JPH09191897A - Measurement of copper ion and reagent composition therefor - Google Patents
Measurement of copper ion and reagent composition thereforInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、液体中の銅イオン
の測定方法およびそのための試薬組成物に関するもので
ある。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring copper ions in a liquid and a reagent composition therefor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】銅イオンは、ヒト生体中において金属酵
素の重要な構成成分として存在しており、銅イオンの増
減は、これら金属酵素の活性の増減に密接に関わってい
る。したがって、ヒト体液中の銅イオンの測定は、金属
酵素の増減に関わる疾病の診断において臨床意義が高
い。血清中の銅イオンの測定方法としては、Landers-Za
k法（光電比色法）あるいは原子吸光分析法があるが、
前者は試料の前処理が煩雑なこと、あるいは発色させる
バソクプロインが銅以外の金属イオンにも作用すること
など、操作性、特異性に問題がある。後者は銅イオンの
特異性は高いものの特別な機器を必要とし、また大量な
試料を処理するには不適であることに問題がある。2. Description of the Related Art Copper ions are present as an important constituent of metalloenzymes in the human body, and increase / decrease in copper ions is closely related to increase / decrease in activity of these metalloenzymes. Therefore, the measurement of copper ions in human body fluids has high clinical significance in the diagnosis of diseases associated with increase / decrease in metalloenzyme. As a method for measuring copper ions in serum, Landers-Za
There are k method (photoelectric colorimetric method) or atomic absorption spectrometry,
The former has problems in operability and specificity such that the pretreatment of the sample is complicated, or that bathocuproine for coloring also acts on metal ions other than copper. Although the latter has a high specificity of copper ions, it requires special equipment and is not suitable for processing a large amount of sample.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】このように液体中の銅
イオンの測定方法において、特別の装置を必要とせず、
短時間で正確に銅イオンを測定することが、従来の測定
方法では困難であった。As described above, the method for measuring copper ions in a liquid does not require a special device,
Accurate measurement of copper ions in a short time has been difficult with conventional measurement methods.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解消するために、汎用の吸光度分析機器にて短時間
で正確に体液中の銅イオンを測定する方法を検討した結
果、銅イオンを補欠因子とするフェニルエチルアミンオ
キシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼを使用するこ
とによって、体液中の銅イオンを測定できることを見い
だし、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems In order to solve the above problems, the present inventors have studied a method for accurately measuring copper ions in a body fluid in a short time with a general-purpose absorbance analyzer, By using phenylethylamine oxidase or histamine oxidase having copper ion as a prosthetic factor, it was found that copper ion in body fluid can be measured, and the present invention has been completed.
【０００５】すなわち、本発明は液体中の銅イオンに、
銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素およ
び該酵素の基質（銅イオンを除く）を作用させ、液体中
の銅イオンによる該酵素活性の変化を測定することによ
り、液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする
銅イオン測定方法である。That is, the present invention relates to copper ions in a liquid,
An enzyme having copper as a prosthetic factor and / or an activator and a substrate of the enzyme (excluding copper ion) are allowed to act, and a change in the enzyme activity due to the copper ion in the liquid is measured to obtain a copper ion in the liquid. It is a copper ion measuring method characterized by measuring the concentration.
【０００６】また、本発明は銅イオンを補欠因子および
／または活性化因子とする酵素、該酵素の基質（銅イオ
ンを除く）、該酵素の反応生成物を測定する試薬を含有
することを特徴とする銅イオン測定用試薬組成物であ
る。Further, the present invention is characterized by containing an enzyme having a copper ion as a prosthetic factor and / or an activator, a substrate for the enzyme (excluding copper ion), and a reagent for measuring a reaction product of the enzyme. And a reagent composition for copper ion measurement.
【０００７】[0007]
【発明の実施態様】本発明において液体とは体液、例え
ば血液、尿、髄液、血漿などに限られず、他の液体、例
えば天然水、海水、廃液、研究用試料など、各種金属の
銅塩など含む液体を包含する。本発明において使用する
銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素とし
ては、フェニルエチルオキシダーゼまたはヒスタミンオ
キシダーゼなどが例示され、これらの酵素はコファクタ
ーとして、３−（２，４，５−トリヒドロキシフェニ
ル）−Ｌ−アラニン（ｔｏｐａ）を有する酵素群であ
る。好ましくはフェニルエチルアミンオキシダーゼまた
はヒスタミンオキシダーゼである。本発明において補欠
因子とは、酵素の発現に必要不可欠な物質のことであ
る。本発明において活性化因子とは、酵素の活性を増大
する効果を有する物質のことである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, the liquid is not limited to body fluids such as blood, urine, cerebrospinal fluid, and plasma, but other liquids such as natural water, seawater, waste liquid, and research samples are copper salts of various metals. Including liquids such as. Examples of the enzyme having copper as a prosthetic factor and / or activator used in the present invention include phenylethyl oxidase, histamine oxidase, and the like. An enzyme group having hydroxyphenyl) -L-alanine (topa). Preferred is phenylethylamine oxidase or histamine oxidase. In the present invention, the prosthetic factor is a substance essential for expression of the enzyme. In the present invention, the activator is a substance having an effect of increasing the activity of the enzyme.
【０００８】本発明に用いるフェニルエチルアミンオキ
シダーゼは、その起源は特に限定されるものではない
が、好適には、アースロバクター・グロビフォルミス
（Arthrobacter globiformis）由来のものが用いられ
る。また、本発明に用いるヒスタミンオキシダーゼは、
その起源は特に限定されるものではないが、好適には、
アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter g
lobiformis）由来のものが用いられる。本発明におい
て、銅を補欠因子および／または活性化因子とする酵素
の基質とは銅イオンを含まない。フェニルエチルアミン
オキシダーゼの基質としては、フェニルエチルアミンお
よびその塩、例えば塩酸塩、チラミン、トリプタミン、
プトレッシンまたはベンジルアミンなどが例示される。
ヒスタミンオキシダーゼの基質としては、ヒスタミンな
どが例示される。The origin of the phenylethylamine oxidase used in the present invention is not particularly limited, but preferably derived from Arthrobacter globiformis. The histamine oxidase used in the present invention is
The origin is not particularly limited, but preferably,
Arthrobacter g
lobiformis) is used. In the present invention, the substrate of an enzyme having copper as a prosthetic factor and / or activator does not include copper ions. Substrates for phenylethylamine oxidase include phenylethylamine and its salts such as hydrochloride, tyramine, tryptamine,
Examples include putrescine or benzylamine.
Examples of the substrate for histamine oxidase include histamine and the like.
【０００９】本発明において使用する上記酵素の反応に
より生じる過酸化水素またはアンモニアを測定試薬とし
ては、従来公知のものが使用できる。過酸化水素測定試
薬としては、４−アミノアンチピリンなどのカップラー
とフェノールまたはアニリンおよびそれらの誘導体など
の色原体およびペルオキシダーゼを含有する試薬、メタ
ノールとカタラーゼおよび生成するホルムアルデヒドを
測定する試薬などが例示される。該試薬に使用するカッ
プラーとしては４−アミノアンチピリン、３−メチル−
２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾン等が使用される。ま
た色原体としてはフェノール、２−クロロフェノール、
４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールな
どのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ
−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチ
ルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメト
キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−
アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）
−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニ
シジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などのアニ
リン類が用いられる。As the measuring reagent for hydrogen peroxide or ammonia generated by the reaction of the above-mentioned enzyme used in the present invention, a conventionally known reagent can be used. Examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a coupler such as 4-aminoantipyrine and a chromogen such as phenol or aniline and derivatives thereof and peroxidase, a reagent for measuring methanol and catalase and formaldehyde produced, and the like. It The coupler used in the reagent includes 4-aminoantipyrine and 3-methyl-
2-Benzothiazoline hydrazone and the like are used. As chromogens, phenol, 2-chlorophenol,
Phenols such as 4-chlorophenol and 2,4-dichlorophenol, aniline, N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, N, N-diethyl-m
-Toluidine, N, N-dimethyl-m-anisidine, N
-Ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-acetylethylenediamine, N-ethyl-N- (β-hydroxyethyl) -m-toluidine, N-ethyl-N- (2-
Hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine,
N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine, N
-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (2
-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N-sulfopropyl-m-
Anisidine, N-ethyl-N- (3-methylphenyl)
-N'-succinylethylenediamine, N-ethyl-N
Anilines such as-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS) are used.
【００１０】本発明の銅イオン測定用試薬組成物は、銅
イオンを補欠因子および／または活性化因子とする酵
素、該酵素の基質（銅イオンを除く）および必要により
該酵素の反応生成物を測定する試薬を含有する。試薬組
成物中の銅イオンを補欠因子および／または活性化因子
とする酵素、例えばフェニルエチルアミンオキシダーゼ
またはヒスタミンオキシダーゼなどの添加量は、特に限
定されるものではないが、好適には５〜１００ｕ／ｌで
ある。該酵素の基質濃度は銅イオンの測定に支障をきた
さない限り、限定されるものではない。The reagent composition for measuring copper ion of the present invention comprises an enzyme having copper ion as a prosthetic factor and / or an activator, a substrate of the enzyme (excluding copper ion) and, if necessary, a reaction product of the enzyme. Contains the reagent to be measured. The amount of the enzyme containing copper ion as a prosthetic factor and / or activator in the reagent composition, such as phenylethylamine oxidase or histamine oxidase, is not particularly limited, but preferably 5 to 100 u / l. Is. The substrate concentration of the enzyme is not limited as long as it does not interfere with the measurement of copper ions.
【００１１】本発明の試薬組成物のｐＨは、酵素反応を
阻害しない範囲であれば、特に限定されるものではない
が、好適には緩衝液によりｐＨ５〜１０に保たれている
のが好ましい。また緩衝液の種類は、銅イオンを含有し
ないものであれば、いかなるものでもよい。たとえば、
GOOD'S緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝
液などが挙げられる。The pH of the reagent composition of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzymatic reaction, but it is preferably maintained at pH 5 to 10 by a buffer solution. The type of buffer solution may be any as long as it does not contain copper ions. For example,
GOOD'S buffer, Tris buffer, phosphate buffer, acetate buffer and the like can be mentioned.
【００１２】本発明の試薬組成物には必要により、界面
活性剤、防腐剤、安定化剤などを使用してもよい。界面
活性剤としては、非イオン界面活性剤（例えばポリオキ
シエチレンオクチルフェニルエーテル）、陽イオン界面
活性剤、陰イオン界面活性剤など、特に限定されるもの
ではなく、約0.01〜0.5%で用いることができる。防腐剤
としてはアジ化ナトリウム、抗生物質が用いられる。安
定化剤としては、安定化効果を示すものであれば、特に
限定されないが、グルコース、マンニトール、トレハロ
ース、グリセロール等の糖類またはアミノ酸類、アルブ
ミンなどが用いられる。If necessary, a surfactant, an antiseptic, a stabilizer and the like may be used in the reagent composition of the present invention. The surfactant is not particularly limited, and includes nonionic surfactants (for example, polyoxyethylene octyl phenyl ether), cationic surfactants, anionic surfactants, etc., and is used at about 0.01 to 0.5%. You can As the preservative, sodium azide and antibiotics are used. The stabilizer is not particularly limited as long as it has a stabilizing effect, and saccharides such as glucose, mannitol, trehalose, glycerol or amino acids, albumin and the like are used.
【００１３】本発明の一実施態様はフェニルエチルアミ
ンオキシダーゼ、フェニルエチルアミン塩酸塩、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を含
有する銅イオン測定用試薬組成物である。また、別な実
施態様はヒスタミンオキシダーゼ、ヒスタミン、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を含
有する銅イオン測定用試薬組成物である。さらに別な実
施態様は、フェニルアミンオキシダーゼまたはヒスタミ
ンオキシダーゼおよびこれらの基質、例えばフェニルエ
チルアミンおよびその塩、チラミン、トリプタミン、プ
トレッシンまたはベンジルアミンなど、またはヒスタミ
ンなど、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグ
ルタミン酸脱水素酵素を含有する銅イオン測定用試薬組
成物である。One embodiment of the present invention is a reagent composition for measuring copper ion containing phenylethylamine oxidase, phenylethylamine hydrochloride, peroxidase, 4-aminoantipyrine and a color former. Another embodiment is a reagent composition for measuring copper ion, which contains histamine oxidase, histamine, peroxidase, 4-aminoantipyrine and a color former. Yet another embodiment is phenylamine oxidase or histamine oxidase and their substrates such as phenylethylamine and its salts, tyramine, tryptamine, putrescine or benzylamine, etc., or histamine, α-ketoglutarate, NAD (P) H and It is a reagent composition for measuring copper ions, which contains glutamate dehydrogenase.
【００１４】本発明の銅イオン測定方法では、液体中の
銅イオンに、銅を補欠因子および／または活性化因子と
する酵素および該酵素の基質（銅イオンを除く）を作用
させ、液体中の銅イオンによる該酵素活性の変化を測定
することにより、液体中の銅イオン濃度を測定する。本
発明の上記酵素活性を測定する方法としては、該酵素の
作用により生成する過酸化水素あるいは消費される酸素
または生成するアンモニアをそれぞれ公知の方法で測定
する。生成する過酸化水素を測定する場合は、一般的に
４−アミノアンチピリンなどのカップラーとフェノール
またはアニリンおよびそれらの誘導体などの色原体をペ
ルオキシダーゼ存在下反応させ、生成する色素の増加を
吸光度を測定する方法あるいはメタノールとカタラーゼ
を作用させ生成するホルムアルデヒドを化学的または酵
素を用いて比色定量する方法などが用いられる。消費す
る酸素を測定する場合は、酸素電極を利用する。In the copper ion measuring method of the present invention, an enzyme having copper as a prosthetic factor and / or an activator and a substrate of the enzyme (excluding copper ion) are allowed to act on the copper ion in the liquid to give a copper ion in the liquid. The copper ion concentration in the liquid is measured by measuring the change in the enzyme activity due to the copper ion. As the method for measuring the enzyme activity of the present invention, hydrogen peroxide produced by the action of the enzyme, oxygen consumed or ammonia produced is measured by a known method. When measuring the produced hydrogen peroxide, generally, a coupler such as 4-aminoantipyrine is reacted with a chromogen such as phenol or aniline and their derivatives in the presence of peroxidase, and the increase in the produced dye is measured by measuring the absorbance. Or a method of colorimetrically determining the formaldehyde produced by the action of methanol and catalase chemically or enzymatically. An oxygen electrode is used to measure the oxygen consumed.
【００１５】また、アンモニアを測定する場合は、α−
ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱
水素酵素を使用し消費されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定す
る方法が用いられる。When measuring ammonia, α-
A method of measuring the amount of NAD (P) H consumed by using ketoglutarate, NAD (P) H and glutamate dehydrogenase is used.
【００１６】本発明の測定方法の一例は、試料中の銅イ
オンに銅イオンによって活性が変化する酵素を用いて、
該酵素の反応がもたらす吸光度変化量を求め、予め標準
液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定する
方法である。One example of the measuring method of the present invention is to use an enzyme whose activity is changed by the copper ion in the sample,
This is a method in which the amount of change in absorbance caused by the reaction of the enzyme is obtained and the amount of the target component is measured in advance from a calibration curve using a standard solution.
【００１７】[0017]
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、こ
れらによって、本発明は限定されるものではない。な
お、実施例中の略号は以下のものを示す。ＨＥＰＥＳ：
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタ
ンスルホン酸EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. The abbreviations in the examples indicate the following. HEPES:
N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
【００１８】実施例１ 銅イオン濃度の測定 下記試薬１および２を調製した。 試薬１：ＨＥＰＥＳ （ｐＨ ６．８） ０．０５Ｍ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．１％ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル） −ｍ−トルイジン （ＴＯＯＳ） ２１ｍＭ フェニルエチルアミンオキシダーゼ ９ｕ／ｌ 試薬２：ＨＥＰＥＳ （ｐＨ ６．８） ０．０５Ｍ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．１％ ４−アミノアンチピリン ２．４ｍＭ ペルオキシダーゼ ２００ｕ／ｍｌ フェニルエチルアミン塩酸塩 ０．７５ｍＭ サンプルとしては、下記サンプルを使用した。 サンプル：０〜５０μＭ 硫酸銅水溶液 Example 1 Measurement of Copper Ion Concentration The following reagents 1 and 2 were prepared. Reagent 1: HEPES (pH 6.8) 0.05M polyoxyethylene octyl phenyl ether 0.1% N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS) 21 mM phenylethylamine oxidase. 9 u / l Reagent 2: HEPES (pH 6.8) 0.05 M polyoxyethylene octyl phenyl ether 0.1% 4-aminoantipyrine 2.4 mM peroxidase 200 u / ml phenylethylamine hydrochloride 0.75 mM As a sample, the following sample It was used. Sample: 0-50 μM copper sulfate aqueous solution
【００１９】上記サンプル６μＬに試薬１を２４０μＬ
添加し、３７℃で５分間加温後、試薬２を１２０μＬ添
加し、第２試薬添加１分後と５分後に精製水を対照に５
４６ｎｍの吸光度を測定し、１分間あたりの吸光度変化
量を求めた。得られた吸光度変化量をもとに、予め標準
液を用いて作成した検量線から銅イオン濃度を求めた。
吸光度変化量より銅イオン濃度を求める計算式は、以下
の通りである。240 μL of reagent 1 was added to 6 μL of the above sample.
After adding and heating at 37 ° C for 5 minutes, 120 μL of reagent 2 was added, and 5 minutes after the addition of the second reagent, purified water was used as a control.
The absorbance at 46 nm was measured and the change in absorbance per minute was determined. Based on the obtained amount of change in absorbance, the copper ion concentration was determined from a calibration curve prepared in advance using a standard solution.
The calculation formula for obtaining the copper ion concentration from the amount of change in absorbance is as follows.
【００２０】△ＡＢＳ／ｍｉｎ＝（Ａ５−Ａ１）／４ Ａ５：第２試薬添加５分後の吸光度 Ａ１：第２試薬添加１分後の吸光度 銅イオン濃度＝（Ｓ−ＢＬ）／（ＳＴＤ−ＢＬ）×１０
０ Ｓ：試料の△ＡＢＳ／ｍｉｎ ＢＬ：精製水の△ＡＢＳ／ｍｉｎ ＳＴＤ：標準液の△ＡＢＳ／ｍｉｎ １００：標準液の銅イオン濃度（μＭ） その結果を表１に示す。表中の数字の単位はμＭであ
る。ΔABS / min = (A5-A1) / 4 A5: Absorbance 5 minutes after addition of second reagent A1: Absorbance 1 minute after addition of second reagent Copper ion concentration = (S-BL) / (STD- BL) × 10
0 S: sample ΔABS / min BL: purified water ΔABS / min STD: standard solution ΔABS / min 100: standard solution copper ion concentration (μM) The results are shown in Table 1. The unit of the numbers in the table is μM.
【００２１】[0021]
【表１】 [Table 1]
【００２２】表１から試料中の銅イオン濃度に比例して
測定値の増加が認められた。From Table 1, an increase in the measured value was recognized in proportion to the copper ion concentration in the sample.
【００２３】実施例２ 血清中の銅イオン濃度の測定 サンプルの前処理操作 血清試料０．４ｍＬに２．５Ｍ塩酸グアニジン水溶液を
０．２ｍｌ添加後、３７℃で５分間インキュベートし
た。インキュベート後、０．９Ｍ ＴＣＡ（トリクロロ
酢酸？）溶液を０．２ｍｌ添加し、攪拌後、遠心分離を
行った。上清を測定用試料とし、実施例１と同様に測定
を行った（ｎ＝５）。その結果を表２に示す。表中の数
値の単位はμＭである。 Example 2 Measurement of Copper Ion Concentration in Serum Pretreatment of Sample 0.2 ml of 2.5 M guanidine hydrochloride aqueous solution was added to 0.4 ml of serum sample and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. After the incubation, 0.2 ml of 0.9 M TCA (trichloroacetic acid?) Solution was added, stirred, and then centrifuged. The supernatant was used as a sample for measurement and the measurement was performed in the same manner as in Example 1 (n = 5). Table 2 shows the results. The unit of numerical values in the table is μM.
【００２４】[0024]
【表２】 表２から明らかなように、本発明の試薬により血清中の
銅イオンを測定することができた。[Table 2] As is clear from Table 2, the reagent of the present invention was able to measure copper ion in serum.
【００２５】実施例３ 他イオンの影響の検討 下記金属塩の水溶液および精製水を試料として使用した
（各水溶液濃度は５０μＭ）。ＣｕＳＯ4 、ＭｇＣ
ｌ2 、ＡｌＣｌ3 、ＭｎＣｌ2 、ＣｏＣｌ2 、ＺｎＣｌ
2 、ＢａＣｌ2 、精製水 試料中の銅イオンの測定は、実施例１と同様にして行っ
た。その結果を表３に示す。 Example 3 Investigation of Effect of Other Ions An aqueous solution of the following metal salt and purified water were used as samples (concentration of each aqueous solution was 50 μM). CuSO 4 , MgC
l 2 , AlCl 3 , MnCl 2 , CoCl 2 , ZnCl
2 , BaCl 2 , purified water The copper ions in the sample were measured in the same manner as in Example 1. Table 3 shows the results.
【００２６】[0026]
【表３】 [Table 3]
【００２７】表３から明らかなように、本発明の酵素で
は他のイオンの影響はほとんどなく、銅イオンに対して
特異性が高いことが確認された。As is clear from Table 3, it was confirmed that the enzyme of the present invention had almost no effect of other ions and had high specificity for copper ions.
【００２８】[0028]
【発明の効果】本発明によれば、銅イオンを補欠因子ま
たは活性化因子とする酵素を用いることによって、特別
な装置を必要とせず、正確性に優れた銅イオンの測定が
可能となる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, by using an enzyme having copper ion as a prosthetic factor or activator, it is possible to measure copper ion with high accuracy without requiring a special device.
Claims (18)
び／または活性化因子とする酵素および該酵素の基質
（銅イオンを除く）を作用させ、液体中の銅イオンによ
る該酵素活性の変化を測定することにより、液体中の銅
イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン測定方
法。1. An enzyme having copper as a prosthetic factor and / or an activator and a substrate of the enzyme (excluding copper ion) are allowed to act on copper ions in the liquid, and the activity of the enzyme by the copper ions in the liquid is increased. A copper ion measuring method, which comprises measuring a copper ion concentration in a liquid by measuring a change.
とする酵素がフェニルエチルアミンオキシダーゼまたは
ヒスタミンオキシダーゼである請求項１項記載の銅イオ
ン測定方法。2. The method for measuring copper ions according to claim 1, wherein the enzyme using copper as a prosthetic factor and / or activator is phenylethylamine oxidase or histamine oxidase.
はヒスタミンオキシダーゼの活性を、該酵素の反応によ
り生じる過酸化水素またはアンモニアまたは消費する酸
素を測定することによって、該酵素活性の変化を測定す
る請求項２項記載の銅イオン測定方法。3. The method according to claim 2, wherein a change in the activity of phenylethylamine oxidase or histamine oxidase is measured by measuring hydrogen peroxide or ammonia produced by the reaction of the enzyme or oxygen consumed. Copper ion measuring method.
質が、フェニルエチルアミンおよびその塩、チラミン、
トリプタミン、プトレッシンまたはベンジルアミンであ
る請求項２記載の銅イオン測定方法。4. The substrate for phenylethylamine oxidase is phenylethylamine and salts thereof, tyramine,
The copper ion measuring method according to claim 2, which is tryptamine, putrescine or benzylamine.
ミンである請求項２記載の銅イオン測定方法。5. The method for measuring copper ions according to claim 2, wherein the substrate for histamine oxidase is histamine.
ミンオキシダーゼおよびフェニルエチルアミン塩酸塩を
作用させ、生成する過酸化水素にペルオキシダーゼ、４
−アミノアンチピリンおよび発色剤を作用させ、吸光度
変化を測定することにより、液体中の銅イオン濃度を測
定することを特徴とする銅イオン測定方法。6. A hydrogen peroxide produced by reacting copper ions in a liquid with phenylethylamine oxidase and phenylethylamine hydrochloride, and peroxidase, 4
-A method for measuring copper ions, characterized in that the concentration of copper ions in a liquid is measured by allowing aminoantipyrine and a color-forming agent to act and measuring the change in absorbance.
ダーゼおよびヒスタミンを作用させ、生成する過酸化水
素にペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび
発色剤を作用させ、吸光度変化を測定することにより、
液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イ
オン測定方法。7. A histamine oxidase and a histamine are allowed to act on copper ions in a liquid, and peroxidase, 4-aminoantipyrine and a color-developing agent are allowed to act on the produced hydrogen peroxide, and the change in absorbance is measured.
A copper ion measuring method, which comprises measuring a copper ion concentration in a liquid.
ミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼ、これ
らの酵素の基質を作用させ、生成するアンモニアにα−
ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱
水素酵素を作用させ、ＮＡＤ（Ｐ）変化量を測定するこ
とにより、液体中の銅イオン濃度を測定することを特徴
とする銅イオン測定方法。8. A copper ion in a liquid is reacted with phenylethylamine oxidase or histamine oxidase or a substrate of these enzymes to produce α-in the produced ammonia.
A method for measuring a copper ion, characterized in that the concentration of copper ion in a liquid is measured by allowing ketoglutarate, NAD (P) H and glutamate dehydrogenase to act and measuring the amount of NAD (P) change.
化因子とする酵素、該酵素の基質（銅イオンを除く）お
よび必要により該酵素の反応生成物を測定する試薬を含
有することを特徴とする銅イオン測定用試薬組成物。9. An enzyme comprising copper ion as a prosthetic factor and / or activator, a substrate for the enzyme (excluding copper ion) and, if necessary, a reagent for measuring a reaction product of the enzyme. A reagent composition for measuring copper ions.
性化因子とする酵素がフェニルエチルアミンオキシダー
ゼまたはヒスタミンオキシダーゼである請求項９項記載
の銅イオン測定用試薬組成物。10. The reagent composition for copper ion measurement according to claim 9, wherein the enzyme having copper ion as a prosthetic factor and / or activator is phenylethylamine oxidase or histamine oxidase.
性化因子とする酵素の反応生成物を測定する試薬が、過
酸化水素またはアンモニアを測定する試薬である請求項
９記載の銅イオン測定用試薬組成物。11. The reagent for measuring copper ion according to claim 9, wherein the reagent for measuring the reaction product of the enzyme having copper ion as a prosthetic factor and / or activator is a reagent for measuring hydrogen peroxide or ammonia. Composition.
基質が、フェニルエチルアミンおよびその塩、チラミ
ン、トリプタミン、プトレッシンまたはベンジルアミン
である請求項１０記載の銅イオン測定用試薬組成物。12. The reagent composition for copper ion measurement according to claim 10, wherein the substrate of phenylethylamine oxidase is phenylethylamine and a salt thereof, tyramine, tryptamine, putrescine or benzylamine.
タミンである請求項６記載の銅イオン測定用試薬組成
物。13. The reagent composition for measuring copper ions according to claim 6, wherein the substrate for histamine oxidase is histamine.
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび発色剤を含有
する請求項１１記載の銅イオン測定用試薬組成物。14. The reagent composition for measuring copper ions according to claim 11, wherein the reagent for measuring hydrogen peroxide contains peroxidase, 4-aminoantipyrine and a color former.
グルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタミン酸脱水素
酵素を含有する請求項１１記載の銅イオン測定用試薬組
成物。15. The reagent composition for measuring copper ions according to claim 11, wherein the reagent for measuring ammonia contains α-ketoglutarate, NAD (P) H and glutamate dehydrogenase.
フェニルエチルアミン塩酸塩、ペルオキシダーゼ、４−
アミノアンチピリンおよび発色剤を含有する銅イオン測
定用試薬組成物。16. Phenylethylamine oxidase,
Phenylethylamine hydrochloride, peroxidase, 4-
A reagent composition for measuring copper ions, which comprises aminoantipyrine and a color former.
ン、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび
発色剤を含有する銅イオン測定用試薬組成物。17. A reagent composition for measuring copper ion, which comprises histamine oxidase, histamine, peroxidase, 4-aminoantipyrine and a color former.
たはヒスタミンオキシダーゼおよびこれらの酵素の基
質、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびグルタ
ミン酸脱水素酵素を含有する銅イオン測定用試薬組成
物。18. A reagent composition for measuring copper ion, which comprises phenylethylamine oxidase or histamine oxidase and a substrate for these enzymes, α-ketoglutarate, NAD (P) H and glutamate dehydrogenase.
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