JPH09220090A - New thermolysin-like protease and its use - Google Patents

New thermolysin-like protease and its use

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JPH09220090A
JPH09220090A JP33093896A JP33093896A JPH09220090A JP H09220090 A JPH09220090 A JP H09220090A JP 33093896 A JP33093896 A JP 33093896A JP 33093896 A JP33093896 A JP 33093896A JP H09220090 A JPH09220090 A JP H09220090A
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JP
Japan
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residue
amino acid
thermolysin
benzyloxycarbonyl
protease
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JP33093896A
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Japanese (ja)
Inventor
Kimiko Endo
Satoshi Hanzawa
Shunichi Kidokoro
Toshio Miyake
Masatake Oe
Akimitsu Wada
俊男 三宅
敏 半澤
昭允 和田
俊一 城所
正剛 大江
きみ子 遠藤
Original Assignee
Sagami Chem Res Center
Tosoh Corp
東ソー株式会社
財団法人相模中央化学研究所
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject new enzyme improved in stability, having a thermolysin-like protease activity and useful for highly effectively synthesizing the precursor of an artificial sweetener, aspartame, etc., by changing amino acids at the specific site of thermolysin.
SOLUTION: The volume of a pore expressed by an electron density and surrounded by at least the 144-Leu, 149-Thr, 240-Ala, 270-Ala and 288-Ala in thermolysin having an amino acid sequence of the formula is changed by replacing one or more of the amino acid residues with one or more of amino acid residues having larger hydrophobicity and bulkiness than those of the above amino acid residues or by giving an influence to the amino acid residues surrounding the pore of the electron density to obtain the new thermolysin-like protease in which the pore is partially filled to reduce its volume. The new thermolysin-like protease is improved in stability and useful for the efficient production of a precursor for synthesizing an artificial sweetener, α-L-aspartyl-L- phenylalanine methyl ester (aspartame), etc.
COPYRIGHT: (C)1997,JPO

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、水溶性媒体中でN BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention, N in an aqueous medium
−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸(以降、Z - benzyloxycarbonyl aspartic acid (hereinafter, Z
−Asp、と略記し、このZ−AspはZ−L−Asp -Asp, abbreviated as, the Z-Asp is Z-L-Asp
又はZ−Aspラセミ体を意味する)及びフェニルアラニンメチルエステル(以降、PMと略記し、このPMはL−PM又はPMラセミ体を意味する)のカップリングにサーモライシン様プロテアーゼを使用して、酵素反応によりベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル(以降、Z− Or means a Z-Asp racemate) and phenylalanine methyl ester (hereinafter, abbreviated as PM, the PM uses thermolysin-like protease for coupling means L-PM or PM racemate), enzymatic reactions benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester (hereinafter the, Z-
APMに略記する)を合成する改善された方法に関連する。 Associated with the improved method for synthesizing abbreviated) to APM.

【0002】この発明は高度に安定化された新規なサーモライシン様プロテアーゼにも関連する。 [0002] The present invention also relates to a highly stabilized novel thermolysin-like protease.

【0003】Z−APMは砂糖の約200倍の甘味度を有し、苦味が残らない等の優れた嗜好性を有する重要な人工甘味料であるα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステル(以降、APMと略記する)の合成の前駆体である。 [0003] Z-APM has about 200 times the sweetness of sugar, which is an important artificial sweetener having an excellent palatability, such as bitterness is not left alpha-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester ( thereafter, the precursor of the synthesis of abbreviated as APM).

【0004】 [0004]

【従来の技術】水溶性媒体中でN−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸及びフェニルアラニンメチルエステルのカップリングにサーモライシン様プロテアーゼを使用して、酵素反応によりベンジルオキシカルボニル− Use thermolysin-like protease for coupling the Related Art in aqueous medium N- benzyloxycarbonyl aspartic acid and phenylalanine methyl ester, benzyloxycarbonyl by an enzymatic reaction -
α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルを酵素反応により合成する方法は、特開平8−1 A method of synthesizing by enzymatic reaction alpha-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester, JP-8-1
96292に記載されている。 It is described in the 96,292. このプロセスにおいては、Z−AspとL−PMがほぼ等モル使用され、反応系のpHが4.5〜6.0の範囲であり、高濃度の塩が必要であり、反応中のサーモライシンの活性はかなり高いが、反応開始時と比較して、反応終了時における酵素の活性低下は著しいことが分かっており、この低下は酵素の使用量が大きくなり、コストアップに繋がってしまう。 In this process, Z-Asp and L-PM is used in equimolar amounts substantially in the range of pH of the reaction system 4.5-6.0, it is required high salt, the thermolysin in the reaction Although activity is quite high, compared to the beginning of the reaction has been found to be remarkable reduced activity of the enzyme at the end of the reaction, this decrease becomes larger amount of the enzyme, which leads to cost increase.

【0005】ここで、本発明をさらに理解するために、 [0005] In order to further understand the present invention,
サーモライシン及びその安定性に関する情報を以下に示す。 Thermolysin and information about its stability are shown below.

【0006】サーモライシンはバチルス・サーモプロテオリチカス(Bacillus thermoproteo-lyticus )の培養液中に最初に発見された金属プロテアーゼである(End [0006] thermolysin is the first to be discovered metal protease to the culture medium of Bacillus Thermo proteolipid Chika scan (Bacillus thermoproteo-lyticus) (End
o,S.(1962) J. Fermentation Tech., 40 , 346-353 )。 o, S. (1962) J. Fermentation Tech., 40, 346-353).
そのアミノ酸配列(Titani,K.,etal., (1972) Nature N Its amino acid sequence (Titani, K., etal., (1972) Nature N
ew Biol., 238 , 35-37; EP-A-0418625; Miki, Y.(199 . ew Biol, 238, 35-37; EP-A-0418625; Miki, Y. (199
4),J. Mol. Biol. 160 , 623-639)や三次元構造(Vrien 4), J. Mol. Biol . 160, 623-639) or three-dimensional structure (Vrien
d,G.(1993), J. Computer- Aided Molecular Design, 7 d, G. (1993), J. Computer- Aided Molecular Design, 7
, 367-396 ; Holmes, MA and Mattews, BW,(198 , 367-396; Holmes, MA and Mattews, BW, (198
2), J. Mol.Biol. 160 , 623-639)及び触媒機構(Kester, 2), J. Mol.Biol. 160, 623-639) and catalytic mechanism (Kester,
R.,K., andMattews BW,(1982) J. Biol. Chem. 252 , R., K., AndMattews BW, (1982) J. Biol. Chem. 252,
7704-7710)が記載されている。 7704-7710) have been described.

【0007】これらの記載によると、サーモリラインの分子中に含まれる亜鉛イオンと同様に143番目のグルタミン酸残基及び231番目のヒスチジンが、サーモライシンにおけるプロテアーゼ活性の発現に対して重要であることが指摘された。 [0007] According to these descriptions, thermo Li line likewise of 143rd glutamic acid residue and 231st and zinc ions contained in the molecule of the histidine, pointed out that it is important for the expression of protease activity in thermolysin It has been. これ以後、これらの143番目及び231番目のアミノ酸残基をプロテアーゼ反応に対する触媒残基と略記する。 Since then, these 143 th and 231 th amino acid residue is abbreviated as catalyst residues to the protease reaction.

【0008】サーモライシンと同様のアミノ酸配列を有し、サーモライシンと同じ様な触媒活性を有するプロテアーゼが文献(例えば、Imanaka, et. al., (1986) Nat [0008] have the same amino acid sequence and thermolysin, protease literature have the same kind of catalytic activity and thermolysin (e.g., Imanaka, et. Al., (1986) Nat
ure, 324 , 695-697)に報告された。 ure, 324, was reported to 695-697). サーモライシンのアミノ酸配列の特定の場所に変異を導入することに関する研究も文献(Kubo, M., et al ,(1992) Appl.Environ. Research literature (Kubo relates to the introduction of a mutation in a specific location of the amino acid sequence of thermolysin, M., et al, (1992 ) Appl.Environ.
Microbiol., 58, 3779-3787 )及び特許出願(EP-A- Microbiol., 58, 3779-3787) and patent application (EP-A-
0.616.033)に報告されている。 It has been reported to 0.616.033). その特許出願において、144番目、150番目、187番目及び227番目への変異導入は、酵素活性を向上することが示されている。 In that patent application, 144th, 150th, mutagenesis of the 187 th and 227 th has been shown to improve the enzymatic activity. これ以降、野性型サーモライシンのZ−APM合成活性値の0.2〜10倍活性値が高いプロテアーゼを“サーモライシン様プロテアーゼ”と略記する。 After this, 0.2 to 10 times more active value of Z-APM synthesis activity of wild-type thermolysin is referred to as "thermolysin-like proteases" a high protease.

【0009】この様に、ここで言う“サーモライシン様プロテアーゼ”とは、アミノ酸配列が配列表1に示すアミノ酸配列と一致するプロテアーゼか、又は、配列表1 [0009] In this way, here say the "like protease thermolysin", or protease amino acid sequence is identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or, SEQ ID NO: 1
に示すアミノ酸配列において、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されているプロテアーゼ、又は、一か所もしくはそれ以上の場所に、一残基もしくはそれ以上のアミノ酸残基が挿入されているか、もしくは、一つ以上のアミノ酸残基が脱落しているアミノ酸配列を有する金属プロテアーゼである。 In the amino acid sequence shown in, protease one or more amino acid residues are substituted by another amino acid residue, or, in one place or more locations, one residue or more amino acid residues There are either inserted or a metalloprotease having the amino acid sequence one or more amino acid residues is missing.

【0010】野性型サーモライシンや、その様にして変異を導入したサーモライシンは、中性付近の緩衝液では非常に安定であり、その様なpHでは非常に活性が高い。 [0010] wild type thermolysin or thermolysin introduced with mutations that way is very stable in buffer at around neutral, high such pH, ​​very active. サーモライシン及び“サーモライシン様プロテアーゼ”の安定性は、pHが約4.5〜6の範囲の弱酸中では減少する;サーモライシンはpHが4以下では完全に失活することが知られている。 Stability of thermolysin and "thermolysin-like protease" is reduced in weak acid pH ranging from about 4.5 to 6; thermolysin is known pH is completely inactivated at 4 or less.

【0011】さらに、サーモライシンの安定性は、ベンジルオキシカルボニル−α−アスパラギン酸(以降、Z Furthermore, the stability of thermolysin is benzyloxycarbonyl -α- aspartic acid (hereinafter, Z
−Aspと略記する。 Abbreviated as -Asp. )の濃度により変化することが知られており(特開平8−131170)、その中で、サーモライシンは、30倍以上のモル比でZ−Aspを存在させると安定化し、また、この効果はZ−APMの合成のためのカップリング反応に有利であるかもしれないと記載されている。 ) Concentrations are known to vary with the (JP-A 8-131170), in which, thermolysin stabilizes The presence of Z-Asp in a molar ratio of 30 times or more, also, the effect is Z the coupling reaction for the synthesis of -APM is described as it may be advantageous. しかしながら、この特許においては、長時間に亘るZ−APMの合成の間のサーモライシンの安定性や、非常に低い活性触媒の濃度におけるZ− However, in this patent, stability or thermolysin during the synthesis of Z-APM for a long time, the concentration of very low activity catalyst Z-
APMカップリング生成反応については全く記述されていない。 Not at all description for APM coupling product reaction.

【0012】また、本発明者等の最近の検討により、p [0012] In addition, recent studies by the present inventors, p
H=4.5〜6の範囲では、そのカップリング反応において、この酵素の安定性が十分でなく、0.3モル/リットル以上のZ−Asp濃度でも、このカップリング反応は効率的に実施できないことが明らかとなった。 In the range of H = 4.5 to 6, in the coupling reaction, the stability of this enzyme is not sufficient, even in Z-Asp concentration of 0.3 mol / liter, this coupling reaction is carried out efficiently it can not be revealed.

【0013】一方、文献(Nakanishi et al (1990) App [0013] On the other hand, the literature (Nakanishi et al (1990) App
l. Microbiol. Biotechnol. 32 ,633-636)によると、Z l. Microbiol. Biotechnol. 32, according to 633-636), Z
−Aspの存在はかえってサーモライシンの安定性に悪影響を及ぼすことが示されている。 The presence of -Asp has been shown to be rather adversely affect the stability of thermolysin.

【0014】他方、サーモライシンと反対に、pH=7 [0014] On the other hand, as opposed to the thermolysin, pH = 7
付近でZ−APMの不安定であり、pH=4.5〜6の弱酸中でより安定である。 Unstable of Z-APM in the vicinity, is more stable in weak acid pH = 4.5 to 6.

【0015】pH=7付近でのZ−APMの不安定性とpH=4.5〜6付近でのサーモライシンの不安定性は、サーモライシンを使用するZ−APMの合成を効率良く進めるのに大きな障害となっている。 The instability of thermolysin in the vicinity of instability and pH = 4.5 to 6 in the Z-APM in the vicinity of pH = 7 is a major obstacle to advance efficiently the synthesis of Z-APM to use thermolysin going on. pH=7付近でサーモライシンを使用してZ−AspとPMとのカップリング反応によりZ−APMを合成する場合は、生成したZ−APMと出発原料のPMが分解し、サーモライシンが安定であるが、Z−APMの回収率が低下するという問題がある。 If using thermolysin at pH = 7 near to synthesize Z-APM by a coupling reaction with Z-Asp and PM is, PM and generated Z-APM starting material is decomposed, but thermolysin is stable , there is a problem that recovery of Z-APM is reduced. また、pH=4.5〜6付近でこの反応を実施すると、サーモライシンが活性低下するという傾向があり、原料および生成物は安定であるがZ−AP Further, when carrying out this reaction in the vicinity of pH = 4.5 to 6, thermolysin tends of reduced activity, the raw material and the product are stable but Z-AP
Mの効率的合成は困難である。 Efficient synthesis of M is difficult.

【0016】従って、pH=4.5〜6付近でのサーモライシンの安定性を改善すれば、Z−APMをこのpH [0016] Therefore, if improving the stability of thermolysin in the vicinity of pH = 4.5 to 6, the pH of Z-APM
領域で効率的に合成することができる。 It can be efficiently synthesized in the area.

【0017】先行文献としての(特開平6−18176 [0017] as a prior art (JP-A-6-18176
1)には、144番目ロイシン残基、150番目アスパラギン酸残基、187番目のグルタミン酸残基及び22 The 1), 144th leucine residue, 150th aspartic acid residue, 187th glutamic acid residue and 22
7番目のアスパラギン残基の少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と置換することにより、Z−A 7 th by at least one amino acid residue asparagine residue is substituted with another amino acid residue, Z-A
PM分解及びZ−APM合成に対する酵素活性が改善されたことが開示されている。 That the enzyme activity is improved is disclosed for PM degradation and Z-APM synthesis. ここでは、Z−Asp/P Here, Z-Asp / P
Mのモル比が約0.5であり、pH=7付近でZ−AP M is the molar ratio of about 0.5, Z-AP at around pH = 7
Mが分解又は合成がされた。 M is decomposed or synthesized. しかしながら、このプロテアーゼの安定性、特に、pH=7以下で、Z−Asp/ However, the stability of the protease, in particular, at pH = 7 or less, Z-Asp /
PMのモル比が0.8〜1.7でのZ−APMの合成に使用された場合の安定性については、全く検討されていない。 Molar ratio of PM is about stability when used in the synthesis of Z-APM at 0.8 to 1.7, it has not been studied at all.

【0018】他の先行文献として既述の特開平8−13 [0018] JP-A described above as other prior art documents 8-13
1170には、N−保護アミノ酸の添加による金属プロテアーゼの安定化について開示されている。 The 1170, discloses a stabilized metalloprotease by the addition of N- protected amino acid. ここでは、 here,
Z−Asp/PMのモル比が約0.5であり、pH=6 Z-Asp / PM molar ratio is about 0.5, pH = 6
付近でZ−APMが分解又は合成がされた。 Z-APM is decomposed or synthesized in the vicinity. しかしながら、この文献においても、このプロテアーゼの安定性、 However, in this document, the stability of the protease,
特に、pH=6以下で、Z−Asp/PMのモル比が0.8〜1.7でのZ−APMの合成に使用された場合の安定性については、全く検討されていない。 In particular, in pH = 6 or less, for stability when the molar ratio of Z-Asp / PM is used in the synthesis of Z-APM at 0.8 to 1.7, has not been studied at all.

【0019】 [0019]

【発明が解決しようとする課題】従って、酵素の活性低下を少なくするプロセスの改善が必要性が存在していた。 [SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, an improvement in the process to reduce the activity reduction of the enzyme was present need. さらに、基質のモル比及びpH領域に関してより柔軟な反応条件が期待されている。 Moreover, more flexible reaction conditions are expected of the molar ratio and the pH region of the substrate.

【0020】本発明の目的は、上述の様な課題を解決し、従来のサーモライシン様プロテアーゼの安定性、特に、約4.5〜6.0のpH領域での安定性を向上させ、この安定化されたサーモライシン様プロテアーゼをZ−AspとL−PMとのカップリング反応に使用して、ベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルを合成して、この合成方法の効率を向上する方法を提供することにある。 It is an object of the present invention is to solve the such problem described above, the stability of conventional thermolysin-like proteases, in particular, to improve the stability in the pH range of about 4.5 to 6.0, the stable the reduction has been thermolysin-like protease using the coupling reaction with Z-Asp and L-PM, by synthesizing benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester, the efficiency of this synthetic method to provide a method of improving.

【0021】 [0021]

【課題を解決するための手段】発明者等は、文献(Vrie Means for Solving the Problems The inventors have literature (Vrie
nd,G. and Eijsink, V.(1993), J. Computer-Aided Mol nd, G. and Eijsink, V. (1993), J. Computer-Aided Mol
ecular Design, 7, 367-396; Holmes, MA and Mattew ecular Design, 7, 367-396; Holmes, MA and Mattew
s, BW,(1982), J.Mol.Biol. 160,623-639)に明かにされているサーモライシンの立体構造を詳細に解析した結果、酵素分子中央部に空隙が存在し、この空隙を埋めることが出来れば、サーモリシン様プロテアーゼの安定性を向上させることが可能であることを突き止めた。 s, BW, (1982), J.Mol.Biol. 160,623-639) apparent to has been that the results of analyzing in detail the three-dimensional structure of thermolysin, there is a gap enzyme molecules central portion, to fill this gap if it possible, I have found that it is possible to improve the stability of thermolysin-like proteases. さらに、詳細に検討した結果、そのサーモリシン様プロテアーゼにおいて、144番目のロイシン残基、149番目のスレオニン残基、240番目のアラニン残基、270 Moreover, as a result of detailed examination, in the thermolysin-like proteases, 144th leucine residue, 149th threonine residue, 240th alanine residue, 270
番目のアラニン残基、288番目のアラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性又はかさの大きいアミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与える(その周辺の部位のアミノ酸置換を行う)ことにより、その空孔の少なくとも一部が埋められ、その空孔の容積を減少させることが可能であること、及び、この様なサーモライシン様プロテアーゼは、低pHやZ−Aspの濃度が高い状態において、他のプロテアーゼよりも安定性が優れていることを見出だし、本発明を完成するに至った。 Alanine residue, a pore volume in the electron density surrounded by 288 th alanine residue, one or more amino acid residues of these residues, hydrophobic than its amino acid residues or by being replaced by bulky amino acid residues, or by affecting the amino acid residues surrounding pores of the electron density (perform amino acid substitution sites in and around), at least of the holes some are filled, it is possible to reduce the volume of the pores, and, such thermolysin-like proteases, the concentration of the low pH and Z-Asp is high, stable than other protease onsets saw that sex is better, which resulted in the completion of the present invention.

【0022】即ち、本発明は、水溶性媒体中で、Z−A [0022] Namely, the present invention is, in an aqueous medium, Z-A
spとPMとのカップリング反応にサーモライシン様プロテアーゼを使用する酵素反応によるZ−APMの合成方法において、配列表1のアミノ酸配列を有するサーモライシン中に存在し、少なくとも144番目のロイシン残基、149番目のスレオニン残基、240番目のアラニン残基、270番目のアラニン残基、288番目のアラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及び嵩の大きいアミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与える(その周辺の部位のアミノ酸置換を行う)ことにより、その空孔の少なくとも一部が埋められ、その空孔の容積が減少している新規なサー In Z-APM synthesis method by an enzymatic reaction using thermolysin-like protease in the coupling reaction with sp and PM, present in thermolysin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, at least 144 th leucine residue, 149th threonine residues, 240th alanine residue, 270th alanine residue, the 288-th pore volume in the electron density surrounded by alanine residues, one or more of those residues amino acid residues, by being replaced by large amino acid residues in the hydrophobic and bulk than its amino acid residues, or affect the amino acid residues surrounding pores of the electron density (sites around the by performing amino acid substitutions), is filled at least part of the pores, a novel service that the volume of the pores is reduced リシン様プロテアーゼを使用することを特徴とする酵素反応によるZ−APM合成方法、特に、置換するアミノ酸残基としては、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、 Z-APM synthesizing method according to the enzyme reaction, characterized by the use of lysine-like proteases, in particular, the amino acid residue to be substituted, histidine, isoleucine, leucine, phenylalanine, threonine,
チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基が好ましく、さらに、144番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基又はチロシン残基で置換されることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼを使用することが特に好ましい。 Preferably the amino acid residue selected from the group consisting of tyrosine and valine, further in particular that 144th leucine residue using a novel thermolysin-like proteases, characterized in that it is substituted with a phenylalanine residue or a tyrosine residue preferable.

【0023】以下の表1に、アミノ酸残基のかさの大きさ(単位:cm 3 /mol,文献(Zamyatnin, AA(198 [0023] Table 1 below, the bulk of the amino acid residues size (unit: cm 3 / mol, literature (Zamyatnin, AA (198
4) Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,13, 145-165) からの値)及び疎水性の大きさ(π値,文献(Fauchere, JL 4) Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 13, 145-165) value from) and hydrophobic size ([pi values, literature (Fauchere, JL
and Pliska, V.(1983) Eur.J. Med Chem., 18, 369-37 and Pliska, V. (1983) Eur.J. Med Chem., 18, 369-37
5)からの値)を示す。 5) shows the values) from.

【0024】 [0024]

【表1】 [Table 1]

【0025】この表からも明らかな様に、もとのアミノ酸残基よりもかさの大きなアミノ酸残基を選んで置換すればよく、例えば、144番目のロイシン残基に対しては、チロシン残基及びフェニルアラニン残基が適当であり、フェニルアラニン残基の方が、かさが大きいばかりでなく、疎水性も大きく好ましい。 [0025] As is apparent from this table, it is sufficient to replace Select large amino acid residues of mocha than the original amino acid residue, for example, for the 144th leucine residue, a tyrosine residue and phenylalanine residues are suitable, who phenylalanine residues, not only a large bulk, hydrophobicity significantly preferred. 149番目のスレオニン残基に対しては、チロシン残基及びフェニルアラニン残基の他に、イソロイシン、ヒスチジン及びバリンも適当となる。 For 149th threonine residue, in addition to the tyrosine residues and phenylalanine residues, isoleucine, histidine and valine also becomes appropriate. 特に、ヒスチジン以外はかさが大きいばかりでなく、疎水性も大きく好ましい。 In particular, other than histidine is not only a large bulk, hydrophobicity significantly preferred.

【0026】また、このZ−APMの合成条件として、 [0026] In addition, as the synthesis conditions of the Z-APM,
その水溶性媒体のpH=4.3〜8.0、Z−Asp/ The pH of the aqueous medium = 4.3~8.0, Z-Asp /
PMのモル比が0.8〜1.7(通常は1:2)の範囲、Z−Aspの仕込み濃度が0.2モル/kg以上であることも特徴とし、特開平6−181761に記載されている従来のサーモライシン様プロテアーゼは使用できない様な新規な反応系でのZ−APMの合成に使用する方法にも関する。 PM (usually 1: 2) molar ratio is 0.8 to 1.7 in the range of, also characterized that feeding concentration of Z-Asp is 0.2 mol / kg or more, described in JP-A-6-181761 has been conventional thermolysin-like proteases also relates to a method used in the synthesis of Z-APM in a novel reaction system such as unusable.

【0027】アミノ酸残基を置換する方法としては、特開平6−181761にも記述されているM13ファージ変異生成方法(Vandeyar M.,et al., (1988) Gene, [0027] As a method for replacing an amino acid residue is written by which M13 phage mutagenesis method to JP-6-181761 (Vandeyar M., et al., (1988) Gene,
65 ,129)がある。 65, 129) there is. この方法は、最初に、プラスミドpU In this method, first, the plasmid pU
CTZ55よりSph I− Bam HI断片を取り出し、 CTZ55 removed Sph I- Bam HI fragment from,
制限酵素Sph IとBam HIで消化したM13mp1 It was digested with restriction enzymes Sph I and Bam HI M13mp1
9に組み換えることにより、組み換え体ファージM13 By recombining to 9, recombinant phage M13
TZSp−Bcを作製する。 To produce a TZSp-Bc. この組み換え体ファージM The recombinant phage M
13TZBa−Spを鋳型とし、変異導入プライマーと逆方向プライマーを用いてPCR反応にて両プライマー間を増幅し、得られる変異導入DNA断片を制限酵素 The 13TZBa-Sp as a template, using the mutagenesis primer and a reverse primer to amplify between both primers by PCR reactions, restriction mutagenesis DNA fragments obtained enzyme S
ph IとBam HIにて消化し、プラスミドpUBTZ It was digested with ph I and Bam HI, plasmid pUBTZ
2のSph I− Bam HI断片と置き換え、大腸菌に形質転換することにより変異体が得られる方法である。 Replace the second Sph I- Bam HI fragment is a method variant is obtained by transforming into E. coli.

【0028】組み換え体ファージM13TZBa−Sp [0028] The recombinant phage M13TZBa-Sp
を鋳型とし、順方向変異導入プライマーとM13逆方向変異導入プライマーを用い、PCR反応にて両プライマー間を増幅する(PCR1)。 As a template, using a forward mutagenic primer and the M13 reverse mutagenesis primer, to amplify between both primers by PCR reactions (PCR1). これとは別にM13TZ Apart M13TZ from this
Ba−Spを鋳型とし、逆方向変異導入プライマーとM The Ba-Sp as a template, reverse mutagenesis primer and M
13順方向変異導入プライマーを用い、PCR反応にて両プライマー間を増幅する(PCR2)。 13 using forward mutagenesis primer, to amplify between both primers by PCR reaction (PCR2). 反応液中のプライマーを除去した後、変異導入された両DNA断片とM13順方向変異導入プライマー及びM13逆方向変異導入プライマーを用い、PCR反応にて両DNA断片を伸長させる(PCR3)。 After removal of the primer in the reaction mixture, using both DNA fragments and M13 forward mutagenesis primer and M13 reverse mutagenesis primer introduced mutation, extending the two DNA fragments in the PCR reaction (PCR3). 得られる変異導入されたDN Mutations introduced DN obtained
A断片を制限酵素Sph IとBam HIにて消化し、プラスミドpUBTZ2のSph I− Bam HI断片と置き換え、大腸菌に形質転換することにより変異体が得られる。 Was digested A fragment with restriction enzymes Sph I and Bam HI, and replaced with Sph I- Bam HI fragment of plasmid pUBTZ2, mutants obtained by transforming E. coli. この構築方法を図4に示す。 It shows this construction method in FIG.

【0029】以下の実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限されるものではない。 [0029] To illustrate the present invention by the following examples and comparative examples, but the invention should not be construed as being limited by these examples.

【0030】 [0030]

【実施例】 【Example】

実施例1 前述したサーモライシンと同一のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの遺伝子npr Mを用いた表記プロテアーゼの製造方法について説明する。 Method for producing a representation protease described using gene npr M of protease with the same amino acid sequence and thermolysin with Example 1 above. なお、以下、 npr In the following, npr M
遺伝子にコードされたプロテアーゼを野性型酵素と呼ぶ。 The encoded protease gene is referred to as a wild type enzyme. 即ち、野性型酵素の144番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基またはチロシン残基に置換する方法を述べる。 That describes a method to replace the 144th leucine residue of the wild type enzyme phenylalanine residue or a tyrosine residue.

【0031】 npr Mを含むプラスミドpMK1の1μ [0031] 1μ of plasmid pMK1, including the npr M
gを20マイクロリットルの反応液(50mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5、10mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化ナトリウム、1mM DTT)に於いて、 Bam HI、 Pst Iの各5ユニットにより3 The g reaction solution 20 microliters (50 mM Tris - HCl buffer pH7.5,10mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, 1 mM DTT) In, Bam HI, 3 by each 5 units of Pst I
7℃で2時間分解させた。 It was decomposed 2 hours at 7 ° C.. このサンプルから1%アガロースゲル電気泳動で約3.7kbのDNA断片を分離し、バイオ101社ジーンクリーンDNA精製キットを用いて精製した。 The samples were separated DNA fragment of about 3.7kb in 1% agarose gel electrophoresis from, and purified using BIO 101 Co. GeneClean DNA purification kit.

【0032】一方、プラスミドベクターpUC9の1μ [0032] On the other hand, 1μ of plasmid vector pUC9
gを含む20マイクロリットルの反応液(50mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5、10mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化ナトリウム、1mM DT Reaction of 20 microliters containing g (50 mM Tris - HCl buffer pH7.5,10mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, 1 mM DT
T)に於いて、 Pst I− Bam HIの各5ユニットによって37℃で2時間反応させた。 In T), and allowed to react for 2 hours at 37 ° C. by each 5 units of Pst I- Bam HI.

【0033】このようにして得られたpMK1のnpr [0033] npr of pMK1 obtained in this way
M遺伝子のPst I− Bam HI断片とpUC9のPs Pst of the M gene I- Bam HI fragment and pUC9 of Ps
I− Bam HIの消化物を宝酒造社製DNAライゲーションキットを用いて反応させ、常法にしたがって大腸菌JM109に形質転換し、 npr M遺伝子のPst t I- Digests of Bam HI reacted with Takara Shuzo DNA ligation kit, according to conventional methods and transformed into E. coli JM109, the npr M gene Pst I
Bam HI断片を持つ組換え体プラスミド(pUCT - Bam recombinant plasmid with HI fragment (PUCT
Z55)を得た(図1)。 Z55) was obtained (Figure 1).

【0034】さらにプラスミドpUCTZ55の1μg Furthermore 1μg of plasmid pUCTZ55
を20マイクロリットルの反応液(50mM トリス− The reaction solution of 20 microliters (50 mM Tris -
塩酸緩衝液 pH7.5、10mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化ナトリウム、1mM DTT)において、 Sph I及びBam HIの各5ユニットを加えて37℃で2時間分解させた。 Magnesium HCl buffer pH7.5,10mM chloride, 100 mM sodium chloride, at 1 mM DTT), was decomposed 2 hours at 37 ° C. was added each 5 units of Sph I and Bam HI. このサンプルから1%アガロースゲル電気泳動で約730kbのDNA断片を分離し、バイオ101社ジーンクリーンDNA精製キットを用いて精製した。 The samples were separated DNA fragment of about 730kb in 1% agarose gel electrophoresis from, and purified using BIO 101 Co. GeneClean DNA purification kit.

【0035】一方、ファージベクターM13mp19の1μgを、20マイクロリットルの反応液(50mM On the other hand, the 1μg of phage vector M13mp19, 20 microliters reaction mixture (50 mM
トリス−塩酸緩衝液 pH7.5、10mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化ナトリウム、1mM DT Tris - HCl buffer pH7.5,10mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, 1 mM DT
T)に於いて、 Sph I及びBam HIの各5ユニットを加えて37℃で2時間分解させた。 In T), was decomposed 2 hours at 37 ° C. was added each 5 units of Sph I and Bam HI.

【0036】このようにして得られたnpr M遺伝子の [0036] of the npr M gene obtained in this way
Sph I及びBam HI断片と、M13mp19のSp And Sph I and Bam HI fragment, M13mp19 of Sp
I及びBam HIの分解物とを宝酒造社製DNAライゲーションキットを用いて連結反応を行った。 a degradation product of h I and Bam HI were subjected to ligation reaction using a Takara Shuzo DNA ligation kit. この反応混合物を、通常の方法で大腸菌JM109に形質転換し、 npr M遺伝子のSph I− Bam HI断片を含む組換え体ファージ(M13TZBa−Sp)を得た(図2)。 The reaction mixture was transformed into E. coli JM109 in a conventional manner to obtain a recombinant phage (M13TZBa-Sp) containing Sph I- Bam HI fragment of the npr M gene (Fig. 2).

【0037】得られた組換え体ファージ(M13TZB [0037] The resulting recombinant phage (M13TZB
a−Sp)から、通常の方法で、1本鎖DNAを調製し、アミノ酸置換の導入に用いた。 From a-Sp), in the usual way, the single-stranded DNA was prepared and used for the introduction of amino acid substitutions.

【0038】第144番目のロイシン残基のフェニルアラニンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入用オリゴヌクレオチドを以下のSEQ ID:No. [0038] The 144th SEQ ID following amino acid substitutions introducing oligonucleotides used in the substitution of phenylalanine leucine residues: No. 2に示した。 It is shown in 2.

【0039】 [0039] また、チロシンへの置換に使用されたアミノ酸置換導入用オリゴヌクレオチドを以下のSEQ ID:No. Further, the following SEQ ID amino acid substitutions introducing oligonucleotides used in the substitution of tyrosine: No. 3
に示した。 It was shown to.

【0040】 [0040] これらのオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズ社製380B型DNA合成装置を用いて作成した。 These oligonucleotides were prepared using an Applied Biosystems Model 380B DNA synthesizer.
以下これらを逆方向合成プライマーと呼ぶ。 Hereinafter referred to these as reverse synthetic primer.

【0041】調製した一本鎖DNA0.5μgをPCR [0041] PCR single-stranded DNA0.5μg prepared
反応溶液(67mM トリス(pH8.8)、16.6 The reaction solution (67 mM Tris (pH 8.8), 16.6
mM 硫酸アンモニウム、6.7mM 塩化マグネシウム、10mM 2−メルカプトエタノール、0.2mM mM ammonium sulfate, 6.7 mM magnesium chloride, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.2 mM
dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dT dATP, 0.2mM dGTP, 0.2mM dT
TP、0.2mM dCTP、 1μM 順方向M13 TP, 0.2mM dCTP, 1μM forward M13
ユニバーサルプライマー、1μM 逆方向合成プライマー)に溶かして、1ユニットのTth DNAポリメラーゼを加えて、ミネラルオイルを一滴重層し、変性を9 Universal primer, dissolved in 1μM reverse synthesis primer), the addition of 1 unit Tth DNA polymerase, a mineral oil and one drop overlaid, a modified 9
3℃で1分、アニールを45℃で1分、伸長を72℃で45秒とし、遺伝子の増幅反応を30サイクル繰り返した。 1 min at 3 ° C., 1 min at 45 ° C. The annealing, extension was 45 seconds at 72 ° C., was repeated 30 cycles amplification reaction of the gene. 反応終了後、水層を回収し、常法に従ってフェノール抽出、エタノール沈殿を行い、増幅されたDNAを回収した。 After completion of the reaction, the aqueous layer was recovered, extracted with phenol according to a conventional method, ethanol precipitated, and recovering the amplified DNA. このようにして得られたDNAの半分量を含む20マイクロリットルの反応液(50mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5、10mM 塩化マグネシウム、 The reaction solution (50 mM Tris 20 microliters containing half the amount of DNA obtained in this way - HCl buffer pH7.5,10mM magnesium chloride,
100mM 塩化ナトリウム 1mM DTT)にBa Ba to 100mM sodium chloride, 1mM DTT)
HI、 Sph I各5ユニットを加えて37℃で2時間反応させた。 m HI, reacted for 2 hours at 37 ° C. by adding Sph I each 5 units. このようにして変異の導入されたnpr Introduced npr M in this way, the mutation
遺伝子の約730bp断片を得た。 To obtain about 730bp fragment of the gene.

【0042】一方、三宅らによって既に構築されいるシャトルベクター、即ち、大腸菌及び枯草菌の両方の宿主で形質転換が可能であり、双方の宿主に於いてnpr On the other hand, a shuttle vector that already constructed by Miyake et al., I.e., is capable of transforming both of the host E. coli and B. subtilis, npr M In both host
遺伝子を発現できるすることができるシャトルベクターpUBTZ2(特開平5−184363)をBam Bam H shuttle vectors pUBTZ2 (Hei 5-184363) which can be capable of expressing the gene
I、 Sph Iで処理した7.4kb断片を得た。 I, to give a 7.4kb fragment treated with Sph I. この7.4kb断片と変異の導入された730bp断片とを宝酒造社製DNAライゲーションキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌JM109に形質転換し、変異の導入された組換体プラスミドpUBTZ2(L144 And introduced 730bp fragment of 7.4kb fragment and the mutant is reacted with a Takara Shuzo DNA ligation kit, and transformed into E. coli JM109 according to a conventional method, the recombinant plasmid pUBTZ2 (L144 introduced mutations
F)およびpUBTZ2(L144Y)を得た(図3)。 To give F) and pUBTZ2 the (L144Y) (Figure 3).

【0043】形質転換体大腸菌の生えている寒天培地上にアルカリ溶液(0.2N 水酸化ナトリウム、0.2 The alkaline solution (0.2 N sodium hydroxide on an agar medium has grown transformant E. coli, 0.2
% SDS)3ミリリットルを加えて溶菌させ、1ミリリットルを回収した。 % SDS) were lysed by adding 3 ml were collected One milliliter. この回収した溶液に1ミリリットルの5M−酢酸カリウムを加えて氷中に10分間放置したのち、8000rpmで20分間遠心分離して、沈殿物を除去した。 After standing in ice for 10 minutes the collected solution by adding 1 ml of 5M- potassium acetate, centrifuged 20 min at 8000 rpm, and the precipitate was removed. 得られた上澄みを常法に従ってフェノール処理、エタノール沈殿し、減圧下で乾燥した後、0. Phenol process the resulting supernatant according to a conventional method, ethanol precipitated, dried in vacuo, 0.
2ミリリットルのTE(10mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5),1mM EDTA)に溶解し、プラスミドを得た。 2 ml of TE (10 mM Tris - HCl buffer (pH7.5), 1mM EDTA) were dissolved in to obtain a plasmid. こうして調製したプラスミドを常法に従って枯草菌MT−2株に形質転換し、1%カゼインおよび20μg/ミリリットルのカナマイシンを含む寒天培地に塗布し、140個のハローを形成するコロニーを選択した。 Thus was transformed prepared plasmid Bacillus subtilis MT-2 strain according to a conventional method, was applied to an agar medium containing 1% casein and 20 [mu] g / ml of kanamycin, colonies were selected to form a 140 amino halo.

【0044】これらのコロニーを、それぞれ20μg/ [0044] These colonies, each 20μg /
ミリリットルのカナマイシンを含むLB培地3ミリリットル中、37℃で一夜培養し、培養液から常法に従ってプラスミドpUBTZ2を抽出し、 Bam HI、 Sph During ml LB medium 3 containing kanamycin ml, cultured overnight at 37 ° C., and a plasmid was extracted pUBTZ2 usual manner from the culture solution, Bam HI, Sph
Iで処理を行い、730bpのDNA断片を回収した。 It performs the processing in the I, to recover a DNA fragment of 730bp.
回収したDNA断片の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社(現在は、パーキンエルマー社)製DNAシーケンサー373Aで分析し、144番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基である遺伝子npr M(L14 The recovered DNA fragment nucleotide sequence Applied Biosystems (now Perkin Elmer) and analyzed made DNA Sequencer 373A, 144 th amino acid residue is a phenylalanine residue gene npr M (L14
4F)またはチロシン残基である遺伝子npr M(L1 4F) or a tyrosine residue gene npr M (L1
44Y)を有するコロニーを選択した。 44Y) were selected colonies with.

【0045】このようにして得られる酵素遺伝子を有する菌株から目的の酵素L144F及びL144Yを以下の様に得られた。 [0045] Thus the purpose of the enzyme L144F and L144Y from strains with gene obtained obtained as follows. 即ち、本発明の遺伝子を有する枯草菌MT−2株/pUBTZ2(L144F)又は枯草菌M That is, Bacillus subtilis MT-2 strain / pUBTZ2 having the gene of the present invention (L144F) or Bacillus subtilis M
T−2株/pUBTZ2(L144Y)を、5μg/ミリリットルの濃度でカナマイシンを含む5ミリリットルのLB培地に接種し、培養種として37℃で8時間培養した。 T-2 strain / pUBTZ2 the (L144Y), were inoculated at 5 ml LB medium containing kanamycin at a concentration of 5 [mu] g / ml, and cultured for 8 hours at 37 ° C. as the culture species. その培養種を食塩以外はLB培地の2倍の成分を有する2L培地に接種して、菌株を37℃で20時間培養した。 The culture species other than sodium chloride is inoculated into 2L medium with twice the components of LB medium and incubated 20 hours strain at 37 ° C.. 培養時における培養種の量は、660nmでの培養液の吸光度が0.02の値となる量とした。 The amount of culture species in the culture, the absorbance of the culture at 660nm was an amount that a value of 0.02. 培養後、培養液は、8000rpmにて20分間遠心分離し、培養液の上澄を得てから、その上澄に60%飽和になるように硫安を加えた。 After culturing, the culture was centrifuged for 20 minutes at 8000 rpm, after obtaining a supernatant of the culture solution was added ammonium sulfate to 60% saturation to the supernatant. 得られた溶液は、4℃で16 The resulting solution, 16 4 ° C.
時間放置し、当該酵素は完全に沈殿した。 And standing time, the enzyme was completely precipitated. 酵素を含有する沈殿は8,000rpmにて20分間遠心分離により回収した。 Precipitate containing the enzyme was recovered by centrifugation for 20 minutes at 8,000 rpm. その沈殿を溶解した緩衝液A(10mM トリス−塩酸、 pH9, 10mM 塩化カルシウム、 The precipitate was dissolved in buffer A (10 mM Tris - HCl, pH 9, 10 mM calcium chloride,
0.3M 硫酸アンモニウム)100ミリリットルを20ミリリットルのブチルトヨパールのカラムに、酵素を吸着させるために通し、緩衝液B(10mM トリス−塩酸、 pH9, 10mM 塩化カルシウム)を酵素と不純物を別々に溶離させるために、1.5ミリリットル/分の流速で流した。 0.3M ammonium sulfate) 100 ml of a column 20 ml of Butyl Toyopearl, through to adsorb the enzyme, buffer B (10mM Tris - HCl, eluting pH 9, a 10mM calcium chloride) and enzyme and impurities are separately for, was run at a flow rate 1.5 ml / min. 当該酵素を含有する溶離液を集め、60%飽和硫安にて塩析し、その沈殿を4℃で一夜放置して熟成した。 The eluant was collected containing the enzyme was salted out with 60% saturated ammonium sulfate, was aged by standing overnight the precipitate at 4 ° C.. この沈殿を、10,000rpm This precipitate, 10,000rpm
で10分間遠心分離し、このようにして得られた沈殿を緩衝液C(10mM トリス−塩酸、 pH7.0, In centrifuged for 10 minutes, the precipitate thus obtained was in buffer C (10 mM Tris - HCl, pH 7.0,
10mM 塩化カルシウム, 100mM 塩化ナトリウム)3ミリリットルに溶解し、ゲル濾過カラム(TS 10mM calcium chloride, dissolved in 100mM sodium chloride) 3 ml gel filtration column (TS
K Gel G2000 SW21.5×600mm) K Gel G2000 SW21.5 × 600mm)
及び溶離液としてその緩衝液を使用して、L144F及びL144Yの精製酵素を得た。 And using that buffer as eluent to give the purified enzyme L144F and L144Y.

【0046】実施例2 (新規プロテアーゼの安定性の評価)精製したL144 [0046] (Evaluation of the stability of novel proteases) Example 2 was purified L144
F又はL144Yを0.8MのZ−Aspと10mMの塩化カルシウムを含む0.1Mの酢酸ナトリウムの緩衝液(pH5.0)に溶解し、16時間40℃に保持した後にその溶液中に残存する酵素量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。 F or L144Y was dissolved in a buffer solution of sodium acetate 0.1M containing Z-Asp and 10mM of calcium chloride 0.8 M (pH 5.0), remains in the solution after holding for 16 hours 40 ° C. the amount of enzyme was determined by high performance liquid chromatography. TSKゲル フェニル−5P TSK gel phenyl -5P
W RP(4.6mmI.D.×7.5cm)を高速液体クロマトグラフィーのカラムとして使用し、溶離は、 W RP and (4.6mmI.D. × 7.5cm) was used as a column for high performance liquid chromatography, elution,
アセトニトリルを含有する10mM酢酸カリウムを溶離液として使用し、1.2ミリリットル/分の流速で実施した。 The 10mM potassium acetate containing acetonitrile as eluent was carried out at 1.2 ml / min flow rate. 酵素の検出は、280nmでの光吸収により実施した。 Detection of the enzyme was performed by light absorption at 280 nm. 溶液の培養後の酵素の残存率は図5に示されている。 Residual rate of the enzyme after incubation of the solution is shown in FIG. L144Y酵素とL144F酵素は両方共、サーモライシン様のアミノ酸配列と同じ配列を有する野性型酵素の約2倍の高い残存率を示し、本発明の両方の酵素は高い安定性を有することが明らかとなった。 L144Y enzyme and L144F enzyme Both showed about 2-fold higher residual rate of the wild-type enzyme having the same sequence as thermolysin-like amino acid sequence, both enzymes of the present invention is found to have a high stability It was.

【0047】比較例1 144番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基及びチロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したサーモライシン様プロテアーゼを製造し、実施例2と比較して、それらの安定性を検討した。 [0047] to produce thermolysin-like protease was replaced Comparative Example 1 144th leucine residue at an amino acid residue other than phenylalanine and tyrosine residues, as compared with Example 2, were examined their stability . 以下に示す塩基配列で記載されるランダムプライマーを使用する以外は、実施例1と同様な操作でこれらのプロテアーゼを製造し、プロテアーゼの安定性の検討を実施例2と同様の操作で実施した。 Except using random primers described by nucleotide sequences shown below, Example 1 and making these proteases in a similar operation was conducted stability studies of protease in the same manner as in Example 2.

【0048】 [0048] 144番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基及びチロシン残基以外のアミノ酸残基に置換したプロテアーゼはプラスミドの塩基配列の決定により同定した。 144th proteases leucine residue is substituted with an amino acid residue other than phenylalanine and tyrosine residues was identified by determination of the base sequence of the plasmid.

【0049】それらの安定性の結果は図4に示されている。 The results of their stability is shown in Figure 4. L144T(ロイシン残基がスレオニン残基に置換されている。)及びL144H(ロイシン残基がヒスチジン残基に置換されている。)は、両方とも野性型酵素よりも安定性が高いが、L144F又はL144Yの安定性よりも低いことが明らかとなった。 L144T (leucine residue is substituted with a threonine residue.) And L144H (leucine residue is substituted with a histidine residue.), Both although more stable than the wild type enzyme, L144F or it was revealed lower than the stability of the L144Y. L144Sは野性型酵素の安定性以下であった。 L144S was less than the stability of the wild type enzyme.

【0050】実施例3 Z−APM分解及びZ−APM合成に対して高い活性を有する二重変異体プロテアーゼ(150番目のアスパラギン酸残基をトリプトファン残基に置換し、227番目のアスパラギン残基をヒシチジン残基で置換したD15 [0050] Example 3 Z-APM degradation and Z-APM double mutant protease (150th aspartic acid residue having a high activity against synthesized substituted tryptophan residue, the 227th asparagine residue D15 which was replaced with Hishichijin residue
0W−N227H)を高安定性酵素の製造の出発原料として使用した。 0W-N227H) was used as the starting material for the production of highly stable enzymes.

【0051】形質転換体枯草菌MT−2/pUBTZ2 [0051] transformant Bacillus subtilis MT-2 / pUBTZ2
(D150W−N227H)から、常法に従ってプラスミドを抽出し、この1μgを含む20マイクロリットルの反応液(50mM トリス−塩酸緩衝液 pH7. (D150W-N227H) from extracted plasmid according to a conventional method, the reaction mixture 20 microliters containing the 1 [mu] g (50 mM Tris - HCl buffer pH 7.
5、10mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化ナトリウム、1mM DTT)をAat I及びSph Iの各5ユニットにより37℃で2時間消化させ、さらに7 5,10mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride, 1 mM DTT) for 2 hours digestion at 37 ° C. by each 5 units of Aat I and Sph I, and further 7
0℃で5分間反応させた。 0 were reacted for 5 minutes at ° C.. このサンプルを1%アガロースゲルによる電気泳動により二重の変異を含むD150 The sample by electrophoresis with 1% agarose gel D150 containing a double mutation
W−N227Hの約530bpのDNA断片を得た。 To obtain a DNA fragment of about 530bp of W-N227H.

【0052】一方、実施例1にて作成したL144Fの変異を含むプラスミドpUBTZ21μgをAat I及<br>びSph Iの各5ユニットにより37℃で2時間消化させ、さらに70℃で5分間反応させた。 Meanwhile, 2 hours and digested at 37 ° C. by each 5 units of Aat I及<br> beauty Sph I plasmid pUBTZ21μg containing mutations L144F created in Example 1, was further reacted for 5 minutes at 70 ° C. It was. このサンプルを1%アガロースゲルによる電気泳動によりL144Fの変異を含む約7.6kpのDNA断片を得た。 This sample by electrophoresis with 1% agarose gel to obtain a DNA fragment of about 7.6kp containing mutations L144F.

【0053】プラスミドpUBTZ2(L144F)からこの様にして得られた約7.6kbのDNA断片及びプラスミドpUBTZ2(D150W−N227H)からこの様にして得られた約530bpのDNA断片を宝酒造社製ライゲーションキットを使用して連結させ、この反応混合物を常法に従って、大腸菌JM103に形質転換し、変異の導入された形質転換体JM103/pU [0053] plasmid pUBTZ2 (L144F) from the DNA fragment of about 7.6kb obtained in this manner and plasmid pUBTZ2 (D150W-N227H) from about 530bp of the DNA fragments produced by Takara Shuzo Co., Ltd. ligation kit of which was obtained in this way ligated using usual manner and the reaction mixture was transformed into E. coli JM103, transformants JM103 / pU introduced mutations
BTZ2を得た。 BTZ2 was obtained. 置換したアミノ酸残基は、プラスミドのヌクレオチド配列の同定によって確認した。 Substituted amino acid residues was confirmed by identification of plasmid nucleotide sequence. 図6に組換えプラスミドpUBTZ2(L144F−D150W 6 two sets recombinant plasmid pUBTZ2 (L144F-D150W
−N227H)の構築方法を示す。 It shows how to build a -N227H).

【0054】このプラスミドDNAを使用して実施例1 [0054] Example 1 using this plasmid DNA
と同様に形質転換体枯草菌MT−2/pUBTZ2(L Transformants Bacillus subtilis as with MT-2 / pUBTZ2 (L
144F−D150W−N227H)を作成し、形質転換体枯草菌MT−2/pUBTZ2(L144Y−D1 144F-D150W-N227H) to create a transformant Bacillus subtilis MT-2 / pUBTZ2 (L144Y-D1
50W−N227H)も作成した。 50W-N227H) was also created.

【0055】この形質転換体枯草菌からの二種類の変異体酵素L144F−D150W−N227H及びL14 [0055] Two types from this transformant Bacillus subtilis mutant enzymes L144F-D150W-N227H and L14
4Y−D150W−N227Hの精製は、緩衝液Bの代わりに緩衝液D(10mM トリス−塩酸 pH8. Purification of 4Y-D150W-N227H is buffer D (10 mM Tris, instead of buffer B - HCl pH 8.
5、0.5M 塩酸グアニジン、10mM 塩化カルシウム)を使用した以外は、実施例1に示した方法に従って精製した。 5,0.5M guanidine hydrochloride, except for using 10mM calcium chloride) and purified according to the method shown in Example 1.

【0056】以上のようにして作成した酵素の安定性を実施例2と同様に評価したところ、L144F−D15 [0056] The stability of the enzyme prepared as described above was evaluated in the same manner as in Example 2, L144F-D15
0W−N227H及びL144Y−D150W−N22 0W-N227H and L144Y-D150W-N22
7Hは両方共、野性型酵素や元のD150W−N227 7H are both wild type enzyme and former D150W-N227
Hに比べて、高い安定性を示した。 Compared to H, it showed high stability. 安定性の評価結果を図7に示した。 The evaluation results of the stability shown in FIG.

【0057】実施例4 実施例3の方法で作成したL144F−D150W−N [0057] L144F-D150W-N created by the method of Example 4 Example 3
227Hを使用して実際のZ−APM合成を実施した。 Was performed actual Z-APM synthesis using 227H.
L−PM(189g;712.6mmol)及びZ−A L-PM (189g; 712.6mmol) and Z-A
sp(113g:633.3mmol)を水に溶解して懸濁液を製造した。 sp (113g: 633.3mmol) was prepared a suspension was dissolved in water. 溶液のpHを22%の水酸化ナトリウム溶液で5.3に調整し、155gの塩化ナトリウムを添加した。 pH was adjusted to 5.3 with 22% sodium hydroxide solution solution, sodium chloride was added 155 g. この調製した溶液は透明であった。 The prepared solution was clear. 同時に酵素液を2.5gの酵素と3.36gのCaCl 2を水に添加して調製した。 At the same time an enzyme solution and the CaCl 2 enzyme and 3.36g of 2.5g were prepared by the addition of water.

【0058】この両方の溶液を混合して、酵素カップリング反応を開始した。 [0058] by mixing a solution of both, and initiation of the enzymatic coupling reaction. この混合後の溶液は以下の表2に示される組成となった。 The solution after the mixture became a composition shown in Table 2 below.

【0059】 [0059]

【表2】 [Table 2]

【0060】酵素反応は約13cmの直径を有し、40 [0060] The enzyme reaction has a diameter of about 13cm, 40
℃に保温されたガラス製反応容器中で実施された。 ℃ was performed by incubated been in a glass reaction vessel. この反応器には、底部から0.5cmの所で、液面から2c The reactor, at the bottom of the 0.5 cm, 2c from the liquid surface
mの深さに長さ11cmの羽根を有する可変速度式の攪拌機が設置された。 Variable speed type agitator is installed with a blade length of 11cm to a depth of m. 攪拌速度は反応開始後50分間は1 It is stirring rate 50 minutes after the start of the reaction 1
分間150回転に調節され、それ以降は1分間300回転に調節された。 Min 150 is adjusted to the rotation, thereafter adjusted to 300 revolutions per minute. 反応混合物のpHは反応中連続的に測定され、pHが5.3以上になったら16%の塩酸を添加して、5.3に調整された。 The pH of the reaction mixture is measured continuously during the reaction, the the addition of 16% hydrochloric When the pH becomes 5.3 or more, was adjusted to 5.3. ある時間の後、サンプルを反応容器から取り出し、以下のHPLC操作によりZ Z by some after time, samples are removed from the reaction vessel, the following HPLC Operation
−Asp,L−PM及び残存している酵素の濃度を分析した。 -Asp, and analyzing the concentration of an enzyme that is L-PM and residual.

【0061】Z−AspとL−PMを、G2000SW [0061] The Z-Asp and L-PM, G2000SW
XL(TSK−GEL)カラムを使用するHPLCシステムにより、1ミリリットル/分の流速、25℃で定量した。 By HPLC system using a XL (TSK-GEL) column, 1 ml / min flow rate was quantified at 25 ° C.. 溶離液として、pH=5.6の0.15M酢酸緩衝液を含む70/30のアセトニトリル/水混合液を使用した。 As eluent, using acetonitrile / water mixture 70/30 containing 0.15M acetate buffer pH = 5.6. 溶離成分の検出は254nmで実施した。 Detection of the eluting component was performed at 254 nm. 残存している酵素の濃度もまた、Phenyl−5PW The concentration of remaining in that enzymes are also, Phenyl-5PW
RP(TSK−GEL)カラムを使用するHPLCシステムにより、1.2ミリリットル/分の流速、25℃で定量した。 By HPLC system using a RP (TSK-GEL) column, 1.2 ml / min flow rate was quantified at 25 ° C.. この分析においては、溶離液A(pH=6の酢酸カルシウム緩衝液を含有する5/95のアセトニトリル/水混合液)及び溶離液B(pH=6の酢酸カルシウム緩衝液を含有する60/40のアセトニトリル/水混合液)から成る傾斜溶離液を使用した。 In this analysis, eluent A (the pH = 6 acetonitrile / water mixture of 5/95 containing calcium acetate buffer) and eluent B (60/40 containing calcium acetate buffer at pH = 6 using gradient elution consisting of acetonitrile / water mixture). 以下の様な傾斜を使用した:0〜4分、A/B=90/10,4〜1 It was used following such inclination: 0-4 min, A / B = 90 / 10,4~1
0分、6分間でA/B=90/10から40/60に変化させた。 0 minutes, was changed from A / B = 90/10 to 40/60 in 6 minutes. 溶離した酵素は280nmの吸収で検知した。 The eluted enzyme was detected at 280nm of absorption.

【0062】Z−AspからのZ−APMへの転換率と酵素残存率の関係を表3に示す。 [0062] Table 3 shows the relationship between conversion and enzyme residual ratio of the Z-APM from Z-Asp.

【0063】 [0063]

【表3】 [Table 3]

【0064】比較例2〜3 野生型酵素及び実施例3で得られたD150W−N22 [0064] Comparative Example 2~3 D150W-N22 obtained in the wild-type enzyme and Example 3
7Hを使用し、以下の表4に示される若干異なる組成の溶液を使用して実施例4と同様の操作を実施した。 Using 7H, it was conducted in the same manner as in Example 4 using a solution of slightly different compositions shown in Table 4 below.

【0065】 [0065]

【表4】 [Table 4]

【0066】得られた結果を以下の表5に示す。 [0066] The results obtained are shown in Table 5 below.

【0067】 [0067]

【表5】 [Table 5]

【0068】この表から明らかな様に、本発明の三重変異体酵素(L144F−D150W−N227H)は、 [0068] As is clear from this table, triple mutant enzymes of the present invention (L144F-D150W-N227H) is,
従来の野性型酵素、二重変異体酵素(D150W−N2 Conventional wild type enzyme, the double mutant enzyme (D150W-N2
27H)と比較して安定性が優れていることが明らかとなった。 27H) stability compared to that is better revealed.

【0069】 [0069]

【発明の効果】本発明の新規なサーモライシン様プロテアーゼは、野性型サーモリシや他の変異導入サーモライシン様プロテアーゼ(例えば、150番目のアスパラギン酸残基をトリプトファン残基に置換し、227番目のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換したサーモリシン様プロテアーゼ)よりも安定性に優れ、特に、pH Novel thermolysin-like protease of the present invention exhibits, wild type Samorishi or other mutagenesis thermolysin-like proteases (e.g., the 150th aspartic acid residue is replaced with a tryptophan residue, 227th asparagine residue the excellent stability than thermolysin-like protease) that is substituted with histidine residues, in particular, pH
=5付近での溶液中でも安定である。 = Any solution in the vicinity of 5 is stable. また、このサーモライシン様プロテアーゼは、出発物質Z−AspとL− In addition, the thermolysin-like protease, and the starting material Z-Asp L-
PMのモル比が0.8〜1.7(通常は2)及び反応液のpHが4.3〜3.8(通常は7)のような従来のサーモライシン様プロテアーゼでは使用不可能な新しいZ Molar ratio of PM is 0.8 to 1.7 (usually 2) and new Z such unusable with conventional thermolysin-like proteases as pH of the reaction solution from 4.3 to 3.8 (usually 7)
−APM合成系でも使用が可能である。 Also used in the -APM synthesis system is possible. このような効果により、反応を長時間継続できることや反応後の酵素の回収量が向上することなどの点で優れた効果が発揮される。 Such effect, an excellent effect in terms of the recovery of enzyme and after the reaction that the reaction can be continued for a long time a is improved is exerted.

【0070】尚、本発明における配列表1は以下のように示される。 [0070] Incidentally, SEQ ID NO: 1 in the present invention is shown as follows.

【0071】[配列表] 配列番号:1 配列の長さ:316 配列の型:アミノ酸 トポロジ−:直鎖状 配列の種類:蛋白質 起源:バチルス属 配列 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe G [0071] [Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 sequence Length: 316 SEQ type: amino acid Topology -: linear sequence type: protein Origin: Bacillus sequence Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe G ly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys ly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】プラスミドpMK1からプラスミドpUCTZ FIG. 1 is a plasmid from the plasmid pMK1 pUCTZ
55を構築する工程図である。 Is a process diagram for building 55.

【図2】プラスミドpUCTZ55からM13ファージM13TZBa−Spを構築する工程図である。 2 is a process diagram to construct M13 phage M13TZBa-Sp from the plasmid PUCTZ55.

【図3】M13TZBa−Spを用いてプラスミドpU [Figure 3] using the M13TZBa-Sp plasmid pU
BTZ2上にクローンされたnpr M遺伝子に変異を導入する工程図である。 BTZ2 view illustrating a process of introducing mutations into cloned npr M gene on.

【図4】PCR法による変異導入方法を示す図である。 4 is a diagram showing the mutagenesis method according to the PCR method.

【図5】144番目のロイシン残基を他のアミノ酸残基で置換したサーモライシン様プロテアーゼの安定性を検討した結果を示す図である。 5 is a diagram showing a 144th results leucine residues was studied the stability of thermolysin-like proteases were substituted by other amino acid residues.

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

S:セリン Q:グルタミン C:システイン W:トリプトファン E:グルタミン酸 A:アラニン L:ロイシン N:アスパラギン H:ヒスチジン T:スレオニン F:フェニルアラニン Y:チロシン S: Serine Q: Glutamine C: Cysteine ​​W: Tryptophan E: Glutamic acid A: Alanine L: Leucine N: Asparagine H: Histidine T: Threonine F: Phenylalanine Y: Tyrosine

【図6】144番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に置換したnpr M遺伝子をクローニングしたプラスミドpUBTZ2(L144F)と二重変異体酵素をクローニングしたプラスミドpUBTZ2(D150W [6] 144th plasmid leucine residues were cloned npr M gene was replaced by a phenylalanine residue pUBTZ2 (L144F) and plasmid was cloned double mutant enzyme pUBTZ2 (D150W
−N227H)からプラスミド(L144F−D150 -N227H) from the plasmid (L144F-D150
W−N227H)を構築する工程図である。 W-N227H) are process diagrams for building.

【図7】サーモライシン様プロテアーゼの安定性を測定した結果を示す図である。 FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the stability of thermolysin-like protease.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台1−9−2 (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都赤坂8−11−4 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Shunichi Kidokoro Sagamihara, Kanagawa Prefecture Minamidai 1-9-2 (72) inventor Kimiko Endo Tokyo Machida Kanamori 1733-10 (72) inventor Akiyoshi Wada Tokyo Akasaka 8-11-4

Claims (13)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】水溶性媒体中で、N−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸及びフェニルアラニンメチルエステルとのカップリングにサーモライシン様プロテアーゼを使用する酵素反応によるベンジルオキシカルボニル− 1. A in aqueous medium, N- benzyloxycarbonyl-aspartic acid and benzyloxycarbonyl by enzymatic reaction using thermolysin-like protease for coupling to phenylalanine methyl ester -
    α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法において、配列表1のアミノ酸配列を有するサーモライシン中に存在し、少なくとも144番目のロイシン残基、149番目のスレオニン残基、24 In the synthesis method of alpha-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester, present in thermolysin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, at least 144 th leucine residue, 149th threonine residue, 24
    0番目のアラニン残基、270番目のアラニン残基、2 0 alanine residues, 270th alanine residue, 2
    88番目のアラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の容積を、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及びかさの大きいアミノ酸残基により置換している、又は、 88 th volume of voids in the electron density surrounded by alanine residues, one or more amino acid residues of these residues, hydrophobic and bulky amino acid residue than the amino acid residues It is replaced by a group, or,
    電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響を与えられていることにより、その空孔の少なくとも一部が埋められており、その空孔の容積が減少していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼを使用することを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 By being affecting amino acid residues surrounding pores of the electron density, and at least a part thereof buried in the holes, novel, characterized in that the volume of the pores is reduced benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl -L- synthesis of phenylalanine methyl ester by enzymatic reaction, characterized by the use of thermolysin-like proteases.
  2. 【請求項2】請求項1に記載の合成方法において、電子密度における空孔の容積が、144番目、149番目、 2. A synthesis method according to claim 1, the volume of pores in the electron density, 144th, 149th,
    240番目、270番目及び288番目のアミノ酸残基が、その残基よりも大きなモル容積を有し、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基により置換されており、その空孔の容積が減少していることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 240th, the 270th and 288 th amino acid residue has a greater molar volume than the residue being substituted histidine, isoleucine, leucine, phenylalanine, threonine, with an amino acid residue selected from the group consisting of tyrosine and valine and which, synthetic methods of the pores benzyloxycarbonyl by enzymatic reaction, wherein a volume is reduced in-.alpha.-L-aspartyl -L- phenylalanine methyl ester.
  3. 【請求項3】請求項2に記載の合成方法において、14 3. A synthesis method according to claim 2, 14
    4番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基又はチロシン残基で置換していることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル− 4 leucine residues benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl by enzymatic reaction, characterized in that substituted with a phenylalanine residue or a tyrosine residue -
    L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 Synthesis of L- phenylalanine methyl ester.
  4. 【請求項4】請求項1〜3のいずれかに記載の合成方法において、150番目のアスパラギン酸残基、187番目のグルタミン酸残基及び227番目のアスパラギン残基の少なくとも一つが他のアミノ酸で置換していることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 4. A synthesis method according to any one of claims 1 to 3, the 150th aspartic acid residue, substituted with at least one of the other amino acids 187th glutamic acid residue and 227th asparagine residue benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl -L- synthesis of phenylalanine methyl ester by enzymatic reaction, characterized in that it is.
  5. 【請求項5】請求項1〜4のいずれかに記載の合成方法において、酵素カップリング反応をpHが4.3〜8. 5. A synthesis process according to any one of claims 1 to 4, pH enzymatic coupling reaction from 4.3 to 8.
    0の範囲にあることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 Benzyloxycarbonyl-.alpha.-L-aspartyl -L- synthesis of phenylalanine methyl ester by enzymatic reaction, characterized in that in the range of 0.
  6. 【請求項6】請求項5に記載の合成方法において、N− 6. The synthesis method according to claim 5, N-
    ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸及びL Benzyloxycarbonyl -L- aspartic acid and L
    −フェニルアラニンメチルエステルを酵素カップリングの基質として使用することを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L−アスパルチル−L - phenylalanine methyl ester benzyloxycarbonyl a by enzyme reaction, characterized by using as a substrate for the enzyme coupling-.alpha.-L-aspartyl -L
    −フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 - method of synthesizing phenylalanine methyl ester.
  7. 【請求項7】請求項6に記載の合成方法において、L− 7. The synthesis method according to claim 6, L-
    アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルに対するN−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸のモル比が0.8〜1.7の範囲にあることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α− Benzyloxycarbonyl by enzymatic reactions the molar ratio of N- benzyloxycarbonyl -L- aspartic acid for aspartyl -L- phenylalanine methyl ester, characterized in that in the range of 0.8 to 1.7-.alpha.-
    L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 Synthesis of L- aspartyl -L- phenylalanine methyl ester.
  8. 【請求項8】請求項1〜7のいずれかに記載の合成方法において、N−ベンジルオキシカルボニル−L−アスパラギン酸の濃度が0.2モル/kg以上であることを特徴とする酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α 8. The synthesis method according to claim 1, by an enzymatic reaction in which the concentration of N- benzyloxycarbonyl -L- aspartic acid is characterized in that 0.2 mol / kg or more benzyloxycarbonyl -α
    −L−アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法。 Synthesis method -L- aspartyl -L- phenylalanine methyl ester.
  9. 【請求項9】配列表1のアミノ酸配列を有するサーモライシン中に存在し、少なくとも144番目のロイシン残基、149番目のスレオニン残基、240番目のアラニン残基、270番目のアラニン残基、288番目のアラニン残基により囲まれている電子密度における空孔の容積が、それらの残基の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基よりも疎水性及びかさの大きいアミノ酸残基により置換していることにより、又は、電子密度の空孔を囲むアミノ酸残基に影響していることにより、その空孔の少なくとも一部を埋められ、その空孔の容積が減少していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。 9. present in thermolysin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, at least 144 th leucine residue, 149th threonine residue, 240th alanine residue, 270th alanine residue, 288 th the volume of pores in the electron density surrounded by alanine residues, one or more amino acid residues of these residues by hydrophobic and bulky amino acid residue than the amino acid residues by is substituted, or by influencing the amino acid residues surrounding pores of the electron density, filled with at least a portion of the pores, the volume of the pores is reduced the novel thermolysin-like protease which is characterized.
  10. 【請求項10】請求項9に記載の新規なサーモライシン様プロテアーゼにおいて、電子密度における空孔の容積が、144番目、149番目、240番目、270番目及び288番目のアミノ酸残基が、その残基よりも大きなモル容積を有し、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン及びバリンの群から選ばれるアミノ酸残基に置換していることにより、その空孔の容積が減少していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。 10. A novel thermolysin-like protease according to claim 9, pore volume is 144th in the electron density, 149th, 240th, and 270th and 288 th amino acid residue, the residue It has a larger molar volume than, histidine, isoleucine, leucine, phenylalanine, threonine, by being replaced with an amino acid residue selected from the group consisting of tyrosine and valine, the volume of the pores is reduced the novel thermolysin-like protease which is characterized.
  11. 【請求項11】請求項9に記載の新規なサーモライシン様プロテアーゼにおいて、144番目のロイシン残基がチロシン残基で置換していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。 11. The novel thermolysin-like protease according to claim 9, novel thermolysin-like protease, wherein the 144th leucine residue is substituted with tyrosine residue.
  12. 【請求項12】請求項9に記載の新規なサーモライシン様プロテアーゼにおいて、150番目のアスパラギン酸残基、187番目のグルタミン酸残基及び227番目のアスパラギン残基の少なくとも一つが他のアミノ酸で置換していることを特徴とする新規なサーモライシン様プロテアーゼ。 12. A novel thermolysin-like protease according to claim 9, 150 th aspartic acid residue, at least one of the 187th glutamic acid residue and 227th asparagine residue is replaced with another amino acid the novel thermolysin-like protease, characterized in that there.
  13. 【請求項13】明細書及び実施例に実質的に記載されている酵素反応によるベンジルオキシカルボニル−α−L 13. specification and benzyloxycarbonyl-.alpha.-L by enzymatic reactions are essentially as described in Example
    −アスパルチル−L−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法及び高度に安定化されたサーモライシン様プロテアーゼ。 - aspartyl -L- phenylalanine methyl ester Method and highly stabilized thermolysin-like proteases.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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RU2536255C2 (en) * 2007-11-01 2014-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Production of thermolysin and its versions, and its use in liquid detergents

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