal residues It is introduced by reacting with an organic derivatizing reagent that can be formed. Cysteinyl residues are most commonly, for example, chloroacetic acid or chloroacetoacetate. Reacting with α-haloacetic acid (and the corresponding amine), such as A methyl or carboxamidomethyl derivative is obtained. Cysteinyl residue is bromo Trifluoroacetone, α-bromo-β- (5-imidozoyl) propionic acid, Chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimide, 3-nitro-2-pyri Zildisulfide, methyl 2-pyridyldisulfide, p-chloromarque Tribenzoate, 2-chloromercury-4-nitrophenol, or chloro Also by reaction with ro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole, Derivatized. Histidyl residues are derivatized by reaction with diethyl pyrocarbonate at pH 5.5-7.0 Is done. This reagent is relatively specific for histidyl side chains. Para-bromofe Nasyl bromide is also useful. This reaction is preferably 0.1M-Na at pH 6.0. Perform in thorium cacodylate. The lysinyl and amino terminal residues are succinic or other carboxylic acid anhydrides. react. Derivatization with these reagents has the effect of reversing the charge of lysinyl residues. You. Other suitable reagents for α-amino-containing residues are eg methylpicoline. Imidoesters such as imidate, pyridoxal phosphate, pyridoxa , Hydrogenated chloroboron, trinitrobenzenesulfonic acid, O-methylisourine Transaminase with elementary, 2,4-pentanedione and glyoxylate- Includes catalytic reactions. Arginyl residues are modified by reaction with one or several conventional reagents, among which Phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedio And ninhydrin. Derivatization of arginine residues requires guanidine functional Base pK_aTherefore, it is necessary to carry out the reaction in alkaline conditions. Further In addition, these reagents also react with the lysine group as well as the arginine epsilon-amino group. You can. Specific modification of tyrosyl residues introduces a spectral label into tyrosyl residues Due to the interest in the reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane Can be done. Most commonly, N-acetylimidazole and tetranitrome To form O-acetyl tyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively. I do. Tyrosyl residue¹²⁵I or¹³¹Labeled protein for radioimmunoassay using I It is iodinated to produce quality, but the chloramine T method is suitable. Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are carbodiimide (R- N = C = N-R ') to selectively modify. Where R and R ' Is, for example, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4-ethyl) carbo Diimide or 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) Different alkyl groups such as carbodiimide. Furthermore, aspartyl And glutamyl residues are treated with asparaginyl by reaction with ammonium ions. And are converted to glutaminyl residues. Derivatization with bifunctional reagents is a method for purifying anti-CHF antibodies or CHF is applied to a water-insoluble support matrix or surface for use in the reverse way. Useful for differential coupling. Commonly used cross-linking agents include, for example, 1,1 -Bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hi Droxysuccinimide ester, for example an ester with 4-azidosalicylic acid, Disuccin such as 3,3'-dithiobis (succinimidyl propionate) Homobifunctional imide esters including imidyl esters, and bis-N-malley Difunctional maleimides such as mid-1,8-octane, and the like. Methyl Derivatization test such as -3-[(p-azidophenyl) dithio] propioimidate The drug gives a photoactivatable intermediate, which forms a cross-link in the presence of light Can be. In addition, reactive water-insoluble matrices such as cyanogen Lomid activated carbohydrates and U.S. Pat. Nos. 3,969,287; 3691016; 41. 95128; 4247642; 4229537; and 4330440. The reactive substrate is used for protein immobilization. Glutaminyl and asparaginyl residues are often deaminated, each Become the corresponding glutamyl and aspartyl residues. These residues are neutral or It is deaminated under basic conditions. The deamidated form of these residues is within the scope of this invention. Contained within. Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, ceryl or threo. Phosphorylation of hydroxyl groups on nyl residues, lysine, arginine, and histidi Methylation of the α-amino group in the side chain (TE Creighton, “Protein : Structure and molecular properties (Proteins: Structure · and · M e., Properties), "W. H. Freeman, Inc. N. Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetylation of the N-terminal amine. And amidation of the C-terminal carboxyl group. Another type of CHF polypeptide included within the scope of this invention is a covalently bound form. Modifications include altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. Here the modification removes one or more carbohydrate groups found in natural CHF, And / or one or more glycosylation sites not present in native CHF Means to add. Glycosylation of polypeptides is typically N-linked or O-linked. N-linked indicates that the carbohydrate group is attached to the side chain of the asparagine residue. Tripe Ptide sequence: asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine ( Where X is an amino acid other than proline) is the carbohydrate group to the asparagine side chain Is a recognition sequence for the enzymatic addition of Therefore, any of these tripeptide sequences The presence in any of the polypeptides constitutes a potential site of glycosylation. O-linked glycosylation is the sugar N-acetylgalactosamine, galactose , Or one of xylose, most commonly serine or threonine 5-hydroxyproline or 5 although shown to bind to roxyamino acids -Hydroxylidine may also be used. The attachment of the glycosylation site to the CHF polypeptide is described in the above tripeptide sequence. Amino to include one or more (for N-linked glycosylation sites) This is conveniently accomplished by altering the acid sequence. This change is a natural CHF sequence With one or more serine or threonine residues (O-glycan) Can also be done by (to the cosylation site). Natural CHF The mino acid sequence preferably encodes at the DNA level, especially the native CHF polypeptide. Bases preselected to create codons that translate DNA into desired amino acids Change by mutating with. DNA mutations are the methods described above in Section 2B. Can be done using. Another method for increasing the number of carbohydrate groups on CHF polypeptides is glycosylation. Binding to a chemical or enzymatic polypeptide. These operations are N- Or, for O-linked glycosylation, polysaccharides in host cells with glycosylation ability It is advantageous in that it does not require peptide production. Depending on the coupling mode used, the sugar (A) Arginine and histidine, (b) free carboxyl group, (c) system Free sulfhydryl group, (d) serine, threonine, or A free hydroxyl group, as in droxyproline, (e) phenylalanine, Aromatic groups such as in tyrosine or tryptophan, or (f) glutamine Can be added to the amide group of. These methods are described in WO87 issued Sep. 11, 1987. / 05330 and Aprin and Wriston, CRC Crit. Rev .. Biochem. , Pp. 259-306 (1981). Removal of carbohydrate moieties present on CHF polypeptides may be accomplished chemically or enzymatically. Can be achieved. For chemical deglycosylation, trifluoromethanesulfonic acid compounds or Or equivalent compound contact with the polypeptide is required. In this treatment, the linked sugar (N- Most or all except acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) Cleaves all sugars but leaves the polypeptide intact. Chemical deglycosylation In Hachimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. , 259: 52 (1987) and Edge et al., Anal. Bioche m. , 118: 131 (1981). Charcoal water on polypeptide Enzymatic cleavage of the compound group is described by Thotakura et al., Meth. Enzymol. , 138: 350 (1987). It can be achieved by the use of glycosidases. Glycosylation at potential glycosylation sites is described in Duskin et al. Bi ol. Chem. 257: 3105 (1982). It can be prevented by using a mycin compound. Tunicamycin is a protein-N-glycoside Inhibits bond formation. Another type of covalent modification of CHF is described in US Pat. Nos. 4,640,835; 449668. 9; 4301144; 4670417; 4791192 or 4179337. In some manner, for example polyethylene glycol, polypropylene glycol, or CHF Polypeptides for various non-protein polymers such as polyoxyalkylenes Including the connection of the code. CHF can also be used, for example, in coacervation techniques or interfacial polymerization (eg, respectively). Hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsules and poly [meth] (Methacrylate) microcapsules) in a colloidal drug delivery system (eg, For example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles And nanocapsules) or microcapsules prepared in macroemulsion Can be captured inside. Such technology is called "Remington's n's. Pharmaceutical Science ", 16th edition, Osl o, A. Ed., (1980). CHF preparations also include radioactive iodine, enzymes, fluorophores, spin labels, etc. When labeled with, an assay for CHF (eg radioimmunoassay, enzyme-linked immunoassay) Or CHF for use as a standard in radioactivity receptor assays In the preparation of antibodies as standards in Useful in surgery and in competitive receptor binding assays. Since it is often difficult to predict the properties of mutant CHF, select the optimal mutant. In order to do so, the search for the obtained mutants is significant. Cardiac hypertrophy, anti-arrhythmia Pulse, muscle inotropic or neurotrophic enhancement, presence of CHF antagonism, expression level Search for improvement, oxidative stability, high-secretion performance, and more. For example, for a given antibody Changes in the immunological properties of CHF molecules, such as the affinity of Escherichia coli, eg competitive immunoassays It is measured by the method. Mutants are hypertrophic, antiarrhythmic, inotropic, and neurogenic. The corresponding activity in which the trophic activity is observed in native CHF in the same assay (eg Using the assay for hypertrophy and neurotrophicity described in the examples) Thus assay for changes in decline or enhancement. Redox or thermal Qualitative, hydrophilic, susceptible to proteolysis, or with carrier or multiplex Other potential modifications of the properties of the protein or polypeptide, such as propensity to associate with Is assayed by methods well known in the art. I. CHF antagonist Antagonists to CHF are predicted receptor families for CHF (CNTF, LIF, and GH / site including oncostatin M receptor subfamily It can be produced by using the Cain receptor family). That is, the receptor Cloned for expression from the family; the soluble form of the receptor is then transferred to the extracellular domain. It can be produced by identifying the in and cleaving it from the transmembrane domain. Soluble type Antagonism of CHF activity using the receptor as an antagonist or the receptor You can search for small molecules that do. Alternatively, using the mouse sequence shown in Figure 1 or the human sequence shown in Figure 5, A variant of natural CHF that acts as an antagonist is produced. GH / cytokine acceptance The body family is known to have two binding sites on the ligand, so CHF Receptor Binding Sites on Escherichia coli Can Be Determined in Binding Studies and Molecules Act as Antagonists One of them can be removed by standard techniques (deletion or radical substitution) Wear. The antagonism described herein is due to several methods including hypertrophic and neurotrophic. Can be decided. J. Hypertrophic test To assay for hypertrophic activity, a reduction assay is preferably used. This test method Then the medium used allows the cells to survive in serum-free low density plating. this Plating directly into the medium eliminates the wash step to remove a few cells. You. Plating density is important: many minority cells and their viability are reduced; Many of the large number of cells and myocytes initiate self-induced hypertrophy. The steps involved are: (A) at least insulin, transferrin, And a myocyte suspension in D-MEM / F-12 medium supplemented with aprotinin, Cell density about 7.5 × 10^FourPlate at cells / mL; (B) culturing cells; (C) Add a substance to be assayed (likely to contain CHF); (D) culturing cells with a substance; and (E) Measure hypertrophicity. This medium also has other elements, such as EGF that ensures long-term cell survival. Can be added, but such addition is not essential. D-MEM / F-1 2 media are available from Gibco BRL, Gaithersburg, MD, It consists of one of the following media: The preferred hypertrophic assay is as follows: (A) A medium containing bovine serum, preferably D-MEM / F supplemented with 4% fetal bovine serum -12 medium, preferably wells, are incubated with this medium for about 8 hours at 37 ° C. Pre-coated on a 96-well tissue culture plate, (B) Excluding the medium; (C) 7.5 × 10^FourCells / mL insulin, transferrin, and application A myocyte suspension of D-MEM- / F-12 medium supplemented with rotinin was added to the inner 60 wells. Plating; (D) Incubating myocytes for at least 24 hours; (E) Add test substance; (F) culturing cells with a test substance (preferably about 24-72 hours, more Preferably about 48 hours); then (G) Enlargement is measured, preferably by crystal violet staining. Preferably the medium used in step (c) is serum-free and the penicillin / strate is Contains leptomycin (pen / strep) and glutamine. Most preferred Specifically, this medium contains 100 mL of D-MEM / F-12 and 10 transferrin. 0 μL (10 mg / mL), insulin 20 μL (5 mg / mL), aprotini 50 μL (2 mg / mL), 1 mL of pen / strep (JRH Bios Sciences No. 59602-77P), L-glutamine 1 mL (200 (mM). Small sample requirement of 100 μL or less, assay of 1000 samples per week Performance allows expression cloning and protein purification, but this is It would not be feasible using the law. Another assay for hypertrophy is atrial natriuretic peptide (ANP) release To the rat ANP receptor A-IgG fusion protein¹²⁵Pairs with I-rat ANP binding Measuring by competition assay. This method suitable for use Is Chamow et al., Biochemistry, 29: 9885-9891. Pp120 using the CD4-IgG fusion protein described in page (1990). Similar to the method used to measure. K. Neurotrophic assay Here, Leung, Neuron, 8: 1045-1053 (1992). ), The assay for ciliary ganglion neurotrophic activity is suitable. Outline For example, ciliary ganglia were excised from E7-E8 chicken embryos and trypsin-EDTA (Gibco 15400-13) and dissociated in phosphate buffered saline at 37 ° C for 15 minutes. Dilute 10 times with water. Keep the ganglia in growth medium (10% saline) until trypsin-free. Fetal calf plasma, 1.5 mM glutamine, penicillin 100 μg / mL and streptococcus Washed with leptomycin (100 μg / mL added high glucose D-MEM) three times, Then, the mixture is gently stirred in 1 mL of growth medium to give a single cell suspension. Growth medium 5 Place this cell mixture in mL in a 100 mm tissue culture dish for 4 hours at 37 ° C incubator. Incubate in to enrich neurons. Non-neuro during this time Cells preferentially attach to the dish and at the end of the incubation the neurons float. You can play and wash gently. The enriched neurons are then pre-coated with collagen Place in 96-well plate and plate. 100 cells in each well Plate 0-2000 to final volume with CHF dilution to be tested The product is 100 to 250 μL. After 2-4 days incubation at 37 ° C In addition, living cells were stained with the vital dye metallothionein (MTT) Evaluate the number. 1/5 volume of MTT (Sigma · M2128) 5mg / ML is added. After incubation at 37 ° C for 2-4 hours, the viable cells (dark purple (Filled with color precipitate) are counted by phase microscope with 100 × magnification.3. Uses and therapeutic compositions and administration of CHF CHF has in vivo heart failure, arrhythmia or inotropic disease and / or peripheral Neuropathy and other motor neurons or neurons in which CNTF is active As a drug for the treatment of mammals (animals or humans) with a series of neurological disorders Believed to have uses. For example, CHF is used in cases where ACE inhibitors are unavailable or ineffective. It may be useful in the treatment of congestive heart failure. In some cases CHF Administered in combination with other agents, including or in concert to treat congestive heart failure. The effective amount of ACE inhibitor to be administered, if adopted, will be determined by the physician or veterinarian. At the discretion. Drug administration and regulation to achieve optimal management of congestive heart failure Made, and ideally the use of diuretics or digitalis and hypotension and kidneys Take into account conditions like obstacles. Dosage depends on type of inhibitor used and treatment It depends on factors such as the particular patient to be treated. Typically the amount employed is an ACE inhibitor Is the same dose used when is administered without CHF. So, for example, if the test dose of enalapril is 5 mg and the patient allows it, This is then increased to a daily dose of 10-20 mg. Another example is captopril Will administer a test dose of 6.25 mg orally to a human patient first and then administer this dose to the patient. 25 mg twice daily (BID) or three times daily (TID), if The dose may later be increased to 50 mg BID or TID. Acceptable levels are low blood pressure and low blood pressure Determine and assess if there are signs of pressure. If prescribed, the dose is 100 It can be increased up to mgBID or TID. Captopril is the active ingredient hydro An enteric coating that, in combination with chlorothiazide, protects captopril until it reaches the intestine. Is formulated as a pH stabilized core with a delayed release coating. Captopril tablets Alternatively, it is available for administration as a capsule. Captopril and other ACE inhibitors For a discussion of doses, dosages, prescriptions and contraindications for agents, see the Doctor Desk Manual. (Physicians. Desk, Reference) ", Medical ・ Economics ・ Data ・ Production, Montvale , NJ. 2314-2320 (1994). CHF also protects oligodendrocytes against natural or tumor necrosis factor-induced death Astroglial in terms of development, maturation and survival of oligodendrocytes in vitro. In terms of cell survival and differentiation and type 2 astrocyte induction, and rat central Of low affinity nerve growth factor and CD-4 by microglial cells of the nervous system (CNS) Potentially useful in stimulating recombinant production. CHF is also potentially useful in providing nutritional effects to denervated skeletal muscle. In addition, leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor Has proliferative response and binding properties of hematopoietic cells transfected with low-affinity receptor By binding to interleukin-6 receptor, Regulation of Brenogen gene expression and trophic effect on mouse embryonal carcinoma cells , Becoming an endogenous thermogenic substance, and mitosis in human IMR32 neuroblastoma Expected to have a promoter effect. In addition, CHF responds to nerve growth factor in cultured rat sympathetic neurons. To maintain motor neurons and their target muscles in the developing rat To induce sprouting of motor neurons in vivo Promoting survival of corticospinal neurons in rat pups, in vivo in adult rat black Preventing degeneration of cytosolic dopaminergic neurons and excitability of hippocampal pyramidal neurons Altering the threshold of susceptibility to toxic injury, neurons in adult rat CNS To prevent the degeneration of humans, promote the production of low-affinity NGF receptor, and fetal rat. It is expected to enhance neuronal survival in hippocampal cultures. These activities are associated with CHF-induced peripheral neuropathy (motor and sensory), ALS, Zheimer's disease, Parkinson's disease, stroke, Huntington's disease, and, for example, in the retina Translated into treatment of all neurodegenerative diseases, including related ophthalmic diseases. CHF is, for example, CNTF, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, or And as a concomitant treatment of neurological disorders with neurotrophic factors such as NT-% Can be useful. Nucleic acid encoding CHF may be useful as a diagnostic agent for tissue-specific typing. For example, on-section hybridization, Northern and Southern blotting, and Operations such as PCR analysis are performed on CHF-encoding DNA and / or RNA. It can be used to determine if it is within the cell type to be valenced. Separated CHF polypeptide can be used as a standard for samples containing unknown amounts of CHF or It can be used in a quantitative diagnostic assay as a control. CHF therapeutics for treatment of heart failure and neurological disorders are expected for storage CHF with purity, if desired, physiologically acceptable carrier, additive, or stable Of the lyophilized cake or aqueous solution, mixed with an agent (Remington's Pharmaceutical Sciences above) Manufactured into shape. Acceptable carriers, additives or stabilizers depend on the dose and Non-toxic to recipients at concentrations such as phosphate, citric acid, etc. Buffers like organic acids; antioxidants containing ascorbic acid; low molecular weight polypeptides (About 10 residues or less); plasma albumin, gelatin, or immunoglobulin Eel protein; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; glycine, gluta Amino acids such as min, asparagine, arginine or lysine; glucose, Monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates containing mannose or dextrin; E Chelating agents such as DTA; Sugar alcohols such as mannitol or sorbitol A salt-forming counterion such as sodium; and / or tween, pluro Or a nonionic surfactant such as polyethylene glycol (PEG) Include. The CHF used for in vivo administration must be sterile. This is freeze-dried and Easily achieved by filtration through sterile filtration membranes before or after reconstitution. It is. CHF is usually stored in lyophilized form or in solution. Therapeutic CHF compositions are generally containers with sterile access ports, eg subcutaneous injection. Place in an intravenous solution bag or vial with a lid that can be pierced by a needle. The route of CHF or CHF antibody administration is, for example, intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, Intraocular, intraarterial, or intralesional routes, etc. Follow known methods such as infusion. CHF can be infused or put together It is administered continuously. CHF antibodies may be administered similarly or in the bloodstream or lymph To be administered. A suitable example of a sustained release formulation is a semipermeable matrix of a solid hydrophilic polymer containing this protein. And molded into films or microcapsules, for example I do. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg L Anger et al. Biomed. Master. Res. , Volume 15: 167 ~ 277 [1981] and Langer et al., Chem. Tech. 1 Volume 2, pages 98-105 [1982], poly (2-hydroxyethyl). (Methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactide (US patent 3773919, EP 58481), L-glutamic acid and gamma-eth Copolymer with ru-L-glutamate (Sidman, etc., Biopolymer s, 22: 547-556 [1983]), non-decomposable ethylene-vinyl acetate. (Langer et al., Supra), degradable lactic acid-glycolic acid copolymers, such as Luprondepo (trade name) (lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolyline acetate Injection microspheres) and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (Europe) Patent 133938). 100 days for polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid While allowing the release of molecules over the above range, some human rogels can Release for a short time. When encapsulated, the protein remains in the body for a long time at 37 ° C. Denaturation or aggregation as a result of exposure to moisture resulting in loss of biological activity and immunogenicity Changes can occur. Rational strategies are related to protein stabilization depending on the mechanism involved. Can be devised. For example, if the aggregation mechanism is due to intermolecular thio-disulfide exchange If found to be in S--S bond formation, stabilization is with sulfhydryl residue modification, Freeze-drying from acidic solutions, moisture content control, use of suitable additives, and specific polymers -Achieved by the development of matrix compositions. Sustained release CHF compositions also include liposome entrapped CHF. Contains CHF Liposomes are known per se: DE 3218121; Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 82: 3688-3692. P. (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980); European Patent 52322; European Patent 36676; European Patent 88046; European Patent 143949; European Patent 1 42641; Japanese Patent Application 83-118008; U.S. Pat. No. 4,485,045; No. 4,544,545; and European Patent No. 102324; Lipos normally The monolayer type is small (about 200 to 800 angstroms) and the lipid content is Sterols greater than about 30 mol%, the ratio chosen to suit optimal CHF therapy Let it. The effective amount of CHF to be used for treatment depends on, for example, the subject to be treated, the administration route, and the patient It depends on the conditions of. Therefore, for the therapist, the drug should be titrated to determine the optimal treatment. It will be necessary to modify the route of administration as necessary to obtain a therapeutic effect. Typical day The dose depends on the above factors and is about 1 μg / kg to 100 mg / kg / day for patients. Over the heavy or higher range, preferably from about 10 μg / kg / day to 1 It is 0 mg / kg / day. Clinicians are typically dosed to treat heart or nerve failure CHF is administered until the desired effect is achieved. For example, this amount is the ventricular contraction force Increases, diminishes peripheral vascular resistance, and relieves similarly critical conditions in patients with heart failure Or treat. The progress of this therapy is easily monitored by conventional assays.4. Manufacture of CHF antibody (I) Starting material and production method Immunoglobulins (Ig) and certain variants thereof are known and many are recombinant. It has been prepared by cell culture. For example, US Pat. No. 4745055; Europe Patent 256654; European Patent 120694; European Patent 125023; European Patent 2 55694; European Patent 266663; WO88 / 03559; Faulkner Et al., Nature, 298: 286 (1982); Morrison, J. Immun. , 123: 793 (1979); Koehler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2197 (198). 0); Raso et al., Cancer Res. , 41: 2073 (198 1 year); Morrison et al., Ann. Rev .. Immunol. Volume 2: 2 39 (1984); Morrison, Science, 229: 120. 2 (1985); and Morrison et al., Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 81: 6851 (1984) ;. Recombination exemption Epidermal globulin chains are also known. For example, US Pat. No. 4,444,878; WO88 / 0. 3565; and European Patent 68763 and the references cited. In the chimera of the present invention The immunoglobulin moiety in the is IgG-1, IgG-2, IgG-3, or Ig G-4 subtype, which may be obtained from IgA, IgE, IgD or IgM, It is preferably obtained from IgG-1 or IgG-3. (Ii) Polyclonal antibody Polyclonal antibodies to CHF polypeptides or CHF fragments are generally CHF Or multiple injections of CHF fragment and adjuvant subcutaneously (sc) or intraperitoneally Created in animals by. Immunize with CHF or a fragment containing the target amino acid sequence Proteins that are immunogenic to the power species, such as keyhole limpet hemocyanin, For serum albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor Bifunctional or derivatizing agents such as maleimidobenzoylsulfosuccinimide s Tell (composite via cysteine residue), N-hydroxysuccinimide (lysine residue) Group), glutaraldehyde, succinic anhydride, SOCl₂, Or R¹N = C = NR (where R and R¹Are different alkyl groups) Can be useful. CHF polypeptide or CHF fragment, immunogenic complex, or derivative To immunize animals by peptide or complex (respectively rabbit or mouse) 1m g or 1 μg was mixed with 3 volumes of Freund's complete adjuvant and the solution was mixed with Injection into the skin. 1 month later, 1/5 to 1/10 the initial amount of Freund's complete Boost the animals by subcutaneously injecting the peptide or complex in the juvant at multiple sites ( Booster). Seven to 14 days later, the animals were bled and serum was added to CHF or CHF. Assay for fragment antibody titers. Boost the animal until the titer stabilizes. Preferred Preferably, it is a complex of the same CHF or CHF fragment but different proteins and / or Alternatively, boost the animal with a complex complexed with different cross-linking reagents. Complex Can also be produced as a fusion protein in recombinant cell culture. A coagulant such as alum Exemption Appropriately used to enhance epidemics. (Iii) Monoclonal antibody A monoclonal antibody is a substantially homogeneous population of antibodies, that is, the individuals that make up the population. Antibodies are identical except for naturally occurring mutations that may be present in trace amounts Obtained from things. Therefore, the modifier "monoclonal" is a mixture of different antibodies. It shows the property of an antibody that it is not a substance. For example, the CHF monoclonal antibody of the present invention is derived from Kohler and Milstei. n, Nature, 256: 495 (1975) first described hive. By using the lidoma method, or by the recombinant DNA method (Cabilly, etc., supra) Can be manufactured. In the hybridoma method, a mouse or other suitable host such as a hamster Specific immunization of CSF or CSF fragments used for immunization by immunizing animals as described above Produce antibodies that bind or produce lymphocytes that can be produced. There Can immunize lymphocytes in vitro. Then use a suitable material such as polyethylene glycol. The lymphocytes are fused with myeloma cells using appropriate fusion agents to form hybridoma cells. (Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice” (Monoclon al ・ Antibodies: Principles ・ and ・ Practic e) ", pp. 59-103 [Academic Press, 1986)]. The hybridoma cells thus produced are preferably used to grow unfused, parental myeloma cells. Alternatively, contact with an appropriate culture medium containing one or more substances that inhibit survival. Seed and grow. For example, if the parental myeloma cells are hypoxanthine guanine phospho If ribosyl transferase (HGPRT or HPRT) is deleted, refer to Typically, the growth medium of hybridomas inhibits the growth of HGPRT-deficient cells The substances hypoxanthine, aminopterin, and thymidine are added (HA T medium). Suitable myeloma cells fuse efficiently and produce stable high levels of selected antibody-producing cells. It maintains antibody production and is sensitive to media such as HAT media. Among these, suitable myeloma cell lines are, for example, Salk Institute e ・ Cell ・ Distribution ・ Center, San Diego, Calijo MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from Lunia, USA Derived from, and American, Type, Culture, C SP available from collection, Rockville, MD, USA- 2 cell-like mouse myeloma lineage. The culture medium for growing hybridoma cells is a monoclonal antibody against CHF. Test for body production. Preferably produced by hybridoma cells The binding specificity of a monoclonal antibody can be determined by immunoprecipitation or, for example, by radioimmunoassay. Assay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Una Determined by in vitro binding assay. The binding affinity of the monoclonal antibody can be determined, for example, by Munson and Polard, Anal. Biochem. , 107: 220 (1980) Scatc. It can be determined by a hard analysis or the like. The hybridoma cells have antibodies with the desired specificity, affinity and / or activity. After confirming production, clones were subcloned by the limiting dilution method. Grow by standard methods (Goding, supra). Culture medium suitable for this purpose Include, for example, D-MEM or RMPI-1640 medium. In addition to this Thus, hybridoma cells can also grow in animals as in vivo ascites tumors. The monoclonal antibody secreted by the subclone is used as a culture medium, ascites fluid, or Is an immunoglobulin purification procedure from serum by a conventional method, for example, protein A-cephalo , Hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or parent Proper separation is performed by an operation such as compatibility chromatography. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by conventional procedures (eg, mouse Antibody capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody. (By using a ligonucleotide probe), Sequenced. The hybridoma cells of the invention serve as a suitable source of this DNA. stand. Once isolated, this DNA is placed in an expression vector, which is then For example, Escherichia coli cells, monkey COS cells and chimeric cells that normally do not produce immunoglobulin proteins A Inheritance in host cells such as Chinese ovary (CHO) cells or myeloma cells Subsequent transfer allows for the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. Code antibody For the recombinant expression of recombinant DNA in bacteria, see Skerra et al., C urr. Opinion in Immunol. Volume 5: 256-262 ( 1993) and Pluckthun, Immunol. Revs. , 130 Volume: 151-188 (1992). DNA is, for example, the constant sequence of human heavy and light chains instead of homologous mouse sequences. Replace the coding sequence of the domain (Morrison et al., Proc. Nat l. Acad. Sci. , 81: 6851 [1984]), or the immune group. A coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide in the coding sequence for lobulin. It can be modified by covalently linking all or part of it. Like this Where the "chimera" has the binding specificity of the anti-CHF monoclonal antibody of the invention. Or "hybrid" antibodies are produced. Typically, such non-immunoglobulin polypeptides will be the constant domain of the antibodies of the invention. In place of, or replace them with one of the antigen binding sites of the antibody of the invention. One antigen-binding site with specificity for CHF by substituting for the variable domain and Chimeric bivalent antibodies containing different antigen binding sites with specificity for different antigens create. Chimeric or hybrid antibodies also include those that involve cross-linking agents in vitro. It may also be prepared using known methods of synthetic protein chemistry, including. For example, disulfide Construct an immunotoxin using an exchange reaction or by forming a thioether bond sell. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mel. Includes captobutyrimidate. For diagnostic applications, the antibodies of the invention will typically be labeled with a detectable group. This detectable group can directly or indirectly produce a detectable signal. Can be something. For example, the detectable group is^ThreeH,¹⁴C,³²P,³⁵S, Or¹²⁵A radioisotope such as I; eg fluorescein isothiocyanate A fluorescent or chemiluminescent compound such as nate, lodamine, or luciferin; For example¹²⁵I,³²P,¹⁴C,^ThreeRadioisotope labels such as H; Sphatase, beta-galactosidase, or horseradish peroxida It can be an enzyme such as a protease. Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); Da. vid, et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al. Immunol. Meth. 40: 219 (1981) Year); and Nygren, J .; Histochem. and Cytoche m. , 30: 407 (1982). Methods known in the art for separately conjugating antibodies to groups can be employed. Antibodies of the invention may be used, for example, in competitive binding assays, direct or indirect sandwich methods. Use in any known assay, such as the switch assay and immunoprecipitation assay You. Zola, "Monoclonal Antibodies: Technical Manual (Monoclonal An. "tibodies: A ・ Manual ・ of ・ Techniques", 147 Pp. 158 (CRC Press, 1987). Competitive binding assays compete with the test sample analyte (CHF) for binding to a predetermined amount of antibody. Performance of the labeled standard (which can be CHF or an immunologically reactive part thereof) in combination Depends on. The amount of CHF in the test sample depends on the amount of the standard that will bind to the antibody. Inversely proportional. For rapid determination of the amount of standard bound, the antibody is generally used. From standards and analytes that remain unbound to standards and analytes that bind to The antibody is immobilized before or after competition so that it can be separated. The sandwich assay is a different immunogenic part of the protein (CHF) to be detected or Includes the use of two antibodies capable of binding the epitope. Sandwich inspection In the conventional method, a test sample analyte is bound to a first antibody immobilized on a solid support, The second antibody is then bound to the analyte to form an insoluble ternary complex. David and Greene, U.S. Pat. No. 4,376,110. Detects secondary antibody itself Functional groups (direct sandwich assay) or detectable groups. Anti-immunoglobulin antibody can be used for measurement (indirect sandwich assay). An example For example, one type of sandwich assay is the ELISA assay, Possible groups are enzymes (eg horseradish peroxidase). (Iv) Humanized antibody Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, a humanized antibody Have one or more amino acid residues introduced from a non-human source. these Non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues and are typically "import" variable Taken from the domain. Humanization is essentially the method of Winter and its co-workers (Jones et al., Nature, 321, 522-525 [1986]. Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 [19. 1988]; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1. 536 [1988]), a rodent CDR or CDR sequence is This can be done by substituting the corresponding sequence of the antibody. Therefore, like this "Humanized" antibodies are chimeric antibodies (Cabilly et al., Supra), where Smaller than qualitatively intact human variable domains correspond to sequences from non-human species Therefore, it has been replaced. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies, Where some of the CDR residues and possibly some of the FR residues are present in rodent antibodies. Replaced by residues from similar sites in. The selection of human variable domains to use in making humanized antibodies depends on the light chain and Both heavy chains are very important for reducing antigenicity. So-called "optimum" According to the method, the sequence of the variable domain of the rodent antibody is changed to the entire known human variable domain sequence. Search against the library. The human sequence closest to that of the rodent is then humanized Accepted as a human framework (FR) for antibodies (Sims et al., J. I. mmunol. 151: 2296 [1993]; Clothia and Le. sk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987)). Alternative One is the consensus of all human antibodies belonging to a particular subgroup in the light or heavy chain. It uses a special framework derived from the sequence. Same framework Can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Nat. l. Acad. Sci. USA 89: 4285 [1992]; Pres Ta, et al. Immunol. 151: 2623 [1993]). Humanization of antibodies with retention of high affinity for the antigen and other favorable biological properties It is even more important to do. To this end, according to the preferred method, Antibodies to parental sequences and various sequences using a three-dimensional model of parental and humanized sequences. Manufactured by the process of analysis of the conceptualized humanized product of Three-dimensional immunoglobulin Models are commonly available and are familiar to those skilled in the art. Selected immunoglobulin composition A computer program that describes and displays the inferred three-dimensional conformational structure of column candidates. Ram available. Examination of these images reveals the functionality of the candidate immunoglobulin sequence. Role of Residues in Amino Acids: Sex of Immunoglobulin Candidates That Bind Antigen It is possible to analyze residues that affect the performance. Thus, the FR residue is consensus Selected from the source and imported sequences to bind and enhance the affinity of the antibody for the target antigen. Try to reach the desired characteristics. In general, CDR residues are directly and most Are involved in the effect on antigen binding. (V) human antibody Human monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method. Human things Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for clonal antibody production The columns are, for example, Kozbor, J. et al. Immunol. 133: 3001 (1 984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Manufacturing Technology and Applications ( Monoclonal / Antibody / Production / Techn issues, and Applications, "pages 51-63 (Marc El Decker, New York, 1987); and Boerner. Do, J. Immunol. 147: 86-95 (1991). You. Nowadays by immunization whole repertoire of human antibodies without endogenous immunoglobulin production Transgenic animals (eg, mice) capable of producing Can produce. For example, antibody heavy chain binding in chimeric and germline mutant mice Area (J_H) Gene homozygous deletion leads to complete inhibition of endogenous antibody production It has been tell. Human germline immunoglobulin gene arrangements such germline projections Transfer to natural mutant mice would lead to the production of human antibodies upon antigen challenge. U. For example, Jakobovits, Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits, etc., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggerm. Ann, etc., Year in Immuno. , 7:33 (1993) Teru. In addition to this, phage display technology ( McCafferty et al., Nature, 348: 552-553 [19. [90 years]) is an in vitro test for immunizing human antibodies and antibody fragments from non-immunized donors. It can be used to produce from the lobulin variable domain (V) gene repertoire. According to this technique, the V domain gene of an antibody is referred to as, for example, M13 or fd. Either the major or the minor coat protein gene of filamentous bacteriophage In-frame cloning and display as a functional antibody fragment on the surface of phage particles Let it. Since the filamentous particle contains a single-stranded DNA copy of the phage genome, it is Selection based on competent properties results in selection of the gene encoding the antibody exhibiting these properties. Come on. The phage will thus mimic some of the properties of B-cells. H The display of pages is done in a variety of ways; For example, Johnson / Kevin / S. And Chiswell, David J. , Current, OPinion, in, Structural, Bio LOGY 3: Vol. 564-571 (1993). V gene segment Several sources of A. can be used for phage display. Na, such as Clackson true, 352: 624-628 (1991) from the spleen of immunized mice. Anti-oxazolone antibody obtained from a small random combinatorial library of induced V genes Multiple arrays of were isolated. Construct V gene repertoire from non-immunized human donors And, in essence, an antibody against a large array of antigens (including self-antigens), Marks et al. Mol. Biol. 222: 581-597 (19 91) or Griffith et al., EMBO.J. , Volume 12: 725-73 They can be separated according to the technique described on page 4 (1993). In the natural immune response, antibody genes accumulate mutations at a high rate (somatic cell height). mutation). Some of the changes introduced confer high affinity, giving high affinity surface immunity B cells displaying lobulin are preferentially replicated before the next antigen challenge, Differentiate. This natural process is called "chain shuffling" (Marks et al., Bio / Technology, 10: 779-783 [1992]) It can be imitated by adopting the technology. In this method, by phage display The affinity of the resulting "primary" human antibody is determined by the heavy and light chain V region genes. Of a naturally occurring variant of the V domain gene (repertoire) obtained from a non-immunized donor It can be improved by sequentially exchanging with the repertoire. Parent of nM range with this technology A compatible antibody or antibody fragment can be produced. Very large phage antibody reper The strategy for creating a tree is described in Waterhouse et al., Nucl. Acids R es. 21: 2265-2266 (1993). When human antibodies have similar affinities and specificities to rodent antibodies, Gene shuffling can also be used to derive human antibodies from rodent antibodies. Also known as "epitope imprinting method" According to this method, called rodent antibody obtained by phage display technology The heavy or light chain V domain genes with the human V domain gene repertoire. Substitute for a rodent-human chimera. Functional antigen binding site in selection for antigen Position, that is, the epitope that controls the choice of binding partner, can be restored. Human variables are separated. Repeat this process to replace the remaining rodent domain And a human antibody is obtained (PCT WO93 / 062 issued April 1, 1993). 13). Unlike conventional humanization of rodent antibodies by CDR grafting, this technique Provide fully human antibody without rodent framework or CDR residues I do. (Vi) Bispecific antibody The bispecific antibody is preferably a human or humanized monoclonal antibody, It has binding specificity for at least two antigens. In this case, one of the binding specificities Is for CHF and the other one is for any other antigen, preferably GH / S To other ligands, which bind to members of the itocaine receptor family. For example Specifically to CHF and neurotrophic factors or different dimorphic CHF polypeptides Conclusion Combined bispecific antibodies are within the scope of the invention. Methods for making bispecific antibodies are known in the art. Traditionally, bispecific antibody recombination For the production, two heavy chains of immunoglobulin heavy chain-light chain pairs with different specificities are co-produced. Expression-based (Milstein and Cuello, Nature, 305 Volume: 537-539 [1983]). Immunoglobulin heavy and light chain runs Due to the dumb classification, these hybridomas have different antibody content. Possibly producing a mixture of 10 offspring, of which only one is correct bispecific Have a structure. It is not possible to purify the correct molecule, which is usually done by affinity chromatography steps. It is troublesome and the product yield is low. A similar operation method is issued on May 13, 1993 W O93 / 08829 and Traunecker et al., EMBO. Volume 10 : 3655-3659 (1991). According to another preferred approach, it has the desired binding specificity (antibody-antigen combining site) The antibody variable domain is fused to an immunoglobulin constant domain sequence. This fusion is Immunoglobules preferably comprising at least hinge, CH2, and CH3 regions With the phosphorus heavy chain constant domain. Heavy chain constant containing the site necessary for light chain binding It is preferred to have the constant region (CH1) present in one of the fusions. Immunoglobulin Separate the DNA encoding the heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain. And inserted into an appropriate expression vector for co-transfection into a suitable host organism. With this build In an embodiment where the unequal ratio of the three polypeptides used gives the optimum yield Great flexibility is provided for adjusting the mutual proportions of the three peptide fragments. Only While, when equal proportion production of at least two polypeptides gives high yields or Two types of polypeptide chains into one of the expression vectors when the ratio does not mean otherwise Alternatively, it is possible to insert all three types of coding sequences. Preferred aspects of this approach So, a bispecific antibody is a hybrid immunization with a first binding specificity in one arm. Globulin heavy chain and hybrid immunoglobulin heavy chain-light chain pair in a separate arm (Providing a second binding specificity). This asymmetric structure is a bispecific molecule Since the presence of immunoglobulin light chains present in only half of the Facilitating separation of desired bispecific compounds from unwanted immunoglobulin chain binders Have been found. For more details on bispecific antibody production, see eg Suresh, Methods in in Enzymol. , 121: 210 (1986) reference. (Vii) Heteroconjugate antibody Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies bind covalently Composed of two antibodies. Such antibodies can, for example, target unwanted cells to the immune system. To target cells (US Pat. No. 4,676,980) and HIV infection (WO91 / 00360; WO92 / 00373; Permission 03089) Proposed. Heteroconjugate antibodies use a convenient cross-linking method. Manufactured. Suitable cross-linking agents are well known in the art and are described in US Pat. 76980, along with a number of cross-coupling techniques.5. Use of CHF antibody CHF antibodies are diagnostic assays for CHF, such as specific cells, tissues or serum. It is useful in production inside. Antibodies in the same manner as in CHF above Label and / or immobilize on insoluble matrix. Receptor binding assay In one aspect of the method, an antibody composition that binds to all CHFs or a plurality of selected CHFs Immobilized on an insoluble matrix, contact the test sample with the immobilized antibody composition Adsorbs all CHF, then immobilized CHF specific to predetermined CHF Be recognized by unique markers such as individual fluorophores and so on Contact with multiple antibodies specific for each CHF. The presence of each unique label and / or By determining the amount, the relative proportion and amount of each CHF can be determined. The antibodies of the invention are also useful for passively immunizing patients. CHF antibodies are used to affinity purify CHF from recombinant cell culture or natural sources. It is also very useful. CHF antibodies that do not detectably cross-react with rat CHF are CH F can be purified without this protein. Suitable methods of diagnostically assaying CHF and its antibodies are well known per se. You. The candidate CHFs described in the examples below were tested and found to be hypertrophic, antiarrhythmic, myopathic. In addition to bioassays to see if they have force or neurotrophic activity, Synthetic, sandwich and steric inhibition immunoassay techniques are also useful. Competitive and And the sandwich method employs a phase separation step as an integral part of the method, while The somatic inhibition assay is performed in a single reaction mixture. Depending on the molecular weight of the substance to be assayed While some methods are preferred, basically the same procedure is used to Test compatible substances. Therefore, regardless of whether it is an antigen or an antibody, test here. The substance to be labeled is called the analyte, and the proteins that bind to the analyte are Either the cell surface receptor or the antigen is designated as the binding partner. All assays for CHF or its antibodies use one or more of the following reagents: Used for: labeled analyte analogues, immobilized analyte analogues, labeled binding partners, immobilization Binding partners, and steric complexes. The labeled reagent is also called a "tracer". The label to be used, which labels the CHF nucleic acid for use as a probe. Is also useful) for detection without interfering with the binding of the analyte and its binding partner. This is a possible function. Many labels are known for use in immunoassays, including Can be detected directly, for example fluorochromes, chemiluminescence, and radiolabels As well as must react or be induced for detection, for example Include non-enzymes. Examples of such labels include radioisotopes³² P,¹⁴C,¹²⁵I,^ThreeH,¹³¹I: rare earth chelate or fluorescein and its Fluorophores like derivatives of; rhodamine and its derivatives; dansyl; umbelliferone Eg firefly and bacterial luciferase (US Pat. No. 4,737,456); Ciferin; 2,3-Dihydrophthalazinedione; Maleate dehydrogenase; Ure Ase; peroxidase such as horseradish peroxidase (HRP) Alkaline phosphatase; β-galactosidase; Glucoamylase; Rhizoti For example glucose oxidase, galactose oxidase, glucose Saccharide oxidases such as su-6-phosphate dehydrogenase; dye precursors Use hydrogen peroxide to oxidize the body, eg HRP, lactoperoxy Uricases and enzymes along with enzymes, such as oxidase or microperoxidase. Heterocyclic oxidases such as santin oxidase; biotin / avidin; Includes pin labels; bacteriophage labels; stable free radicals; others. Those of ordinary skill in the art will be aware of other suitable labels that may be employed in the present invention. CHF, The conjugation of the antibody or fragment uses standard techniques commonly known to those skilled in the art. Achieved. For example, dialdehyde, carbodiimide, dimaleimide, bisui Midate, bisdiazotized benzidine, and other binding reagents are fluorescent, chemiluminescent as described above. And can be used to mark the polypeptide with an enzyme label. For example, US Xu 3940457 (fluorescent assay) and 3645090 (enzyme); Hunte r et al., Nature 144: 945 (1962); David et al. Biochemtry, 13: 1014-1021 (1974); P. ain et al. Immunol. Methods, 40: 219-230. (1981); Nygren, J .; Histochem. and Cytoc hem. , 30: 407-412 (1982); O'Sullivan Et al., “Methods for producing enzyme-antibody conjugates for use in enzyme immunoassays (Methods). ・ For ・ the ・ Preparation ・ of ・ Enzyme-antib ody ・ Conjugates ・ for ・ Use ・ in ・ Enzyme ・ Imm unoassay) ", J. J. Langone and H.M. van Vunakis Ed. "Methods in Enzymology (Methods in Enzymology)", Vol. 73, pp. 147-166 (Acadmic Press, New York, NY, 1981); Kennedy et al., Clin. Chim. Acta, 7 0: 1-31 (1976); and Schurs et al., Clin. Chi m. Acta, 81: 1-40 (1970). In the last article The coupling techniques are glutaraldehyde method, periodate method, dimaleimide method, and m- Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimide ester method. Enzyme labels are the preferred embodiment in the practice of the present invention. All conceivable tests No single enzyme is ideal for use as a label in conventional methods. Instead, one must determine which enzyme is suitable for the particular assay system. An important criterion for enzyme selection is the turnover number of pure enzyme (enzyme per unit time). Number of substrate molecules converted to products per product), enzyme product purity, product detection sensitivity, fermentation Ease and speed of elementary reaction detection, absence of interfering factors and enzyme-like activity in test solution, And stability of the complex, availability and cost of the enzyme and its complex, etc. You. Included in the enzymes used as suitable labels in the assay method of the invention Among them are alkaline phosphatase, HRP, beta-galactosidase, urea. Ase, glucose oxidase, glucoamylase, maleate dehydrogenase, And glucose-6-phosphate dehydrogenase. Urease is even better Among the suitable enzyme labels is the chromophore pH finger whose activity is particularly readily visible to the naked eye. Because it is a drug. Immobilization of reagents is required for certain assays. Immobilization involves binding partner in solution It is intended to be separated from free and dissolved analytes. This convenience combines Water-insoluble matrix prior to assay procedure with either partner or analyte analog Or by adsorption to a surface (Bennic et al., US Pat. 60) by covalently bonding (eg using glutaraldehyde cross-linking Or by subsequent immunoprecipitation of the partner or analogue, for example. It is achieved by solubilization. Another test method, called the competitive or sandwich test, is well established. Widely used by commercial diagnostic companies. A competitive assay is a limited number of binding moieties in which the tracer analog has a common binding partner. Position depends on its ability to compete with the test sample analyte. The binding partner is generally Tracer and analyte, which are later insolubilized and then bound to their binding partners, become unbound. Separate from racer and analyte. This separation can be done by decantation. When the binding partner was previously insolubilized) or by centrifugation (after binding reaction of the binding partner) Achieved (when it settles). The amount of test sample analyte is determined by the amount of marker substance It is inversely proportional to the amount of bound tracer. Dose-effect curve with known amount of analyte Is prepared and compared with the test results to quantitatively determine the amount of the analyte present in the test sample. Set. When using a detectable enzyme as a marker, these assays are ELIS Called system A. Another type of competitive assay, called the "homogeneous" assay, is phased. No need for separation. Here, the anti-analyte forms a complex between the enzyme and the analyte. The presence of anti-analyte is used to alter the enzymatic activity upon binding to the analyte. In this case, CHF or an immunologically active fragment thereof is linked with an organic bifunctional crosslinker. Complexes with enzymes like oxydose. Anti-CHF binding inhibits the enzymatic activity of the label Alternatively, the conjugate is selected for use with anti-CHF in a potentiated manner. This The method itself is widely used under the name of EMIT. The steric complex is used in the steric hindrance method of homogeneity assay. This complex pairs with the hapten The antibody to be bound to the complex at the same time as the anti-analyte, A low molecular weight hapten is synthesized by covalently linking it to a small analyte. You. In this assay procedure, the analyte present in the test sample binds to the anti-analyte and At this time, by binding the anti-hapten to the complex, for example, when the hapten is a fluorescent substance, Alters the properties of the complex hapten, including changes in fluorescence. The sandwich assay is particularly useful for measuring CHF or CHF antibodies. Tests using immobilized binding partners in a sequential sandwich assay Adsorb the analyte, remove the test sample by washing, and use the bound analyte. Adsorbed labeled partner and bound material was then separated from the residual tracer. Let go. The amount of bound tracer is directly proportional to the test sample analyte. "simultaneous In a “selective” sandwich assay, the test sample should be separated before adding the labeled binding partner. Do not let go. Anti-CHF monoclonal antibody as one of the antibodies, and polychrome Sequential sandwich assay using null anti-CHF antibody on the other hand shows CHF activity Useful for testing. The above are merely exemplary CHF and antibody diagnostic assays. These subdivisions Other methods currently or hereafter developed for the determination of deposits include the bioassay methods described above. Included within this range. The following examples are provided by way of illustration and not limitation. Statement All references cited in this book are explicitly cited for reference. Example I Confirmation of CHF and in vitro activity A. Assays for expression-cloned substances The assay used for hypertrophy is generally described as It is an in vitro assay for cardiac hypertrophy. : 1. Preparation of myocyte suspension The production of myocyte suspensions is described by Chien et al. Clin. Invest. , 75 Volume: 1770-1780 (1985) and Iwaki, et al. Based on the method 1-2 day-old Sprague-Dawley rat pups The ventricles obtained from were taken and divided into three. The shredded ventricles were treated with a series of collagenase treatments. Digested. The resulting single cell suspension was purified on a discontinuous Percoll gradient 95% pure myocyte suspension was obtained. 2. Myocyte plating and culture The two published myocyte plating and culture methods are as follows: (1) L Ong et al. (supra), the cell suspension was pre-prepared for 30 minutes in MEM / 5% bovine serum. Started. Next, the muscle cells that did not adhere were treated with insulin and transfer 35 mm tissue in serum-free MEM with serum, BrdU, and bovine serum albumin 7.5 x 10 per mL in culture dish^FourPlated at cell density. (2) Iw aki, etc. (supra) are in D-MEM / 199/5% horse serum / 5% fetal bovine serum. Cell suspension of 3 x 10 per mL in a 10 cm tissue culture dish.^FivePlating on cells did. After culturing for 24 hours, the cells were washed and washed in serum-free D-MEM / 199. Has been recorded. In this invention, these cells were plated to increase test performance in the mini-assay. Different protocols have been developed for coating and culturing. 96-well tissue culture Pre-coat plates with D-MEM / F12 / 4% fetal bovine serum for 8 hours at 37 ° C. I do. The medium is removed and the cell suspension is placed in 60 inner wells for insulin and 7. 7 mL / mL of D-MEM / F-12 supplemented with nsferin and aprotinin. 5 × 10^FourPlate on cells. This medium is typically penicillin / st Contains an antibiotic such as leptomycin and glutamine. This medium The cells are allowed to survive at this low serum-free plating density. Cells for 24 hours After incubation, the test substances are added directly to the wells. 3. Hypertrophic reading Newborns in culture after stimulation with alpha adrenergic agonists or endothelin Rat myocardial cells have increased cell size found in congestive heart failure in vivo And individual contractile protein aggregates increase to form organized contractile units Some of the features of myocardial cell hypertrophy including the above are shown. FAS such as Chien EB J. I mentioned earlier. These changes can be visualized with an anti-phase microscope and the degree of hypertrophy is controlled. It was recorded on the scale 7 to 0. 7 is a completely enlarged cell, 3 is not stimulated Is a cell. These 3 and 7 steps are described by Simpson, Circulati on Research, 51: 787-801 (1982), FIG. 2, A. And B respectively. Persistent recording, facilitating microscopic reading of 96-well cultures In order to create the Dyed with a methanol solution. Crystal violet is a protein stain for cultured cells Commonly used for color. In addition to this, take an appropriate amount from a 96-well plate and release ANF or ANP Was monitored for protein marker expression.B. Expression cloning Poly (A)⁺RNA was isolated from 7-day mouse embryoid bodies (Aviv and Leder Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 69: 1408-141 2 [1972]; Cathala et al., DNA, 2: 329-335 [. 1983]). Embryoid bodies are formed by differentiation of pluripotent embryonic stem cells (ES) (Do etschman et al. Embryol. Exp. Morphol. , 87 Volume: 27-45 [1985]). This embryonic stem cell line ES-D3 (ATCC CRL1934) to LIF (Williams et al., Nature, 336 volumes: It is maintained in an undifferentiated state in a medium containing 684 to 687 [1988]). This Is D-MEM (high glucose), 1% glutamine, 0.1 mM-2-mel Mosquito Ptoethanol, penicillin-streptomycin, 15% heat-inactivated fetal bovine blood Qing and 15 ng / mL mouse LIF. These cells are Put in suspension culture in the same medium containing 20% heat-inactivated fetal calf serum And (day 0), they aggregated and differentiated into multicellular structures called embryoid bodies. Culture 8 A primordium-like structure that pulsates by the first day is formed in a part of the structure. Differentiating E S cells were treated with serum-free medium (D-MEM / F-12, 1% glutamine, penicillin- Stored for 24 hours after changing to streptomycin and 0.03% bovine serum albumin) The embryoid bodies were evaluated for production of CHF activity by stacking. Official Concentrate the previously adjusted medium 10-fold with a 3-K ultrafiltration membrane (Amicon), He dialyzed against the ground. The medium adjusted for 24 hours starting from the 3rd day has a hypertrophic score It showed 4.5-5.5, and when starting from the 6th day, it showed 5.5-7.5. Plasmid expression vector pRK5B (Holmes et al., Science, 2 53: 1278-1280 [1991]). Tarpriming method (Strathde et al., Nature, 356: 7 63-767 [1992]). No vector pRK5B Linearized at the tI site, treated with alkaline phosphatase, sequence: Single-stranded oligonucleotide ocdl. Linked to 1.3. The ligation product is then Cleavage with BstXI and 4700 bp vector fragment for agarose gel electrophoresis More separated. The vector was further purified by oligo dA chromatography. Expression library is poly (A)⁺RNA 1 μg, vector primer 5 μg, And Amersham reagents. First and second strand synthesis And after T4-DNA polymerase filling reaction, 500 bp by gel electrophoresis. Blunt end ligation without ligating linkers, sizing material for larger insertions It was cyclized by the method. The ligation product was used to transform E. coli DH5α by electroporation. Changed. Poly (A)⁺Double-stranded cDNA (499 ng) was prepared from 1 μg of RNA. 17 ng of cDNA was ligated and 3.3 ng was transformed to obtain 780000 clones. Obtained, of which 83% had inserts with an average size of 1470 bp. DNA was isolated from a pool of 75-15,000 clones and subjected to Lipofecta Human embryo by min-transfection (Gibco-BRL) Gene transfer into kidney 293 cells. ~ 20 of 6-well dish using 2 μg of DNA Gene transfer into 0000 cells. Cells were incubated in 2 mL of serum-free assay medium for 4 days. Cubated. This medium is 100 mL of D-MEM / F-12, trans. Ferrin 100 μL (10 mg / mL) 100 μL, insulin (5 mg / mL ) 20 μL, aprotinin (2 mg / mL) 50 μL, pen / strep (J RH / Biosciences / No. 59602-77P) 1 mL, and L -Composed of 1 mL of glutamine (200 mM). Gene transfer and expression The efficiency of Escherichia coli is 0.2% of the plasmid DNA expressing the secreted form of alkaline phosphatase. was observed by adding μg (Tate et al., FASEB J., 4: 227-23). 1 [1990]). 100 μL of conditioned culture medium from each transfection pool in a final volume of 200 μL Tested for hypertrophicity. In one pool, conditioned medium was used in Centrico prior to assay. n.3 microconcentrators (trade name: Amicon) It was concentrated 4-5 times. 19 pools of 10,000-15,000 clones, 1000- 359 pools of 5800 clones and 723 pools of 75-700 clones Was introgressed and assayed for hypertrophic activity. 2 of these 1172 pools It was positive. Pool 437 (pool of 187 clones) and pool 781 ( A pool of 700 clones) gave a score of 4. Pure claw from pool 437 Clones (named pchf.437.48) in a positive pool They were separated by repeated re-transfection until single clones were obtained. Pool 7 The pure clone from 81 (designated pchf.781) is clone pchf.781. 43 Separation was performed by colony hybridization method to insert from 7.48. Clone pchf. The sequence of the 781 insert is shown in Figure 1 (SEQ ID NOs: 1, 2, and 3). : 2 nucleotide chains and amino acid sequence). Clone pchf . The sequence of the 437.48 insert is clone 7 starting at base 27 (underlined). 8 Matches 1. Clone pchf. The first open reading frame for 781 (see translation in Figure 1) is the amino acid ( It encodes 203 proteins (translated as MW = 21.5 kDa). This protein The quality contains one cysteine residue and one site for N-linked glycosylation, but the parent There is no aqueous N-terminal secretory signal sequence. Clone pchf. 3'of 781-non-reversal The translation region contains a normal mouse repetitive sequence called b1 (bp to 895 to 1015). Including. 7th day embryoid body poly (A)⁺Clone pchf. From 781 Hybridization with the probe of C. showed a single band of ~ 1.4 kb, which was c The inserts from the DNA clones are roughly the same size. The encoded sequence is any of the known protein sequences in the Dayhoff database. There is no high degree (> 35% amino acid identity) similarity. However, this is C NTF, interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL- 11), LIF and Oncostatin M (OSM) (Bazan, Neuron). , 7: 197-208 [1991]). It shows a low degree of similarity to Amilly. Mouse CHF is similar to mouse LIF With 24% acid identity (Rose and Todaro, WO 93/05169), 21% amino acid identity to human CNTF (McDonald et al., Biochim . Biophys. Acta, 1090: 70-80 pages [1991]) One. See Figure 2 for a sequence comparison of mouse CHF and human CNTF. CNTF, IL-6, IL-11, LIF, and OSM are GH / cytokine receptor proteins. Using related receptor signal proteins including gp130 belonging to Milly (Kis Himoto et al., Cell 76: 253-262 [1994]). C Like HF, CNTF does not have an N-terminal secretory signal sequence.C. Clone properties and activity Clone pchf. To prove that 781 encodes CHF, 29 By both gene transfer of 3 cells and use of the in vitro SP6 transcription / translation binding system Expression studies were performed. pchf. Produced by 781-transfected 293 cells Protein³²S-methionine and cysteine labeling (compared to vector transgenic cells) The conditioned medium contains about 21.8 kDa labeled protein, and the cell extract contains 22.5 kDa. The protein of kDa is shown. Conditioned media from these gene transfer at a 1: 4 dilution A score of 6 was given for cardiac hypertrophy using the above assay. Unlabeled gene transfer The conditioned medium from No. 1 showed a morphological score of 5.5-6.5 at a 1: 1 dilution. These assays were also positive for a second measure of cardiac hypertrophic-ANP release. See FIG. This test¹²⁵I-rat ANP to rat ANP receptor A-IgG fusion protein This was done by measuring the competition for binding. This method uses a CD4-IgG fusion protein Measurement of gp120 using white matter (such as Chamow, Biochemistr y, 29: 9885-9891 [1990]). Outline For example, the wells of a microtiter plate may be mixed with rat anti-human IgG antibody (2 μg / (mL) 100 μL coated overnight at 4 ° C. Phosphoric acid supplemented with 0.5% bovine serum albumin After washing with salt-buffered saline, the wells were 3 ng / mL rat ANP receptor A-IgG1. 00 μL (human ANP receptor A-IgG (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23060-23067 [1991]) (Prepared by method and purified) and incubated at 24 ° C. for 1 hour. Well And wash with 50 μL of rat ANP standard or sample for 1 hour at 24 ° C. Cubated. next¹²⁵I-rat ANP (Amersham) 50μ L was added and incubated for an additional 1 hour. Wash wells, count The extent of binding competition was measured. Compare ANP concentration in sample with rat ANP standard curve Decided. Clone pchf. 781 SP6-binding in vitro transcription / translation (Promeg Protein from the company a)³⁵The S-methionine label is a 22.4 kDa label. Showed protein. This labeled translation product was assayed for cardiac hypertrophy at a dilution ratio of 1: 200. Was positive (morphological score 5-6). This 22.4 kDa labeled band is fertilized The labeled translation product was loaded onto a reverse-phase C4 column to prove that it was responsible for the macroactivity. (Synchropak RO-4-4000) with 10% acetonitrile, 0. Equilibrated in 1% TFA and eluted with an acetonitrile gradient. Labeled protein peak And the peak of hypertrophic activity are simultaneously dissolved from this column with ~ 55% acetonitrile. Released. Cardiomyocyte hypertrophic activity has already been partially purified from rat cardiac fibroblasts. Have been. I mentioned earlier, such as Long. Further study of the properties of CHF herein Therefore, rat heart fibroblasts were cultured. Conditioned medium from primary culture is tested according to the invention In vitro neonatal rat cardiac hypertrophic assay with cardiac hypertrophic activity. Clone pchf. Probe with the coding region fragment of 781 (hybridization was 5 × SSC, 20% ho Lumamide, the final wash at 42 ° C was 0.2 x SSC, 50 ° C). 1. In the blot hybridization of rat fibroblast mRNA isolated from the product, 1. A clear band was shown at 4 kb.D. Factor purification Clone pchf. Depending on the cells transfected with 781 or human clones The adjusted culture medium was adjusted to 1.5M-NaCl, and Toyopearl (commodity Name) Put on a Butyl-650M column. This column is 10 mM-TRIS- Washed with HCl, pH 7.5, 1M NaCl, 10 mM-TRIS-HCl, The activity is dissolved at pH 7.5, 10 mM-Zwittergent (trade name) 3-10. Let go. The activity peak was adjusted to 150 mM-NaCl, pH 8.0, and the MONO -Place in Q, Fast, Flow column. This column is 10 mM-TRIS- Wash with HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% octyl glucoside Upon purification, activity is found in the flow-through fraction. Next, the active substance was added with 0.1% TFA, 10 Reverse phase C4 column in 100% acetonitrile, 0.1% TFA to 80% Elute with a gradient. The activity is fractionated on a gel filtration column to approximately 15-30 kDa. A chaotropic agent such as guanidine-HCl is required for fractionation and recovery Is expected. Example II In vivo hypertrophy activity test A. Normal rat Purified CHF of Example I has, for example, blood pressure, heart rate, systemic vascular resistance, contractility, heart rate. Force, concentrated or delayed hypertrophy, left ventricular systolic pressure, left ventricular mean pressure, left ventricular end diastolic pressure, Like cardiac output, pulsatility, histological parameters, ventricular size, wall pressure, etc. It is tested to observe the effects on various cardiovascular parameters in normal rats.B. Pressure overload mouse model Purified CHF in a pressure-overloaded mouse model in which right ventricular failure was caused by stenosis of the pulmonary artery Also test.C. RV rat dysfunction model A retroviral mouse model of ventricular dysfunction was used to test purified CHF. Can be used and dP / dt, ejection fraction and volume can be tested by the hypertrophic assay. this In the model, the pulmonary artery of a mouse is narrowed to create pulmonary hypertrophy and lung failure.D. Transgenic mouse model Transgenic with muscle actin promoter-IGF-I fusion gene Mice show hypertrophy of myocardium and skeletal muscle without signs of myopathy or heart failure. Further In addition, IGF-I gene-targeted mice showed markedly decreased expression of ventricular muscle contractile protein gene. Shows heart (and skeletal) muscle development defects including. Purified CH with these two models Test F. In addition, a gene-induced model of dilated myocardial injury and cardiac dysfunction without necrosis Transgenic and gene-targeted mice (MLC-ras mice; heterozygous) Aortic banding of IGF-I-deficient mice).E. FIG. Post myocardial infarction model in rat The rat is a predictor of congestive heart failure in humans in natriuretic peptide production. Purified CHF is tested in a post myocardial infarction model. Specifically male Sprague-D awley rat (Charles, River, Breeding, Labo) ratories, 8 weeks old) is acclimated to the device for at least 1 week before surgery. Rat Are allowed free access to granular rat chow and water and are housed in a light temperature controlled room. 1. Coronary artery ligation Myocardial infarction is described in Greenen et al. Appl. Physiol. , Volume 91: 92-96 (1987) and Buttric et al., Am. J. Phys iol. 260: 11473-11479 (1991). Then, it is generated by ligating the left coronary artery. Rat with pentobarbital natriu Anesthesia (60 mg / kg, intraperitoneal), intubated by tracheostomy, and ventilated (Ha Aerate with rvard Apparatus, model 683). After thoracotomy on the left side, About 2 mm from the root of the left coronary artery is ligated with 7-0 silk suture. Sham movement The procedure is the same except that the suture is passed under the coronary artery and then removed. La All were adopted by the American Heart Association on November 11, 1984 for research purposes. In accordance with the American Heart Association's Position on Animal Use ”. 4 to 6 weeks of ligation Later, rat myocardial infarction progresses to heart failure. In clinical patients, myocardial infarction or coronary artery disease is the most common cause of heart failure. You. Congestive heart failure in this model leads to congestive heart failure in a large number of human patients Reasonably similar. 2. electro-cardiogram One week after surgery, electrocardiography was performed under mild metophane anesthesia to record infarct progression. Take a picture. The ligated rats of this study were subjected to the depth and duration of pathological Q-waves through the precordial lead. Then divide into subgroups. Butrick and others mentioned above; Kloner Do Am. Heart J. 51: 1009-1013 (1983). This gives an approximate estimate of infarct size, and the distribution of infarcts of large or small size is CHF or CHF. Ensure no difference between ligated rats treated with antagonist and vehicle. precision Confirm by infarct size measurement. 3. Administration of CHF or CHF antagonist 4 weeks after surgery, CHF or CHF antagonist (10 μg / kg to 10 mg / kg) kg twice a day for 15 days) or saline base for ligation rats and sham controls Inject subcutaneously. Body weight is measured twice a week during treatment. CHF or CHF antagonist Is dissolved in saline or water as a base for administration. 4. Catheter mounting After treatment with CHF, CHF antagonist, or vehicle for 13 days, rats were pentobarbied. Anesthetize with sodium tar (50 mg / kg, ip). Catheter (PE5 PE10) bound to 0 was filled with heparin-saline solution (50 / U / mL), Insert into the abdominal aorta to measure arterial pressure and heart rate through the right femoral artery. A second catheter (PE50) is passed through the right jugular vein to measure right atrial pressure and saline. Insert into the right atrium for injection. Measurement of left ventricular pressure and contractility (dP / dt) For this purpose, a third catheter (PE50) is inserted into the left ventricle through the right carotid artery. temperature Thermistor catheter (Lyons M) for measuring cardiac output by the dilution method medical instrument, Sylmar, CA) into the aortic arch Enter. Bundle all catheters behind the neck with a stainless steel wire that runs subcutaneously, then Fix it. Following catheterization, all rats are placed in a private room. 5. Hemodynamic measurement One day after the catheter is installed, the thermistor catheter is installed in the microcomputer system. (Lyons / Medical / Instrument) Measure and measure the other 3 catheters with the Grass, Model, 7 polygraph (Gra CP-10 type with ss Instruments Inc., Quincy, MA) For pressure transmitter (Century Technology, Quincy, MA) connect. Mean arterial pressure (MAP), systolic pressure (SAP), heart rate (HR), right Atrial pressure (RAP), left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular mean pressure (LVMP), Left ventricular late diastolic pressure (LVEP) and left ventricular maximal pressure (dP / dt) Measure in restrained rats. To measure cardiac output, use 0.1 mL of isotonic saline through a jugular vein catheter at room temperature. Inject at one time. The thermodilution curve was recorded on a VR-16simultrace recorder (Ho Monitored by NYELLY, NY), the cardiac output (CO) count value was You get it. Beating volume (SV) = CO / HR; Cardiac index (CI) = CO / BW; systemic vascular resistance (SVR) = MAP / CI. After measuring these hemodynamic parameters, 1 mL of blood was passed through an arterial catheter. And collect. Serum was separated and stored at -70 ° C for CHF concentration and if desired. Various biochemical parameters are measured. At the end of this experiment, rats were treated with sodium pentobarbital (60 mg / kg) Anesthetize with and infuse the heart in diastole with an intraatrial injection of KCl (1M). heart Remove and remove the atrium and canal from the ventricle. 10% buffered forma by weighing the ventricles Fix in phosphorus. All experimental procedures are performed and managed by Genentech, Inc. before starting the study. Get committee approval. 6. Infarct size measurement Separate the wall of the right ventricle from the left ventricle. Divide the left ventricle into 4 parts from top to bottom You. A 5 μm section is taken, stained with Masson's trichrome stain, and mounted. Infarcted and non-infarcted Left ventricular endocardium and epicardial borders It is measured with a Ge Analyzer analyzer planimeter. Infarcted all 4 slices The peripheral and left ventricular margins separately for each epicardial and endocardial surface, and the total value is Expressed as the ratio of infarcted margin to left ventricular margin for each surface. These two ratios are averaged and displayed as a percentage of infarct size. 7. Statistical analysis Results are expressed as mean ± standard error. Two-way and one-way analysis of variation (ANO VA) is performed to assess differences in parameters between groups. Then the significance of the difference Is post hoc analyzed using the Newman-Keuls method. p <0.05 is significant. 8. result Mean body weight before and after treatment with CHF or CHF antagonist or vehicle is experimental It is not expected to differ between groups. The infarct size of the ligated rat is CH It is not expected to differ from the F or CHF antagonist treated groups. Administration of CHF or CHF antagonist at the above doses to ligated rats is a vehicle Increased and reduced ventricular contraction than that observed in treated sham controls and ligated rat controls. It is expected to improve cardiac hypertrophy by reducing tree vascular resistance. This expected result The result is that administration of CHF or CHF antagonist improves cardiac function in congestive heart failure. Prove that. However, administration of CHF or CHF antagonists in sham rats Probably at this dose except for a slight decrease in arterial pressure and peripheral vascular resistance It is not expected to significantly change cardiac function. Rat data here was found in horses, cows, humans, and other mammals Can be extrapolated if corrected for mammalian body weight according to veterinary and clinical techniques It is reasonable to expect that. Veterinarians using standard experimental designs and methods Or the clinician may choose to use CHF or C to achieve the best effect on the mammal to be treated. The dose, dosage regimen and form of the HF antagonist can be adjusted. This is also for humans Believed to react in a manner. Example III Proposed clinical treatment for dilated cardiomyopathy A. Treatment policy Initial dose of CHF or CHF antagonist 10-150 μg / kg / day Propose to give. If there are side effects, reduce the dose. No useful results during reassessment The dose is increased if there are no limiting side effects. Concurrent dosing (eg ACE inhibition) Captopril and diuretics as agents are adjusted at the discretion of the research physician. maximum After administration of the dose for 8 weeks, the administration of CHF or CHF antagonist was stopped, and the similar treatment was not performed. Reassess after the period (or placebo).B. Transfer judgment criteria Patients will be considered for control if the following criteria are met: -Dilated cardiomyopathy (DCM). Contrast ventriculography or 2D echocardiography And idiopathic DCM that does not include isolated regions of akinesia / dyskinesia in the left ventricle (LV), Is ischemic DCM. LV end-diastolic dimension (EDD)> 3.2 cm / m²B EDV> 82mL / m by SA or 2D echocardiography², Echocardiography Partial shortening of LV <28%, or excretion rate (contrast ventriculography or radiation Evidence of systolic dysfunction including nuclide angiography) <0.49. -Signs. At least 1 for digoxin, diuretics and vasodilators (ACE inhibitors) Monthly stable New York Heart Association class III or best exercise VO₂<16 mL / kg / min (adjusted by age). -Currently undergoing ACE inhibitor treatment. -A suitable echocardiographic "window" from which left ventricular volume and weight can be estimated. -Self-administer CHF or CHF antagonist according to the dosing regimen and follow up reliably. Ability to return for trace evaluation. -Consent to the participation of the patient and his first visit physician. -The absence of compliance with the exclusion criteria.C. Exclusion criteria Patients are excluded from consideration for any of the following reasons: -Dilated cardiomyopathy due to heart valve disease (regardless of surgery), specific treatment possible Nosocomial etiology (including alcohol that has not been attempted to be withdrawn) or operable coronary motion Pulse disease. -Motion restriction due to certain back pain or obstructive peripheral vasculopathy. -Chronic obstructive pulmonary disease. -Diabetes or impaired glucose tolerance. -History of carpal tunnel syndrome or evidence of positive Tinel sign on examination. -History of kidney stones. -Signs of osteoarthritis. -A series of bicycle ergometry with invasive hemodynamic monitoring (as described below) Inability to consent to or participate in. -Active malignancy.D. Patient evaluation 1) Main evaluation points: baseline; for post-peak stable CHF or CHF antagonists Amount continued for 8 weeks; after-equal period after discontinuation of medication. -Patients are hospitalized for 2 to 3 days after the start of the actual treatment, daily with weight and electrolytes, phosphorus, Will collect test data including BUN, creatinine, and glucose. You. This is followed by daily observation for 2 or 3 more days at the floor of the laboratory. i. Physical fitness measurement. ii. Symptom evaluation score (Kelly et al., Amer. Heart. J., 11 9: 1111 [1990]). iii. Clinical test items: CBC; electrolyte (Mg⁺²And Ca⁺²); B UN; Creatinine; Phosphorus; Fasting glucose and lipid characteristics (total cholesterol , HDL-C, LDL-C, triglyceride); liver function test (AST, ALT, Alkaline phosphatase, total bilirubin); total protein; albumin; uric acid; and And CHF. iv. 2D, M-Mode, and Doppler Echocardiography: Papillary Muscle Level Diastolic and systolic dimensions in the abdominal cavity; Estimated ejection fraction evaluated by area measurement, systole by the method of Simpson's law, and Estimated diastolic volume and estimated left ventricular volume; mitral valve inflow characteristics (IVRT, peak) E, peak A, bradycardia time, A wave time), and pulmonary venous flow profile (systole) Flow area, diastolic flow area, reverse time, and velocity) Doppler evaluation; v. Resting and exercise hemodynamics and percutaneously inserted pulmonary artery and arterial catheter Oxygen consumption measurement using bicycle ergometry on tell. The detected level of exercise is B recorded on the org scale, systolic, diastolic and mean pressure of pulmonary artery and arterial pressure And pulmonary capillary wedge pressure, arterial and mixed venous oxygen content at each stage of exercise Measure with volume to calculate cardiac output. vi. Evaluation of fat and lean body mass and skeletal muscle strength and endurance. 2) Mid-term score: weekly i. Physical fitness measurement. ii. The score of the symptom point. iii. Laboratory data: electrolyte, BUN, creatinine, phosphorus, fasting glue Course, somatomedin-C, and CHF.E. FIG. Possible benefits 1) Improvement of feeling of satisfaction. 2) Increased exercise allowance. 3) Increased muscle strength and lean body mass. 4) Decrease in systemic vascular resistance. 5) Enhancing cardiac performance. 6) Enhancement of complementary myocardial hypertrophy. Example IV In vitro neurotrophic activity test Assay for Ciliary Ganglion Neurotrophic Activity, Leung, Neuron, 8:10 45 to 1053 (1992). In short, E7-E Ciliary ganglia were dissected from 8 chicken embryos and trypsin-EDTA (Gibco. 15400-013), and 10 times in phosphate buffered saline at 37 ° C for 15 minutes. Diluted. Growth medium (10% fetal bovine serum, 1.5 mM-Glutamine, Penicillin 100 μg / mL, and Streptomyces High glucose D-MEM supplemented with 100 μg / mL of syn) was washed 3 times, and then grown. A 1-cell suspension was prepared by gently stirring in 1 mL of the medium. Saw in 5 mL of growth medium The above cell mixture was plated on a 100 mm tissue culture dish and incubated at 37 ° C for 4 hours. The neurons were enriched by placing them in a woven culture incubator. Non-neurons during this The cells preferentially attach to the dish, and at the end of the incubation the neurons slowly Washed. The enriched neurons were then plated in 96-well plates pre-coated with collagen. I plated. 1000 to 2000 cells were placed in each well, and Example I was used. Pchf. 781-final volume diluted with conditioned medium from 293 cells with gene transfer The volume was 100 to 250 μL. Cells with control gene transfer 293 conditioned medium Both, and with the CNTF standard as a comparison. 2 to 4 days at 37 ° C After incubation with, the live dye metallothionein (MTT) was used to Viable cells were stained to assess the number of viable cells. MTT (Sigma / M2128) 5 One fifth volume of mg / mL was added to the wells. Incubate at 37 ° C for 2-4 hours Viable cells (filled with dark purple sediment) after the Was counted. The result of this test is shown in FIG. pchf. 781 gene transfer (triangle) is gene transfer Survival of neurons with increasing reciprocal of assay volume of 293 conditioned medium (measured by cell number Can be recognized to increase. This is similar to the pattern of the CNTF standard (circle) Control transfection showing no increase in viability as a function of assay volume of conditioned medium In contrast to (square). This is similar to that observed with CNTF in CHF It has an effect and is shown to be useful as a neurotrophic agent. Example V Human CHF (also called human cardiotrophin-1 [CT-1]) The source of the mRNA to be cloned was constructed with a probe from mouse CHF cDNA clone. It was confirmed by searching poly (A) + RNA from several human tissues. Heart, skeletal muscle, colon, Ovary and prostate are 20% formamide, 5xSSC, 180bp at 42 ° C. A mouse CHF probe (19 bp 5'starting ATG to amino acid 50) Lot hybridized and finally washed at 0.25 x SSC, 52 ° C. An 8 kb band was shown. Human heart with the same probe and conditions (final wash 55 ° C) Human C by searching a cDNA library (Clontech) A clone encoding T-1 was isolated. Eleven clones were selected from 1 million. Several EcoRI inserts of this clone The insert was subcloned into a plasmid vector and its DNA sequence was determined. DNA sequence from clone h5 (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7: sense and The antisense strand) is shown in Figure 5 and includes the entire coding region. clone h5 (pBSSK + .hu.CT1.h5) was published by Amer on July 26, 1994. ATCC No. 75 in ican ・ Type ・ Culture ・ Collection Deposited as 841. The DNA sequence of another clone, designated h6, was cloned. In the overlapping region, it coincided with that of h5. Clone h6 is base 4 of clone h5 It starts from 7 and extends up to 521 bases 3'of clone h5. From Figure 6 As is apparent, the sequence encoded in the protein encoded by human CT-1 (SEQ ID NO: 8) is mouse. 79% identical to the CHF sequence (SEQ ID NO: 3), the former being "humct1", The latter is named "chf.781". Demonstration that human CT-1 encoded by clone h5 is biologically active To obtain the EcoRI fragment, the mammalian expression vector pRK5 (European Patent 3072 47) and cloned into the unique EcoRI site of plasmid pRK5. hu. I got CT1. This plasmid was transferred into human 293 cells and the cells were serum-free. The medium was maintained for 3 to 4 days. This medium is then used for cardiomyocyte hypertrophy in mice Assayed for CHF as described above. The gene-transferred 293 conditioned medium is It was clearly active in this assay (hypertrophic score 5.5 at 1:20 dilution).Material Deposit The following plasmids were used for American, Type, Culture, and Colle. action, 12301, Parklawn, Drive, Rockville, MD, Deposited in the United States (ATCC). This deposit is of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Procedure. It was done in accordance with the regulation and the rules below (Budapest Treaty). This is Guarantee the maintenance of the viable culture of the deposit for 30 years from the date of deposit. This deposit is related Issuance of a U.S. patent or publication of a U.S. or foreign patent, whichever comes first. After the ATCC, the Budapest Treaty provisions and Genentech and AT Under the contract with CC about the progeny of the deposit culture, perpetual and unlimited to the public Guaranteeing availability, US Patent Law Section 122 and US Patent and Trademark Office Commissioner Regulations (Including Article 37 CFR 1.14, which refers to the Gazette of Japan, Vol. 886, Item 638) Guarantee the availability of descendants of the deposit to anyone determined by the Commissioner of the National Patent and Trademark Office. The assignee of the present application, if the deposited plasmid culture was cultivated under suitable conditions In the event of death, loss, or destruction, the plasmid may be replaced with the same plasmid if informed. Agree to quickly exchange for another Sumid. Deposited plasmid available Consent to the practice of the present invention, which infringes the right of each government to be granted by the authority of its patent law Should not be understood as doing. The above specification is considered to be sufficient for a person skilled in the art to practice the present invention. The deposited embodiment is merely illustrative of one aspect of the invention, and is a functionally equivalent construct. Is intended to be within the scope of this invention, the present invention is It is not limited in scope by the constructed construct. It is true that this material was deposited Inappropriate to practice any aspect of the invention, including the detailed description, including its best mode Does not constitute a confession of claim and claims to the particular examples it presents. It should not be understood as limiting the scope of the section. In fact, in addition to this disclosure and description, Various modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and various modifications of the invention. The decoration is within the scope of the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/02 21/08 7823−4Ｂ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＣＧ０１Ｎ 33/53 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者ベイカー，ジョフレアメリカ合衆国94018カリフォルニア州エル・グラナダ、アベニュー・カブリロ 239番 (72)発明者チェン，ケネスアメリカ合衆国92037カリフォルニア州ラ・ジョラ、カレ・ベラ・クルズ6232番 (72)発明者キング，キャスリーンアメリカ合衆国94044カリフォルニア州パシフィカ、カーメル・アベニュー239番 (72)発明者ペニカ，ダイアンアメリカ合衆国94010カリフォルニア州バーリンゲイム、ホール・ドライブ2417番 (72)発明者ウッド・ウィリアムアメリカ合衆国94402カリフォルニア州サン・マテオ、タリータウン・ストリート 1400番─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C12P 21/02 7823-4B C12Q 1/02 21/08 7823-4B 1/68 A C12Q 1/02 0276-2J G01N 33/53 D 1/68 9282-4B C12N 15/00 C G01N 33/53 9282-4B 5/00 B // (C12P 21/02 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP, MX (72) Inventor Baker, Joffre United States 94018 California EL・ Granada, Avenue Cabrillo No. 239 (72) Inventor Chen, Kenneth United States 92037 La Jola, California Carella Bella Cruz No. 6232 (72) Invention King, Kathleen United States 94044 Carmel Avenue, 239 (72) Pacifica, CA Inventor Penica, Diane United States 94010 Hall Drive, 2417 (72) Burlingame, CA Inventor Wood William United States 94402 Sun, CA Mateo, 1400, Tarrytown Street

Claims

[Claims] 1. Separated CHF (but not rat CHF). 2. The CHF of claim 1 having a molecular weight of about 21-23 kD on reducing SDS-PAGE. 3. The CHF of claim 1, which shares at least 75% sequence identity with the translated CHF sequence shown in FIG. 4. The CHF of claim 1, which shares at least 75% sequence identity with the translated CHF sequence shown in FIG. 5. The CHF of claim 1, which is a mature human CHF having the translated CHF sequence shown in FIG. 6. An isolated antibody capable of binding to the CHF of claim 1. 7. A hybridoma cell line producing the antibody of claim 6. 8. A method for detecting CHF, which comprises contacting the antibody of claim 6 with a sample or cell suspected of containing CHF and detecting whether binding has occurred. 9. A method for purifying CHF, which comprises passing a mixture of CHF through a column having the antibody of claim 6 bound thereto. 10. An isolated nucleic acid molecule encoding the CHF of claim 1. 11. An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of the open reading frame shown in FIG. 12. An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence of the open reading frame shown in FIG. 13. (A) A cDNA clone containing the nucleotide sequence of the coding region of the CHF gene shown in FIG. 1; (b) a DNA sequence capable of hybridizing with the clone of (a) under stringent conditions; and (c) (a) A) a gene variant of any of the DNA sequences of (1), which is isolated from rat CHF selected from the group consisting of: (d) a polypeptide encoding a polypeptide having the biological properties of a natural CHF polypeptide. Nucleic acid molecule. 14． (A) A cDNA clone containing the nucleotide sequence of the coding region of the CHF gene shown in FIG. 5; (b) a DNA sequence capable of hybridizing with the clone of (a) under stringent conditions; and (c) (a) Isolated from a rat CHF selected from the group consisting of (d) a polypeptide encoding a polypeptide having the biological properties of a natural CHF polypeptide. Nucleic acid molecule. 15. An isolated DNA molecule having a sequence capable of hybridizing to the DNA sequence provided in Figure 1 under moderately stringent conditions, the biologically active CHF polypeptide being other than rat CHF. A DNA molecule that encodes. 16. An isolated DNA molecule having a sequence capable of hybridizing to the DNA sequence provided in Figure 5 under moderately stringent conditions, the DNA molecule being a biologically active entity other than rat CHF. Those encoding a CHF polypeptide. 17． The nucleic acid molecule of claim 10, further comprising a promoter operably linked to the nucleic acid molecule. 18. The nucleic acid molecule of claim 10 which is DNA and comprises the translated DNA sequence shown in FIG. 19. The nucleic acid molecule of claim 10 which is DNA and comprises the translated DNA sequence shown in FIG. 20. The nucleic acid molecule according to claim 10, which is labeled. 21. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 10. 22. An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 10 operably linked to a control sequence recognized by a host cell transformed with the vector. 23. A host cell comprising the nucleic acid molecule of claim 10. 24. A method of using a CHF-encoding nucleic acid molecule for the production of CHF, comprising culturing the host cell of claim 23. 25. 25. The method of claim 24, wherein CHF is recovered from the host cell. 26. 25. The method of claim 24, wherein CHF is recovered from the host cell culture medium. 27. 25. The method of claim 24, wherein the host cell is transfected with an expression vector containing a CHF nucleic acid molecule. 28. A method of determining the presence of a CHF nucleic acid molecule in a test sample comprising hybridizing the nucleic acid molecule of claim 10 to a test sample nucleic acid and determining the presence of CHF nucleic acid. 29. A method of amplifying a nucleic acid test sample comprising priming a nucleic acid polymerase chain reaction in the test sample with the nucleic acid molecule of claim 10. 30. (A) plating a 96-well plate with a myocyte suspension having a cell density of about 7.5 × 10 ⁴ cells / mL of D-MEM / F-12 medium containing insulin, transferrin, and aprotinin; (C) adding the test sample to the cultured cells; (d) culturing the cells with the test sample; and (e) testing the test sample for hypertrophic activity, including measuring hypertrophic activity. How to test.