JPH09512250A - 細胞移植体の隔離に用いる微小加工カプセル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、環状側壁（２２）と非常に薄い膜の外殻端面（２４と２６）を形成するのに充分な機械強度を有する生体適合性材料で製造されたカプセル（２０）であって、前記外殻端面が、所望の生物活性分子産物を通過させるのに充分に大きいがより大きなすべての免疫分子の通過を遮断するほぼ均一な大きさで均一な間隔をおいて配置された細孔を具備するカプセルを提供するものである。したがって、本発明は、中に入っている細胞移植体の免疫隔離を行うものである。また、本発明は、かようなカプセル（２０）の要素として使用できる自立性薄膜構造体、かようなカプセル（２０）の加工方法、および生物活性分子を宿主生物に投与するのにかようなカプセル（２０）を使用する方法を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞移植体の隔離に用いる微小加工カプセル 関連出願の相互参照 本願は、１９９４年３月７日出願の米国特許願第０８／２０７，４５９号およ び１９９４年３月７日出願の米国特許願第０８／２０７，４５７号の一部継続出 願である。 発明の背景 本発明は、概しては、微小加工カプセル（microfabricated capsule）に関し 、さらに詳しくは、細胞移植体の免疫隔離（immunological isolation）に用い る微小加工多孔質カプセルに関する。 医学研究者達は、免疫隔離を行うために微小被包の概念が有効であることを実 証してきた。哺乳類内でインスリンを産生するランゲルハンス島は、異なる種の 間で移植されている。例えば、ブタのランゲルハンス島は、インスリンを産生さ せるため糖尿病のイヌに移植されている。しかし、これら無防備のランゲルハン ス島は、宿主の免疫系がそのドナー細胞を殺すまでの短期間しか機能しない。 免疫系の巨大分子から保護するためにランゲルハンス島を被包すると、ドナー 細胞の生存が延長されることが報告されている。各種の被包手段を使用すること によって、イヌにおける、ブタのランゲルハンス島からのインスリンの産生は、 １００日以上も維持された。 今までの被包方法では、アモルファス有機ポリマーの半透膜、一体焼結粒子（si ntered together particle）および相互に組合わせたセラミックニードル（inte rmeshed ceramic needle）が使用されている。しかし、これらのカプセルの耐用 寿命は、せいぜい１００日間に限定されるという重大問題に遭遇している。 既存のカプセルの二つの主な問題点は、機械強度が不足していることおよび細 孔の大きさと分布の制御が不充分なことである。具体的に述べると、有機膜のカ プセル壁の厚みが、必要な機械強度を与えるために増大すると、分子は、必要な 時に適切な生理的応答を提供するため充分迅速に、カプセル壁を通って拡散する ことができない。さらに、一体焼結粒子またはアモルファスポリマー膜の場合の ように、細孔の大きさと分布を制御できないとき、細胞が大きすぎるとかまたは オーバーラップする確率が高いので、免疫巨大分子がカプセル中に入るのに十分 に大きな開口を提供することがある。 改良されたカプセルは、機械強度、ならびに酸素、水、二酸化炭素およびグル コースなどのような小分子は自由に拡散することができ、一方、免疫グロブリン 類および主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原類などのような一層大きい分子の通過を 防止する性能を兼ね備えていなければならない。また、ドナー細胞が産生するイ ンスリンのような中間の大きさの分子産物は、必要な代謝機能を提供するのに充 分な速度で宿主中に拡散できなければならない。このような用具は、現在利用で きるカプセルより長期にわたる耐久性がある代替品を提供し、そして免疫反応が 起こらないように、移植された細胞を物理的に隔離するという単純な方法によっ て、拒絶反応制御剤の必要がなくなる。その結果、任意の起源からの細胞を任意 の宿生に移植することができる。受容者に対するドナーの組織適合性は重要でな い。 理想的な構造体は、所望の生物活性分子産物を通過させるのに丁度充分に大き く、一方、より大きいすべての免疫分子の通過を全く遮断する均一な大きさでか つ均一な間隔をおいて配置された細孔を具備する少なくとも一つの領域を有する 非常に薄い膜を形成するのに充分な機械強度をもっている生物適合性材料で製造 されたカプセルである。このような構造体は、アモルファス分子構造を有するポ リマーから、一体焼結粒子または相互に組合わせたセラミックニードルでは製造 できない。 したがって、本発明の目的は、所望の活性分子産業物を通過させるのに充分に 大きく、一方より大きなすべての免疫分子の通過を遮断して中に入っている細胞 移植体の免疫隔離を行うほぼ均一な大きさでかつほぼ均一な間隔をおいて配置さ れた細孔を内部に具備する少なくとも一つの領域を有する薄い膜外殻を形成する のに充分な機械強度をもっている生物適合性材料で製造されたカプセルを提供す ることである。 本発明の他の目的は、このようなカプセルの要素として使用することができる 自立性（free-standing）薄膜構造体を提供することである。 本発明の他の目的は、このような要素およびかようなカプセルの加工方法を提 供することである。 本発明の他の目的は、このようなカプセルに充填する方法を提供することであ る。 本発明のさらに他の目的は、かのようなカプセルに充填する装置を提供するこ とである。 本発明のさらに他の目的は、生物活性分子の内因性産生が不足している宿生生 物に前記生物活性分子を、かようなカプセルを用いて 投与する方法を提供することである。 本発明のその外の目的と利点は、以下の説明で述べるが、一部分は該説明から 自明であろうし、または本発明を実施することによって分かるであろう。本発明 の目的と利点は、特許請求の範囲に特に指摘されている手段および組合せによっ て実現され、そして得ることができる。 発明の概要 本発明は、封入カプセルを提供するものである。本発明のカプセルは、無機材 料で構成された外殻を有し、その外殻中に予め決められた、ほぼ均一な大きさと 分布を有する細孔を具備する少なくとも一つの多孔質領域を有している。その外 殻は、カプセルの内部と外部の間の選択分子バリヤーを提供している。 また、本発明は、かようなカプセルの要素として用いることができる、自立性 薄膜構造体も提供するものである。 また、本発明は、少なくとも一つの開口を有する構造体またはカプセル外殻用 に基板でモールドを作製し、そのモールドを犠牲層（sacrificial layer）でコ ートし、次いでモールドが満たされるまで、犠牲層上に薄膜を成長させることに よる、かような構造体およびカプセルの製造方法を提供するものである。次に犠 牲層を除去することによって、完成された構造体をモールドから取り出すことが できる。 構造体が、封入カプセルの外殻のような一層複雑な構造体の部分を形成しなけ ればならない場合、犠牲層を除去してモールドから外殻を取出す前に、追加の要 素を外殻上に形成させてもよい。次に、 前記外殻で画定される空間内に入れるべき物体を中に入れ、次いで前記外殻の開 口を微小加工薄膜メンブレンフィルタでカバーする。 また、本発明は、大きさが前記物体より大きいカプセルの開口を通じて、カプ セル内に入れるべき前記物体を含有する流体流を生成させ、次いで上記第一流体 流から、カプセルの該開口を通過する第二流体流を生成させることによる、封入 カプセルに充填する方法を提供するものである。このようにして、第一流中の物 体は第二流によってカプセル中に導入される。 封入カプセルに充填する装置も本発明によって提供される。この装置は、複数 の流体アクセスポートを有する空中ハウジングおよび部分的に完全な多孔質封入 カプセルを保有する底部が多孔質の空洞を有するトランスファウエハ（transfer wafer）をハウジング内の全面に取付けて、ハウジングを第一領域と第二領域に 分割する手段を備えている。また、この装置は、ハウジング内の第一流体アクセ スポートによってハウジングの第一領域に接続された第一ポンプとリザーバ、そ れにハウジング内の第二流体アクセスポートによってハウジングの第二領域に接 続された第二ポンプも備えている。カプセル中に入れるべき物体を含有する溶液 は、上記リザーバ内に入れ第一ポンプによって第一領域に供給される。第二ポン プは、多孔質カプセルとウエハを通じて第一領域から第二領域へ流体流を生成し て、大きすぎてカプセルの細孔を通過できない、溶液中の物体をカプセルに充填 する。 さらに、本発明は、マイクロカプセル内で生理的に望ましい速度で産生される 生物性分子を拡散することができるが、マイクロカプセルの外側に存在する免疫 分子の通過を防止するように制御された予め決められた細孔の大きさを有する無 機の生体適合性マイクロカ プセルを提供することによって、宿生生物に生物活性分子を与える方法を提供す るものであ。したがって、このマイクロカプセルに、所望の生物活性分子を産性 できる細胞、組織または医薬組成物を充填し、次いで宿生生物に投与される。 図面の簡単な説明 本明細書に組みこまれて本発明書の一部を構成する添付図面は、本発明の好ま しい実施態様を図式的に示し、そして本発明の上記概要説明とともに、下記の好 ましい実施態様の詳細な説明は、本発明の原理を説明するのに役立つ。 図１Ａは、本発明の封入カプセルの概略斜視図である。 図１Ｂは、本発明のカプセルの端面を形成する微小加工フィルターの概略図で ある。 図２Ａ〜２Ｇは、本発明の加工工程の第一ステップを示す概略断面図である。 図２Ｈ〜２Ｊ、図２Ｌ〜２Ｏおよび図２Ｑは、本発明のカプセルの加工工程の 早期段階を示す概略斜視図である。 図２Ｋは、基板ウエハにエッチングされ、プラグされかつ保護された孔の概略 断面図である。 図２Ｐは、仕上げられた構造体をモールドから水力で突出するのに有用な、モ ールドウエハの背後に光電化学的にエッチングされた長くて小直径の経路の概略 断面図である。 図２Ｒは、本発明のカプセルの補強側壁構造体を示す概略断面図である。 図３Ａ〜３Ｈは、本発明のフィルタ端面の加工ステップを示す概 略断面図である。 図３Ｉは、本発明の、構造支持部材に取り付けられた完成フィルタ端面と、カ プセル側壁（図示せず）の頂部の概略斜視図を示す。 図３Ｊは、本発明のフィルター端面の、カプセル内から見た底部を示す。 図３Ｋは、図３ＩのＡ−Ａ線断面図を示し、本発明のフィルター端面を形成す る二つの構造層間の接続部を示す。 図４Ａ〜４Ｃと図４Ｅ〜４Ｇは、本発明のカプセルの加工工程の後期段階を示 す概略断面図である。 図４Ｄは、本発明のカプセル充填装置の概略断面図である。 好ましい実施態様の説明 本発明を好ましい実施態様によって説明する。これら実施態様は、微小加工さ れた封入カプセルまたはマイクロカプセル並びにその加工方法である。また、こ のようなカプセルを加工するのに有用な、自立性のすなわち基板に取り付けられ ていない、垂直アスペクト比が高い薄膜構造体、およびその加工方法も説明する 。微小加工封入カプセルに充填する方法と装置、およびそのカプセルを生物学的 治療に用いる方法も説明する。 本発明の封入カプセル２０を図１Ａに示す。カプセル２０は、環状側壁２２、 構造支持部材すなわちリブ２５および多孔質端面２４と２６を具備する直円筒で ある。細胞、組織または医薬組成物２８はカプセル２０の管腔２９中に入ってい る。カプセル２０は、直径Ｄが約１０ミクロン〜約２０００ミクロン以上であり 、高さＨが約１０ミクロン〜約１０００ミクロンである。 端面２４と２６は、出願人が本願と共通の譲受人であり１９９４年３月７日に 出願された標題が「ＭＩＣＲＯＦＡＢＲＩＣＡＴＥＤ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＦＩ ＬＴＥＲ」の米国特許願第０８／２０７，４５７号に記載されているような微小 加工粒子フィルターでもよい。なお、この出願明細書は、全体を本明細書に援用 するものである。 このようなフィルターの一実施例を図１Ｂに示す。ほぼ均一に分布した入口経 路１０６が、フィルター（カプセルの端面）２４内の非常に狭いほぼ均一な大き さの細孔チャンネル１２４に通じている。これらの細孔１２４は、水およびグル コースなどの小分子は矢印１２２で示すようにカプセル端面２４と２６を通過し て自由に拡散できるが、免疫グロブリン類などのような大きな巨大分子を遮断で きるようにフィルターの加工工程で大きさを選択して加工される。これらの細孔 は、約１５オングストローム（Ａ）幅から約１０００Ａ以上の幅で形成される。 インスリンなどのような中間の大きさの分子は、生理的に望ましい速度で、カ プセルの端面２４と２６を経過して拡散することができる。図に示すように、ラ ンゲルハンス島または医薬組成物のような、インスリンのごとき所望の生物活性 分子を産生する、細胞、組織または医薬組成物２８が、カプセル２０の管腔２９ 内に入っている。 約６０ミクロンまでの高さを有する側壁２２とリブ２５は、本願に記載の方法 、または出願人が本願と共通の譲受人であり１９９４年３月７日に出願された標 題が「ＨＩＧＨ ＶＥＲＴＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴ ＲＡＴＩＯ ＴＨＩＮ Ｆ ＩＬＭ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ」の米国特許願第０８／２０７，４５９号に記載 の方法によって加工することができる。なお、この出願明細書は、全体を本明細 書に援用するものである。 側壁２２と構造部材２５を形成する薄膜は、厚みが約１〜約６ミクロンである が、構造上の要求によっては、厚みが約１０〜約５０ミクロン以上の補強された 側壁２２と支持構造体２５が形成される。補強材２３を有する側壁２２を図式的 に示す例を図２Ｒに示す。 本発明のこのような構造体用のモールドを加工する最初のステップを図２Ａ〜 ２Ｇと図２Ｈに示す。図２Ａに示すように、ｎ型（１００）シリコンウエハのよ うな適切な基板３１を、例えば化学蒸着のような方法で、０．２〜１ミクロン、 好ましくは０．５ミクロンのシリコンリッチの窒化ケイ素３３ａと、０．２〜１ ミクロン、好ましくは０．５ミクロンのシリコン３３ｂのマスキング層３３でコ ートする。可能性がある他のマスキング層としては、シリコン、二酸化ケイ素、 炭化ケイ素およびその組合せがある。 図２Ｂと２Ｃに示すように、マスキング層３３を回転霧化塗布された（spin-a pplied）ホトレジスト３９でコートする。このホトレジスト３９は、マスク３３ を露出する、レジスト３９中の約１〜６ミクロン幅の一連のせん孔３２として、 構造支持部材２５（図１Ａ）に対する所望の形態３０（図２Ｈ）のモールドキャ ビティをホトリソグラフィでパターン付けする。 図２Ｄに示すように、次に、せん孔３２で画定されるマスク３３の露出部分が プラズマエッチングされ、せん孔３２が窒化ケイ素層３３ａまで延びる。ホトレ ジスト３９を除去し、次にそのウエハ３１を酸化炉に入れて、図２Ｅに示すよう に露出シリコン３３ｂ上に熱酸化物層３３ｃを成長させる。次にウエハ３１をプ ラズマエッチングを行い、せん孔３２をシリコンウエハ３１の表面まで延ばす。 図２Ｆは、このステップが完了したことを示す。マスク３３に異な る組成の各種の層３３ａ、３３ｂおよび３３ｃが使用されている。というのは、 これらの各層が、加工工程の各種段階で用いられる異なるエッチング法に耐える のに必要な適当な溶解特性を持っているからである。 図２Ｇに示すように、ウエハ３１の孔３４は、浅いピラミッド形ピット３４ａ のプラズマもしくは水酸化カリウム（ＫＯＨ）によるエッチングで開始され、そ のピットの末端頂点は、シリコンウエハ３１の（１１１）面で形成されている。 例えばウエハ３１は、２０〜８０℃、好ましくは６０℃の２０％ＫＯＨ水溶液中 に数分間入れる。孔３４は、この方式で開始される。というのは、ピラミッド形 のピット３４ａ、光電化学エッチングステップの電場を、孔３４（２１）の中央 部に集中させて、横方向のエッチングを最小にして最高のエッチング結果が達成 されるからである。図２Ｈは、この段階まで処理されたウエハの斜視図である。 図２Ｉによれば、モールドのこの部分で形成されるべき薄膜構造部材２５の所 望の厚みにより、小さい幅の孔３４は、次に、ウエハ３１内で光電化学的にエッ チングされ、エッチングされたピラミッドピット３４ａが延びる。孔３４は、構 造部材２５の所望の高さにほぼ等しい深さまでエッチングされる。約６００ミク ロン以上の孔の深さ、したがって構造体の高さは、著しい横方向のエッチングな しで本発明の方法で達成することができる。次に、そのウエハ３１を脱イオン水 で徹底的にすすぐ。 光電気化学エッチングは、以下のように実施することができる。可能な工程パ ラメータとしては、１ｃｍ²当り１０ミリアンペア（１０ｍＡ／ｃｍ²）のエッチ ング電流、１０％のフッ化水素酸（ＨＦ）濃度、白金カソードを使用することお よびウエハの背面す なわちパターン化面の反対側の面に光を照射することである。 図によれば、ウエハ３１内の浅くエッチングされたピラミッド形ピット３４ａ は、水素の泡の生成を抑制するため充分な過酸化水素などの酸化剤とともに３〜 １０％のＨＦ水溶液に暴露される。白金電極（図示せず）がＨＦ溶液中に配置さ れ、ワイヤ（図示せず）がウエハ３１の背面に接続されるが、この背面は該溶液 から隔離されている。ウエハ３１は、溶液中の白金電極に対して約３Ｖ正になっ ている。光は、ウエハ３１の背面に均一に照射される。その光は、フィルタ（図 示せず）を通過して、波長が８０００Åより大きいすべての光子を、ウエハ３１ に到達する前に除去する。光の明るさは、所望のエッチング電流が得られるよう に調節することができる。エッチング電流が大きければ大きいほど、孔３４の直 径が大きくなる。孔３４が所望の深さに到達したならば、エッチングを停止して ウエハ３１を脱イオンで徹底的にすすぐ。 孔３４が所望の深さに到達したならば、孔３４は、例えば、図２Ｊと２Ｋに示 すように、ウエハ３１を熱酸化することによって酸化物３５でプラグし、次いで 窒化ケイ素上にシリコンを重ねた保護コーティング３６でカバーする。 図２Ｌに示すように、次に側壁２２のパターン３７を、上記方法に従って、上 記の保護された端面保持構造体の孔３４の周りに第二系列の孔３８としてフォト リソグラフィでパターン付けする。次に、深さがより深い第二セットの孔４０を 先に述べたのと同じ方法に従って光電化学的にエッチングする。これらの孔４０ は、直径がカプセル２０の側壁２２の所望の厚みより小さく、かつ加工すべき薄 膜構造体４６（図２０）の所望の高さにほぼ等しい深さまでエッチングされる。 封入カプセルの場合、これは約５０〜約６００ミクロン が好ましい。 図２Ｌは、上記ステップに従ってウエハ３１にエッチングされて二つの構造体 の深さを形成する孔３４と４０をすべて示す。図３Ｍでは、浅い方の孔３４上の 窒化物保護層をフッ化水素酸もしくはリン酸またはプラズマエッチングで除き、 次いですべての孔３４と４０を繰返し交互に好ましくは熱によって酸化し、次に 好ましくは４９％のフッ化水素酸でエッチングを行って、これらの孔を合体して 、カプセル壁２２と支持部材２５のモールド４４を形成する連続した側壁のトレ ンチ４２と構造体リブのトレンチ４３にする。あるいは、等方性ウェットエッチ ング、例えば６５％の硝酸、３％のフッ化アンモニウムおよび３２％の水が使用 できる。 モールド４４の表面の粗さは、モールドウエハ３１を管形炉（tube furnace） に入れ、１１００℃で２．５時間湿潤酸化を行って１ミクロンの酸化物を成長さ せることによって平滑にすることができる。次に、これは４９％のフッ化水素酸 のエッチングによって完全に除去することができる。あるいは、平滑化は、６５ ％の硝酸、３％のフッ化アンモニウムおよび３２％の脱イオン水の溶液（室温） を用いる時間制御された等方性エッチング（timed isotropic etch）で達成する ことができる。 モールドは、各種の形態と複雑さを有する構造体用に、本明細書に記載の方法 で製造することができる。例えば、製造される構造体の構造上の要求によっては 、側壁と支持構造体は補強してもよい。例えば、モールドは、図２Ｒに示すよう な補強材２３を具備する側壁２２を有する構造体を産生するよう上記のように製 造される。このような場合、モールドのパターンは、一定間隔をおいてブリッジ されている二つの同心円で構成されている。図２Ａ〜２Ｎに関連し て先に述べた方法に従って、孔がエッチングされトレンチが形成される。 図２Ｎに示すように、モールド４４が完成してから、モールドウエハ３１の表 面を、次の処理を行い易い平坦面にするため、ラッピングを行い、次いでポリッ シュする。ラッピングとポリッシュは、０．３ミクロンの凝集していないα−ア ルミナを含有するグリセリンのスラリーを塗布することによって達成することが できる。 その後、モールド４４は、犠牲層４５でライニングを行う。犠牲物質が必要な 場所には、一般に二酸化ケイ素の層を用いる。酸化物の犠牲層を作るのにいくつ もの方法を使用することができる。 ウエハ３１の熱酸化方法を使用することができる。しかし、この方法は、モー ルド４４のシリコンを消費するので、上記のようにエッチングされた表面を平滑 化するために１回しか行ってはならない。 したがって、好ましい方法では、５８０℃で６５Å毎分の速度で化学蒸着（Ｃ ＶＤ）されたポリシリコンを用い、次いでこの層を１１００℃での湿潤酸化方に よって酸化物に完全に変換する。この方法は、非常にコンフォーマルな（confor mal）コーティングすなわち基盤のトポグラフィーのいかんにかかわらず、厚み が均一なコーティングを生成し、モールド４４を消費しない。ＣＶＤポリシリコ ンは、堆積（デポジション）中にホスフィンで選択的にドープして、形成される 構造体に導電性領域を作ることができる。 他の可能性がある方法では、４５０℃で１４０Å毎分の速度でＣＶＤされ被膜 中に８％のリンを含有するホスホシリケートガラス（ＰＳＧ）または４５０℃で ＣＶＤされた末ドープの酸化物が用いられる。ＰＳＧは、比較的速いエッチング 層を提供する（４９％フッ化水素酸（ＨＦ）中、２０ミクロン（μｍ）毎分まで ）。これら の方法の組合せも使用できる。 犠牲層４５は、構造体の層がモールド４４と直接接触して堆積（デポジット） されてモールド４４に結合するのを防止するため、加工中必要である。加工の最 終ステップは、この物質をエッチングで除いて、完成した構造体をモールド４４ から取り外すステップである。 犠牲層４５を堆積させた後、モールド４４を、好ましくは化学蒸着（ＣＶＤ） によって、構造体４６を形成する適切な無機材料で満たす。その材料には、二つ の重要な要件がある。すなわち、その材料はコンフォーマルな堆積を行えなけれ ばならない、つまり基板のトポグラフィーのいかんにかかわらず全く空隙を残さ ずにモールド４４を完全にかつ均一に満たすことができなければならない、そし て構造体４６を外すため犠牲層４５をモールド４４から除くのに利用されるエッ チングステップに耐えることができなければならない。そのうえ、生体内での用 途に用いる封入カプセル２０の部分を形成するための構造体４６は、生物適合性 材料すなわち生組織に移植したとき全く副作用を起こさない材料で構成されてい なければならない。これらの材料の例としては、アモルファスで多結晶のシリコ ン、好ましくは（ＣＶＤ）ポリシリコン、窒化ケイ素およびタングステンがある 。また、これらの材料は、有機膜より機械強度が高いので、要求される高い拡散 速度が可能になるよう充分に薄く作ることができ、一方では充分に制御された細 孔の大きさと分布を提供する加工工程になじみやすい。このような材料で構成さ れたカプセルの膜、すなわち外殻は、１００Åと薄くそして高い拡散性と高い選 択性を同時に達成している点で、生細胞膜の性能に近づいている。 ＣＶＤ充填は、ポリシリコンによって、５８０℃で、約０．３９ ミクロン毎時の堆積速度、１００標準立法センチメートル毎分（ｓｃｃｍ）のシ ラン、３００ミリトルで行うことができる。 モールド４４の充填に続いて、ウエハ３１のラッピングとポリッシュを行って 表面を平坦面にし、次いで封入カプセルの場合、基板表面４９を選択的にエッチ ングして、多孔質端面２４のような他の要素を次に付加するため構造体の支持部 材２５と側壁２２の上面を露出させる。 次に、構造体４６をウエハ３１から外す。あるいは、構造体４６を以下に考察 するように、外す前に加工してもよい。酸化物の犠牲層４５をフッ化水素酸（Ｈ Ｆ）でエッチングして除くことによって取外しを行うことができる。この犠牲酸 化物は、完全な暗闇下で、約０．１％の濃度のトリトンＸ−１００のような界面 活性剤を含有する４９％ＨＦで溶解することができる。この界面活性剤は、外さ れたシリコン構造体の疎水性表面が互いに粘着して上記水溶液との接触が最少に なることを防止するため必要である。全表面に単分子層を形成するように充分な 界面活性剤が存在していなければならない。上記暗闇は、光子で誘発されるシリ コンのエッチングに対する予防措置である。 図２０〜２Ｐによれば、ウエハ３１をラッピングしポリッシュしてから犠牲層 ４５をエッチングすると、構造体４６がモールド４４の上面４９を越えて延びる 。ワックスのコーティングまたは疎水性両面テープのような粘着面５２を有する 平坦ウエハ５０を用いて、矢印５３で示したように、構造体４６をモールド４４ から持ち上げることができる。図２０は、モールド４４をコートしている犠牲層 ４５をエッチングした後、上記の方法によって構造体４６をモールド４４から取 り出しているところを示す。 完成した構造体４６をモールド４４から取り出す他の方法を図２Ｐに示す。図 ４４用の基板３１は、ｎ型（１００）ポリシリコンであり、背面５５からモール ド４４の厚い部分を貫通して通じている小直径の長い経路５４が、該当技術分野 で公知でかつ先に述べた方法によって光電化学的にエッチングされる。これらの 経路は、酸化物の犠牲層４５が取除かれた後、構造体４６を放出するのに用いら れる。その好ましい作動流体は、米国ミズーリ州６３１１８セントルイス、デカ ルブ３５００に所在するＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社から入手でき るトリトンＸ１００などの介面活性剤を０．１％含有する脱イオン水である。あ るいは、本発明によってモールド４４で加工された構造体４６、部分的に完成さ れたカプセル４８について図４Ａと４Ｂに示し、以下一層詳細に考案するように 、第二ウエハ６０に予めエッチングされた受取空洞６２中に直接突き出してもよ い。 構造体４６が封入カプセル２０のような一層複雑な構造の部材を形成すべき場 合、その構造体４６はモールド４４から取出す前にさらに加工される。図２Ｑに は、出願人が先に挙げた標題が「ＭＩＣＲＯ−ＦＡＢＲＩＣＡＴＥＤ ＰＡＲＴ ＩＣＬＥ ＦＩＬＴＥＲ」の米国特許願第０８／２０７，４５７号に記載されて いるような微小加工フィルタ端面２４を付加した構造体４６を有する部分的に完 成されたカプセル４８が示されている。カプセル２０を完成するため、第二のフ ィルタを残りの開放末端７０に取り付ける。 実施例として、フィルタは、図３Ａ〜３Ｈに示すように、以下のようにして構 造体４６と支持部材２５の露出部分に加工される。犠牲層１００を、図３Ａに示 すように、モールド基板３１の上面４９上に成長させて、完成されたフィルタを 基板３１から分離できるよ うにする。実施例として、二酸化ケイ素の２ミクロン厚の被膜を４５０℃で化学 蒸着によって堆積させる。このようにして、基板の露出面４９は、犠牲層１００ でコートされる。次に、その犠牲層１００を図３Ｂに示すように構造部材２５の 表面１０２と側壁（図示せず）が露出するまでエッチングする。 次に、図３Ｃに示すように、第一薄膜構造層１０４を犠牲層１００と表面１０ ２の上に堆積させ、次に図３Ｄに示すようにフォトリソグラフィでパターン付け し、次いでエッチングを行って孔１０６を形成させる。層１０４は、ＣＶＤで成 長させた２ミクロン厚のアモルファスのシリコン被膜である。層１０４は、表面 １０２に接触すると結合して構造体４６の一部になる。 図３Ｅに示すように、次に薄膜１０８を被膜１０４上に成長させ、細孔の形態 を画定する細孔犠牲層が設置される。この被膜の厚みは、フィルタの細孔の所望 の幅に等しく、典型的には５０〜３０００オングストロームである。被膜１０８ は、被膜１０４を酸化することによって成長させた二酸化ケイ素である。被膜１ ０８をホトリソグラフィでパターン付けし、次いでエッチングを行って下側の構 造体１０４の選択された領域１１０を露出させる（図３Ｋ参照）。これは、皮膜 １０４が提供しない細孔の壁を提供する第二構造層１１２に第一構造層１０４が 結合される領域である。 図３Ｆに示すように、第二構造層１１５が堆積される。第一構造層と同様に、 第二構造層は、ＣＶＤで成長させた２ミクロク厚のシリコン皮膜である。この層 の部分１１４は、皮膜１０４の孔１０６を満たしている。次ぎに、皮膜１１２を ホトリソグラフィでパターン付けし、次いでエッチングして第一構造層１０４の 上記の未エッチング部分に完全に適合する孔１１６を形成させ、図３Ｇに示す構 造体が得られる。 図３Ｈに示すフィルター端面２４を得るため、上記のように、構造層１０４と １１２をエッチングしない方法を用いて、犠牲層１００と１０８をエッチングす る。この実施態様の場合、これら犠牲層はやはり二酸化ケイ素で製造され、フッ 化水素酸を用いてエッチングされる。図３Ｈの矢印１２２は、生成したフィルタ ー２４の細孔１２４を通過するために通行しなければならない曲った経路を示す 。上記細孔の幅は、約１５オングストローム以上である。上記細孔の長さは、孔 １２６と１２８が互いに接近しかつ第一構造層が十分に薄い場合、１ミクロンと 短い。 図３Ｈの実施態様では、第二構造層１１２は、細孔犠牲層をつなぎ留める孔１ １０を提供することによって第一構造層１０４につなぎ留めた（図３Ｋ）。これ によって、図３Ｆに示すように、第二構造層１１２を堆積する前の第一構造層１ ０４の上面が露出する。このつなぎ留め法の多くの変形が本発明の範囲を逸脱す ることなく可能である。このような代わりの方式は、構造層として用いられる異 なる材料の結合を最適化するのに用いることができる。 図３Ｉは、構造支持部材２５と側壁の頂部（図示せず）とに取り付けられた完 成フィルター端面２４の概略斜視図を示す。図３Ｊは、フィルター端面２４の底 部をカプセル２０の内側から見た図を示す。図３Ｋは、図３ＩのＡ−Ａ線断面図 であり、層１０４と層１１２の間の接続部を示す。 犠牲層４５をエッチングした後、構造体４６の外表面を、過フッ化ポリエーテ ルのような宿主生物の細胞が粘着しない有機層８９で処理する。 図４Ａは、部分的に成形されたカプセル４８を受け入れる大きさ の複数の空洞６２を有するトランスファーウエハ６０を示す。各空洞６２は、流 体が流通することができる多孔質領域６４をそのベース６６に備えている。この 多孔質領域６４は、以下に説明するように、部分的に成形されたカプセル４８を 空洞６２内に入れて保持するだけでなく、該カプセルに充填する役割を果してい る。 部分的に成形されたカプセル４８は、例えば図２Ｐについて先に述べた方法に 従って、矢印６８で示すように加えた水圧によって、基板ウエハ３１のモールド ４４から、トランスファーウエハ６０の空洞６２に移される。これらウエハの位 置合わせ（alignment）は、機械的取り付けジグ（図示せず）を用いて行うこと ができる。水圧はシリンジポンプで供給される。 図４Ｂは、部分的に成形されたカプセル４８の移転が完了した後のモールドウ エハ３１とトランスファーウエハ６０を示す。ここで、モールドウエハ３１は、 取り出して新しい側壁構造体４６を成形するのに使用することができる。 この時点で、側壁構造体４６と端面２４の内側を、細胞培養の技術分野の当業 者にとって公知の、ドナー細胞２８が粘着する有機層６９で処理してもよい。こ のような有機層としてはフィブリノーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンが ある。 図４Ｃと４Ｄは、以下に説明するように、部分カプセル４８に充填する方法と 装置を示す。モールドウエハ３１を取り出したならば、部分的に完成したカプセ ル４８を保有するトランスファーウエハ６０を充填装置６７の中に入れて固定す る（図４Ｄ）。装置６７は、複数の流体アクセスポート９０，９１および９２な らびにトランスファーウエハ６０を中空ハウジング７７内に固定するのに使用す るクランプまたはねじのような手段９３を具備する中空ハウジング７ ７で構成されている。トランスファーウエハ６０が固定されると、ハウジング７ ７は該ウエハの両側の二つの領域９４と９５に有効に分割される。 リザーバ７５を具備するポンプ７３（シリンジポンプでもよい）が、流体アク セスポートのうちの一つ９０によって、トランスファーウエハ６０内の部分的に 完成されたカプセル４８の開放末端７０に隣接する領域９４に接続されている。 第二ポンプ７９は、第二流体アクセスポート９１によって、トランスファーウエ ハ６０のベース６６に隣接する領域９５に接続されている。 例えば、ランゲルハンス島２８を含有する溶液７１をリザーバ７５内に入れ、 矢印９６で示すように、シリンジポンプ７３で生成した流体流によって領域９４ に供給される。第二ポンプ７９は、矢印９７で示すように、第一領域９４から第 二領域９５へ部分的に完成されたカプセル４８とトランスファーウエハ６０を通 過する流体流を生成させることができる。このようにして、ランゲルハンス島２ ８は、部分的に完成されたカプセル４８中に引き入れられる。残りの溶液７１は 、矢印９８で示すようにハウジング７７からポート９２を通じて流出し、溶液９ ９に収集される。 この工程は、図４Ｅに示すように部分カプセル４８が充填される９９．９％の 確率があるまで続けられる。この時点で、ランゲルハンス島２８の流れ９６に対 する供給を停止する。ランゲルハンス島の自由流れ９６と部分カプセル４８を通 過する流れ９７は、部分カプセル４８の管腔２９内にランゲルハンス島が留まり 、一方追加のランゲルハンス島２８は部分カプセル４８の開放末端７０から除か れるように維持される。 本願出願人の上記米国特許願第０８／２０７，４５７号の方法に よって製造されかつ端面２４について先に述べたような、端面２６を保有するキ ャップウエハ８０を、図４Ｆに示す。キャップウエハ８０は、例えば機械的取付 けジグ（図示せず）を用いて、トランスファーウエハ６０上の部分カプセル４８ の位置に合わせて配置する。次に、キャップウエハ８０を、例えば流れ７４の吸 込圧力によって、部分カプセル４８の開放末端７０を画定する側壁２２の末端８ ２に接触させる。また、端面２６は、側壁末端８２に向かい合った部分に、タン グステンまたはドープされたポリシリコンのような加熱することができる組成物 ８４を備えている。この組成物８４は、ポリエチレンのようなシーラント８６で カバーされている。 末端キャップウエハ８０が正常位置にあるとき、加熱組成物８４は、例えば、 無線周波または直流オーム加熱によって活性化され、カプセル２０の管腔２９中 に入っている生物学的要素を損傷することなく該組成物を溶融するのに充分な温 度までシーラント８６を加熱する。そのとき、シーラント８６は、端面２６を側 壁末端８２に結合してカプセル２０が完成される。あるいは、加熱組成物８４を 省略して、生物適合性接着剤で結合を行ってもよい。 最後に、図４Ｇに示すように、末端キャップウエハ８０を取り外し、次いで流 れ７４を矢印８８で示すように逆流させて完成されたカプセル２０を、トランス ファー６０から突き出す。 これらカプセル２０は、生物学的要素２８を宿主生物に投与するまで保管する ため、細胞培養の技術分野の当業者にとって公知のことであるが、適当な水性支 持媒体中に保持しなければならない。 宿主に対する投与は、カプセルに入れた生物活性分子産生因子、例えば細胞、 組織または医薬組成物によって提供される生物活性分子を宿主に与えるため、宿 主動物の適当な部位に、注射または外科 移植を行うことによって達成される。宿主は、動物であり、好ましくは哺乳動物 であり、最も好ましいのはヒトである。 いくつもの可能な構造体が本明細書に開示した方法にしたがって加工できるこ とは、当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。上記当業者は、本明細書 に記載の工程によってモールドを作るためシリコンウエハの基板に適当なホトリ ソグラフィのパターンを付けることによって、いくつもの構造体を製造すること ができることが分かるであろう。例えば、記載した方法に従って異なる形態のモ ールドを作ることによって、複数のカプセルが入っているシートのような構造体 を製造することができる。さらに、出願人は、本発明の方法が本明細書に記載さ れている封入カプセルの加工に限定されないと考えている。むしろ、カプセルは 、本発明の方法で製造される構造体の一実施態様にすぎず、本発明の方法は、微 小引張り試験器およびディスク駆動読取／書込ヘッドのような他の構造体の加工 にも利用できる。 まとめると、微小加工封入カプセル、構造体の要素、カプセルに充填する方法 と装置、およびカプセルの加工方法と使用方法を説明してきた。 本発明を好ましい実施態様によって説明してきた。しかし、本発明は、記載し た諸実施態様に限定されない。そうではなくて、本発明の範囲は、以下の特許請 求の範囲によって定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／２５４，３３０ (32)優先日 1994年６月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フェラーリ モーロ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94596 ウォルナット クリーク エクレ ストン 2815

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．制御された、ほぼ均一な大きさでかつほぼ均一に分布した細孔を有する少な くとも一つの多孔領域を有する自立性薄膜構造体からなるマイクロカプセル。 ２．無機材料から構成された外殻からなる封入カプセルであって、 前記外殻中の少なくとも一つの多孔領域が予め決められた、ほぼ均一な大きさ でかつほぼ均一に分布した細孔を有し、および 前記外殻が前記カプセルの内部と外部間の選択的分子バリヤーを提供する ことを特徴とする封入カプセル。 ３．さらに、前記カプセルに対し追加の構造体支持を提供するリブ部材を有する 請求の範囲２記載の封入カプセル。 ４．無機材料が生体適合性である請求の範囲２記載の封入カプセル。 ５．無機材料が、コンフォーマル堆積を行いかつフッ化水素酸のエッチングに耐 えることができる請求の範囲２記載の封入カプセル。 ６．無機材料が、多結晶シリコン、アモルファスシリコン、窒化ケイ素およびタ ングステンからなる群から選択される請求の範囲５記載の封入カプセル。 ７．前記多孔領域が微小加工された薄膜のメンブレンフィルタを備えてなる請求 の範囲２記載の封入カプセル。 ８．前記外殻が、環状壁と平坦な端面を有する直円筒である請求の範囲２記載の 封入カプセル。 ９．前記環状壁が高い垂直アスペクト比の薄膜からなり、そして前記端面の少な くとも一つが微小加工された薄膜のメンブレンフィルタからなる請求の範囲８記 載の封入カプセル。 １０．少なくとも一つの端面が、シーラントによって前記環状壁に結合されてい る請求の範囲９記載の封入カプセル。 １１．前記シーラントが生体適合性の高分子材料である請求の範囲１０記載の封 入カプセル。 １２．前記シーラントがポリエチレンである請求の範囲１１記載の封入カプセル 。 １３．細孔の大きさが、前記カプセルの内部で産生される生物活性分子の自由拡 散を許容するが前記カプセルの外部に存在する免疫分子の通過を防止する請求の 範囲２記載の封入カプセル。 １４．細孔の大きさが、約１０オングストローム〜約１０００オングストローム の範囲内である請求の範囲１３記載の封入カプセル。 １５．細孔の大きさが、約２０オングストローム〜約５０オングストロームの範 囲内である請求の範囲１４記載の封入カプセル。 １６．前記カプセルの内側をドナー細胞が粘着する第一有機層で処理し、そして 前記カプセルの外側を宿主細胞が粘着しない第二有機層で処理した請求の範囲１ ３記載の封入カプセル。 １７．前記カプセルが他の同じカプセルに結合されて複数の前記カプセルからな るシートが形成されている請求の範囲２記載の封入カプセル。 １８．少なくとも一つの開口を有する外殻用のモールドを基板に形成させ、 前記モールドを犠牲層でコートし、 前記モールドが満たされるまで、前記犠牲層上に薄膜を成長させ、前記犠牲層を 除去して前記外殻を前記モールドから取り出し、 前記外殻によって画定された空間内に、入れるべき物体を入れ、次いで 前記外殻の開口を微小加工された薄膜の膜フィルターでカバーすることを含んで なる封入カプセルの加工方法。 １９．前記物体が生物活性分子産生因子を含む請求の範囲１８記載の方法。 ２０．カプセルの側壁構造体を示す個別のせん孔のパターンを基板上のマスキン グ層にパターン付けし、 前記パターンに従って、前記基板に孔を光電化学的にエッチングし、 前記孔を酸化しエッチングを行って前記孔を合体させてモールドを形成させ、 前記モールドを犠牲層でコートし、 前記犠牲層上に薄膜を成長させて前記モールドを満たし、 前記側壁構造体の一露出端に、第一の微小加工薄膜のメンブレンフィルタを形成 し、 前記犠牲層をエッチングして前記の側壁構造体とフィルタを前記モールドから取 り出し、 前記の側壁構造体とフィルタによって画定される空間内に、生物活性分子産生因 子を入れ、次いで 前記の側壁構造体の一開放端に、第二の微小加工薄膜の膜フィルターを形成する ことを含んでなる封入カプセルの加工方法。 ２１．カプセル内に入れるべき物体を含有する第一流体流を、前記物体の大きさ より大きい、前記カプセルの開口を通じて生成させ、次いで 前記第一流体流から第二流体流を生成させて、前記第一流中の物体が前記第二流 によって前記カプセル中に導入される、 ことからなる多孔質封入カプセルに充填する方法。 ２２．複数の流体アクセスポートを具備する中空ハウジング、 部分的に完成した多孔質封入カプセルを保有し、底部が多孔質の空洞を具備する トランスファーウエハを、前記ハウジングの前面に固定して、前記ハウジングを 第一領域と第二領域に分割する手段、 前記ハウジングの第一流体アクセスポートによって、前記ハウジングの前記第一 領域に接続された第一ポンプとリザーバ、および 前記ハウジングの第二流体アクセスポートによって、前記ハウジングの前記第二 領域に接続された第二ポンプを備えてなり、 前記カプセル内に入れるべき物体を含有する溶液を前記リザーバ内に入れ、次い で前記第一ポンプによって前記第一領域に供給し、次いで 第二ポンプが、前記多孔質のカプセルとウエハを通じて前記第一領域から前記第 二領域へ流体流を生成させて、前記カプセルに前記溶液中の物体を充填する ことを特徴とする多孔質封入カプセルに充填する装置。 ２３．マイクロカプセル内の細胞、組織または医薬組成物が産生する生物活性分 子を生理的に望ましい速度で拡散できるが前記マイクロカプセルの外部に存在す る免疫分子の通過を防止するよう、制御された均一な細孔の大きさを有する無機 の生体適合性マイクロカプセルを提供し、 所望の生物活性分子を産性できる細胞、組織または医薬組成物を前記マイクロカ プセルに充填し、次いで 前記カプセル内に入れた前記細胞、組織または医薬組成物を宿主生物に投与する ことを含んでなる生物活性分子を宿主生物に与える方法。 ２４．前記生物が動物である請求の範囲２３記載の方法。 ２５．前記動物が哺乳動物である請求の範囲２４記載の方法。 ２６．前記哺乳動物がヒトである請求の範囲２５記載の方法。 ２７．自立性薄膜構造体を示す個別のせん孔のパターンを基板上のマスキング層 にパターン付けし、 前記パターンに従って、前記基板に孔を光電化学的にエッチングし、前記孔を酸 化しエッチングを行って前記孔を合体させてモールドを形成させ、 前記モールドを犠牲層でコートし、 前記犠牲層上に薄膜を成長させて前記モールドを満たし、 前記犠牲層をエッチングして前記側壁構造体とフィルターを前記モールドから取 り外す ことを含んでなる自立性薄膜構造体の加工方法。 ２８．請求の範囲２７の方法に従って加工された自立性薄膜構造体。