JPH09501829A

JPH09501829A - Method for amplification and detection of hepatitis B virus nucleotide sequence and DNA

Info

Publication number: JPH09501829A
Application number: JP7504627A
Authority: JP
Inventors: シユピーズ，ウーベ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-07-13
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 1997-02-25
Also published as: EP0785996A4; AU7326494A; CA2167056A1; EP0785996A1; WO1995002690A1

Abstract

(57)【要約】検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスの存在及び種類を決定するために有用な肝炎Ｂ型ウイルスの短いヌクレオチド配列。提供する配列は、修飾ポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応を含む種々のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によって増幅できる。提供する配列はまた、標準的ドット−又はレプリカ−ドット操作によってハイブリダイズできる。検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスの検出及び検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスの種類の決定に使用される方法及びキットも提供する。 (57) [Summary] Short nucleotide sequences of hepatitis B virus useful for determining the presence and type of hepatitis B virus present in a test sample. The provided sequences can be amplified by a variety of DNA hybridization techniques, including modified polymerase chain reaction or ligase chain reaction. The sequences provided can also be hybridized by standard dot- or replica-dot operations. Also provided are methods and kits used to detect hepatitis B virus in a test sample and determine the type of hepatitis B virus present in the test sample.

Description

【発明の詳細な説明】肝炎Ｂ型ウイルスのヌクレオチド配列及びＤＮＡの増幅及び検出のための方法技術分野本発明は一般的には、肝炎Ｂ型ウイルス、並びに肝炎Ｂ型ウイルスを検出するための方法及び検査キットに関する。本発明はより特定的には、肝炎Ｂ型ウイルスゲノムのセグメントと相補的なヌクレオチド配列であって、増幅することができ、及び／又は検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定するために使用できるヌクレオチド配列に関する。発明の背景肝炎Ｂ型ウイルス（以後ＨＢＶと称する）のウイルス増殖の検出は、ウイルス複製及び患者感染度の有用な指標であることが判明した。ＨＢＶは、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅと称する新種ウイルスの原型物質である。これらのウイルスは、一本鎖の部分を含む小さい環状ＤＮＡ分子と、ＤＮＡを修復して完全に二本鎖にする内在性ＤＮＡポリメラーゼとを有する。肝細胞に対する強い向性及び持続的感染の発生も、この種のウイルスの特徴である。Ｂ型肝炎の完全ビリオンは、全体の直径が４２ｎｍの複雑な二層構造からなる。２７ｎｍの高電子密度コアは、分子量１．６×１０⁶の環状二本鎖ＤＮＡを含んでいる。コアを包囲する厚さ７ｎｍの外層は、ＨＢｓＡｇと称する生化学的に不均一な複合体からなる。ＨＢｓＡｇは感染した肝細胞が多く産生し、大きさ１７〜２５ｎｍの範囲の球形粒子、及び直径は類似しているが長さは様々である管状フィラメントとして血液中に放出される。コア及び表面抗原に対する抗体は、それぞれ抗ＨＢｃ及び抗ＨＢｓと称する。Ｂ型肝炎感染では第三の抗原−抗体系も観察され、ＨＢｅＡｇ／抗ＨＢｅと称されている。現在のデータは、ＨＢｅＡｇがＢ型肝炎ビリオンのキャプシドの構成部分であることを示唆している。ＨＢｅＡｇはＨＢＶのヌクレオチドキャプシドと密に相関しているため、ビリオン濃度の、従って血清感染度の信頼できる指標である。現在の慢性Ｂ型肝炎療法はいずれも、ウイルス複製の持続的抑制を目指している。従って、ウイルスＤＮＡの信頼できる直接的測定方法があれば、療法に応答する患者と応答しない患者とを早期に判別する上で極めて有用である。血清ＨＢＶ−ＤＮＡ及びＨＢｅＡｇは、ＨＢＶ複製を監視するための信頼できる指標であると考えられる。ＨＢｓＡｇの主な抗原決定基又はサブタイプは４種類存在し、ａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ及びａｙｒと称されている。ａｄｗ及びａｙｒサブタイプは、東南アジア及び極東を除き殆ど世界中で優位を占めているが、東南アジア及び極東ではａｄｒも一般的である。ａｙｒサブタイプはめったに観察されない。基反応性決定基（ｇｒｏｕｐ−ｒｅａｃｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）ａは前記４種類の間で交差反応し、この決定基に対する抗体が生ずると、第二のサブタイプによる再感染が防護される。血清及び他の体液中のＨＢＶを検出するために、種々の検査が使用されてきた。免疫学的検査は、ヒト又は動物の体内で産生された抗体に依存して、前述の特定ウイルスタンパク質を検出する。しかしながら、免疫学的検査は間接的であり、非特異的抗原−抗体反応があると偽陽性という結果をもたらし得る。また、ある状況下では、抗原−抗体検査が血清陰性の人からでも、輸血した血液の受容体がＨＢＶ感染を引き起こす。サザンブロット又はドットブロット操作のようなハイブリダイゼーション技術も使用されてきた。この種の技術は通常、細胞スクレープ又は生検材料からＤＮＡを抽出し、これを固相上に完全ＤＮＡとして直接固定するか、又は分解した後でゲル電気泳動によって制限フラグメントとして固定する操作を含む。固定したＤＮＡは、放射性標識を有する核酸プローブによって検出するのが最も一般的である。しかしながら、標準的ハイブリダイゼーション方法の感度はごく僅かのウイルス複製を認識するほど十分ではないため、感染患者と非感染患者とを判別することができない。この感度の問題を解決するために、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ウイルスＤＮＡ配列を増幅することができる。このようにして得た生成物は、ウイルスの種類を同定するための一般的ハイブリダイゼーション技術、例えばサザンブロットを用いて同定できる。Ｃ．Ｏｓｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：１６３（１９８８）及びＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，２０２号参照。ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に記載されており、標準的ハイブリダイゼーション方法の感度の改善に使用されてきた。米国特許第４，５６２，１５９号には、検査試料中のＨＢＶＤＮＡを特異的に検出するためにＰＣＲを使用する方法及びキットが開示されている。実際の操作では、感度レベルは、試料当たり約５０〜１００コピーである。前述のようなスクリーニング方法があるにも拘わらず、輸血後肝炎症例のかなりの割合が、依然として、検出を免れたＨＢＶで汚染された血液の輸血によって発生している。従って、臨床試料中のＨＢＶを同定するための、より正確で、信頼性が高く、半自動化が可能な別の方法が必要とされている。別の標的増幅メカニズムとして、欧州特許出願公開第３２０３０８号又は欧州特許出願公開第４３９１８２号に記載のようなリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ（商標））も知られている。ＬＣＲ（商標）は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ標的の検出に使用できる。この操作では、標的核酸配列の隣接領域に対して相補的な二つのプローブ（例えばＡ及びＢ）をハイブリダイズし、ＤＮＡリガーゼによって連結する。次いで、連結したプローブを変性して標的から切り離し、その後、最初のプローブＡ及びＢと反対のセンスの二つの別のプローブ（Ａ’及びＢ’）とハイブリダイズする。次いで、前記第二のプローブを連結する。その後の変性／ハイブリダイゼーション／連結サイクルによって、センス（＋）及びアンチセンス（−）両方の２倍の長さのプローブが形成される。ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを繰り返すと、標的核酸の増幅が達成される。ＬＣＲはこれまで、ＨＢＶの検出及び／又は定量に使用されたことはない。従って、増幅が可能であり、検査試料中にＨＢＶがあればこれをＬＣＲの使用によって検出するためのＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖を提供することは有益なことと思われる。オリゴヌクレオチド鎖を組合わせて使用することは、検査試料中のＨＢＶの存在及び特定種類の特異的且つ高感度なｉｎｖｉｔｒｏ診断を可能にするために有利であろう。また、慢性活性肝炎患者の薬物療法の成果を監視するために、検査試料中のＨＢＶの定量法を提供することも有益であろう。発明の概要ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する約１０〜約６０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブが、本発明により提供されよう。標的ＨＢＶ配列（配列番号２１、２２、２３、２４及び２５）及びオリゴヌクレオチドプローブは、下記のうちの一つ以上から選択し得る：ｘは特に指示のない限りヒドロキシルである。下線の塩基は、本明細書中に記載のような意図的な不適合である。一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは下記の中から選択する：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９又はこれらの相補配列。非標的ＤＮＡを含む検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを検出するための構成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）も提供される。該構成物は、第一上流オリゴヌクレオチドプローブと、第一下流オリゴヌクレオチドプローブとを含み、各プローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、上流プローブの３’末端が下流プローブの５’末端の近傍にハイブリダイズし、標的核酸配列は前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である。本発明の構成物は更に、上流プローブの３’末端及び下流プローブの５’末端が無修正の場合には連結不能であるという特徴も有する。ある実施態様では、末端が連結可能となるように、上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することによって、連結不能末端を修正する。この種の構成物は、下記の対セット又はこれらの相補配列の中から選択し得る：本発明の別の実施態様では、末端が連結可能となるように、標的依存エキソヌクレオリチック物質（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｇｅｎｔ）により下流プローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いで対応する上流プローブを標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、連結不能末端を修正する。この種の構成物は下記の対セット又はこれらの相補配列の中から選択し得る：本発明の第三の実施態様では、下流プローブが標的にハイブリダイズした時に５’突出部を形成し、プローブの末端を連結可能にすべく前記突出部を除去する修正をなし、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように操作することからなる。検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスのＤＮＡを検出するための構成物であって、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列にハイブリダイズすることができる約１０〜約６０ヌクレオチドの第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブからなる構成物も提供される。標的核酸配列は前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５又はその相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択され、前記プローブは、肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的核酸配列の互いに反対側の末端で互いに反対側の鎖にハイブリダイズされる。対は下記の対セット又はその相補配列の中から選択し得る：検査試料中に存在する肝炎Ｂ型ウイルスのＤＮＡを検出するための構成物であって、（ａ）第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが、ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズできる約１０〜約６０個のヌクレオチドからなり、第一上流プローブの３’末端が第一下流プローブの５’末端の近傍にハイブリダイズされ、標的核酸配列が前述のような配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列である第一オリゴヌクレオチドセット、並びに（ｂ）第二上流プローブ及び第二下流プローブを含み、どちらのプローブもステップ（ａ）の第一オリゴヌクレオチドセットにハイブリダイズでき、第二上流プローブの５’末端が第二下流プローブの３’ 末端の近傍にハイブリダイズされる第二オリゴヌクレオチドセットであると定義される構成物も提供される。該構成物は、第一上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結可能になるように修正される連結不能末端を有する。ある実施態様では、４個のオリゴヌクレオチドプローブを下記の中から選択する：（ａ）セット４０３Ｇ：配列番号１及び３がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号２及び４がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｂ）セット１８４Ｇ：配列番号５及び７がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号６及び８がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｃ）セット２３１Ｇ：配列番号９及び１１がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１０及び１２がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｄ）セット１８７５Ｇ：配列番号１３及び１５がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１４及び１６がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｅ）セット６６４Ｇ：配列番号１７及び１９がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号１８及び２０がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである。これらのセットは下記のように例示される：別の実施態様では、本発明の構成物は、標的依存エキソヌクレオリチック剤によって非ホスホリル化又は不適合塩基を第一下流プローブの５’末端から除去し、次いで標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで上流プローブを延長することにより、末端が連結可能になるように修正される連結不能末端を有する。該構成物は、下記の中から選択した４個のオリゴヌクレオチドプローブを有する：（ａ）セット４０３Ｅ：配列番号１及び２８がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号２７及び４がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｂ）セット２３１Ｅ：配列番号９及び３２がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号３１及び３３がそれぞれ第二下流プローブ及び第二上流プローブである；（ｃ）セット６６４Ｅ：配列番号１７及び３６がそれぞれ第一上流プローブ及び第一下流プローブであり、配列番号３５及び３７がそれぞれ第二上流プローブ及び第二下流プローブである。これらのセットは下記のように例示される：別の実施態様では、本発明の構成物は、標的にハイブリダイズした時に５’末端突出部を有する下流プローブを含み、プローブの末端を連結可能にすべく前記突出部を除去する修正をなし、修正後の下流プローブの５’末端が上流プローブの３’末端に当接するように操作することからなる。検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定するための方法も提供する。該方法は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、検査試料中のＤＮＡを本発明の一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプローブは非ハイブリダイズプローブと区別ができるようになっており、ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することからなる。別の実施態様では、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在を決定する方法で連結可能対セットを使用する。この場合は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）検査試料中のＤＮＡを、本発明の一つ以上の上流オリゴヌクレオチドプローブ及び一つ以上の下流オリゴヌクレオチドプローブで、肝炎Ｂ型ウイルスの標的核酸配列の同一鎖とハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーションの結果として、無修正のままでは連結不能な末端を発生させ、（ｂ）プローブを連結可能にするために、上流プローブの３’末端を標的依存的に修正し、（ｃ）ハイブリダイズした上流プローブの３’末端をハイブリダイズした下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に連結して、ハイブリダイズしたプローブを非ハイブリダイズプローブと区別できるようにし、（ｄ）ハイブリダイズしたプローブの存在を検出する。更に別の実施態様として、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの存在をＰＣＲによって決定する方法を提供する。この方法は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）第一オリゴヌクレオチドプローブ及び第二オリゴヌクレオチドプローブを、肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡの同一標的核酸配列の互いに反対側の末端で互いに反対側の鎖にハイブリダイズし、（ｂ）ハイブリダイズした第一及び第二オリゴヌクレオチドプローブを延長して、標的配列に対し連続的に相補的にして、ハイブリダイズしたプローブを非ハイブリダイズプローブと区別できるようにし、（ｄ）ハイブリダイズしたプローブの存在を検出することからなる。ＬＣＲ対は、検査試料中の肝炎Ｂ型ウイルスの存否又は量を決定するための方法でも使用される。この場合は、標的配列を配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列から選択し、（ａ）一本鎖標的核酸配列を含んでいる疑いのある試料を、第一上流プローブ及び第一下流プローブを含み、各プローブが前記ハイブリダイゼーション条件下で肝炎Ｂ型ウイルスの前記標的核酸配列の同一鎖にハイブリダイズすることができ、下流プローブの５’末端及び／又は上流プローブの３’末端がこれらのプローブを標的にハイブリダイズできるように修正されない限り連結不能であるような第一オリゴヌクレオチドセットに暴露し、（ｂ）第一上流プローブの３’末端及び第一下流プローブの５’末端を、これらのプローブが標的配列にハイブリダイズした時にのみ修正し、それによって前記末端を連結可能にし、（ｃ）二つの第一プローブを連結して第一連結生成物を形成し、該第一連結生成物を標的から分離し、（ｄ）該混合物を、ハイブリダイゼーション条件下で、第二上流プローブ及び第二下流プローブからなる第二オリゴヌクレオチドセットに暴露し、二つの第二プローブを連結して第二連結生成物を形成し、該第二連結生成物を第一連結生成物から分離し、ここで連結したプローブは非連結プローブから区別することができるものであり、ステップ（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返し、（ｅ）標的ＤＮＡの存否又は量と相関している連結オリゴヌクレオチドプローブの存在を検出するステップからなる。配列番号２１、２２、２３、２４及び２５並びにこれらの相補配列の中から選択した一つ以上の配列に指向される本発明の一つ以上のオリゴヌクレオチドであって、検出可能なように標識されたオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドを検出するための手段と、試料中の肝炎Ｂ型ウイルスＤＮＡを増幅する試薬とを含む、肝炎Ｂ型ウイルス検出キットも提供する。図面の簡単な説明第１図は、先行技術で公知のリガーゼ連鎖反応のプロセスを示す説明図である。第２図は、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）１０³ＨＢＶゲノムコピー／ｍｌ患者血清で、ＨＢＶＤＮＡ標的分子の数をＩＭｘ（登録商標）速度（計数／秒／秒）に対してプロットした標準曲線である。ＨＢＶＤＮＡ陽性試料を、ＨＢＶ指標が陰性のヒト血清中に希釈した。血清希釈物は陰性対照としても使用した。血清１ｍｌ当たりのＨＢＶＤＮＡ分子数としてグラフに示す陽性対照希釈物を反復して検査し、平均値をＩＭｘ（登録商標）速度として示した。約２０００〜３０００ゲノムコピー／ｍｌ又は１０〜１５コピー／アッセイにそれぞれ等しい５〜１０ｆｇＨＢＶ−ＤＮＡ／ｍｌ試料の検出限界が得られた。ＬＣＲの結果は後述の実施例１で得た。第３図ａ〜第３図ｃは、ＨＢＶに感染した３人の患者（Ａ、Ｂ、Ｃ）から得られた結果を示すグラフである。ＬＣＲで得られたデータ（実施例７）は、半定量的にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルと明らかに併行していた（第３図ａ）。ＨＢＶ−ＤＮＡレベルは、インターフェロンで治療した患者の逐次的採血試料中でも測定できた（３ｂ〜３ｃ）。これらの患者の血清では、ＨＢＶ−ＤＮＡは、インターフェロン治療開始前は一般的なドットブロットハイブリダイゼーション検査によって明らかに検出可能であったが、治療後は陰性となった。ＬＣＲ検出システムでは、治療に成功した後でも、一般的なハイブリダイゼーションアッセイより数週間長い期間にわたって血清ＨＢＶ−ＤＮＡを検出することができた。発明の詳細な説明定義本発明で使用する用語は下記のように定義される。「アッセイ条件」とは、温度、イオン強度、プローブ濃度等に関するＬＣＲ条件を意味する。これらは当業者に公知である。ＬＣＲは本質的に二つの状態又は条件、即ちアニーリング又ハイブリダイゼーション条件、及び変性条件を使用する。「ハイブリダイゼーション条件」は一般的に、アニーリング及びハイブリダイゼーションを促進する条件であると定義される。しかしながら当業者によく知られているように、このようなアニーリング及びハイブリダイゼーションは幾つかの要素、例えば温度、イオン強度、プローブの長さ及びプローブのＧ：Ｃ含量に依存するものである。例えば、反応温度の低下はアニーリングを促進する。任意の所与のプローブセットについて、融点又はＴｍは幾つかの公知の方法のいずれかによって測定できる。典型的には、アッセイ条件は、融点よりやや低い温度を含む。イオン強度又は「塩」濃度も融点に作用する。なぜなら、小型のカチオンはホスホジエステル主鎖上の負電荷を無くすことにより二重構造（ｄｕｐｌｅｘ）の形成を安定化する傾向を示すからである。典型的な塩濃度はカチオンの種類及び原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。また、高いＧ：Ｃ含量及び長いプローブ長も、二重構造の形成を安定化することが知られている。なぜなら、Ａ：Ｔ対には水素結合が２個しかないのに対し、Ｇ：Ｃ対合は３個の水素結合を有し、またプローブが長いと塩基を互いに保持する水素結合がより多くなるからである。従って、高いＧ：Ｃ含量及び長いプローブ長は、融点を低下させ「アッセイ条件」に作用する。プローブを選択すればＧ：Ｃ含量及び長さが分かり、これを基にして、どのような「アッセイ条件」とするかを正確に決定することができる。イオン強度は典型的には酵素活性に関して最適化されるため、変化させる余地がある唯一のパラメーターは温度であり、特定プローブセット及びシステムの適当な「アッセイ条件」は当業者が決定できる。「変性条件」は、一般的には、二本鎖オリゴヌクレオチドから一本鎖形態への解離を促進する条件であると定義される。この条件には、高温及び／又は低イオン強度が含まれる。これは、当業者には明らかなように、前述のパラメーターと本質的に反対のものである。塩基に関する「相補（的）」という用語は、ＤＮＡの場合には塩基対Ａ及びＴ、Ｃ及びＧを意味し、ＲＮＡの場合には塩基対Ａ及びＵ、Ｃ及びＧを意味する。即ち、ＧはＣに対して相補的であり、ＣもＧに対して相補的である。相補塩基は「適合」であり、非相補塩基は「不適合」である。核酸配列に関しては、プローブ又は標的に対して「相補的」な核酸配列又はプローブとは、その配列がアッセイ条件下で相補プローブ又は標的にハイブリダイズできることを意味する。従って、アッセイ条件下でハイブリダイズさせることができさえすれば、ハイブリダイゼーション可能領域に不適合塩基対を有し得る配列が含まれる。後述のように、プローブＡはプローブＡ’と相補的であり、プローブＢはプローブＢ’と相補的である。「修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」は、上流プローブを対応する下流プローブに標的依存的に連結できるようにする操作を意味する。従って、標的、標的相補配列又はこれらから生成されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしたプローブのみが「修正」される。好ましくは、ハイブリダイズしたプローブを、標的内に含まれている配列情報に依存する方法で酵素的に修正して、これらのプローブが互いに連結できるようにする。好ましい酵素は、５’から３’への標的依存エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼである。５’から３’への標的依存エキソヌクレアーゼ活性は、５’から３’への標的依存ポリメラーゼ活性を有する試薬と組合わせて使用することもできる。「修正」は、使用する修飾末端の種類に応じて、幾つかの方法で実施し得る。例えば、本発明のプローブの一部は、１９９１年１０月１日出願の米国特許出願第０７／７６９，７４３号に記載のようなギャップ充填、又は１９９２年８月３日出願の米国特許出願第０７／９２５，４０２号に記載のようなエキソヌクレアーゼ開裂によって「修正」されるように設計した。前記先行特許はどちらも本明細書に参考として包含される。「エキソフォーマット（ｅｘｏｆｏｒｍａｔ）」は、標的依存性エキソヌクレオリチック剤により下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端から非ホスホリル化又は不適合塩基を除去し、次いですぐ近傍の上流プローブの３’末端を標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結可能にするように連結不能末端を修正する操作を意味する。「エキソヌクレオリチック」という用語は、好ましくは酵素が示す、ＤＮＡ又はＲＮＡ基質の５’末端からの除去活性を意味する。エキソヌクレオリチック活性は、通常はある種のＤＮＡポリメラーゼと協働するエキソヌクレアーゼ又は５ ’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性と協働し得る。後で詳述するように、エキソヌクレオリチック活性は通常鋳型依存性である。「ギャップフォーマット」は、標的にハイブリダイズした上流オリゴヌクレオチドプローブの３’末端を、標的核酸配列の非ハイブリダイズ介在部分と相補的なヌクレオチドで延長することにより、末端が連結できるように、連結不能末端を修正する方法を意味する。「連結」は一般的な用語であり、二つのプローブを共有的に結合させる任意の方法を意味する。酵素連結及び光連結（ｐｈｏｔｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）は二つの一般的に使用されている連結方法である。好ましい酵素連結ステップを可能にする条件及び試薬は当業者に公知であり、前出の参考文献に開示されている。本発明で有用な連結試薬としては、Ｔ４リガーゼ、並びに原核生物リガーゼ、例えば大腸菌リガーゼ、及び欧州特許第３２０３０８号に教示されているようなＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）が挙げられる。最後に挙げたリガーゼは、ＬＣＲ（商標）の熱サイクルの間活性を維持することができるため、現在好んで使用されている。熱的に安定なリガーゼがなければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを再添加しなければならない。真核生物リガーゼ、例えばＲａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６）に記載のようなショウジョウバエのＤＮＡリガーゼも有用である。酵素連結に代え得るものの一つは、欧州特許出願明細書第３２４６１６号に記載のような光連結である。「修正がないと連結不能」という用語は、標的依存的に修正していない場合には別のプローブに連結できない上流プローブの３’末端又は下流プローブの５’ 末端を説明する用語である。修正は、この末端を連結可能にするために除去、置換又は別の修飾にかける操作であり得る。連結不能末端の具体例としては、上流プローブの３’に連結することはできないが、連結可能になるように標的依存的に修正することはできる、下流プローブの非ホスホリル化５’末端が挙げられる。別の具体例は、標的の末端に対するプローブの末端又は内部不適合である。プローブがそれぞれの標的にハイブリダイズしたら、これらの不適合を標的依存的に修正してプローブの連結を可能にする。別の具体例は、前出の米国特許出願第０７／９２５，４０２号に記載されている。「近傍（ｐｒｏｘｉｏｍａｔｅ）」は、３’末端及び５’末端が約１〜２０ヌクレオチド、より好ましくは約１〜１０ヌクレオチドの距離内で位置するように、近傍で同一標的鎖にハイブリダイズした後述のような上流及び下流プローブの位置を意味する。近傍は、ギャップ及び突出延長を含み得る。これに対し、「隣接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」プローブは、それぞれの３’及び５’末端が０ヌクレオチドの距離で位置するような位置でハイブリダイズしたものであると定義される。近傍プローブは修正によって隣接する。「上流」及び「下流」プローブは、同一標的核酸鎖の異なる領域にハイブリダイズした二つの異なる非重複オリゴヌクレオチドを意味する。一方のオリゴヌクレオチドの３’末端は他方のオリゴヌクレオチドの５’末端の方向にある。前者は「上流」プローブと称し、後者は「下流」プローブと称する。「プライム（’）」符号は、相補的な塩基又は配列を示すのに使用されている。従ってプローブＡは、Ａ’に対して補末端（ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）ではない末端を有し得るとしても、前述の定義に従い、Ａ’に対して相補的であり得る。Ｂ及びＢ’についても同様である。「適した及び／又は適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）」は、近傍プローブのギャップを充填するために必要なヌクレオチドを意味する。必要とされるヌクレオチドの種類及び量は標的ＤＮＡに依存する。ギャップ充填については後で詳述する。典型的ヌクレオチドは、ＤＮＡの場合にはグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を含み、ＲＮＡの場合にはチミンの代わりに塩基ウラシル（Ｕ）を含む。この用語には、３７ＣＦＲ１．８２２（ｐ）（１）に記載のような前述の塩基の類似体及び誘導体も含まれる。本発明では縮重塩基イノシン（Ｉ）を使用し得るが、本発明のプローブの修飾部分内でＩを使用するのは好ましくない。標的核酸配列本発明のオリゴヌクレオチド配列は、肝炎Ｂ型ウイルス抗原をコードする遺伝子上の特定位置を同定する。既知のゲノム配列を有する種々のＨＢＶ株を野生型ＨＢＶ株（株ａｄｗ）と比較して保存領域を検出し、この保存領域を共通配列として検査した。ＨＢＶゲノムの相同性領域をカバーするオリゴヌクレオチドプローブを最初に検査し、次いで標的依存的に増幅し得る。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、ＨＢＶの表面抗原（Ｓ）をコードする遺伝子上の特定座を同定する。ヌクレオチド配列、及びＨＢＶの表面抗原をコードする遺伝子上の対応する位置の非限定的具体例を下記に示す。一般的なヌクレオチドホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学、及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手できる装置を使用して、所望のプローブを常法により合成する。適当なプローブの５’末端のホスホリル化はリガーゼによる連結に必要であり、キナーゼによって、又は当業者に公知の、もしくは本明細書にいう修正メカニズムとして加えられるような、市販の合成試薬によって実施し得る。一般的には、本発明の方法は、（ａ）選択した一次プローブを標的ＨＢＶＤＮＡに（そして、標的相補配列が存在するような二本鎖の場合には標的相補配列に）ハイブリダイズするステップと、（ｂ）選択したプローブを標的依存的に修正して一次プローブを連結可能にするステップと、（ｃ）修正したプローブを相手に連結して融合即ち連結生成物を形成するステップと、（ｄ）融合生成物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、修正及び連結ステップを繰り返して所望の標的配列を増幅するステップとを反復することからなる。プローブのハイブリダイゼーション概論標的への（及び場合によっては標的相補配列への）プローブのハイブリダイゼーションは、先行技術、例えば欧州特許出願第３２０３０８号、米国特許第５１８５２４３号及び米国特許第４８８３７５０号に記述されている。プローブの長さ、プローブ濃度及び条件の厳密性は総て、ハイブリダイゼーションが生起する度合い及び速度に作用する。プローブは、所望の特異性を与える、即ち試料中の非標的配列にハイブリダイズするのを回避するのに十分な長さを有するのが好ましい。現時点で好ましいのは、約１５〜約４０塩基の長さを有するプローブである。一本鎖プローブ及び連結可能な対セット本明細書で定義されているような一本鎖プローブ及び対セットのハイブリダイゼーションは、効果的なハイブリダイゼーション選択性、好ましくは結合プローブの特定長さに対する最大のハイブリダイゼーション選択性が得られるように選択した温度で実施する。有利なことに、本発明のプローブ及びプローブ対には通常中庸な温度を使用する。温度は一般的には約２０℃〜約９０℃、より一般的には約３０℃〜７０℃、好ましくは３７℃〜６０℃にする。改変ＰＣＲ本明細書で「短いＰＣＲ」又は「ｓＰＣＲ」と称する改変形態ＰＣＲのプライマーのためのハイブリダイゼーションは、当業者に公知のものである。典型的条件は、下記の実施例１１及び１２に記載されている。ハイブリダイゼーション条件は、一本鎖核酸標的へのプローブの結合を可能にするものでなければならない。公知のように、プローブは、二重配列に沿ったこれらプローブの相対位置が、一つのプローブから合成した延長生成物が、該延長生成物を鋳型（相補配列）から分離した時に他方のプローブを延長するための鋳型として機能して所定長さの複製鎖を形成するような位置となるように選択する。リガーゼ連鎖反応標的への、そして場合によっては標的相補配列へのＬＣＲ（商標）プローブセットのハイブリダイゼーションは、先行技術、例えば欧州特許出願第３２０，３０８号及び欧州特許第４３９，１８２号に記述されている。プローブは化学量論的に反応すると予測されるため、ほぼ等モルの濃度で加える。各プローブは約５ナノモル（ｎＭ）〜約９０ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約３５ｎＭの濃度で存在させる。これは、標準的反応量５０μｌの場合には、約３×１０¹¹〜約１×１０¹²分子の各プローブの添加に等しい。約５×１０¹¹分子／５０μｌから始めるのがよい。各反応に使用する最適プローブ量は、実施しなければならないサイクルの数及びもちろん反応量によっても変化する。プローブ濃度は、所与のサイクル数で最適シグナルが得られるように、当業者が容易に決定できる。条件の厳密性は、温度、溶媒及び他の要素に依存することが当業者に公知である。これらの要素のうちで最も簡単に制御できるものはおそらく温度であるため、通常ＬＣＲ性能は温度を変えて調節する。本発明の実施に必要な厳密性条件は一般的なＬＣＲの条件と変わらないため、これ以上の詳細説明は無用と思われる。実際日常的に実施する人は下記の実施例に従えばよい。典型的には、任意にアセチル化ＢＳＡを加えたＬＣＲ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、２０ｍＭＫＣ１、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ及び任意的な０．５ｍＭＮＡＤ⁺）中で反応を実施した。温度サイクルは、例えばＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ（ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）のサーマルサイクラー又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＣｙｃｌｅｒＲｅａｃｔｏｒ（商標）（Ｅｒｉｃｏｍｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから市販）を用いて実現した。プローブの修正本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、「ギャップ充填」フォーマット又は「エキソ」フォーマットで修正し得る。これら２種類の修正を以下に説明する。ギャップ充填フォーマットによる修正ギャップ充填法で修正したプローブは、プローブのうちの一つ以上から短い塩基配列を除去した結果、二つのプローブを標的（もしくは標的相補配列又はこれらから生成したポリヌクレオチド）にハイブリダイズした時に、一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間に凹部ないしギャップが残されるために生じる修飾末端を有する。ＬＣＲによって標的を増幅するためには、プローブ間のギャップを充填しなければならない（即ち、修飾「修正」しなければならない）。ギャップフォーマットではこの操作を、ポリメラーゼ又は逆転写酵素と、ギャップと反対側の標的鎖に対して相補的な過剰なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとを用いて実施できる。この実施態様では、本発明は、（ａ）プローブを標的ＨＢＶに（そして、標的相補配列が存在するような二本鎖の場合には標的相補配列に）ハイブリダイズさせるステップと、（ｂ）少なくとも一つのギャップを埋めるために少なくとも一つのプローブを延長するステップと、（ｃ）延長したプローブを隣接プローブに連結して融合即ち連結生成物を形成するステップと、（ｄ）融合生成物を標的から解離し、ハイブリダイゼーション、延長及び連結ステップを繰り返して所望の標的配列を増幅するステップとを反復することからなる。シングルギャップ（ＳＧ）形態及びダブルギャップ（ＤＧ）形態の両方を含むこの実施態様では、「修飾末端」を形成する「ギャップ」を、ポリメラーゼ又は逆転写酵素を用いて修飾プローブの一方又は両方を延長することにより修正する。ＨＢＶＤＮＡ標的にハイブリダイズしたプローブの延長は通常、当業者に公知のように、ＤＮＡポリメラーゼ又はクレノウフラグメントによって行う。ＲＮＡ標的の場合は、延長を逆転写酵素によって行う。逆転写酵素の具体例としては、当業者が一般的に入手できる鳥類骨髄母細胞ウイルス（ＡＭＶ）及びＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）由来のものが挙げられる。ある種のＤＮＡポリメラーゼも、特定条件下でＲＮＡを鋳型として認識する。勿論、熱的に安定であり、ＬＣＲに必要な高温サイクルに耐えることができる延長試薬を使用することが好ましい。熱的に安定でない延長試薬は、原則として各ＬＣＲサイクル毎に再添加しなければならない。この種の熱安定性ポリメラーゼの具体例としては現在のところ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）（Ｃｅｔｕｓ−ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能）、Ｔｈｅｒｍｕｓポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，“ＭＢＲ”から入手可能）、及びＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又は熱安定性であることが知られている他の種に由来する組換え又は精製野生型ポリメラーゼが挙げられる。このような延長による修正では、ギャップ領域内の標的の塩基と相補的なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を反応混合物中に存在させる必要がある。より特定的には、第１図に基づいて説明すると、配列Ｘ_nを有するギャップの場合は、供給すべきｄＮＴＰはｄＸ’ＴＰと称する。Ｘ’はギャップＸ_n内の各塩基の相補塩基を意味する。ｄＮＴＰは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む多くの業者から市販されている。延長は、延長したプローブが隣接プローブに当接してこれに連結できるように、正確に連結点で終結しなければならない。そのためには「ストップベース（ｓｔｏｐｂａｓｅ）」を使用する。Ｑ’と称するストップベース（第１図参照）は対応する相補塩基Ｑに関して定義され、Ｑと相補的なｄＮＴＰを反応混合物から省略する、即ちｄＱ’ＴＰを反応混合物から省略することにより得られる。このようにして、４個のｄＮＴＰのうち相補的な３個を反応混合物に加えるために、４個の塩基のうち３個のみからなるセットＮから如何にしてギャップ配列用塩基を選択すべきかが理解される。第四のｄＮＴＰであるｄＱ’ＴＰが反応混合物中に存在しなければ、延長は所望の連結点で終結する。従って、Ｑ’が下流プローブの第一塩基であり、ストップベースをコードする標的上の塩基がギャップに隣接する第一塩基ということになる。ポリメラーゼ又は転写酵素による延長は５’から３’への方向で生起する。従って、両方の上流プローブ（第１図、プローブＡ及びＢ’）の３’末端は、延長を妨害するものがなければポリメラーゼにより延長することができる。延長は、鋳型によって必要とされる次の塩基が反応混合物中に存在しない時に終結する。即ち、プローブＡは、標的鎖上でストップベース相補塩基（Ｑ）と遭遇するまでギャップＸ_nを通して延長される。同様にして、プローブＢ’は、（標的相補配列上又は再構成されたＡ：ＢのＡ側の半分で）ストップベース相補塩基（Ｑ）に遭遇するまで、ギャップＹ_mを通して延長される。プローブＡ’もＢも、Ａ又はＢ’の延長鋳型として機能することはない。従ってプローブＡ及びＢ’は、標的に（又は先行サイクルで得られた再構成ポリヌクレオチド生成物に）ハイブリダイズした時にのみ延長される。前述のように、Ａ及びＢ’の延長は、延長したプローブが下流プローブＢ及びＡ’の５’末端に連結できるように、それぞれのギャップの末端（即ち連結点）で終結することが重要である。従って、反応混合物から、ギャップＸ_n及びＹ_mの５’末端のすぐ隣の塩基（Ｑ）と相補的なデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートを抜く。勿論、同一塩基で両方向の延長を停止する必要はない。ギャップのいずれかを充填する必要がなければ、異なる塩基を使用できる。この実施態様では、実際の連結点が常に下流プローブ（Ａ’及びＢ）の５’末端にあることは明らかであろう。これらの連結点がストップベースＱ’の位置でもあることは単なる偶然ではない。従って、ギャップＸ_n及びＹ_mは任意の塩基数の長さを有し得る。即ち、ｎは１以上の任意の整数であり得、ｍは０より大きい任意の整数であり得る。しかしながら、どのギャップをＸ_nにし、どのギャップをＹ_mにするかはひとまず任意に選択する。但し、ｎ及びｍの両方が０であってはならない。ギャップは同じ長さを有する必要はない。即ち、ｍはｎに等しくなくてもよい。ｍがゼロに等しい場合は、ダブルギャップ形態でなくなり、特定のシングルギャップ形態に変化する。これは、本明細書で開示する実施態様では使用されない。塩基Ｘに関する唯一の制約は、４種の塩基のうち任意の１〜３種からなるセットＮから選択しなければならないという点にある。同様にして、塩基ＹはセットＭから選択する。少なくとも一つのストップベースＱ’を確保しなければならないため、それぞれＸ及びＹに関して可能な塩基を表すセットＮ及びＭの組合わせは、４種の塩基のうちの３種以下しか含むことができない。従ってＹは、少なくとも１種の塩基がセット「非Ｎ非Ｍ」中に残る限り、４種の塩基のうちの任意の３種〜０であってよい。セットＮが４種の塩基のうちの３種より少ない塩基からなる場合には、Ｙは、対応する相補塩基がプローブ延長終結用ストップベースＱ’として機能し得る少なくとも１種の塩基が残存する限り、Ｎ内に存在しない塩基であってよい。単一のストップベースを使用して、ギャップＸ_n 及びＹ_m両方の延長を終結することができる。配列Ｙ_mの第二の制限はｍがｎに等しい場合に生じる。ギャップの長さが互いに同じである時は、配列Ｙ_mは配列Ｘ_nと相補的であってはならず、又はプローブＡの３’末端及びＢ’が「付着末端」を構成する。付着末端は、連結及び増幅が生起するようにプローブＡがプローブＢ’にハイブリダイズする標的非依存性二本鎖複合体の形成を可能にする。ｍがｎに等しい場合は、Ｙ_mがＸ_nと相補的ではないことが好ましい。即ち、プローブＡ及びＢ ’の末端は少なくとも、同じ長さを有し得るが相補的ではない「平滑末端（Ｓｌｉｐｐｅｒｙｅｎｄ）」でなければならない。本発明の好ましい実施態様の一つでは、第四プローブＢ’が、標的内のＸ_n配列ギャップと同じ長さを有するＸ_nの３’末端配列を含む。しかしながら、この構造は本発明にとって必須ではない。なぜなら、ギャップはプローブ間に形成されさえすればよいからである。従って、第四プローブＢ’の３’末端は、第二プローブＢに対する３’凹末端（ｒｅｃｅｓｓｅｄｅｎｄ）が存在しない限り、配列Ｘ_nの３’末端の手前で停止し得る。延長は５’から３’に向かって生起し、且つｄＸ’ＴＰは（Ｘ_nを通して延長するために）とにかく存在していなければならないため、プローブＢ’は、第一プローブＡがＸ_nギャップを通して延長されるのと同様に、ギャップ（Ｙ_m及びＸ_n残部の両方）を通して延長される。エキソフォーマットによる修正この実施態様では、連結不能末端が下流プローブの非ホスホリル化５’末端であり得る。この末端は、上流プローブの３’末端に連結することはできないが、標的依存的に修正して連結可能にすることはできる。連結不能末端の別の具体例としては、標的の末端に対するプローブの末端不適合又は内部不適合が挙げられる。この種のプローブがそれぞれの標的にハイブリダイズしたら、短い塩基配列を除去し、その結果二つのプローブを標的（もしくは標的相補配列又はこれらから産生したポリヌクレオチド）にハイブリダイズした時に一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間に凹部又はギャップが残されるようにして、一つ以上のプローブの５’末端を修飾することにより、前記不適合を標的依存的に修正する。この修飾は、エキソヌクレオリチック活性、好ましくはＤＮＡポリメラーゼに基づく５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって修正する（Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．編，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。これらのＤＮＡポリメラーゼは、適当なデオキシヌクレオチドの存在下で、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブの３’ヒドロキシル末端から合成を開始し、ＤＮＡ標的鋳型に沿って進み、このプロセスでハイブリダイズしたＤＮＡ配列を加水分解し、置換する。ＤＮＡ配列のエキソヌクレオリチック分解の結果、モノ、ジ及びより大きいヌクレオチドフラグメントが放出される。典型的には、このエキソヌクレアーゼ活性は合成依存性である。従って、合成の終結は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性の終結をもたらす。合成を調節的に終結させる方法の一つは、ＤＮＡ合成に必要な４個のｄＮＴＰのうちの１個又は数個を除去して、ｄＮＴＰプールを制限することからなる。ＤＮＡポリメラーゼによる合成は、ｄＮＴＰプールから除去されたデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートと相補的な標的上の鋳型塩基（ストップベース）に遭遇するまで続く。分解及び合成はその時点で終了する。ＬＣＲでは、修正しなければ連結不能である５’末端を含む下流プローブを使用する。修飾は、プローブの標的非依存性連結を阻止する。また、隣接ＬＣＲプローブは標的核酸配列の存在下でハイブリダイズはするが、連結可能にはならない。標的ＤＮＡに含まれている配列情報を、連結不能末端を修正するための鋳型として使用する。合成依存性鎖置換５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して上流プローブを延長し、標的核酸を鋳型として下流プローブを加水分解する。上流プローブの延長及び下流プローブの加水分解は、ＤＮＡ合成に必要な４種のｄＮＴＰのサブセットを使用することにより、相補ｄＮＴＰが存在しない標的内の鋳型塩基に遭遇した時点で合成及び加水分解が停止するように制御し得る。その結果得られる下流プローブは、延長した上流プローブの３’ヒドロキシル末端に隣接することになる５’ホスフェートで終結する。この方向の隣接ＤＮＡ配列は、ＤＮＡリガーゼによる連結のための適当な基質である。結果としてプローブ間に生じたギャップは充填の必要がある（即ち、修飾を修正しなければならない）。この修正は、ギャップ充填フォーマットについて説明したように行う。連結一般的には、修正に次ぐステップは、一方のプローブを隣接プローブに連結することからなる。即ち、修正した各第一上流（又は一次）プローブを対応する第一下流プローブに連結し、修正した各第二下流（又は二次）プローブを対応する第二上流プローブに連結する。「隣接」プローブは連続方向で標的にハイブリダイズできる二つのプローブのうちのいずれか一つである。前記二つのプローブのうちの一方は、ホスホリル化５’末端が相手のプローブの３’ヒドロキシル末端に当接した状態で存在する。「隣接」プローブは、修飾末端を前述のように標的依存的に修正した時に形成される。二つの隣接プローブを共有的に結合するための好ましい方法は酵素連結である。但し、「連結」は一般的な用語であり、二つのプローブを共有結合する任意の方法を含むと理解されたい。好ましい酵素連結ステップを可能にする条件及び試薬は当業者に公知であり、前出の参考文献に開示されている。本発明で有用な連結試薬としては、Ｔ４リガーゼ並びに原核生物リガーゼ、例えば大腸菌リガーゼ及び欧州特許出願第３２０３０８号に教示されているようなＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）が挙げられる。最後に挙げたリガーゼはＬＣＲの熱サイクルの間活性を維持することができるため、現在好んで使用されている。熱的に安定なリガーゼが存在しないと、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを再添加しなければならない。真核生物リガーゼ、例えばＲａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６）に記載のようなショウジョウバエのＤＮＡリガーゼも有用である。連結後は、一般的ＬＣＲの場合のように融合再構成プローブを標的から解離し（例えば熔融し）、この操作を数サイクル繰り返す。反復サイクル数は１〜約１００とし得るが、現時点で好ましいのは約１５〜約７０である。プローブは、相補的（二次）プローブにハイブリダイズした時に、所期の連結点と反対側の末端が別の望ましくない連結反応に関与できないように設計することが望ましい。即ち、連結可能な付着末端又は平滑末端は回避しなければならない。この種の末端を使用する必要がある時は、５’末端ホスフェートを回避、除去又はブロックする。この操作は、オリゴヌクレオチドプローブ（通常は５’末端ホスフェート基を有していない）の合成を介して、又は（例えばＤＮＡの制限消化によって産生したオリゴヌクレオチドから）末端ホスフェートを除去するためのホスファターゼ酵素の使用を介して実施することができる。あるいは、少なくとも一方のプローブの末端を後述のように「フック」又はマーカー部分でブロックすることにより、プローブの「間違った」外側末端の連結を防止することもできる。前記技術のいずれも使えなければ、プローブの外側末端を、これらのプローブが結合した時に指数増幅用鋳型として機能しないようにずらすことができる。特に好ましい形態では、ハプテン又は「フック」を、少なくとも２個のプローブの使用可能な外側末端（融合生成物の互いに反対側の末端）、好ましくは４個のプローブ全部の外側末端に取り付ける。「フック」は、特異的リガンド−受容体親和性を有する任意の部分からなる。例えば、ハプテン又はポリヌクレオチドのセグメントであってよい。一つのプローブにフックを結合し、同一方向の別のプローブに標識を結合してもよい。連結によって標識が親和性部分に結合し、分離後に、分離した標識を固相上で測定できる。検出増幅した標的の存在は、任意の方法で検出できる。一つの方法は、特定の大きさの反応生成物を分子量によって弁別することからなる。分子量弁別方法の具体例としては、アフィニティ標識、組成、ゲル濾過、沈降速度、浸透圧又はゲル電気泳動が挙げられる。特に好ましい方法は、使用するヌクレオチドが³²Ｐのような放射性標識で標識されている場合に特に有用なゲル電気泳動である。検出は、典型的には、分離後に分離フラクション中の標識量を測定することによって実施する。勿論、分離フラクション中の標識は、系に添加した標識の総量を知り、非分離フラクション中に存在する量を測定することによって、引き算で測定することもできる。分離は、電気泳動、クロマトグラフィー又は下記の好ましい方法によって実施し得る。別の方法としては、検出可能なシグナルを発生することができる物理的標識でヌクレオチドを標識する方法が挙げられる。使用し得る種々の「シグナル発生化合物」（標識）にとしては、色原体、酵素のような触媒、フルオレセン及びローダミンのような発光化合物、化学発光化合物、放射性元素及び直接視覚標識がある。酵素の具体例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。特定標識の選択は決定的に重要ではないが、単独で、又は１種類以上の別の物質と協働して、シグナルを発生できるものを選択する。ハプテンは様々なものが知られており、本発明では実質的に任意のハプテンを使用し得る。本発明が必要とするのは、特異的結合相手が既知であるか又は製造できるものであること（ハプテンの定義に基づく特性）と、ハプテンがハイブリダイゼーションを妨害しないようにプローブに結合できることだけである。プローブにハプテンを付加する方法は当業者に多数知られている。ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ）はどちらもプローブ標識技術を開示し商品化している。例えば、３’−アミン−ＯＮＣＰＧ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて３’オリゴ末端に一級アミンを付加することができる。また、ＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒII（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて５’オリゴ末端に一級アミンを付加することもできる。アミンは、一般的な活性化及び結合化学手法を用いて、種々のハプテンと反応させることができる。また、１９９０年１２月１１日及び１９９０年１２月２０日それぞれ出願された米国特許同時係属出願第６２５，５６６号及び第６３０，９０８号は、プローブをそれぞれ５’末端及び３’末端で標識する方法を教示している。前記二つの同時係属出願は参考として本明細書に包含される。ハプテンの非限定的具体例としては、多くの薬剤（例えば、ジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、サリチル酸塩等）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；並びに修飾ヌクレオチド、例えばブロモウラシル、及びＮ−アセチル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の導入によって修飾した塩基等が挙げられる。本明細書に記載の特定ハプテンは、いずれも１９９１年１２月１７日に出願された同時係属共有米国特許出願第０７／８０８，５０８号（アダマンタン酢酸）及び米国特許出願第８０８，８３９号（カルバゾール及びジベンゾフラン）、どちらも１９９２年３月２７日に出願された米国特許出願第０７／８５８，９２９号及び米国特許出願第０７／８５８，８２０号に開示されている（本明細書では、これらをまとめて「ハプテン出願」と称する）。前記ハプテン出願の各々の開示全体は本明細書に参考として包含される。二つ以上の標的、例えばＨＢＶ及びＨＣＶを検出するための手順は、１９９２年３月３１日出願の米国特許出願第８６０，７０２号に詳述されているように、２種類の標識、即ち共通標識及び固有標識を含み得る。どちらの標識も検出標識として使用し得る。説明を簡単にするために、ハプテンを共通標識及び固有標識の両方として使用しながら実施態様を説明する。勿論、ハプテンのうちの少なくとも一つ、特に共通ハプテンに代えて、別の標識も容易に使用できる。好ましい標準的ＬＣＲ手順では、第一ハプテンを用いて、再構成された分子を捕捉し分離する。第二ハプテンは、再構成された複合体をシグナル発生体と結合するのに使用する。この操作は、欧州特許出願公開第４３９−１８２号に詳述されている。例えば、第一の一次プローブの５’末端及び第一の二次プローブの３ ’末端にフルオレセンを結合する。更に、異なるハプテン、例えばビオチンを、第二の一次プローブの３’末端及び第二の二次プローブの５’末端に結合する。このようにして、再構成分子が二重構造になると、二重構造の一方の末端に二つのビオチンが存在し、他方の末端に二つのフルオレセンが存在する。抗フルオレセンのコーティングを有する固相を用いて、ビオチンを有する非連結プローブから再構成分子を分離する。（フルオレセンを有する非連結プローブも捕捉される。）酵素のような検出可能なシグナル発生体で標識したアビジン又は抗アビジンを用いて、分離複合体を検出する。検査試料は、ＨＢＶを含んでいる疑いのある任意の生物学的物質であってよい。例えば、検査試料は、ヒト体組織、又はＨＢＶを含んでいる疑いのある細胞を含む検査試料であり得る。この用語は、実質的に任意の液体試料を意味し得る。検査試料は、任意の所望の供給源、例えば体液、例えば血液、唾液、水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、羊水等に由来し得る。液体検査試料は使用前に、血液からの血漿の調製、粘稠液の希釈等の予備処理にかけ得る。予備処理の方法としては、分離、濾過、蒸留、濃縮、妨害成分の不活化及び試薬の添加も挙げられる。体液以外に、水、食品等のような液体試料も使用できる。また、固体検査試料を、液体媒質を形成するように改質した後で使用することもできる。キット本発明の方法で使用する試薬は、診断キットに組込むことができる。診断キットは標識オリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドが非標識の場合は、特異的標識試薬もキットに組込み得る。キットは更に、特定のプローブ設計及びギャップ充填もしくはセキソ充填の必要に応じて、ヌクレオシドトリホスフェート、例えばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰの組合わせ、即ちｄＮＴＰのうちの３種以下の組合わせを適当に包装したものも含み得る。キットは更にポリヌクレオチドポリメラーゼを含み得、上流及び下流配列を共有的に結合する手段、例えばリガーゼも含み得る。これらの試薬は、典型的には、別個の容器に入れてキットに組込むが、反応性及び保存性が許せば、同一容器内に包装することもできる。キット内の種々の薬剤の相対量は、本発明で生起する必要がある反応を最適化する試薬濃度を得るために、且つアッセイ感度を最適化するために、広い範囲で変化させ得る。キットは更に、分析対象を変性させるための変性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄溶液、酵素基質、陰性及び陽性対照並びにアッセイを実施するための説明書も含み得る。ここで実施例を挙げて本発明を説明する。以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、前述の一般的説明及び詳細説明と協働して、本発明の理解を更に深め、本発明の好ましい実施態様の特徴を明らかにするためのものである。実施例材料及び方法実施例で使用する下記の用語は、下記の定義に従う商標、商品名又は化学的略号である：ＢＳＡ：ウシ血清アルブミンＥＤＴＡ：金属キレート化剤であるエチレンジアミンテトラ酢酸ＥＰＰＳ：緩衝液として使用される［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン −Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）］酸の化学的略号ＦＩＴＣ：蛍光ハプテン誘導体であるフルオレセンイソチオシアネートの化学的略号ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィーＭＥＳ：緩衝液である［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］の化学的略号ＩＭｘ（登録商標）：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）を実施するための本出願人の自動化装置の商標Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンからなる緩衝液下記の表は、以下の実施例で使用するプローブ及び／又はプライマーを示すものである。各配列は、特定実施例でそれぞれの配列番号によって示されている。任意の種類の細胞、スワブ、スミア、血液又は組織を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のそれぞれの細胞懸濁液の遠心分離により、試料として調製し得る。通常は、ペレットを１００μｌの１０ｍＭＮａＯＨに再懸濁し、１００℃で５〜１０分間加熱する。沸騰後、試料を再度遠心分離し、細胞残渣を除去する。上清の一部を、５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び５×１０¹¹分子の本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物に加える。捕捉リガンドオリゴヌクレオチドＡ及びＡ’は、カルバゾール及び／又はＦＩＴＣで誘導体化し得る。プローブＢ及びＢ’は、アダマンタン又はビオチンをシグナル部分として誘導体化し得る。ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、選択したプローブの５’末端をホスホリル化する。試料及び反応混合物を入れた管の上部を鉱油で覆い、約３分間沸騰させる。その後、管を１分間８５℃に維持し、更に１分間５０℃に維持する。反応混合物にＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（Ａｂｂｏｔｔ）及びＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）を加える。次いで管を、サーマルサイクラーで、又は二つの水浴の間で、交互に８５℃及び５０℃ にする。アッセイのために標的ＨＢＶＤＮＡを増幅するには、通常３０回のＬＣＲサイクルで十分である。反応生成物を検出するために、混合物を鉱油層から分離し、同量の蒸留水で希釈する。反応混合物の一部をＩＭｘ（登録商標）分析器の使い捨て反応セル内に充填する。検査のそれぞれの試薬、例えば試料希釈緩衝液、メチルウンベリフェロンホスフェート、抗ビオチンアルカリホスファターゼ結合体、抗フルオレセンコーティングした粒子等をＩＭｘ（登録商標）分析器に充填する。３０分以内でＭＥＩＡが完了した後、アルカリホスファターゼ結合速度を、計数／秒／秒で表される反応速度から算出する。ポリメラーゼの量は下記のように定義される単位で表す：１単位の酵素は製造業者（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）によって定義されている通りである。リガーゼ酵素の単位は本明細書で下記のように定義される：１ｍｇの純度９５％ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼをもって約１×１０⁸単位の比活性を有するものとする。これは正確には標準化されておらず、２０％も変化し得、最適化は当業者によって実施され得る。ＬＣＲ（商標）条件総ての反応は、特に指摘のない限り、ＬＣＲ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、２０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ）中で実施した。温度サイクルは、例えばＣｏｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔｓ（ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）のサーマルサイクラー、又はＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＣｙｃｌｅｒＲｅａｃｔｏｒ（商標）（Ｅｒｉｃｏｍｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから市販されている）で実施した。反応は、アリコートを停止緩衝液（８０％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ：ｖ）キシレンシアノール及び０．０５％ブロモフェノールブルー）中に移すことによって停止させた。連結生成物及び非連結生成物を、８０ｍＭＴｒｉｓ中８．３Ｍ尿素、８０ｍＭホウ酸ｐＨ８．０、１．０ｍＭＥＤＴＡを含む１６×２０×０．０４ｃｍの１５％ポリアクリルアミドゲル上で分割した。ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、オートラジオグラフを鋳型として用いて連結プローブ及び非連結プローブを切除し、各バンドの放射能の量を液体シンチレーション計数で測定した。連結プローブの放射能の割合を、各レーンの総計数の関数として計算した。実施例１配列番号１、２、３及び４（表Ａ参照）からなるプローブセット４０３Ｇを用いて、ＬＣＲ緩衝液を入れた０．５ｍｌポリプロピレン管内でＬＣＲ（商標）を実施した。ＨＢＶＤＮＡを含んでいる検査試料（２．８×１０⁷分子ＨＢＶＤＮＡ／ｍｌ）を、ＨＢＶ指標が陰性のヒト血清中に希釈した。この血清希釈物は陰性対照としても使用した。各プローブは５×１０¹¹分子／反応で存在させ、ＤＮＡリガーゼ最終濃度は５０００単位、ＤＮＡポリメラーゼ最終濃度は１．０単位とした。試料を鉱油で覆い、８５℃で３０秒のインキュベーション、次いで５０℃で２０秒のインキュベーションからなる温度サイクルにかけた。グラフでは血清１ｍｌ当たりのＨＢＶＤＮＡ分子として示した陽性対照の希釈物を２個ずつ検査し、平均値を下記の表１にＩＭｘ（登録商標）速度として示した。直線範囲の計算値は第２図に直線グラフとして示す。軸値は、反応当たりの分子数（表１）に反応のｍｌ数（×２００）を掛けることにより算出する。実施例２前記実施例１に記載の条件下で、ＨＢＶＤＮＡ用プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３、４）を用いてＬＣＲを実施した。結果は下記の表２に示す。実施例３前記実施例１に記載の条件下で、プローブセット２３１Ｅ（配列番号９、３１、３２及び３３）及び２３１Ｇ（配列番号９、１０、１１及び１２）を用いてＬＣＲを実施した。プローブセット３２１Ｅの場合はサイクルを４５回実施した。結果は下記の表３に示す通りである。プローブセット２３１Ｇの場合は、温度８５℃及び６０℃でそれぞれ３０秒及び２０秒のサイクルを４０回実施した。結果は表４に示す。実施例４前記実施例１に記載の条件下で、プローブセット６６４Ｇ（配列番号１７、１８、１９及び２０）及び６６４Ｅ（配列番号１７、３５、３６及び３７）を用いてＬＣＲを実施した。６６４Ｇの結果は表５、６６４Ｅの結果は表６に示す。実施例５実施例１に記載の条件下で、但し１３５０単位のリガーゼを使用して、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施した。ＨＢＶ−ＤＮＡに対するこれらのプローブの特異性を、健常者、非Ｂ型肝炎患者及び自己免疫性肝炎患者に由来する３１個の血清試料を用いて明らかにした（下記の表６参照）。検査結果が陰性の各患者は、肝機能検査で明らかなように、ＬＣＲ方法を用いると偽陽性がないことを示している。各検査試料は血清試料当たり２５０分子のＨＢＶＤＮＡを有していた。健常者は肝疾患がなく、非Ｂ型肝炎患者は肝疾患陽性兆候を示し、自己免疫性肝炎患者は肝炎様症状と肝臓欠陥の臨床的兆候とを示した。実施例６Ｂ型肝炎に感染した（ＨＢｓＡｇ＋）種々の患者群に由来する２０個のヒト血清試料を使用し、実施例１に記載の条件下で、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）及び１８４Ｇ（配列番号５、６、７及び８）を用いてＬＣＲを実施した。結果は下記の表７に示す。試料は二回反復して検査し、平均値を信号雑音（Ｓ／Ｎ）比で示した。検査試料の評価基準（−、＋／−、＋又は＋＋）は、ＩＭｘ（登録商標）バックグラウンド（ｂｇ）速度に基づいて定義される。０〜１．５×ｂｇ速度は陰性（−）と定義され、＞１．５〜３．０×ｂｇ速度は中間（＋／−）と定義され、３．０−２０×ｂｇ速度は弱陽性（＋）と定義され、＞２０×ｂｇ速度は陽性（＋＋）と定義される。ＬＣＲ以外に、ＡｂｂｏｔｔＨＢＶＤＮＡ検査（ＤＮＡ溶液ハイブリダイゼーションアッセイ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて試料を評価した。試料は総てＨＢｓＡｇ陽性であり、ＨＢｅＡｇ又は抗ＨＢｅの結果が含まれる。検査したＨＢＶキャリヤーは種々の臨床的背景を有していた。高ウイルス血症はＨＢＶＤＮＡ及びＨＢｅＡｇの存在を特徴とし、低ウイルス血症は抗ＨＢｅ及びＨＢＶＤＮＡの存在を特徴とし、無症候ＨＢＶキャリヤーは抗ＨＢｅの存在を特徴としていた。実施例７実施例１に記載の条件下でプローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施し、慢性肝炎患者（Ａ、Ｂ、Ｃ）の追跡検査試料中のＨＢＶＤＮＡ濃度のモニターに使用した。信号雑音（Ｓ／Ｎ）比として示されるＩＭｘ（登録商標）装置から得たＬＣＲデータは、グラフで、肝臓由来酵素アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の血清中濃度（ｍ／ｌ）と比較できる。検査試料の評価基準は前記実施例６に記載の通りである。検査は下記のように実施した。患者Ａには１９９０年６月１３日及び１９９０年１０月１５日にインターフェロン療法（下記の表に＊で示す）を施した（下記のＡ２及びＡ３）。１９９２年３月１７日まで設定された間隔でＨＢＶＤＮＡ濃度を監視した。患者Ｃには、１９９１年１１月１４日、１９９１年１２月１０日、１９９２年１月７日、１９９２年１月２８日及び１９９２年３月３日にインターフェロン療法を施した（下記のＣ４〜Ｃ８）。１９９２年５月２６まで設定された間隔でＨＢＶＤＮＡ濃度を監視した。これらの患者の血清中では、インターフェロン治療の開始前には一般的なドットブロットハイブリダイゼーションによってＨＢＶ−ＤＮＡが明白に検出されたが、治療後は陰性になった。ＬＣＲ検出システムでは、治療に成功した後でも、一般的ハイブリダイゼーションアッセイの場合より数週間長い期間にわたって血清ＨＢＶ−ＤＮＡを検出することができた。ＬＣＲ検出によるＨＢＶＤＮＡ及びＡＬＴの半定量的モニターの適性は、第３図ａ〜第３図ｃのグラフから明らかである。実施例８実施例１に記載の条件下で、但し０．５単位のＤＮＡポリメラーゼ及び３４００単位のＤＮＡリガーゼを使用して、プローブセット４０３Ｇ（配列番号１、２、３及び４）を用いてＬＣＲを実施した。反応は、ＨＢＶＤＮＡ陰性血清（陰性対照）又はａｄｗ型又はａｙ型ＨＢＶを含む血清で生起させた。増幅後に反応混合物をＩＭｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅生成物を、ＡｂｂｏｔＩＭｘ（登録商標）自動化免疫アッセイシステムを用いて実施したサンドイッチ免疫アッセイによって検出した。以下の実施例中の数値は、このプロセスの速度読取り値を計数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）で表したものである。連結プローブの量は、読取った速度に直接関連していた（欧州特許出願公開第３５７−０１１号参照）。試料は３回の反復検査にかけた。３回の反復検査の平均値と変動係数（ＣＶ％）とを下記の表９に示す。これらの結果は、プローブセット４０３Ｇが、ＨＢＶ各サブタイプに共通した検出と、抗ウイルス療法に対して効果を示している又は該療法を受けている患者の追跡検査に有用であることを示している。実施例９「短いＰＣＲ」又は「ｓＰＣＲ」と称するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の修飾を用いてＨＢＶＤＮＡを検出するために、プローブ配列番号１及び４を使用した。ｓＰＣＲは本質的に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから市販されているＧｅｎｅ−ＡＭＰ（商標）キットの包装中の説明書に従って実施した。対照は、ＡｂｂｏｔｔＧｅｎｏｓｔｉｃｓ（商標）ＤＮＡキットのものを使用した。ＰＣＲ操作は、プライマーセット配列番号１及び４を１×１０¹²分子／反応で使用し、反応緩衝液を９４℃で３０秒、５０℃で２０秒のサイクル３０回にわたって使用し、且つＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）を１．２５単位／反応で使用して行った。１９９０年３月７日公開のＬａｆｆｌｅｒらの欧州特許第３５７，０１１号に記載のように、ＩＭｘ（登録商標）装置で二重構造生成物を分離し、検出した。前記欧州特許は全体が本明細書に参考として包含される。反復操作の結果の平均値を下記の表に示す。実施例１０プローブ配列番号５及び８をプライマーとして用いて、前記実施例９に記載のようにＰＣＲでＨＢＶＤＮＡを検出した。反復操作の結果の平均値を下記の表に示す。実施例１１プライマー配列番号１及び３を用いて、１９９３年２月９日交付米国特許第５１８５２４３号に記載のように、標的特異的ポリマー化及び連結反応を実施した。前記米国特許は全体が本明細書に参考として包含される。プローブを前述のようにＦＩＴＣ及び／又はフルオレセンで誘導体化し、選択した標的ＨＢＶＤＮＡ、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏから入手可能な修飾ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液及び水と混合する。該混合物を５分間８０℃に加熱し、ゆっくりと２３℃まで放冷する。短時間の遠心にかけた後、該反応混合物に、³²Ｐ標識ｄＣＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを加える。得られた溶液を２３℃で１２時間インキュベートする。前記反応混合物の一部を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、長さ４８塩基の³²Ｐ標識生成物が示される。この生成物は、標的にハイブリダイズした後の配列番号１及び３の充填及び連結生成物に対応する。実施例１２前記実施例１１に記載の条件下で、但しｄＡＴＰ及びｄＣＴＰを加えて、プローブ配列番号１及び２８を標的ＨＢＶＤＮＡにハイブリダイズする。反応混合物の一部は、長さ４８塩基の³²Ｐ標識生成物を示す。この生成物は、標的にハイブリダイズした後の配列番号１及び２８の充填及び連結生成物に対応する。 Detailed Description of the Invention Method for amplification and detection of hepatitis B virus nucleotide sequence and DNA Technical field The present invention generally detects hepatitis B virus, as well as hepatitis B virus. And a test kit. The invention is more particularly directed to hepatitis B virus. A nucleotide sequence complementary to a segment of the genome and can be amplified. And / or used to determine the presence of hepatitis B virus DNA in the test sample. Applicable nucleotide sequences. BACKGROUND OF THE INVENTION Detection of viral growth of hepatitis B virus (hereinafter referred to as HBV) It proved to be a useful indicator of replication and patient infection. HBV isHepad naviridae It is a prototype substance of a new virus called. These viruses Is a small circular DNA molecule that contains a single-stranded portion and a double-stranded DNA that repairs DNA. It has an endogenous DNA polymerase for chaining. Strong tropism and susceptibility to hepatocytes Continuous feeling The occurrence of staining is also a feature of this type of virus. Complete virion of hepatitis B consists of a complex bilayer structure with an overall diameter of 42 nm . The 27 nm high electron density core has a molecular weight of 1.6 × 10⁶Containing circular double-stranded DNA of It is. A 7 nm thick outer layer surrounding the core is biochemically called HBsAg. It consists of a heterogeneous complex. HBsAg is produced in large numbers by infected hepatocytes and has a size of 1 Spherical particles in the range 7-25 nm, and tubes of similar diameter but varying length It is released into the blood as filamentous filaments. Antibodies to core and surface antigens are They are called anti-HBc and anti-HBs, respectively. The third antigen-antibody system in hepatitis B infection Has also been observed and is referred to as HBeAg / anti-HBe. The current data is HBeA It is suggested that g is a component of the capsid of hepatitis B virion. HB Since eAg is closely correlated with the nucleotide capsid of HBV, virion concentration It is a reliable indicator of the degree of infection and thus of serum infection. All current chronic hepatitis B therapies aim at the continuous suppression of viral replication. You. Therefore, if there is a reliable and direct method for measuring viral DNA, it will respond to therapy. It is extremely useful for early discrimination between patients who respond and patients who do not respond. Serum HBV-DNA and HBeAg are reliable for monitoring HBV replication Considered to be an indicator. There are four major antigenic determinants or subtypes of HBsAg, including adw and adr. , Ayw and ayr. adw and ayr subtypes are Southeast Asia Except for A and the Far East, it occupies most of the world, but in Southeast Asia and the Far East a dr is also common. The ayr subtype is rarely observed. Group reactivity determination The groups (group-reactive detergent) a are the above-mentioned four types. Cross-reacting between the two and producing antibodies against this determinant, the second subtype Re-infection is protected. Various tests have been used to detect HBV in serum and other body fluids . Immunological tests rely on the antibodies produced in the human or animal body to produce the characteristics described above. Detects constant viral proteins. However, immunological tests are indirect , Non-specific antigen-antibody reactions can result in false positives. See you In some situations, the receptor for transfused blood, even from people who are seronegative for the antigen-antibody test, Causes HBV infection. Hive like Southern or dot blot operations Redidation techniques have also been used. This type of technique usually involves cell scraping. Alternatively, the DNA is extracted from the biopsy material and directly immobilized on the solid phase as complete DNA. Or as a restriction fragment by gel electrophoresis after digestion Including operations. Immobilized DNA is detected by nucleic acid probe with radioactive label The most common is to However, standard hybridization methods Is not sensitive enough to recognize very little viral replication, Indistinguishable patients cannot be distinguished. An example to solve this sensitivity problem Amplify viral DNA sequences using, for example, the polymerase chain reaction (PCR) be able to. The product thus obtained is used to identify the virus type. Identifiable using common hybridization techniques such as Southern blot . C. Oste,BioTechniques 6: 163 (1988) and K. . B. See Mullis, U.S. Pat. No. 4,683,202. PCR is a US patent No. 4,683,195 and No. 4,683,202, the standard It has been used to improve the sensitivity of hybridization methods. US Patent Nos. 4,5 No. 62,159 shows HB in the test sample. Methods and kits for using PCR to specifically detect V DNA are disclosed. Have been. In actual operation, the sensitivity level is about 50-100 copies per sample. is there. Despite the screening methods mentioned above, I wonder if there are cases of post-transfusion hepatitis. Of the HBV-contaminated blood that escaped detection It has occurred. Therefore, a more accurate and reliable method for identifying HBV in clinical samples. There is a need for a more reliable and semi-automated alternative. As another target amplification mechanism, European Patent Application Publication No. 320 308 or European Ligase chain reaction (LCR (as described in State Patent Application Publication No. 439 182). Trademarks)) are also known. LCR ™ is a test for single-stranded or double-stranded DNA targets. Can be used for output. In this procedure, two complementary regions to the flanking regions of the target nucleic acid sequence are used. Probe (for example, A and B) and hybridized with DNA ligase. Tie. The ligated probe is then denatured and cleaved from the target, after which Probe A and B with two other probes (A 'and B') of opposite sense. Ibridize. Then, the second probe is ligated. Subsequent denaturation / Depending on the hybridization / ligation cycle, sense (+) and antisense Probes that are twice as long as both negative (-) are formed. Hybridization Amplification of the target nucleic acid is achieved by repeating the cycle of ligation and ligation. LCR has never been used for detection and / or quantification of HBV. Obedience Therefore, amplification is possible, and if HBV is present in the test sample, it can be amplified by using LCR. It would be beneficial to provide a DNA oligonucleotide strand for detection by Seem. The use of a combination of oligonucleotide chains is Enables the presence of BV and specific and sensitive in vitro diagnosis of specific types Would be advantageous for. It also monitors the outcome of drug therapy in patients with chronic active hepatitis. Therefore, it would be beneficial to provide a method for quantifying HBV in a test sample. Summary of the Invention It hybridizes to the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus under hybridization conditions. An oligonucleotide of about 10 to about 60 nucleotides having a nucleotide sequence capable of soybean. Cletide probes will be provided by the present invention. Target HBV sequence (SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 and 25) and oligos The nucleotide probe can be selected from one or more of the following: x is hydroxyl unless otherwise indicated. Underlined bases are deliberate incompatibilities as described herein. Single-stranded oligonucleotide probes are selected from: SEQ ID NOs: 1,3 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 or their complementary sequences. Detects hepatitis B virus DNA present in a test sample containing non-target DNA Compositions are also provided for. The composition is the first upstream Includes an oligonucleotide probe and a first downstream oligonucleotide probe , Each probe is a target nucleus of hepatitis B virus under hybridization conditions. It consists of about 10 to about 60 nucleotides that can hybridize to the same strand of the acid sequence. The 3'end of the upstream probe hybridizes to the vicinity of the 5'end of the downstream probe. And the target nucleic acid sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 and 25 as described above or One or more sequences selected from these complementary sequences. The composition of the present invention is If the 3'end of the upstream probe and the 5'end of the downstream probe are unmodified, It also has the feature that it cannot be connected. In one embodiment, the 3'end of the upstream probe is ligated so that the ends can be ligated. It may be extended with nucleotides complementary to the non-hybridizing intervening portion of the target nucleic acid sequence. By Correct the unconnectable ends. This kind of construct is composed of the following paired sets or their complements. You can choose from among the sequences: In another embodiment of the invention, the target-dependent exonu Downstream with an exonucleolytic agent Removal of unphosphorylated or incompatible bases from the 5'end of the probe, followed by the corresponding Nucleotide that complements the upstream probe with the non-hybridizing intervening portion of the target nucleic acid sequence. Correct the non-ligable ends by extending with tide. This kind of composition is It may be chosen among a pair set or their complementary sequences: In a third embodiment of the invention, when the downstream probe hybridizes to the target Forming a 5'overhang and removing said overhang to allow the ends of the probe to be ligated 5'end of the downstream probe after modification is abutted on the 3'end of the upstream probe It consists of operating as if to do. A composition for detecting hepatitis B virus DNA present in a test sample About 1 that can hybridize to the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus. Structure consisting of first and second oligonucleotide probes of 0 to about 60 nucleotides Products are also provided. The target nucleic acid sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 2 as described above. 4 and 25 or one or more sequences selected from the complementary sequences thereof, The probes are the opposite ends of the same target nucleic acid sequence of hepatitis B virus DNA. Hybridized at opposite ends to opposite strands. The pair is the following pair set or its phase Select from complementary sequences You can choose: A composition for detecting hepatitis B virus DNA present in a test sample (A) includes a first upstream probe and a first downstream probe, and each probe is Under hybridization conditions, the same strand of the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus is The first upstream probe consists of about 10 to about 60 nucleotides that can be bridized. 3'end of the first downstream probe is hybridized near the 5'end, The acid sequences are SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 24 and 25 as described above and these First oligonucleotide set which is one or more sequences selected from complementary sequences , And (b) a second upstream probe and a second downstream probe, Bumo step (a) first oligonucleotide set And the 5'end of the second upstream probe is 3'of the second downstream probe. Defined as a second set of oligonucleotides that hybridize near the ends Compositions are also provided. The construct is designed to target the 3'end of the first upstream probe to the target nucleus. By extending with a nucleotide complementary to the non-hybridizing intervening portion of the acid sequence. And has unligable ends that are modified to allow ligation. In one embodiment, the four oligonucleotide probes are selected from: RU: (A) Set 403G: SEQ ID NOS: 1 and 3 are first upstream probe and first, respectively Is a downstream probe, SEQ ID NOS: 2 and 4 are the second downstream probe and the second upper probe, respectively. Flow probe; (B) set 184G: SEQ ID NOS: 5 and 7 are the first upstream probe and the first, respectively Is a downstream probe, SEQ ID NOS: 6 and 8 are the second downstream probe and the second upper probe, respectively. Flow probe; (C) Set 231G: SEQ ID NOS: 9 and 11 are the first upstream probe and the first One downstream probe, SEQ ID NOS: 10 and 12 are the second downstream probe and Second upstream professional Is a move; (D) Set 1875G: SEQ ID NOS: 13 and 15 are the first upstream probe and And the first downstream probe, and SEQ ID NOS: 14 and 16 are second downstream probes, respectively. And a second upstream probe; (E) set 664G: SEQ ID NOS: 17 and 19 are the first upstream probe and A first downstream probe, wherein SEQ ID NOS: 18 and 20 are the second downstream probe and And the second upstream probe. These sets are exemplified as follows: In another embodiment, the composition of the invention is a target-dependent exonucleolytic agent. Thus non-phosphorylated or incompatible salts The group is removed from the 5'end of the first downstream probe and then unhybridized to the target nucleic acid sequence. By extending the upstream probe with a nucleotide complementary to the soybean intervening portion, The ends have non-ligable ends that are modified to allow ligation. The construct has four oligonucleotide probes selected from: RU: (A) Set 403E: SEQ ID NOS: 1 and 28 are the first upstream probe and the second, respectively. SEQ ID NOs: 27 and 4 are the second downstream probe and the second downstream probe, respectively. Two upstream probes; (B) set 231E: SEQ ID NOS: 9 and 32 are the first upstream probe and the second One downstream probe, SEQ ID NOs: 31 and 33 are the second downstream probe and A second upstream probe; (C) set 664E: SEQ ID NOS: 17 and 36 are the first upstream probe and The first downstream probe, SEQ ID NOS: 35 and 37 are the second upstream probe and And the second downstream probe. These sets are exemplified as follows: In another embodiment, the constructs of the invention have a 5'end when hybridized to a target. A downstream probe having an end protrusion, wherein the end of the probe can be ligated The 5'end of the downstream probe after modification was made by removing the overhang and the upstream probe was The abutment on the 3'end of the. Also provided are methods for determining the presence of hepatitis B virus DNA in a test sample. . The method uses the target sequences as SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 and 25 and these The DNA in the test sample is selected from one or more sequences selected from among the complementary sequences of It is hybridized with one or more oligonucleotide probes of the invention to produce a high Bridged probes can now be distinguished from unhybridized probes. And detect the presence of hybridized probes. Consists of In another embodiment, a method of determining the presence of hepatitis B virus DNA in a test sample. Use a connectable pair set by method. In this case, the target sequence is SEQ ID NO: 21, 22. , 23, 24 and 25 and one or more sequences selected from the complementary sequences thereof (A) the DNA in the test sample is selected from one or more upstream oligonucleotides of the invention. Hepatitis B with a reotide probe and one or more downstream oligonucleotide probes It hybridizes with the same strand of the target nucleic acid sequence of the virus, and the hybridization As a result of the reaction, unmodified ends generate unligable ends, and (b) the probe Target-dependently modifying the 3'end of the upstream probe to allow ligation of (c ) Downstream oligo hybridized to the 3'end of the hybridized upstream probe The hybridized probe is linked to the 5'end of the nucleotide probe to To make it distinguishable from the hybridizing probe, and Detect the presence of a probe. In yet another embodiment, the presence of hepatitis B virus DNA in the test sample is detected by the PC. A method of determining by R is provided. In this method, the target sequence is 2, 23, 24 And 25 and one or more sequences selected from these complementary sequences, (A) a first oligonucleotide probe and a second oligonucleotide probe , At the opposite ends of the same target nucleic acid sequence of hepatitis B virus DNA, (B) hybridized first and second oligonucleotides to the opposite strand The nucleotide probe is extended to sequentially complement the target sequence and Allow the lysed probe to be distinguished from the unhybridized probe, (d ) Detecting the presence of hybridized probe. LCR pair is a method for determining the presence or absence or amount of hepatitis B virus in a test sample. Also used in law. In this case, the target sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 and 25 and 25 and one or more sequences selected from these complementary sequences, ( a) A sample suspected of containing a single-stranded target nucleic acid sequence is provided with a first upstream probe and Including the first downstream probe, each probe is Is capable of hybridizing to the same strand of said target nucleic acid sequence of a B virus of inflammation, The 5'end of the downstream probe and / or the 3'end of the upstream probe are these probes. Target First oligonucleosides that cannot be ligated unless modified to allow soybeans (B) the 3'end of the first upstream probe and the first downstream probe after exposure to Tidoset Corrects the 5'end of DNA only when these probes hybridize to the target sequence Thereby allowing the ends to be ligated, (c) ligating the two first probes Forming a first ligation product, separating the first ligation product from the target, and (d) the mixing. A second upstream probe and a second downstream probe under hybridization conditions. Exposed to a second oligonucleotide set consisting of Forming a second ligation product, separating the second ligation product from the first ligation product, The ligated probe here can be distinguished from the unligated probe. , Step (a) to (c) are repeated one or more times, and (e) presence or amount of target DNA From the step of detecting the presence of a linked oligonucleotide probe that is correlated with Become. Selected from among SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 and 25 and their complementary sequences. One or more oligonucleotides of the invention directed to one or more selected sequences. And a detectably labeled oligonucleotide, Means for detecting nucleotides and amplifying hepatitis B virus DNA in a sample Also provided is a hepatitis B virus detection kit including the reagent. Brief description of the drawings FIG. 1 is an explanatory diagram showing a ligase chain reaction process known in the prior art. . FIG. 2 shows the probe set 403G (SEQ ID NOS: 1, 2, 3 and 4) 10^ThreeHB The number of HBV DNA target molecules was determined by IMx (registration in V genome copy / ml patient serum). Trademark) standard curve plotted against velocity (counts / sec / sec). HBV D NA positive samples were diluted in human serum negative for HBV index. Serum dilution is negative It was also used as a control. Graph as number of HBV DNA molecules per ml of serum The positive control dilutions shown in Figure 4 were tested repeatedly and the average was taken as the IMx® rate. Showed. About 2000-3000 genome copies / ml or 10-15 copies / a 5 to 10 fg of HBV-DNA / ml sample Obtained. The LCR results were obtained in Example 1 below. FIGS. 3a to 3c show three patients infected with HBV. It is a graph which shows the result obtained from (A, B, C). Data obtained by LCR (Example 7) is a semi-quantitative assay for alanine aminotransferase (ALT) level. It was clearly parallel with Le (Fig. 3a). HBV-DNA levels are It could also be measured in serial blood samples of patients treated with Elon (3b-3c). this HBV-DNA was common in the sera of these patients prior to initiation of interferon therapy. Clearly detectable by a simple dot blot hybridization assay However, after treatment, it became negative. With the LCR detection system, even after successful treatment Serum over several weeks longer than a typical hybridization assay HBV-DNA could be detected. Detailed Description of the InventionDefinition The terms used in the present invention are defined as follows. “Assay conditions” means LCR conditions relating to temperature, ionic strength, probe concentration, etc. Means a matter. These are known to those skilled in the art. LCR is essentially two states or Conditions, namely annealing or hybridization conditions, and denaturing conditions are used. You. “Hybridization conditions” generally refer to annealing and hybridizing It is defined as a condition that promotes zation. However, familiar to those skilled in the art As such, some such annealing and hybridization Factors such as temperature, ionic strength, probe length and G: C content of the probe. It depends. For example, lowering the reaction temperature promotes annealing. Any For a given probe set of, the melting point or Tm is any of several known methods. It can be measured by The assay conditions are typically at temperatures just below the melting point. Including. Ionic strength or "salt" concentration also affects the melting point. Because of the small cations Is a double structure by eliminating the negative charge on the phosphodiester backbone. This is because it tends to stabilize the formation of). Typical salt concentration is the type of cation And valence, which will be readily understood by those skilled in the art. High G: C included Amounts and long probe lengths are also known to stabilize the formation of dual structures. What If so, the A: T pair has only two hydrogen bonds, whereas the G: C pair has three water bonds. Longer probes have more hydrogen bonds that hold bases to each other Because it will be. Therefore, high G: C Content and long probe lengths lower the melting point and affect the "assay conditions". Professional The G: C content and length can be found by selecting the appropriate curve, and based on this, what kind of " The “assay condition” can be accurately determined. Ionic strength is typically Is optimized for enzyme activity, so the only parameter that can be changed Is temperature and the appropriate "assay conditions" for a particular probe set and system are It can be determined by those skilled in the art. “Denaturation conditions” generally refers to converting a double-stranded oligonucleotide to a single-stranded form. It is defined as a condition that promotes dissociation. This condition includes high temperature and / or low Intensity is included. It will be appreciated by those skilled in the art that Essentially the opposite. The term "complementary" with respect to bases refers to base pairs A and T in the case of DNA. , C and G, and in the case of RNA, the base pairs A and U, C and G. That is, G is complementary to C, and C is also complementary to G. Complementary base "Compatible" and non-complementary bases are "mismatched". For nucleic acid sequences, Nucleic acid sequences or probes that are “complementary” to a probe or target are those sequences that B condition Means that it can hybridize to a complementary probe or target. Therefore, As long as it is possible to hybridize under the same conditions, hybridization Sequences that may have mismatched base pairs. As described below, Probe A is complementary to probe A'and probe B is complementary to probe B '. . “Correction” is an upstream probe that corresponds to a corresponding downstream probe. Means an operation that enables target-dependent ligation. Therefore, target, target complement Sequences hybridized to the sequences or the polynucleotide sequences generated therefrom. Only the probe is "corrected". Preferably, the hybridized probe is targeted to These probes were enzymatically modified in a manner that relied on the sequence information contained within. Allow the tabs to connect to each other. Preferred enzymes are 5'to 3'target dependent It is a DNA polymerase that exhibits exonuclease activity. 5'to 3'mark Dependent exonuclease activity is 5'to 3'target dependent polymerase activity It can also be used in combination with a reagent having "Modify" is the end of the modification It can be done in several ways, depending on the type of edge. For example, one of the probes of the present invention The department is As described in US patent application Ser. No. 07 / 769,743 filed October 1, 1991. Una gap filling, or US patent application Ser. No. 07/925, filed Aug. 3, 1992. , "Corrected" by exonuclease cleavage as described in No. 402. Designed to. Both of the aforementioned prior patents are incorporated herein by reference. "Exo format" is a target-dependent exo format A non-phosphoric acid is introduced from the 5'end of the downstream oligonucleotide probe by a leoritic agent. Remove the lysed or incompatible bases and then label the 3'end of the immediate upstream probe. To extend with a nucleotide complementary to the non-hybridizing intervening portion of a specific nucleic acid sequence Means an operation of modifying a non-ligable end so that the end can be ligated. The term "exonucleolytic" preferably refers to DNA or Means the activity of removing the RNA substrate from the 5'end. Exonuclear activity The sex is usually an exonuclease or 5 that cooperates with some DNA polymerases. It may cooperate with the'to 3'exonuclease activity. As detailed later, Xonucleolytic activity is usually template dependent. The “gap format” is the upstream oligonucleotidic hybridized to the target. The 3'end of the Ctide probe is complementary to the non-hybridizing intervening portion of the target nucleic acid sequence. Non-ligated ends so that the ends can be ligated by extending Means how to fix. "Ligation" is a general term that refers to any covalent attachment of two probes. Means the way. Two enzyme-linked and photo-ligated Is a commonly used connection method. Allows preferred enzyme ligation step The conditions and reagents used are known to the person skilled in the art and are disclosed in the references cited above. Book Ligation reagents useful in the invention include T4 ligase, as well as prokaryotic ligases, eg E. coli ligase, and as taught in EP 320 308T hermus thermophilusLigase (eg ATCC 2763 4) is mentioned. The last-mentioned ligase was used during the LCR ™ thermal cycling. It is currently preferred because it can maintain activity. Thermally stable Without gauze, ligase would have to be added again after each cycle. Yes. Eukaryotic ligases, such as Rabin et al. Biol. Che m. 261: 10637-10647 (1986). The fly DNA ligase is also useful. One of the alternatives to enzyme ligation is the European Optical connection as described in Japanese Patent Application No. 324 616. The term "unlinkable without modification" is used to mean Is the 3'end of the upstream probe or 5'of the downstream probe that cannot be ligated to another probe It is a term that describes the end. Modifications have been removed and placed to make this end ligable. Substitution or other modification may be performed. Examples of non-ligable ends include upstream It cannot be ligated to the 3'of the probe, but is target-dependent so that it can be ligated. Unphosphorylated 5'end of the downstream probe, which can be modified to . Another embodiment is the end or internal mismatch of the probe to the end of the target. Step Once the lobes hybridize to their respective targets, these mismatches are target-dependent. To allow probe ligation. Another example is the above-mentioned US patent application No. 07 / 925,402. "Proximate" refers to about 1 to 20 nucleotides at the 3'and 5'ends. Cleotide, more preferably about 1 It hybridizes to the same target strand in its vicinity, so that it is located within a distance of 10 nucleotides. It means the positions of the upstream and downstream probes as described below. Neighborhood is a gap And a protrusion extension. In contrast, “adjacent” probes At positions such that the respective 3'and 5'ends are located at a distance of 0 nucleotides It is defined as hybridized with. Neighbor probe is next to it by modification Contact. "Upstream" and "downstream" probes hybridize to different regions of the same target nucleic acid strand. It means two different non-overlapping oligonucleotides. One oligonuc The 3'end of the reotide is oriented towards the 5'end of the other oligonucleotide. former Is called the "upstream" probe and the latter is called the "downstream" probe. The "prime (')" code is used to indicate a complementary base or sequence . Therefore, probe A is not co-terminal to A '. May have a terminal end, but may be complementary to A'according to the definition above. . The same applies to B and B '. “Suitable and / or suitable deoxynucleotide triphos "Sphate (dNTP)" is required to fill the gaps of neighboring probes. Means nucleotides. The type and amount of nucleotides required is the target DNA Depends on. The gap filling will be described in detail later. A typical nucleotide is D In the case of NA, guanine (G), cytosine (C), adenine (A) and thymine ( T) and, in the case of RNA, the base uracil (U) instead of thymine. This The term includes the aforementioned bases as described in 37 CFR 1.822 (p) (1). Also included are analogs and derivatives of. The degenerate base inosine (I) may be used in the present invention. However, it is not preferred to use I within the modified portion of the probe of the invention.Target nucleic acid sequence The oligonucleotide sequence of the present invention is a gene encoding a hepatitis B virus antigen. Identify a specific location on the child. Wild-type various HBV strains with known genomic sequences A conserved region was detected in comparison with the HBV strain (strain adw), and this conserved region was designated as a common sequence. And inspected. Oligonucleotides that cover the homology region of the HBV genome The probe can be examined first and then amplified in a target-dependent manner. In a preferred embodiment, The oligonucleotide sequence encodes the surface antigen (S) of HBV To identify a specific locus on the gene. The nucleotide sequence and the surface antigen of HBV Non-limiting examples of corresponding positions on the encoding gene are shown below. Common nucleotide phosphoramidite Chemistry, and Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE), or Mil Ligen (Bedford, MA) using the desired device. The lobes are synthesized by the usual method. The phosphorylation of the 5'end of the appropriate probe is Is required for ligation by a protease, is known to one of ordinary skill in the art, or Are commercially available synthetic reagents, such as those added as a correction mechanism herein. Can be implemented. Generally, the method of the present invention comprises (a) targeting the selected primary probe to the target HBV D In NA (and in the case of double-stranded where the target complementary sequence is present, the target complementary sequence Hybridizing step) and (b) target-dependent modification of the selected probe. Correct the primary probe so that it can be ligated, and (c) modify the probe. Ligating to the hand to form a fusion or ligation product, and From the target Dissociate and repeat the hybridization, correction and ligation steps to obtain the desired label. And amplifying the target sequence.Probe hybridization Introduction Hybridization of probe to target (and optionally to target complementary sequence) Are described in the prior art, eg European Patent Application No. 320 308, US Pat. 185243 and U.S. Pat. No. 4,883,750. Of the probe The length, probe concentration and stringency of the conditions are all such that hybridization occurs. Affect the degree and speed. The probe gives the desired specificity, ie in the sample It is preferred to have sufficient length to avoid hybridizing to non-target sequences of Good. Presently preferred are probes having a length of about 15 to about 40 bases. is there.Single-stranded probe and ligable pair set Single-stranded probe as defined herein and a paired set of hybrids The lysis is an effective hybridization selectivity, preferably a binding probe. Maximum hybridization selectivity for a particular length of lobe At the temperature so selected. Advantageously, the probes and probes of the present invention Pairs usually use moderate temperatures. The temperature is generally about 20 ° C to about 90 ° C, more Generally, it is about 30 ° C to 70 ° C, preferably 37 ° C to 60 ° C.Modified PCR A modified PCR ply, referred to herein as "short PCR" or "sPCR". Hybridization for mers is known to those of skill in the art. Typical Article The matter is described in Examples 11 and 12 below. Hybridization The condition must allow binding of the probe to the single-stranded nucleic acid target . As is known, the probe is characterized by the relative position of these probes along the double sequence: Whether the extension product synthesized from one probe is a template (complementary sequence) Function as a template for extending the other probe when separated from the The position is selected so that a replica strand is formed.Ligase chain reaction LCR ™ probe probe to target and optionally target complementary sequence Hybridization has been described in the prior art, for example in European Patent Application No. 320,3. 08 and Europe It is described in State Patent No. 439,182. Probe reacts stoichiometrically Therefore, it is expected to be added at an approximately equimolar concentration. Each probe is approximately 5 nanomolar (n M) to about 90 nM, preferably about 10 nM to about 35 nM. This This is about 3 x 10 for a standard reaction volume of 50 μl.¹¹~ About 1 × 10¹²Each of the molecules Equivalent to probe addition. About 5 × 10¹¹It is good to start with molecules / 50 μl. each The optimal amount of probe to use in a reaction depends on the number of cycles that must be performed and also on Of course, it also changes depending on the reaction amount. The probe concentration is optimal for a given number of cycles. A person skilled in the art can easily determine so as to obtain the signal. It is known to those skilled in the art that the stringency of the conditions will depend on temperature, solvent and other factors. You. Probably the most easily controlled of these factors is temperature Normally, LCR performance is adjusted by changing the temperature. The stringent conditions required to carry out the present invention are Since it is the same as the general LCR condition, further detailed explanation is not necessary. . A person who actually performs it on a daily basis may follow the examples below. Typically, LCR buffer (50 mM EP, optionally with acetylated BSA) PS pH 7.8, 20 mM KC 1, 30 mM MgCl₂10 mM NH_FourCl and optional 0.5 mM NA D⁺The reaction was carried out in The temperature cycle is, for example, Coy Laborato thermal cycler of ry Products (Ann Arbor, MI) Is a Programmable Cycler Reactor ™ (Eri (commercially available from Comp, San Diego, CA).Modification of the probe The oligonucleotide probes of the invention may be in a "gap fill" format or Can be modified in "exo" format. These two types of modifications are described below.Correction by gap filling format Probes modified by the gap-filling method are short salts from one or more of the probes. As a result of removing the base sequence, the two probes are targeted (or target complementary sequence or One of the probes when hybridized to a polynucleotide produced from Leaving a recess or gap between the 5'end of the probe and the 3'end of the other probe. Due to the resulting modified ends. To amplify the target by LCR, The gap between the cables must be filled (ie Must be "correct"). This operation is performed in Gap format Enzyme or reverse transcriptase and excess deoxynucleotide complementary to the target strand opposite the gap. It can be carried out using ciribonucleotide triphosphate. In this embodiment, the invention provides that (a) the probe is targeted to HBV (and Hybridized to the target complementary sequence (in the case of a double-stranded chain where the complementary sequence exists). And (b) at least one to fill at least one gap. The step of extending one probe, and (c) extending the probe to an adjacent probe. Ligating to form a fusion or ligation product, and (d) targeting the fusion product. And then repeat the hybridization, extension and ligation steps to obtain the desired Amplifying the target sequence. Includes both single-gap (SG) and double-gap (DG) configurations In this embodiment, the "gap" forming the "modified end" is defined by a polymerase or Correct by extending one or both modified probes using reverse transcriptase . The extension of the probe hybridized to the HBV DNA target is commonly known to those of ordinary skill in the art. As you know, DNA polymer This is done with a lase or Klenow fragment. Reversed extension for RNA targets Transcriptase is used. Specific examples of reverse transcriptases are commonly available to those of skill in the art. Avian myeloid virus (AMV) and Moloney murine leukemia virus (M-MuLV) -derived. Some DNA polymerases Recognizes RNA as a template under specific conditions. Of course, it is thermally stable and LCR It is preferable to use extension reagents that can withstand the required high temperature cycles. Extension reagents that are not thermally stable should, in principle, be added again after each LCR cycle. Must. Currently, specific examples of this type of thermostable polymerase include A mpliTaq ™ (available from Cetus-PerkinElmer) ,ThermusPolymerase (Molecular Biology Res) oures, Inc. Available from Milwaukee, WI, "MBR") ,as well asThermus aquaticus,Thermus thermop hilus Or a recombinant derived from another species known to be thermostable or Purified wild-type polymerase is included. With such extension correction, the target in the gap region Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) complementary to the base It must be present in the reaction mixture. More specifically, a description will be given based on FIG. Then array X_nIn the case of a gap having the following, the dNTP to be supplied is dX'TP To call. X'is the gap X_nMeans the complementary base of each base in dNTP is P harmacia (Piscataway, NJ) and Bethesda Re search Laboratories (Gaithersburg, MD) Are commercially available from many vendors including. The extension allows the extended probe to abut and connect to an adjacent probe. , Must end exactly at the junction. To do so, use "stop base (s topbase) ”. The stop base called Q '(see Fig. 1) is A dNTP, defined with respect to the corresponding complementary base Q and complementary to Q, is extracted from the reaction mixture. It is obtained by omitting, i.e. omitting dQ'TP from the reaction mixture. this Thus, to add 3 complementary 4 out of 4 dNTPs to the reaction mixture, How to use gap sequence bases from set N consisting of only 3 of 4 bases Understand what to choose. The fourth dNTP dQ'TP is reacted and mixed. If not present in the entity, the extension terminates at the desired junction. Therefore, Q'is The first base of the lobe, the base on the target that encodes the stopbase is a gap It is the first base adjacent to. Extension by polymerase or transcriptase occurs in the 5'to 3'direction. Obedience Thus, the 3'ends of both upstream probes (Fig. 1, probes A and B ') are extended. Can be extended by polymerase if nothing interferes. Extension It terminates when the next base required by the template is not present in the reaction mixture. That is, probe A encounters a stop base complementary base (Q) on the target strand Gap x_nBe extended through. Similarly, probe B'has To the stop base complementary base (Q) on the row or on the A side half of the reconstructed A: B Until you encounter Gap Y_mBe extended through. Both probe A'and B are A or It does not serve as an extension template for B '. Thus probes A and B'are targeted (Or to the reconstituted polynucleotide product obtained in the preceding cycle) It will be extended only when you do it. As mentioned above, the extension of A and B'can be extended probe So that it can be ligated to the 5'ends of the downstream probes B and A '. It is important to terminate at the end of (i.e., the junction). Therefore, from the reaction mixture, Gap x_nAnd Y_mDeoxyribonucleus complementary to the base (Q) immediately adjacent to the 5'end of Remove cleotide triphosphate. Of course, stop extension in both directions with the same base No need. Use different bases if you do not need to fill any of the gaps it can. In this embodiment, the actual junction is always the downstream probe (A 'and B). It will be clear that it is at the 5'end. These connecting points are the stop base Q ' It is not just a coincidence that it is also a position. Therefore, the gap X_nAnd Y_mCan have a length of any number of bases. That is, n is 1 It can be any integer above and m can be any integer greater than zero. But But what gap is X_nAnd which gap is Y_mYou can choose whether or not to Choose. However, both n and m must not be 0. The gap has the same length You don't have to have one. That is, m need not be equal to n. if m equals zero Disappears from the double-gap morphology and changes to a particular single-gap morphology. This is the case in the embodiments disclosed herein. Not used The only restriction on the base X is any 1 to 3 of the 4 bases. The point is that we must choose from a set N consisting of Similarly, salt The group Y is selected from the set M. Ensure at least one stop base Q ' Must be a set N and a possible base for X and Y, respectively. Combinations of M can include no more than 3 of the 4 bases. Therefore Y is of four bases as long as at least one base remains in the set "non-N-M". It may be any 3 to 0 of them. Set N is less than 3 out of 4 bases In the case of a non-existing base, Y indicates that the corresponding complementary base is a probe extension termination strand. As long as there remains at least one base that can function as a base Q '. It may be a non-existing base. Gap X using a single stop base_n And Y_mBoth extensions can be terminated. Array Y_mThe second constraint of occurs when m equals n. The gap lengths are Array Y when_mIs the array X_nMust not be complementary to or a probe The 3'end of A and B'constitute a "sticky end". Sticky ends can be ligated and amplified Probe A is placed on probe B'so that Allows the formation of hybridizing target-independent double-stranded complexes. m equals n If not, Y_mIs X_nIt is preferably not complementary to. That is, probes A and B 'Ends may have at least the same length but are not complementary "blunt ends (Sl Ippery end) ". In one of the preferred embodiments of the present invention, the fourth probe B'is the X in the target._nDistribution X with the same length as the column gap_n3'terminal sequence of However, this The structure is not essential to the invention. Because the gap is created between the probes This is because it only needs to be done. Therefore, the 3'end of the fourth probe B'is Unless there is a 3'recessed end for lobe B, Array X_nMay stop before the 3'end of The extension occurs from 5'to 3 ' , And dX'TP is (X_nMust be present anyway to extend through) Since the probe B'has to be_nExtend through the gap The gap (Y_mAnd X_nBoth the rest) are extended through.Correction by exo format In this embodiment, the unligable end is a non-ligated end of the downstream probe. It can be a phorylated 5'end. This end is linked to the 3'end of the upstream probe. However, it can be modified in a target-dependent manner so that it can be linked. Linking Another specific example of a non-capable end is an incompatibility of the probe with the end of the target or Internal nonconformity is mentioned. This kind of probe hybridizes to each target Then, remove the short base sequence, and as a result, target two probes (or target). Complementary sequences or polynucleotides produced from them) when hybridized There is a recess or gap between the 5'end of one probe and the 3'end of the other probe. By modifying the 5'end of one or more probes so that , Correct the mismatch in a target-dependent manner. This modification is an exonucleolytic activity. 5'to 3'exonuclease based on sex, preferably DNA polymerase Correction by zeal activity (Gelfand, D.,Taq DNA Polym erase in PCR Technology: Principles a nd Applications for DNA Amplification n Errich, H .; A. Edited by Stockton Press, N. et al. Y. (1 989)). These DNA polymers The enzyme will hybridize to the target DNA in the presence of the appropriate deoxynucleotide. Synthesis was initiated at the 3'-hydroxyl end of the probe and aligned with the DNA target template. To hydrolyze and replace the hybridized DNA sequences in this process. You. As a result of exonucleolytic degradation of DNA sequences, mono, di and larger The nucleotide fragment is released. Typically this exonuclease The activity is synthetically dependent. Therefore, the termination of the synthesis is a 5'to 3'exon It results in termination of the activity of the lease. One of the ways to terminate the synthesis in a controlled manner is DN By removing one or several of the four dNTPs required for A synthesis, the dNTP pool It consists of limiting Synthesis by DNA polymerase is based on dNTP pool Complementary to the deoxyribonucleoside 5'-triphosphate removed from Continue until the template base (stop base) on the target is encountered. Decomposition and synthesis at that time End at a point. LCR uses a downstream probe containing a 5'end that cannot be ligated without modification. To use. The modification blocks target-independent ligation of the probe. Also, the adjacent LCR The lobes hybridize in the presence of the target nucleic acid sequence but are ligable. Not be. The sequence information contained in the target DNA was used to correct the unligable ends. Used as a casting mold. Synthesis-dependent strand displacement 5 '→ 3' exonuclease activity The upstream probe is extended using a DNA polymerase having To hydrolyze the downstream probe. Extension of upstream probe and addition of downstream probe Hydrolysis is by using a subset of the four dNTPs required for DNA synthesis. Therefore, when the template base in the target where complementary dNTP is not present is encountered, it is synthesized and hydrolyzed. The decomposition can be controlled to stop. The resulting downstream probe was extended With a 5'phosphate that will be adjacent to the 3'hydroxyl end of the upstream probe To end. Adjacent DNA sequences in this direction are suitable for ligation by DNA ligase. It is a suitable substrate. The resulting gap between the probes needs to be filled (ie, modified. Must be correct). This fix describes the gap fill format Do as you did.Linking Generally, the next step after modification is to ligate one probe to an adjacent probe. It consists of That is, each modified The first upstream (or primary) probe was linked to the corresponding first downstream probe and modified Each second downstream (or secondary) probe is linked to a corresponding second upstream probe. "next to "Bound" probe is one of two probes that can hybridize to a target in Either one. One of the two probes has a phosphorylated 5'end. Present with the end abutting the 3'hydroxyl end of the partner probe. "adjacent The probe is formed when the modified ends are target-dependently modified as described above. A preferred method for covalently joining two adjacent probes is enzymatic ligation. However, "ligation" is a general term and refers to any method that covalently links two probes. It should be understood to include the law. Conditions and reagents that enable the preferred enzymatic ligation step are known to those of skill in the art, It is disclosed in the aforementioned references. Ligation reagents useful in the present invention include T4 Riga. And prokaryotic ligases such as E. coli ligase and European Patent Application No. 320 As taught in No. 308Thermus thermophilus Ligase (eg ATCC 27634). Last mentioned ligase Can maintain activity during thermal cycling of the LCR, Currently preferred. Cycles without the presence of thermally stable ligase Ligase must be added again after each repetition. Eukaryotic ligase, for example Rabin et al. Biol. Chem. 261: 10637-10647 (1 Drosophila DNA ligases as described in 986) are also useful. After ligation, the fusion reconstituted probe is dissociated from the target as in the case of general LCR (For example, melting) and this operation is repeated for several cycles. Number of repeat cycles is 1 to about 1 00, but presently preferred is about 15 to about 70. The probe will ligate as expected when hybridized to a complementary (secondary) probe. Design the end opposite the point so that it cannot participate in another undesired ligation reaction. Is desirable. That is, sticky ends or blunt ends that can be ligated must be avoided. Yes. When it is necessary to use this type of end, avoid or remove the 5'terminal phosphate. Leave or block. This procedure involves the oligonucleotide probe (usually the 5'end). Via synthesis of no terminal phosphate groups, or (eg DNA restriction) Removal of terminal phosphates (from oligonucleotides produced by digestion) Phosphatase This can be done through the use of enzymes. Alternatively, at least one plot By blocking the end of the hook with a "hook" or marker part as described below It can also prevent ligation of the "wrong" outer ends of the probe. Of the technology If neither can be used, the outer ends of the probes are Can be shifted so that it does not function as a template for exponential amplification. In a particularly preferred form, the hapten or "hook" is provided with at least two probes. Usable outer ends of the lobes (opposite ends of the fusion product), preferably 4 Attach to the outer ends of all of the probes. “Hook” is a specific ligand-receptor It consists of any part with body affinity. For example, hapten or polynucleotide May be a segment of Connect the hooks to one probe and A label may be attached to the probe. Ligation binds the label to the affinity moiety and After separation, the separated label can be measured on the solid phase.detection The presence of amplified target can be detected by any method. One way is a certain size The reaction product of Sao It consists of separating. Specific examples of the molecular weight discrimination method include an affinity label and a group. Examples include growth, gel filtration, sedimentation rate, osmotic pressure or gel electrophoresis. Especially preferred The method depends on the nucleotide³²When labeled with a radioactive label such as P It is especially useful for gel electrophoresis. Detection is typically done by separating fluxes after separation. This is done by measuring the amount of labeling in the tablet. Of course, in the separation fraction For the label, know the total amount of label added to the system, and determine the amount present in the non-separated fraction. By measuring, it can also be measured by subtraction. Separation can be performed by electrophoresis, It can be carried out by romatography or the preferred method described below. Alternatively, a physical label capable of producing a detectable signal A method of labeling a nucleotide can be mentioned. Various "signaling that can be used "Compounds" (labels) include chromogens, catalysts such as enzymes, fluorescein and rho. There are luminescent compounds such as damine, chemiluminescent compounds, radioactive elements and direct visual labeling. You. Specific examples of the enzyme include alkaline phosphatase and horseradish peroxida. And β-galactosidase and the like. The choice of specific label is crucial But not alone, or one or more Select a substance that can generate a signal in cooperation with a substance. Various haptens are known, and in the present invention, virtually any hapten can be used. Can be used. The present invention requires that specific binding partners be known or prepared. What is possible (characteristics based on the definition of hapten) and that the hapten is hybrid It is only capable of binding to the probe so as not to interfere with the dimization. Professional There are many methods known to those skilled in the art for adding a hapten to a tube. Enzo Bio chemical (New York) and Clontech (Palo Al Both of them disclose and commercialize the probe labeling technology. For example, 3'-a Min-ON CPG ™ (Clontech, Palo Alto, CA) Can be used to add a primary amine to the 3'oligo terminus. Also, Amin 5'oligo ends using omodiifer II® (Clontech) It is also possible to add a primary amine to the end. Amine general activation and conjugation Scientific techniques can be used to react with various haptens. Also filed on December 11, 1990 and December 20, 1990, respectively. United States Patent Co-pending Application No. 625 Nos. 566 and 630,908 refer to probes at the 5'and 3'ends, respectively. Teaches how to label with. The two co-pending applications are hereby incorporated by reference. Is included. Non-limiting examples of haptens include many drugs (eg, digo Xin, theophylline, phencyclidine (PCP), salicylate, etc.), T3 , Biotin, fluorescein (FITC), dansyl, 2,4-dinitropheno (DNP); and modified nucleotides such as bromouracil, and N-acetate. Modified by the introduction of a tyl-7-iodo-2-fluorenylamino (AIF) group Bases and the like. All of the specific haptens described herein are 1991 Co-pending shared US patent application Ser. No. 07 / 808,508 filed December 17 (Adamantane acetic acid) and US Patent Application No. 808,839 (carbazole and Dibenzofuran), both US patent applications filed on March 27, 1992 No. 07 / 858,929 and US patent application Ser. No. 07 / 858,820. (In the present specification, these are collectively referred to as “hapten application”). Said c The entire disclosure of each of the Puten applications is incorporated herein by reference. To detect more than one target, eg HBV and HCV The procedure for this is detailed in US Patent Application No. 860,702, filed March 31, 1992. As mentioned, two types of labels can be included, a common label and a unique label. Th Other labels may also be used as detection labels. For the sake of simplicity The embodiments are described using both as common and unique labels. Of course, Easy replacement of at least one of the puttens, especially the common hapten Can be used. A preferred standard LCR procedure uses the first hapten to reconstitute the reconstituted molecule. Capture and separate. The second hapten binds the reconstituted complex to the signal generator Used to do. This operation is detailed in EP-A-439-182. Have been. For example, the 5'end of the first primary probe and the 3'of the first secondary probe. Fluorescein is attached to the'end. In addition, different haptens, such as biotin, It binds to the 3'end of the second primary probe and the 5'end of the second secondary probe. In this way, when the reconstituted molecule becomes a double structure, two molecules are formed at one end of the double structure. Biotin is present and two fluorescenes are present at the other end. Anti-fluore The solid phase with the coating of Sen was used to The reconstituted molecule is separated from the unligated probe. (Unlinked with fluorescein The probe is also captured. ) A labeled with a detectable signal generator such as an enzyme. Separate complexes are detected using vidin or anti-avidin. The test sample may be any biological material suspected of containing HBV. . For example, the test sample may be human body tissue, or cells suspected of containing HBV. It can be a test sample containing. The term can mean virtually any liquid sample. The test sample may be any desired source, such as body fluids such as blood, saliva, lens fluid, It may be derived from cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, mucus, synovial fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid and the like. liquid Before use, the physical examination sample should be used for pretreatment such as preparation of plasma from blood and dilution of viscous liquid. You can get it. Pretreatment methods include separation, filtration, distillation, concentration, and inactivation of interfering components. And addition of reagents. In addition to body fluids, use liquid samples such as water and food it can. Also, the solid test sample is used after being modified to form a liquid medium. You can also.kit The reagents used in the method of the invention can be incorporated into a diagnostic kit. Diagnostic kit Contains labeled oligonucleotides obtain. If the oligonucleotide is unlabeled, a specific labeling reagent is also included in the kit. obtain. Kits also include specific probe designs and gap or sexo filling Optionally a nucleoside triphosphate such as dATP, dGTP, A combination of dCTP or dTTP, that is, a combination of 3 or less of dNTPs. It may also include a properly packaged case. The kit also includes Polynucleotide Polymer And also means for covalently linking upstream and downstream sequences, such as ligase. obtain. These reagents are typically included in the kit in a separate container, but If the flexibility and storability allow, they can be packaged in the same container. Various in the kit The relative amounts of the agents in the assay yield reagent concentrations that optimize the reactions that need to occur in the present invention. A wide range can be varied in order to optimize the assay sensitivity. Ki Is a denaturing agent to denature the analyte, a hybridization buffer Fluids, wash solutions, enzyme substrates, negative and positive controls, and instructions for performing the assay. It may also include a memorandum. The present invention will now be described with reference to examples. The following examples limit the scope of the invention Instead, it should be understood that the invention may be understood in cooperation with the general description and the detailed description above. Book deeper The purpose is to clarify the features of the preferred embodiment of the invention. ExampleMaterials and methods The following terms used in the examples are trademarks, trade names or chemical abbreviations according to the definitions below. Is the issue: BSA: bovine serum albumin EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid which is a metal chelating agent EPPS: [N- (2-hydroxyethyl) piperazine used as a buffer -N- (3-propanesulfonic acid)] acid chemical abbreviation FITC: Chemical of fluorescein isothiocyanate, a fluorescent hapten derivative Abbreviation HPLC: high performance liquid chromatography MES: Chemical abbreviation for [2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid] which is a buffer solution issue IMx®: for performing a particulate enzyme immunoassay (MEIA) Applicant's trademark for automated equipment Tris: from tris (hydroxymethyl) aminomethane Buffer solution The table below shows the probes and / or primers used in the examples below. Of. Each sequence is indicated by its respective SEQ ID NO in the specific examples. Any type of cell, swab, smear, blood or tissue can be treated with phosphate buffered saline ( Samples can be prepared by centrifugation of the respective cell suspensions in PBS). Usually, the pellet is resuspended in 100 μl of 10 mM NaOH and incubated at 100 ° C for 5 Heat for 10 minutes. After boiling, the sample is centrifuged again to remove cell debris. Up A portion of the supernatant was added to 50 mM EPPS pH 7.8, 30 mM MgCl 2.₂, 20m M KCl, 1 μM deoxynucleotide triphosphate and 5 × 10¹¹Molecule to the reaction mixture containing the oligonucleotide probe of the invention. You. The capture ligand oligonucleotides A and A'are carbazole and / or F It can be derivatized with ITC. Probes B and B'have adamantane or biotin It can be derivatized as a signal moiety. Selection using polynucleotide kinase The 5'end of the probe is phosphorylated. Of the tube containing the sample and reaction mixture Cover top with mineral oil and boil for about 3 minutes. Then keep the tube at 85 ° C for 1 minute, Hold at 50 ° C for an additional minute. To the reaction mixtureThermus thermoph ilus Ligase (Abbott) andThermus DNA polymerase ( Molecular Biology Resources) is added. Then Tubes in a thermal cycler or alternately between two water baths at 85 ° C and 50 ° C To To amplify the target HBV DNA for the assay, typically 30 L CR cycles are sufficient. The mixture is removed from the mineral oil layer to detect reaction products. Separate and dilute with the same amount of distilled water. IMx® analysis of a portion of the reaction mixture Fill the disposable reaction cell of the vessel. Each test reagent, eg sample dilution Immersion liquid, methyl umbelliferone phos Fate, anti-biotin alkaline phosphatase conjugate, anti-fluorescein coat The charged particles and the like are loaded into an IMx (registered trademark) analyzer. MEIA within 30 minutes Alkaline phosphatase binding rate, expressed in counts / second / second, Calculate from the response speed. The amount of polymerase is expressed in units defined as follows: 1 unit of enzyme is manufactured Established by a contractor (Molecular Biology Resources) It is just as it is meant to be. The units of ligase enzyme are defined herein below. 1mg purity 95%Thermus thermophilus DNA About 1 x 10 with ligase⁸It shall have a specific activity of unit. This is exactly Is not standardized and can vary by as much as 20% and optimization can be performed by one of ordinary skill in the art. You.LCR (trademark) conditions All reactions were LCR buffer (50 mM EPPS p unless otherwise indicated). H7.8, 20 mM KCl, 30 mM MgCl₂10 mM NH_FourCl) in It was carried out in. The temperature cycle is performed, for example, by Coy Laboratory Prod. cts (Ann Arbor, MI) Therma Le Cycler or Programmable Cycler Reactor ™ (commercially available from Ericomp, San Diego, CA) Carried out. Reactions are aliquoted in stop buffer (80% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% (w: v) xylene cyanol and 0.05% bromofe It was stopped by transferring into Nolblue). Ligated and unligated products 8.3 M urea in 80 mM Tris, 80 mM boric acid pH 8.0, 1.0 16x20x0.04 cm 15% polyacrylamide gel containing mM EDTA Split on Le. The gel is autoradiographed and the autoradiograph is The coupled and uncoupled probes were excised using the template and the radioactivity of each band Was measured by liquid scintillation counting. The radioactivity ratio of the ligation probe is Calculated as a function of total counts in each lane. Example 1 For probe set 403G consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 (see Table A) The LCR ™ in a 0.5 ml polypropylene tube containing LCR buffer. Carried out. Test sample containing HBV DNA (2.8 x 10⁷molecule HBV DNA / ml) was diluted in human serum negative for HBV index. This blood The clear dilution was also used as a negative control. 5x10 for each probe¹¹Exists by molecule / reaction DNA ligase final concentration is 5000 units, DNA polymerase final concentration Was 1.0 unit. Cover sample with mineral oil and incubate at 85 ° C for 30 seconds , Followed by a temperature cycle consisting of a 20 second incubation at 50 ° C. Dilution of positive control shown as HBV DNA molecules per ml serum in the graph Two objects were inspected, and the average value is shown in Table 1 below as IMx (registered trademark) speed. Was. The calculated values of the linear range are shown as a linear graph in FIG. Axis value is per reaction It is calculated by multiplying the number of molecules (Table 1) by the number of ml (× 200) of the reaction. Example 2 Under the conditions described in Example 1, the HBV DNA probe set 403G ( LCR was performed using SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4). The results are shown in Table 2 below. . Example 3 Under the conditions described in Example 1 above, probe set 231E (SEQ ID NO: 9, 31 , 32 and 33) and 231G (SEQ ID NOs: 9, 10, 11 and 12). A CR was performed. In the case of the probe set 321E, the cycle was performed 45 times. The results are shown in Table 3 below. In the case of the probe set 231G, the temperature is 8 A cycle of 30 seconds and 20 seconds at 5 ° C. and 60 ° C. was performed 40 times. result Are shown in Table 4. Example 4 Under the conditions described in Example 1 above, probe set 664G (SEQ ID NO: 17, 1 8, 19 and 20) and 664E (SEQ ID NOs: 17, 35, 36 and 37) LCR was performed. The results for 664G are shown in Table 5, and the results for 664E are shown in Table 6. Example 5 Under the conditions described in Example 1, but using 1350 units of ligase, LCR was performed with Buset 403G (SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4). H The specificity of these probes for BV-DNA was examined in healthy individuals, non-hepatitis B patients and And 31 serum samples from patients with autoimmune hepatitis (see below) Table 6). Each patient with a negative test result had LC as evidenced by a liver function test. It shows that there are no false positives using the R method. Each test sample is per serum sample It had 250 molecules of HBV DNA. Healthy people have no liver disease and non-hepatitis B Patients show positive signs of liver disease and autoimmune hepatitis patients show hepatitis-like symptoms and liver defects. Showed floor signs. Example 6 20 human bloods from various patient groups infected with hepatitis B (HBsAg +) Using a clean sample and under the conditions described in Example 1, probe set 403G (SEQ ID NO: Nos. 1, 2, 3 and 4) and 184G (SEQ ID NO: 5, 6, 7 and 8) R was performed. The results are shown in Table 7 below. The sample was tested in duplicate and the average value The signal noise (S / N) ratio is shown. Evaluation criteria for inspection sample (-, +/-, + or ++ ) Is defined based on IMx® background (bg) rate . 0-1.5xbg rate is defined as negative (-),> 1.5-3.0xbg rate Is defined as intermediate (+/-) and 3.0-20 x bg rate is defined as weak positive (+). > 20 × bg rate is defined as positive (++). In addition to LCR, Abbott HBV DNA test (DNA solution hybrid Zation assay) and polymerase chain reaction (PCR) to evaluate samples did. All samples are HBsAg positive and include HBeAg or anti-HBe results It is. The tested HBV carriers had varying clinical backgrounds. High virus Is characterized by the presence of HBV DNA and HBeAg and hypoviremia is anti-H Be And asymptomatic HBV carriers are characterized by the presence of anti-HBe. It was characterized by existence. Example 7 Under the conditions described in Example 1, probe set 403G (SEQ ID NOS: 1, 2, 3 and 4) was used to perform LCR in the follow-up test samples of chronic hepatitis patients (A, B, C). Used to monitor HBV DNA concentration. Shown as Signal Noise (S / N) Ratio The LCR data obtained from the IMx® instrument is a graph showing the liver-derived enzyme Can be compared with the serum concentration (m / l) of Lanine aminotransaminase (ALT) You. Evaluation criteria for the test sample are as described in Example 6 above. The inspection was carried out as follows. Patient A on June 13, 1990 and 1990 Interferon therapy (indicated by * in the table below) was administered on October 15, 2015 (see below) A2 and A3). HBV DNA at set intervals until March 17, 1992 The concentration was monitored. For Patient C, November 14, 1991, December 10, 1991 Sun, January 7, 1992, January 28, 1992 and March 3, 1992 Terferon therapy was given (C4 to C8 below). Set until May 26, 1992 HBV DNA concentration was monitored at defined intervals. In the serum of these patients, Prior to initiation of terferon treatment, standard dot blot hybridization should be performed. HBV-DNA was unambiguously detected by HBV, but became negative after treatment. LC With the R detection system, even after successful treatment, general hybridization Detecting serum HBV-DNA over a period of several weeks longer than that of essays I was able to. Suitable for semi-quantitative monitoring of HBV DNA and ALT by LCR detection The sex is apparent from the graphs of Figures 3a-3c. Example 8 Under the conditions described in Example 1, except that 0.5 unit of DNA polymerase and 340 Using 0 units of DNA ligase, probe set 403G (SEQ ID NO: 1, 2 LCR was carried out with 3 and 4). The reaction was based on HBV DNA negative serum (negative Sex control) or serum containing adw or ay HBV. After amplification, the reaction mixture was diluted 1: 1 with IMx® dilution buffer and LC The R-amplification product was labeled with the Abbott IMx® automated immunoassay system. Was detected by a sandwich immunoassay carried out with. In the examples below Is the velocity reading of this process in counts / second / second (c / s / s) Things. The amount of tethered probe was directly related to the speed of reading (European patent See Application Publication No. 357-011). The sample was subjected to 3 replicates. 3 times anti Table 9 below shows the average value and coefficient of variation (CV%) of the reinspection. These results show that the probe set 403G was common to each HBV subtype. Patients who have detected or are effective against antiviral therapy It has been shown to be useful for follow-up examinations of. Example 9 Of the polymerase chain reaction (PCR) termed "short PCR" or "sPCR" Probes SEQ ID NOs: 1 and 4 were used to detect HBV DNA with the modification. Used. sPCR is essentially a Perkin-Elmer / Cetus, Eme Gene-AMP ™ kit package commercially available from Ryville, CA It was carried out according to the instructions in the packaging. The control is Abbott Genetics ( (Trademark) DNA kit was used. PCR operation, primer set sequence number Issue 1 and 4 1 x 10¹²Used in molecule / reaction, reaction buffer at 94 ° C for 30 seconds, 5 Use 30 cycles of 20 seconds at 0 ° C. and use Taq polymerase (C etus) at 1.25 units / reaction. Published on March 7, 1990 IMx (registered as described in European Patent No. 357,011 to Laffler et al. The double-structured product was separated and detected on a Trademark instrument. The European patent is hereby incorporated by reference It is included as a reference in the book. The average values of the results of repeated operations are shown in the table below. Example 10 As described in Example 9 above, using probe SEQ ID NOs: 5 and 8 as primers. Thus, HBV DNA was detected by PCR. The average value of the results of the iterative operation is shown in the table below. Shown in Example 11 U.S. Patent No. 5, issued Feb. 9, 1993, using primer SEQ ID NOS: 1 and 3. Target-specific polymerization and ligation reactions were performed as described in 185243. . The aforementioned US patents are incorporated herein by reference in their entirety. Probe as described above Target HBV DN derivatized with FITC and / or fluorescein A, United States Biochemical, Clevelan d, mixed with modified t7 DNA polymerase available from Ohio, buffer and water I do. The mixture is heated to 80 ° C for 5 minutes and slowly allowed to cool to 23 ° C. Short time After centrifugation for between, the reaction mixture was³²P-labeled dCTP, T4 DNA liger Zease and DNA polymerase are added. The resulting solution was incubated at 23 ° C for 12 hours. Beate. A part of the reaction mixture was subjected to denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. If you play, it is 48 bases long³²P-labeled product is shown. This product is high on target Corresponds to the fill and ligation products of SEQ ID NOs: 1 and 3 after bridging. Example 12 Under the conditions described in Example 11 above, except that dATP and d CTP was added to hybridize probe SEQ ID NOS: 1 and 28 to the target HBV DNA. Soy. A portion of the reaction mixture was 48 bases long.³²The P-labeled product is shown. this The product is the fill and ligation product of SEQ ID NOS: 1 and 28 after hybridizing to the target. Corresponds to the product.

Claims

[Claims] 1. Detects hepatitis B virus DNA present in test samples containing non-target DNA A first upstream oligonucleotide probe, and a first downstream Oligonucleotide probe and each probe is hybridized About 1 capable of hybridizing to the same strand of the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus under conditions It consists of 0 to about 60 nucleotides, and the 3'end of the upstream probe is the downstream probe. Of the target sequence of SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24 and 25 or one or more sequences selected from the complementary sequences thereof Composition. 2. The 3'end of the upstream probe or the 5'end of the downstream probe is attached to these ends. The composition of claim 1 which is non-connectable unless modified. 3. The 3'end of the upstream probe is linked to the target nucleic acid sequence so that the ends can be ligated. Linking by extending with a nucleotide complementary to the non-hybridizing intervening portion The composition according to claim 2, wherein the dead ends are modified. 4. The upstream and downstream oligonucleotide probes are Pairs: (a) SEQ ID NOS: 1 and 3, (b) SEQ ID NOS: 5 and 7, (c) SEQ ID NO: 9 and 11 and (d) SEQ ID NOS: 13 and 15, and (e) SEQ ID NOS: 17 and 19 The composition of claim 1 which is a pair selected from 5. The target-dependent exonucleolytic agent allows the ends to be ligated. Unphosphorylated or incompatible bases from the 5'end of the downstream probe, and then Nucleotides complementary to the upstream probe to the non-hybridizing intervening portion of the target nucleic acid sequence. The composition according to claim 2, wherein the non-ligable end is modified by extending the end with a cord. 6. The upstream and downstream oligonucleotide probes have the following pairs: (a) SEQ ID NO: 1 and 28, (b) SEQ ID NOS: 9 and 32, and (c) SEQ ID NOS: 17 and 36 Is a pair selected from these complementary sequences. 7. The downstream probe forms a 5'overhang when hybridized to the target, 5'end of the downstream probe is 3'of the upstream probe so that the ends of the probe can be ligated. The structure according to claim 2, which comprises removing the protrusion so as to abut the distal end. Stuff. 8. Presence or absence of hepatitis B virus DNA in the test sample A method for determining the amount of (a) DNA in a test sample according to claim 1. One or more upstream oligonucleotide probes and one or more downstream oligonucleotides of Hybridized with the same strand of the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus using ochidoprobe However, as a result of the hybridization, uncorrected ends were generated in the uncorrected case. , (B) target-dependent on the 3'end of the upstream probe to allow ligation of the probe The 3'end of the upstream probe hybridized with (c) hybridized Ligated to the 5'end of the downstream oligonucleotide probe, (D) Presence of HBV DNA in test sample As a measure of presence or quantity, comprising detecting the degree of formation of ligation products Method. 9. The method according to claim 8, wherein the probes are discriminated by molecular weight. 10. Furthermore, (a) the detectable signal can be generated directly or indirectly Attached a reporter group to at least one of the oligonucleotide probes. , (B) emits a signal from the reporter group in association with hybridization. And (c) detecting the generated signal. 9. The method of claim 8, further comprising the step of determining the presence of hepatitis B virus by Law. 11. An amplification step may be performed before or at the same time as the hybridization step. 9. The method of claim 8 including. 12. The method according to claim 11, wherein the amplification is LCR or PCR. 13. Modifications allow the 3'of the upstream probe and the 5'of the downstream probe to be ligated In order for the nucleotide sequence complementary to the non-hybridizing intervening portion of the target sequence to 9. The method of claim 8, comprising extending at least one end of one probe. 14． Target-dependent exonucleolysis to allow modification to ligate ends Unphosphorylated or incompatible base from the 5'end of the downstream probe due to tic activity The nucleoside complementary to the non-hybridizing intervening portion of the target nucleic acid sequence. 9. The method of claim 8, comprising extending the upstream probe with a tide. 15. Whether detection monitors the removal of fragments from downstream probes 15. The method of claim 14 consisting of: 16. 5 when the downstream probe hybridizes to the target 'A modified downstream probe to form an overhang and to allow the ends of the probe to be ligated. To remove the overhang so that the 5'end of the probe abuts the 3'end of the upstream probe. 9. The method of claim 8 consisting of making a positive. 17． A kit for detecting hepatitis B virus according to claim 1. At least one of the probes, including a composition consisting of upstream and downstream probes. One is detectably labeled and also includes means for detecting the probe. The rare kit. 18. The kit according to claim 17, further comprising a ligase. 19. In addition, a polymerase and at least one deoxynucleotide triphos 18. The kit according to claim 17, comprising feeding a fate. 20. Composition for detecting hepatitis B virus DNA present in test sample Which is capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus from about 10 to about Includes first and second oligonucleotide probes of 60 nucleotides , The target nucleic acid sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 and 25 or complementary sequences thereof. The probe is selected from one or more sequences selected from the sequence and the probe is hepatitis B virus DN The above construct, which is capable of hybridizing to opposite strands at opposite ends of the same target sequence of A. 21. The first and second oligonucleotide probes have the following pair: (a) SEQ ID NO: Nos. 1 and 4, (b) SEQ ID NOs: 5 and 8, (c) SEQ ID NOs: 9 and 12, (d) sequence 21. The composition of claim 20, which is a pair selected from numbers 13 and 16. 22. Hepatitis B virus DN in a test sample using the composition according to claim 20. A method of determining the presence of A, comprising: (a) a first oligonucleotide probe and Second oligonucleotide probe with the same target nucleic acid sequence of hepatitis B virus DNA Hybridize to the opposite strand at the opposite end of and the (b) extension product is used for its formation. Hybridization and extension of the opposite probe when separated from the template used. Hybridized first and second orientations so that they can be used as templates for length. The gonucleotide probe is extended to form an extension product, and (c) the extension product is Separated from the template used for the formation of (d) the first and second oligos of step (a) Hybridizing a nucleotide probe to the extension product of step (b), which To form an extension product with less (e) steps (a) and (d). Kutoichi Repeat (f) the extension probe as a measure of the hepatitis DNA present in the test sample. Said method comprising detecting the presence. 23. 23. The method of claim 22, wherein steps (c) and (d) are repeated at least 10 times. How to list. 24. Furthermore, (a) the detectable signal can be generated directly or indirectly Attached a reporter group to at least one of the oligonucleotide probes. , (B) emits a signal from the reporter group in association with hybridization. And (c) an extended oligonucleotide probe that is correlated with the presence of the target DNA. 23. The method of claim 22, also including the step of detecting the presence of a bump. 25. 21. A kit for detecting hepatitis B virus, the method according to claim 20. Of the oligonucleotide probe pair of At least one is detectably labeled and a hand for detecting the probe is used. The above kit, which also includes steps. 26. In addition, a polymerase and all four deoxynucleotide triphosphates 26. The kit of claim 25, which comprises: 27. Composition for detecting hepatitis B virus DNA present in test sample And (a) including a first upstream probe and a first downstream probe, each probe , To the same strand of the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus under hybridization conditions The target sequence consists of about 10 to about 60 nucleotides that can hybridize. Selected from column numbers 21, 22, 23, 24 and 25 or their complementary sequences A first oligonucleotide set, which is one or more sequences, and (b) a second downstream probe. And a second upstream probe, both probes being the first oligo of step (a). A second oligonucleotide set that can hybridize to the nucleotide set The composition comprising. 28. 5'end of at least one first downstream probe and / or at least one 28. The 3'end of one upstream probe is unligable unless modified, The described composition. 29. The 3'end of the first upstream probe is linked to the target nucleic acid so that the ends can be ligated. By extending with a nucleotide complementary to the non-hybridizing intervening part of the sequence 29. The composition of claim 28, wherein the non-ligated ends are modified. 30. The four oligonucleotide probes are (a) Column numbers 1 and 3 are the first upstream probe and the first downstream probe, respectively, and SEQ ID NO: 2 and And 4 are the second upstream and second downstream probes, respectively, set 403G, (b) Column numbers 5 and 7 are the first upstream probe and the first downstream probe, respectively, and SEQ ID NO: 6 and Set 184G and (c) in which 2 and 8 are the second downstream probe and the second upstream probe, respectively. Column numbers 9 and 11 are the first upstream probe and the first downstream probe, respectively, and SEQ ID NO: 1 Set 231G, where 0 and 12 are the second downstream and second upstream probes, respectively ( d) SEQ ID NOs: 13 and 15 are the first upstream and first downstream probes, respectively, Set 18 in which column numbers 14 and 16 are second downstream and second upstream probes, respectively 75G, and (e) SEQ ID NOS: 17 and 19 are the first upstream and first downstream programs, respectively. SEQ ID NOS: 18 and 20 are the second downstream and second upstream probes, respectively. 30. The composition of claim 29, selected from a set 664G. 31. Target unphosphorylated or incompatible bases so that the ends can be ligated. Removal from the 5'end of the first downstream probe with a live exonucleolytic agent , Then the upstream probe complementary to the non-hybridizing intervening portion of the target sequence. 28. The non-ligable end is modified by extending with a nucleotide. Composition. 32. The four oligonucleotide probes correspond to (a) SEQ ID NOS: 1 and 28. The first upstream probe and the first downstream probe, respectively, and SEQ ID NOS: 27 and 4 respectively Second downstream and second upstream probe set 403E, (b) SEQ ID NOs: 9 and 32 Are first upstream and downstream probes, respectively, and SEQ ID NOs: 31 and 33 are Set 231E (SEQ ID NO: 9, 31, 32 and 33), and (c) SEQ ID NOS: 17 and 36 are the first upstream and the first, respectively. Downstream probes, SEQ ID NOS: 35 and 37 are the second downstream and second upstream probes, respectively. The structure of claim 31, wherein the structure is selected from the set of lobes 664E. Adult. 33. When the downstream probe hybridizes to the target, it forms a 5'overhang and Positive, but the 5'end of the modified downstream probe was modified to allow the ends of the probe to be ligated. A contract comprising removing said protrusion to abut the 3'end of the upstream probe. The composition according to claim 27. 34. Presence or absence of hepatitis B virus DNA in the test sample or An amount is detected by a ligase chain reaction using the composition according to claim 27. And (a) a sample suspected of containing a single-stranded target nucleic acid sequence, A lobe and a first downstream probe, each probe containing the hybridization Under the conditions capable of hybridizing to the same strand of the target nucleic acid sequence of hepatitis B virus, The 5'end of the downstream probe and / or the 3'end of the upstream probe mark the probe. First oligo that cannot be ligated unless modified so that it is hybridizable Exposed to a set of nucleotides, (b) the probe hybridizes to the target sequence Only when the 3'end of the first upstream probe and / or the 5'end of the first downstream probe Modifying the ends to allow the ends to be ligated, and (c) ligating the two first probes together to form the first series. Forming a ligation product and separating the first ligation product from the target, (d) said mixture A second upstream probe and a second downstream probe are included under hybridization conditions. Exposure to the second oligonucleotide set and ligating the two second probes together Forming a ligation product, separating the second ligation product from the first ligation product, Probe can be discriminated from the uncoupled probe, and steps (a) to (c) ) Is repeated at least once, and (e) Presence of a linked oligonucleotide probe that correlates to the presence or amount of target DNA Said method comprising detecting 35. 35. The method of claim 34, wherein the ligation probe is detected by molecular weight. 36. Tethered probe for affinity labeling, composition, gel filtration, sedimentation rate, permeation 35. The method according to claim 34, which is detected by pressure or gel electrophoresis. 37. Furthermore, (a) the detectable signal can be generated directly or indirectly Attached a reporter group to at least one of the oligonucleotide probes. , (B) emits a signal from the reporter group in association with hybridization. (C) an extended oligonucleotide probe that is correlated with the presence of labeled DNA. 35. The method of claim 34, also including the step of detecting the presence of a lobe. 38. A correction step was performed to allow the ends to be ligated, so that the 3'end of the first upstream probe The end and / or the 5'end of the first downstream probe through the non-hybridization of the target nucleic acid sequence. 35. The method of claim 34, which comprises extending with a nucleotide complementary to the locus. . 39. A correction step is used to Targeting phorolylated or unsuitable bases with a target-dependent exonucleolytic agent Flow probe from the 5'end and then the upstream probe to a non-high end of the target nucleic acid sequence. 35. Extending with a nucleotide complementary to the bridging intervening portion. The method described in. 40. When the downstream probe hybridizes to the target, it forms a 5'overhang and Positive, but the 5'end of the modified downstream probe was modified to allow the ends of the probe to be ligated. A contract comprising removing said protrusion to abut the 3'end of the upstream probe. The method according to claim 34. 41. A kit for detecting the presence of hepatitis B virus DNA in a test sample Wherein at least one of the probes comprises the composition of claim 27. It is labeled to allow detection and also includes means for detecting the probe. The rare kit. 42. 42. The kit according to claim 41, further comprising a ligase. 43. Furthermore, a polymerase and at least one deoxynucleotide triphosphine 43. A kit according to claim 42, including the supply of a package. 44. Hepatitis B virus under hybridization conditions About 10 to about having a nucleotide sequence capable of hybridizing to the target nucleic acid sequence of A 60 nucleotide oligonucleotide probe, the target sequence of which is SEQ ID NO: One selected from 21, 22, 23, 24 and 25 and their complementary sequences The oligonucleotide probe selected from the above sequences. 45. SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19 or The oligonucleotide pro according to claim 44, which is selected from among these complementary sequences. Move 46. A method for determining the presence of hepatitis B virus DNA in a test sample. The DNA in the test sample is one or more oligonucleotides according to claim 44. Hybridize with the probe and unhybridize the hybridized probe. The presence of hybridized probes. The method comprising: 47. Furthermore, (a) the detectable signal can be generated directly or indirectly Attached a reporter group to at least one of the oligonucleotide probes. , (B) emits a signal from the reporter group in association with hybridization. And (c) detecting the generated signal. 47. The method of claim 46, also including the step of determining the presence of hepatitis B virus by. Method. 48. Furthermore, an amplification step may be performed before or at the same time as the hybridization step. 47. The method of claim 46, which also includes a pop. 49. 49. The method of claim 48, wherein the amplification is LCR or PCR. 50. The kit for detecting hepatitis B virus according to claim 44. Containing one or more oligonucleotides of Labeled as described above, and also includes means for detecting the oligonucleotide. The above kit. 51. 6. A reagent for amplifying hepatitis B virus DNA in a sample is also included. The kit according to 0.