JPH09504703A - Arabinoxylan degrading enzyme - Google Patents

Arabinoxylan degrading enzyme

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JPH09504703A
JPH09504703A JP8508490A JP50849095A JPH09504703A JP H09504703 A JPH09504703 A JP H09504703A JP 8508490 A JP8508490 A JP 8508490A JP 50849095 A JP50849095 A JP 50849095A JP H09504703 A JPH09504703 A JP H09504703A
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デル ヴァウ モニーク ヨシナ アンドレア ファン
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グラーフ レーンデルト ヘンドリック デ
ヤコブ ヴィーセル
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ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ
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Abstract

(57)【要約】 選択された宿主細胞における、菌源のアラビノキシラン分解酵素のクローニング及び過剰発現の為の方法及び発現構造体が提供される。この酵素は、トウモロコシから得られる水不溶性固体の分解において活性であることが示される。この酵素は、動物の飼料組成物、人間の食品の調製又は工業的加工に使用出来る。   (57) [Summary] Methods and expression constructs for cloning and overexpression of arabinoxylan-degrading enzymes of bacterial origin in selected host cells are provided. This enzyme has been shown to be active in the degradation of water insoluble solids obtained from corn. The enzyme can be used in animal feed compositions, human food preparation or industrial processing.

Description

【発明の詳細な説明】 アラビノキシラン分解酵素技術分野 本発明は、分子生物学の分野に関し、特にアラビノキシラン分解活性を示すポ リペプチドをコードする遺伝子のクローニング及び発現に関する。この酵素は、 例えばパン焼き、紙・パルプ加工及び飼料及び食品の調製（添加剤）の様な工業 方法で使用するのに適する。発明の背景 植物細胞壁の組成は複雑且つ変化に富んでいる。多糖類は、長鎖のセルロース （植物細胞壁の主構造成分）、ヘミセルロース（種々のβ−キシラン鎖から成る ）及びペクチンの形態で、主に存在する。植物細胞壁多糖類の発生、分布及び構 造的要素は、（１）植物種、（２）系(Variety)、（３）組織型、（４）成長条 件、（５）樹齢及び（６）供給前の植物物質の処理によって決定される。 単子葉植物（例えば、穀類及び草）及び双子葉植物（例えば、クローバー、菜 種及び大豆）との間、及び植物の種と発育成長部分との間には基本的な相違が存 在する（Chesson，1987: Carre and Brillouet，1986）。 単子葉植物は、大きなヘミセルロース主鎖の如きアラビノキシラン複合体の存 在に特徴がある。双子葉植物中のヘミセルロースの主構造は、キシログルカン複 合体である。更に、高いペクチン濃度は、単子葉植物よりも双子葉植物中に見出 される。種子では、一般に、ペクチン物質が非常に多いが、セルロース物質では 比較的少ない。 ３つ程度の相互に作用する多糖類構造は、細胞壁中で区別する事が出来る。 （１）中間ラメラは、外側の細胞壁を形成する。また、植物組織マトリックス内 で、互いに個々の細胞の付着点として働く。中間ラメラは、主として、高度にエ ステル化されたペクチンのカルシウム塩から成る。 （２）第一の壁は、中間ラメラの丁度内側に位置する。ペクチン、ヘミセルロー ス、フェノール系エステル及びタンパク質の非晶質マトリックス中に封入されて いるセルロース超微小繊維の十分に組織化された構造である。 （３）第二の壁は、植物の成熟につれて形成される。植物の成長及び老化期の間 に、セルロース超微小繊維、ヘミセルロース及びリグニンが沈着する。 成熟の第一の細胞壁、新陳代謝的に活性な植物細胞（例えば、葉肉及び上皮） は、この段階で、高度にリグニン化された第二細胞壁より酵素加水分解に対して 敏感である。 細胞壁中のセルロース、ヘミセルロース及びペクチン間には、高い程度の相互 作用が存在する。これらの、むしろ強固に架橋された多糖類構造の酵素分解は、 単純な方法ではない。例えば、アラビノキシランを完全に破壊するのには、少な くとも５つの異なる酵素が必要である。内部開裂(endo-cleavage)は、エンド− β（１→４）−Ｄ−キシラナーゼの使用によって効果的に行われる。エクソ−（ １→４）−Ｄ−キシラナーゼは、多糖類の非還元末端でキシロース単位を遊離す る。他の３つの酵素（α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ 及びアセチルエステラーゼ）は、キシラン主鎖上の置換体を攻撃するのに使用さ れる。特定の酵素の選択は、勿論分解されるべき特定のヘミセルロースに依存す る(McCleary and Matheson，1986)。 キシランバックボーンの側鎖を攻撃する酵素は、それらが重合体の特性を変え 、或る種の応用に適するものとするので、興味あるものである。更にそれら酵素 は、主鎖を開裂するエンド−キシラナーゼと、共働作用的に作用する可能性があ る（更に詳しくは、Kormelink，1992，PhD thesis，University of Wageningen を参照）。 アラビノキシラン分解活性をコードするDNAフラグメントは公知である。ヨー ロッパ特許出願第463,706号には、アスペルギルス・チュービゲンシス(Asperugi llus tubigensis)由来のエンド−キシラナーゼの単離、特徴及び遺伝子クローニ ングが開示される。この酵素は、アラビノキシラン主鎖の側鎖を攻撃出来ない。 又、側鎖を攻撃出来る酵素活性は、アスペルギルス・ニガー由来が知られてい る（Kormelink，1992，supra，Chapters 6 and 7）。アラビノフラノシダーゼA( アラフルＡ(ArafurA))と呼ばれる酵素は、アラビノキシランから得られるオリゴ サッカライド構造から、アラビノース残基を遊離する能力に特徴がある。然しな がら、アラフルＡは、高分子量物質には活性がない。更に、アスペルギルス・ニ ガーは、アラフルＢ(ArafurB)と言う名の酵素を産生し、これは、オリゴサッカ ライドにも、高分子量アラビノキシラン構造にも活性である。アラフルＢの酵素 活性は、末端単一置換キシロース残基からアラビノース残基を遊離する事に限定 される。DNAフラグメントは、今までのところ知られていない。 オリゴサッカライドと高分子量アラビノキシラン構造両方における非末端単一 置換キシロース残基からアラビノース残基を遊離出来る活性は、アスペルギルス ・アワモリ(Asperugillus awamori)から単離されている。この酵素は、アラビノ キシランアラビノフラノースヒドロラーゼ(AXH)と名付けられる。今までのとこ ろ、DNAフラグメント及び／又は配列データは得られていない。アラビノキシラ ン分解に含まれる全ての酵素は未だ検出されていない事は明らかである(Kormeli nk 1990)。 例えば、アラビノースで二重に置換されたキシロース分子を攻撃する酵素は未 だ見付かっていない。その理由は、これらの酵素は、少量しか分泌されないから である。これら酵素の適当な宿主での分子クローニング及び過剰産生は、容易で はないが、様々な適用におけるそれらの意義を評価するのに十分な量の純粋な酵 素を得る為の方法である。発明の要約 本発明は、アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチド、又はそれらのポ リペプチド前駆体をコードするＤＮＡフラグメントから成る組換え体ＤＮＡを提 供するもので、ＤＮＡフラグメントは、 （ａ）配列番号５のアミノ酸１〜３０６で表示されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド又はアミノ酸−２７〜３０６で表示されるポリペプチドのポリペプチド 前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｂ）配列番号７のアミノ酸１〜３０６で表示されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド又はアミノ酸−２７〜３０６で表示されるポリペプチドのポリペプチド 前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｃ）依然として、アラビノキシラン分解活性を有する、配列番号５又は７で記 述されるアミノ酸残基１〜３０６で表示されるポリペプチドの変異体または部分 又はそれらの前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｄ）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードし、且つ配列番 号５のヌクレオチド７８４〜１７７９又は配列番号７のヌクレオチド８２３〜１ ８１８で表示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメント、 （ｅ）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチド又はそのポリペプチドの 一部をコードするＤＮＡフラグメントであって、配列番号５のヌクレオチド７８ ４〜１７７９又は配列番号７のヌクレオチド８２３〜１８１８で表示されるＤＮ Ａフラグメントに対してハイブリダイズ出来るＤＮＡフラグメント、 から選択される事を特徴とする。本発明の組換え体ＤＮＡは、糸状菌から得る事 が出来、特にアスペルギルス種から得られる。特に好ましい組換え体ＤＮＡ配列 は、アスペルギルス・ニガー又はチュービゲンシス由来のＡＸＤＡをコードする ＤＮＡフラグメントから成る。 他の実施態様によれば、本発明の組換え体ＤＮＡは、原核又は真核宿主細胞に おいて、ＤＮＡフラグメントの発現に必要な５′及び３′調節ＤＮＡ配列を含む 。調節ＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡのポリペプチドをコードする配列に関して非相 同(heterologous)である事が好ましく、更には、その相同的調節ＤＮＡ配列に結 合される時の、前記宿主でのＤＮＡフラグメントの発現に比べて宿主中でのＤＮ Ａフラグメントの発現を高める様に選択されるのが好ましい。 他の実施態様では、前記組換え体ＤＮＡは、ベクターの形態にある。 更に、本発明は、本発明による組換え体ＤＮＡ、好ましくはアスペルギルス属 による組換え体ＤＮＡを含む形質転換された真核又は原核宿主細胞、及び形質転 換条件下の宿主細胞を本発明の組換え体ＤＮＡで処理し、前記アラビノキシラン 分解酵素の高められた発現を選択する事によって、アラビノキシラン分解酵素の 高められた発現を可能とする宿主細胞を得る方法を提供する。 又、本発明は、その手助けとなる条件下で、前記酵素を産生できる宿主細胞を 増殖させる工程及び酵素を回収する工程を含むアラビノキシラン分解酵素を得る 方法を提供するもので、前記宿主細胞又はそれら先祖が、本発明の組換え体ＤＮ Ａで形質転換されている事を特徴とする。 更に、他の実施態様では、本発明は、アラビノキシラン分解活性を有する、実 質的に純粋なポリペプチドであって、配列番号６又は配列番号８で記述されるア ミノ酸配列を特徴とするポリペプチド、並びに、依然として前記活性を有する遺 伝子的変異体及びその部分を提供する。 又、本発明は、飼料、食品又は紙・パルプ処理での使用の為に作られた、場合 によっては酵素が固定されている請求項１４の実質的に純粋なポリペプチドを含 む組成物を提供する。 又、紙・パルプ加工及びパン焼きでの飼料又は食品添加剤として、アラビノキ シラン分解を補助する本発明のポリペプチドの使用方法を提供する。 又、本発明のポリペプチドを含む飼料又は食品が請求される。 更に他の実施態様では、配列番号５のヌクレオチド１〜７８３で表示されるＤ ＮＡフラグメント又はそれに結合されるＤＮＡ配列の発現を調節する事の出来る 、そのサブフラグメントを含む組換え体ＤＮＡ並びに、配列番号７のヌクレオチ ド１〜８２２で表示されるＤＮＡフラグメント又はそれに結合されるＤＮＡ配列 の発現を調節する事の出来る、そのサブフラグメントを含む組換え体ＤＮＡが提 供される。 本発明は、添付図面についての説明によって、更に例示される。図面の簡単な説明 図１は、ＨＰＬＣでのアラビノキシラン分解活性の溶出プロファイル（ＯＤ２８ ０）。 図２は、ｐＨの関数としてのトウモロコシの水不溶性固体（ＷＩＳ）画分に関す るＡＸＤＡの活性を示す図表。 図３は、粗ＡＸＤＡ酵素の量の関数としてのトウモロコシＷＩＳの試験管内消化 割合。 図４は、ｐＩＭ３００１における制限部位のマップ。 図５は、ｐＩＭ３００２における制限部位のマップ。発明の詳細な説明 本発明は、アラビノキシラン分解酵素遺伝子及びその遺伝子変異体から成る、 精製、単離されたＤＮＡ分子を提供する。ＤＮＡ分子は、アラビノキシラン分解 酵素コード領域と、その領域に隣接する５′及び３′調節領域を含んでいてもよ い。遺伝子変異体は、突然変異体アラビノキシランタンパク質をコードするＤＮ Ａ分子を含み、ＤＮＡ分子を分解して、それから発現される酵素の望ましい活性 を保持する。 又、本発明は、望ましい発現宿主でのアラビノキシラン分解酵素の発現の為の ＤＮＡ構造体を提供する。この発現構造体は、プロモーター、相同又は非相同の 微生物を起源とする分泌及びターミネイターシグナルの様な調節領域に人為的に 結合されたアラビノキシラン分解酵素をコードする領域を含むハイブリッドＤＮ Ａ分子を含み、これら調節領域は、適当な宿主で、アラビノキシラン分解酵素を コードするＤＮＡ分子によってコードされる酵素の高められた発現に係わる事が 出来る。好ましくは、発現構造体は、選択された発現宿主のゲノム中に統合され る。 更に、本発明は、アラビノキシラン分解酵素の発現の為に、ＤＮＡ構造体の微 生物宿主中への導入を介して、微生物宿主のクローニング及び／又は形質転換の 為のベクター、好ましくはプラスミドを提供する。 更に、本発明は、上述のＤＮＡ構造体を含むベクターで形質転換された相同又 は非相同宿主を提供する。非相同宿主はバクテリア、酵母又は菌から選択されて もよい。 本発明の文章において、「相同」(homologous)なる言葉は、その調節領域を含 む、対象とされるアラビノキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ分子に対してネ イティブであるところのもの全てを意味するものである。相同宿主とは、その様 なＤＮＡ分子が単離され得る種と定義される。 「非相同」なる言葉は、調節領域を含み、対象それ自身のアラビノキシラン分 解酵素をコードするＤＮＡ分子に対してネイティブではないところの全てのもの と定義される。非相同宿主とは、アラビノキシラン分解酵素をコードする遺伝子 が単離されているもの以外の微生物種と定義される。 本発明において、「対象のアラビノキシラン分解酵素の高められた発現」なる 文句は、相同野生型微生物において元々出くわす以上の水準での、対象のアラビ ノキシラン分解酵素の発現、と定義される。同じ文章で、また、高められた発現 とは、対象のアラビノキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ分子又は発現構造体 の、非相同発現宿主への導入の為以外は、普通その様なアラビノキシラン分解酵 素を産生しない非相同微生物における、対象のアラビノキシラン分解酵素の発現 をも意味する。これら発現宿主の子孫は、勿論、本発明によって包含されるべき ものと理解される。 又、本発明は、上述の菌から得られるＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ 配列であって、遺伝子コードまたは交雑種変態(cross-species variation)の退 化によるコドン配列とは異なってもよい配列を含む。この様に、本発明は、アス ペルギルス以外の他の種から得られるアラビノキシラン分解酵素をコードするＤ ＮＡフラグメントを含む。一般に、類似のＤＮＡフラグメントを得る為の方法は 、バクテリア、又は既知の微生物又は本発明のアラビノキシラン分解酵素を産生 する事が期待される微生物由来のＤＮＡフラグメントを含む組換え体プラスミド で形質転換されたバクテリオファージプラークのスクリーニングを含む。ＤＮＡ のその場での複写後、このＤＮＡは、細胞又はプラークから放出され、フィルタ ー（一般に、ニトロセルロース）上に固定される。次いで、このフィルターは、 アスペルギルスａｘｄＡ遺伝子に対して決定された配列を基にした標識化核酸プ ローブを使用する相補性ＤＮＡフラグメントに対してスクリーンされる。スクリ ーンされるべき微生物が、遠縁にあたるか、近縁にあたるかによって、ハイブリ ダイゼイション及び洗浄条件は、真のポジティブをピックアップし、偽ポジティ ブの量を減少する為に適用されるべきである。フィルター固定化ＤＮＡのハイブ リダイゼイションの一般的方法は、「核酸ハイブリダイゼイション−実用的方法 」(B．D．Hames & S．J．Higgins Eds.，1985，IRL Press，Oxford)の第５章、 表３、１２０頁〜１２１頁に開示される。最適条件は、一般的に実験的に決定さ れるが、２、３の経験則が、近縁及び遠縁の配列に適用出来る。 プローブに極近縁のＤＮＡフラグメントを同定する為に、ハイブリダイゼイシ ョンは、前出のヘイムス及びヒギンス(Hames & Higgins)の表３に記載されてい る通り（その要点は、以下に再度示される）、６８℃で、０．１＊SETバッファ ー(20 倍SET=３Ｍ NaCl、20 mM EDTA、0.4 M Tris-HCl、pH 7.8)で、高いストリ ンジェンシーの最終洗浄工程を伴って行われる。 プローブに対する限定された相同性を持つ配列を同定する為の次の方法は、前 出のヘイムス及びヒギンスの表３の通りであるが、ハイブリダイゼイションと洗 浄の温度を下げて行われる。例えば、５０℃、２＊SETバッファーでの最終洗浄 は、約75％の相同性を有する配列の同定を可能とする。当業者にとっては良く知 られている様に、相同性とハイブリダイゼイション条件との間の正確な相関関係 は、プローブ、基体組成（Ｇ＋Ｃの％）及び不整合の分布に依存する。つまり、 ランダム分布は、非ランダム又は不整合のクラスター化パターンよりＴmに関し て強い減少効果を有する。 上記条件は、少なくとも300bp、好ましくは少なくとも500bp、更に好ましくは 約１ｋbpの長さと、約50±10％のプルーブされるべきＤＮＡのＧＣ−含有量を有 するプローブに適用する。与えられた微生物のＧＣ−含有量が既知である場合は 、この条件は、次の式を考慮して、実験的に最適化（１Ｍ NaClで、35％≦（％ Ｇ＋Ｃ）≦75％の範囲内）されてもよい。 Ｔm＝８１．５＋０．４１＊（％Ｇ＋Ｃ） 概ね、これは、ＧＣ−含有量（％Ｇ＋Ｃ）が平均より１０％高いと、（ストリ ンジェント）ハイブリダイゼイション条件は、ハイブリダイゼイション及び洗浄 温度を約４℃増加する事のよって調整され得る事を意味する。 この開示の目的の為、本発明によるＤＮＡフラグメントに対してハイブリダイ ズすると言われるＤＮＡフラグメントは、配列番号５又は７で記述される配列の 少なくとも３００ｂｐ、好ましくは５００ｂｐ、更に好ましくは１ｋｂｐのプロ ーブでのハイブリダイゼイション及び、５０℃の温度、２＊SETバッファー(即ち 、０．３Ｍ NaCl)でのヘイムス及びヒギンスの第５章の表３の方法（以下に要点 が再度示される）に続く洗浄後に、固定化ＤＮＡについてポジティブシグナルを 与えると定義される。 ヘイムス及びヒギンスの第５章の表３に記載の方法の要点は次の通りである。 （１）プローブなしでのフィルターのプレハイブリダイゼイション、 （２）５０〜６８℃の間の温度で、０．１と４＊SETバッファー（ストリンジェ ンシーによる）の間、１０＊デンハート(Denhardt's)溶液（100＊デンハート溶 液は、2%ウシ血清アルブミン、2%フィコール、2%ポリビニルピロリドンを含む） 、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌサケ精子Ｄ ＮＡ（１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを溶解し、２００〜５００ｂｐの長さに超 音波処理し、水浴に２０分間置き、水で最終濃度の１ｍｇ／ｍｌまで希釈して得 られるストックからの）でのハイブリダイゼイション。ハイブリダイゼイション 時間は、臨界的ではなく、１〜２４時間の間のどの時間でもよく、好ましくは約 １６時間である（ｏ／ｎ）。プローブは、一般に、５*107〜５*108c.p.m.／μg の間の特定の活性に対する放射線標識としての32Pを使用するニック−トランス レイション(nick-translation)で標識化される。 （３）50〜68℃の間の温度（必要とされるストリンジェンシーによる）で、68℃ で、３＊SET、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウムでのフィルターの（繰り返し ）洗浄。SET濃度を0.1%まで下げながらの繰り返し洗浄、室温で4*SET中で20分間 の一度の洗浄、３MMペーパー上でのフィルターの乾燥、-70℃、１〜９６時間（ シグナルの強度に依存する）、カセット中で、フィルターをＸ−線フィルムに曝 露、そしてフィルムの現像。 一般に、プレハイブリダイゼイションとハイブリダイゼイションの混合の容量 は最少に維持されるべきである。全ての「湿潤」工程は、予熱された水浴中で、 殆ど密閉されていないバッグ中で行ってもよい。 上記の方法は、本発明の、ハイブリダイズすると言われるＤＮＡフラグメント を定義するのに役立つ。自明の如くに、多くの変更は、本発明のＤＮＡフラグメ ントの同定及び単離する為の方法に対して為される。この様にして得られるＤＮ Ａフラグメントは、これらが、この方法を使用して、現に同定及び／又は単離さ れたかどうかに関係なく、これらが上記方法に従って検出出来る場合には、請求 の範囲に含まれるものと理解されるべきである。 本発明のＤＮＡフラグメントを同定し、単離するのに適切に使用できる多くの プロトコールは、上に引用したヘイムス及びヒギンスを含めて、文献及びハンド ブックに開示されている。 上記方法は、ポリヌクレオチドプローブの為のものである。オリゴヌクレオチ ドプローブが、Ｔd間の相関関係で使用されている時は、完全に一致しているハ イブリッドが半分解離する温度は、Ｔd＝４℃／ＧＣ塩基対＋２℃／ＡＴ塩基対 の相関関係で推定される。又、存在するプロトコルを基に、そしてこの経験則を 使用して、オリゴヌクレオチドプローブを、関連する微生物及び非関連微生物か ら、本発明のアラビノキシラン分解酵素をコードするＤＮＡフラグメントを効果 的単離する様に設計できる。オリゴヌクレオチドを使用する方法は、特に、酵素 が、異なる起源から精製されたものであり、アミノ酸配列の一部が決定されてい る場合に有用である。この配列を使用して、主として上に述べた様なＤＮＡライ ブラリー又はサザーンブロットのスクリーニングの為の一組の変性プローブを作 ることができる。 スクリーニングの為に良好な候補は、他の糸状菌、例えばトリコデルマ(Trich oderma)、ペニシリウム、ジコトミタス・スカラス(Dichotomitus squalus)、ジ スポロトリシューム・ジモルフォスポルム(Disporotrichum dimorphosporum)及 びバクテリア、例えばバチルス種等である。初期スクリーニングが、ハイブリダ イジングフラグメントを含む事が明らかなクローンを得るならば、そのフラグメ ントは単離可能であり、望むならは、配列類似性を決定する為に配列する事も可 能である。 一度、対象のアラビノキシラン分解酵素が同定されたならば、その様な酵素を コードするＤＮＡ配列は、アラビノキシラン含有培地で菌を培養し、実施例１で その概略が示される公知の方法を使用して、望ましいアラビノキシラン分解酵素 を単離し、精製したタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定する事に よって、自然に酵素を産生する糸状菌から得てもよい。 ＤＮＡプローブは、その後、推論された部分的アミノ酸配列を基としてオリゴ ヌクレオチド配列を設計する事によって得てもよい。アミノ酸配列は、完全なタ ンパク質のＮ−末端及び／又は完全なタンパク質のタンパク質分解性又は化学的 消化を経て得られる中間ペプチドフラグメントのＮ−末端から決定してもよい。 プローブが得られたならば、ＤＮＡプローブは、次いで、ゲノム又はｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーンするのに使用される。 ゲノムライブラリーは、４つの連続ヌクレオチド、例えば、Ｓａｕ３ＡのＤＮ Ａ配列を認識する制限酵素で菌類染色体ＤＮＡを部分的に消化し、得られるフラ グメントを、適当なプラズマ又はλファージベクター、例えばλＧＥＭ−１１に おいてクローニングすることにより調製してもよい。 別に、ｃＤＮＡライブラリーは、アラビノキシラン分解酵素の合成の為に、適 当なファージベクター、例えばλｇｔ１０中に誘発された菌類細胞から単離され るｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡをクローニングすることにより調製してもよ い。 次に、十分な量のコロニー又はプラークをプレート化した後、ゲノム又はｃＤ ＮＡライブラリーを、適当なＤＮＡプローブでスクリーンしてもよい。 この方法がうまく行かなければ、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを、非誘発 及び誘発細胞由来のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡプローブで別々にスクリーン してもよい。誘発ｍＲＮＡは、炭素源としてアラビノキシランを含む培地で増殖 された細胞から調製されるが、非誘発ｍＲＮＡは、アラビノキシラン以外の炭素 源、例えばグルコースで増殖された細胞から単離されなければならない。誘発ｃ ＤＮＡプローブでのみハイブリダイズするクローンの内で、望ましいアラビノキ シラン分解酵素をコードする遺伝子を含むクローンは、回収可能である。別に、 アラビノキシラン分解酵素遺伝子は、関連配列で以て、クロス−ハイブリダイゼ イションで同定可能である。 好適には、オリゴヌクレオチドプローブは、アスペルギルス・ニガー培養ろ液 から精製された３２ｋＤａの見掛け分子量を有するアラビノキシラン分解酵素の Ｎ−末端アミノ酸配列（実施例1.5.1参照）及び／又はCNBrでの酵素の消化で得 られる中間ペプチドフラグメント（実施例1.5.2参照）のアミノ酸配列から得ら れる。 開発された様なオリゴヌクレオチド混合物は、ゲノム及びｃＤＮＡライブラリ 一両方でハイブリダイズするのに使用出来る。別に、そしてここで例示される様 に、精製されたＡＸＤＡは、抗体生起の為に使用される。抗体は、発現ライブラ リーの免疫スクリーニングで使用される。かくして、ＡＸＤＡ発現クローンが同 定される。タンパク質は、アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスから 単離され、ｃＤＮＡは、異なるアスペルギリがＡＸＤＡ活性を含むことを例示し ているアスペルギルス・ニガーＮ４００から単離される点に注意されたい。 新ＤＮＡ増幅技術、例えば、直接的又は逆転ＰＣＲの出現で、コード領域の末 端配列が知れれば、試験管内でＤＮＡフラグメントをクローン化可能である。 アラビノキシラン分解酵素をコードするＤＮＡ配列の利用性は、部位直接突然 変異生成(site-directed mutagenesis)によって、変異体酵素分子の構築を可能 とする。アラビノキシラン分解酵素の三次構造が分かり、その触媒性及びドメイ ンを結合している基体が位置決めされれば、触媒性及び／又は機能を結合してい る基体に最も影響を及ぼす突然変異生成（例えば、コンピュータモデル化の助け で）の為のアミノ酸を選択可能である。タンパク質の三次構造が分からなければ 、ランダム変異体は、全コード配列に沿って発生されてもよく、或いはタンパク 質の三次構造は、他の微生物から単離された類似の既知の酵素の比較で予測され てもよい。 １以上の非相同調節領域から成る発現構造体への、ＡＸＤＡコード配列を含む ＤＮＡ配列のインサーションを促進するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）(PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification，(1 989)H.A．Ehrlich，ed.，Stockton Press，New York)は、ＡＸＤＡコード配列の ５′及び３′末端で、適当な制限酵素部位の導入の為に使用してもよい。制限部 位の選択は、発現ベクターのＤＮＡ配列、即ちＤＮＡ分子内の他の制限部位の存 在に依存する。 オリジナル（相同）産生種において、又は別に非相同菌類株においてＡＸＤＡ タンパク質の高められた発現を得る為に、それら自身の調節領域を含むＡＸＤＡ をコードするＤＮＡ領域は、遺伝子のコピー数、従ってタンパク質発現を増加す る為に、選択された発現宿主に導入される。 非相同発現宿主がよけれは、そして酵母又バクテリア株が選択される場合は、 ゲノムフラグメント上に存在するスプライスシグナルが、非相同宿主によって認 識されない可能性を避ける為に、連続（介在配列なし）ＤＮＡ分子が、非相同発 現ベクターの構築に使用される。この連続ＤＮＡ分子は、ＡＸＤＡの合成のため に誘発された細胞から単離されたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリー から得られる。このライブラリーは、前述の如くに得られたオリゴヌクレオチド 又はｃＤＮＡプローブでスクリーンできる。別に、連続ＤＮＡ分子は、アラビノ キシラン誘発細胞のＲＮＡから合成された第一ストランドｃＤＮＡの適当な５′ 及び３′オリゴヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応を適用して得られ る。 又、対象のＡＸＤＡの高められた発現は、非相同調節領域の選択、例えば、発 現の増加に役立つプロモーター、分泌リーダー及びターミネーター領域の選択に よって、そして、望むならば、選択された発現宿主からの対象のタンパク質の分 泌水準及び／又は対象のＡＸＤＡの発現の誘発調節を用意する事によって達成で きる。 対象の生来のプロモーターに加えて、他のプロモーターが、その発現を行うの に使用できる。このプロモーターは、望ましい発現宿主において、対象のＡＸＤ Ａの発現を行う場合のその効率で選択できる。 他の実施態様では、構成プロモーターは、他の酵素とは関係無しに、望ましい ＡＸＤＡの発現に対して選択してもよい。その様な発現構造体は、誘発基体とし てアラビノキシランを含む培地で、発現宿主を培養する事の必要性を回避するの で、更に有利である。 菌類発現宿主での使用に適する強力な構成及び／又は誘発性プロモーターの例 としては、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９(oliC)、トリオースホスフェ ートイソメラーゼ(tpi)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhA)、α-アミラーゼ(a my)、グルコアミラーゼ(gam)、アセトアミダーゼ(amdS)及びグリセルアルデヒド -3-ホスフェートオデヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターがある。 強力な酵母プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクタ ーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ及びトリオースホスフェートイソメラー ゼプロモーターがある。 強力なバクテリアプロモーターとしては、α−アミラーゼ及びSpo2プロモータ ーと、細胞外プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターがある。 又、ハイブリッドプロモーターは、発現構造体の誘発性調節を改善するのに有 利に使用してもよい。 発現宿主から、培地中に分泌される対象のAXDAが望ましい。 本発明によれば、対象の生来の分泌リーダー配列のＡＸＤＡは、発現されたＡ ＸＤＡの分泌を効果的ならしめる為に使用されてもよい。 然しながら、酵素の発現での増加は、時に、タンパク質生成物が細胞内に蓄積 する様な障害を創り出す、発現宿主が処理及び分泌出来る以上の水準でのタンパ ク質の産生を招く。従って、又、本発明は、選択された発現宿主からの酵素の最 も効率的な分泌を提供する為の非相同リーダー配列を提供する。 本発明によれば、分泌リーダーは、望ましい発現宿主を基に選択されてもよい 。非相同配列リーダーは、発現構造体のその他の調節領域に相同であることが選 択されてもよい。例えば、多量に分泌されるグルコアミラーゼタンパク質のリー ダーは、グルコアミラーゼプロモーターそれ自身との組み合わせでも、他のプロ モーターとの組み合わせでも使用してよい。又、ハイブリッドシグナル配列は、 本発明の文章内において有利に使用されてもよい。 好適な非相同分泌リーダー配列は、グルコアミラーゼ遺伝子（菌類）、α−因 子遺伝子（酵母）、又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）を起源とするもので ある。 一般に、ターミネーターは、遺伝子の高められた発現にとって、臨界的要素と は考えられない。望むならば、ターミネーターは、プロモーターと同じ遺伝子か ら選択されてもよく、或いは別に相同性ターミネーターが使用されてもよい。 上述のゲノムフラグメントに加えて、形質転換ＤＮＡは、非形質転換細胞のバ ルクからの望ましい遺伝子を導入した細胞を区別する為に、選択マーカーを含ん でもよい。適当な５′及び３′調節配列を用意したこの選択マーカーは、望まし い遺伝子を含む同じＤＮＡ分子上に存在してもよいし、別々の分子上に存在して もよい。後者の場合、同時形質転換(co-transformation)が行われなければなら ない。発現ベクター／選択ベクターの比は、高い割合の選択形質転換体が、対象 のＡＸＤＡの発現構造体を含むベクターを導入している様な方法で調製されなけ ればならない。 工業的な微生物の最も適切な選択システムは、宿主微生物において突然変異を 必要としない選択マーカーのグループで形成されるものである。菌類選択マーカ ーの例としては、アセトアミダーゼ(amdS)、ATPシンセターゼ、サブユニット９( oliC)及びベノミル耐性(benomyl resistance)(benA)の遺伝子がある。非菌類選 択マーカーの例としては、バクテリアG418耐性遺伝子（これは、酵母で使用して もよいが、菌類では使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、及び ネオマイシン耐性遺伝子（バチルス）がある。 望ましい発現構造体が組み立てられたら、構造体を増殖する為に、大腸菌のよ うな適当なクローニング宿主中に形質転換される。その後、発現構造体は、適当 な発現構造体中に導入され、そこで発現構造体は、ゲノム中に集積される。バチ ルス種の様な或る種の宿主は、クローニング及び発現宿主の両方として使用して もよく、このようにして外部形質転換ステップを回避する。 本発明によれば、種々の微生物が、対象のＡＸＤＡの産生の為の宿主として使 用できる。 １つの実施態様では、相同性発現宿主が使用される。これは、ＤＮＡ配列をコ ードするＡＸＤＡが、増加した遺伝子コピー数において、又は上述の非相同調節 領域の調節のもとに、またはその両方において単離された株の中への発現構造体 の導入を含む。 他の実施態様では、対象のＡＸＤＡは、バクテリア、酵母又は菌類の様な非相 同宿主中の適当な調節領域の調節のもとで、対象のアラビノキシラン分解酵素を コードするＤＮＡ構造体を導入及び発現する事によって産生できる。この目的の 為に、対象のＡＸＤＡをコードするＤＮＡ配列は、非相同宿主起源のプロモータ ー及びターミネーター配列の調節のもとに、発現されるのが好ましい。更に、生 成物の最も効率的な発現と分泌を達成する為に、発現宿主に相同なリーダー配列 で、原生分泌リーダー配列を置き換える事が必要かもしれない。 特有のグリコシル化にとって必要な、又は対象のＡＸＤＡの細胞外分泌にとっ て必要であるサイズ（分子量）の様な因子は、発現宿主の分泌において重要な役 割を演ずる。 グラム陰性バクテリア大腸菌は、非相同性遺伝子発現用宿主として広く使用さ れる。然しながら、大量の非相同性タンパク質は、細胞の内側に蓄積する傾向が ある。大腸菌細胞内タンパク質のバルクからの望ましいタンパク質のその後の精 製は、時に困難である。 大腸菌とは反対に、バチルス属由来のバクテリアは、培地へタンパク質を分泌 するそれらの能力の故に、非相同宿主として非常に適するものである。ＤＮＡ分 子それ自身をコードするＡＸＤＡの性質によって、及び／又は発現されたタンパ ク質の更なる処理のための必要性によって、酵母又は菌類の様な真核宿主が好ま しい。一般に、酵母細胞は、取扱が容易であるので菌類細胞より好ましい。然し ながら、幾つかのタンパク質は酵母細胞からの分泌が少ないか、又はある場合に は適当に処理されない（例えば、酵母における高グリコシル化）。その場合には 、菌類宿主微生物が選択されるべきである。 又、非相同宿主は、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)の様 な酵素を普通に産生しない宿主を選択することによって、他の多糖類分解酵素と 実質的に関係のない対象のＡＸＤＡを発現する為に選択されてもよい。 本発明の範囲内での好適な発現宿主の例としては、アスペルギルス(Aspergill us)種（ＥＰ１８４．４３８及びＥＰ２８４．６０３に開示される）及びトリコ デルマ種(Trichoderma)種の様な菌類、バチルス種（ＥＰ１３４．０４８に開示 される）の様なバクテリア、クルイベロミセス種（ＥＰ９６．４３０及びＥＰ３ ０１．６７０に開示される）及びサッカロミセス種の様な酵母がある。 特に好ましい発現宿主は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ア スペルギルス・ニガー変異体アワモリ(Aspergillus niger var.awamori)、アス ペルギルス・アクレアチス(Aspergillus aculeatis)、アスペルギルス・オリザ エ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、バチ ルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus l icheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacie ns)、クルイベロミセス・ラクチス及びサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharo myces cerevisiae)から選択されてもよい。 対象のＡＸＤＡの発現は、通常の栄養醗酵培地で、適当な発現構造体で形質転 換された発現宿主の培養によって、効果的に行われる。 醗酵培地は、炭素源（例えば、グルコース、マルトース、糖みつ等）、窒素源 （例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機 窒素源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプトーン等）及び無機栄養源（ 例えば、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄等）を含む通常の培地か らなる。任意に、誘発物質（アラビノキシラン）を含んでもよい。 適当な培地の選択は、発現宿主の選択に基づくものでもよく、及び／又は発現 構造体の調節要件に基づくものでもよい。その様な培地は、当業者には公知のも のである。若し望むならば、培地は、他の潜在的汚染微生物に対して、形質転換 された発現宿主を好ましいものとする追加成分を含んでもよい。 醗酵は、０〜４５℃の範囲の温度で、ｐＨ２〜１０の間で、バッチ又はフェド −バッチ(fed-batch)方法で、０．５〜２０日の期間にわたって行われる。好適 な醗酵条件は、２０〜３７℃の範囲の温度と、３〜９の間のｐＨである。適当な 条件は、発現宿主の選択を基準に選択される。 醗酵後、細胞は、遠心分離機又はろ過手段によって、醗酵ブロスから除去され る。細胞を除去後、次いで酵素を回収し、必要ならば精製し、通常手段で単離す る。 生成物は、液体又は乾燥形態で、安定的に製剤化される。或る種の適用の為に は、固体マトリックスへの酵素の固定化が好ましい。 本発明の方法で製造される酵素は、アラビノキシラン分解酵素の作用を必要と する様々な方法において、単独或いは他の選択された酵素と一緒に適用してもよ い。 本発明のアラビノキシラン分解酵素は、食品（例えば、パン）、飼料及び飲料 （例えば、ビール及び果物ジュース）の加工又は調製において使用される。 又、アラビノキシラン分解酵素は、紙・パルプの製造及び加工において、特に 外部キシラナーゼとの組み合わせで、有利に使用される。 本発明で例示された通り、アラビノキシラン分解酵素は、アラビノキシランが 豊富な動物飼料に添加される。オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギ又は オートムギの様な穀類、又はコムギのもみがら又はトウモロコシブランの様な穀 類副産物を含む単胃動物（例えば、家禽又は豚）用飼料（貯蔵生牧草を含む）に 添加する場合は、この酵素は、動物による植物栄養のより良い利用となる植物細 胞壁の破壊を顕著に改善する。結果として、成長速度及び／又は飼料転換が改善 される。更に、アラビノキシラン分解酵素は、アラビノキシランを含む飼料の粘 度を減少させるのに使用してもよい。 アラビノキシラン分解酵素は、予備浸漬又は湿潤消化が好ましい場合は、飼料 又は貯蔵生牧草に前以って添加してもよい。更に、本発明を経て産生されるＡＸ ＤＡは、生体内において、飼料中のアラビノキシランを加水分解し続ける。 又、アラビノキシラン分解酵素は、実施例８で示す様に、パンの製造において 有用である。実験用 株 大腸菌ＢＢ４(Silvay et al.，1984): 大腸菌ＤＨ５α(Hanahan、1983): 大腸菌ＬＥ３９２(Murray、1977): 大腸菌ＸＬ１−Blue MRF′(Jerpseth et al.，1992): アウペルギルス・ニガーＮ４００（ＣＢＳ１２０．４９） アウペルギルス・ニガーＮ４０２(cspA1)(Goosen et al.，1987) アウペルギルス・ニガーＮＷ２１９(leuA1、nicA1、pyrA6)ベクター: pBluescript SK+/-(Short，J．M.，et al.，1988) pUC19(Yanish-Perron et al.，1985) 次の溶液を、サムブルック等(Sambrook et al.，1989)により調製した。 バッファー: TE、50*TAE、20*SSC; ハイブリダイゼイション、100*デンハート、 SM、DNAローディング、 培地: NZYCM、LB及び最少培地。 ビスニアック溶液(Visniac solution)は、ビスニアック及びサンター(Santer)(1 957)によって調製した。実施例 実施例１：酵素単離 実施例１．１： アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスアラビノキシラン分解活性Ａ（ ＡＸＤＡ）の精製と特性化 アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスＤＳ１６８１３を、酵母抽出 物及び２％のオートスペルトキシランの代わりの粗コムギアラビノキシラン画分 無しで、ＥＰＡ０４６３７０６に開示される様に増殖した。細胞をろ過によって 除去し、上澄み液を、限外濾過機で乾燥した。 ＡＸＤＡの乾燥の為に、５ｇの粗酵素調製物を１００ｍｌの１０ｍＭTris/HCl 、 pH 8.0で希釈した。酵素溶液を濾過し(Seitz/supro no 250及びSeitz/supro EKS )、5.2g/lの最終タンパク質濃度(Biorad protein assay)に希釈した。粗酵素を 、DEAE TSK 650(M)アニオン交換カラム(600ml（速度25ml/分）上で、HPLCで分別 した(Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System)。 カラムを、25mM Tris/HCl(pH 8.0)で平衡とした。サンプル(3gのタンパク質) をカラムに入れ、100mM NaClを含む平衡バッファーの勾配で溶出した。ＡＸＤＡ 酵素を、図１で示す様に、５３ｍＭのNaCl濃度で溶出した。 実施例１．２：ｐＨ最適値 ＡＸＤＡ粗酵素調製物のｐＨ最適値を決定する為に、トウモロコシの水不溶性 固体（ＷＩＳ）重合体画分を基体として使用した。１．６ｍｇの粗酵素調製物を 、０．５ｇのＷＩＳに添加し、３．４０〜７．６５に変わるｐＨのバッファー（ １００ｍＭ 酢酸ナトリウム）で５ｍｌに希釈した。サンプルを６０分間、３９ ℃で培養し、１５分間（２８００ｇ）、遠心分離に掛けた。上澄み液において、 糖の減少をサムナー試薬(Sumner reagent)を使用して測定した。 サムナー試薬の調製: 10gのフェノールを、22mlの10%NaOHに添加し、次いで容 量を蒸留水で100mlに調整した。10ｇのNaHSO3を添加し、この溶液の70mlに300ml の4.5%NaOHを添加し、次いで255g K/Na酒石酸塩及び800mlの１％3,5-ジニトロサ リチル酸を添加した。次いで、混合物を、化合物が溶解するまで、室温で攪拌し た。 0.5mｌのサムナー試薬を、200μｌのサンプルに添加し、10分間煮沸した。冷 却後、５ｍｌの蒸留水を添加した。吸光度は、515nmで測定した。サンプルの還 元糖含有量は、キシロースの検量線を使用して計算した。 図２で示される様に、酵素のpH最適値は５．０であった。 実施例１．３：アミノ酸組成 ＤＥＡＥカラムのＡＸＤＡ画分から、アミノ酸組成を、PICO-TAG 150 MMカラ ム(254nmで検出)で測定した。次の組成が判明した。 実施例１．４： 生化学的特性化（IEP及び分子量） ＡＸＤＡのＩＥＰを、ｐＨ３〜９のファーマシアミニゲル(Pharmacia minigel )で決定した。タンパク質を、ファーマシアシルバーステイン溶液(Pharmacia si lver stain solution)で染色した。ＡＸＤＡ酵素のＩＥＰは、３．６と推定され た。 ＡＸＤＡの分子量は、ファーマシアミニ勾配ＳＤＳ-gel(10〜15%)で決定し、 タンパク質を、シルバーステイニング(Pharmacia)で検出した。ＡＸＤＡの分子 量は、３２kDaと推定された。 実施例１．５： アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスアラビノキシラン分解活性Ａ（ ＡＸＤＡ）のタンパク質配列 実施例１．５．１： アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスアラビノキシラン分解活性Ａ（ ＡＸＤＡ）のＮ−末端のアミノ酸配列 凡そ１nmol（≒３０μｇ）のＡＸＤＡを、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で電気泳動に掛け、次いで、マツダイラ（１９８７）の方法により、Immo bilion-P膜(Millipore)上へのエレクトロブロッティングを行った。３２ kDaの 見掛け分子量を有する主バンドを含む膜断片を、気相配列(Amons、1987)(SON fa cility、Leiden)での配列分析に掛け、次の配列を決定した。 実施例１．５．２： アラビノキシラン分解活性Ａ（ＡＸＤＡ）のＣＮＢｒペプチドのアミノ酸配列決 定 凡そ２nmolのＡＸＤＡを、ＣＮＢｒによる化学的開裂に掛けた。凡そ２nmol（ ≒６０μｇ）のＡＸＤＡを凍結乾燥し、１２５μｇのＣＮＢｒ(2.5mg/ml)を含 む70％蟻酸の60μｌ中に再懸濁した。この反応混合物を、室温で、４８時間、暗 所で培養した。液を、スピードバック(Speedvac)中で蒸発させ、滅菌ビデスト(s terile bidest)で洗浄し、再度蒸発させた。この洗浄ステップを二度繰り返した 。 次いで、反応混合物を、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動 に掛け、次いで、マツダイラ（１９８７）の方法により、Immobilion-P膜(Milli pore)上へのエレクトロブロッティングを行った。凡そ９ kDaの見掛け分子量を 有する主バンドを含む膜断片を、気相配列(Amons、1987)(SON facility、Leiden )での配列分析に掛けた。次の配列が決定した。 ＣＮＢｒ： 不明確なアミノ酸は、括弧書きで示した。 実施例２：ＡＸＤＡの酵素プロファイル α−アラビノフラノシダーゼ活性を、パラ−ニトロフェニルアラビノフラノシ ド基体(Sigma)上で測定した。１ｍｌの基体に、３００μｌの酵素を添加した。 ３０℃で、１５分間培養後、反応を５ｍｌのNa2CO3(5M)で停止した。吸光度を、 402nmで測定した。α−アラビノフラノシダーゼ活性を計算した（容積＊吸光度 ／Ｅ＊時間）。 粗酵素調節物は、０．３０ pNPAF U/mgのα−アラビノフラノシダーゼ活性を 含んでいた。DEAEカラムからの画分の活性度を試験した。アラビノフラノシダー ゼ活性プールは、3.0 pNPAF U/mgを含んでいた（図１参照）。α−フラノシダー ゼ活性を持つ他の画分は見つからなかった。アラビノフラノシダーゼ活性プール は、その後、トウモロコシの水不溶性重合体画分について試験し、この基体につ いての活性は測定されなかった。 これは、ＡＸＤＡが、パラニトロフェニル基体に関してα−アラビノフラノシ ダーゼ活性を有しない事を示した。 ＡＸＤＡの酵素活性を同定する為の更なる試みでは、アスペルギルス・チュー ビゲンシスａｘｄＡ−遺伝子で形質転換されたアスペルギルス・ニガー培養物の ろ液を、コムギアラビノキシランからなる基体についての活性に対してスクリー ンした。このチュービゲンシス遺伝子を、ピルベートキナーゼ(pyruvate kinase )（グリコリティック）プロモーターのコントロール下に置き、増殖条件を、内 因性アラビノース分解酵素の発現を避けて、導入遺伝子(transgene)の発現を好 ましいものとする様に選択した。 これによって、ＡＸＤＡが高分子量アラビノキシラン基体について、アラビノ ース放出活性を有した事が決定された。タンパク質含有量は、セドマック法(Sed mak method)を使用して決定した。ＡＸＤＡの活性は、培養物ろ液の１００μｌ の異なる希釈液(１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中、pH5.0)に、150μｌの50 mM酢酸ナトリウム(pH5.0)と250μｌの0.4%コムギアラビノキシラン(Megazyme)を 添加し、40℃、１時間培養で決定した。１００℃で、１０分間、混合物を加熱し て反応を停止した。アラビノキシラン分解生成物を、サンプルとして加熱不活性 培養(heat-inactivated incubations)を使用して、ＨＰＡＥＣ（高速アニオン交 換クロマトフラフィー）を使用してモニターした。 結果は次の通りであった。 アラビノースフラノヒドロラーゼ活性の１単位は、１分当たり、アラビノキシラ ンから１μモルのアラビノースを放出出来る酵素量と定義される。 アスペルギルス・チュービゲンシスのＡＸＤＡ酵素は、アラビノースフラノヒド ロラーゼ（ＡＸＨ）活性を有することが結論付けられた。 アラビナーゼ活性は、メガザイム(Megazyme)のアラビナーゼテストキットで測 定し、指示に従って行った。 この実験で、DEAEカラムのＡＸＤＡプールは、直鎖アラビナンに関して活性を 示さなかった。 これは、ＡＸＤＡがアラビナーゼではないことを示した。 エンドキシラナーゼ活性は、オートスペルトキシランに関して測定した。１０ ｍｌの５％キシラン懸濁液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５）を、１０ 分間煮沸した。冷却後、懸濁液を、３９℃で、１０分間培養した。０．５ｍｌの 酵素溶液を添加して反応を開始した。幾つかの培養期間（５、１０、１５、２０ 及び２５分）後、３９℃培養からの１．５ｍｌサンプルを、１．５ｍｌの脱イオ ン水に添加し、１０分間煮沸した。サンプルを１５分間、遠心分離に掛けた（２ ８００ｇ）。上澄み液について、還元糖を、サムナー試薬で検出した（実施例１ ．２参照）。 ＡＸＤＡ画分プールにおいて、３９９．０Ｕ／ｍｇのエンドキシラナーゼ活性 が見出された。エンドキシラナーゼ活性及びＡＸＤＡは、その後、試験管内消化 系でテストした（実施例６参照）。 そのテストから、ＡＸＤＡ画分プールのエンドキシラナーゼ活性は、異なるポ リペプチド活性と関連する活性である事が結論付けられた。ポリペプチドが、Ａ ＸＤＡに類似の酵素を持つエンドキシラナーゼ共溶出物(co-elute)を有すると言 う更なる指摘が、コルメリンク(Kormelink)によって見出された(1992、PhD．The sis、Chapter 6、p．107、最後の２章及びp．108)。 ＡＸＤＡは、それ自身エンドキシラナーゼ活性を有すると結論している。 実施例３：ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築 実施例３．１：ｍＲＮＡの誘発及び単離 アスペルギルス・ニガーＮ４００培養物を、酵母抽出物及び２％のオートスペ ルトキシランの代わりの粗コムギアラビノキシラン画分無しで、ＥＰＡ０４６３ ７０６に開示される様に、６９時間及び８１時間それぞれに増殖し、菌糸体(myc elium)を濾過によって採取した後、無菌食塩水で洗浄した。次に、菌糸体を液体 窒素中で凍結し、その後、マイクロディスメンブレーター(Microdismembrator)( Braun)を使用して粉末とした。RNAがCsCl勾配を使用して、２度遠心分離に掛け られた以外は、全RNAを、サムブルック等(1989)に開示されるグアニジウムチオ シアネート/CsClプロトコールにより菌糸体から単離した。ポリＡ+ mRNAを、オ リゴ(dT)-セルロースクロマトグラフィー(Aviv and Leder、1972、Sambrook et al.，1989)で、次の変更を加えて、５ｍｇの全RNAから単離した：ＳＤＳを全溶 液から除き、ローディングバッファーを、９％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド で補充した。 実施例３．２：ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡを、７μｇのポリＡ+ mRNAから合成し、製造説明書によりＺＡＰ（商 標）−ｃＤＮＡ合成キット(Stratagene)を使用して、バクテリオファージλ Uni -ZAP XR中に結紮した。Uni-ZAP XRベクター−アーム中へのｃＤＮＡの結紮後、 製造説明書により、ファージＤＮＡを、パッカジェン（商標）抽出物(Packagene extracts)(Promega)でパッケージにした。1.2μgベクターアームへの120ngのcD NAの結紮及びその後の反応混合物のパッケージングは、3.5*104組換え体ファー ジから成るプライマリーライブラリーとなった。このプライマリーライブラリー を、大腸菌XLl-Blue MRF′を使用して増幅し、滴定し、４℃で貯蔵した。 実施例４： ＡＸＤＡに対して生起した抗体で、（ａｘｄＡ）の為のアスペルギルス・ニガー Ｎ４００ｃＤＮＡのスクリーニング及びｃＤＮＡクローンの単離 実施例４．１： 兎における、ＡＸＤＡに対して生起される抗体の調製 ５００μｇのＡＸＤＡを、１ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０に対して透析 し、凍結乾燥した。タンパク質を、１ｍｌの滅菌ＰＢＳ(０．１３６ＭＮａＣｌ 、２．７ｍＭＫＣｌ、８ｍＭNa2HPO4、１．７５ｍＭKH2PO4、pH7.4)に再懸濁し た。 このタンパク質混合物へ、１ｍｌのフロインド完全アジュバンド(Freunds' co mplete adjuvant)を添加し、安定なエマルジョンを得る為に、30分間攪拌した。 この混合物を、兎に皮下注入した。６週で、０．５ｍｌのフロインド不完全アジ ュバンドが添加された、０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中の２５０μｇのＡＸＤＡを注 射して、追加免疫を与えた。この兎を、７週で採血し、その血清を試験した。１ ３週で、２５０μｇの第二追加免疫を与え、次いで１４週で採血した。採血まで ６週の間隔のある追加免疫方法は、数度繰り返してもよい。 集めた血液を、３７℃で３０分間培養し、４℃で１６時間貯蔵した。ソルバル 高速遠心分離機(Sorvall High speed centrifuge)で、5000rpmで遠心分離後、血 清を回収した。 実施例４．２：ＡＸＤＡTUBに対して生起する抗体を持つ、アスペルギルス・ニ ガーＮ４００ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング ａｘｄＡ ｃＤＮＡクローンに対して、実施例３．２で構築された、アスペル ギルス・ニガーＮ４００ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンする為、プレート化 バクテリアとして大腸菌BB4を使用して、５＊１０3pfu／プレートを、開示の如 くに(Maniatis et al.，1082，pp．64)、85mm直径のNZYCM(１．５％アガー)上で 、０．７％のアガロースを含むNZYCMトパガロースでプレート化した。 それぞれのプレートについて２つのレプリカを、サムブルック等が開示する(S ambrook et al.，1989，pp．12.16-12.17)ニトロセルロースフィルター(Schleid er and Schull BA85)上で作成した。ＡＸＤＡNIGを、EPA91205944.5(公開番号第 0463706A1)に開示の如く、免疫染色後に、精製ＡＸＤＡTUB（実施例４．１）に 対して生起する抗体を使用して可視化した。レプリカフィルター上に複製表示さ れる免疫染色プラークを同定した。８つのポジティブプラークを選択した。各ポ ジティブプラークを、パスツールピペットを使用してプレートから取り上げ、プ ラークを、マニアチス等の開示の如くに(Maniats et al.，1982，pp．64)、20μ ｌのクロロホルムを含むSMバッファー１ｍｌ中のアガープラグから溶出させた。 得られたファージを、単離されたファージの５０〜１００プラークを含むプレ ートから、フィルターレプリカを使用して、上述の方法を繰り返す事によって精 製した。 精製後、プラークを、NZYCM培地で、5x103ファージをプレート化することによ って増殖した。37℃で、一昼夜培養後、融合プレートを得、それからプラークを 、5mlSMバッファーを添加し、断続的な震盪をしながら、４℃で２時間貯蔵する 事によって溶出した。ピペットを使用して上澄み液を回収後、４℃で、１０分間 、４０００ｘｇで、遠心分離によって、バクテリアを、溶液から除去した。上澄 み液へ、０．３％クロロホルムを添加し、pfuの数を決定した。これらのファー ジストックは、凡そ1010pfu/mlを含む。 実施例４．３ axdA cDNAクローンについての制限分析 axdA cDNAから成る組換え体Uni-ZAP XRクローンを、製造説明書により、スト ラタジエン(Stratagene)のZAP-cDNA合成キットに含まれる繊維状ヘルパーファー ジ、イーエックスアシスト(ExAssist)（商標）で、重複感染(superinfection)を 使用して、ブルースクリプトファーゲミド(Bluescript phagemid)に転換した。 次いで、ファーゲミドＤＮＡを、サムブルック等(Sambrook et al.，1989，pp． 1.25-1.28)に記載のとおりに単離した。 axdA cDNAクローンの単離されたＤＮＡを、次の制限酵素を使用して、制限分 析に掛けた：EcoRI及びXhoI。ＤＮＡを３７℃で、次の溶液から成る反応混合物 中で２時間消化した：２μｌ（≒１μｇ）のＤＮＡ溶液、２μｌの凡そ１０＊リ アクトバッファー(BRL)、10Ｕの各制限酵素及び２０μｌの最終容量とする為の 滅菌蒸留水。４μｌのＤＮＡローディングバッファーの添加後、サンプルを、８ ０Ｖで、１．５時間、電気泳動で分離した。 制限分析は、axdA cDNAクローンは凡そ１．２ kbの分子サイズを有する事を示 した。 実施例４．４：アスペルギルス・ニガーａｘｄＡ ｃＤＮＡクローンの配列分析 ｃＤＮＡの一次構造を、配列反応で、プライマーとして特定のオリゴヌクレオ チドの使用と組み合わせた配列分析により決定した。 ヌクレオチド配列は、ファーマシアT7 DNAポリメラーゼ配列キットを使用して 、ジデオキシヌクレオチド鎖−末端化方法(dideoxynucleotide chain-terminati on procedure)(Sanger et al.，1977)で決定した。PC/GENEプログラムを使用し てコンピュター分析を行った。 実施例４．５：フラグメントの32P-標識化 アスペルギルス・ニガーａｘｄＡ ｃＤＮＡクローンフラグメントを単離し、 EP出願91205944.5（公開番号0463706A1、実施例2.2及び7.1、参照としてここに 導入される）に開示の様に標識化した。 実施例４．６：ａｘｄＡ遺伝子及びその遺伝子の単離の為のアスペルギルス・ニ ガー変異体ニガー・ゲノムライブラリー ａｘｄＡ遺伝子の為に、ハームセン等(Harmsen ey al.，1990)による開示の如 くに構築したアスペルギルス・ニガー変異体ニガー・ゲノムライブラリーのスク リーニングの為、3x103pfu／プレートを、プレート化バクテリアとして大腸菌Ｌ Ｅ３９２を使用して、開示の如くに(Maniatis et al.，1982，pp．64)、５つの 、８５ｍｍ直径NZYCM(1.5％アガー)上で、0.7%のアガロースから成るNZYCMトッ プアガロース中でプレート化した。 ３７℃で、プレートを一昼夜培養後、マニアチス等(Maniatis et al.，1982， pp．320-321)が開示の如く、各プレートの２つのレプリカを、HybondNフィルタ ー上で作成した。 3xSSC中でフィルターを湿潤後、フィルターを、3xSSC中で、室温で、60分間洗 浄した。フィルターを、6xSSC、0.5%SDS、10xデンハート溶液、0.01M EDTA及び1 00μg/ml加熱変性ニシン精子DNA（Boerhinger Mannheim）を含むプレハイブリダ イゼイションバッファー中で、65℃で２時間、プレハイブリダイズした。２時間 のプレハイブリダイゼイション後、プレハイブリダイゼイションバッファーを、 プレハイブリダイゼイションバッファーと同じであるが、アスペルギルス・ニガ ーａｘｄＡ ｃＤＮＡクローンから成る32P-標識化１．２kbフラグメントを含む ハイブリダイゼイションバッファーで置き換え、実施例４．５と同様に調製した 。フィルターを、温度６５℃で、１８時間ハイブリダイズした。 ハイブリダイゼイション後、フィルターを、６５℃で、３０分間、５＊SSC/0. 1%SDSで第一洗浄し、次いで６５℃で、３０分間、２＊SSC/0.1%SDSで第二洗浄し た。次いでフィルターを、６５℃で、３０分間、0.1＊SSC/0.1%SDSで洗浄し、次 いで６５℃で、３０分間、0.1＊SSCで最終洗浄した。空気乾燥したフィルターを 、ワットマン3MM紙のシート上にテープで止め、キーマークを放射線インクで付 け、ワットマン紙とフィルターを、サランラップでカバーした。ハイブリダイジ ングプラークは、同定スクリーンを使用して、コダックXAR X-線フィルムを72時 間、-70℃で曝露して同定した。 レプリカフィルター上に複製表示される、ポジティブハイブリダイジングプラ ークが見つかった。４つのポジティブプラークを、パスツールピペットを使用し てプレートから取り上げ、このプラークを、マニアチス等(Maniatis et al.，19 82，pp．64)の開示の如く、２０μｌのクロロホルムを含むＳＭバッファーの１ ｍｌ中で、アガープラークから溶出した。得られたプラークを、単離されたプラ ークの５０〜１００プラークを含むプレートから、フィルターレプリカを使用し て、上述の方法を繰り返して精製した。 精製後、プラークを、NZYMC培地上で、5x103プラークをプレート化して増殖し た。37℃で一昼夜培養後、5mlSMバッファーを添加し、断続的な震盪をしながら 、４℃で２時間貯蔵する事によって溶出されたファージから融合プラークを得た 。ピペットを使用して上澄み液を回収後、４℃で、１０分間、４０００ｘｇで、 遠心分離によって、バクテリアを、溶液から除去した。上澄み液へ、０．３％ク ロロホルムを添加し、pfuの数を決定した。これらのファージストックは、凡そ1 010pfu/mlを含む。 実施例４．７：バクテリオファージλからのＤＮＡの単離 それぞれの単離されたファージを、300μlSMバッファー中の５＊１０9大腸菌L E392バクテリアと、２＊１０6ファージとを組み合わせて増殖し、37℃で15分間 培養した。培養期間の後、この感染バクテリアを、100mlの予備加熱した(37℃)N ZYCM培地に接種するのに使用し、次いで、250rpmの新型ブルンスビック回転震盪 機中で、37℃で９〜12時間培養した。その期間経過後、バクテリは溶解した。バ クテリアの破片(debris)を、ソーバル高速遠心分離機で、４℃で、10,000rpmで 、10分間の遠心分離で除去した。10ｇのポリエチレングリコール-6000及び11.7 ｇのNaClを添加し、溶液を、４℃で一昼夜貯蔵して、得られた上澄み液(100ml) からファージを沈殿させた。沈殿したファージを、１４，０００ｘｇで、４℃で 、２０分間の遠心分離によって回収した。上澄み液を吸引濾過で除去し、最後の 液の残りを、紙タオルを使用して除去した。ファージを、４ｍｌＳＭバッファー 中に注意深く再懸濁し、等容量のクロロホルムで一度抽出した。 ＤＮＡをファージ粒子から抽出する前に、溶解バクテリア起源のＤＮＡとＲＮ Ａを、ＤＮaseＩとＲＮase A（共に１００μｇ／ｍｌ）と一緒に、ファージ懸濁 液を、３７℃で、３０分間培養して除去した。次いで、最終濃度２０ｍＭまでＥ ＤＴＡを添加して、ファージからファージＤＮＡを放出させながら、等容量のフ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)で２度抽出して、溶 液からタンパク質を除去した。ソーバル遠心分離機を使用して（14,000ｘｇ、 １０分間）、遠心分離でファージを分離後、水性相を、等容量のクロロホルム／ イソアミルアルコール（24:1）で一度抽出した。この相を、遠心分離で分離後、 0.1容量の5M過塩素酸ナトリウムと0.1容量のイソプロパノールを添加して水性相 からＤＮＡを沈殿させ、氷上で、３０分間培養した。４℃、１０分間（１４，０ ００ｘｇ）での遠心分離によって、ＤＮＡを回収した。上澄み液を吸引濾過で除 去した後、４００μｌＴＥバッファー中に、ＤＮＡを再懸濁した。0.1容量の3M 酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを添加して、この溶液からＤＮＡを再度沈 殿させた。４℃で、１０分間の遠心分離によって（１４，０００ｘｇ）ＤＮＡを 回収した。上澄み液を吸引濾過で除去し、残ったペレットを真空下で簡単に乾燥 し、その後、ＤＮＡを、0.1μg/mlのＲＮase Aを含む125μlTEバッファー中に再 懸濁した。この精製方法は、各ファージから、凡そ50〜100μｇＤＮＡの単離を もたらした。 実施例４．８：ファージを含むアスペルギルス・ニガー変異体ニガーａｘｄＡ ＤＮＡのサザーン分析 ファージλnigaxd1からλnigaxd4までの単離ＤＮＡを、次の制限酵素を使用し て、サザーン分析で分析した；KpnI、SalI、SstI、XbaI及びXhoI、及び次の溶液 から成る反応混合物中で、５時間、３７℃で、KpnI+XbaI、KpnI+SstI及びKpnI+X hoIを組み合わせたもの；５μｌ（≒１μｇ）ＤＮＡ溶液、２μｌの凡そ１０ｘ リアクトバッファー(BRL)、10Ｕの制限酵素(BRL)及び２０μｌの最終容量とする 為の滅菌蒸留水。消化後、ＤＮＡを、0.1容量の3M酢酸ナトリウム及び２容量の エタノールを添加して沈殿させた。このＤＮＡを、１０分間、室温で、遠心分離 （１４，０００ｘｇ）によって回収した。上澄み液を、吸引濾過で除去し、残っ たペレットを真空下で簡単に乾燥し、滅菌蒸留水に再懸濁した。４μｌＤＮＡロ ーディングバッファーを添加後、サンプルを１０分間、６５℃で培養し、ＴＡＥ バッファー中の０．６％アガロースゲル上にサンプルをロードする前に、氷上で 急速に冷却した。ＤＮＡフラグメントを、２５Ｖで、１５〜１８時間の電気泳動 で分離した。 電気泳動後、ＤＮＡを移入し、指示マニュアル(pp．25-26)通りに、ナイロン 膜(HybondN、Amersham)にアルカリ真空ブロッティング(alkaline vacuum blotti ng)(VacuGene XL，Pharmacia LKB)する事により変性し、次いで、プレハイブリ ダイズし、実施例４．６と同じ標識化アスペルギルス・ニガーaxdA cDNAクロー ンと、実施例３．３に開示のハイブリダイゼイション条件を使用してハイブリダ イズした。ハイブリダイゼイションパターンは、同定スクリーンを使用して、コ ダックXAR X-線フィルムを18時間、-70℃で曝露して得た。 得られた結果から、４つの単離されたクローンの全てが、アスペルギルス・ニ ガーaxdA cDNAでハイブリダイズされたと結論した。４つのクローン全てにおい て、同じゲノム領域起源のフラグメントが見つかった。 実施例４．９：アスペルギルス・ニガー変異体ニガーaxdA遺伝子のサブクローニ ング λnigaxd1由来の３．７ｋｂXhoIを、凍結圧搾方法(freeze-squeeze method)で 、0.7%アガロースゲルから単離した。電気泳動後に、適当なバンドをスライスし 、１ｍｌＦＳ１溶液（０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０；１ｍＭＥＤＴＡ） 中で３０分間穏やかに震盪した。アガローススライスを、小さなシリカガラスウ ールプラグを含み、底に穴がある、液体窒素で冷凍された、０．５ｍｌエッペン ドルフチューブに移した。次いで、この０．５ｍｌのチューブを、１．５ｍｌの エッペンドルフチューブに移し、次いで１０分間遠心分離に掛けた。上澄み液に 、1/50容量のFS2溶液(0.5MMgCl2; 5%酢酸)を添加し、2.5%容量の100%エタノール を添加した。-70℃で、20分培養後、ＤＮＡを、４℃、１４、０００ｘｇで１５ 分間の遠心分離で回収した。上澄み液を除去後、ＤＮＡペレットを、サーバント スピードバック真空遠心分離機(Savant Speedvac vacuum centrifuge)を使用し て乾燥した。ＤＮＡを、１０μｌＴＥバッファーに溶解し、濃度を、対照の既知 濃度のλＤＮＡと、ＤＮＡ検出の為のエチジウムブロマイド染色を使用してアガ ロース電気泳動で決定した。 ベクターPbluescript SK-を、XhoIで消化し、次の様に調製したアルカリホス ファターゼで脱リン酸塩化した: １μｌ（１μｇ／μｌ）pBluescripを、２μｌ の１０＊リアクト２(BRL)、１μｌ（１Ｕ／μｌ）XhoI及び16μｌ滅菌蒸留水と 混合した。ＤＮＡを、３７℃で、２時間消化した後、０．５μｌアルカリホスフ ァーゼ（１Ｕ／μｌ）(Pharmacia)を添加し、次いで、37℃で、追加の30分間、 更なる培養を行った。上述の0.7%アガロースゲルから、線状化ベクターを単離し た。 3.7 kb XhoIフラグメントを、XhoIで消化され、脱リン酸塩化されたpBluescri pt SK-ベクターで、次の方法を経て結紮した: 40ngのpBluescriptフラグメント を、300ngの3.7 kb XhoIフラグメントと、４μｌの５＊結紮バッファー（500mM Tris-HCl、pH 7.6; 100mM MgCl2; 10mM ATP; 10mMジチオスレイトール; 25% PEG -6000）と混合し、１μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ(BRL)を、この混 合物に添加し、２０μｌの最終容量とした。得られたプラスミドを、pIM3002と 名付けた。16℃、16時間の培養後、混合物をCa-HEPES、pH7.0バッファーで100μ lに希釈した。希釈混合物の10μlを、次の様に調製した形質転換大腸菌DH５αコ ンピテント細胞に使用した：２００μｌの大腸菌DH５αの一昼夜培養物をＬＢ培 地（１０００ｍｌ当たりのＬＢ培地：１０ｇのトリプチカーゼペプトーン(BRL) 、５ｇの酵母抽出物(BBL)、１０ｇのNaCl、0.5mMのTris-HCl、pH7.5）で、予備 増殖した。この培養物を、その密度が0.15-0.2のO.D.600相当になるまで、37℃ で、オービタルシェーカー中で培養した。次いで、バクテリアを、４℃で、５０ ００rpmで遠心分離に掛けて回収した。上澄み液を棄てた後、細胞を氷上で、一 定に保持した。バクテリアペレットを、上述の遠心分離に続いて、この細胞を再 懸濁する事によって、100mlの100mMMgCl2、5mM Tris-HCl、pH7.4で洗浄した。こ れを、100mlの100mMCaCl2、5mM Tris-HCl、pH7.4で繰り返した。最後に、細胞を 、２mlの100mMCaCl2、5mM Tris-HCl、pH7.4、14%のグリセロール中に再懸濁した 。アリコット(50μl)を、直ちに形質転換又は-70℃での凍結用に使用した。 大腸菌DH５αコンピテント細胞を、50μｌの細胞上澄み液と、4.5μｌの結紮 混合物との組み合わせによって、形質転換実験に使用した。氷上での30分間培養 後、細胞を42℃で、２分間培養した。次いで、１ｍｌのＬＢ培地を添加し、細胞 を３７℃で１時間培養した。次いで、バクテリアを３０秒間、１４，０００ｇの 遠心分離で回収した。上澄み液を棄てた後、細胞を２００μｌのＬＢ培地に再懸 濁した。得られたバクテリア上澄み液を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０ μｇ／ｍｌX-ゲル及び６０μｇ／ｍｌIPTGを含むＬＢ培地でプレート化した。 得られたコロニーの内１２を選択し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ Ｂ培地で一昼夜増殖した。培養物プラスミドＤＮＡを、マニアチス等(Maniatis et al.，1982，pp．368-369)の開示する、望ましいプラスミドが住むクローンを 選択する為の、実施例４．３で開示する制限分析で使用されるアルカリ細胞溶解 方法で単離した。プラスミドＤＮＡを、製造指示書により、ヌクレオボンドPC-5 00キット(Nagel)を使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で 増殖したプラスミドpIM3002を含む大腸菌DH５α培養物250mlから、大規模に単離 した。プラスミドpIM3002を、更に、図４で示される制限マップで得られる制限 酵素で分析した。プラスミドpIM3002を含む大腸菌DH５αのサンプルを、オラン ダのバールンのＣＢＳに、1995年８月28日付けで、番号ＣＢＳ６３７．９５で寄 託した。 実施例４．１０：アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９でのクローン化遺伝子の過 剰発現 実施例４．１０．１：同時形質転換による、アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９ でのアスペルギルス・ニガー変異体ａｘｄＡの導入 実施例４．９で得られたプラスミドpIM3002を、同時形質転換プラスミドとし てのプラスミドpGW635(Goosen et al.，1987)及びプラスミドpIM3002について、 選択マーカーとしてアスペルギルス・ニガーpyrAを使用して、アスペルギルス・ ニガーＮＷ２１９の同時形質転換によって、アスペルギルス・ニガーに導入した 。 アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９のサンプルを、オランダのバールンのＣＢ Ｓに、1995年８月25日付けで、番号ＣＢＳ６３５．９５で寄託した。 プロトプラストを、0.5%酵母抽出物、0.2%カザミノ酸、50mMグルコース、10mM ニコチン酸アミド及び10mMウリジンで補充した無機培地で、アスペルギルス・ニ ガーＮＷ２１９を、30℃で、18時間増殖する事によってマイセリウムから調製し た。アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９のプロトプラストの調製及び形質転換方 法は、グーセン等(Goosen et al.，1987)の開示に従って行った。得られたPYR+ 形質転換体を、ウエスターンブロット分析で、アスペルギルス・ニガー変異体ニ ガーａｘｄＡ遺伝子の発現について分析した。 実施例４．１０．２：アスペルギルス・ニガー変異体ニガーａｘｄＡ遺伝子の発 現の為の形質転換体のスクリーニング 実施例４．１０．１で得られた形質転換体の、アスペルギルス・ニガー変異体 ニガーａｘｄＡ遺伝子生成物、ＡＸＤＡNIGタンパク質の形成について分析した 。 ＡＸＤＡNIGの分析には、１９の形質転換体を増殖実験に使用した。アスペル ギルス・ニガーＮ４０２株は、野生型対照物として使用した。形質転換体を、実 施例３．１と同様に、２４、４０、４８及び６８時間で増殖した。増殖後、マイ セリウムを濾過によって除去し、培養物ろ液を、兎で、ＡＸＤＡTUBに対して生 起する抗体を使用して（実施例４．１）、ウエスターンブロッティングで分析し た。分析された１９の形質転換体の内の８つが、この方法によって検出された様 に、ＡＸＤＡNIGタンパク質を過剰産生した。 実施例４．１１：アスペルギルス・ニガー変異体ニガーａｘｄＡ遺伝子の配列分 析及び配列 アスペルギルス・ニガー変異体ニガーａｘｄＡ遺伝子の配列、そのプロモータ ー／調節領域、遺伝子の構造的部分及びターミネーション領域を、配列反応で、 プライマーとして特定のオリゴヌクレオチドの使用との組み合わせで、pBluescr ipt SK-及びpUC19で、pIM3002からのフラグメントをサブクローニングして決定 した。ヌクレオチド配列は、実施例４．４で開示の通りに決定した（配列番号： ５）。 得られた配列は、２１０１ｂｐ、５′非コード領域で７８３ｂｐ及び３′非コ ード領域で３２２ｂｐから成る。５′非コード領域では、ＴＡＴＡボックスが、 ６６５−６７０の位置で見つかった。アスペルギルス・ニガーａｘｄＡ遺伝子の コード部分は、９９６ｂｐ長であり、イントロンによる割り込みはない。遺伝子 は、３３２アミノ酸サイズでタンパク質をコードする。アスペルギルス・ニガー 変異体チュービゲンシスＡＸＤＡタンパク質を基に、実施例１．５．１で決定し た様に、Ｎ−末端配列は、２６アミノ酸長のプレペプチドで先行される。成熟タ ンパク質は、３０６アミノ酸サイズであり、３３．１０１kDaの推定分子量と、4 .07の理論等電点を有する。 実施例５．１：ＰＣＲで得られるアスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシ スａｘｄＡから成るｃＤＮＡフラグメントのクローニング 実施例５．１．１：ＰＣＲによるｃＤＮＡフラグメントの発生 ＡＸＤＡTUBに対して決定された内部ＣＮＢｒフラグメント（配列番号：２） の部分的アミノ酸配列を、オリゴヌクレオチド混合物を設計する為に使用した。 次の混合物が誘導された。 ５′−ＡＴＧ−ＡＴＫ−ＧＴＩ−ＧＡＲ−ＧＣＩ−ＡＴＫ−ＧＧ−３′(20mer )（配列番号：３）、ただし、Ｉはイノシンを、ＫはＡ、Ｔ又はＣを、そしてＲ はＡ又はＧを表す。このオリゴヌクレオチドは、アミノ酸１（Ｉ）からアミノ酸 ６Ｇの、実施例１．４．２において、上述のＡＸＤＡTUBの内部アミノ酸配列か ら誘導された。ＡＴＧは、ＣＮＢｒ−開裂メカニズムで、ペプチドフラグメント のＮ−末端に存在することが知られているメチオニンから誘導された。 オリゴヌクレオチド混合物を、オリゴヌクレオチドＴ７(Stratagene)５′−Ａ ＡＴ−ＡＣＧ−ＡＣＴ−ＣＡＣ−ＴＡＴ−ＡＧ−３′(17mer)（配列番号：４） との組み合わせで、実施例４．７と同様に単離されたｃＤＮＡを使用して、ＰＣ Ｒ(Saiki et al.，1988)で使用した。 ＰＣＲの為、得られたλ−ｃＤＮＡの２μｌを、５μｌの１０＊リアクション バッファー(100mMTris-HCl、pH8.3; 500mlKCl; 15mMMgCl2; 0.01%ゼラチン)、4. 0μｌの1.25mMの４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び最終容量の5 0μｌ中の0.5μｇのオリゴヌクレオチドと組み合わせた。この反応混合物を混合 し、0.5μｌのTAQポリメラーゼ(5U/μｌ)(HT Biotechnology，Cambridge UK)を 添加した。ＤＮＡを、９５℃で、３分間、次いで９５℃で、１分間、４２℃で１ 分間及び７２℃で１分間の２５サイクルでの培養で、加熱変性した。２５サイク ルの後、混合物を７２℃で５分間培養した。反応生成物の分析では、約５００ｂ ｐと６００ｂｐの２つの不連続生成物を示した。ＡＸＤＡの３２ｋＤａの見掛け 分子量とＣＮＢｒペプチドの９ｋＤａの見掛け分子量を基にして、このフラグメ ントは、期待された制限内にあった。 実施例５．１．２：５００ｂｐ及び６００ｂｐＰＣＲフラグメントのクローニン グ及び分析 実施例５．１．２．１：５００ｂｐ及び６００ｂｐＰＣＲフラグメントのクロー ニング ５００ｂｐ及び６００ｂｐＰＣＲフラグメントを、製造指示書によって、ｐＧ ＥＭ−Ｔ（商標）(Promega)ベクター中に結紮した。14℃で16時間の培養後、4.5 μｌの結紮混合物を、大腸菌DH５αコンピテント細胞を形質転換するのに使用し た。各結紮から、得られたコロニーの内の６つを選択し、１００μｇ／ｍｌアン ピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜増殖した。培養物から、プラスミドＤＮＡを、 マニアチス等(Maniatis et al.，1982，pp．368-369)の開示するアルカリ細胞溶 解法で単離した。 実施例５．１．２．２．：５００ｂｐ及び６００ｂｐＰＣＲフラグメントの配列 分析 ５００ｂｐ及び６００ｂｐＰＣＲフラグメントの一次構造を、実施例４．４同 様に、フラグメントの配列決定法によって決定した。 両ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列のコンピューター分析は、６００ｂ ｐＰＣＲフラグメントは、既知のアラビノキシラン分解遺伝子には全く類似せず 、それ故人工産物と見られることを示した。５００ｂｐＰＣＲフラグメントのヌ クレオチド配列は、ヌクレオチド７０６〜１２０４の図４で示されるｃＤＮＡク ローンのヌクレオチド配列に非常に類似していた。 実施例５．２：５００ｂｐＰＣＲフラグメントの32P-標識化 ＰＣＲで得られた５００ｂｐフラグメントを単離し、EPA91205944.5(公開番号 0463706A1、実施例2.2及び7.1、参照としてここの導入される)に開示の通りに標 識化した。 実施例５．３：ａｘｄＡ遺伝子のアスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシ スゲノムライブラリーのスクリーニング ａｘｄＡ遺伝子の為に、EPA91205944.5(公開番号0463706A1)の実施例２で開示 される様に構築されたアスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスゲノムラ イブラリーのスクリーニングの為に、３ｘ１０3pfu／プレートを、実施例４．６ 同様に、プローブとして、実施例５．１．１と同様に調製した32P-標識化５００ ｂｐＰＣＲフラグメントでプレート化した。 レプリカフィルター上に複製表示される、３つのハイブリダイジングプラーク を同定し、λtubaxh1〜λtubaxh3と名付けた。このプラークを単離し、実施例４ ．６と同様に増殖した。 実施例５．４：ファージ含有アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａ ｘｄＡＤＮＡのサザーン分析 ＤＮＡを、実施例４．７同様に、λバクテリオファージから単離した。ファー ジλtubaxd1〜λtubaxd3の単離されたＤＮＡを、次の制限酵素を使用して、サザ ーン分析によって分析した：BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、SalI、SstI及びXho I。サザーン分析は、実施例４．８同様に行った。 得られた結果から、３つの単離されたクローン全てのＤＮＡが、アスペルギル ス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡｃＤＮＡでハイブリダイズされたと 結論された。３つのクローン全てに、同じゲノム領域起源のフラグメントが見つ かった。 実施例５．５：アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子 のサブクローニング λtubaxd3由来の５．５ｋｂSstIフラグメントを単離し、実施例４．９と同様 に、pIM3001と名付けられるプラスミドとなる、消化され、脱リン酸塩化された ベクターpBluescript SK-SSstI中に結紮した。プラスミドpIM3001を、図６に示 される制限マップとなる制限酵素によって、更に分析した。pIM3001を含む大腸 菌DH５αのサンプルを、オランダのバールンのＣＢＳに、1995年８月28日付けで 、番号ＣＢＳ６３６．９５で寄託した。 実施例５．６：アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９でのコローン化アスペルギル ス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子の発現 実施例５．６．１：同時形質転換による、アスペルギルス・ニガーＮＷ２１９で のアスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子の導入 実施例５．５で得たプラスミドpIM3001を、実施例４．１０．１と同様に、ア スペルギルス・ニガーＮＷ２１９の同時形質転換で、アスペルギルス・ニガー中 に導入した。次いで、ウエスターンブロット分析で、得られたＰＹＲ+形質転換 体の、アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子の発現に ついて分析した。 実施例５．６．２：アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺 伝子の発現の為の形質転換体のスクリーニング 実施例５．６．１で得られた形質転換体を、アスペルギルス・ニガー変異体チ ュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子生成物、ＡＸＤＡTUBタンパク質の形成について 分析した。これら形質転換体の内の19を、ＡＸＤＡTUB発現についての分析の為 の増殖実験に使用した。アスペルギルス・ニガーＮ４０２株を、野生型対照物と して使用した。形質転換体を、実施例３．１同様に、２０、４１、６０及び８６ 時間増殖した。増殖後、マイセリウムを、濾過によって除去し、培養物ろ液を、 兎で、ＡＸＤＡTUBに対して生起する抗体を使用して（実施例４．１）、ウエス ターンブロッティングで分析した。分析された１９の形質転換体の内の12が、こ の方法によって検出されたＡＸＤＡTUBタンパク質を産生した。 実施例５．７：アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子 の配列分析及び配列 アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子の配列、その プロモーター／調節領域、遺伝子の構造的部分及びターミネーション領域を、配 列反応で、プライマーとして特定のオリゴヌクレオチドの使用との組み合わせで 、pBluescript SK-及びpUC19で、pIM3001からフラグメントをサブクローニング して決定した。ヌクレオチド配列は、実施例４．４で開示の通りに決定した（配 列番号：７）。 得られた配列は、２８５９ｂｐ、５′非コード領域で８２３ｂｐ及び３′非コ ード領域で１０４１ｂｐから成る。５′非コード領域では、ＣＡＡＴボックスが 、６５１−６５５の位置で、そしてＴＡＴＡボックスが、７１３−７２０の位置 で見つかった。アスペルギルス・ニガー変異体チュービゲンシスａｘｄＡ遺伝子 のコード部分は、９９６ｂｐ長であり、イントロンによる割り込みはない。遺伝 子は、サイズで３３２アミノ酸タンパク質をコードする。実施例１．５．１で決 定し た様な、Ｎ−末端配列は、２６アミノ酸長のプレペプチドで先行される。成熟タ ンパク質は、３０６アミノ酸サイズであり、３３．２５０kDaの推定分子量と、4 .20の理論等電点を有する。 実施例６．１：水不溶性固体（ＷＩＳ）の単離 試験管内消化システムの為、トウモロコシの不溶性重合体画分を単離した。ト ウモロコシをレッチ粉砕機(Retsch miller)で、粉(3mm)にし、６時間、ヘキサン （蒸留の為のソックスレー構成）で脱脂した。脱脂後、トウモロコシを１０５℃ で乾燥し、再度粉にした(1mm、Retsch miller)。400gの脱脂トウモロコシに、1. 51の1.5%SDS/0.5%β−メルカプトエタノールを添加し、室温で（タンパク質を破 壊する為に）１時間攪拌後、１５分間、２４，０００ｇで遠心分離に掛けた。タ ンパク質の変性後、ペレットを１１のＳＤＳ／β−メルカプトエタノールで３度 洗浄し、１１の蒸留水で２度洗浄した。ペレットを４１の脱イオン水に再懸濁し 、３２μｍで篩分けした。この洗浄方法及び篩分けを繰り返した。粗ＷＩＳ画分 ペレット（３２μｍより大きい）を１１のマレエートバッファー(pH6.5)に溶解 し、90℃で、50分間培養した。２ｍｇのα−アミラーゼ(Maxamyl（商標）、Gist -brocades)を添加し、30℃で16時間培養後、15分間、24,000gで遠心分離に掛け た。この酵素消化を繰り返した後、ペレットを、65℃の脱イオン水で３度洗浄し た。このペレット（ＷＩＳ）を凍結乾燥した。このＷＩＳは、３０％のキシロー ス、２９％のアラビノース、２３％のグルコース及び７％のガラクトースを含ん でいた。グルコースは、澱粉では無いことを決定した(Boeringer Mannheim、sta rch testkit)。 実施例６．２：家禽の試験管内消化システム ＷＩＳの乾燥物質含有量を、１２０℃で、乾燥前後のＷＩＳ重量の決定によっ て決定した（95.73%）。 家禽の試験管内消化システムで、１ｇのＷＩＳに対して、２００μのNaN3(Mer ck)及び１ｍｌの内部標準（ソルビトール、３５ｍｇ／ｍｌ、シグマ）を添加し た。酵素穀物消化（（２００μｇのタンパク質）酵素で又は酵素無しで）の為に 、サンプルを、１５ｍｌまで、バッファー(酢酸ナトリウム、pH5.5)で充たし、3 9℃で１時間培養した。胃消化の為に、５ｍｌのペプシン(5.28g/l、pH3.0:Merck )を添加し39℃で1.5時間培養した。腸消化の為に、2.5mlのパンクレアチン／胆 汁塩(それぞれに１６ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ、Merck)を添加し、39℃で1.5時間培 養した。サンプルを15分間、2800ｇで遠心分離に掛けた。上澄み液を、酵素消化 中に放出された単糖類を測定する為に使用した(HPLC、Spectra Physics; HPX-87 Pカラム、Biorad)。ペレットを、120℃で乾燥し、重量を決定した。乾燥物質の 割合を計算した。 対照として、試験管内システムで、粗酵素調製物の投与量応答(dose response )を添加した（結果は、図３に示される）。ＡＸＤＡ酵素（２００μｇのＡＸＤ Ａタンパク質が添加された）は、対照のものに比較して、乾燥物質消化の著しい 増加を示した。 トウモロコシＷＩＳ画分での１５．８％の乾燥物質含有量の割合は、対照のト ウモロコシＷＩＳに対して４．１％の増加であった。 実施例７：トウモロコシＷＩＳでの試験管内消化性実験 実施例７．１：トウモロコシＷＩＳの単離 ＳＤＳ／メルカプトエタノール培養は動物飼料には適用できないので、幾分変 更して実施例６同様に、トウモロコシＷＩＳの単離を行った。単離方法は、１ｋ ｇの脱脂トウモロコシについて行った。この１ｋｇの脱脂トウモロコシに、４ｇ のパペイン(papain)(Gist-brocades)／100gトウモロコシタンパク質を添加し、3 0℃で２時間懸濁した。この後、懸濁液を１００℃で、マクサミル(Maxamyl)（商 標）(Gist-brocades)(2ml/l)で消化し、15分間、24,000ｇの遠心分離に掛けた。 上澄み液を棄て、この酵素消化方法を、ペレットについて繰り返した。上澄み液 を再度遠心分離に掛け、脱イオン水(11)で３度洗浄した。洗浄後、ペレッ ト（水不溶固体）を凍結乾燥した。 トウモロコシＷＩＳのモノ／オリゴサッカライド含有量を、トリフルオロサク サン（ＴＦＡ）分析で決定した。０．３ｇのＷＩＳに、１ｍｌの３５ｍｇ／ｍｌ ソルビトール（内部標準）、２ｍｌの脱イオン水及び４５０μｌのＴＦＡを添加 し、次いで１２０℃で１時間加水分解した。冷却後、２０ｍｌの脱イオン水を添 加し、加水分解を、１２０℃で１時間続けた。冷却後、サンプルを凍結乾燥し、 ３ｍｌの脱イオン水に再懸濁した。単糖類を、ＨＰＬＣシステム(Spectra Physi cs)で、ＨＰＸ−８７カラム(Boirad)で除去した。トウモロコシのＷＩＳ重合体 画分は、124.8mg/gのキシロース、96.6mg/gのアラビノース、28.2mg/gのガラク トース及び156.0mg/gのグルコースを含んでいた。高グルコース含有量なので、 ＷＩＳ画分を、澱粉(澱粉テストキット、Boehringer Mannhaim)の分析に掛けた 。ＷＩＳ画分は、何等澱粉を含まないことが分かった。 実施例７．２：ブロイラーでの消化性実験 卜ウモロコシ由来のＷＩＳ２０％を添加した飼料の真の新陳代謝性エネルギー 含量についての酵素ＡＸＤＡの影響を検出する為の実験を行った。使用した方法 は、変更「シブバルド−アッセイ」(modified“sibbald-assay”)であった。 雄のブロイラー（３週令）を、環境調節した部屋で、個々に籠の中に入れた。 動物は４８時間絶食させた。次いで、正確に決めた量の肥料を、チューブで与え た。内因性エネルギー含有成分の損失を補正する為に、対照グループを実験に含 めた。これらの動物に、１０ｇのＤ−グルコースを与え、その他のものは１０ｇ の飼料を与えた。各飼料が６つの動物に与えられた。グルコース対照グループは ５つの動物から成る。 動物を別に４８時間断食させ、その間に、排泄物を定量的に回収した。排泄物 を、分析が行われるまで、−２０℃で貯蔵した。この期間中１度だけ動物は水を 使い、１度だけチューブで水が与えられた。 回収された消化物を凍結乾燥し、空気になじませた後に計量した。飼料サンプ ル中及び、消化物乾燥物質のサンプル中の窒素及びエネルギー含有量を分析した 。 対照動物の結果は、実験飼料供給された動物の結果を補正するのに使用した。 適用された方法は、マクナブ及びブレアー(McNab and Blair，1988)開示の実験 方法の適用である。その論文で、分析及び計算の方法が与えられる。 又、実施例６．２記載の方法で、試験管内乾燥物質消化性測定を行った。 実験処理は次の通りであった。 Ｉ トウモロコシ基体飼料（表２） II トウモロコシ基体飼料＋１０％トウモロコシＷＩＳ III トウモロコシ基体飼料＋２０％トウモロコシＷＩＳ IV トウモロコシ基体飼料＋２０％トウモロコシＷＩＳ＋100mg/kgＡＸＤＡ Ｖ トウモロコシ基体飼料＋２０％トウモロコシＷＩＳ＋45mg/kg粗酵素 VI トウモロコシ基体飼料＋２０％トウモロコシＷＩＳ＋90mg/kg粗酵素 VII トウモロコシ基体飼料＋２０％トウモロコシＷＩＳ＋200mg/kgエンドキシラ ナーゼ 基体食物の組成は表２に示される。 ビタミン／ミネラルプレミックスは、飼料のｋｇ当たりで配合した：リボフラ ビン４ｍｇ、ナイアシン４０ｍｇ、ｄ−パントテン酸１２ｍｇ、コリン−クロラ イド５００ｍｇ、Ｂ１２を１５μｇ、Ｅを１５ｍｇ、Ｋ３を５ｍｇ、レチニルア セテート３．４４ｍｇ、コレカルシフェロール５０μｇ、ビオチン０．１ｍｇ、 葉酸０．７５ｍｇ、FeSO4・7H2Oを３００ｍｇ、MnO2を100mg、CuSO4・5H2Oを100 mg、ZnSO4・7H2Oを150mg、Na2SeO3を0.15mg、酸化防止剤100mg及びバージニアマ イシン(virginiamycin)20mg。 結果（窒素(TMEn)に対して補正された真の新陳代謝可能なエネルギー及び試験 管内アッセイの結果）は表３に示される。 TMEn-レベルは、トウモロコシWIS添加の増加と共に、著しく減少した。 全ての酵素調製物は、TEMn値を改善したが、エンドキシラナーゼの+7.0%、AXD Aの+10.7%だけが顕著であった。平均値では、AXDAは、10％トウモロコシＷＩＳ で補充された基体飼料のレベルまでエネルギー値を改善した。 試験管内モデル（ニワトリでの消化過程を模擬している）では、ＡＸＤＡは、 乾燥物質消化を大いに改善した（＋２４．５％）。エンドキシラナーゼと粗酵素 調製物は、このモデルでは、ＡＸＤＡ同様の効果は示さなかった。 実施例８：パン焼きでのＡＸＤＡ 薄いパンを使用して、ＡＸＤＡを、パプローフベーキングテスト(puploaf bak ing test)でテストした。200gの小麦粉(Robijin（商標）／Columbus（商標）80/ 20)、104mlの水、1.4gの乾燥ベーカーイースト(Fermipan（商標）)、４ｇの塩、 ３ｇの砂糖、４００ｍｇのCaCl2・2H2O、３ｍｇ(15ppm)のアスコルビン酸及び５ ｍｇ(25ppm)の菌類α-アミラーゼ(Fermizyme（商標）P200)と25μｇの精製AXDA を混合して得た150gのパン生地から、パプローフを焼いた。ピンミキサーで、52 rpmで、６分１５秒間混合後、パン生地を分割し、３０℃で４５分間ねかせ、パ ンチし、別に２５分間ねかせ、型にしてパンにかけた。３０℃で７０分間の最後 のねかせの後、パン生地を２２５℃で２０分間焼いた。ローフの容量を、ラペシ ード置き換え法(rapeseed displacement method)で決定した。ローフの容量は、 ４９０ｍｌ（対照）から、ＡＸＤＡを含むローフの５３５ｍｌへ増加、即ち９％ 増加した。 Detailed Description of the Invention                         Arabinoxylan degrading enzymeTechnical field   The present invention relates to the field of molecular biology, and in particular, it exhibits arabinoxylan degrading activity. The present invention relates to cloning and expression of a gene encoding a lipid peptide. This enzyme Industries such as baking, paper and pulp processing and feed and food preparation (additives) Suitable for use in the method.Background of the Invention   The composition of plant cell walls is complex and varied. Polysaccharides are long-chain cellulose (Main structural component of plant cell wall), hemicellulose (consisting of various β-xylan chains ) And in the form of pectin. Occurrence, distribution and structure of plant cell wall polysaccharides Artificial elements are (1) plant species, (2) system (Variety), (3) tissue type, (4) growth line , (5) age and (6) treatment of plant material prior to feeding.   Monocots (eg cereals and grasses) and dicots (eg clover, vegetables) Seeds and soybeans) and between plant seeds and growing parts. (Chesson, 1987: Carre and Brillouet, 1986).   Monocotyledonous plants contain arabinoxylan complexes, such as the large hemicellulose backbone. There is a feature. The main structure of hemicellulose in dicots is xyloglucan complex. It is united. Furthermore, higher pectin concentrations are found in dicotyledons than in monocots. Is done. Seeds are generally very high in pectin material, while cellulosic material is Relatively few.   About three interacting polysaccharide structures can be distinguished in the cell wall. (1) The intermediate lamella forms the outer cell wall. Also in the plant tissue matrix Thus, they act as attachment points for individual cells. Intermediate lamellae are mainly highly Consists of a calcium salt of pectin that has been stealized. (2) The first wall is located just inside the middle lamella. Pectin, hemicellulo Encapsulated in an amorphous matrix of phenolics, phenolic esters and proteins It is a well-organized structure of cellulose microfibrils. (3) The second wall is formed as the plant matures. During plant growth and senescence Ultrafine cellulose fibers, hemicellulose, and lignin are deposited on the surface.   Primary cell wall of maturation, metabolically active plant cells (eg mesophyll and epithelium) At this stage is more susceptible to enzymatic hydrolysis than the highly ligninized second cell wall. Sensitive.   There is a high degree of interaction between cellulose, hemicellulose and pectin in the cell wall. There is an effect. Enzymatic degradation of these rather rather strongly cross-linked polysaccharide structures Not a simple method. For example, to completely destroy arabinoxylan, At least 5 different enzymes are required. Endo-cleavage is the end- This is effectively done by the use of β (1 → 4) -D-xylanase. Exo- ( 1 → 4) -D-xylanase releases xylose units at the non-reducing end of polysaccharides You. Three other enzymes (α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase And acetylesterase) are used to attack substitutions on the xylan backbone. It is. The choice of a particular enzyme depends, of course, on the particular hemicellulose to be degraded. (McCleary and Matheson, 1986).   Enzymes that attack the side chains of the xylan backbone cause them to alter the properties of the polymer. , It is interesting because it will be suitable for some applications. Furthermore those enzymes May act synergistically with the endo-xylanase that cleaves the backbone. (For more details, Kormelink, 1992, PhD thesis, University of Wageningen See).   DNA fragments encoding arabinoxylan degrading activity are known. Yaw Roppa Patent Application No. 463,706 includes Aspergillus tubevigensis. , characterization and gene clones of endo-xylanase from L. tubigensis) Is disclosed. This enzyme cannot attack the side chains of the arabinoxylan backbone.   Also, the enzyme activity that can attack the side chain is known to originate from Aspergillus niger. (Kormelink, 1992, supra, Chapters 6 and 7). Arabinofuranosidase A ( The enzyme called Arafur A is an oligo derived from arabinoxylan. It is characterized by the ability to release arabinose residues from the saccharide structure. However However, Alaflu A is not active on high molecular weight substances. In addition, Aspergillus ni Gar produces an enzyme called Arafur B, which is an oligosaccharide It is active on both ride and high molecular weight arabinoxylan structures. Alaflu B enzyme Activity limited to releasing arabinose residues from terminally substituted xylose residues Is done. No DNA fragment is known so far.   Non-terminal single in both oligosaccharide and high molecular weight arabinoxylan structures The activity of releasing an arabinose residue from a substituted xylose residue is Aspergillus ・ Isolated from Asperugillus awamori. This enzyme is arabino It is named xylan arabinofuranose hydrolase (AXH). Up to now However, no DNA fragment and / or sequence data are available. Arabinoxyla It is clear that all the enzymes involved in protein degradation have not yet been detected (Kormeli nk 1990).   For example, no enzyme attacks the xylose molecule that is doubly substituted with arabinose. But not found. The reason is that these enzymes are secreted only in small amounts. It is. Molecular cloning and overproduction of these enzymes in a suitable host is easy. But not in sufficient quantities to evaluate their significance in various applications. It is a way to get the element.Summary of the Invention   The present invention provides a polypeptide having arabinoxylan degrading activity, or a polypeptide thereof. Providing a recombinant DNA consisting of a DNA fragment encoding a polypeptide precursor DNA fragment, (A) a poly having an amino acid sequence represented by amino acids 1 to 306 of SEQ ID NO: 5 Peptides or polypeptides of polypeptides represented by amino acids -27-306 A DNA fragment encoding the precursor, (B) Poly having the amino acid sequence represented by amino acids 1 to 306 of SEQ ID NO: 7 Peptides or polypeptides of polypeptides represented by amino acids -27-306 A DNA fragment encoding the precursor, (C) As shown in SEQ ID NO: 5 or 7, which still has arabinoxylan degrading activity. A variant or portion of the polypeptide represented by amino acid residues 1 to 306 described above Or a DNA fragment encoding these precursors, (D) a polypeptide which has arabinoxylan degrading activity and which has a sequence number Nucleotides 784-1779 of No. 5 or nucleotides 823-1 of SEQ ID NO: 7 A DNA fragment having the nucleotide sequence represented by 818, (E) a polypeptide having arabinoxylan degrading activity or a polypeptide thereof A DNA fragment encoding a portion of nucleotide 78 of SEQ ID NO: 5 4 to 1779 or DN represented by nucleotides 823 to 1818 of SEQ ID NO: 7 A DNA fragment capable of hybridizing to the A fragment, It is characterized by being selected from. The recombinant DNA of the present invention is obtained from filamentous fungi. Can be obtained, especially from Aspergillus species. Particularly preferred recombinant DNA sequences Encodes AXDA from Aspergillus niger or Tubigensis It consists of a DNA fragment.   In another embodiment, the recombinant DNA of the present invention is used in prokaryotic or eukaryotic host cells. Contains the 5'and 3'regulatory DNA sequences necessary for expression of the DNA fragment. . The regulatory DNA sequence is non-phased with respect to the sequence encoding the polypeptide of said DNA. It is preferably heterologous, and is further linked to its homologous regulatory DNA sequence. DN in the host as compared to expression of the DNA fragment in said host when combined It is preferably selected so as to enhance the expression of the A fragment.   In another embodiment, the recombinant DNA is in the form of a vector.   Furthermore, the invention relates to a recombinant DNA according to the invention, preferably Aspergillus. And a transformed eukaryotic or prokaryotic host cell containing recombinant DNA according to A host cell under recombinant conditions is treated with the recombinant DNA of the present invention to obtain the arabinoxylan. By selecting for enhanced expression of the degrading enzyme, the arabinoxylan degrading enzyme Provided are methods of obtaining host cells that allow for enhanced expression.   In addition, the present invention provides a host cell capable of producing the enzyme under the conditions that facilitate the above. Obtaining an arabinoxylan-degrading enzyme including a step of growing and a step of recovering the enzyme A method is provided wherein the host cells or their ancestors are the recombinant DN of the invention. It is characterized by being transformed with A.   In yet another embodiment, the present invention provides arabinoxylan degrading activity A qualitatively pure polypeptide, which is the polypeptide described in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. Polypeptides characterized by mino acid sequences, as well as those which still have said activity Provided are genetic variants and parts thereof.   The invention also relates to cases where it is made for use in feed, food or paper / pulp processing. 15. The substantially pure polypeptide of claim 14 wherein the enzyme is immobilized. A composition is provided.   Also, as a feed or food additive for paper / pulp processing and bread baking, arabinoki Provided are methods of using the polypeptides of the invention to aid in silane degradation.   Also claimed is a feed or food containing the polypeptide of the invention.   In yet another embodiment, D represented by nucleotides 1-783 of SEQ ID NO: 5. Can regulate the expression of NA fragments or DNA sequences bound to them , A recombinant DNA containing a subfragment thereof, as well as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7. DNA fragment represented by D1 to 822 or DNA sequence bound thereto Recombinant DNA containing subfragments that can regulate the expression of Provided.   The invention is further illustrated by the description of the accompanying drawings.Brief description of the drawings FIG. 1 shows the elution profile (OD28) of arabinoxylan degrading activity on HPLC. 0). Figure 2 relates to the water insoluble solid (WIS) fraction of corn as a function of pH. A chart showing the activity of AXDA. Figure 3. In vitro digestion of corn WIS as a function of amount of crude AXDA enzyme. Percentage. FIG. 4 is a map of restriction sites in pIM3001. FIG. 5 is a map of restriction sites in pIM3002.Detailed description of the invention   The present invention comprises an arabinoxylan degrading enzyme gene and a gene variant thereof, Provided is a purified, isolated DNA molecule. DNA molecules are degraded by arabinoxylan It may include an enzyme coding region and 5'and 3'regulatory regions flanking that region. Yes. The gene variant is DN encoding a mutant arabinoxylan protein. Desirable activity of enzymes containing A molecules, degrading DNA molecules and expressed therefrom Hold.   The present invention also provides for the expression of arabinoxylan degrading enzyme in a desired expression host. A DNA structure is provided. This expression construct contains promoters, homologous or heterologous. Artificial regulatory regions such as secretion and terminator signals originating from microorganisms Hybrid DN containing a linked arabinoxylan degrading enzyme coding region A regulatory molecule, which contains an A molecule and is capable of reacting with arabinoxylan degrading enzyme in a suitable host. Involved in the enhanced expression of the enzyme encoded by the encoding DNA molecule. I can do it. Preferably, the expression construct is integrated into the genome of the expression host of choice. You.   In addition, the present invention provides for the expression of an arabinoxylan degrading enzyme, which results in a smaller DNA structure. Cloning and / or transformation of a microbial host through introduction into a biological host A vector, preferably a plasmid, is provided.   Furthermore, the present invention relates to a homologous or transgenic vector transformed with a vector containing the above DNA construct. Provides a heterologous host. The heterologous host is selected from bacteria, yeasts or fungi Good.   In the context of the present invention, the term "homologous" includes its regulatory domain. The target DNA molecule encoding the arabinoxylan-degrading enzyme is It means all that are inactive. A homologous host is like that DNA molecules are defined as the species from which they can be isolated.   The term "heterologous" includes the regulatory region and contains the arabinoxylan component of the subject itself. Everything that is not native to the DNA molecule that encodes the enzyme Is defined as A heterologous host is a gene that encodes an arabinoxylan-degrading enzyme. Is defined as a microbial species other than that which has been isolated.   According to the present invention, "increased expression of the target arabinoxylan-degrading enzyme" The complaint is that the target arabic is at a level above that originally encountered in homologous wild-type microorganisms. It is defined as the expression of noxyllan degrading enzyme. In the same sentence, also increased expression Is a DNA molecule or expression structure encoding the target arabinoxylan-degrading enzyme Of arabinoxylan, except for the introduction into a heterologous expression host. Expression of target arabinoxylan-degrading enzyme in a heterologous microorganism that does not produce element Also means The progeny of these expression hosts should, of course, be covered by the present invention. To be understood.   The present invention also provides a DNA that hybridizes to a DNA sequence obtained from the above-mentioned fungus. Sequence, which is a genetic code or cross-species variation regression Include sequences that may differ from the codon sequence due to Thus, the present invention D encoding an arabinoxylan-degrading enzyme obtained from other species than Pergillus Includes NA fragment. In general, the method for obtaining similar DNA fragments is , A bacterium, or a known microorganism or an arabinoxylan-degrading enzyme of the present invention Recombinant plasmid containing a DNA fragment derived from a microorganism that is expected to Screening of bacteriophage plaques transformed with. DNA After in situ copying of the DNA, this DNA is released from the cells or plaques and (Generally, nitrocellulose). This filter is then A labeled nucleic acid sequence based on the sequence determined for the Aspergillus axdA gene Screened for complementary DNA fragments using lobes. Screw Depending on whether the microorganisms to be cloned are distant relatives or close relatives, The dyeing and washing conditions pick up true positives and false positives It should be applied to reduce the amount of blisters. Filter-immobilized DNA hive The general method of redidation is described in "Nucleic Acid Hybridization-Practical Method". (B.D. Hames & S. J. Higgins Eds., 1985, IRL Press, Oxford), Chapter 5, It is disclosed in Table 3, pages 120-121. Optimal conditions are generally determined experimentally. However, a few rules of thumb can be applied to the near and far edge arrays.   In order to identify the DNA fragment that is most closely related to the probe, the hybridization Are listed in Table 3 of Hames & Higgins, above. As per (the point is shown again below), at 68 ℃, 0.1 * SET buffer -(20x SET = 3M NaCl, 20 mM EDTA, 0.4 M Tris-HCl, pH 7.8) It is carried out with a final washing step of the mood.   The next method for identifying sequences with limited homology to the probe is As shown in Table 3 of Hames and Higgins, the hybridization and washing It is performed by lowering the temperature of purification. For example, a final wash with 2 * SET buffer at 50 ° C Allows the identification of sequences with about 75% homology. Familiar to those skilled in the art Exact correlation between homology and hybridization conditions, as Depends on the probe, substrate composition (% of G + C) and the distribution of mismatches. That is, Random distributions are better than TmRegarding Has a strong reducing effect.   The above conditions are at least 300 bp, preferably at least 500 bp, more preferably It has a length of about 1 kb and a GC-content of the DNA to be probed of about 50 ± 10%. Apply to the probe. If the GC-content of a given microorganism is known , This condition was experimentally optimized by considering the following equation (35% ≤ (% G + C) ≦ 75%).                 Tm= 81.5 + 0.41 * (% G + C)   Generally, this means that if the GC-content (% G + C) is 10% higher than the average, Hybridization conditions include hybridization and washing. It means that the temperature can be adjusted by increasing the temperature by about 4 ° C.   For the purposes of this disclosure, hybridizing to a DNA fragment according to the present invention. The DNA fragment which is said to have the sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 At least 300 bp, preferably 500 bp, more preferably 1 kbp pro And hybridization at 50 ° C, 2 * SET buffer (ie , Haemens and Higgins, Chapter 3, Table 3, Method (Table below). Are shown again) and a positive signal is given for the immobilized DNA after washing. It is defined as giving.   The main points of the method described in Table 3 of Chapter 5 of Hames and Higgins are as follows. (1) Pre-hybridization of filters without probes, (2) At temperatures between 50 and 68 ° C, 0.1 and 4 * SET buffer (stringer 10 * Denhardt's solution (100 * Denhardt's solution) The solution contains 2% bovine serum albumin, 2% ficoll, and 2% polyvinylpyrrolidone) , 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 μg / ml salmon sperm D NA (dissolve 1 mg / ml salmon sperm DNA and increase the length to 200-500 bp Sonicate, place in a water bath for 20 minutes and dilute with water to a final concentration of 1 mg / ml. (From the stocks available). Hybridization The time is not critical and can be any time between 1 and 24 hours, preferably about 16 hours (o / n). The probe is generally 5 * 107~ 5 * 108c.p.m./μg As a radiolabel for specific activity during32Nick-Trance using P It is labeled with a nick-translation. (3) 68 ° C at a temperature between 50 and 68 ° C (depending on the stringency required) Then, repeat the filter with 3 * SET, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate (repeat )Washing. Repeated washing with decreasing SET concentration to 0.1%, 20 minutes in 4 * SET at room temperature Wash once, dry the filter on 3MM paper, -70 ℃, 1-96 hours ( (Depending on the signal strength), expose the filter to X-ray film in a cassette. Dew, and film development.   Generally, the volume of pre-hybridization and hybridization mixed Should be kept to a minimum. All "wetting" steps were performed in a preheated water bath. It may be carried out in a bag which is hardly sealed.   The above method is a DNA fragment of the present invention, which is said to hybridize. Helps to define. Obviously, many modifications will result in DNA fragmentation of the present invention. A method for identifying and isolating an agent. DN obtained in this way The A fragments are those that were actually identified and / or isolated using this method. If these can be detected according to the above method, whether or not It should be understood to be included in the range of.   Many of the suitable use for identifying and isolating the DNA fragments of the present invention Protocols include literature and handbooks, including the Haems and Higgins quoted above. It is disclosed in the book.   The above method is for a polynucleotide probe. Oligonucleotide Deprobe is TdWhen used in a correlation between The temperature at which the ibrid is half dissociated is Td= 4 ° C / GC base pair + 2 ° C / AT base pair It is estimated by the correlation of. Also, based on the existing protocols and applying this rule of thumb Use the oligonucleotide probe to identify relevant and unrelated microorganisms. The effect of the DNA fragment encoding the arabinoxylan-degrading enzyme of the present invention Can be designed for selective isolation. Methods using oligonucleotides are especially However, it has been purified from a different source, and part of the amino acid sequence has been determined. It is useful when This sequence was used primarily for DNA sequencing as described above. Create a set of denatured probes for the screening of Blarry or Southern blots. Can be   Good candidates for screening are other filamentous fungi such as Trichoderma (Trich oderma), penicillium, Dichotomitus squalus, di Sporotrichum dimorphosporum and And bacteria such as Bacillus species. The initial screening is hybrid If you get a clone that clearly contains an Ising fragment, Can be isolated and, if desired, sequenced to determine sequence similarity. Noh.   Once the target arabinoxylan-degrading enzyme has been identified, such enzyme should be The coding DNA sequence was determined in Example 1 by culturing the bacterium in a medium containing arabinoxylan. The desired arabinoxylan degrading enzyme using known methods outlined To determine at least part of the amino acid sequence of the purified protein. Therefore, it may be obtained from a filamentous fungus that naturally produces an enzyme.   The DNA probe is then oligo-based on the deduced partial amino acid sequence. It may be obtained by designing the nucleotide sequence. The complete amino acid sequence is N-terminal and / or complete protein proteolytic or chemical It may be determined from the N-terminus of the intermediate peptide fragment obtained through digestion. Once the probe is obtained, the DNA probe can then be used for genomic or cDNA labeling. Used to screen ibrary.   A genomic library has four consecutive nucleotides, egSau3A DN A fragment obtained by partially digesting fungal chromosomal DNA with a restriction enzyme that recognizes the A sequence Fragment into a suitable plasma or lambda phage vector, eg lambda GEM-11. It may be prepared by cloning in advance.   Separately, the cDNA library is suitable for the synthesis of arabinoxylan degrading enzymes. Isolated from fungal cells induced in the phage vector of interest, eg λgt10 It may be prepared by cloning a cDNA synthesized from the mRNA Yes.   Next, after plating a sufficient amount of colonies or plaques, the genomic or cDNA The NA library may be screened with an appropriate DNA probe.   If this method is unsuccessful, the genomic or cDNA library is uninduced. And screened separately with cDNA probes derived from mRNA from induced cells May be. Induced mRNA grows in medium containing arabinoxylan as a carbon source Prepared from cultured cells, non-induced mRNA contains carbon other than arabinoxylan. It must be isolated from cells grown in a source such as glucose. Provocation c Among the clones that hybridize only with the DNA probe, the desired arabinoki A clone containing a gene encoding a silane-degrading enzyme can be recovered. Apart from The arabinoxylan-degrading enzyme gene has a cross-hybridase with related sequences. Identification.   Suitably, the oligonucleotide probe is an Aspergillus niger culture filtrate. Of an arabinoxylan-degrading enzyme having an apparent molecular weight of 32 kDa purified from Obtained by digestion of the enzyme with the N-terminal amino acid sequence (see Example 1.5.1) and / or CNBr Obtained from the amino acid sequence of the intermediate peptide fragment (see Example 1.5.2) It is.   A mixture of oligonucleotides, such as those developed, is used for genomic and cDNA libraries. Can be used to hybridize with both. Separately and as illustrated here In addition, the purified AXDA is used to raise antibodies. Antibody expression library Used in Lee's immunoscreening. Thus, the AXDA expressing clone is the same. Is determined. Protein from Aspergillus niger mutant Tubigensis The isolated cDNA demonstrates that different Aspergilli contain AXDA activity. Note that it is isolated from Aspergillus niger N400.   With the advent of new DNA amplification techniques, such as direct or inverted PCR, the end of the coding region DNA fragments can be cloned in vitro if the end sequences are known.   The availability of DNA sequences encoding arabinoxylan-degrading enzymes is Mutant enzyme molecules can be constructed by site-directed mutagenesis And The tertiary structure of the arabinoxylan degrading enzyme was found, its catalytic activity and domain If the substrate binding the catalyst is positioned, it is bound catalytically and / or functionally. Mutagenesis that most affects the substrate (eg, computer modeling aids The amino acid for () can be selected. If you do not know the tertiary structure of the protein , Random variants may be generated along the entire coding sequence, or the protein Quality tertiary structure is predicted by comparison of similar known enzymes isolated from other microorganisms. May be.   Includes AXDA coding sequence into an expression construct consisting of one or more heterologous regulatory regions To facilitate the insertion of DNA sequences, the polymerase chain reaction (PCR ) (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1 989) H.A. Ehrlich, ed., Stockton Press, New York) of the AXDA coding sequence. It may be used at the 5'and 3'ends to introduce appropriate restriction enzyme sites. Restriction section The choice of position depends on the presence of the DNA sequences of the expression vector, ie other restriction sites within the DNA molecule. Depend on you.   AXDA in the original (homologous) producing species or separately in non-homologous fungal strains AXDA containing their own regulatory regions to obtain increased expression of proteins DNA region that encodes increases the copy number of the gene and thus protein expression In order to be introduced into the selected expression host.   If non-homologous expression host is selected and yeast or bacterial strain is selected, The splice signal present on the genomic fragment is recognized by the heterologous host. Consecutive (no intervening sequences) DNA molecules are non-homologous Used to construct the current vector. This continuous DNA molecule is for the synthesis of AXDA CDNA library constructed from mRNA isolated from heat-induced cells Obtained from This library contains oligonucleotides obtained as described above. Alternatively, it can be screened with a cDNA probe. Separately, contiguous DNA molecules are arabino. Appropriate 5'of 1st strand cDNA synthesized from RNA of xylan-induced cells And obtained by applying the polymerase chain reaction using 3'oligonucleotides You.   In addition, the enhanced expression of AXDA in a subject can be attributed to the selection of heterologous regulatory regions, eg, expression. Selection of promoters, secretory leaders and terminator regions that are useful for current growth Thus, and, if desired, the amount of protein of interest from the selected expression host. Achieved by providing inducible regulation of the level of secretion and / or expression of AXDA in the subject. Wear.   In addition to the native promoter of interest, other promoters may drive its expression. Can be used for This promoter is a promoter of the AXD of interest in the desired expression host. The efficiency can be selected when the expression of A is performed.   In other embodiments, constitutive promoters are desirable independent of other enzymes. You may choose for the expression of AXDA. Such expression constructs serve as trigger substrates To avoid the need to culture the expression host in a medium containing arabinoxylan. Therefore, it is more advantageous.   Examples of strong constitutive and / or inducible promoters suitable for use in fungal expression hosts Include ATP-synthase, subunit 9 (oliC), triosephosphatase Isomerase (tpi), alcohol dehydrogenase (adhA), α-amylase (a my), glucoamylase (gam), acetamidase (amdS) and glyceraldehyde There is a 3-phosphate odehydrogenase (gpd) promoter.   Examples of strong yeast promoters include alcohol dehydrogenase, lacta , 3-phosphoglycerate kinase and triose phosphate isomerer There is a promoter.   Strong bacterial promoters include α-amylase and Spo2 promoters , And a promoter from the extracellular protease gene.   Hybrid promoters also play a role in improving the inducible regulation of expression constructs. You may use it to your advantage.   Desirable is AXDA, which is secreted from the expression host into the medium.   According to the present invention, the subject's native secretory leader sequence AXDA is expressed A It may be used to effectively secrete XDA.   However, the increase in expression of the enzyme sometimes led to the accumulation of protein product inside the cell. Tampering at a level above the level that the expression host can process and secrete. Induces the production of quality. Therefore, the present invention also provides for the reconstitution of enzymes from selected expression hosts. Also provides a heterologous leader sequence to provide efficient secretion.   According to the invention, the secretory leader may be selected based on the desired expression host. . Heterologous sequence leaders are preferred to be homologous to other regulatory regions of the expression construct. May be selected. For example, a highly secreted glucoamylase protein In combination with the glucoamylase promoter itself, It may also be used in combination with a motor. Also, the hybrid signal sequence is It may be used to advantage within the context of the present invention.   Suitable non-homologous secretory leader sequences are glucoamylase genes (fungi), α-factor Originating from a child gene (yeast) or α-amylase gene (bacillus) is there.   In general, terminators are a critical element for increased expression of genes. I can't imagine. If desired, is the terminator the same gene as the promoter? Alternatively, a homologous terminator may be used separately.   In addition to the genomic fragments described above, transforming DNA can be used to transform non-transformed cells. Include a selectable marker to distinguish cells into which the desired gene from Luk has been introduced May be. This selectable marker with appropriate 5'and 3'regulatory sequences is desirable. May be present on the same DNA molecule containing the gene or on different molecules. Good. In the latter case, co-transformation must take place. Absent. The ratio of expression vector / selection vector is higher than that of selectable transformants. Of the AXDA expression construct of E. coli. I have to.   The most suitable selection system for industrial microorganisms is to make mutations in the host microorganism. It is formed by a group of selectable markers that are not needed. Fungal selection marker Examples of acetamidase include acetamidase (amdS), ATP synthetase, subunit 9 ( There are genes for oliC) and benomyl resistance (benA). Non-fungal selection An example of a selectable marker is the bacterial G418 resistance gene (which is used in yeast Good, but not usable in fungi), ampicillin resistance gene (E. coli), and There is a neomycin resistance gene (bacillus).   Once the desired expression construct has been assembled, E. coli can be used to grow the construct. Transformed into a suitable cloning host. The expression construct is then Expression construct, where the expression construct is integrated into the genome. Mallet Certain hosts, such as Rhus species, can be used as both cloning and expression hosts. Well, thus avoiding the external transformation step.   According to the present invention, various microorganisms are used as hosts for the production of AXDA of interest. Can be used.   In one embodiment, homologous expression hosts are used. This is a DNA sequence AXDA is associated with increased gene copy number or above heterologous regulation Expression constructs into strains isolated under region regulation or both Including the introduction of.   In another embodiment, the AXDA of interest is a non-phased organism such as a bacterium, yeast or fungus. The arabinoxylan degrading enzyme of interest is regulated under the control of the appropriate regulatory region in the host. It can be produced by introducing and expressing a coding DNA structure. For this purpose Therefore, the DNA sequence encoding the AXDA of interest should have a promoter derived from a heterologous host. Preferably, it is expressed under the control of the -and terminator sequences. Furthermore, raw A leader sequence homologous to the expression host to achieve the most efficient expression and secretion of the product. So it may be necessary to replace the native secretory leader sequence.   Depending on the extracellular secretion of AXDA that is necessary for the specific glycosylation or is of interest. Factors such as size (molecular weight) that are needed for production play an important role in the secretion of the expression host. Play a percent.   The gram-negative bacterium E. coli is widely used as a host for heterologous gene expression. It is. However, large amounts of heterologous proteins tend to accumulate inside cells. is there. Subsequent purification of the desired protein from the bulk of E. coli intracellular protein Manufacturing is sometimes difficult.   Contrary to E. coli, Bacillus-derived bacteria secrete proteins into the medium Due to their ability to act, they are well suited as heterologous hosts. DNA minutes Tampa expressed and / or expressed by the nature of AXDA encoding the child itself Eukaryotic hosts such as yeast or fungi are preferred due to the need for further processing of the protein. New In general, yeast cells are preferred over fungal cells because they are easier to handle. But However, some proteins may be secreted by yeast cells, Is not processed properly (eg hyperglycosylation in yeast). In that case , Fungal host microorganisms should be selected.   Heterologous hosts are similar to Kluyveromyces lactis. Other polysaccharide-degrading enzymes by choosing a host that does not normally produce It may be selected to express AXDA in a substantially unrelated subject.   Examples of suitable expression hosts within the scope of the present invention include Aspergill us) species (disclosed in EP184.438 and EP284.603) and Tricho Fungi such as Trichoderma spp., Bacillus spp. (Disclosed in EP 134.048) Kluyveromyces spp. (EP96.430 and EP3) No. 01.670) and yeasts such as Saccharomyces spp.   Particularly preferred expression hosts are Aspergillus niger, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. Awamori, Aspergillus niger var. Awamori Aspergillus aculeatis, Aspergillus oryza D (Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei, Bachi Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis icheniformis), Bacillus amyloliquefacie ns), Kluyveromyces lactis and Saccharomyces cerevisiae (Saccharo myces cerevisiae).   The expression of AXDA of interest was transformed with an appropriate expression construct in a normal nutrient fermentation medium. This is effectively done by culturing the transformed expression host.   The fermentation medium is a carbon source (eg glucose, maltose, molasses, etc.), nitrogen source (For example, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, etc.), organic Nitrogen sources (eg yeast extract, malt extract, peptone, etc.) and inorganic nutrient sources ( Ordinary medium containing phosphate, magnesium, potassium, zinc, iron, etc.) Consists of Optionally, an inducer (arabinoxylan) may be included.   Selection of the appropriate medium may be based on the choice of expression host and / or expression It may be based on the regulation requirements of the structure. Such media are well known to those of skill in the art. Of. If desired, the medium can be transformed to other potentially contaminating microorganisms. Additional components may be included to render the expression host preferred.   Fermentation is carried out in a batch or fed batch at a temperature in the range of 0 to 45 ° C, between pH 2 and 10. -In a fed-batch method, over a period of 0.5-20 days. Suitable Fermentation conditions are temperatures in the range of 20-37 ° C and pH between 3-9. Appropriate Conditions are selected with reference to the choice of expression host.   After fermentation, cells are removed from the fermentation broth by centrifuge or filtration means. You. After removing the cells, the enzyme is then recovered, purified if necessary, and isolated by conventional means. You.   The product is stably formulated in liquid or dry form. For some applications Immobilization of the enzyme on a solid matrix is preferred.   The enzyme produced by the method of the present invention requires the action of arabinoxylan degrading enzyme. Can be applied alone or in combination with other selected enzymes in various ways. Yes.   The arabinoxylan degrading enzyme of the present invention is used in foods (for example, bread), feeds and beverages. Used in the processing or preparation of (eg beer and fruit juices).   In addition, arabinoxylan degrading enzyme is particularly useful in the production and processing of paper and pulp. It is advantageously used in combination with external xylanase.   As exemplified in the present invention, the arabinoxylan degrading enzyme is arabinoxylan. Added to abundant animal feed. Barley, wheat, corn, rye or Cereals such as oats or cereals such as wheat chaff or corn bran For monogastric animal (eg, poultry or pig) feeds (including stockgrass) containing by-products When added, this enzyme is used to enhance plant nutrients that provide better utilization of plant nutrition by animals. Remarkably improves the destruction of the cell wall. As a result, improved growth rate and / or feed conversion Is done. In addition, arabinoxylan-degrading enzymes are responsible for the viscosity of feed containing arabinoxylan. May be used to reduce power.   The arabinoxylan degrading enzyme should be used in feed if pre-soaking or wet digestion is preferred. Alternatively, it may be added in advance to the stored raw grass. Furthermore, AX produced through the present invention DA continues to hydrolyze arabinoxylan in feed in vivo.   Further, as shown in Example 8, arabinoxylan degrading enzyme was used in the production of bread. Useful.experimental stock E. coli BB4 (Silvay et al., 1984): E. coli DH5α (Hanahan, 1983): E. coli LE392 (Murray, 1977): E. coli XL1-Blue MRF '(Jerpseth et al., 1992): Aupelgills Niger N400 (CBS120.49) Aupelgills niger N402 (cspA1) (Goosen et al., 1987) Aupelgills Niger NW219 (leuA1, nicA1, pyrA6)vector: pBluescript SK +/- (Short, JM, et al., 1988) pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985)   The following solutions were prepared by Sambrook et al., 1989. Buffer: TE, 50 * TAE, 20 * SSC; Hybridization, 100 * Denhart, SM, DNA loading, Medium: NZYCM, LB and minimal medium. The Visniac solution is a visniac solution and a Santar (1 957).Example Example 1: Enzyme isolation Example 1.1: Aspergillus niger mutant Tubigencis arabinoxylan degrading activity A ( AXDA) purification and characterization   Yeast extraction of Aspergillus niger mutant Tubigensis DS16813 And crude wheat arabinoxylan fraction in place of 2% oat spelled xylan Proliferated as described in EPA 046 3706, without. By filtering the cells After removal, the supernatant was dried with an ultrafilter.   For drying AXDA, 5 g of crude enzyme preparation was added to 100 ml of 10 mM Tris / HCl. , Diluted at pH 8.0. The enzyme solution was filtered (Seitz / supro no 250 and Seitz / supro EKS ), And diluted to a final protein concentration (Biorad protein assay) of 5.2 g / l. Crude enzyme , DEAE TSK 650 (M) Anion exchange column (600 ml (speed 25 ml / min), HPLC fractionation (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System).   The column was equilibrated with 25 mM Tris / HCl (pH 8.0). Sample (3g protein) Was loaded onto the column and eluted with a gradient of equilibration buffer containing 100 mM NaCl. AXDA The enzyme was eluted at a NaCl concentration of 53 mM, as shown in FIG. Example 1.2: pH optimum   Water insoluble in corn to determine pH optimum of AXDA crude enzyme preparation The solid (WIS) polymer fraction was used as the substrate. 1.6 mg of crude enzyme preparation , 0.5 g of WIS, and a buffer of pH (3.40 to 7.65) Diluted to 5 ml with 100 mM sodium acetate). Sample for 60 minutes, 39 It was incubated at 0 ° C. and centrifuged for 15 minutes (2800 g). In the supernatant, Sugar reduction was measured using the Sumner reagent.   Preparation of Sumner reagent: Add 10 g of phenol to 22 ml of 10% NaOH, then add to volume. The volume was adjusted to 100 ml with distilled water. 10g NaHSOThreeAdd 300 ml to 70 ml of this solution 4.5% NaOH was added, then 255 g K / Na tartrate and 800 ml 1% 3,5-dinitrosa Lytic acid was added. The mixture is then stirred at room temperature until the compound dissolves. Was.   0.5 ml Sumner reagent was added to 200 μl sample and boiled for 10 minutes. cold After rejection, 5 ml of distilled water was added. Absorbance was measured at 515 nm. Sample return The original sugar content was calculated using a calibration curve for xylose.   As shown in FIG. 2, the optimum pH value of the enzyme was 5.0. Example 1.3: Amino acid composition   From the AXDA fraction on the DEAE column, the amino acid composition was determined by PICO-TAG 150 MM color. (Detected at 254 nm). The following composition was found. Example 1.4: Biochemical characterization (IEP and molecular weight)   AXDA IEP is used for Pharmacia minigel (pH 3-9). ) Decided. Protein was added to the Pharmacia silver stain solution (Pharmacia si It was stained with lver stain solution). The IEP of the AXDA enzyme is estimated to be 3.6 Was.   The molecular weight of AXDA was determined by Pharmacia Mini Gradient SDS-gel (10-15%), Protein was detected by silver staining (Pharmacia). AXDA molecule The amount was estimated to be 32 kDa. Example 1.5: Aspergillus niger mutant Tubigencis arabinoxylan degrading activity A ( AXDA) protein sequence Example 1.5.1: Aspergillus niger mutant Tubigencis arabinoxylan degrading activity A ( AXDA) N-terminal amino acid sequence   About 1 nmol (≈30 μg) of AXDA was added to 15% SDS-polyacrylamide. Electrophoresis on gel and then Immo by the method of Matsudaira (1987). Electroblotting was performed on a bilion-P membrane (Millipore). 32 kDa A membrane fragment containing a main band having an apparent molecular weight was analyzed by gas phase array (Amons, 1987) (SON fa Cility, Leiden) and subjected to sequence analysis to determine the next sequence. Example 1.5.2: Amino acid sequence of CNBr peptide of arabinoxylan degrading activity A (AXDA) Fixed   Approximately 2 nmol of AXDA was subjected to chemical cleavage with CNBr. About 2 nmol ( ≈60 μg) of AXDA was freeze-dried and 125 μg of CNBr (2.5 mg / ml) was added. Resuspended in 60 μl of 70% formic acid. The reaction mixture was allowed to stand at room temperature for 48 hours in the dark. Cultured in place. The liquid was evaporated in a Speedvac and sterilized bidest (s It was washed with terile bidest) and evaporated again. This washing step was repeated twice .   The reaction mixture is then electrophoresed on a 15% SDS-polyacrylamide gel. Immobilion-P membrane (Milli) by the method of Matsudaira (1987). Electroblotting onto the pores was performed. With an apparent molecular weight of approximately 9 kDa The membrane fragment containing the main band was analyzed by gas phase array (Amons, 1987) (SON facility, Leiden ) For sequence analysis. The next sequence was determined. CNBr: Ambiguous amino acids are shown in brackets. Example 2: Enzymatic profile of AXDA   The α-arabinofuranosidase activity was measured by para-nitrophenylarabinofuranosidase. Measured on a substrate (Sigma). To 1 ml of substrate was added 300 μl of enzyme. After incubating at 30 ° C for 15 minutes, the reaction was carried out with 5 ml of Na.2COThreeIt stopped at (5M). Absorbance It was measured at 402 nm. The α-arabinofuranosidase activity was calculated (volume * absorbance / E * hours).   The crude enzyme preparation had 0.30 pNPAF U / mg of α-arabinofuranosidase activity. Included. Fractions from the DEAE column were tested for activity. Arabino furano cedar The zeo activity pool contained 3.0 pNPAF U / mg (see Figure 1). α-furanosider No other fraction with zeoactivity was found. Arabinofuranosidase activity pool Was then tested for the water-insoluble polymer fraction of corn and Activity was not measured.   This is because AXDA has shown that α-arabinofuranosyl with respect to para-nitrophenyl substrates. It was shown to have no dase activity.   Further attempts to identify the enzymatic activity of AXDA include Aspergillus chuu. Of Aspergillus niger culture transformed with Vigensis axdA-gene The filtrate was screened for activity on a substrate composed of wheat arabinoxylan. I did. This tubuigensis gene is called pyruvate kinase (pyruvate kinase). ) (Glycolytic) promoter under control of growth conditions Avoid transgene expression by avoiding expression of causative arabinose-degrading enzymes. I chose to make it better.   This allows AXDA to improve the arabinoxylation of high molecular weight arabinoxylan substrates. It was determined that it had a release activity. The protein content is determined by the Sedmac method (Sedmac mak method). The activity of AXDA was 100 μl of the culture filtrate. 50 μl of 50 in different dilutions (10 mM sodium acetate buffer, pH 5.0) mM sodium acetate (pH 5.0) and 250 μl of 0.4% wheat arabinoxylan (Megazyme) It was added and determined by culturing at 40 ° C. for 1 hour. Heat the mixture at 100 ° C. for 10 minutes To stop the reaction. Heat-inert arabinoxylan degradation product as a sample Using heat-inactivated incubations, HPAEC (fast anion exchange) This was monitored using a chromatographic chromatography. The results were as follows. One unit of arabinose furanohydrolase activity is arabinoxyla per minute. It is defined as the amount of enzyme capable of releasing 1 μmol of arabinose from the enzyme. The AXDA enzyme of Aspergillus tubevigensis is arabinose furanohide. It was concluded to have lorase (AXH) activity.   Arabinase activity is measured with the Megazyme arabinase test kit. And followed the instructions.   In this experiment, the DEAE column AXDA pool showed activity for linear arabinan. Not shown.   This indicated that AXDA was not an arabinase.   Endoxylanase activity was measured on autospertoxylan. 10 10 ml of 5% xylan suspension (100 mM sodium acetate, pH 3.5) was added. Boiled for a minute. After cooling, the suspension was incubated at 39 ° C. for 10 minutes. 0.5 ml The enzyme solution was added to start the reaction. Several culture periods (5, 10, 15, 20 And 25 minutes), a 1.5 ml sample from the 39 ° C. culture was added to 1.5 ml of deionized water. Water and boiled for 10 minutes. The sample was centrifuged for 15 minutes (2 800 g). Reducing sugar was detected with the Sumner reagent in the supernatant (Example 1). . 2).   Endoxylanase activity of 399.0 U / mg in the AXDA fraction pool Was found. Endoxylanase activity and AXDA were then digested in vitro. The system was tested (see Example 6).   From that test, the endoxylanase activity of the AXDA fraction pools was found to be different in pox. It was concluded that the activity is related to the peptide activity. The polypeptide is A It is said to have an endoxylanase co-elute with an enzyme similar to XDA. A further indication was found by Kormelink (1992, PhD. The). sis, Chapter 6, p. 107, last two chapters and p. 108).   AXDA concludes that it has endoxylanase activity by itself. Example 3: Construction of cDNA expression library Example 3.1: Induction and isolation of mRNA   Aspergillus niger N400 culture was treated with yeast extract and 2% autospray. EPA0463 without crude wheat arabinoxylan fraction instead of rutoxylan 706, which grows at 69 and 81 hours, respectively, to produce mycelium (myc). (elium) was collected by filtration and washed with sterile saline. Next, the mycelium is liquid Frozen in nitrogen and then Microdismembrator ( Braun) was used to make the powder. RNA was centrifuged twice using a CsCl gradient Except that, the total RNA was isolated from guanidinium thiols disclosed in Sambrook et al. (1989). Isolated from mycelium by cyanate / CsCl protocol. Poly A+ mRNA Rigo (dT) -cellulose chromatography (Aviv and Leder, 1972, Sambrook et al., 1989) and isolated from 5 mg of total RNA with the following modifications: Remove from the solution and load buffer with 9% (v / v) dimethyl sulfoxide. Replenished with. Example 3.2: Construction of cDNA library   cDNA was added with 7 μg of poly A+ Synthesized from mRNA, and according to the manufacturer's instructions, ZAP (quote Standard) -cDNA synthesis kit (Stratagene) using the bacteriophage λ Uni -Ligated in ZAP XR. Uni-ZAP XR vector-after ligation of the cDNA into the arm, According to the manufacturer's instructions, the phage DNA was labeled with Packagene ™ extract (Packagene).  It was packaged with (extracts) (Promega). 120 ng cd to 1.2 μg vector arm The ligation of NA and subsequent packaging of the reaction mixture was 3.5 * 10FourRecombinant fur It became the primary library consisting of Ji. This primary library Was amplified using E. coli XLl-Blue MRF ', titrated and stored at 4 ° C. Example 4: An antibody raised against AXDA, Aspergillus niger for (axdA) Screening of N400 cDNA and isolation of cDNA clone Example 4.1: Preparation of antibodies raised against AXDA in rabbits   Dialyze 500 μg of AXDA against 1 mM phosphate buffer, pH 7.0. And lyophilized. Protein was added to 1 ml of sterile PBS (0.136M NaCl 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPOFour1.75 mMKH2POFour, PH 7.4) Was.   1 ml of Freund's complete adjuvant (Freunds' co) was added to the protein mixture. mplete adjuvant) and stirred for 30 minutes in order to obtain a stable emulsion. This mixture was subcutaneously injected into rabbits. In 6 weeks, 0.5 ml Freund's incomplete horse mackerel Tube with 250 μg AXDA in 0.5 ml sterile PBS To give booster immunity. The rabbit was bled at 7 weeks and the serum was tested. 1 At 3 weeks, a second boost of 250 μg was given and then at 14 weeks blood was drawn. Until blood collection The booster method with 6 week intervals may be repeated several times.   The collected blood was incubated at 37 ° C for 30 minutes and stored at 4 ° C for 16 hours. Solval Centrifuge at 5000 rpm with a high-speed centrifuge (Sorvall High speed centrifuge), Collected Qing. Example 4.2: AXDATUBAspergillus ni, which has antibodies raised against Immunoscreening of Gar N400 cDNA library   Against the axdA cDNA clone, the Asperi constructed in Example 3.2 Plated to screen Gills Niger N400 cDNA library 5 * 10 using Escherichia coli BB4 as bacteriaThreepfu / plate as disclosed Kuni (Maniatis et al., 1082, pp. 64) on 85mm diameter NZYCM (1.5% agar) , NZYCM topagarose containing 0.7% agarose.   Sambrook et al. Disclose two replicas for each plate (S ambrook et al., 1989, pp. 12.16-12.17) Nitrocellulose filter (Schleid er and Schull BA85). AXDANIGEPA91205944.5 (public number no. 0463706A1) and after immunostaining, purified AXDATUB(Example 4.1) Visualization was performed using an antibody raised against it. The duplicate is displayed on the replica filter. Immunostained plaques were identified. Eight positive plaques were selected. Each port Use a Pasteur pipette to remove the negative plaque from the plate and Lark, as disclosed in Maniatis et al. (Maniats et al., 1982, pp. 64), 20 μ Elution was from an agar plug in 1 ml of SM buffer containing 1 l of chloroform.   The resulting phage was pre-treated with 50-100 plaques of isolated phage. From the router, using a filter replica, Made.   After purification, plaques are 5x10 in NZYCM medium.ThreeBy plating the phage It proliferated. After overnight culture at 37 ° C, obtain fusion plates and then plaques. Add 5 ml SM buffer and store at 4 ° C for 2 hours with intermittent shaking. It was eluted by the thing. After collecting the supernatant using a pipette, at 4 ℃ for 10 minutes Bacteria were removed from the solution by centrifugation at 4000 xg. Supernatant 0.3% chloroform was added to the sample solution to determine the number of pfu. These fur Jistock is about 10TenContains pfu / ml. Example 4.3 Restriction analysis for axdA cDNA clones   Recombinant Uni-ZAP XR clone consisting of axdA cDNA was Fibrous helper fur included in the Stratagene ZAP-cDNA synthesis kit The super-infection with EX Assist (trademark) Used to convert to Bluescript phagemid. The fergemid DNA was then labeled with Sambrook et al., 1989, pp. It was isolated as described in 1.25-1.28).   The isolated DNA of the axdA cDNA clone was digested with the following restriction enzymes. Subjected to analysis: EcoRI and XhoI. A reaction mixture consisting of the following solutions of DNA at 37 ° C: Digested for 2 hours in: 2 μl (≈1 μg) DNA solution, 2 μl approximately 10 * Act Buffer (BRL), 10 U of each restriction enzyme and 20 μl final volume Sterile distilled water. After addition of 4 μl DNA loading buffer, the sample was Electrophoretic separation was carried out at 0 V for 1.5 hours.   Restriction analysis shows that the axdA cDNA clone has a molecular size of approximately 1.2 kb. did. Example 4.4: Sequence analysis of Aspergillus niger axdA cDNA clone   The primary structure of the cDNA was sequenced to a specific oligonucleotide as a primer. Determined by sequence analysis combined with the use of tide.   Nucleotide sequences can be obtained using the Pharmacia T7 DNA Polymerase Sequence Kit. , Dideoxynucleotide chain-terminati on procedure) (Sanger et al., 1977). Using a PC / GENE program Computer analysis. Example 4.5: Fragment32P-labelling   The Aspergillus niger axdA cDNA clone fragment was isolated, EP application 91205944.5 (Publication number 0463706A1, Examples 2.2 and 7.1, here (Introduced) and labeled as disclosed. Example 4.6: axdA gene and Aspergillus ni for isolation of the gene Gar mutant niger genomic library   For the axdA gene, as disclosed by Harmsen et al., 1990. The Aspergillus niger mutant niger genomic library 3x10 for leaningThreeE. coli L as a plate-forming bacterium using pfu / plate Using E392, as disclosed (Maniatis et al., 1982, pp. 64), 5 , NZYCM toss consisting of 0.7% agarose on 85mm diameter NZYCM (1.5% agar) Plated in Puagarose.   After incubating the plate at 37 ° C. for one day, Maniatis et al. (1982) pp. 320-321) disclosed two replicas of each plate with HybondN filters. -Created above.   After wetting the filter in 3xSSC, wash the filter in 3xSSC at room temperature for 60 minutes. Clean Filter is 6xSSC, 0.5% SDS, 10x Denhardt's solution, 0.01M EDTA and 1 Prehybridizer containing 00 μg / ml heat-denatured herring sperm DNA (Boerhinger Mannheim) Prehybridization was carried out for 2 hours at 65 ° C. in the incubation buffer. 2 hours After pre-hybridization of, pre-hybridization buffer, Same as prehybridization buffer, but with Aspergillus niger -Consisting of axdA cDNA clone32Includes P-labeled 1.2 kb fragment Substituting with a hybridization buffer and prepared in the same manner as in Example 4.5. . The filters were hybridized at a temperature of 65 ° C for 18 hours.   After hybridization, filter at 65 ° C for 30 minutes at 5 * SSC / 0. First wash with 1% SDS, then second wash with 2 * SSC / 0.1% SDS for 30 minutes at 65 ° C. Was. The filter is then washed with 0.1 * SSC / 0.1% SDS for 30 minutes at 65 ° C, then And a final wash with 0.1 * SSC for 30 minutes at 65 ° C. Air dried filter , Tape on Whatman 3MM paper sheet, attach key mark with radiation ink Then, the Whatman paper and the filter were covered with Saran wrap. Hybridization Ngplak uses Kodak XAR X-ray film at 72 o'clock using an identification screen. And exposed at -70 ° C for identification.   A positive hybridizing model displayed as a duplicate on the replica filter. The ark was found. 4 positive plaques using a Pasteur pipette The plaque and picked up the plaque from Maniatis et al., 19 82, pp. 64), 1 μm of SM buffer containing 20 μl of chloroform. Elution from agar plaques in ml. The resulting plaque is isolated from the isolated plaque. Use a filter replica from a plate containing 50-100 plaques of Then, the above-mentioned method was repeated for purification.   After purification, plaques were plated on NZYMC medium at 5x10ThreePlate the plaques and grow Was. After incubating at 37 ℃ for 24 hours, add 5 ml SM buffer, and perform intermittent shaking. Fusion plaques were obtained from phages eluted by storage at 4 ° C for 2 hours . After collecting the supernatant using a pipette, at 4 ° C. for 10 minutes at 4000 × g, Bacteria were removed from the solution by centrifugation. To the supernatant, add 0.3% Loloform was added and the number of pfu was determined. These phage stocks are approximately 1 0TenContains pfu / ml. Example 4.7: Isolation of DNA from bacteriophage lambda   Each isolated phage was added to 5 * 10 in 300 μl SM buffer.9E. coli L E392 bacteria and 2 * 106Propagated in combination with phages and incubated at 37 ℃ for 15 minutes Cultured. After the incubation period, 100 ml of this pre-heated (37 ° C) N was added to the infectious bacteria. Used to inoculate ZYCM medium, then 250 rpm new Brunsbyk rotary shake Incubated at 37 ° C. for 9 to 12 hours in the machine. After that period, the bacteria had dissolved. Ba Debris of Cteria in a Sorvall high speed centrifuge at 4 ° C and 10,000 rpm It was removed by centrifugation for 10 minutes. 10 g polyethylene glycol-6000 and 11.7 g of NaCl was added and the solution was stored overnight at 4 ° C. to obtain the resulting supernatant (100 ml). The phage was precipitated from the. Precipitated phage at 14,000 xg at 4 ° C It was recovered by centrifugation for 20 minutes. The supernatant is removed by suction filtration and the final The rest of the liquid was removed using a paper towel. Phage in 4 ml SM buffer Carefully resuspend in and extract once with an equal volume of chloroform.   Before extracting the DNA from the phage particles, the DNA and RN of lysed bacterial origin A, phage suspension with DNase I and RNase A (both 100 μg / ml) The liquid was removed by culturing at 37 ° C for 30 minutes. Then E to a final concentration of 20 mM Add DTA to release phage DNA from the phage while adding an equal volume of phage. Extract twice with ethanol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) and dissolve. The protein was removed from the liquid. Using a Soval centrifuge (14,000 xg, After separating the phages by centrifugation for 10 minutes), the aqueous phase was mixed with an equal volume of chloroform / It was extracted once with isoamyl alcohol (24: 1). After separating this phase by centrifugation, Aqueous phase with the addition of 0.1 volume of 5M sodium perchlorate and 0.1 volume of isopropanol. DNA was precipitated from the cells and incubated on ice for 30 minutes. 4 ° C, 10 minutes (14.0 The DNA was recovered by centrifugation at 00xg). The supernatant is removed by suction filtration After removal, the DNA was resuspended in 400 μl TE buffer. 0.1M 3M Re-precipitate the DNA from this solution by adding sodium acetate and 2 volumes of ethanol. I let you. DNA (14,000xg) was obtained by centrifugation at 4 ° C for 10 minutes. Recovered. The supernatant is removed by suction filtration and the remaining pellet is easily dried under vacuum DNA was then resuspended in 125 μl TE buffer containing 0.1 μg / ml RNase A. Suspended. This purification method isolates approximately 50-100 μg DNA from each phage. Brought. Example 4.8: Aspergillus niger mutant niger axdA containing phage Southern analysis of DNA   Phage λnigaxd1From λnigaxd4Isolated DNA up to, using the following restriction enzymes And analyzed by Southern analysis; KpnI, SalI, SstI, XbaI and XhoI, and the following solutions In a reaction mixture consisting of KpnI + XbaI, KpnI + SstI and KpnI + X for 5 hours at 37 ° C. A combination of hoI; 5 μl (≈1 μg) DNA solution, 2 μl approximately 10 × React buffer (BRL), 10 U restriction enzyme (BRL) and 20 μl final volume Sterile distilled water for. After digestion, the DNA was treated with 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2 volumes of Ethanol was added to cause precipitation. Centrifuge this DNA for 10 minutes at room temperature (14,000 xg). The supernatant is removed by suction filtration and left The pellets were briefly dried under vacuum and resuspended in sterile distilled water. 4 μl DNA After adding the buffering solution, incubate the sample for 10 minutes at 65 ℃ and On ice before loading the sample on a 0.6% agarose gel in buffer It cooled rapidly. Electrophoresis of DNA fragments at 25V for 15-18 hours Separated.   After electrophoresis, transfer the DNA and use nylon according to the instruction manual (pp.25-26). Membranes (Hybond N, Amersham) were subjected to alkaline vacuum blotting (alkaline vacuum blotti). ng) (VacuGene XL, Pharmacia LKB), and then prehybridized. Soybean and labeled with Aspergillus niger axdA cDNA clones as in Example 4.6. And the hybridization conditions disclosed in Example 3.3. I did it. The hybridization pattern was identified using the identification screen. Duck XAR X-ray film was obtained by exposing for 18 hours at -70 ° C.   From the results obtained, all four of the isolated clones were Aspergillus niger. It was concluded that it was hybridized with the Garx axdA cDNA. Smell all four clones , A fragment from the same genomic region was found. Example 4.9: Subcloni of the Aspergillus niger mutant niger axdA gene Ning   λnigaxd1Derived 3.7 kb XhoI by freeze-squeeze method , 0.7% agarose gel. After electrophoresis, slice the appropriate band 1 ml FS1 solution (0.3 M sodium acetate, pH 7.0; 1 mM EDTA) Shake gently for 30 minutes in. Add agarose slices to a small silica glass 0.5 ml Eppenda, which contains a plug and has a hole in the bottom, is frozen in liquid nitrogen Transferred to a dolf tube. This 0.5 ml tube is then replaced with 1.5 ml Transferred to an Eppendorf tube and then centrifuged for 10 minutes. In the supernatant , 1/50 volume FS2 solution (0.5MMgCl25% acetic acid) and 2.5% volume of 100% ethanol Was added. After culturing at -70 ℃ for 20 minutes, the DNA was incubated at 4 ℃ at 14,000 xg for 15 minutes. It was recovered by centrifugation for 1 minute. After removing the supernatant, remove the DNA pellet from the servant. Use a Savant Speedvac vacuum centrifuge. And dried. DNA was dissolved in 10 μl TE buffer and the concentration was Concentration of λDNA and ethidium bromide staining for DNA detection Determined by rose electrophoresis.   Vector Pbluescript SK-Was digested with XhoI and prepared as follows. Dephosphorylated with fatase: 1 μl (1 μg / μl) pBluescrip, 2 μl With 10 * React 2 (BRL), 1 μl (1 U / μl) XhoI and 16 μl sterile distilled water Mixed. After digesting the DNA at 37 ° C for 2 hours, 0.5 μl of alkaline phosphine was used. Ase (1 U / μl) (Pharmacia) was added, followed by an additional 30 minutes at 37 ° C. Further culturing was performed. Isolate the linearized vector from the 0.7% agarose gel described above. Was.   The 3.7 kb XhoI fragment was digested with XhoI and dephosphorylated pBluescri pt SK-The vector was ligated via the following method: 40 ng pBluescript fragment. With 300 ng of 3.7 kb XhoI fragment and 4 μl of 5 * ligation buffer (500 mM Tris-HCl, pH 7.6; 100 mM MgCl210 mM ATP; 10 mM dithiothreitol; 25% PEG -6000) and 1 μl (1 U / μl) of T4 DNA ligase (BRL) was added to this mixture. Compound to give a final volume of 20 μl. The resulting plasmid was named pIM3002 I named it. After incubating at 16 ℃ for 16 hours, the mixture is 100μ in Ca-HEPES, pH 7.0 buffer. Diluted to l. 10 μl of the diluted mixture was added to the transformed E. coli DH5α co-prepared as follows. Used for competent cells: 200 μl of E. coli DH5α overnight culture was LB-cultured. Ground (LB medium per 1000 ml: 10 g of trypticase peptone (BRL)) Preliminary with 5 g yeast extract (BBL), 10 g NaCl, 0.5 mM Tris-HCl, pH 7.5) Proliferated. This culture was treated with an O.D. having a density of 0.15-0.2.60037 ° C until equivalent And cultured in an orbital shaker. The bacteria are then 50 at 4 ° C. It was recovered by centrifugation at 00 rpm. After discarding the supernatant, the cells should be I kept it constant. The bacterial pellet was resuspended in the cells following centrifugation as described above. By suspending, 100 ml of 100 mM MgCl2Washed with 5 mM Tris-HCl, pH 7.4. This 100 ml of 100 mM CaCl2, 5 mM Tris-HCl, pH 7.4. Finally, the cells 2 ml of 100 mM CaCl2, Resuspended in 5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 14% glycerol . Aliquots (50 μl) were used immediately for transformation or freezing at -70 ° C.   E. coli DH5α competent cells were ligated with 4.5 μl of cell supernatant of 50 μl Used in transformation experiments in combination with the mixture. Incubate for 30 minutes on ice The cells were then incubated at 42 ° C for 2 minutes. Then, 1 ml of LB medium was added to the cells Was cultured at 37 ° C. for 1 hour. The bacteria are then added to 14,000 g for 30 seconds. It was recovered by centrifugation. After discarding the supernatant, resuspend the cells in 200 μl LB medium. It became cloudy. The obtained bacterial supernatant was treated with 100 μg / ml ampicillin, 50 Plated in LB medium containing μg / ml X-gel and 60 μg / ml IPTG.   12 of the obtained colonies were selected and L containing 100 μg / ml ampicillin was selected. Proliferated overnight in B medium. The culture plasmid DNA was cloned into Maniatis et al. et al., 1982, pp. 368-369), and clones containing the desired plasmid. Alkaline cell lysis used in the restriction assay disclosed in Example 4.3 for selection Isolated by method. Nucleobond PC-5 according to manufacturing instructions 00 kit (Nagel) in LB medium containing 100 μg / ml ampicillin Large scale isolation from 250 ml of E. coli DH5α culture containing grown plasmid pIM3002 did. The plasmid pIM3002 was further digested with the restriction maps obtained with the restriction map shown in FIG. It was analyzed by enzyme. Samples of E. coli DH5α containing plasmid pIM3002 were Contributed to CBS in Baarn, Da, on August 28, 1995 with the number CBS637.95. Entrusted. Example 4.10: Cloning Gene Overload in Aspergillus niger NW219 Overexpression Example 4.10.1: Aspergillus niger NW219 by cotransformation Of Aspergillus niger mutant axdA in Japan   The plasmid pIM3002 obtained in Example 4.9 was used as a cotransformation plasmid. For all plasmids pGW635 (Goosen et al., 1987) and plasmid pIM3002, Use Aspergillus niger pyrA as a selection marker to Introduced into Aspergillus niger by co-transformation of Niger NW219 .   Sample of Aspergillus niger NW219, CB, Baarn, Netherlands S, deposited on August 25, 1995, under the number CBS635.95.   Protoplasts with 0.5% yeast extract, 0.2% casamino acid, 50 mM glucose, 10 mM Mineral media supplemented with nicotinamide and 10 mM uridine was added to Aspergillus niger. Gar NW219 was prepared from Mycerium by growing at 30 ° C for 18 hours. Was. Method for preparing and transforming protoplasts of Aspergillus niger NW219 The method was performed according to the disclosure of Goosen et al., 1987. Obtained PYR+ The transformants were analyzed by Western blot to analyze the Aspergillus niger mutant niger. The expression of the gir axdA gene was analyzed. Example 4.10.2: Expression of the Aspergillus niger mutant niger axdA gene Screening of transformants for real   Aspergillus niger mutant of the transformant obtained in Example 4.10.1 Niger axdA gene product, AXDANIGAnalyzed for protein formation .   AXDANIG19 transformants were used in the growth experiments. Aspel Gills niger N402 strain was used as a wild type control. Transformants Propagated at 24, 40, 48 and 68 hours as in Example 3.1. After multiplication, my Cerium was removed by filtration and the culture filtrate was AXDA in rabbit.TUBRaw against The resulting antibody was used (Example 4.1) and analyzed by Western blotting. Was. Eight of the 19 transformants analyzed were detected by this method. To AXDANIGOverproduced the protein. Example 4.11: Sequence of the Aspergillus niger mutant niger axdA gene Analysis and arrangement   Sequence of Aspergillus niger mutant niger axdA gene and its promoter -The regulatory region, the structural part of the gene and the termination region in a sequence reaction, In combination with the use of specific oligonucleotides as primers, pBluescr ipt SK-And pUC19 determined by subcloning the fragment from pIM3002 did. The nucleotide sequence was determined as disclosed in Example 4.4 (SEQ ID NO: 5).   The sequence obtained was 2101 bp, 783 bp in the 5'non-coding region and 3'non-coding region. The code area consists of 322 bp. In the 5'non-coding region, the TATA box Found at positions 665-670. Of the Aspergillus niger axdA gene The code part is 996 bp long, and there is no interrupt by the intron. gene Encodes a protein with a size of 332 amino acids. Aspergillus niger Determined in Example 1.5.1 based on mutant Tubigensis AXDA protein As such, the N-terminal sequence is preceded by a 26-amino acid long pre-peptide. Mature ta The protein is 306 amino acids in size, and has an estimated molecular weight of 33.101 kDa and 4 It has a theoretical isoelectric point of 0.07. Example 5.1: PCR Aspergillus niger mutant Tubigencius Cloning of a cDNA fragment consisting of SaxdA Example 5.1.1: Generation of cDNA fragment by PCR   AXDATUBInternal CNBr fragment determined against (SEQ ID NO: 2) The partial amino acid sequence of was used to design an oligonucleotide mixture. The following mixture was derived.   5'-ATG-ATK-GTI-GAR-GCI-ATK-GG-3 '(20mer ) (SEQ ID NO: 3), where I is inosine, K is A, T or C, and R Represents A or G. This oligonucleotide consists of amino acid 1 (I) to amino acid 6G, in Example 1.4.2, above AXDATUBInternal amino acid sequence of Was induced from ATG is a peptide fragment with a CNBr-cleavage mechanism. It was derived from methionine, which is known to exist at the N-terminus of.   The oligonucleotide mixture was added to the oligonucleotide T7 (Stratagene) 5'-A. AT-ACG-ACT-CAC-TAT-AG-3 '(17mer) (SEQ ID NO: 4) In combination with, using the cDNA isolated as in Example 4.7, PC R (Saiki et al., 1988).   For PCR, 2 μl of the obtained λ-cDNA was added to 5 μl of 10 * reaction. Buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3; 500 ml KCl; 15 mM MgCl2; 0.01% gelatin), 4. 0 μl of 1.25 mM 4 deoxynucleotide triphosphates and a final volume of 5 Combined with 0.5 μg of oligonucleotide in 0 μl. Mix this reaction mixture 0.5 μl TAQ polymerase (5 U / μl) (HT Biotechnology, Cambridge UK) Was added. DNA at 95 ° C for 3 minutes, then 95 ° C for 1 minute, 42 ° C for 1 minute Heat denaturation was carried out by culturing for 25 minutes at 1 minute and 72 ° C. for 1 minute. 25 cycles After that, the mixture was incubated at 72 ° C. for 5 minutes. Analysis of the reaction product shows about 500b Two discontinuous products of p and 600 bp are shown. AXDA's appearance of 32kDa Based on the molecular weight and the apparent 9 kDa molecular weight of the CNBr peptide, this fragment Was within the expected limits. Example 5.1.2: Clonin of 500 bp and 600 bp PCR fragments And analysis Example 5.1.2.1: Cloning of 500 bp and 600 bp PCR fragments Training   The 500 bp and 600 bp PCR fragments were labeled with pG according to the manufacturer's instructions. Ligated into EM-T ™ (Promega) vector. After 16 hours of incubation at 14 ° C, 4.5 μl of the ligation mixture was used to transform E. coli DH5α competent cells. Was. From each ligation, 6 of the resulting colonies were selected and 100 μg / ml amp The cells were grown overnight in LB medium containing picillin. Plasmid DNA from the culture Alkaline cytolysis disclosed by Maniatis et al., 1982, pp.368-369 The solution was isolated. Example 5.1.2.2. : Sequence of 500 bp and 600 bp PCR fragments analysis   The primary structures of the 500 bp and 600 bp PCR fragments are shown in Example 4.4. Similarly, it was determined by the fragment sequencing method.   Computational analysis of the nucleotide sequences of both PCR fragments was 600b. The pPCR fragment has no similarity to any known arabinoxylan-degrading genes , Therefore it was shown to be an artifact. A 500 bp PCR fragment The nucleotide sequence is the nucleotide sequence of nucleotides 706 to 1204 shown in FIG. It was very similar to the loan nucleotide sequence. Example 5.2: of the 500 bp PCR fragment32P-labelling   The 500 bp fragment obtained by PCR was isolated and labeled with EPA91205944.5 (Publication No. 0463706A1, Examples 2.2 and 7.1, incorporated herein by reference). I have become intelligent. Example 5.3: Aspergillus niger mutant Tubigenci of the axdA gene Screening of genome library   Disclosed in Example 2 of EPA 91205944.5 (Publication No. 0463706A1) for the axdA gene Aspergillus niger mutant Tubigensis Genomera constructed as described 3x10 for evary screeningThreepfu / plates from Example 4.6 Similarly, a probe was prepared in the same manner as in Example 5.1.1.32P-labeled 500 Plated with bp PCR fragment.   Three hybridizing plaques displayed in duplicate on the replica filter Identify λtubaxh1~ Λtubaxh3I named it. The plaque was isolated and tested in Example 4. . Proliferated as in 6. Example 5.4: Phage-containing Aspergillus niger mutant Tubigensis a Southern analysis of xdADNA   DNA was isolated from lambda bacteriophage as in Example 4.7. fur The λtubaxd1~ Λtubaxd3The isolated DNA of Analyzed by Bone HI analysis: BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, SalI, SstI and Xho. I. Southern analysis was performed in the same manner as in Example 4.8.   From the results obtained, the DNA of all three isolated clones was S. niger mutant hybridized with Tubigensis axdA cDNA It was concluded. Fragments from the same genomic region are found in all three clones won. Example 5.5: Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene Subcloning of   λtubaxd3The 5.5 kb SstI fragment from the above was isolated and the same as in Example 4.9. Was digested and dephosphorylated into a plasmid named pIM3001 Vector pBluescript SK-SLigated in SstI. The plasmid pIM3001 is shown in Figure 6. Further analysis was done by a restriction enzyme that provided a restriction map. Large intestine containing pIM3001 A sample of fungus DH5α was placed on CBS in Baarn, the Netherlands on August 28, 1995. , No. CBS636.95. Example 5.6: Aspergillus niger NW219 colonized aspergill Expression of the S. niger mutant Tubigensis axdA gene Example 5.6.1: Aspergillus niger NW219 by cotransformation Of Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene   The plasmid pIM3001 obtained in Example 5.5 was cloned in the same manner as in Example 4.10.1. Under Aspergillus niger by simultaneous transformation of Spergillus niger NW219 Was introduced. The resulting PYR was then analyzed by Western blot analysis.+Transformation Expression of the Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene in the body I analyzed it. Example 5.6.2: Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA Screening of transformants for gene expression   The transformant obtained in Example 5.6.1 was used as an Aspergillus niger mutant strain. Ubigensis axdA gene product, AXDATUBAbout protein formation analyzed. Of these transformants, 19 were AXDATUBFor analysis of expression It was used for the growth experiment. Aspergillus niger N402 strain as a wild type control Used. The transformants were treated with 20, 41, 60 and 86 in the same manner as in Example 3.1. Proliferated for hours. After growth, the mycerium was removed by filtration and the culture filtrate was Rabbit, AXDATUBUsing an antibody raised against (Example 4.1) It was analyzed by turn blotting. 12 out of the 19 transformants analyzed AXDA detected by the methodTUBProduced protein. Example 5.7: Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene Sequence analysis and sequence   Sequence of Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene, The promoter / regulatory region, the structural part of the gene and the termination region In combination with the use of specific oligonucleotides as primers in column reactions , PBluescript SK-And sub-cloning the fragment from pIM3001 with pUC19 Decided. The nucleotide sequence was determined as disclosed in Example 4.4 (SEQ ID NO: 1). Column number: 7).   The resulting sequence was 2859 bp, 823 bp in the 5'noncoding region and 3'noncoding. The code area is composed of 1041 bp. In the 5'non-coding region, the CAAT box , 651-655 and the TATA box at 713-720. Found in. Aspergillus niger mutant Tubigensis axdA gene Is 996 bp long and there is no interrupt by the intron. Heredity The offspring encodes a 332 amino acid protein in size. Determined in Example 1.5.1 Fixed Such an N-terminal sequence is preceded by a 26-amino acid long pre-peptide. Mature ta The protein is 306 amino acids in size and has an estimated molecular weight of 33.250 kDa and 4 It has a theoretical isoelectric point of .20. Example 6.1: Isolation of Water-Insoluble Solid (WIS)   An insoluble polymer fraction of corn was isolated for the in vitro digestion system. G Using a Retsch miller, powder corn (3 mm) and hexane for 6 hours. It was degreased (soxhlet composition for distillation). After degreasing, the corn is heated to 105 ° C. Dried in, and re-ground (1 mm, Retsch miller). To 400 g of defatted corn, 1. 51 of 1.5% SDS / 0.5% β-mercaptoethanol was added and the After stirring for 1 hour (in order to break), it was centrifuged for 15 minutes at 24,000 g. Ta After denaturing the protein, the pellet was treated with 11 SDS / β-mercaptoethanol three times. It was washed and washed twice with 11 distilled water. Resuspend the pellet in 41 deionized water , 32 μm. This washing method and sieving were repeated. Coarse WIS fraction Dissolve pellets (greater than 32 μm) in 11 maleate buffers (pH 6.5) And incubated at 90 ° C for 50 minutes. 2 mg of α-amylase (Maxamyl ™, Gist -brocades), and incubate at 30 ℃ for 16 hours, then centrifuge at 24,000g for 15 minutes. Was. After repeating this enzymatic digestion, the pellet was washed 3 times with deionized water at 65 ° C. Was. This pellet (WIS) was freeze-dried. This WIS is 30% xylo Sucrose, 29% arabinose, 23% glucose and 7% galactose I was out. Glucose was determined not to be starch (Boeringer Mannheim, sta rch test kit). Example 6.2: In vitro digestion system for poultry   Determine the dry matter content of WIS at 120 ° C by determining the WIS weight before and after drying. It was decided (95.73%).   In vitro digestion system for poultry, 200μ NaN for 1g WISThree(Mer ck) and 1 ml of internal standard (sorbitol, 35 mg / ml, Sigma) Was. For enzyme grain digestion (with (200 μg protein) enzyme or without enzyme) , Fill the sample up to 15 ml with buffer (sodium acetate, pH 5.5), It was cultured at 9 ° C for 1 hour. 5 ml of pepsin (5.28 g / l, pH3.0: Merck for gastric digestion ) Was added and the mixture was cultured at 39 ° C. for 1.5 hours. 2.5 ml of pancreatin / gall for intestinal digestion Add soup salt (16g / l, 0.1g / l, Merck respectively) and incubate at 39 ℃ for 1.5 hours. Nourished. The sample was centrifuged for 15 minutes at 2800 g. Enzyme digestion of the supernatant Used to determine the monosaccharides released into the product (HPLC, Spectra Physics; HPX-87 P column, Biorad). The pellets were dried at 120 ° C and weighed. Of dry matter The percentage was calculated.   As a control, an in vitro system was used to measure the dose response of the crude enzyme preparation. ) Was added (the results are shown in FIG. 3). AXDA enzyme (200 μg of AXD A protein was added) showed a significant dry matter digestion compared to that of the control. Showed an increase.   The percentage of dry matter content of 15.8% in the corn WIS fraction was compared to the control The increase was 4.1% with respect to the corn WIS. Example 7: In vitro digestibility experiment with corn WIS Example 7.1: Isolation of corn WIS   SDS / mercaptoethanol culture is not applicable to animal feed, so some changes Further, corn WIS was isolated in the same manner as in Example 6. Isolation method is 1k g defatted corn. 4g of this 1kg defatted corn Of papain (Gist-brocades) / 100g corn protein added, 3 Suspended at 0 ° C for 2 hours. After this, the suspension is placed at 100 ° C. in Maxamyl (commercial Digested with Gist-brocades (2 ml / l) and centrifuged for 15 minutes at 24,000 g. The supernatant was discarded and this enzymatic digestion method was repeated on the pellet. Supernatant Was centrifuged again and washed 3 times with deionized water (11). After cleaning, (Water-insoluble solid) was freeze-dried.   The content of mono / oligosaccharide in corn WIS was adjusted to trifluorosac Determined by Sun (TFA) analysis. 0.3g WIS, 1ml 35mg / ml Add sorbitol (internal standard), 2 ml deionized water and 450 μl TFA And then hydrolyzed at 120 ° C. for 1 hour. After cooling, add 20 ml of deionized water. The hydrolysis was continued for 1 hour at 120 ° C. After cooling, freeze-dry the sample, Resuspended in 3 ml deionized water. Monosaccharides were analyzed by HPLC system (Spectra Physi cs) and removed on a HPX-87 column (Boirad). Corn WIS polymer Fractions consist of 124.8 mg / g xylose, 96.6 mg / g arabinose, 28.2 mg / g galactose. It contained tose and 156.0 mg / g glucose. High glucose content, The WIS fraction was subjected to analysis of starch (starch test kit, Boehringer Mannhaim) . It was found that the WIS fraction did not contain any starch. Example 7.2: Digestibility experiment in broilers   True metabolizable energy of feed supplemented with 20% WIS derived from corn Experiments were performed to detect the effect of the enzyme AXDA on content. The method used Was a modified "sibbald-assay".   Male broilers (3 weeks old) were individually caged in a climate controlled room. Animals were fasted for 48 hours. Then, give an accurately determined amount of fertilizer in tubes. Was. A control group was included in the experiment to compensate for the loss of endogenous energy-containing components. I did. These animals were given 10 g of D-glucose, others 10 g Was fed. Each diet was fed to 6 animals. The glucose control group It consists of 5 animals.   Animals were fasted for another 48 hours, during which excreta were quantitatively collected. Excrement Were stored at -20 ° C until analysis was performed. The animal only watered once during this period It was used and watered in a tube only once.   The recovered digest was lyophilized, conditioned in air and weighed. Feed sump And nitrogen and energy content of samples of dry matter of digested material were analyzed .   The control animal results were used to correct the experimental diet-fed animal results. The method applied is based on the experiments disclosed by McNab and Blair (1988). It is the application of the method. In that paper the method of analysis and calculation is given.   Further, in vitro digestibility of dry matter was measured by the method described in Example 6.2.   The experimental treatment was as follows. I Corn-based feed (Table 2) II Corn-based feed + 10% corn WIS III Corn-based feed + 20% corn WIS IV Corn-based feed + 20% corn WIS + 100mg / kg AXDA V Corn-based feed + 20% corn WIS + 45 mg / kg crude enzyme VI Corn-based feed + 20% corn WIS + 90mg / kg crude enzyme VII Corn-based feed + 20% corn WIS + 200mg / kg Endoxyla     Nase The composition of the base food is shown in Table 2.   Vitamin / mineral premix was formulated per kg of feed: Ribofla Bottle 4 mg, niacin 40 mg, d-pantothenic acid 12 mg, choline-chlora Id 500 mg, B12 15 μg, E 15 mg, K3 5 mg, retinyl acetate Cetate 3.44 mg, cholecalciferol 50 μg, biotin 0.1 mg, Folic acid 0.75mg, FeSOFour・ 7H2300 mg O, MnO2100 mg, CuSOFour・ 5H2O to 100 mg, ZnSOFour・ 7H2O 150 mg, Na2SeOThree0.15 mg, antioxidant 100 mg and Virginia 20 mg of isin (virginiamycin).   Results (true metabolizable energy and test corrected for nitrogen (TMEn) The results of the in vitro assay) are shown in Table 3.   TMEn-levels decreased significantly with increasing corn WIS addition.   All enzyme preparations improved TEMn values, but + 7.0% of endoxylanase, AXD Only + 10.7% of A was significant. On average, AXDA is 10% corn WIS Energy values were improved to the level of substrate diet supplemented with.   In an in vitro model (simulating the digestive process in chickens), AXDA Greatly improved dry matter digestion (+ 24.5%). Endoxylanase and crude enzyme The preparation did not show AXDA-like effects in this model. Example 8: AXDA on Bread   Using thin bread, AXDA, puploaf baking test (puploaf bak ing test). 200 g flour (Robijin (TM) / Columbus (TM) 80 / 20), 104 ml water, 1.4 g dry baker yeast (Fermipan ™), 4 g salt, 3g sugar, 400mg CaCl2・ 2H2O, 3 mg (15 ppm) ascorbic acid and 5 25 mg (25 ppm) of fungal α-amylase (Fermizyme ™ P200) and 25 μg of purified AXDA Paploaf was baked from 150 g of bread dough obtained by mixing. With a pin mixer, 52 After mixing at rpm for 6 minutes and 15 seconds, divide the dough and let it rest at 30 ° C for 45 minutes. Punch, let it sit for another 25 minutes, mold and bun it. The end of 70 minutes at 30 ℃ After the soaking, the dough was baked at 225 ° C for 20 minutes. The capacity of the loaf is Determined by the rapeseed displacement method. The capacity of the loaf is Increase from 490 ml (control) to 535 ml of loaf containing AXDA, ie 9% Increased.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/24 8827−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｄ２１Ｃ 3/00 7633−3Ｂ Ｄ２１Ｃ 3/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:685） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファン オーイェン アルバート ヨハネ ス ヨセフ オランダ エヌエル‐2275イックスイック ス フォールブルク オーヴェルブルクカ ーデ 78 (72)発明者 ギールケンス マルクス マテウス カタ リーナ オランダ エヌエル‐6708ペーペー ワー ヘニンゲン ラインステーグ ８―６セー (72)発明者 デ グラーフ レーンデルト ヘンドリッ ク オランダ エヌエル‐6862セーカー オー ステルベーク コルネリス コーニングス トラート ８ (72)発明者 ヴィーセル ヤコブ オランダ エヌエル‐6703セーカー ワー ヘニンゲン ヒンケロールドセウェッヒ ５─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12N 9/24 8827-4B C12N 9/24 D21C 3/00 7633-3B D21C 3/00 // (C12N 15 / 09 ZNA C12R 1:66) (C12N 15/09 ZNA C12R 1: 685) (C12N 1/15 C12R 1:66) (C12N 9/24 C12R 1: 685) (81) Designated country EP (AT, BE, CH , DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Juan Owen Albert Johannes Joseph Netherlands Enuel-2275 IX Icks Fauhlburg Oberburg Kade 78 (72) Inventor Girkens Marx Mateus Catalina Netherlands Enuel-6708 Papeewa Wenningen Rheinstaeg 8-6 Sa (72) Inventor De Graaf Reindert Hendrick Netherlands Enuel-6682 Saker Oh Sterbeek Cornelis Corning Strat 8 (72) Inventor Wissel Jacob Ola Da Nuel-6703 Saker Waheningen Hinkerold de Wech 5

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチド又はそのポリペプチド前駆 体をコードするＤＮＡフラグメントを含有し、かつ前記ＤＮＡフラグメントが、 以下のフラグメントから選択される事を特徴とする組換え体ＤＮＡ。 （ａ）配列番号５のアミノ酸１〜３０６で表示されるアミノ酸配列を有するポ リペプチド又はアミノ酸−２７〜３０６で表示される該ポリペプチドのポリペプ チド前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｂ）配列番号７のアミノ酸１〜３０６で表示されるアミノ酸配列を有するポ リペプチド又はアミノ酸−２７〜３０６で表示される該ポリペプチドのポリペプ チド前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｃ）依然としてアラビノキシラン分解活性を有する、配列番号５又は７にお いて記述されるアミノ酸残基１〜３０６で表示されるポリペプチドの変異体又は 部分、又はそのポリペプチド前駆体をコードするＤＮＡフラグメント、 （ｄ）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列 番号５のヌクレオチド７８４〜１７７９又は配列番号７のヌクレオチド８２３〜 １８１８で表示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメント、 （ｅ）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドの 一部をコードするＤＮＡフラグメントであって、ＤＮＡフラグメントが配列番号 ５のヌクレオチド７８４〜１７７９又は配列番号７のヌクレオチド８２３〜１８ １８で表示されるＤＮＡフラグメントに対してハイブリダイズ出来るＤＮＡフラ グメント ２．アラビノキシラン分解活性が糸状菌から得られることを特徴とする、請求項 １の組換え体ＤＮＡ。 ３．糸状菌がアスペルギルス種であることを特徴とする、請求項２の組換え体Ｄ ＮＡ。 ４．アスペルギルスがニガー又はチュービゲンシスであることを特徴とする、請 求項３の組換え体ＤＮＡ。 ５．原核又は真核宿主細胞に存在する場合に、ＤＮＡフラグメントの発現に必要 とされる調節ＤＮＡ配列を更に含む、請求項１の組換え体ＤＮＡ。 ６．調節ＤＮＡ配列が、該ＤＮＡフラグメントのポリペプチドをコードする配列 に関して非相同であることを特徴とする、請求項５の組換え体ＤＮＡ。 ７．非相同調節ＤＮＡ配列が、その相同の調節ＤＮＡ配列に結合されると、宿主 におけるＤＮＡフラグメントの発現に比べて該宿主でのＤＮＡフラグメントの発 現を高める為に選択される、請求項６の組換え体ＤＮＡ。 ８．ベクターの形態にある、請求項１〜７のいずれか一項の組換え体ＤＮＡ。 ９．請求項１〜８のいずれか一項の組換え体ＤＮＡを含有する、形質転換された 真核又は原核宿主細胞。 １０．宿主がアスペルギルス属に属する、請求項９の形質転換された真核宿主細 胞。 １１．形質転換条件下で、宿主細胞を、請求項８の組換え体ＤＮＡで処理し、ア ラビノキシラン分解酵素の高められた発現を選択することによって、該アラビノ キシラン分解酵素の高められた発現のできる宿主細胞を得る方法。 １２．該宿主細胞が、アスペルギルス種宿主細胞である、請求項１１の方法。 １３．宿主又はそれらの先祖が、請求項８の組換え体ＤＮＡで形質転換されてい る事を特徴とする、アラビノキシラン分解酵素を産生できる宿主細胞を、その手 助けとなる条件下で増殖し、該酵素を回収する工程を含むアラビノキシラン分解 酵素の取得方法。 １４．配列番号６又は配列番号８で記述されるアミノ酸配列を特徴とする、アラ ビノキシラン分解活性を有する実質的に純粋なポリペプチド又は依然として活性 を有するその変異体もしくはその部分。 １５．飼料、食品又は紙・パルプ加工での使用の為に作られた、請求項１４の殆 ど純粋なポリペプチドから成る組成物。 １６．酵素が固定化される、請求項１５の組成物。 １７．アラビノキシラン分解を補助する為の、請求項１４のポリペプチドの使用 。 １８．飼料又は食品添加剤としての、請求項１４のポリペプチドの使用。 １９．紙・パルプ加工での、請求項１４のポリペプチドの使用。 ２０．パン焼きでの、請求項１４のポリペプチドの使用。 ２１．請求項１４のポリペプチドを含有する飼料又は食品。 ２２．配列番号５のヌクレオチド１〜７８３で表示されるＤＮＡフラグメント又 はそれに結合したＤＮＡ配列の発現を調節することのできる、そのサブフラグメ ントを含有する組換え体ＤＮＡ。 ２３．配列番号７のヌクレオチド１〜８２２で表示されるＤＮＡフラグメント又 はそれに結合したＤＮＡ配列の発現を調節することのできる、そのサブフラグメ ントを含有する組換え体ＤＮＡ。[Claims] 1. Polypeptide having arabinoxylan degrading activity or its polypeptide precursor Containing a DNA fragment encoding the body, and said DNA fragment Recombinant DNA selected from the following fragments.   (A) A polynucleotide having an amino acid sequence represented by amino acids 1 to 306 of SEQ ID NO: 5. A polypeptide or a polypeptide of the polypeptide represented by amino acids -27 to 306 A DNA fragment encoding the tide precursor,   (B) A amino acid sequence represented by amino acids 1 to 306 of SEQ ID NO: 7 A polypeptide or a polypeptide of the polypeptide represented by amino acids -27 to 306 A DNA fragment encoding the tide precursor,   (C) SEQ ID NO: 5 or 7 still having arabinoxylan degrading activity Or a variant of the polypeptide represented by amino acid residues 1 to 306 or A DNA fragment encoding a portion, or a polypeptide precursor thereof,   (D) a sequence encoding a polypeptide having arabinoxylan degrading activity and having a sequence Nucleotides 784 to 1779 of SEQ ID NO: 5 or nucleotides 823 to 823 of SEQ ID NO: 7 A DNA fragment having the nucleotide sequence represented by 1818,   (E) a polypeptide having arabinoxylan degrading activity or A DNA fragment encoding a part, wherein the DNA fragment is SEQ ID NO: 5 nucleotides 784 to 1779 or SEQ ID NO: 7 nucleotides 823 to 18 A DNA fragment capable of hybridizing to the DNA fragment represented by 18. Gumento 2. The arabinoxylan degrading activity is obtained from a filamentous fungus, 1. Recombinant DNA of 1. 3. Recombinant D according to claim 2, characterized in that the filamentous fungus is Aspergillus spp. NA. 4. A contract, characterized in that Aspergillus is niger or tubogensis Recombinant DNA of claim 3. 5. Required for expression of DNA fragments when present in prokaryotic or eukaryotic host cells 2. The recombinant DNA of claim 1, further comprising a regulatory DNA sequence said to be 6. The regulatory DNA sequence is a sequence encoding the polypeptide of the DNA fragment. Recombinant DNA according to claim 5, characterized in that it is heterologous with respect to. 7. When a heterologous regulatory DNA sequence is linked to its homologous regulatory DNA sequence, the host Expression of the DNA fragment in the host relative to the expression of the DNA fragment in Recombinant DNA according to claim 6, which is selected to enhance the expression. 8. Recombinant DNA according to any one of claims 1 to 7, in the form of a vector. 9. Transformed, containing the recombinant DNA of any one of claims 1-8 Eukaryotic or prokaryotic host cells. 10. The transformed eukaryotic host cell according to claim 9, wherein the host belongs to the genus Aspergillus. Vesicles. 11. The host cells are treated with the recombinant DNA of claim 8 under transforming conditions, By selecting for enhanced expression of the rabinoxylan degrading enzyme, the arabino A method for obtaining a host cell capable of enhanced expression of a xylan-degrading enzyme. 12. 12. The method of claim 11, wherein the host cell is an Aspergillus sp. Host cell. 13. Hosts or their ancestors have been transformed with the recombinant DNA of claim 8. A host cell capable of producing an arabinoxylan-degrading enzyme, which is characterized by Arabinoxylan degradation involving the step of recovering the enzyme grown under conditions that help Enzyme acquisition method. 14． An array characterized by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. Substantially pure polypeptide having vinoxylan degrading activity or still active A variant or part thereof having 15. Most of claim 14 made for use in feed, food or paper and pulp processing. A composition consisting of a pure polypeptide. 16. 16. The composition of claim 15, wherein the enzyme is immobilized. 17． Use of the polypeptide of claim 14 to aid in arabinoxylan degradation. . 18. Use of the polypeptide of claim 14 as a feed or food additive. 19. Use of the polypeptide of claim 14 in paper and pulp processing. 20. Use of the polypeptide of claim 14 in baking. 21. A feed or food containing the polypeptide of claim 14. 22. A DNA fragment represented by nucleotides 1 to 783 of SEQ ID NO: 5 or Is a subfragment capable of regulating the expression of DNA sequences bound to it. Recombinant DNA containing the same. 23. A DNA fragment represented by nucleotides 1 to 822 of SEQ ID NO: 7 or Is a subfragment capable of regulating the expression of DNA sequences bound to it. Recombinant DNA containing the same.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2006219767A (en) * 2005-02-08 2006-08-24 Univ Of Tsukuba Method for removing unsaturated uronic acid in chemical pulp for papermaking

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