JP2009183278A - Mutant-type protease and peptide synthesis method using the peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、変異型プロテアーゼに関する。また該プロテアーゼを用いたペプチド合成方法に関する。特に、アスパルテーム前駆体であるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、「Z-Asp-PheOMe」とも称する）の合成方法に関する。 The present invention relates to a mutant protease. The present invention also relates to a peptide synthesis method using the protease. In particular, the present invention relates to a method for synthesizing benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (hereinafter also referred to as “Z-Asp-PheOMe”), which is an aspartame precursor.
工業的に有用なプロテアーゼとして、サーモライシンが知られている。サーモライシンは、洗剤、食品製造、化粧品等の分野で使用され、特に、人工甘味料の一種であるアスパルテームの前駆体Z-Asp-PheOMeの合成等に使用されている(特許文献１参照)。 Thermolysin is known as an industrially useful protease. Thermolysin is used in the fields of detergents, food production, cosmetics, and the like, and is particularly used for the synthesis of aspartame precursor Z-Asp-PheOMe, which is a kind of artificial sweetener (see Patent Document 1).
サーモライシンは優れた酵素であるが、一分子あたりカルシウムイオンが４個存在するため、酵素反応を安定して行うためには、反応系内のカルシウムイオンの存在が重要となる（非特許文献１参照）。 Thermolysin is an excellent enzyme, but since there are four calcium ions per molecule, the presence of calcium ions in the reaction system is important in order to carry out the enzyme reaction stably (see Non-Patent Document 1). ).
そのため、通常、サーモライシンを用いてペプチド合成反応を行う場合には、反応溶液中にカルシウムイオンを過剰に添加している（非特許文献２参照）。特にサーモライシンを用いてアスパルテーム前駆体等を連続的に製造する場合には、基質となるN-ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（Z-Asp）等のキレート作用によりサーモライシンのカル
シウムイオンが除去されるため、反応液にカルシウムイオンを添加し続けることが必要である（非特許文献３及び４参照）。
Therefore, normally, when performing a peptide synthesis reaction using thermolysin, an excessive amount of calcium ions is added to the reaction solution (see Non-Patent Document 2). In particular, when aspartame precursors are continuously produced using thermolysin, the calcium ions of thermolysin are removed by chelating action of N-benzyloxycarbonylaspartic acid (Z-Asp) as a substrate. It is necessary to continue adding calcium ions to the liquid (see Non-Patent Documents 3 and 4).
一方、カルシウムイオンはZ-Asp等と難溶性の塩を形成し、設備にスケーリングを起こ
すことが示唆されている（非特許文献５参照）。従って、サーモライシンを用いて反応を行う場合には、定期的に反応容器を洗浄することが必要である。
On the other hand, it has been suggested that calcium ions form a sparingly soluble salt with Z-Asp and the like, causing scaling of the equipment (see Non-Patent Document 5). Therefore, when the reaction is performed using thermolysin, it is necessary to periodically wash the reaction vessel.
一方、ペプチド合成に有用な酵素として、微生物Pseudomonas aeruginosa PST-01株が
産生するPST-01プロテアーゼが知られている（非特許文献６参照）。
On the other hand, as an enzyme useful for peptide synthesis, PST-01 protease produced by the microorganism Pseudomonas aeruginosa PST-01 strain is known (see Non-Patent Document 6).
PST-01プロテアーゼ遺伝子は、既にクローニングされ、塩基配列も明らかにされている(非特許文献７参照)。 The PST-01 protease gene has already been cloned and the nucleotide sequence has been clarified (see Non-Patent Document 7).
PST-01プロテアーゼは、一分子あたりカルシウムイオンを１個含み、当該カルシウムイオンは容易に離脱しないため、カルシウムイオンを添加する必要は特にない。従って、サーモライシンを用いた場合のような反応容器の洗浄も実質的に不要である。 PST-01 protease contains one calcium ion per molecule, and the calcium ion does not easily leave, so it is not particularly necessary to add calcium ion. Therefore, it is substantially unnecessary to clean the reaction vessel as in the case of using thermolysin.
但し、PST-01プロテアーゼを用いたZ-Asp-PheOMe合成反応は、サーモライシンを用いた場合と比べて、反応速度が遅い。
本発明は、優れたペプチド合成活性を有し、かつ、反応容器の定期的な洗浄を実質的に不要とする新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼを用いたペプチド合成方法を提供することを主な課題とする。 The main object of the present invention is to provide a novel protease having excellent peptide synthesis activity and substantially eliminating the need for periodic washing of a reaction vessel, and a peptide synthesis method using the protease. .
本発明は、上記課題を解決することを主な目的として検討を重ねた結果、PST-01プロテアーゼの変異体が、優れたペプチド合成活性を有することを見出し、更に検討を重ねて完成するに至った。 As a result of repeated studies with the main purpose of solving the above-mentioned problems, the present invention has found that a mutant of PST-01 protease has excellent peptide synthesis activity, and has been completed through further studies. It was.
即ち、本発明は、以下の変異型プロテアーゼ、該プロテアーゼを用いたペプチド合成方法、及びZ-Asp-PheOMeの合成方法に関する。 That is, the present invention relates to the following mutant protease, a peptide synthesis method using the protease, and a Z-Asp-PheOMe synthesis method.
項１：配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンが、セリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されている変異型プロテアーゼ。 Item 1: A variant of a protease having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine which is the 114th amino acid residue in the amino acid sequence is serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine , A mutant protease substituted with any one amino acid selected from the group consisting of isoleucine, lysine, methionine, proline, threonine, leucine, tryptophan and valine.
項１に含まれる変異型プロテアーゼの１つとして、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンが、アラニン、バリン又はロイシンに置換されている変異型プロテアーゼ。 As one of the mutant proteases included in Item 1, a protease mutant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine which is the 114th amino acid residue in the amino acid sequence is alanine, valine Or a mutant protease substituted with leucine.
特に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがアラニンに置換されている変異型プロテアーゼ。換言すると、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する変異型PST-01プロテアーゼ。 In particular, a mutant protease having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine, the 114th amino acid residue in the amino acid sequence, is substituted with alanine. In other words, a mutant PST-01 protease having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
項２：配列表の配列番号１のアミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンが、セリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、トレオニン及びロイシンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されている項１に記載の変異型プロテアーゼ。 Item 2: Tyrosine, the 114th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is any one amino acid selected from the group consisting of serine, arginine, alanine, cysteine, histidine, methionine, threonine, and leucine Item 2. The mutant protease according to Item 1, wherein
項３：配列表の配列番号１のアミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されている項１に記載の変異型プロテアーゼ。 Item 3: Tyrosine, the 114th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is substituted with any one amino acid selected from the group consisting of serine, arginine, alanine, cysteine, histidine and methionine Item 2. A mutant protease according to Item 1.
項４：更に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列における114番目以外の１又は数個の
アミノ酸が欠失、置換又は付加されている、項１〜３に記載の変異型プロテアーゼ。
Item 4: The mutant protease according to Items 1 to 3, wherein one or several amino acids other than position 114 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are deleted, substituted, or added.
換言すると、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換され、かつ114番目以外の１又は数個の
アミノ酸が欠失、置換又は付加されている、項１〜３に記載の変異型プロテアーゼ。
In other words, a variant of a protease having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine which is the 114th amino acid residue in the amino acid sequence is serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, It is substituted with any one amino acid selected from the group consisting of isoleucine, lysine, methionine, proline, threonine, leucine, tryptophan and valine, and one or several amino acids other than 114 are deleted, substituted or added Item 4. The mutant protease according to Items 1 to 3.
項４に含まれる変異型プロテアーゼの一つとして、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがアラニン、バリン又はロイシンに置換され、かつ114番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている変異型プロテアーゼ。 One of the mutant proteases included in Item 4 is a protease mutant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine as the 114th amino acid residue in the amino acid sequence is alanine, valine or A mutant protease in which leucine is substituted and one or several amino acids other than 114 are deleted, substituted or added.
特に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼの変異型であって、該アミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがアラニンに置換され、かつ114番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている、項１に記載の変異型プロテアーゼ。換言すると、配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている変異型PST-01プロテアーゼ。 In particular, a variant of a protease having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, wherein tyrosine, the 114th amino acid residue in the amino acid sequence, is substituted with alanine, and one or several other than the 114th amino acid sequence Item 2. The mutant protease according to Item 1, wherein the amino acid is deleted, substituted or added. In other words, a mutant PST-01 protease in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
また、項４に含まれる変異型プロテアーゼの一つとして、配列表の配列番号１のアミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンが、セリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、トレオニン及びロイシンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換され、かつ114番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている変異型プロテアーゼ。 Moreover, as one of the mutant proteases included in Item 4, tyrosine, which is the 114th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is serine, arginine, alanine, cysteine, histidine, methionine, threonine and A mutant protease in which any one amino acid selected from the group consisting of leucine is substituted, and one or several amino acids other than the 114th amino acid are deleted, substituted or added.
また、項４に含まれる変異型プロテアーゼの一つとして、配列表の配列番号１のアミノ酸配列における114番目のアミノ酸残基であるチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン及びメチオニンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換され、かつ114番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されている変異型プロテアーゼ。 In addition, as one of the mutant proteases included in Item 4, tyrosine, which is the 114th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, is selected from the group consisting of serine, arginine, alanine, cysteine, histidine, and methionine. A mutant protease in which any one selected amino acid is substituted, and one or several amino acids other than the 114th amino acid are deleted, substituted or added.
好ましくは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列における129番目、132番目、137番目
、142番目、148番目、186番目、187番目、190番目及び197番目から選ばれる１以上のアミノ酸が更に置換されている、項１〜３のいずれかに記載の変異型プロテアーゼ。
Preferably, one or more amino acids selected from the 129th, 132nd, 137th, 142th, 148th, 186th, 187th, 190th and 197th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are further substituted. Item 4. The mutant protease according to any one of Items 1 to 3.
項５：ペプチドの合成方法であって、項１〜４のいずれかに記載の変異型プロテアーゼを、アミノ酸及びその誘導体から選ばれる１種以上を含む基質溶液に接触させる工程を含む方法。 Item 5: A method for synthesizing a peptide, comprising the step of bringing the mutant protease according to any one of Items 1 to 4 into contact with a substrate solution containing one or more selected from amino acids and derivatives thereof.
項６：ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの合成方法であって、
項１〜４のいずれかに記載の変異型プロテアーゼを、ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルを含有する基質溶液に接触させる工程を含む方法。
Item 6: A method for synthesizing benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester,
Item 5. A method comprising contacting the mutant protease according to any one of Items 1 to 4 with a substrate solution containing benzyloxycarbonyl-α-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester.
以下、本発明について、詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
１．変異型PST-01プロテアーゼ
本発明のプロテアーゼは、PST-01プロテアーゼの有する配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、114番目のチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する。
1. Mutant PST-01 Protease The protease of the present invention is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of PST-01 protease, wherein the 114th tyrosine is serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine. , Isoleucine, lysine, methionine, proline, threonine, leucine, tryptophan, and valine.
例えば、PST-01プロテアーゼの有する配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、114番目のチロシンがアラニンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは、配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。
For example, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is substituted with alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of PST-01 protease is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Have an amino acid sequence.
PST-01プロテアーゼの有する配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、114番目のチロシンがバリンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは、配列表の配列
番号３で表されるアミノ酸配列を有する。
In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing possessed by PST-01 protease, the mutant PST-01 protease in which 114th tyrosine is substituted with valine is the amino acid represented by SEQ ID NO: 3 of the sequence listing. Has an array.
PST-01プロテアーゼの有する配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、114番目のチロシンがロイシンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは、配列表の配
列番号４で表されるアミノ酸配列を有する。
In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing of the PST-01 protease, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is replaced by leucine is the amino acid represented by SEQ ID NO: 4 of the sequence listing. Has an array.
製造方法
本発明のプロテアーゼは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするPST-01プロテアーゼ遺伝子において、PST-01プロテアーゼアミノ酸配列における114番目のチロシン残基をコードする部分を対応するアミノ酸をコードする塩基配列に置換した遺伝子を用いて、製造することができる。
Production method The protease according to the present invention is a PST-01 protease gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, wherein the amino acid sequence corresponding to the portion encoding the 114th tyrosine residue in the PST-01 protease amino acid sequence Can be produced using a gene substituted with a nucleotide sequence encoding.
例えば、114番目のチロシンがアラニンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼで
あれば、PST-01プロテアーゼ遺伝子において、PST-01プロテアーゼアミノ酸配列における114番目のチロシン残基をコードする部分をアラニンをコードする塩基配列に置換した遺
伝子を用いて、製造することができる。
For example, in the case of a mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is substituted with alanine, the portion encoding the 114th tyrosine residue in the PST-01 protease amino acid sequence is replaced with alanine in the PST-01 protease gene. It can be produced using a gene substituted with a base sequence to be encoded.
また例えば、114番目のチロシンがバリンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼ
であれば、PST-01プロテアーゼ遺伝子において、PST-01プロテアーゼアミノ酸配列における114番目のチロシン残基をコードする部分をバリンをコードする塩基配列に置換した遺
伝子を用いて、製造することができる。
Further, for example, in the case of a mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is substituted with valine, the portion encoding the 114th tyrosine residue in the PST-01 protease amino acid sequence in the PST-01 protease gene Can be produced using a gene substituted with a nucleotide sequence encoding.
例えば、114番目のチロシンがロイシンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼで
あれば、PST-01プロテアーゼ遺伝子において、PST-01プロテアーゼアミノ酸配列における114番目のチロシン残基をコードする部分を、ロイシンをコードする塩基配列に置換した
遺伝子を用いて、製造することができる。
For example, if the 114th tyrosine is a mutant PST-01 protease in which leucine is substituted, the portion encoding the 114th tyrosine residue in the PST-01 protease amino acid sequence in the PST-01 protease gene Can be produced using a gene substituted with a nucleotide sequence encoding.
PST-01プロテアーゼ遺伝子としては、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。例えば、PST-01プロテアーゼ遺伝子としては、非特許文献７（Biochemical Engineering Journal, 5 (2000) 191-200）に開示されている方法に従っ
て取得したPseudomonas aeruginosaPST-01株由来のPST-01プロテアーゼ遺伝子を挙げることができる。
Examples of the PST-01 protease gene include a gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing. For example, as the PST-01 protease gene, a PST-01 protease gene derived from Pseudomonas aeruginosa PST-01 strain obtained according to the method disclosed in Non-Patent Document 7 (Biochemical Engineering Journal, 5 (2000) 191-200) is exemplified. be able to.
また、PST-01プロテアーゼ遺伝子は、例えば、ホスファイト トリエステル法 (Nature,310, 105 (1984))等の常法に従って、又はDNA シンセサイザーによって、配列表の配列番号５で表される塩基配列の全部又は一部を合成する等の方法により取得することもできる。 In addition, the PST-01 protease gene has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing according to a conventional method such as the phosphite triester method (Nature, 310, 105 (1984)) or by a DNA synthesizer. It can also be obtained by a method such as synthesizing all or a part.
また、Pseudomonas aeruginosa PST-01株と類似の性質を有する微生物から産生された
プロテアーゼや、PST-01プロテアーゼにおいて１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加しているプロテアーゼをコードする遺伝子を利用して取得することも可能である。
In addition, it uses proteases produced from microorganisms with similar properties to Pseudomonas aeruginosa PST-01 strains, and genes encoding proteases in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in PST-01 protease It is also possible to obtain it.
PST-01プロテアーゼ遺伝子において、114番目のチロシン残基をコードする部分を、セリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸をコードする配列に置換する方法としては、例えば、Kunkelの方法 (T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)）、ダブルプライマー法 (P. Carter, H. Bedouelle, G. Winter, Nucleic Acid Res., 13, 4431 (1985)) 、チオヌクレオチドを用いる方法 (J. W. Taylor, J. Ott, F. Eckstern, Nucleic Acid Res., 13, 8764 (1985))、カセット変異導入法（J. A. Wells, et al., Gene, 34, 315 (1985)）等の方法を採ることができる。また、市販の遺伝子変異用キットを用いることも可能である。 In the PST-01 protease gene, the portion encoding the 114th tyrosine residue is defined as serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, leucine, tryptophan and valine. As a method for substitution with a sequence encoding any one amino acid selected from the group consisting of, for example, the method of Kunkel (TA Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)), double Primer method (P. Carter, H. Bedouelle, G. Winter, Nucleic Acid Res., 13 , 4431 (1985)), method using thionucleotide (JW Taylor, J. Ott, F. Eckstern, Nucleic Acid Res., 13 , 8764 (1985)), cassette mutagenesis method (JA Wells, et al., Gene, 34 , 315 (1985)) and the like. It is also possible to use a commercially available gene mutation kit.
具体的な置換方法の一例を挙げると、PST-01プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、置換したい塩基を含む一対の変異プライマーと、DNAポリメラーゼを用いて、伸
張反応を繰り返し、更に制限酵素を用いて鋳型を消化することにより、部位特異的変異された遺伝子を含むプラスミドを得て、目的とする変異が導入されたPST-01プロテアーゼ遺伝子を得ることができる。
An example of a specific replacement method is that a plasmid containing the PST-01 protease gene is used as a template, a pair of mutation primers containing the base to be replaced and a DNA polymerase are used to repeat the extension reaction, and further a restriction enzyme is used. By digesting the template, a plasmid containing the site-specific mutated gene can be obtained, and the PST-01 protease gene into which the target mutation has been introduced can be obtained.
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをアラニンに置換するための変異プライマーは、常法に従って適宜設計できるが、例えば、配列番号７に記載の塩基配列を有するプライマー及び配列番号８に記載の塩基配列を有するプライマーを用いることができる（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号７：GTGGAGAACGCCgcCTGGGACGGCACG
配列番号８：CGTGCCGTCCCAGgcGGCGTTCTCCAC
A mutation primer for substituting tyrosine, which is the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with alanine can be appropriately designed according to a conventional method. For example, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: A primer having the base sequence described in 8 can be used (lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 7: GTGGAGAACGCCgcCTGGGACGGCACG
Sequence number 8: CGTGCCGTCCCAGgcGGCGTTCTCCAC
変異型PST-01プロテアーゼは、上記のように変異を導入したPST-01プロテアーゼ遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、該ベクターを用いて適当な宿主の形質転換を行い、得られた形質転換体により産生されたプロテアーゼを回収することにより、得ることができる。 The mutant PST-01 protease is constructed by constructing an expression vector using the PST-01 protease gene into which the mutation has been introduced as described above, and transforming an appropriate host using the vector. It can obtain by collect | recovering the protease produced by.
発現ベクターの種類は、かかる変異遺伝子を発現し得るものであれば特に限定されず、例えば、ファージ、プラスミド、コスミド等を用いることができる。好ましいベクターとしては、大腸菌や枯草菌由来のプラスミドを挙げることができる。 The type of expression vector is not particularly limited as long as it can express such a mutated gene. For example, phages, plasmids, cosmids and the like can be used. Preferred vectors include plasmids derived from E. coli and Bacillus subtilis.
また、発現ベクターには、変異型プロテアーゼ遺伝子を効率良く発現させるために、プロモーター、選択マーカー、及び複製起点等を適宜含めることもできる。 In addition, in order to efficiently express the mutant protease gene, the expression vector may appropriately include a promoter, a selection marker, a replication origin, and the like.
発現ベクターの構築方法は、公知の方法に従って、適宜行うことができる。 The construction method of the expression vector can be appropriately performed according to a known method.
発現ベクターで形質転換を行う宿主は、選択した発現ベクターの種類に応じて適宜決定することができる。例えば、大腸菌由来のベクターであれば、宿主として大腸菌を用いることができる。また枯草菌由来のベクターであれば、宿主として枯草菌を用いることができる。 The host to be transformed with the expression vector can be appropriately determined according to the type of the selected expression vector. For example, in the case of a vector derived from E. coli, E. coli can be used as a host. Moreover, if it is a vector derived from Bacillus subtilis, Bacillus subtilis can be used as a host.
また、形質転換は、選択した発現ベクター又は宿主の種類に応じ、公知の方法に従って、適宜行うことができる。 Further, transformation can be appropriately performed according to a known method according to the selected expression vector or host.
得られた形質転換体を培地に培養し、かかる培養物からプロテアーゼ活性を有する酵素を採取することにより、変異型プロテアーゼを取得することができる。 By culturing the obtained transformant in a medium and collecting an enzyme having protease activity from the culture, a mutant protease can be obtained.
培地等の培養条件及び培養物の回収方法は、宿主の種類等に応じて適宜設定し得る。 The culture conditions such as the medium and the culture recovery method can be appropriately set according to the type of the host.
また、培養温度及び培養時間も宿主の種類に応じて決定されるが、大腸菌とする場合は、通常培養温度は10〜40℃、好ましくは20〜37℃程度であり、培養時間は、1〜30時間、
好ましくは2〜12時間程度である。
In addition, the culture temperature and the culture time are also determined according to the type of the host. When Escherichia coli is used, the culture temperature is usually 10 to 40 ° C., preferably about 20 to 37 ° C., and the culture time is 1 to 30 hours,
Preferably it is about 2 to 12 hours.
上記培養により得られる培養物から、酵素を回収する方法は、常法に従って行うことができる。 The method for recovering the enzyme from the culture obtained by the above culture can be performed according to a conventional method.
例えば、宿主が菌体外にプロテアーゼを分泌する場合は、培養物を遠心分離し、培養上清を得、得られた培養上清を粗酵素溶液として用いることができる。 For example, when the host secretes protease outside the cells, the culture is centrifuged to obtain a culture supernatant, and the obtained culture supernatant can be used as a crude enzyme solution.
また、菌体外に分泌されない場合には、超音波破砕などによって菌体を破砕し、遠心分離を行って、粗酵素溶液を得ることができる。 Moreover, when it is not secreted outside a microbial cell, a microbial cell is crushed by ultrasonic crushing etc., Centrifugation can be performed and a crude enzyme solution can be obtained.
粗酵素溶液から、変異型プロテアーゼの単離精製を行う方法も、常法に従って行うことができる。 A method for isolating and purifying the mutant protease from the crude enzyme solution can also be performed according to a conventional method.
具体的には、硫酸アンモニウムを用いた塩析、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、透析法、疎水クロマトグラフィー、又はこれらの組合せ等を用いることができる。 Specifically, salting out using ammonium sulfate, electrophoresis, affinity chromatography, dialysis, hydrophobic chromatography, or a combination thereof can be used.
このように、変異型PST-01プロテアーゼは、変異型PST-01プロテアーゼ遺伝子を構築することによって、取得することができる。 Thus, a mutant PST-01 protease can be obtained by constructing a mutant PST-01 protease gene.
また、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、114番目のアミノ酸がアラニン、
アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換された配列を、ペプチドシンセサイザー等を用いてペプチド合成することにより、または、無細胞タンパク質合成法を利用して合成することにより、取得することもできる。
Also, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 114th amino acid is alanine,
Using a peptide synthesizer or the like, a sequence in which any one amino acid selected from the group consisting of arginine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, tryptophan and valine is substituted It can also be obtained by peptide synthesis or by synthesis using a cell-free protein synthesis method.
配列
本発明の変異型プロテアーゼは、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において114番目のチロシンに相当するアミノ酸が対応するアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を
有する。
Sequence The mutant protease of the present invention has an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to the 114th tyrosine is substituted with the corresponding amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
例えば、114番目のチロシンがアラニンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは
、114番目の配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において114番目のチロシンに相当するアミノ酸がアラニンであるアミノ酸配列、即ち、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する。
For example, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is substituted with alanine is an amino acid in which the amino acid corresponding to the 114th tyrosine is an alanine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the 114th sequence listing The sequence has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明の変異型プロテアーゼは、本発明の効果を奏する範囲内であれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における114番目のチロシン以外の１又は数個のアミノ酸
が、欠失、置換又は付加されていてもよい。
In the mutant protease of the present invention, one or several amino acids other than the 114th tyrosine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. It may be substituted or added.
換言すると、本発明の変異型プロテアーゼは、
（１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において114番目のチロシンに相当
するアミノ酸がセリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、又は、
（２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、114番目のチロシンに相
当するアミノ酸がセリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換されており、かつ、114番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加により変異されているアミノ酸配列を有するプロテアーゼを含む。
In other words, the mutant protease of the present invention is
(1) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the amino acid corresponding to the 114th tyrosine is serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, proline, threonine, leucine , An amino acid sequence substituted with any one amino acid selected from the group consisting of tryptophan and valine, or
(2) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the amino acid corresponding to the 114th tyrosine is serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, proline, serine, An amino acid sequence that is substituted by any one amino acid selected from the group consisting of threonine, leucine, tryptophan, and valine, and that one or several amino acids other than the 114th amino acid are mutated by deletion, substitution, or addition A protease having
114番目以外の変異部位としては、例えば、129番目、132番目、137番目、142番目、148番目、186番目、187番目、190番目及び197番目から選ばれる１以上の部位が挙げられる。 Examples of mutation sites other than the 114th include one or more sites selected from the 129th, 132nd, 137th, 142th, 148th, 186th, 187th, 190th and 197th.
具体的に、114番目以外の変異としては、例えば、132番目のアミノ酸のフェニルアラニンへの置換や、148番目のアミノ酸のアスパラギン、ヒスチジン又はトリプトファンへの
置換などが挙げられる。これらの変異は、ペプチド合成活性や酵素の安定性等を改善し得る。
Specifically, examples of mutations other than the 114th include substitution of the 132nd amino acid with phenylalanine and substitution of the 148th amino acid with asparagine, histidine or tryptophan. These mutations can improve peptide synthesis activity, enzyme stability, and the like.
また、142番目のアミノ酸のセリンへの置換や、197番目のアミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン又はチロシンへの置換などが挙げられる。これらの変異は、酵素活性を更に向上させ得る。 Examples include substitution of the 142nd amino acid with serine and substitution of the 197th amino acid with glycine, alanine, valine, phenylalanine or tyrosine. These mutations can further improve enzyme activity.
また、190番目のアミノ酸のバリンへの置換などが挙げられる。 Moreover, the substitution of the 190th amino acid to valine, etc. are mentioned.
性質
本発明の変異型プロテアーゼは、ペプチド合成活性やエステル合成活性に優れ、ペプチド合成反応やエステル合成反応の触媒として利用し得る。
Properties The mutant protease of the present invention is excellent in peptide synthesis activity and ester synthesis activity, and can be used as a catalyst for peptide synthesis reaction and ester synthesis reaction.
本発明の変異型プロテアーゼは、Z-Asp-PheOMeの合成において、高い合成活性を奏し、かつ、優れた反応速度を奏する。 The mutant protease of the present invention exhibits high synthetic activity and excellent reaction rate in the synthesis of Z-Asp-PheOMe.
特に、114番目のチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、トレオニン又はロイシンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは、一段と優れた反応速度を示す。 In particular, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is substituted with serine, arginine, alanine, cysteine, histidine, methionine, threonine, or leucine shows a much better reaction rate.
更に、114番目のチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン又はメチオニンに置換されている変異型PST-01プロテアーゼは、より優れた反応速度を示し、サーモライシンよりも速い反応初速度を有する。 Furthermore, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine is replaced with serine, arginine, alanine, cysteine, histidine or methionine shows a better reaction rate and a faster initial reaction rate than thermolysin.
また、サーモライシン（Thermolysin）を用いた反応は、カルシウムイオンの添加が必要で、反応容器の定期的洗浄も必要であるが、本発明の変異型PST-01プロテアーゼを用いた場合には、反応系にカルシウムイオンを添加することは必ずしも必要でなく、反応容器の定期的な洗浄が実質的に不要である（図１参照）。 In addition, the reaction using Thermolysin requires the addition of calcium ions and periodic cleaning of the reaction vessel. However, when the mutant PST-01 protease of the present invention is used, the reaction system It is not always necessary to add calcium ions to the reactor, and periodic cleaning of the reaction vessel is substantially unnecessary (see FIG. 1).
また、本発明の変異型PST-01プロテアーゼは、有機溶媒存在下での安定性に優れ、有機溶媒を用いたペプチド合成反応やエステル合成反応に利用することが可能である。 In addition, the mutant PST-01 protease of the present invention is excellent in stability in the presence of an organic solvent, and can be used for peptide synthesis reaction and ester synthesis reaction using an organic solvent.
例えば、ジメチルスルフォキシド、1，5−ペンタジオール、エチレングリコール、1，4−ブタンジオール、グリセロール、メタノール、エタノール、2−プロパノール、ジメチ
ルフォルムアミド等の有機溶媒存在下で安定である。
For example, it is stable in the presence of an organic solvent such as dimethyl sulfoxide, 1,5-pentadiol, ethylene glycol, 1,4-butanediol, glycerol, methanol, ethanol, 2-propanol, dimethylformamide and the like.
また、本発明のプロテアーゼを、エチレンジアミン四酢酸等のキレートの存在下におくと、活性中心にある亜鉛イオンが除かれ、アポ酵素となるため、酵素活性を消失又は低減させ得る。また、当該アポ酵素に亜鉛イオンやコバルトイオン等を添加することで、酵素活性を復活させることも可能である。そのため、本発明のプロテアーゼを用いた反応においては、キレート剤や金属イオンの添加により、反応の進行や停止を制御することが可能である。また、例えば、基質がキレート作用を有する場合には、亜鉛イオンやコバルトイオンを添加することにより、酵素活性を向上させることもできる。 Further, when the protease of the present invention is placed in the presence of a chelate such as ethylenediaminetetraacetic acid, the zinc ion at the active center is removed and becomes an apoenzyme, so that the enzyme activity can be lost or reduced. In addition, the enzyme activity can be restored by adding zinc ions, cobalt ions, or the like to the apoenzyme. Therefore, in the reaction using the protease of the present invention, the progress or termination of the reaction can be controlled by adding a chelating agent or a metal ion. In addition, for example, when the substrate has a chelating action, the enzyme activity can be improved by adding zinc ions or cobalt ions.
２．ペプチド合成方法
本発明は、更に、上記変異型PST-01プロテアーゼを用いたペプチド合成方法を提供する。
2. Peptide Synthesis Method The present invention further provides a peptide synthesis method using the above mutant PST-01 protease.
ペプチド合成反応は、アミノ酸、ペプチド又はそれらの誘導体から選ばれる１種以上を含む基質溶液に、上記変異型PST-01プロテアーゼを接触させる工程を含む。 The peptide synthesis reaction includes a step of bringing the mutant PST-01 protease into contact with a substrate solution containing one or more selected from amino acids, peptides, or derivatives thereof.
アミノ酸としては、目的とするペプチドに応じて適宜選択したものを用い得るが、例えば、アラニン、リシン、アルギニン、トレオニン、グリシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイシン、チロシンからなる群から選ばれる１以上から選択することができる。 As the amino acid, those appropriately selected according to the target peptide can be used. For example, the amino acid is selected from the group consisting of alanine, lysine, arginine, threonine, glycine, glutamic acid, phenylalanine, asparagine, aspartic acid, leucine and tyrosine. One or more can be selected.
ペプチドとしては、上記アミノ酸が複数結合してなるペプチドが挙げられる。 Examples of the peptide include a peptide formed by combining a plurality of the above amino acids.
アミノ酸又はペプチドの誘導体としては、上記アミノ酸又はペプチドの有するカルボキシル基やアミノ基を保護基で修飾したもの等が挙げられる。 Examples of amino acid or peptide derivatives include those obtained by modifying the carboxyl group or amino group of the amino acid or peptide with a protecting group.
カルボキシル基の保護基としては、メチルエステル、エチルエステル、アミノ、tert-ブチルエステル、ヒドラジノ、アニリノ、ジフェニルメチルエステル等が挙げられる。 Examples of the protecting group for the carboxyl group include methyl ester, ethyl ester, amino, tert-butyl ester, hydrazino, anilino, diphenylmethyl ester and the like.
またアミノ基の保護基としては、アセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル等が挙げられる。 Examples of amino-protecting groups include acetyl, t-butyloxycarbonyl, benzoyl, benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl and the like.
特に、本発明における変異型PST-01プロテアーゼは、ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルを基質とするアスパルテーム前駆体の合成に適している。 In particular, the mutant PST-01 protease in the present invention is suitable for the synthesis of aspartame precursors using benzyloxycarbonyl-α-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester as substrates.
反応溶液における変異型PST-01プロテアーゼの濃度は、基質の種類等によって適宜設定し得るが、通常1μg/mL〜1 g/mL程度、好ましくは10μg/mL〜10 mg/mL程度である。 The concentration of the mutant PST-01 protease in the reaction solution can be appropriately set depending on the type of substrate and the like, but is usually about 1 μg / mL to 1 g / mL, preferably about 10 μg / mL to 10 mg / mL.
反応溶液における基質の濃度は、基質の種類によって適宜設定し得るが、通常1μM〜1 M程度、好ましくは、1 mM〜1 M程度である。 The concentration of the substrate in the reaction solution can be appropriately set depending on the type of the substrate, but is usually about 1 μM to 1 M, preferably about 1 mM to 1 M.
溶媒の種類は適宜設定し得るが、例えば、水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合溶媒等が挙げられる。 Although the kind of solvent can be suitably set, for example, water, an organic solvent, a mixed solvent of water and an organic solvent, or the like can be given.
水と有機溶媒との比率は、通常容積比で水：有機溶媒＝100：0〜0：100程度、好ましくは、100：0〜30：70程度である。 The ratio of water to the organic solvent is usually about water: organic solvent = 100: 0 to 0: 100, preferably about 100: 0 to 30:70 in a volume ratio.
有機溶媒としては、ジメチルスルフォキシド、1，5−ペンタジオール、エチレングリコール、1，4−ブタンジオール、グリセロール、メタノール、エタノール、2−プロパノー
ル、ジメチルフォルムアミド等が挙げられる。
Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide, 1,5-pentadiol, ethylene glycol, 1,4-butanediol, glycerol, methanol, ethanol, 2-propanol, dimethylformamide and the like.
特に、ジメチルスルフォキシド、1，5−ペンタジオール、エチレングリコール、1，4−ブタンジオール、グリセロール、メタノール及びエタノールから選ばれる１以上の有機溶媒と水との混合溶媒が、収率や反応速度に優れる点で好ましく用いられる。 In particular, a mixed solvent of one or more organic solvents selected from dimethyl sulfoxide, 1,5-pentadiol, ethylene glycol, 1,4-butanediol, glycerol, methanol, and ethanol, with water, yield and reaction rate. It is preferably used in that it is excellent in.
反応温度は適宜設定し得るが、通常−20℃〜60℃程度、好ましくは、25℃〜40℃程度である。また反応時間は、酵素量等に応じて適宜設定し得るが、通常1分〜1週間程度、好ましくは1時間〜2日程度である。 The reaction temperature can be appropriately set, but is usually about -20 ° C to 60 ° C, preferably about 25 ° C to 40 ° C. The reaction time can be appropriately set according to the amount of enzyme and the like, but is usually about 1 minute to 1 week, preferably about 1 hour to 2 days.
反応系内には、必要に応じて、他の成分を適宜添加することができる。 Other components can be appropriately added to the reaction system as necessary.
例えば、基質に強いキレート作用がある場合には、酵素活性や生産性の向上等を目的に、亜鉛イオン、コバルトイオン、カルシウムイオン等を少量添加することもできる。 For example, when the substrate has a strong chelating action, zinc ions, cobalt ions, calcium ions, and the like can be added in small amounts for the purpose of improving enzyme activity and productivity.
また、適当な塩や緩衝成分を適宜配合することもできる。 Moreover, a suitable salt and a buffer component can also be mix | blended suitably.
反応後、目的とするペプチドを単離精製する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、晶析、クロマトグラフィー、膜分離、抽出又はそれらの組合せを挙げることができる。 After the reaction, a method for isolating and purifying the target peptide can be performed according to a known method. For example, crystallization, chromatography, membrane separation, extraction or a combination thereof can be mentioned.
本発明の変異型PST-01プロテアーゼを用いたペプチド合成方法は、優れた平衡収率並びに反応速度を奏する。 The peptide synthesis method using the mutant PST-01 protease of the present invention exhibits excellent equilibrium yield and reaction rate.
更に、本発明のペプチド合成反応では、カルシウムの添加は特に必要なく、反応容器の定期的な洗浄も実質的に不要である（図１参照）。 Furthermore, in the peptide synthesis reaction of the present invention, addition of calcium is not particularly necessary, and periodic cleaning of the reaction vessel is substantially unnecessary (see FIG. 1).
更に、本発明のペプチド合成方法では、有機溶媒を反応溶媒として用いることができ、ペプチドの収率をより向上させることが可能であり、また、雑菌の混入や、反応溶液中における雑菌の生育も低減させることもできる。 Furthermore, in the peptide synthesis method of the present invention, an organic solvent can be used as a reaction solvent, and the yield of the peptide can be further improved. In addition, contamination with bacteria and growth of bacteria in the reaction solution can be achieved. It can also be reduced.
３．Z-Asp-PheOMeの合成方法
本発明は、更に上記変異型PST-01プロテアーゼを用いたZ-Asp-PheOMeの合成方法を提供する。
3. Method for Synthesizing Z-Asp-PheOMe The present invention further provides a method for synthesizing Z-Asp-PheOMe using the mutant PST-01 protease.
Z-Asp-PheOMeの合成方法は、L-フェニルアラニンメチルエステル（L-PheOMe）と、N-ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（Z-Asp）を含む基質溶液に、上記変異型PST-01
プロテアーゼを接触させる工程を含む。
Z-Asp-PheOMe was synthesized by adding the above mutant PST-01 to a substrate solution containing L-phenylalanine methyl ester (L-PheOMe) and N-benzyloxycarbonylaspartic acid (Z-Asp).
Contacting the protease.
反応溶液における変異型PST-01プロテアーゼの濃度は、通常1μg/mL〜1 g/mL程度、好
ましくは10μg/mL〜10 mg/mL程度である。
The concentration of the mutant PST-01 protease in the reaction solution is usually about 1 μg / mL to 1 g / mL, preferably about 10 μg / mL to 10 mg / mL.
基質溶液におけるL-フェニルアラニンメチルエステル（L-PheOMe）の濃度は、10 mM〜1M程度、好ましくは、50 mM〜0.7 M程度である。 The concentration of L-phenylalanine methyl ester (L-PheOMe) in the substrate solution is about 10 mM to 1 M, preferably about 50 mM to 0.7 M.
基質溶液における、N-ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（Z-Asp）の濃度は、1mM〜1 M程度、好ましくは、1 mM〜60 mM程度である。 The concentration of N-benzyloxycarbonylaspartic acid (Z-Asp) in the substrate solution is about 1 mM to 1 M, preferably about 1 mM to 60 mM.
L-PheOMeとZ-Aspとの使用比率は、L-PheOMe：Z-Asp＝1:1〜1000:1程度、好ましくは1:1〜100:1程度である。 The use ratio of L-PheOMe to Z-Asp is about L-PheOMe: Z-Asp = 1: 1 to 1000: 1, preferably about 1: 1 to 100: 1.
溶媒の種類は適宜設定し得るが、例えば、水、有機溶媒、または水と有機溶媒との混合溶媒等が挙げられる。 Although the kind of solvent can be suitably set, for example, water, an organic solvent, a mixed solvent of water and an organic solvent, or the like can be given.
水と有機溶媒との比率は、通常容積比で水：有機溶媒＝100：0〜0：100程度、好ましくは、100：0〜30：70程度である。 The ratio of water to the organic solvent is usually about water: organic solvent = 100: 0 to 0: 100, preferably about 100: 0 to 30:70 in a volume ratio.
有機溶媒としては、ジメチルスルフォキシド、1，5−ペンタジオール、エチレングリコール、1，4−ブタンジオール、グリセロール、メタノール、エタノール、2−プロパノー
ル、ジメチルフォルムアミド等を挙げることができる。
Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide, 1,5-pentadiol, ethylene glycol, 1,4-butanediol, glycerol, methanol, ethanol, 2-propanol, dimethylformamide and the like.
特に、ジメチルスルフォキシド、1，5−ペンタジオール、エチレングリコール、1，4−ブタンジオール、グリセロール、メタノール及びエタノールから選ばれる１以上の有機溶媒と水との混合溶媒が、収率や反応速度に優れる点で好ましく用いられる。 In particular, a mixed solvent of one or more organic solvents selected from dimethyl sulfoxide, 1,5-pentadiol, ethylene glycol, 1,4-butanediol, glycerol, methanol, and ethanol, with water, yield and reaction rate. It is preferably used in that it is excellent in.
中でも、水とジメチルスルフォキシド（DMSO）との混合溶媒を用いることが好ましく、特に、容積比で、水：DMSO＝80：20〜30：70程度、特に70：30〜50：50程度である混合溶媒が、速い反応速度と高い収率が得られる点で好ましい。 Among them, it is preferable to use a mixed solvent of water and dimethyl sulfoxide (DMSO), and in particular, by volume ratio, water: DMSO = about 80:20 to 30:70, especially about 70:30 to 50:50. A certain mixed solvent is preferable in that a high reaction rate and a high yield can be obtained.
反応温度は適宜設定し得るが、通常−20℃〜60℃程度、好ましくは、25℃〜40℃程度である。反応時間は、酵素量等に応じて適宜設定し得るが、通常1分〜1週間程度、好ましくは1時間〜2日程度である。 The reaction temperature can be appropriately set, but is usually about -20 ° C to 60 ° C, preferably about 25 ° C to 40 ° C. The reaction time can be appropriately set according to the amount of enzyme and the like, but is usually about 1 minute to 1 week, preferably about 1 hour to 2 days.
反応系内には、必要に応じて、他の成分を適宜添加することができる。 Other components can be appropriately added to the reaction system as necessary.
例えば、基質に強いキレート作用がある場合には、酵素活性や生産性の向上等を目的に、亜鉛イオン、コバルトイオン、カルシウムイオンを少量添加することもできる。 For example, when the substrate has a strong chelating action, a small amount of zinc ion, cobalt ion, or calcium ion can be added for the purpose of improving enzyme activity or productivity.
また、適当な塩や緩衝成分を適宜配合することもできる。 Moreover, a suitable salt and a buffer component can also be mix | blended suitably.
反応後、Z-Asp-PheOMeを単離精製する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、晶析、クロマトグラフィー、抽出又はそれらの組合せを挙げることができる。 After the reaction, the method for isolating and purifying Z-Asp-PheOMe can be performed according to a known method. For example, crystallization, chromatography, extraction, or a combination thereof can be mentioned.
本発明の変異型PST-01プロテアーゼを用いたZ-Asp-PheOMe合成方法では、高い合成活性と、速い反応速度が奏される。 In the method for synthesizing Z-Asp-PheOMe using the mutant PST-01 protease of the present invention, high synthetic activity and fast reaction rate are exhibited.
更に、サーモライシンを用いた反応では、カルシウムの添加が必要であり、反応容器の定期的な洗浄も必要であるが、本発明のZ-Asp-PheOMe合成反応では、カルシウムの添加は特に必要なく、反応容器の定期的な洗浄も実質的に不要となる（図１参照）。 Furthermore, in the reaction using thermolysin, it is necessary to add calcium, and it is also necessary to periodically wash the reaction vessel. However, in the Z-Asp-PheOMe synthesis reaction of the present invention, addition of calcium is not particularly necessary. Periodic cleaning of the reaction vessel is also substantially unnecessary (see FIG. 1).
更に、本発明のZ-Asp-PheOMe合成方法では、有機溶媒を反応溶媒として用いることができ、Z-Asp-PheOMeの収率を更に向上させることができ、雑菌の混入や、反応溶液中での雑菌の生育を低減させることもできる。 Furthermore, in the Z-Asp-PheOMe synthesis method of the present invention, an organic solvent can be used as a reaction solvent, and the yield of Z-Asp-PheOMe can be further improved. It is also possible to reduce the growth of various germs.
本発明は、PST-01プロテアーゼの114番目のチロシンがセリン、アルギニン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン及びバリンからなる群から選ばれるいずれか１つのアミノ酸に置換された変異型PST-01プロテアーゼを提供する。 In the present invention, the 114th tyrosine of the PST-01 protease is any selected from the group consisting of serine, arginine, alanine, cysteine, glutamic acid, glutamine, histidine, isoleucine, lysine, methionine, proline, threonine, leucine, tryptophan and valine. A mutant PST-01 protease substituted with one amino acid is provided.
本発明の変異型PST-01プロテアーゼは、ペプチド合成活性に優れ、高い平衡収率を示し、反応速度も速い。 The mutant PST-01 protease of the present invention is excellent in peptide synthesis activity, exhibits a high equilibrium yield, and has a high reaction rate.
特にPST-01プロテアーゼの114番目のチロシンが、セリン、アルギニン、アラニン、システイン、ヒスチジン又はメチオニンに置換された変異型PST-01プロテアーゼは、サーモライシンよりも速い反応初速度を示す。 In particular, the mutant PST-01 protease in which the 114th tyrosine of the PST-01 protease is substituted with serine, arginine, alanine, cysteine, histidine or methionine shows a faster initial reaction rate than thermolysin.
また、サーモライシンを用いた反応は、カルシウムイオンの添加が必要であり、また、反応容器の定期的洗浄が必要であるが、本発明の変異型PST-01プロテアーゼを用いた反応では、カルシウムイオンの添加は特に必要なく、反応容器の定期的な洗浄も実質的に要しない。 In addition, the reaction using thermolysin requires the addition of calcium ions, and the reaction vessel must be periodically washed. In the reaction using the mutant PST-01 protease of the present invention, Addition is not particularly necessary, and regular cleaning of the reaction vessel is also substantially unnecessary.
また、本発明の変異型PST-01プロテアーゼは、有機溶媒存在下での安定性に優れ、有機溶媒を用いたペプチド合成反応やエステル合成反応に利用することができ、高い合成収率を示す。 Moreover, the mutant PST-01 protease of the present invention is excellent in stability in the presence of an organic solvent, and can be used for peptide synthesis reaction and ester synthesis reaction using an organic solvent, and exhibits a high synthesis yield.
また、本発明は、変異型PST-01プロテアーゼを用いたペプチド合成方法及びZ-Asp-PheOMe合成方法を提供する。本発明の合成方法では、優れた反応速度が奏される。 The present invention also provides a peptide synthesis method using a mutant PST-01 protease and a Z-Asp-PheOMe synthesis method. In the synthesis method of the present invention, an excellent reaction rate is achieved.
更に、本発明の合成方法においては、カルシウムの添加は必ずしも必要でなく、反応容器の定期的な洗浄も実質的に不要である。また、本発明の合成方法は、有機溶媒を用いることができ、収率をより向上させることができる。また、雑菌の混入や、反応溶液中での雑菌の生育も低減させることができる。 Furthermore, in the synthesis method of the present invention, addition of calcium is not always necessary, and periodic cleaning of the reaction vessel is substantially unnecessary. In addition, the synthesis method of the present invention can use an organic solvent, and can further improve the yield. Moreover, contamination of germs and growth of germs in the reaction solution can be reduced.
このように、本発明は、ペプチド合成に有用な新規プロテアーゼを提供するものであり、効率のよいペプチド合成方法を提供するものである。 Thus, the present invention provides a novel protease useful for peptide synthesis and provides an efficient peptide synthesis method.
以下、本発明を実施例や比較例等を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, a comparative example, etc., this invention is not limited to these Examples.
１．プラスミドpPC1の構築
プラスミドpPC1を、H. Ogino, J. Yokoo, F. Watanabe, and H. Ishikawa, Cloning and sequencing of a gene of organic solvent-stable protease secreted from Pseudomonas aeruginosa PST-01 and its expression in Escherichia coli, Biochemical Engineering Journal, 5 (3), 191-200 (2000).に記載されている方法に従って作製した。
1. Construction of plasmid pPC1 Plasmid pPC1 was transformed into H. Ogino, J. Yokoo, F. Watanabe, and H. Ishikawa, Cloning and sequencing of a gene of organic solvent-stable protease secreted from Pseudomonas aeruginosa PST-01 and its expression in Escherichia coli , Biochemical Engineering Journal, 5 (3), 191-200 (2000).
具体的には、Pseudomonas aeruginosaPST-01株の染色体DNAをSau3A Iで部分分解し、pUC19のBamH Iサイトに挿入した後、大腸菌JM109株を形質転換した。プロテアーゼ活性が付与された形質転換体からプラスミドを抽出することによって、pPC1を取得した。なお、pPC1は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−20964（受託日：平成18年7月18日）として寄託されている。 Specifically, the chromosomal DNA of Pseudomonas aeruginosa PST-01 was partially digested with Sau3A I and inserted into the BamHI site of pUC19, and then E. coli JM109 was transformed. PPC1 was obtained by extracting a plasmid from a transformant imparted with protease activity. PPC1 has been deposited with the Patent Biological Deposit Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM P-20964 (date of deposit: July 18, 2006).
またpPC1の全塩基配列の解析結果を、配列表の配列番号６に示す。 The analysis result of the entire base sequence of pPC1 is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
２．部位特異的変異の導入
pPC1を鋳型とし、置換したい塩基を含む1対の変異プライマーとDNAポリメラーゼを用いて95℃で１分間保温した後、95℃で50秒間の変性、60℃で50秒間のアニーリング、ならびに68℃で5.2分間の伸長反応を18回繰り返した。さらに、68℃で7分間保温した後、Dpn Iを用いて鋳型を消化することにより、部位特異的変異を導入したプラスミドを構築した。
2. Introduction of site-specific mutation
Use pPC1 as a template, incubate at 95 ° C for 1 minute using a pair of mutant primers containing the base to be substituted and DNA polymerase, then denaturate at 95 ° C for 50 seconds, anneal at 60 ° C for 50 seconds, and at 68 ° C. The extension reaction for 5.2 minutes was repeated 18 times. Furthermore, after incubating at 68 ° C. for 7 minutes, the template was digested with Dpn I to construct a plasmid into which a site-specific mutation was introduced.
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをフェニルアラニンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号９で表される塩基配列、と、配列表の配列表の配列番号１０で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号９ ：GCAGCGTGGAGAACGCCTtCTGGGACGGCACGGCG
配列番号１０：CGCCGTGCCGTCCCAGaAGGCGTTCTCCACGCTGC
When tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, is substituted with phenylalanine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and a sequence number in the sequence listing of the sequence listing. The base sequence represented by 10 was used (lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 9: GCAGCGTGGAGAACGCCTtCTGGGACGGCACGGCG
Sequence number 10: CGCCGTGCCGTCCCAGaAGGCGTTCTCCACGCTGC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをアラニンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号７で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号８で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。 When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with alanine, as a mutation primer, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and SEQ ID NO: 8 in the sequence listing of the sequence listing are used. (Lower case letters indicate mutation sites).
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをバリンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号１１で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号１２で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号１１：GCGTGGAGAACGCCgTgTGGGACGGCACGG
配列番号１２：CCGTGCCGTCCCAcAcGGCGTTCTCCACGC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with valine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and SEQ ID NO: 12 in the sequence listing of the sequence listing (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 11: GCGTGGAGAACGCCgTgTGGGACGGCACGG
Sequence number 12: CCGTGCCGTCCCAcAcGGCGTTCTCCACGC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをロイシンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号１３で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号１４で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号１３：GCGTGGAGAACGCCcTgTGGGACGGCACGG
配列番号１４：CCGTGCCGTCCCAcAgGGCGTTCTCCACGC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with leucine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing and SEQ ID NO: 14 in the sequence listing of the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 13: GCGTGGAGAACGCCcTgTGGGACGGCACGG
Sequence number 14: CCGTGCCGTCCCAcAgGGCGTTCTCCACGC
PST-01プロテアーゼのN末端から190番目のアミノ酸であるイソロイシンをバリンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号１５で表される塩基配列と、配列表の配列番号１６で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号１５：CCTGATCGGCTACGACgTCAAGAAGGGCAGCGG
配列番号１６：CCGCTGCCCTTCTTGAcGTCGTAGCCGATCAGG
When isoleucine, the 190th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, is substituted with valine, the mutation primer is represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 in the sequence listing and SEQ ID NO: 16 in the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 15: CCTGATCGGCTACGACgTCAAGAAGGGCAGCGG
Sequence number 16: CCGCTGCCCTTCTTGAcGTCGTAGCCGATCAGG
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをセリンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号１７で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号１８で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号１７：GGAGAACGCCTcCTGGGACGGCAC
配列番号１８：GTGCCGTCCCAGgAGGCGTTCTCC
When substituting tyrosine, which is the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with serine, as a mutation primer, the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 in the sequence listing and SEQ ID NO: 18 in the sequence listing of the sequence listing are used. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 17: GGAGAACGCCTcCTGGGACGGCAC
Sequence number 18: GTGCCGTCCCAGgAGGCGTTCTCC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをアルギニンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号１９で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号２０で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号１９：GGAGAACGCCgcCTGGGACGGCACGG
配列番号２０：CCGTGCCGTCCCAGgcGGCGTTCTCC
When substituting arginine for tyrosine which is the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing and SEQ ID NO: 20 in the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 19: GGAGAACGCCgcCTGGGACGGCACGG
Sequence number 20: CCGTGCCGTCCCAGgcGGCGTTCTCC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをシステインに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号２１で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号２２で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号２１：GGAGAACGCCTgCTGGGACGGCACG
配列番号２２：CGTGCCGTCCCAGcAGGCGTTCTCC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with cysteine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing and SEQ ID NO: 22 in the sequence listing of the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 21: GGAGAACGCCTgCTGGGACGGCACG
Sequence number 22: CGTGCCGTCCCAGcAGGCGTTCTCC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをヒスチジンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号２３で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号２４で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号２３：GGAGAACGCCcaCTGGGACGGCACG
配列番号２４：CGTGCCGTCCCAGtgGGCGTTCTCC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with histidine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 23 in the sequence listing and SEQ ID NO: 24 in the sequence listing of the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 23: GGAGAACGCCcaCTGGGACGGCACG
Sequence number 24: CGTGCCGTCCCAGtgGGCGTTCTCC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをメチオニンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号２５で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号２６で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号２５：GGAGAACGCCaTgTGGGACGGCACG
配列番号２６：CGTGCCGTCCCAcAtGGCGTTCTCC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with methionine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 25 in the sequence listing and SEQ ID NO: 26 in the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 25: GGAGAACGCCaTgTGGGACGGCACG
Sequence number 26: CGTGCCGTCCCAcAtGGCGTTCTCC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをトレオニンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号２７で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号２８で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号２７：GTGGAGAACGCCacCTGGGACGGCACGG
配列番号２８：CCGTGCCGTCCCAGgtGGCGTTCTCCAC
When tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, is substituted with threonine, the mutation primer is a base sequence represented by SEQ ID NO: 27 in the sequence listing and SEQ ID NO: 28 in the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
SEQ ID NO: 27: GTGGAGAACGCCacCTGGGACGGCACGG
Sequence number 28: CCGTGCCGTCCCAGgtGGCGTTCTCCAC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをトリプトファンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号２９で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号３０で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号２９：GTGGAGAACGCCTggTGGGACGGCACGG
配列番号３０：CCGTGCCGTCCCAccAGGCGTTCTCCAC
When substituting tryptophan for tyrosine, which is the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, as a mutation primer, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 in the sequence listing and SEQ ID NO: 30 in the sequence listing of the sequence listing are used. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 29: GTGGAGAACGCCTggTGGGACGGCACGG
Sequence number 30: CCGTGCCGTCCCAccAGGCGTTCTCCAC
PST-01プロテアーゼのN末端から114番目のアミノ酸であるチロシンをイソロイシンに置換する場合、変異プライマーとしては、配列表の配列番号３１で表される塩基配列と、配列表の配列表の配列番号３２で表される塩基配列を用いた（小文字は変異箇所を示す）。
配列番号３１：GGAGAACGCCaTCTGGGACGGCACG
配列番号３２：CGTGCCGTCCCAGAtGGCGTTCTCC
When substituting tyrosine, the 114th amino acid from the N-terminal of PST-01 protease, with isoleucine, the mutation primer includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 31 in the sequence listing and SEQ ID NO: 32 in the sequence listing. (Lower case letters indicate mutation sites).
Sequence number 31: GGAGAACGCCaTCTGGGACGGCACG
Sequence number 32: CGTGCCGTCCCAGAtGGCGTTCTCC
上記のように、pPC1を鋳型とした変異導入により、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをフェニルアラニンに置換したPST-01-Y114Fプロテアーゼ、
190番目のアミノ酸であるイソロイシンをバリンに置換したPST-01-I190Vプロテアーゼ、
114番目と190番目のアミノ酸をそれぞれフェニルアラニンとバリンに置換したPST-01-Y114F-I190Vプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをセリンに置換したPST-01-Y114Sプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをアルギニンに置換したPST-01-Y114Rプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをアラニンに置換したPST-01-Y114Aプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをシステインに置換したPST-01-Y114Cプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをヒスチジンに置換したPST-01-Y114Hプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをメチオニンに置換したPST-01-Y114Mプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをトレオニンに置換したPST-01-Y114Tプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをロイシンに置換したPST-01-Y114Lプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをバリンに置換したPST-01-Y114Vプロテアーゼ、
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをトリプトファンに置換したPST-01-Y114Wプロテアーゼ、及び
PST-01プロテアーゼの114番目のアミノ酸であるチロシンをイソロイシンに置換したPST-01-Y114Iプロテアーゼの遺伝子を構築した。
As mentioned above, by mutagenesis using pPC1 as a template,
PST-01-Y114F protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with phenylalanine,
PST-01-I190V protease in which isoleucine which is the 190th amino acid is substituted with valine,
PST-01-Y114F-I190V protease in which the 114th and 190th amino acids are substituted with phenylalanine and valine, respectively.
PST-01-Y114S protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with serine,
PST-01-Y114R protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with arginine,
PST-01-Y114A protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with alanine,
PST-01-Y114C protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with cysteine,
PST-01-Y114H protease obtained by substituting histidine for tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease,
PST-01-Y114M protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with methionine,
PST-01-Y114T protease obtained by substituting threonine for tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease,
PST-01-Y114L protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with leucine,
PST-01-Y114V protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with valine,
PST-01-Y114W protease in which tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, is substituted with tryptophan, and
A gene for PST-01-Y114I protease was constructed by substituting tyrosine, the 114th amino acid of PST-01 protease, with isoleucine.
３．粗酵素溶液の調製
PST-01プロテアーゼ遺伝子を含むpPC1あるいはpPC1を鋳型として変異導入することによって作製された変異型PST-01プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌JM109株を50 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地（1.0 %(w/v) Tryptone、0.5%(w/v) Yeastextract、1.0 %(w/v) NaCl、pH 7.0）を用いて、37 ℃、150 rpmで16時間振盪培養した。培養液を4 ℃、9,840×gで5分間遠心分離し、沈殿した細胞を回収した。細胞を10 mM Tris-HCl 緩衝溶液（pH 8.0）200 mlに懸濁した後、氷冷しながら超音波照射することにより細胞を破砕した。さらに、4 ℃、19,400×gで20分間遠心分離し、遠心上清を粗酵素溶液として回収した。
3. Preparation of crude enzyme solution
LB medium containing 50 mg / L ampicillin of E. coli strain JM109 transformed with a plasmid containing a mutant PST-01 protease gene prepared by mutagenesis using pPC1 containing pST-01 protease gene or pPC1 as a template ( 1.0% (w / v) Tryptone, 0.5% (w / v) Yeastextract, 1.0% (w / v) NaCl, pH 7.0) was used for shaking culture at 37 ° C. and 150 rpm for 16 hours. The culture broth was centrifuged at 9,840 × g for 5 minutes at 4 ° C., and the precipitated cells were collected. The cells were suspended in 200 ml of 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) and then disrupted by irradiating with ultrasonic waves while cooling with ice. Further, the mixture was centrifuged at 19,400 × g for 20 minutes at 4 ° C., and the centrifuged supernatant was recovered as a crude enzyme solution.
４．酵素の精製
粗酵素溶液に硫酸アンモニウム（硫安）を40％飽和になるように加えた。4 ℃、11,900×gで10分間の遠心分離して得た遠心上清に、75％飽和になるようにさらに硫安を加え、
同じ条件の遠心分離で得られた沈殿を回収した。沈殿は、1 M硫安を含む10 mM Tris-HCl
緩衝溶液（pH 8.0）に溶解し、1 M硫安を含む10 mM Tris-HCl緩衝溶液（pH 8.0）で平衡
化したButyl Toyopearl 650Mカラムに吸着させた。吸着した酵素は、1 M硫安を含む10 mMTris-HCl緩衝溶液（pH 8.0）と硫安を含まない10 mM Tris-HCl緩衝溶液（pH 8.0）を用
い、硫安濃度を直線的に低下させることにより、溶出させた。プロテアーゼ活性を有する画分を回収した。再度、同様にButyl Toyopearl 650Mカラムを用いたクロマトグラフィーを行い、プロテアーゼ活性を有する画分を回収することにより、精製酵素を得た。精製酵素は75%飽和となるように硫安を加え、沈殿させることにより濃縮した。
4). Purification of enzyme Ammonium sulfate (ammonium sulfate) was added to the crude enzyme solution to a saturation of 40%. To the supernatant obtained by centrifugation at 11,900 xg for 10 minutes at 4 ° C, add further ammonium sulfate to 75% saturation.
The precipitate obtained by centrifugation under the same conditions was collected. The precipitate is 10 mM Tris-HCl containing 1 M ammonium sulfate.
It was dissolved in a buffer solution (pH 8.0) and adsorbed on a Butyl Toyopearl 650M column equilibrated with a 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 1 M ammonium sulfate. The adsorbed enzyme uses 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 1 M ammonium sulfate and 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) not containing ammonium sulfate, and by reducing the ammonium sulfate concentration linearly, Elute. Fractions having protease activity were collected. Again, chromatography was performed using a Butyl Toyopearl 650M column in the same manner, and a purified enzyme was obtained by collecting fractions having protease activity. The purified enzyme was concentrated by adding ammonium sulfate to 75% saturation and precipitating.
５. 酵素の加水分解活性
0.6% (w/v)のカゼイン（ICN Pharmaceuticals, Inc. 社製Hammarsten1 Grade）を含む50 mM 四ホウ酸ナトリウム-HCl緩衝溶液（pH 8.5）5 mlを30℃で5分間予熱した後、酵素溶液100 μlを加えてよく混合し、30℃で反応した。10分後TCA溶液（5.44% (w/v) トリクロロ酢酸、6.6% (w/v) 酢酸および5.46% (w/v) 酢酸ナトリウムを含む水溶液）1 mlを加えて4 ℃で30分以上放置した後、濾紙（東洋濾紙No. 5C）で濾過した。この濾液の波長280 nmの吸光度を測定することによって、分解したタンパク質の濃度を測定した。反応のブランクとしては、酵素溶液を加えた後直ちにTCA溶液によって反応を停止したものを用いた。標準としてはチロシンを用い、1分間に分解するタンパク質量をチロシン1μmolの吸光度に相当するカゼインを可溶化した酵素活性量を1 Unitと定義した。
5. Enzymatic hydrolysis activity
Pre-heat 5 ml of 50 mM sodium tetraborate-HCl buffer solution (pH 8.5) containing 0.6% (w / v) casein (Hammarsten1 Grade manufactured by ICN Pharmaceuticals, Inc.) for 5 minutes at 30 ° C. 100 μl was added, mixed well, and reacted at 30 ° C. 10 minutes later, add 1 ml of TCA solution (5.44% (w / v) trichloroacetic acid, 6.6% (w / v) acetic acid and 5.46% (w / v) sodium acetate aqueous solution) and leave at 4 ° C for 30 minutes or more Then, it was filtered with a filter paper (Toyo Filter Paper No. 5C). The concentration of the degraded protein was measured by measuring the absorbance of the filtrate at a wavelength of 280 nm. As a blank for the reaction, a reaction was immediately stopped with a TCA solution after the enzyme solution was added. As a standard, tyrosine was used, and the amount of protein that decomposes in 1 minute was defined as 1 unit of enzyme activity that solubilized casein corresponding to the absorbance of 1 μmol of tyrosine.
６. 基質の調製
東京化成工業社製L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩を水に溶解し、等モルの炭酸ナトリウムを添加することにより中和し、クロロホルムでL-フェニルアラニンメチルエステルを抽出した。クロロホルムは減圧により取り除き、L-フェニルアラニンメチルエステル（L-PheOMe）を得た。
6. Preparation of substrate L-phenylalanine methyl ester hydrochloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. was dissolved in water, neutralized by adding equimolar sodium carbonate, and L-phenylalanine methyl ester was extracted with chloroform. Chloroform was removed under reduced pressure to obtain L-phenylalanine methyl ester (L-PheOMe).
N-ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（Z-Asp）は、関東化学社から購入した。 N-benzyloxycarbonylaspartic acid (Z-Asp) was purchased from Kanto Chemical.
７. アスパルテーム前駆体合成反応・分析条件
30 mM Z-Asp、500 mM L-PheOMe及び30 U/mL （約0.85 mg/mL）酵素を含み、水とジメチルスルフォキシド（DMSO）との容積比が50：50となるように調製した50 mM Tris-HCl 緩
衝溶液（pH 7.0）を、30℃で保温することにより反応させた。
7. Aspartame precursor synthesis reaction and analysis conditions
Contains 30 mM Z-Asp, 500 mM L-PheOMe, and 30 U / mL (approximately 0.85 mg / mL) enzyme, and was prepared so that the volume ratio of water to dimethyl sulfoxide (DMSO) was 50:50 A 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.0) was reacted by incubating at 30 ° C.
反応開始後、定期的に反応溶液を採取し、9倍量の60% (v/v)アセトニトリルを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝溶液（pH 2.5）を加え、−20℃に冷やすことにより、反応を停止
し、ナカライテスク社製Cosmosil 5C18-AR-IIを用い、流速0.8 ml/minの33% (v/v)アセトニトリルを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝溶液（pH 2.3）を移動相とする高速液体クロマトグラフで分析することにより、基質や生成物量を分析した。
After starting the reaction, collect the reaction solution regularly, add 50 mM sodium phosphate buffer solution (pH 2.5) containing 9 times the amount of 60% (v / v) acetonitrile, and cool to -20 ° C. And using a Cosmosil 5C18-AR-II manufactured by Nacalai Tesque, with a mobile phase of 50 mM sodium phosphate buffer solution (pH 2.3) containing 33% (v / v) acetonitrile at a flow rate of 0.8 ml / min The amount of substrate and product was analyzed by analyzing with a liquid chromatograph.
８. 種々の酵素を用いたアスパルテーム前駆体（Z-Asp-PheOMe）の合成結果
PST-01プロテアーゼの野生型と種々の変異型酵素、およびサーモライシン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko (Protease Type X)を用い、50% DMSO存在下でZ-Asp-PheOMeの合成反応を行った。
8. Synthesis results of aspartame precursor (Z-Asp-PheOMe) using various enzymes
Synthesis of Z-Asp-PheOMe in the presence of 50% DMSO using PST-01 protease wild-type and various mutant enzymes and thermolysin (Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko (Protease Type X) manufactured by Sigma-Aldrich Japan KK) Went.
Z-Asp-PheOMeの生成量は、高速液体クロマトグラフ（島津製作所社製LC-10A）で測定した。 The amount of Z-Asp-PheOMe produced was measured with a high performance liquid chromatograph (LC-10A manufactured by Shimadzu Corporation).
反応開始3時間程度までの反応溶液を定期的にサンプリングし、サンプリングサンプル
に含まれる生成物量を測定することにより反応初速度を求めた。
The reaction solution up to about 3 hours from the start of the reaction was sampled periodically, and the initial reaction rate was determined by measuring the amount of product contained in the sample.
また、反応開始後、6日と7日後に反応溶液に含まれる生成物量を測定し、違いがないことを確認し、平衡収率とした。 In addition, 6 days and 7 days after the start of the reaction, the amount of product contained in the reaction solution was measured, and it was confirmed that there was no difference, and the equilibrium yield was obtained.
反応初速度（Initial rate）と平衡収率（Equilibrium yield)の結果を図２に示す。 The results of the initial rate and the equilibrium yield are shown in FIG.
平衡収率は70から87%程度に至っており、野生型PST-01プロテアーゼ、PST-01-Y114F-I190Vプロテアーゼ、PST-01-I190Vプロテアーゼ、PST-01-Y114Fプロテアーゼ、PST-01-Y114Iプロテアーゼ、PST-01-Y114Wプロテアーゼ、PST-01-Y114Vプロテアーゼ、PST-01-Y114Lプロテアーゼ、PST-01-Y114Tプロテアーゼ、PST-01-Y114Mプロテアーゼ、PST-01-Y114Hプロテアーゼ、PST-01-Y114Cプロテアーゼ、PST-01-Y114Aプロテアーゼ、PST-01-Y114Rプロテアーゼ、PST-01-Y114Sプロテアーゼ及びサーモライシンの平衡収率はほぼ同程度であった。 Equilibrium yield has reached about 70 to 87%, wild type PST-01 protease, PST-01-Y114F-I190V protease, PST-01-I190V protease, PST-01-Y114F protease, PST-01-Y114I protease, PST-01-Y114W protease, PST-01-Y114V protease, PST-01-Y114L protease, PST-01-Y114T protease, PST-01-Y114M protease, PST-01-Y114H protease, PST-01-Y114C protease, PST The equilibrium yields of -01-Y114A protease, PST-01-Y114R protease, PST-01-Y114S protease and thermolysin were almost the same.
一方、反応初速度は、野生型PST-01プロテアーゼやPST-01-I190Vプロテアーゼはサーモライシンの半分以下であったが、PST-01-Y114FプロテアーゼやPST-01-Y114F-I190Vプロテアーゼでは、サーモライシンと同程度の反応初速度を示した。また、PST-01-Y114Mプロテアーゼは、PST-01-Y114Hプロテアーゼ、PST-01-Y114Cプロテアーゼ、PST-01-Y114Aプロテアーゼ、PST-01-Y114Rプロテアーゼ、及びPST-01-Y114Sプロテアーゼでは、それぞれサーモライシンの1.6倍、1.9倍、2.1倍、2.3倍、3.3倍、及び3.5倍の反応初速度を示した。 On the other hand, the initial reaction rate of wild-type PST-01 protease and PST-01-I190V protease was less than half that of thermolysin, but PST-01-Y114F protease and PST-01-Y114F-I190V protease were the same as those of thermolysin. An initial reaction rate of a certain degree was exhibited. In addition, PST-01-Y114M protease is PST-01-Y114H protease, PST-01-Y114C protease, PST-01-Y114A protease, PST-01-Y114R protease, and PST-01-Y114S protease. The initial reaction rates were 1.6 times, 1.9 times, 2.1 times, 2.3 times, 3.3 times, and 3.5 times.
Claims (6)
が欠失、置換又は付加されている、請求項１〜３のいずれかに記載の変異型プロテアーゼ。 The mutant protease according to any one of claims 1 to 3, wherein one or several amino acids other than the 114th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing are deleted, substituted or added.
請求項１〜４のいずれかに記載の変異型プロテアーゼを、ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルを含有する基質溶液に接触させる工程を含む方法。 A method for synthesizing benzyloxycarbonyl-α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester,
A method comprising contacting the mutant protease according to any one of claims 1 to 4 with a substrate solution containing benzyloxycarbonyl-α-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester.
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2008
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