JPH09154579A - アンチセンス核酸の調製方法 - Google Patents
アンチセンス核酸の調製方法Info
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- JPH09154579A JPH09154579A JP19541996A JP19541996A JPH09154579A JP H09154579 A JPH09154579 A JP H09154579A JP 19541996 A JP19541996 A JP 19541996A JP 19541996 A JP19541996 A JP 19541996A JP H09154579 A JPH09154579 A JP H09154579A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アンチセンス核酸法に有効に利用されるアン
チセンス核酸の調製方法の提供。 【解決手段】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡと、当該ＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の
塩基配列の一部分と同一の塩基配列を有する複数種のオ
リゴ核酸とを、ハイブリダイズ(対合)させることにより
アンチセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハ
イブリダイズ(対合)する核酸をアンチセンス核酸とす
る。 【効果】 本発明によれば、目的とする蛋白質をコード
するＤＮＡ又はＲＮＡ上におけるアンチセンス核酸標的
部位を効率よく確定することができ、治療剤、診断剤、
研究試薬の開発に有用なアンチセンス核酸効果に優れた
アンチセンス核酸を容易に調製し得る。
チセンス核酸の調製方法の提供。 【解決手段】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡと、当該ＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の
塩基配列の一部分と同一の塩基配列を有する複数種のオ
リゴ核酸とを、ハイブリダイズ(対合)させることにより
アンチセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハ
イブリダイズ(対合)する核酸をアンチセンス核酸とす
る。 【効果】 本発明によれば、目的とする蛋白質をコード
するＤＮＡ又はＲＮＡ上におけるアンチセンス核酸標的
部位を効率よく確定することができ、治療剤、診断剤、
研究試薬の開発に有用なアンチセンス核酸効果に優れた
アンチセンス核酸を容易に調製し得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アンチセンス核酸
法に有効に利用されるアンチセンス核酸の調製方法に関
するものであり、生化学、特に遺伝子発現制御技術に関
するものである。
法に有効に利用されるアンチセンス核酸の調製方法に関
するものであり、生化学、特に遺伝子発現制御技術に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】アンチセンス核酸法は、目的の遺伝子と
ハイブリダイズ(対合)する配列を持ち、その遺伝子によ
る蛋白質の発現を抑止するアンチセンス核酸を、医薬や
遺伝子組み換え植物の調製等に利用するというものであ
る。従って、アンチセンス核酸法においては、その様な
特性を発揮させる塩基配列を持つアンチセンス核酸を調
製することがまず必要であるが、その方法として、これ
までに十分に確立されたといえるものは未だ見いだされ
ていない。即ち、翻訳開始部位やその上流の非翻訳部位
を標的としてアンチセンス核酸を調製する方法が提案さ
れているが(K. R. Blake等, Biochemistry 24巻 6132-6
138頁 1985年; E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Revi
ews 90巻 543-584頁 1990年)、当該方法により選択され
たアンチセンス核酸が、常に蛋白質の発現を有効に阻害
するとは限らず(例えば、R. D. Ricker, A. Kaji, FEBS
Letters 309 巻363-370頁 1992年)、又、計算をもとに
アンチセンス核酸標的部位を予測する方法も提案されて
いるが、この方法で選択されたものも必ずしも有効なも
のではない(R. A. Stull等, Nucleic Acids Research 2
0巻 3501-3508 1992年)。
ハイブリダイズ(対合)する配列を持ち、その遺伝子によ
る蛋白質の発現を抑止するアンチセンス核酸を、医薬や
遺伝子組み換え植物の調製等に利用するというものであ
る。従って、アンチセンス核酸法においては、その様な
特性を発揮させる塩基配列を持つアンチセンス核酸を調
製することがまず必要であるが、その方法として、これ
までに十分に確立されたといえるものは未だ見いだされ
ていない。即ち、翻訳開始部位やその上流の非翻訳部位
を標的としてアンチセンス核酸を調製する方法が提案さ
れているが(K. R. Blake等, Biochemistry 24巻 6132-6
138頁 1985年; E. Uhlmann, A. Peyman, Chemical Revi
ews 90巻 543-584頁 1990年)、当該方法により選択され
たアンチセンス核酸が、常に蛋白質の発現を有効に阻害
するとは限らず(例えば、R. D. Ricker, A. Kaji, FEBS
Letters 309 巻363-370頁 1992年)、又、計算をもとに
アンチセンス核酸標的部位を予測する方法も提案されて
いるが、この方法で選択されたものも必ずしも有効なも
のではない(R. A. Stull等, Nucleic Acids Research 2
0巻 3501-3508 1992年)。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アンチセン
ス核酸法において有効に利用し得るアンチセンス核酸、
即ち、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ
に対してアンチセンス核酸として有効に機能する塩基配
列を持つアンチセンス核酸を、当該ＤＮＡ又はＲＮＡの
塩基配列のなかに、アンチセンス核酸が有効に効果を発
揮し易い箇所(塩基配列)を、即ち、アンチセンス核酸の
標的部位を効率的に見いだしてアンチセンス核酸を調製
するという、アンチセンス核酸を容易に調製し得る方法
を提供することを課題とするものである。
ス核酸法において有効に利用し得るアンチセンス核酸、
即ち、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ
に対してアンチセンス核酸として有効に機能する塩基配
列を持つアンチセンス核酸を、当該ＤＮＡ又はＲＮＡの
塩基配列のなかに、アンチセンス核酸が有効に効果を発
揮し易い箇所(塩基配列)を、即ち、アンチセンス核酸の
標的部位を効率的に見いだしてアンチセンス核酸を調製
するという、アンチセンス核酸を容易に調製し得る方法
を提供することを課題とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、複数のランダムな
塩基配列を有するオリゴ核酸を目的とする蛋白質をコー
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ、特に目的とする蛋白質をコー
ドするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の全部又は一部とハイ
ブリダイズ(対合)させることにより、更にはハイブリダ
イズした箇所を核酸分解能を有する物質を用いて分解さ
せることにより、アンチセンス核酸の標的部位が効率的
に判別出来ること、及びそれに基づいてアンチセンス核
酸が容易に調製出来ることを見い出し、更に、特定の部
位を標的部位の対象から除外して標的部位を探索するた
めの方法についても見い出し、本発明を完成したのであ
る。即ち、本発明は目的とする蛋白質をコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡと複数のランダムな塩基配列を有するオリ
ゴ核酸とをハイブリダイズ(対合)させることによりアン
チセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハイブ
リダイズ(対合)する核酸を取得することを特徴とするア
ンチセンス核酸の調製方法に関するものであり、又、目
的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと複数の
ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸とをハイブリダ
イズ(対合)させると共に核酸分解能を有する物質でハイ
ブリダイズ(対合)した箇所を分解させることによりアン
チセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハイブ
リダイズ(対合)する核酸を取得することを特徴とするア
ンチセンス核酸の調製方法に関するものであり、更に
は、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと
複数のランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸とをハイ
ブリダイズ(対合)させると共に核酸分解能を有する物質
でハイブリダイズ(対合)した箇所を分解させることによ
りアンチセンス核酸の標的部位を確定するに際し、標的
部位の対象から除外すべき部位に実質的に相補な塩基配
列を持ち、核酸分解能を有する物質による分解を受けな
い機能を有する核酸を併用することにより、目的とする
蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の一部
を標的部位の対象外として、標的部位にハイブリダイズ
(対合)する核酸を取得することを特徴とするアンチセン
ス核酸の調製方法に関するものである。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、複数のランダムな
塩基配列を有するオリゴ核酸を目的とする蛋白質をコー
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ、特に目的とする蛋白質をコー
ドするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の全部又は一部とハイ
ブリダイズ(対合)させることにより、更にはハイブリダ
イズした箇所を核酸分解能を有する物質を用いて分解さ
せることにより、アンチセンス核酸の標的部位が効率的
に判別出来ること、及びそれに基づいてアンチセンス核
酸が容易に調製出来ることを見い出し、更に、特定の部
位を標的部位の対象から除外して標的部位を探索するた
めの方法についても見い出し、本発明を完成したのであ
る。即ち、本発明は目的とする蛋白質をコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡと複数のランダムな塩基配列を有するオリ
ゴ核酸とをハイブリダイズ(対合)させることによりアン
チセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハイブ
リダイズ(対合)する核酸を取得することを特徴とするア
ンチセンス核酸の調製方法に関するものであり、又、目
的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと複数の
ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸とをハイブリダ
イズ(対合)させると共に核酸分解能を有する物質でハイ
ブリダイズ(対合)した箇所を分解させることによりアン
チセンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハイブ
リダイズ(対合)する核酸を取得することを特徴とするア
ンチセンス核酸の調製方法に関するものであり、更に
は、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと
複数のランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸とをハイ
ブリダイズ(対合)させると共に核酸分解能を有する物質
でハイブリダイズ(対合)した箇所を分解させることによ
りアンチセンス核酸の標的部位を確定するに際し、標的
部位の対象から除外すべき部位に実質的に相補な塩基配
列を持ち、核酸分解能を有する物質による分解を受けな
い機能を有する核酸を併用することにより、目的とする
蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配列の一部
を標的部位の対象外として、標的部位にハイブリダイズ
(対合)する核酸を取得することを特徴とするアンチセン
ス核酸の調製方法に関するものである。
【０００５】
【実施の形態】以下、本発明について詳細に説明する。 ○ ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸 本発明は、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲ
ＮＡの塩基配列において、アンチセンス核酸の標的部位
になる箇所を、複数のランダムな塩基配列を有するオリ
ゴ核酸( 以下ランダム配列オリゴ核酸という) の混合物
を用いて効率的に探索するというものであり、複数のラ
ンダム配列オリゴ核酸の混合物としては、オリゴ核酸の
塩基配列の各位置にＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ(又はＵ)の４種の核
酸塩基が任意に配列されたオリゴ核酸の集合体を代表的
なものとして例示することができる。即ち、ｎ量体のラ
ンダム配列オリゴ核酸には、４n個の異なる塩基配列の
オリゴ核酸が存在し得るのであり、本発明における複数
のランダム配列オリゴ核酸とはその様な多数の分子種か
らなるものを主として指すものであるが、必ずしもそれ
に限定されるものではない。ランダム配列オリゴ核酸
は、以下の調製方法で調製することが可能であり、本発
明においては、以下の様にして調製されたものも、市販
されているものも使用可能である。オリゴ核酸の調製方法 天然型及びホスホロチオエート型のオリゴ核酸は、例え
ば、ＡＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製のＤＮＡ合
成機もしくはＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、又はパーセプティ
ブ社製核酸自動合成機などを用いて、ホスホロアミダイ
ト法(ABI社の手順書又はF. Eckstein, Oligonucleotide
s and Analogues: A Practical Approach, IRL Press,
1991年参照)により行うことができる。又、天然のオリ
ゴ核酸については、チオフォスファイト法を用い、核酸
自動合成機で合成することもできる(特公平6-84396及び
米国特許4,808,708を参照)。ランダム配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドは、上述の核酸自動合成機を利用
してホスホロアミダイト法又はチオフォスファイト法に
より合成する際、４種類のホスホロアミダイト試薬のカ
ップリングの割合がお互いにそれぞれが等しくなる様に
混合して合成することができる。ランダム配列のホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドにつ
いても、同様に、核酸自動合成機を利用してホスホロア
ミダイト法でヌクレオチド同士の縮合を行ったのち、テ
トラエチルチウラムジサルフィド(TETD)又はBeaucage試
薬等によりリン酸エステル部分をチオ化して合成するこ
とができる。得られたオリゴデオキシリボヌクレオチド
又はホスホロチオエート型のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの粗製物は、通常の精製方法、例えば、逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾
過クロマトグラフィーの原理に基づく高速液体クロマト
グラフィー(HPLC)、超臨界クロマトグラフィー等種々の
クロマトグラフィー、エタノール沈澱法及び電気泳動法
などを用いて精製される。このほか、逆相クロマトグラ
フィーの原理に基づいて製造されたカートリッジ[例え
ば、tC18を充填剤とするセップパックプラス(ロングボ
ディ/ENV);パーセプティブ社製]等を用いても精製され
る。なお、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドの純
度は、HPLCやキャピラリー電気泳動法による分析により
調べることができる。アンチセンス核酸の標的部位の探
索を行う際に、どのような鎖長のオリゴ核酸を用いるか
は、充分に考慮すべき点である。即ち、オリゴ核酸の長
さがある程度以上でないとmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等
とのハイブリッドが形成されない恐れがあるため、アン
チセンス核酸の標的部位の探索のために用いられるラン
ダム配列オリゴ核酸の長さとしては４量体以上であるの
が好ましく、基本的にはその鎖長が長くなる程、ＤＮＡ
やＲＮＡ、特にmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体とのハイブリ
ッド形成能が増加するので好ましい。これは、最近接塩
基対モデルを用いて実験データを解析した結果からも推
論出来ることである(杉本直己「蛋白質核酸酵素」臨時増
刊号(40 巻10号)「核酸化学の新展開−新しい機能性高分
子を求めて」(松田、大塚、上杉及び三浦編) 1548-1557
頁 共立出版 1995年及び杉本直己 特願平7-124852, 199
5年)。即ち、上記結果に基づけば、ハイブリッドの長さ
が１塩基対伸びることにより、安定化エネルギーが平均
で１.５kcal/mol増えることになり、これはハイブリッ
ド形成の定数が３７℃において１１倍になることに相当
することを示すものであり、それは、ランダム配列のオ
リゴ核酸を用いた場合、該オリゴ核酸の長さが１塩基増
えることにより、特定の塩基配列を有する分子の全体に
占める割合は、１塩基増える前の４分の１に減少するも
のの、総合的に見ると、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の特
定塩基配列についてのハイブリッド形成能は、同じ濃度
のランダム配列オリゴ核酸で１塩基増やす前の２.７５
(11/4)倍になることを示すものである。そしてこれは、
オリゴ核酸の塩基配列が長くなればなる程、mＲＮＡ又
はmＲＮＡ前駆体とのハイブリッド形成は有利になると
いうことを示すものである。しかし、前記した様に、長
くなることにより、ランダム配列オリゴ核酸では、ある
特定の分子種の割合が指数関数的に減少する、即ち、各
４種類の塩基が同じ割合で含まれているとすると、ｎ量
体においては、ある特定の塩基配列を有する分子種の割
合は、１/４nとなる。例えば、9量体を使用する場合、
ある特定塩基配列のアンチセンス核酸濃度は、全濃度の
1/49＝1/262144となる。したがって、例えば、９量体の
ランダム配列オリゴ核酸を用いた場合、その総濃度が２
６２μMであっても、Ｇ、Ａ、Ｃ及びＴ(又はＵ)がそれ
ぞれ同じ割合で含まれている場合、特定の分子種の濃度
は約１nMしか存在しないことになる。さらに、長くなる
に従って、オリゴ核酸が分子内で二次構造を形成する可
能性やオリゴ核酸同士で二次構造を形成する可能性も生
じ、アンチセンス核酸としての機能が低下することが予
想でき、さらに不必要にオリゴ核酸の塩基配列を長くす
ることに合成的及び経済的に見て格別の利点はないた
め、通常アンチセンス核酸として用いられる２０乃至３
０量体が、本発明においても実用的な長さの限度であ
り、好ましくは９量体から目的とするアンチセンス核酸
と同程度の長さのもの、さらに好ましくは、目的とする
アンチセンス核酸と同じ長さのものである。
ＮＡの塩基配列において、アンチセンス核酸の標的部位
になる箇所を、複数のランダムな塩基配列を有するオリ
ゴ核酸( 以下ランダム配列オリゴ核酸という) の混合物
を用いて効率的に探索するというものであり、複数のラ
ンダム配列オリゴ核酸の混合物としては、オリゴ核酸の
塩基配列の各位置にＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ(又はＵ)の４種の核
酸塩基が任意に配列されたオリゴ核酸の集合体を代表的
なものとして例示することができる。即ち、ｎ量体のラ
ンダム配列オリゴ核酸には、４n個の異なる塩基配列の
オリゴ核酸が存在し得るのであり、本発明における複数
のランダム配列オリゴ核酸とはその様な多数の分子種か
らなるものを主として指すものであるが、必ずしもそれ
に限定されるものではない。ランダム配列オリゴ核酸
は、以下の調製方法で調製することが可能であり、本発
明においては、以下の様にして調製されたものも、市販
されているものも使用可能である。オリゴ核酸の調製方法 天然型及びホスホロチオエート型のオリゴ核酸は、例え
ば、ＡＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製のＤＮＡ合
成機もしくはＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、又はパーセプティ
ブ社製核酸自動合成機などを用いて、ホスホロアミダイ
ト法(ABI社の手順書又はF. Eckstein, Oligonucleotide
s and Analogues: A Practical Approach, IRL Press,
1991年参照)により行うことができる。又、天然のオリ
ゴ核酸については、チオフォスファイト法を用い、核酸
自動合成機で合成することもできる(特公平6-84396及び
米国特許4,808,708を参照)。ランダム配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドは、上述の核酸自動合成機を利用
してホスホロアミダイト法又はチオフォスファイト法に
より合成する際、４種類のホスホロアミダイト試薬のカ
ップリングの割合がお互いにそれぞれが等しくなる様に
混合して合成することができる。ランダム配列のホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドにつ
いても、同様に、核酸自動合成機を利用してホスホロア
ミダイト法でヌクレオチド同士の縮合を行ったのち、テ
トラエチルチウラムジサルフィド(TETD)又はBeaucage試
薬等によりリン酸エステル部分をチオ化して合成するこ
とができる。得られたオリゴデオキシリボヌクレオチド
又はホスホロチオエート型のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの粗製物は、通常の精製方法、例えば、逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾
過クロマトグラフィーの原理に基づく高速液体クロマト
グラフィー(HPLC)、超臨界クロマトグラフィー等種々の
クロマトグラフィー、エタノール沈澱法及び電気泳動法
などを用いて精製される。このほか、逆相クロマトグラ
フィーの原理に基づいて製造されたカートリッジ[例え
ば、tC18を充填剤とするセップパックプラス(ロングボ
ディ/ENV);パーセプティブ社製]等を用いても精製され
る。なお、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドの純
度は、HPLCやキャピラリー電気泳動法による分析により
調べることができる。アンチセンス核酸の標的部位の探
索を行う際に、どのような鎖長のオリゴ核酸を用いるか
は、充分に考慮すべき点である。即ち、オリゴ核酸の長
さがある程度以上でないとmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等
とのハイブリッドが形成されない恐れがあるため、アン
チセンス核酸の標的部位の探索のために用いられるラン
ダム配列オリゴ核酸の長さとしては４量体以上であるの
が好ましく、基本的にはその鎖長が長くなる程、ＤＮＡ
やＲＮＡ、特にmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体とのハイブリ
ッド形成能が増加するので好ましい。これは、最近接塩
基対モデルを用いて実験データを解析した結果からも推
論出来ることである(杉本直己「蛋白質核酸酵素」臨時増
刊号(40 巻10号)「核酸化学の新展開−新しい機能性高分
子を求めて」(松田、大塚、上杉及び三浦編) 1548-1557
頁 共立出版 1995年及び杉本直己 特願平7-124852, 199
5年)。即ち、上記結果に基づけば、ハイブリッドの長さ
が１塩基対伸びることにより、安定化エネルギーが平均
で１.５kcal/mol増えることになり、これはハイブリッ
ド形成の定数が３７℃において１１倍になることに相当
することを示すものであり、それは、ランダム配列のオ
リゴ核酸を用いた場合、該オリゴ核酸の長さが１塩基増
えることにより、特定の塩基配列を有する分子の全体に
占める割合は、１塩基増える前の４分の１に減少するも
のの、総合的に見ると、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の特
定塩基配列についてのハイブリッド形成能は、同じ濃度
のランダム配列オリゴ核酸で１塩基増やす前の２.７５
(11/4)倍になることを示すものである。そしてこれは、
オリゴ核酸の塩基配列が長くなればなる程、mＲＮＡ又
はmＲＮＡ前駆体とのハイブリッド形成は有利になると
いうことを示すものである。しかし、前記した様に、長
くなることにより、ランダム配列オリゴ核酸では、ある
特定の分子種の割合が指数関数的に減少する、即ち、各
４種類の塩基が同じ割合で含まれているとすると、ｎ量
体においては、ある特定の塩基配列を有する分子種の割
合は、１/４nとなる。例えば、9量体を使用する場合、
ある特定塩基配列のアンチセンス核酸濃度は、全濃度の
1/49＝1/262144となる。したがって、例えば、９量体の
ランダム配列オリゴ核酸を用いた場合、その総濃度が２
６２μMであっても、Ｇ、Ａ、Ｃ及びＴ(又はＵ)がそれ
ぞれ同じ割合で含まれている場合、特定の分子種の濃度
は約１nMしか存在しないことになる。さらに、長くなる
に従って、オリゴ核酸が分子内で二次構造を形成する可
能性やオリゴ核酸同士で二次構造を形成する可能性も生
じ、アンチセンス核酸としての機能が低下することが予
想でき、さらに不必要にオリゴ核酸の塩基配列を長くす
ることに合成的及び経済的に見て格別の利点はないた
め、通常アンチセンス核酸として用いられる２０乃至３
０量体が、本発明においても実用的な長さの限度であ
り、好ましくは９量体から目的とするアンチセンス核酸
と同程度の長さのもの、さらに好ましくは、目的とする
アンチセンス核酸と同じ長さのものである。
【０００６】○ 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ
又はＲＮＡ 本発明に用いられる目的とする蛋白質をコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡ、特に本発明に好ましいmＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体は以下の手順で調製、精製、更には標識化して
使用される。mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の調製 目的とする蛋白質をコードするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆
体等は、当該遺伝子、即ち、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の塩基配列を文献等の情報に
より又は実験を行うことにより調べ、直接又は鋳型ＤＮ
Ａ又はプラスミドの調製を経る等の方法により調製する
ことができる(J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniat
is, Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年)。mＲ
ＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の直接調製法としては、得ら
れた塩基配列に基づいて自動合成機などを用いて化学合
成する方法がある。鋳型ＤＮＡを基にmＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体等を調製する方法には、該mＲＮＡ又はmＲＮＡ
前駆体等に対応する塩基配列を持ち、かつ必要に応じそ
の上流にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識する部
位、例えば、ＳＰ６、Ｔ７又はＴ３部位などに対応する
塩基配列を持つ鋳型ＤＮＡを化学的に合成し、該ＤＮＡ
を鋳型とし、該部位を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼを用いて、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの４種類のモノヌク
レオチド三リン酸をそれぞれのポリメラーゼに適した条
件下で順次結合させ合成する方法がある。プラスミドを
経てmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を製造する方法は、特
に限定されないが、例えば、次の様に行うことができ
る。即ち、目的とする構造遺伝子はクローニングにより
又はクローニングにより得た該遺伝子を組み込んだプラ
スミドから調製する。次いで、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼが認識する部位を上流に持つ、任意の構造遺伝
子のプラスミドを用いて、任意の構造遺伝子の上流と下
流とに存在する異種又は同種の制限酵素部位を、それぞ
れに対する制限酵素で切断する。なお、これらの制限酵
素部位は、目的とする構造遺伝子のそれぞれ上流及び下
流に存在する制限酵素部位と一致していることが必要で
ある。そして、クローニング等により得た該構造遺伝子
を組み込んだＤＮＡ又はプラスミドについても同一の制
限酵素で切断し、これをプラスミドから置換すべき構造
遺伝子を除去した部分にＤＮＡリガーゼの作用を利用し
て結合させる。クローニング等により得た該構造遺伝子
を組み込んだＤＮＡ又はプラスミドについて、対応する
制限酵素部位がない場合は、化学合成により得られたオ
リゴデオキシヌクレオチドを該構造遺伝子にリガーゼ等
で結合させ、目的のものを得ることができる。この様に
して得たプラスミドを、例えば大腸菌等に導入し、それ
を寒天培地等に蒔いて培養し、コロニーを形成させる。
目的の遺伝子が確かに含まれているか否かをポリメラー
ゼチェーン反応(PCR)等を利用して確認する。目的に合
致したコロニーについては、必要に応じ、それを更に大
腸菌等の増殖作用を利用して大量に複製する。ここで、
大腸菌としては、例えばE. Coli JM109、E. Coli HB10
1、E. Coli DH5等を用いることができる。次いで、大腸
菌からプラスミドを抽出精製し、目的のプラスミドを入
手する。その方法は特に限定されないが、例えば、次の
様に行うことができる。即ち、まず、目的とするプラス
ミドを含有する大腸菌等の細胞を遠心分離操作により集
める。ついで、該細胞にＧＴＥ溶液(50mMグルコース, 2
5mM Tris・Cl及び10mM EDTA 含有, pH=8.0)を加えて懸
濁し、リゾチーム溶液及び水酸化ナトリウム−ドデシル
硫酸ナトリウム混合溶液を用いて細胞を溶解させる。酢
酸カリウムを加えて中和し、不溶物質を遠心分離操作で
除去する。蛋白質を除去するため、フェノール−クロロ
ホルム−イソアミルアルコール(２５：２４：１)の混合
溶液を加えて振り混ぜる。遠心分離操作を行って上層
(水相)を取り出し、水相と等量の2-プロパノールを加え
て撹拌し、室温でしばらく置く。これを遠心分離して得
られたものが目的のプラスミドを含有する。次いで、こ
れを適量のＴＥ(10mM Tris・Cl及び1mM EDTA含有、pH=
8.0)に溶かし、それを塩化セシウムの密度勾配分離用液
に混ぜ、超遠心分離操作により分離する。塩化セシウム
は、プラスミドをＴＥに対して透析することにより除去
することができる。この様にして得たプラスミドは、ア
ガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法、パルスフィールドゲル電気泳動法、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー法、沈降速度法、光散乱法等によって
分子量を決定することができる。更に、目的の蛋白質を
コードする塩基配列が含まれていることは、Ｓanger法
又はＭaxam-Ｇilbert法を用いて調べることができる。
この様にして得られたプラスミドを用いて目的の蛋白質
の全て又は一部をコードするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等を大量に調製する。このとき、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等を大量に調製するためには、Ｐromega社製のＲib
oＭＡＸTM ＬargeＳcale ＲＮＡ Ｐroduction Ｓystems
のキット等を用いることができる。実験方法は、同キッ
トに添付の方法に準じて行うことができる。なお、必要
に応じて、プラスミドの適当な部位を制限酵素等で切断
し、直鎖状にして用いる。調製した該mＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体等の濃度は紫外領域での吸収スペクトルから求
めることができる。又、アガロースゲル電気泳動又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、それをエチジウ
ムブロマイド溶液に浸し、その後ゲルに紫外光を照射し
つつ、目的物のバンドの光り方の程度を、濃度及び分子
量が既知のＲＮＡと比較することによっても求めること
ができる。
又はＲＮＡ 本発明に用いられる目的とする蛋白質をコードするＤＮ
Ａ又はＲＮＡ、特に本発明に好ましいmＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体は以下の手順で調製、精製、更には標識化して
使用される。mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の調製 目的とする蛋白質をコードするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆
体等は、当該遺伝子、即ち、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の塩基配列を文献等の情報に
より又は実験を行うことにより調べ、直接又は鋳型ＤＮ
Ａ又はプラスミドの調製を経る等の方法により調製する
ことができる(J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniat
is, Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年)。mＲ
ＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の直接調製法としては、得ら
れた塩基配列に基づいて自動合成機などを用いて化学合
成する方法がある。鋳型ＤＮＡを基にmＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体等を調製する方法には、該mＲＮＡ又はmＲＮＡ
前駆体等に対応する塩基配列を持ち、かつ必要に応じそ
の上流にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが認識する部
位、例えば、ＳＰ６、Ｔ７又はＴ３部位などに対応する
塩基配列を持つ鋳型ＤＮＡを化学的に合成し、該ＤＮＡ
を鋳型とし、該部位を認識するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼを用いて、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの４種類のモノヌク
レオチド三リン酸をそれぞれのポリメラーゼに適した条
件下で順次結合させ合成する方法がある。プラスミドを
経てmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を製造する方法は、特
に限定されないが、例えば、次の様に行うことができ
る。即ち、目的とする構造遺伝子はクローニングにより
又はクローニングにより得た該遺伝子を組み込んだプラ
スミドから調製する。次いで、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼが認識する部位を上流に持つ、任意の構造遺伝
子のプラスミドを用いて、任意の構造遺伝子の上流と下
流とに存在する異種又は同種の制限酵素部位を、それぞ
れに対する制限酵素で切断する。なお、これらの制限酵
素部位は、目的とする構造遺伝子のそれぞれ上流及び下
流に存在する制限酵素部位と一致していることが必要で
ある。そして、クローニング等により得た該構造遺伝子
を組み込んだＤＮＡ又はプラスミドについても同一の制
限酵素で切断し、これをプラスミドから置換すべき構造
遺伝子を除去した部分にＤＮＡリガーゼの作用を利用し
て結合させる。クローニング等により得た該構造遺伝子
を組み込んだＤＮＡ又はプラスミドについて、対応する
制限酵素部位がない場合は、化学合成により得られたオ
リゴデオキシヌクレオチドを該構造遺伝子にリガーゼ等
で結合させ、目的のものを得ることができる。この様に
して得たプラスミドを、例えば大腸菌等に導入し、それ
を寒天培地等に蒔いて培養し、コロニーを形成させる。
目的の遺伝子が確かに含まれているか否かをポリメラー
ゼチェーン反応(PCR)等を利用して確認する。目的に合
致したコロニーについては、必要に応じ、それを更に大
腸菌等の増殖作用を利用して大量に複製する。ここで、
大腸菌としては、例えばE. Coli JM109、E. Coli HB10
1、E. Coli DH5等を用いることができる。次いで、大腸
菌からプラスミドを抽出精製し、目的のプラスミドを入
手する。その方法は特に限定されないが、例えば、次の
様に行うことができる。即ち、まず、目的とするプラス
ミドを含有する大腸菌等の細胞を遠心分離操作により集
める。ついで、該細胞にＧＴＥ溶液(50mMグルコース, 2
5mM Tris・Cl及び10mM EDTA 含有, pH=8.0)を加えて懸
濁し、リゾチーム溶液及び水酸化ナトリウム−ドデシル
硫酸ナトリウム混合溶液を用いて細胞を溶解させる。酢
酸カリウムを加えて中和し、不溶物質を遠心分離操作で
除去する。蛋白質を除去するため、フェノール−クロロ
ホルム−イソアミルアルコール(２５：２４：１)の混合
溶液を加えて振り混ぜる。遠心分離操作を行って上層
(水相)を取り出し、水相と等量の2-プロパノールを加え
て撹拌し、室温でしばらく置く。これを遠心分離して得
られたものが目的のプラスミドを含有する。次いで、こ
れを適量のＴＥ(10mM Tris・Cl及び1mM EDTA含有、pH=
8.0)に溶かし、それを塩化セシウムの密度勾配分離用液
に混ぜ、超遠心分離操作により分離する。塩化セシウム
は、プラスミドをＴＥに対して透析することにより除去
することができる。この様にして得たプラスミドは、ア
ガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法、パルスフィールドゲル電気泳動法、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー法、沈降速度法、光散乱法等によって
分子量を決定することができる。更に、目的の蛋白質を
コードする塩基配列が含まれていることは、Ｓanger法
又はＭaxam-Ｇilbert法を用いて調べることができる。
この様にして得られたプラスミドを用いて目的の蛋白質
の全て又は一部をコードするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等を大量に調製する。このとき、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等を大量に調製するためには、Ｐromega社製のＲib
oＭＡＸTM ＬargeＳcale ＲＮＡ Ｐroduction Ｓystems
のキット等を用いることができる。実験方法は、同キッ
トに添付の方法に準じて行うことができる。なお、必要
に応じて、プラスミドの適当な部位を制限酵素等で切断
し、直鎖状にして用いる。調製した該mＲＮＡ又はmＲＮ
Ａ前駆体等の濃度は紫外領域での吸収スペクトルから求
めることができる。又、アガロースゲル電気泳動又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、それをエチジウ
ムブロマイド溶液に浸し、その後ゲルに紫外光を照射し
つつ、目的物のバンドの光り方の程度を、濃度及び分子
量が既知のＲＮＡと比較することによっても求めること
ができる。
【０００７】mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の末端標識化 目的とする蛋白質をコードするmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆
体の全部又は一部については、その一端をラジオアイソ
トープや蛍光物質等で標識して用いるのが好ましい。標
識方法として特に限定されたものはないが、5'末端を標
識するには、例えば、まず、アルカリフォスファターゼ
でＲＮＡの5'末端のリン酸基を除去し、次に、この脱リ
ン酸化したmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を用い、5'末端
を標識化する。すなわち、Ｔ4ポリヌクレオチドキナー
ゼで[γ-32Ｐ]ＡＴＰのγ位のリン酸基をＲＮＡの5'位
水酸基に転移させる操作を行う(J. Sambrook, E. F. Fr
itsch, T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laborato
ry Manual 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1989年)。これらの際、操作途中にＲＮaseが混在す
る可能性が除去できないため、リボヌクレアーゼ阻害剤
の存在下で反応を行う。又、高次構造をとるＲＮＡの標
識化を効率よく行うために、ジメチルスルフォキシド(D
MSO)を適当に、例えば最終濃度７.５〜１５％となるよ
うに添加する。なお、反応混合液組成物の[γ-32Ｐ]Ａ
ＴＰの代わりに[γ-33Ｐ]ＡＴＰ等を用いることもでき
る。3'末端を標識する場合は、例えば次の様に行うこと
ができる(添田・久原・高岩共著, 核酸の塩基配列決定法,
121−122頁, 学会出版センター, 1987年)。即ち、脱リ
ン酸化した3'末端を持つmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等に
[5'-32Ｐ]pＮp(ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ等のヌ
クレオシドを表し、Ｎの前のpはヌクレオシドの5'位に
リン酸が結合していることを、又Ｎの後のpはヌクレオ
シドの3'位にリン酸が結合していることを示す。ここで
5'位のリン酸はリンとして放射性同位元素である32Ｐを
含む。32Ｐにかわるものとして、33Ｐ等、Ｔ4ＲＮＡリ
ガーゼの基質となりうるものならば他の放射性同位元素
でも良い)をＴ4ＲＮＡリガーゼを用いて結合させること
により、3'末端が標識されたmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等を得ることができる。末端標識化mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の精製 上述の操作で得られた末端標識化mＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等には、目的とする完全長のmＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等以外に実験操作途中に生じた様々な短鎖のmＲＮ
Ａ又はmＲＮＡ前駆体等で標識化されたものも混在して
いる場合がある。従って、本発明の目的を効率良く達成
するために、末端を標識した完全長又は所望の長さのm
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体のみを用いたいときには、分
離・回収して精製する必要がある。分離は、末端標識化
mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を熱変性し、それをアガロ
ースゲル電気泳動にかけて行い、ＲＮＡの検出は泳動終
了後のゲルへの紫外線の照射により行う。末端標識化m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の濃度は同時に泳動を行っ
た濃度既知のＲＮＡの濃度を基準に計算する。次に、目
的のＲＮＡを含むバンドのみを切り出してＲＮＡを回収
し、それを精製する。これら一連の操作を行う方法は特
に限定されないが、たとえばＲＮaidR Kit(BIO101社製)
を用い、そこで指定された方法で行うことができる。
体の全部又は一部については、その一端をラジオアイソ
トープや蛍光物質等で標識して用いるのが好ましい。標
識方法として特に限定されたものはないが、5'末端を標
識するには、例えば、まず、アルカリフォスファターゼ
でＲＮＡの5'末端のリン酸基を除去し、次に、この脱リ
ン酸化したmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を用い、5'末端
を標識化する。すなわち、Ｔ4ポリヌクレオチドキナー
ゼで[γ-32Ｐ]ＡＴＰのγ位のリン酸基をＲＮＡの5'位
水酸基に転移させる操作を行う(J. Sambrook, E. F. Fr
itsch, T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laborato
ry Manual 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1989年)。これらの際、操作途中にＲＮaseが混在す
る可能性が除去できないため、リボヌクレアーゼ阻害剤
の存在下で反応を行う。又、高次構造をとるＲＮＡの標
識化を効率よく行うために、ジメチルスルフォキシド(D
MSO)を適当に、例えば最終濃度７.５〜１５％となるよ
うに添加する。なお、反応混合液組成物の[γ-32Ｐ]Ａ
ＴＰの代わりに[γ-33Ｐ]ＡＴＰ等を用いることもでき
る。3'末端を標識する場合は、例えば次の様に行うこと
ができる(添田・久原・高岩共著, 核酸の塩基配列決定法,
121−122頁, 学会出版センター, 1987年)。即ち、脱リ
ン酸化した3'末端を持つmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等に
[5'-32Ｐ]pＮp(ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ等のヌ
クレオシドを表し、Ｎの前のpはヌクレオシドの5'位に
リン酸が結合していることを、又Ｎの後のpはヌクレオ
シドの3'位にリン酸が結合していることを示す。ここで
5'位のリン酸はリンとして放射性同位元素である32Ｐを
含む。32Ｐにかわるものとして、33Ｐ等、Ｔ4ＲＮＡリ
ガーゼの基質となりうるものならば他の放射性同位元素
でも良い)をＴ4ＲＮＡリガーゼを用いて結合させること
により、3'末端が標識されたmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等を得ることができる。末端標識化mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の精製 上述の操作で得られた末端標識化mＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等には、目的とする完全長のmＲＮＡ又はmＲＮＡ前
駆体等以外に実験操作途中に生じた様々な短鎖のmＲＮ
Ａ又はmＲＮＡ前駆体等で標識化されたものも混在して
いる場合がある。従って、本発明の目的を効率良く達成
するために、末端を標識した完全長又は所望の長さのm
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体のみを用いたいときには、分
離・回収して精製する必要がある。分離は、末端標識化
mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等を熱変性し、それをアガロ
ースゲル電気泳動にかけて行い、ＲＮＡの検出は泳動終
了後のゲルへの紫外線の照射により行う。末端標識化m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の濃度は同時に泳動を行っ
た濃度既知のＲＮＡの濃度を基準に計算する。次に、目
的のＲＮＡを含むバンドのみを切り出してＲＮＡを回収
し、それを精製する。これら一連の操作を行う方法は特
に限定されないが、たとえばＲＮaidR Kit(BIO101社製)
を用い、そこで指定された方法で行うことができる。
【０００８】探索のための反応条件の検討 探索のための実験条件としては、実験に用いるオリゴ核
酸、標識化したmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等、及びＲＮ
ase Ｈなどの核酸分解能を有する化合物が安定に存在す
る条件が採用されるが、生物体の通常の条件下における
アンチセンス核酸標的部位を探索する目的には、可能な
限り生物体の存在する条件と同じ条件の下で行うのが望
ましい。即ち、一般的には、温度３７℃程度、イオン強
度０.１５M程度、圧力１気圧程度の条件で行うのが望ま
しい。探索のために用いるランダム配列オリゴ核酸の鎖
長は、前記した様に、鎖長が長くなる程mＲＮＡ又はmＲ
ＮＡ前駆体とのハイブリッド形成能が増加するので本発
明にとり好ましいが、同時に自己構造をとる可能性も高
くなるので不必要に長くする必要はなく、４量体以上で
あればよく、好ましくは６量体以上であり、特に好まし
くは９量体以上であり、長いものとしては、通常アンチ
センス核酸として用いられる２０乃至３０量体が実用的
な長さの限度であり、細胞実験や動物実験で用いるアン
チセンス核酸と同程度、さらには同一の鎖長のランダム
配列オリゴ核酸を用いると特に好都合である。用いるオ
リゴ核酸の濃度は、たとえばランダム配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチド９量体を用い、ＲＮase Ｈを０.
０６ユニットU/μl用いた場合は、0.１乃至５００μMで
行うことができ、好ましくは１乃至５０μMである。ま
た、たとえばランダム配列のオリゴデオキシリボヌクレ
オチド２０量体を用い、ＲＮaseＨを０.００６ユニット
U/μl用いた場合は、0.１乃至５０μMで行うことがで
き、好ましくは、１乃至５μMである。３７℃で１０秒
もしくは１分程度から１８０分程度の間の反応の経時変
化を追跡し、ハイブリダイズ(対合)の状況または反応の
進行程度を測定する。ランダム配列オリゴ核酸の鎖長が
短いものを用いて反応を行う場合は、核酸濃度を増加さ
せる、反応時間を長くする、又はＲＮase Ｈの量を増加
させる、等の条件変更を考慮して反応を行う。反応が終
了した該混合液には変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動用の色素入り泳動用緩衝液を加え、９５℃で５分間熱
変性させ、その後直ちに氷中に移し、そこで３分間保
つ。これを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
る。泳動は、たとえば定電圧(５０V/cm程度)下で適当な
時間(３０分程度から数時間程度)行う。その後、変性ポ
リアクリルアミドゲルをそのまま固定化してオートラジ
オグラフィーを行い、もとのmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等以外の断片の生成の有無について調べる。この際、m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体にオリゴ核酸混合物が結合し
ている部位を特異的に効率よく検出するために、例えば
ＲＮase Ｈなどの核酸分解能を有する物質の共存下で反
応を行ったのであれば、それにより引き起こされる切断
部位を上記の方法で容易に検出することができる。すな
わち、該部位で切断されていることをポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの分析化学的手法により検出する
ことができる。
酸、標識化したmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等、及びＲＮ
ase Ｈなどの核酸分解能を有する化合物が安定に存在す
る条件が採用されるが、生物体の通常の条件下における
アンチセンス核酸標的部位を探索する目的には、可能な
限り生物体の存在する条件と同じ条件の下で行うのが望
ましい。即ち、一般的には、温度３７℃程度、イオン強
度０.１５M程度、圧力１気圧程度の条件で行うのが望ま
しい。探索のために用いるランダム配列オリゴ核酸の鎖
長は、前記した様に、鎖長が長くなる程mＲＮＡ又はmＲ
ＮＡ前駆体とのハイブリッド形成能が増加するので本発
明にとり好ましいが、同時に自己構造をとる可能性も高
くなるので不必要に長くする必要はなく、４量体以上で
あればよく、好ましくは６量体以上であり、特に好まし
くは９量体以上であり、長いものとしては、通常アンチ
センス核酸として用いられる２０乃至３０量体が実用的
な長さの限度であり、細胞実験や動物実験で用いるアン
チセンス核酸と同程度、さらには同一の鎖長のランダム
配列オリゴ核酸を用いると特に好都合である。用いるオ
リゴ核酸の濃度は、たとえばランダム配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチド９量体を用い、ＲＮase Ｈを０.
０６ユニットU/μl用いた場合は、0.１乃至５００μMで
行うことができ、好ましくは１乃至５０μMである。ま
た、たとえばランダム配列のオリゴデオキシリボヌクレ
オチド２０量体を用い、ＲＮaseＨを０.００６ユニット
U/μl用いた場合は、0.１乃至５０μMで行うことがで
き、好ましくは、１乃至５μMである。３７℃で１０秒
もしくは１分程度から１８０分程度の間の反応の経時変
化を追跡し、ハイブリダイズ(対合)の状況または反応の
進行程度を測定する。ランダム配列オリゴ核酸の鎖長が
短いものを用いて反応を行う場合は、核酸濃度を増加さ
せる、反応時間を長くする、又はＲＮase Ｈの量を増加
させる、等の条件変更を考慮して反応を行う。反応が終
了した該混合液には変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動用の色素入り泳動用緩衝液を加え、９５℃で５分間熱
変性させ、その後直ちに氷中に移し、そこで３分間保
つ。これを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
る。泳動は、たとえば定電圧(５０V/cm程度)下で適当な
時間(３０分程度から数時間程度)行う。その後、変性ポ
リアクリルアミドゲルをそのまま固定化してオートラジ
オグラフィーを行い、もとのmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体
等以外の断片の生成の有無について調べる。この際、m
ＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体にオリゴ核酸混合物が結合し
ている部位を特異的に効率よく検出するために、例えば
ＲＮase Ｈなどの核酸分解能を有する物質の共存下で反
応を行ったのであれば、それにより引き起こされる切断
部位を上記の方法で容易に検出することができる。すな
わち、該部位で切断されていることをポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの分析化学的手法により検出する
ことができる。
【０００９】探索結果に基づくアンチセンス核酸標的部
位の確定 以上の結果から、該mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等上にお
ける、アンチセンス核酸の標的部位を確定できる。即
ち、切断された断片の大きさから、どの部位で切断が起
こっているかがわかる。特に、反応の初期に見られる切
断片は、アンチセンス核酸の標的部位を確定するのに有
力な手がかりを与える。これらの結果をもとに、切断部
位を含むその近傍の部位を、アンチセンス核酸の標的部
位として確定することができる。アンチセンス核酸効果の確認 確定したアンチセンス核酸標的部位に相補的な塩基配列
をもつ核酸が、本発明が目的とするアンチセンス核酸で
あり、当該アンチセンス核酸のアンチセンス核酸として
の効果の確認は、目的とする蛋白質をコードする遺伝子
を含むプラスミド又はＤＮＡを用い、該アンチセンス核
酸の存在下に、無細胞転写翻訳系において、目的とする
蛋白質の発現量を調べることにより行うことができる。
又、目的とする蛋白質をコードするmＲＮＡを用い、当
該アンチセンス核酸を共存させ、翻訳系において、目的
とする蛋白質の発現量を調べることにより行うこともで
きる。転写翻訳系及び翻訳系としては、目的とする蛋白
質を産生するものならばいずれも利用することができ、
兎網状赤血球溶解物由来の転写翻訳系及び翻訳系並びに
小麦胚由来の転写翻訳系及び翻訳系等を利用することが
できる。これらの転写翻訳系及び翻訳系においては、た
とえば、L-35S-メチオニン、L-35S-システイン、及びL-
3H-スレオニンなどの放射性同位元素で標識したアミノ
酸を加え、その蛋白質への取り込みを指標に蛋白質の発
現量を知ることができる。ここで、アンチセンス核酸効
果、即ち、目的とする蛋白質に対する発現阻害効果を高
めるためにＲＮＡ分解酵素の一つであるＲＮase Ｈを加
えることができる。ＲＮase Ｈは、ＲＮＡが、その塩基
配列に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドと水素
結合を介して２本鎖を形成したとき、ＲＮＡをその２本
鎖形成部分で切断する酵素である(H. Stein, P. Hause
n, Science 166巻 393-395頁, 1969年；P. Hausen,H. S
tein, European Journal of Biochemistry, 14巻 278-2
83頁, 1970年)。この酵素を共存させることにより、そ
の遺伝子がコードする蛋白質の産生阻害がいっそう確実
に行われるようになる。上述のような無細胞系のかわり
に、細胞系を用いて、該標的部位に相補的な塩基配列を
持つアンチセンス核酸を細胞に添加し、目的とする蛋白
質の発現を調べることもできる。そのような細胞系とし
ては、目的とする蛋白質を発現するものを利用すること
ができる。上述の転写翻訳系又は翻訳系で目的とする蛋
白質の生成を確認する方法としては、目的とする蛋白質
であることを確実に判明できる方法が用いられ、それら
の中から種々の要件を考慮して任意に選択することがで
き、その代表例として以下の２つを挙げることができ
る。第一の方法として、目的とする蛋白質に対する抗体
を用いて確認する方法、例えばサンドイッチ方式の酵素
免疫測定法(例えばE. Harlow, D. Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988年参照)が挙げられる。この方法は一般によく知ら
れた方法であり、具体的には、マイクロタイタープレー
ト等に上述の抗体を常法(例えば、上掲のE. Harlow, D.
Lane, Antibodies:A Laboratory Manual参照)に従って
固定化し、ついで、目的の蛋白質をコードする遺伝子を
転写翻訳系に加えて適当な温度に維持した後マイクロタ
イタープレート等に入れて室温で放置し、洗浄する。し
かる後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ等で標識した、
目的の蛋白質に対する抗体を添加して室温で放置した後
に洗浄し、酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼの基
質として、例えば、オルト−ジアミノベンゼンを含有す
る溶液を加え、適度に発色するまで室温で放置後、吸光
度を測定し、目的とする蛋白質の含有量を評価する。な
お、この方法は、細胞系において、該標的部位に相補的
な塩基配列を持つアンチセンス核酸を添加し、目的とす
る蛋白質の発現を調べる際にも用いることができる。第
二の方法として、目的とする蛋白質が上述の転写翻訳系
又は翻訳系で生成することをラジオアイソトープでラベ
ルしたアミノ酸の取り込みを指標にＳＤＳ−ＰＡＧＥ
(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法)及びオートラジオグラフィーを用いて確認す
る方法がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、常法(例えば、Pro
mega社の転写翻訳系キットに添付されている手順書及び
高木俊夫, PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動法, 広
川書店,1990年参照)に従えばよく、典型的な例は、次の
とおりである。転写翻訳系又は翻訳系の反応混合液に2-
メルカプトエタノール含有のＳＤＳＳample緩衝液(Prom
ega社の手順書による)を加えて密栓後、熱処理を行って
蛋白質を変性させる。このサンプルを泳動槽に取り付け
たドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの
ウェルに添加し、電気泳動を行う。その後、オートラジ
オグラフィーを行うために、ゲルを濾紙に移し、ゲル乾
燥装置を用いて乾燥させ、次いで、暗室中でそのゲルを
Ｘ線用フィルムと重ねてカセットに入れ、数時間から数
十時間、室温で放置したあと、該Ｘ線用フィルムを現像
する。目的とする蛋白質が発現していれば、該蛋白質の
分子量に応じた位置にバンドが出現する。アンチセンス
核酸化合物によって該蛋白質の発現が阻害されている場
合には、該バンドは発現しないか又は発現が弱くなる。
無細胞転写翻訳系等の無細胞系でアンチセンス核酸効果
を評価する際のアンチセンス核酸化合物の濃度は、天然
型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いた場合、
０.１〜１０μM、好ましくは０.４〜２μMである。特に
好ましくは、ＲＮase Ｈ共存下０.４μMである。ホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用
いた場合のアンチセンス核酸化合物の濃度は、０.０１
〜１μM、好ましくは０.０２〜０.４μMである。特に好
ましくは、ＲＮase Ｈ共存下０.０６４μM又は０.１５
μMである。細胞系でアンチセンス核酸効果を評価する
際のアンチセンス核酸化合物の濃度は、天然型のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを用いた場合、０.１〜１０
０μM、好ましくは０.５〜３０μMである。ホスホロチ
オエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いた
場合のアンチセンス核酸化合物の濃度は０.０１〜１０
０μM、好ましくは０.０５〜３０μMである。又、必要
に応じ、例えばリポフェクチン試薬やＤＯＴＡＰ試薬等
の細胞内導入試薬をアンチセンス核酸の導入効率を上げ
るために用いることができる。添加した核酸化合物、す
なわち、アンチセンス核酸化合物の、目的とする蛋白質
をコードする遺伝子に対する発現阻害効果は、それを添
加しない場合と比較することで行うことができる。例え
ば、目的とする蛋白質が生成するか否かの確認方法に記
載の通り、産生した目的の蛋白質を前記ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離し、それをオートラジオグラフィーに付し、そ
の黒化度をデンシトメータで定量すればよい。そして、
アンチセンス核酸化合物を添加した場合の黒化度を添加
しない場合の黒化度と比較することにより評価すること
ができる。なお、この方法は、細胞系において、標的部
位に相補的な塩基配列を持つアンチセンス核酸を添加
し、目的とする蛋白質の発現を調べる際にも、免疫沈降
法で目的の蛋白質のみを選択的に選び出したあとに適用
することができる。かかる比較によって、遺伝子の発現
阻害率を求めることができ、探索により決定した標的部
位に相補的なアンチセンス核酸による蛋白質発現阻害効
果を確認することができる。
位の確定 以上の結果から、該mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等上にお
ける、アンチセンス核酸の標的部位を確定できる。即
ち、切断された断片の大きさから、どの部位で切断が起
こっているかがわかる。特に、反応の初期に見られる切
断片は、アンチセンス核酸の標的部位を確定するのに有
力な手がかりを与える。これらの結果をもとに、切断部
位を含むその近傍の部位を、アンチセンス核酸の標的部
位として確定することができる。アンチセンス核酸効果の確認 確定したアンチセンス核酸標的部位に相補的な塩基配列
をもつ核酸が、本発明が目的とするアンチセンス核酸で
あり、当該アンチセンス核酸のアンチセンス核酸として
の効果の確認は、目的とする蛋白質をコードする遺伝子
を含むプラスミド又はＤＮＡを用い、該アンチセンス核
酸の存在下に、無細胞転写翻訳系において、目的とする
蛋白質の発現量を調べることにより行うことができる。
又、目的とする蛋白質をコードするmＲＮＡを用い、当
該アンチセンス核酸を共存させ、翻訳系において、目的
とする蛋白質の発現量を調べることにより行うこともで
きる。転写翻訳系及び翻訳系としては、目的とする蛋白
質を産生するものならばいずれも利用することができ、
兎網状赤血球溶解物由来の転写翻訳系及び翻訳系並びに
小麦胚由来の転写翻訳系及び翻訳系等を利用することが
できる。これらの転写翻訳系及び翻訳系においては、た
とえば、L-35S-メチオニン、L-35S-システイン、及びL-
3H-スレオニンなどの放射性同位元素で標識したアミノ
酸を加え、その蛋白質への取り込みを指標に蛋白質の発
現量を知ることができる。ここで、アンチセンス核酸効
果、即ち、目的とする蛋白質に対する発現阻害効果を高
めるためにＲＮＡ分解酵素の一つであるＲＮase Ｈを加
えることができる。ＲＮase Ｈは、ＲＮＡが、その塩基
配列に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドと水素
結合を介して２本鎖を形成したとき、ＲＮＡをその２本
鎖形成部分で切断する酵素である(H. Stein, P. Hause
n, Science 166巻 393-395頁, 1969年；P. Hausen,H. S
tein, European Journal of Biochemistry, 14巻 278-2
83頁, 1970年)。この酵素を共存させることにより、そ
の遺伝子がコードする蛋白質の産生阻害がいっそう確実
に行われるようになる。上述のような無細胞系のかわり
に、細胞系を用いて、該標的部位に相補的な塩基配列を
持つアンチセンス核酸を細胞に添加し、目的とする蛋白
質の発現を調べることもできる。そのような細胞系とし
ては、目的とする蛋白質を発現するものを利用すること
ができる。上述の転写翻訳系又は翻訳系で目的とする蛋
白質の生成を確認する方法としては、目的とする蛋白質
であることを確実に判明できる方法が用いられ、それら
の中から種々の要件を考慮して任意に選択することがで
き、その代表例として以下の２つを挙げることができ
る。第一の方法として、目的とする蛋白質に対する抗体
を用いて確認する方法、例えばサンドイッチ方式の酵素
免疫測定法(例えばE. Harlow, D. Lane, Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988年参照)が挙げられる。この方法は一般によく知ら
れた方法であり、具体的には、マイクロタイタープレー
ト等に上述の抗体を常法(例えば、上掲のE. Harlow, D.
Lane, Antibodies:A Laboratory Manual参照)に従って
固定化し、ついで、目的の蛋白質をコードする遺伝子を
転写翻訳系に加えて適当な温度に維持した後マイクロタ
イタープレート等に入れて室温で放置し、洗浄する。し
かる後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ等で標識した、
目的の蛋白質に対する抗体を添加して室温で放置した後
に洗浄し、酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼの基
質として、例えば、オルト−ジアミノベンゼンを含有す
る溶液を加え、適度に発色するまで室温で放置後、吸光
度を測定し、目的とする蛋白質の含有量を評価する。な
お、この方法は、細胞系において、該標的部位に相補的
な塩基配列を持つアンチセンス核酸を添加し、目的とす
る蛋白質の発現を調べる際にも用いることができる。第
二の方法として、目的とする蛋白質が上述の転写翻訳系
又は翻訳系で生成することをラジオアイソトープでラベ
ルしたアミノ酸の取り込みを指標にＳＤＳ−ＰＡＧＥ
(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法)及びオートラジオグラフィーを用いて確認す
る方法がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、常法(例えば、Pro
mega社の転写翻訳系キットに添付されている手順書及び
高木俊夫, PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動法, 広
川書店,1990年参照)に従えばよく、典型的な例は、次の
とおりである。転写翻訳系又は翻訳系の反応混合液に2-
メルカプトエタノール含有のＳＤＳＳample緩衝液(Prom
ega社の手順書による)を加えて密栓後、熱処理を行って
蛋白質を変性させる。このサンプルを泳動槽に取り付け
たドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの
ウェルに添加し、電気泳動を行う。その後、オートラジ
オグラフィーを行うために、ゲルを濾紙に移し、ゲル乾
燥装置を用いて乾燥させ、次いで、暗室中でそのゲルを
Ｘ線用フィルムと重ねてカセットに入れ、数時間から数
十時間、室温で放置したあと、該Ｘ線用フィルムを現像
する。目的とする蛋白質が発現していれば、該蛋白質の
分子量に応じた位置にバンドが出現する。アンチセンス
核酸化合物によって該蛋白質の発現が阻害されている場
合には、該バンドは発現しないか又は発現が弱くなる。
無細胞転写翻訳系等の無細胞系でアンチセンス核酸効果
を評価する際のアンチセンス核酸化合物の濃度は、天然
型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いた場合、
０.１〜１０μM、好ましくは０.４〜２μMである。特に
好ましくは、ＲＮase Ｈ共存下０.４μMである。ホスホ
ロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用
いた場合のアンチセンス核酸化合物の濃度は、０.０１
〜１μM、好ましくは０.０２〜０.４μMである。特に好
ましくは、ＲＮase Ｈ共存下０.０６４μM又は０.１５
μMである。細胞系でアンチセンス核酸効果を評価する
際のアンチセンス核酸化合物の濃度は、天然型のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを用いた場合、０.１〜１０
０μM、好ましくは０.５〜３０μMである。ホスホロチ
オエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いた
場合のアンチセンス核酸化合物の濃度は０.０１〜１０
０μM、好ましくは０.０５〜３０μMである。又、必要
に応じ、例えばリポフェクチン試薬やＤＯＴＡＰ試薬等
の細胞内導入試薬をアンチセンス核酸の導入効率を上げ
るために用いることができる。添加した核酸化合物、す
なわち、アンチセンス核酸化合物の、目的とする蛋白質
をコードする遺伝子に対する発現阻害効果は、それを添
加しない場合と比較することで行うことができる。例え
ば、目的とする蛋白質が生成するか否かの確認方法に記
載の通り、産生した目的の蛋白質を前記ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離し、それをオートラジオグラフィーに付し、そ
の黒化度をデンシトメータで定量すればよい。そして、
アンチセンス核酸化合物を添加した場合の黒化度を添加
しない場合の黒化度と比較することにより評価すること
ができる。なお、この方法は、細胞系において、標的部
位に相補的な塩基配列を持つアンチセンス核酸を添加
し、目的とする蛋白質の発現を調べる際にも、免疫沈降
法で目的の蛋白質のみを選択的に選び出したあとに適用
することができる。かかる比較によって、遺伝子の発現
阻害率を求めることができ、探索により決定した標的部
位に相補的なアンチセンス核酸による蛋白質発現阻害効
果を確認することができる。
【００１０】
【作用】アンチセンス核酸の標的部位として、mＲＮＡ
又はmＲＮＡ前駆体上で一本鎖になっている部位、アン
チセンス核酸であるオリゴデオキシリボヌクレオチド若
しくはホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチド等が結合しやすい部位、及びオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド若しくはホスホロチオエート型オリゴデオ
キシリボヌクレオチドが結合することによって核酸分解
能を有する物質、例えばＲＮase Ｈの作用を受け切断さ
れやすくなっている部位が、オリゴ核酸の各位置にＧ、
Ａ、Ｃ、Ｔ(又はＵ)の４種の核酸塩基をランダムに有す
るオリゴ核酸の集合体を用いることにより確定されるの
である。
又はmＲＮＡ前駆体上で一本鎖になっている部位、アン
チセンス核酸であるオリゴデオキシリボヌクレオチド若
しくはホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチド等が結合しやすい部位、及びオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド若しくはホスホロチオエート型オリゴデオ
キシリボヌクレオチドが結合することによって核酸分解
能を有する物質、例えばＲＮase Ｈの作用を受け切断さ
れやすくなっている部位が、オリゴ核酸の各位置にＧ、
Ａ、Ｃ、Ｔ(又はＵ)の４種の核酸塩基をランダムに有す
るオリゴ核酸の集合体を用いることにより確定されるの
である。
【００１１】
【実施例】mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体等の大量調製 血管内皮細胞増殖因子[ＶＥＧＦ:別名血管透過性因子
(ＶＰＦ)]をコードする６３５塩基からなるmＲＮＡを、
目的とする塩基配列を有するプラスミドを経る方法によ
り、以下の様にして大量調製した。 （１）プラスミドの構築及び塩基配列の決定 プラスミドpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)(Promega社製)に含
まれるルシフェラーゼ構造遺伝子の上流と下流をそれぞ
れ制限酵素ＡpaI及び制限酵素ＳacIで切断した。一方、
ＰＣＲ法により得たヒト由来ＶＥＧＦをコードする遺伝
子を、プラスミドpＲＣ／ＣＭＶのマルチクローニング
サイト中にあるＡpaI部位とＸbaI部位間に挿入したプラ
スミドpＳＵ０１を構築した。ついで該プラスミドをＶ
ＥＧＦ遺伝子の上流に存在するＡpaI部位及び下流に存
在するＳacI部位をそれぞれに作用する制限酵素ＡpaI及
びＳacIで同様に切断した。pＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)か
ら前記２種の制限酵素(ＡpaI及びＳacI)でルシフェラー
ゼ構造遺伝子を切断除去した残りの部分に、ＶＥＧＦ構
造遺伝子を含みＡpaI及びＳacIで切断された部分をＴak
ara社製のＤＮＡ Ｌigation Ｋitを用いて結合させた。
次に、このようにして得られたプラスミドをＴakara社
製の大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９に、同社の説明
書に従って導入し、大量に複製し、該プラスミドを含有
する大腸菌等の細胞を遠心分離操作により集めた。つい
で、該細胞にＧＴＥ溶液(50mMグルコース, 25mM Tris・
Cl及び10mM EDTA含有, pH=8.0)を加えて懸濁し、その１
／９量のリゾチーム溶液(50mg/ml)及び２０／９量の水
酸化ナトリウム(0.2N)-ドデシル硫酸ナトリウム(1%)混
合溶液を用いて細胞を溶解させた。酢酸カリウム(pH=5.
2)を加えて(最終濃度1M)中和し、不溶物質を遠心分離操
作で除去した。蛋白質を除去するため、フェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール(25 ：24：1)の混合
溶液を加えて振り混ぜた。遠心分離操作を行って上層
(水相)を取り出し、水相と等量の2-プロパノールを加え
て撹拌し、室温でしばらく放置した。これを遠心分離し
て得られたものが目的のプラスミド(pＳＵ０２と命名)
を含有していた。ついで、これを適量のＴＥ(10mM Tris
・Cl及び1mM EDTA含有, pH=8.0)に溶かし、それを塩化セ
シウムの密度勾配分離用液に混ぜ、超遠心分離操作によ
り分離した。得られたプラスミドは、塩化セシウムを除
去するため、ＴＥに対して透析した(前掲のMolecular C
loning参照)。この様にして、目的のプラスミド(pＳＵ
０２)を０.７mg得た。ここで得たプラスミド(pＳＵ０
２)は、約３.６kbp(bp:塩基対)からなることがアガロー
スゲル電気泳動の結果から示された(図１)。図１中、レ
ーン１はpＳＵ０２のみ、レーン２はpＳＵ０２に制限酵
素ＡpaI(10U)処理したもの、レーン３は、pＳＵ０２に
制限酵素ＡpaI(20U)処理したものを表す。Ｍは、分子量
マーカーを表す。次に、pＳＵ０２のうちＶＥＧＦ構造
遺伝子部分およびその前後の部分について、その塩基配
列をＳanger法で決定した。その塩基配列を配列番号１
に示す。
(ＶＰＦ)]をコードする６３５塩基からなるmＲＮＡを、
目的とする塩基配列を有するプラスミドを経る方法によ
り、以下の様にして大量調製した。 （１）プラスミドの構築及び塩基配列の決定 プラスミドpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)(Promega社製)に含
まれるルシフェラーゼ構造遺伝子の上流と下流をそれぞ
れ制限酵素ＡpaI及び制限酵素ＳacIで切断した。一方、
ＰＣＲ法により得たヒト由来ＶＥＧＦをコードする遺伝
子を、プラスミドpＲＣ／ＣＭＶのマルチクローニング
サイト中にあるＡpaI部位とＸbaI部位間に挿入したプラ
スミドpＳＵ０１を構築した。ついで該プラスミドをＶ
ＥＧＦ遺伝子の上流に存在するＡpaI部位及び下流に存
在するＳacI部位をそれぞれに作用する制限酵素ＡpaI及
びＳacIで同様に切断した。pＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)か
ら前記２種の制限酵素(ＡpaI及びＳacI)でルシフェラー
ゼ構造遺伝子を切断除去した残りの部分に、ＶＥＧＦ構
造遺伝子を含みＡpaI及びＳacIで切断された部分をＴak
ara社製のＤＮＡ Ｌigation Ｋitを用いて結合させた。
次に、このようにして得られたプラスミドをＴakara社
製の大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９に、同社の説明
書に従って導入し、大量に複製し、該プラスミドを含有
する大腸菌等の細胞を遠心分離操作により集めた。つい
で、該細胞にＧＴＥ溶液(50mMグルコース, 25mM Tris・
Cl及び10mM EDTA含有, pH=8.0)を加えて懸濁し、その１
／９量のリゾチーム溶液(50mg/ml)及び２０／９量の水
酸化ナトリウム(0.2N)-ドデシル硫酸ナトリウム(1%)混
合溶液を用いて細胞を溶解させた。酢酸カリウム(pH=5.
2)を加えて(最終濃度1M)中和し、不溶物質を遠心分離操
作で除去した。蛋白質を除去するため、フェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール(25 ：24：1)の混合
溶液を加えて振り混ぜた。遠心分離操作を行って上層
(水相)を取り出し、水相と等量の2-プロパノールを加え
て撹拌し、室温でしばらく放置した。これを遠心分離し
て得られたものが目的のプラスミド(pＳＵ０２と命名)
を含有していた。ついで、これを適量のＴＥ(10mM Tris
・Cl及び1mM EDTA含有, pH=8.0)に溶かし、それを塩化セ
シウムの密度勾配分離用液に混ぜ、超遠心分離操作によ
り分離した。得られたプラスミドは、塩化セシウムを除
去するため、ＴＥに対して透析した(前掲のMolecular C
loning参照)。この様にして、目的のプラスミド(pＳＵ
０２)を０.７mg得た。ここで得たプラスミド(pＳＵ０
２)は、約３.６kbp(bp:塩基対)からなることがアガロー
スゲル電気泳動の結果から示された(図１)。図１中、レ
ーン１はpＳＵ０２のみ、レーン２はpＳＵ０２に制限酵
素ＡpaI(10U)処理したもの、レーン３は、pＳＵ０２に
制限酵素ＡpaI(20U)処理したものを表す。Ｍは、分子量
マーカーを表す。次に、pＳＵ０２のうちＶＥＧＦ構造
遺伝子部分およびその前後の部分について、その塩基配
列をＳanger法で決定した。その塩基配列を配列番号１
に示す。
【００１２】（２）mＲＮＡの大量調製 mＲＮＡを大量に調製するためには、Ｐromega社製のＲi
boＭＡＸTM Ｌarge Ｓcale ＲＮＡ Ｐroduction Ｓyste
m ＳＰ６のキットを用いた。実験方法は、同キットに添
付の方法にほぼ従い、その半量のスケールで行った。以
下に反応混合液の組成を示す。なお、ここで用いる直鎖
状pＳＵ０２は配列番号１に示すpＳＵ０２の６７２番目
の塩基から６７７番目の塩基に対する制限酵素ＢamHIで
切断(センス鎖では６７２番目と６７３番目の間で切断)
したものである。 この反応混合液を３７℃で４時間保った後に、ＲＱ１Ｒ
Ｎase-不含ＤＮaseを２５U加え、更に１５分間保った。
そして、フェノール処理、エタノール沈澱を行い、沈澱
したＶＥＧＦmＲＮＡを７０％エタノールで洗浄した。
洗浄後のＶＥＧＦmＲＮＡは１５分間風乾し、ＲＮase-
不含Ｈ2Ｏ ２５０μlで希釈した。調製したＶＥＧＦmＲ
ＮＡの濃度は紫外領域での吸収スペクトルから求めた。
そのために、まず、ＶＥＧＦmＲＮＡを２０mMリン酸ナ
トリウムと１００mM塩化ナトリウムからなる緩衝液(pH=
7.0)で１００〜３００倍に希釈し、光路長１cmのセルを
用いて２６０nm及び２８０nmで測定(室温)し、ＶＥＧＦ
mＲＮＡの濃度を換算した。ここに、ＶＥＧＦmＲＮＡの
紫外吸収スペクトルの測定結果の一例を示す(図２)。濃
度を求める際には、２６０nmで吸光度の値が１の時、そ
の溶液１ml中にＲＮＡが４０μg含まれているとした。
boＭＡＸTM Ｌarge Ｓcale ＲＮＡ Ｐroduction Ｓyste
m ＳＰ６のキットを用いた。実験方法は、同キットに添
付の方法にほぼ従い、その半量のスケールで行った。以
下に反応混合液の組成を示す。なお、ここで用いる直鎖
状pＳＵ０２は配列番号１に示すpＳＵ０２の６７２番目
の塩基から６７７番目の塩基に対する制限酵素ＢamHIで
切断(センス鎖では６７２番目と６７３番目の間で切断)
したものである。 この反応混合液を３７℃で４時間保った後に、ＲＱ１Ｒ
Ｎase-不含ＤＮaseを２５U加え、更に１５分間保った。
そして、フェノール処理、エタノール沈澱を行い、沈澱
したＶＥＧＦmＲＮＡを７０％エタノールで洗浄した。
洗浄後のＶＥＧＦmＲＮＡは１５分間風乾し、ＲＮase-
不含Ｈ2Ｏ ２５０μlで希釈した。調製したＶＥＧＦmＲ
ＮＡの濃度は紫外領域での吸収スペクトルから求めた。
そのために、まず、ＶＥＧＦmＲＮＡを２０mMリン酸ナ
トリウムと１００mM塩化ナトリウムからなる緩衝液(pH=
7.0)で１００〜３００倍に希釈し、光路長１cmのセルを
用いて２６０nm及び２８０nmで測定(室温)し、ＶＥＧＦ
mＲＮＡの濃度を換算した。ここに、ＶＥＧＦmＲＮＡの
紫外吸収スペクトルの測定結果の一例を示す(図２)。濃
度を求める際には、２６０nmで吸光度の値が１の時、そ
の溶液１ml中にＲＮＡが４０μg含まれているとした。
【００１３】ＶＥＧＦmＲＮＡの5'末端標識化 まず、5'末端のリン酸基をアルカリフォスファターゼで
以下の様にして除去した。その際、操作途中にＲＮase
が混在する可能性が存在するときは、リボヌクレアーゼ
阻害剤の存在下に反応を行った。 （注）10×反応緩衝液 500mM Tris-HCl,pH=9.0 10mM MgCl2 上記の反応混合液を６５℃で３０分間保った後に、０.
５M ＥＤＴＡ(pH=8.0)を１μl添加して反応を停止し
た。フェノール抽出を３回行った後、３M酢酸ナトリウ
ム(pH=5.3)３.４μl、およびＥtachinmate(ニッポンジ
ーン社製)２μlを加えよく攪拌後、２倍量のエタノール
を加えた。そして、１４krpm、５分間(４℃)遠心を行う
ことにより、ＶＥＧＦmＲＮＡを回収し、７０％エタノ
ールで洗浄した。洗浄後のＶＥＧＦmＲＮＡは１５分間
風乾し、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ ２０μlで溶解した。次
に、以下の様に、この脱リン酸化したＶＥＧＦmＲＮＡ
を用い、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-32
Ｐ]ＡＴＰのγ位のリン酸基をＲＮＡの5'位水酸基に転
移させ、末端を標識化した。この際にも、上述と同様、
操作途中にＲＮaseが混在する可能性があるときは、リ
ボヌクレアーゼ阻害剤存在下に反応を行った。また、高
次構造をとるＲＮＡの標識化を効率よく行うために、Ｄ
ＭＳＯを添加して行った。 上記の反応混合液を３７℃で１時間保ち、０.５M ＥＤ
ＴＡ ３μlを添加し反応を停止した。ＶＥＧＦmＲＮＡの3'末端標識化 5'のリン酸に32Ｐが入っているＣytidine-3',5'-bispho
sphate([5'-32P]pCp)を、以下の反応系によってＶＥＧ
ＦmＲＮＡの3'末端に結合し標識化した。その際、操作
途中にＲＮaseが混在する可能性があるため場合は、リ
ボヌクレアーゼ阻害剤存在下で反応を行った。 （注）10×反応緩衝液 500 mM Tris-HCl,pH=7.5 100 mM MgCl2 100 mM DTT 10 mM ATP 上記の反応混合液を１４℃で１４〜２０時間保ち、０.
５M ＥＤＴＡ １.５μlを添加し反応を停止した。5'及び3'末端標識化ＶＰＦmＲＮＡの分離・回収、精製 上述の操作で得られた5'及び3'末端標識化ＲＮＡには、
完全長のＶＥＧＦmＲＮＡ以外に実験操作途中に生じた
様々なＶＥＧＦmＲＮＡの断片も含まれているため、分
離及び回収・精製を以下の様に行った。まず、キナーゼ
反応を停止した5'末端標識化反応溶液あるいはリガーゼ
反応を停止した3'末端標識化反応溶液にアガロースゲル
電気泳動用色素であるブロモフェノールブルーの入った
緩衝液を等量添加し、これを９５℃で５分間保って熱変
性させ、ついで直ちに氷中に移し３分間保持した。これ
を非変性型アガロースゲル電気泳動により分離した。そ
の際、用いるアガロースは、短フラグメント用低融点ア
ガロースであるＮusieveR GTG Ａgarose(Takara 社製)
を用いた。アガロースゲルの濃度は３.０% とし、緩衝
液は、１×ＴＢＥ(89mM Tris 89mMホウ酸、2mM EDTA)溶
液を用いた。泳動は、定電圧(６V/cm)で３時間行った。
泳動終了後は、０.５μg/mlのエチジウムブロマイドの
入った１×ＴＢＥ溶液にゲルを２０分間浸した後、紫外
線照射下でＲＮＡを検出した。5'あるいは3'末端標識化
ＶＥＧＦmＲＮＡの濃度は同時に泳動を行ったサイズマ
ーカーを基に次のように換算した。即ち、０.５μg/ml
のエチジウムブロマイドの入った１×ＴＢＥ溶液に電気
泳動後の非変性型アガロースゲルを２０分間浸して、紫
外線を照射してバンドの輝度を比較した場合、同程度の
輝度であれば、ＲＮＡのほうが二本鎖ＤＮＡに比べ、
２.５倍の濃度であることがわかったのでこれをもとに
換算した。次に、目的の完全長ＶＥＧＦmＲＮＡのバン
ドのみをカッターナイフで切り出し細かくスライスした
後、１.５mlチューブに約０.３gずつ分けた。ここで目
的の完全長ＶＥＧＦmＲＮＡを回収するために、ＲＮaid
R Kit(BIO101社製)を利用した。操作方法は、同キット
に添付の方法にほぼ従った。即ち、まず、スライスした
ゲル約０.３ｇ入りのチューブに３倍量のＲＮＡ Ｂindi
ngsalt(約1ml)を添加し、アガロースゲルを完全に分解
させた。チューブあたり５μlのRNAMATRIXTMを添加し、
よく攪拌し、その後１５分間室温で放置した。その際、
RNAMATRIXTMに効率よくＶＥＧＦmＲＮＡが結合するよう
に時々攪拌した。そして、ＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIX
TMを１４krpmで１分間、室温で遠心し回収した。回収し
たＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMにＲＮＡ washsolution
をチューブあたり５００μl添加し、よく洗浄した(この
洗浄操作は２回行った)。そのＲＮＡ washsolutionを遠
心操作によって完全に除いた後、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ(チ
ューブあたり20μl)でＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMを
よく攪拌した。そして、５５℃で３０分間保つことによ
りＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMから溶離させた。この
溶離操作を行った後、１４krpmで２分間室温で遠心を行
い、ＶＥＧＦmＲＮＡを回収した。回収したＶＥＧＦmＲ
ＮＡに混在しているRNAMATRIXTMを完全に除去するため
に再度、遠心を行った。このようにして得た5'あるいは
3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを更にフェノールで処理
した後、エタノールを加えて沈澱させた。その沈殿した
mＲＮＡを７０％エタノールで洗浄後、１５分間風乾
し、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ ３０μlに溶解し、ランダムス
クリーニングに用いる5'あるいは3'末端標識化ＶＥＧＦ
mＲＮＡとした。
以下の様にして除去した。その際、操作途中にＲＮase
が混在する可能性が存在するときは、リボヌクレアーゼ
阻害剤の存在下に反応を行った。 （注）10×反応緩衝液 500mM Tris-HCl,pH=9.0 10mM MgCl2 上記の反応混合液を６５℃で３０分間保った後に、０.
５M ＥＤＴＡ(pH=8.0)を１μl添加して反応を停止し
た。フェノール抽出を３回行った後、３M酢酸ナトリウ
ム(pH=5.3)３.４μl、およびＥtachinmate(ニッポンジ
ーン社製)２μlを加えよく攪拌後、２倍量のエタノール
を加えた。そして、１４krpm、５分間(４℃)遠心を行う
ことにより、ＶＥＧＦmＲＮＡを回収し、７０％エタノ
ールで洗浄した。洗浄後のＶＥＧＦmＲＮＡは１５分間
風乾し、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ ２０μlで溶解した。次
に、以下の様に、この脱リン酸化したＶＥＧＦmＲＮＡ
を用い、Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-32
Ｐ]ＡＴＰのγ位のリン酸基をＲＮＡの5'位水酸基に転
移させ、末端を標識化した。この際にも、上述と同様、
操作途中にＲＮaseが混在する可能性があるときは、リ
ボヌクレアーゼ阻害剤存在下に反応を行った。また、高
次構造をとるＲＮＡの標識化を効率よく行うために、Ｄ
ＭＳＯを添加して行った。 上記の反応混合液を３７℃で１時間保ち、０.５M ＥＤ
ＴＡ ３μlを添加し反応を停止した。ＶＥＧＦmＲＮＡの3'末端標識化 5'のリン酸に32Ｐが入っているＣytidine-3',5'-bispho
sphate([5'-32P]pCp)を、以下の反応系によってＶＥＧ
ＦmＲＮＡの3'末端に結合し標識化した。その際、操作
途中にＲＮaseが混在する可能性があるため場合は、リ
ボヌクレアーゼ阻害剤存在下で反応を行った。 （注）10×反応緩衝液 500 mM Tris-HCl,pH=7.5 100 mM MgCl2 100 mM DTT 10 mM ATP 上記の反応混合液を１４℃で１４〜２０時間保ち、０.
５M ＥＤＴＡ １.５μlを添加し反応を停止した。5'及び3'末端標識化ＶＰＦmＲＮＡの分離・回収、精製 上述の操作で得られた5'及び3'末端標識化ＲＮＡには、
完全長のＶＥＧＦmＲＮＡ以外に実験操作途中に生じた
様々なＶＥＧＦmＲＮＡの断片も含まれているため、分
離及び回収・精製を以下の様に行った。まず、キナーゼ
反応を停止した5'末端標識化反応溶液あるいはリガーゼ
反応を停止した3'末端標識化反応溶液にアガロースゲル
電気泳動用色素であるブロモフェノールブルーの入った
緩衝液を等量添加し、これを９５℃で５分間保って熱変
性させ、ついで直ちに氷中に移し３分間保持した。これ
を非変性型アガロースゲル電気泳動により分離した。そ
の際、用いるアガロースは、短フラグメント用低融点ア
ガロースであるＮusieveR GTG Ａgarose(Takara 社製)
を用いた。アガロースゲルの濃度は３.０% とし、緩衝
液は、１×ＴＢＥ(89mM Tris 89mMホウ酸、2mM EDTA)溶
液を用いた。泳動は、定電圧(６V/cm)で３時間行った。
泳動終了後は、０.５μg/mlのエチジウムブロマイドの
入った１×ＴＢＥ溶液にゲルを２０分間浸した後、紫外
線照射下でＲＮＡを検出した。5'あるいは3'末端標識化
ＶＥＧＦmＲＮＡの濃度は同時に泳動を行ったサイズマ
ーカーを基に次のように換算した。即ち、０.５μg/ml
のエチジウムブロマイドの入った１×ＴＢＥ溶液に電気
泳動後の非変性型アガロースゲルを２０分間浸して、紫
外線を照射してバンドの輝度を比較した場合、同程度の
輝度であれば、ＲＮＡのほうが二本鎖ＤＮＡに比べ、
２.５倍の濃度であることがわかったのでこれをもとに
換算した。次に、目的の完全長ＶＥＧＦmＲＮＡのバン
ドのみをカッターナイフで切り出し細かくスライスした
後、１.５mlチューブに約０.３gずつ分けた。ここで目
的の完全長ＶＥＧＦmＲＮＡを回収するために、ＲＮaid
R Kit(BIO101社製)を利用した。操作方法は、同キット
に添付の方法にほぼ従った。即ち、まず、スライスした
ゲル約０.３ｇ入りのチューブに３倍量のＲＮＡ Ｂindi
ngsalt(約1ml)を添加し、アガロースゲルを完全に分解
させた。チューブあたり５μlのRNAMATRIXTMを添加し、
よく攪拌し、その後１５分間室温で放置した。その際、
RNAMATRIXTMに効率よくＶＥＧＦmＲＮＡが結合するよう
に時々攪拌した。そして、ＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIX
TMを１４krpmで１分間、室温で遠心し回収した。回収し
たＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMにＲＮＡ washsolution
をチューブあたり５００μl添加し、よく洗浄した(この
洗浄操作は２回行った)。そのＲＮＡ washsolutionを遠
心操作によって完全に除いた後、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ(チ
ューブあたり20μl)でＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMを
よく攪拌した。そして、５５℃で３０分間保つことによ
りＶＥＧＦmＲＮＡ-RNAMATRIXTMから溶離させた。この
溶離操作を行った後、１４krpmで２分間室温で遠心を行
い、ＶＥＧＦmＲＮＡを回収した。回収したＶＥＧＦmＲ
ＮＡに混在しているRNAMATRIXTMを完全に除去するため
に再度、遠心を行った。このようにして得た5'あるいは
3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを更にフェノールで処理
した後、エタノールを加えて沈澱させた。その沈殿した
mＲＮＡを７０％エタノールで洗浄後、１５分間風乾
し、ＲＮase-不含Ｈ2Ｏ ３０μlに溶解し、ランダムス
クリーニングに用いる5'あるいは3'末端標識化ＶＥＧＦ
mＲＮＡとした。
【００１４】天然型及びホスホロチオエート型のオリゴ
核酸の合成及び精製 天然型及びホスホロチオエート型のオリゴ核酸の合成
は、ＡＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製の３８１Ａ
ＤＮＡ合成機、３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、及びパー
セプティブ社製８９０９核酸自動合成機を用いて、ホス
ホロアミダイト法(ABI社の手順書又はF.Eckstein, Olig
onucleotides and Analogues: A Practical Approach,
IRL Press, 1991年参照)により行った。ランダム配列の
オリゴデオキシリボヌクレオチドは、例えば上述のＡＢ
Ｉ社などのオリゴ核酸自動合成機を利用してホスホロア
ミダイト法により合成する際、４種類のホスホロアミダ
イト試薬のカップリングの割合ができるだけ等しくなる
ように混合したものを用いて合成した。またこのように
して合成した市販品をも利用した。ランダム配列のホス
ホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドに
ついても、同様に、ミリポア社製のオリゴ核酸自動合成
機を利用してホスホロアミダイト法により合成する際、
４種類のホスホロアミダイト試薬のカップリングの割合
ができるだけ等しくなるように混合したものを用いて合
成した。最後のサイクルにおいて、5'末端の糖水酸基の
保護基(ジメトキシトリチル基)が結合した状態で合成を
終了した。室温下において、約２５％のアンモニア水で
６０分間処理し、合成したオリゴマーをサポートから切
断した。これを５５℃で８時間保ち、塩基部分およびリ
ン酸部分の脱保護を行い、天然型およびホスホロチオエ
ート型オリゴデオキシリボヌクレオチドの粗製物を得
た。得られた天然型オリゴデオキシリボヌクレオチド粗
製物は、逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造
されたカートリッジ[ウォーターズ社製セップパックプ
ラス(ロングボディ／ENV)]を用いて以下の通り精製し
た。即ち、２０mlのアセトニトリルでカートリッジ内を
洗浄したあと、２０mlの１２％アセトニトリル−８８％
ＴＥＡＡ(TEAA:0.1M酢酸トリエチルアンモニウムpH=7.
2)溶液でカートリッジ内を平衡化した。約３mlの１２％
アセトニトリル−８８％ＴＥＡＡに溶解したオリゴデオ
キシリボヌクレオチド粗精製物をカートリッジ内に注入
し、その際に溶出した液を再びカートリッジ内に注入し
た(２回繰り返す)。１５mlの１２％アセトニトリル−８
８％ＴＥＡＡでカートリッジ内を洗浄した後、３mlのＴ
ＥＡＡでカートリッジ内の溶液を置換した。ついで、３
mlの２％トリフルオロ酢酸水溶液をカートリッジ内に注
入し、約４分間そのまま放置して、ジメトキシトリチル
基を切断後、３mlの２％トリフルオロ酢酸水溶液を新た
に注入し、カートリッジ内のトリフルオロ酢酸水溶液を
排出した。３mlのＴＥＡＢ(重炭酸トリエチルアンモニ
ウム pH=7)でカートリッジ内を置換した後、８mlの１５
％アセトニトリル−８５％ＴＥＡＢで溶出し、精製オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを含む分画を集めた。これ
を真空下で乾固した後、滅菌した生理食塩水０.２mlを
加え、再び真空下で乾固した。少量の滅菌水を加えて乾
固する操作を繰り返し(合計２回)、最初に加えた滅菌生
理食塩水と同量の滅菌水を加え、これを所定の濃度(オ
リゴデオキシリボヌクレオチドとして５００μM)に希釈
して後述のスクリーニング実験に用いた。但し、２０mM
リン酸ナトリウムと１００mM塩化ナトリウムからなる緩
衝液(pH=7.0)にオリゴデオキシリボヌクレオチドを溶か
し、光路長１cmのセルを用いて２６０nmで測定(室温)し
たときの吸光度の値が１のとき、その溶液１ml中には、
オリゴデオキシリボヌクレオチドが３３μg含まれてい
るとした。又、天然型オリゴデオキシリボヌクレオチド
のヌクレオチドあたりの分子量は３３０として換算する
か、報告されているモノヌクレオチド及びジヌクレオチ
ドの分子吸光係数(E. G. Richards, Handbook of Bioch
emistry and Molecular Biology: Nucleic Acids(C. D.
Fasman)第3版, 1 巻 p197 CRCCleveland OH)を基にす
る最近接近似法に従って７０〜８０℃で求めた。本発明
において記載の核酸化合物の濃度は、以上のいずれかの
方法で計算した値である。ホスホロチオエート型オリゴ
デオキシリボヌクレオチド(20量体、粗製品で約3mg)の
逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造されたカ
ートリッジ[パーセプティブ社製セップパックプラス(ロ
ングボディ／ENV)]を用いる精製も上述の天然型の場合
と同様に行った。但し、カートリッジの平衡化、粗製物
のカートリッジに添加後の洗浄及び精製ホスホロチオエ
ート型オリゴデオキシリボヌクレオチドの溶出には、２
０％アセトニトリル−８０％ＴＥＡＡ(又はTEAB)を用い
た。なお、このようにして精製されたオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド及びホスホロチオエート型のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの純度は、HPLC分析により調べ
た。
核酸の合成及び精製 天然型及びホスホロチオエート型のオリゴ核酸の合成
は、ＡＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製の３８１Ａ
ＤＮＡ合成機、３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機、及びパー
セプティブ社製８９０９核酸自動合成機を用いて、ホス
ホロアミダイト法(ABI社の手順書又はF.Eckstein, Olig
onucleotides and Analogues: A Practical Approach,
IRL Press, 1991年参照)により行った。ランダム配列の
オリゴデオキシリボヌクレオチドは、例えば上述のＡＢ
Ｉ社などのオリゴ核酸自動合成機を利用してホスホロア
ミダイト法により合成する際、４種類のホスホロアミダ
イト試薬のカップリングの割合ができるだけ等しくなる
ように混合したものを用いて合成した。またこのように
して合成した市販品をも利用した。ランダム配列のホス
ホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチドに
ついても、同様に、ミリポア社製のオリゴ核酸自動合成
機を利用してホスホロアミダイト法により合成する際、
４種類のホスホロアミダイト試薬のカップリングの割合
ができるだけ等しくなるように混合したものを用いて合
成した。最後のサイクルにおいて、5'末端の糖水酸基の
保護基(ジメトキシトリチル基)が結合した状態で合成を
終了した。室温下において、約２５％のアンモニア水で
６０分間処理し、合成したオリゴマーをサポートから切
断した。これを５５℃で８時間保ち、塩基部分およびリ
ン酸部分の脱保護を行い、天然型およびホスホロチオエ
ート型オリゴデオキシリボヌクレオチドの粗製物を得
た。得られた天然型オリゴデオキシリボヌクレオチド粗
製物は、逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造
されたカートリッジ[ウォーターズ社製セップパックプ
ラス(ロングボディ／ENV)]を用いて以下の通り精製し
た。即ち、２０mlのアセトニトリルでカートリッジ内を
洗浄したあと、２０mlの１２％アセトニトリル−８８％
ＴＥＡＡ(TEAA:0.1M酢酸トリエチルアンモニウムpH=7.
2)溶液でカートリッジ内を平衡化した。約３mlの１２％
アセトニトリル−８８％ＴＥＡＡに溶解したオリゴデオ
キシリボヌクレオチド粗精製物をカートリッジ内に注入
し、その際に溶出した液を再びカートリッジ内に注入し
た(２回繰り返す)。１５mlの１２％アセトニトリル−８
８％ＴＥＡＡでカートリッジ内を洗浄した後、３mlのＴ
ＥＡＡでカートリッジ内の溶液を置換した。ついで、３
mlの２％トリフルオロ酢酸水溶液をカートリッジ内に注
入し、約４分間そのまま放置して、ジメトキシトリチル
基を切断後、３mlの２％トリフルオロ酢酸水溶液を新た
に注入し、カートリッジ内のトリフルオロ酢酸水溶液を
排出した。３mlのＴＥＡＢ(重炭酸トリエチルアンモニ
ウム pH=7)でカートリッジ内を置換した後、８mlの１５
％アセトニトリル−８５％ＴＥＡＢで溶出し、精製オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを含む分画を集めた。これ
を真空下で乾固した後、滅菌した生理食塩水０.２mlを
加え、再び真空下で乾固した。少量の滅菌水を加えて乾
固する操作を繰り返し(合計２回)、最初に加えた滅菌生
理食塩水と同量の滅菌水を加え、これを所定の濃度(オ
リゴデオキシリボヌクレオチドとして５００μM)に希釈
して後述のスクリーニング実験に用いた。但し、２０mM
リン酸ナトリウムと１００mM塩化ナトリウムからなる緩
衝液(pH=7.0)にオリゴデオキシリボヌクレオチドを溶か
し、光路長１cmのセルを用いて２６０nmで測定(室温)し
たときの吸光度の値が１のとき、その溶液１ml中には、
オリゴデオキシリボヌクレオチドが３３μg含まれてい
るとした。又、天然型オリゴデオキシリボヌクレオチド
のヌクレオチドあたりの分子量は３３０として換算する
か、報告されているモノヌクレオチド及びジヌクレオチ
ドの分子吸光係数(E. G. Richards, Handbook of Bioch
emistry and Molecular Biology: Nucleic Acids(C. D.
Fasman)第3版, 1 巻 p197 CRCCleveland OH)を基にす
る最近接近似法に従って７０〜８０℃で求めた。本発明
において記載の核酸化合物の濃度は、以上のいずれかの
方法で計算した値である。ホスホロチオエート型オリゴ
デオキシリボヌクレオチド(20量体、粗製品で約3mg)の
逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造されたカ
ートリッジ[パーセプティブ社製セップパックプラス(ロ
ングボディ／ENV)]を用いる精製も上述の天然型の場合
と同様に行った。但し、カートリッジの平衡化、粗製物
のカートリッジに添加後の洗浄及び精製ホスホロチオエ
ート型オリゴデオキシリボヌクレオチドの溶出には、２
０％アセトニトリル−８０％ＴＥＡＡ(又はTEAB)を用い
た。なお、このようにして精製されたオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド及びホスホロチオエート型のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドの純度は、HPLC分析により調べ
た。
【００１５】探索法のための反応条件の検討 探索を行う際に、どのような鎖長のオリゴ核酸を用いる
かは、前述した様に、充分に考慮すべき点であり、本発
明者等は、ランダム配列オリゴ核酸として、まず天然型
の６量体、９量体及び２０量体を用いた。これらは、自
社で合成したものあるいは市販されているもののいずれ
かを使用した。また、用いるランダム配列オリゴ核酸の
濃度や反応条件の検討を行うに先立ち、アンチセンス核
酸効果によりＶＥＧＦの発現阻害を引き起こすことが既
に示されている、配列番号１に示すＶＥＧＦの塩基配列
の塩基番号５０３〜５１０番目に相補的な配列をもつア
ンチンス核酸Ａ５０３Ｈ(8量体; 天然型; 配列番号２)
を用いて検討した(PCT/JP95/01121参照)。その際、ＶＥ
ＧＦmＲＮＡは5'末端を標識化したものを使用した。こ
のアンチセンス核酸を用いて、ランダム配列オリゴ核酸
を用いた場合に使用可能な濃度範囲でＲＮase Ｈによる
部位特異的な切断が検出し得るかどうかを以下の様にし
て判定した。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH=7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン 上記の反応混合液を３７℃で２又は６時間保った後、
０.５M ＥＤＴＡ １μlを添加して反応を停止した。つ
いで、この反応混合液に色素(キシレンシアノール及び
ブロモフェノールブルー)の入った変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動用緩衝液を加え、９５℃で５分間保ち
熱変性させた。これを直ちに氷中に移し、３分間置いた
のち、８M Ｕrea-６％ポリアクリルアミドゲルにのせ、
定電圧(５２V/cm)下で１時間、電気泳動を行った。その
後、ゲルを濾紙に固定化し、オートラジオグラフィーを
行い、元の完全長mＲＮＡ以外に、ＲＮase Ｈで切断さ
れた断片が生じているかどうかを調べた。その結果を図
３に示す。図３でレーン１〜４はＲＮase Ｈが存在した
場合(６U/μl)であり、レーン５はＲＮase Ｈが存在し
ない場合である。また、レーン１と２はＡ５０３Ｈの濃
度が１nMであり、レーン３〜５ではその濃度が１０nMで
ある。さらに、レーン１と３の反応時間は２時間であ
り、レーン２、４、５での反応時間は６時間である。図
３から明らかなようにレーン１〜４においては、Ａ５０
３Ｈが結合するmＲＮＡの部位で切断された断片(〜４７
０nt)が検出できた(図３で矢印にて示す)。したがっ
て、１nM又は１０nMの濃度のアンチセンス核酸存在下で
ＲＮase Ｈによる切断が起きることがわかった。その切
断の程度は、Ａ５０３Ｈの濃度や反応時間とともに増大
することもわかった。なお、図３には示していないが、
この切断片の生成にアンチセンス核酸であるＡ５０３Ｈ
の存在が必須であることは別の実験において示された。
次に、２６２μMの９量体ランダム配列オリゴ核酸を用
い、その他は上述の条件と同様に反応を行い、ランダム
配列オリゴ核酸の存在下でＲＮase Ｈによる切断が検出
できるかどうかを以下の反応混合液を使用して判定し
た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン その結果、２６２μMの９量体ランダム配列オリゴ核酸
の存在下、３７℃で２時間反応させた場合、完全長のＶ
ＥＧＦmＲＮＡ及びその切断片ともに検出することがで
きなかった。すなわち、この反応条件下では、ＲＮase
Ｈによる切断反応がかなり進んでいることがわかった。
そこで、次に反応混合液中のランダム配列オリゴ核酸の
濃度を２６.２又は２.６２μMの２種、ＲＮase Ｈの濃
度を０.０６、０.６又は６U/μlの３種とし、３７℃で
２時間反応を行った。図３の結果を得た場合と同様にED
TAを添加して反応を止め、後処理して得た結果を図４に
示す。レーン１〜３は、ランダム配列オリゴ核酸濃度が
２.６２μMのものを用い、ＲＮase Ｈはそれぞれ０.０
６、０.６、６U/μlのものを用いた場合である。レーン
４〜６はランダム配列オリゴ核酸濃度が２６.２μMのも
のを用い、ＲＮase Ｈはそれぞれ０.０６、０.６、６U/
μlのものを用いた場合である。０.０６U/μlのＲＮase
Ｈを用いて、３７℃で２時間、反応を行った場合に２
４ntの断片が検出された(図４に矢印で示す)。なお、２
４ntの断片が生じたことは、塩基番号６１の3'末端側で
切断されたことを意味する。用いるＲＮase Ｈの濃度を
０.６又は６U/μlとすることにより、切断の程度がさら
に進み、その断片の大きさがさらに小さくなることもわ
かった。なお、０.０６U/μlのＲＮase Ｈを用いた場合
に生じる断片(矢印で示す)の大きさが２４ntであること
は、配列番号３に示す３０量体のＲＮＡを別途合成し、
その5'末端を標識化後に、酸処理及びＲＮase Ｔ1 処理
して得られた断片との比較から確認した。このＲＮＡの
塩基配列は、本実験で用いたＶＥＧＦmＲＮＡの塩基配
列３８番目〜６７番目に等しい。更に、この２４ntの断
片が完全長のＶＥＧＦmＲＮＡから直接に、すなわち反
応の一次産物として生じたものであるか否かを確かめる
ために、以下に示すように、２.６２μMの９量体のラン
ダム配列オリゴ核酸、及び０.０６U/μlのＲＮase Ｈを
用い、その生成を経時的に調べた。
かは、前述した様に、充分に考慮すべき点であり、本発
明者等は、ランダム配列オリゴ核酸として、まず天然型
の６量体、９量体及び２０量体を用いた。これらは、自
社で合成したものあるいは市販されているもののいずれ
かを使用した。また、用いるランダム配列オリゴ核酸の
濃度や反応条件の検討を行うに先立ち、アンチセンス核
酸効果によりＶＥＧＦの発現阻害を引き起こすことが既
に示されている、配列番号１に示すＶＥＧＦの塩基配列
の塩基番号５０３〜５１０番目に相補的な配列をもつア
ンチンス核酸Ａ５０３Ｈ(8量体; 天然型; 配列番号２)
を用いて検討した(PCT/JP95/01121参照)。その際、ＶＥ
ＧＦmＲＮＡは5'末端を標識化したものを使用した。こ
のアンチセンス核酸を用いて、ランダム配列オリゴ核酸
を用いた場合に使用可能な濃度範囲でＲＮase Ｈによる
部位特異的な切断が検出し得るかどうかを以下の様にし
て判定した。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH=7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン 上記の反応混合液を３７℃で２又は６時間保った後、
０.５M ＥＤＴＡ １μlを添加して反応を停止した。つ
いで、この反応混合液に色素(キシレンシアノール及び
ブロモフェノールブルー)の入った変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動用緩衝液を加え、９５℃で５分間保ち
熱変性させた。これを直ちに氷中に移し、３分間置いた
のち、８M Ｕrea-６％ポリアクリルアミドゲルにのせ、
定電圧(５２V/cm)下で１時間、電気泳動を行った。その
後、ゲルを濾紙に固定化し、オートラジオグラフィーを
行い、元の完全長mＲＮＡ以外に、ＲＮase Ｈで切断さ
れた断片が生じているかどうかを調べた。その結果を図
３に示す。図３でレーン１〜４はＲＮase Ｈが存在した
場合(６U/μl)であり、レーン５はＲＮase Ｈが存在し
ない場合である。また、レーン１と２はＡ５０３Ｈの濃
度が１nMであり、レーン３〜５ではその濃度が１０nMで
ある。さらに、レーン１と３の反応時間は２時間であ
り、レーン２、４、５での反応時間は６時間である。図
３から明らかなようにレーン１〜４においては、Ａ５０
３Ｈが結合するmＲＮＡの部位で切断された断片(〜４７
０nt)が検出できた(図３で矢印にて示す)。したがっ
て、１nM又は１０nMの濃度のアンチセンス核酸存在下で
ＲＮase Ｈによる切断が起きることがわかった。その切
断の程度は、Ａ５０３Ｈの濃度や反応時間とともに増大
することもわかった。なお、図３には示していないが、
この切断片の生成にアンチセンス核酸であるＡ５０３Ｈ
の存在が必須であることは別の実験において示された。
次に、２６２μMの９量体ランダム配列オリゴ核酸を用
い、その他は上述の条件と同様に反応を行い、ランダム
配列オリゴ核酸の存在下でＲＮase Ｈによる切断が検出
できるかどうかを以下の反応混合液を使用して判定し
た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン その結果、２６２μMの９量体ランダム配列オリゴ核酸
の存在下、３７℃で２時間反応させた場合、完全長のＶ
ＥＧＦmＲＮＡ及びその切断片ともに検出することがで
きなかった。すなわち、この反応条件下では、ＲＮase
Ｈによる切断反応がかなり進んでいることがわかった。
そこで、次に反応混合液中のランダム配列オリゴ核酸の
濃度を２６.２又は２.６２μMの２種、ＲＮase Ｈの濃
度を０.０６、０.６又は６U/μlの３種とし、３７℃で
２時間反応を行った。図３の結果を得た場合と同様にED
TAを添加して反応を止め、後処理して得た結果を図４に
示す。レーン１〜３は、ランダム配列オリゴ核酸濃度が
２.６２μMのものを用い、ＲＮase Ｈはそれぞれ０.０
６、０.６、６U/μlのものを用いた場合である。レーン
４〜６はランダム配列オリゴ核酸濃度が２６.２μMのも
のを用い、ＲＮase Ｈはそれぞれ０.０６、０.６、６U/
μlのものを用いた場合である。０.０６U/μlのＲＮase
Ｈを用いて、３７℃で２時間、反応を行った場合に２
４ntの断片が検出された(図４に矢印で示す)。なお、２
４ntの断片が生じたことは、塩基番号６１の3'末端側で
切断されたことを意味する。用いるＲＮase Ｈの濃度を
０.６又は６U/μlとすることにより、切断の程度がさら
に進み、その断片の大きさがさらに小さくなることもわ
かった。なお、０.０６U/μlのＲＮase Ｈを用いた場合
に生じる断片(矢印で示す)の大きさが２４ntであること
は、配列番号３に示す３０量体のＲＮＡを別途合成し、
その5'末端を標識化後に、酸処理及びＲＮase Ｔ1 処理
して得られた断片との比較から確認した。このＲＮＡの
塩基配列は、本実験で用いたＶＥＧＦmＲＮＡの塩基配
列３８番目〜６７番目に等しい。更に、この２４ntの断
片が完全長のＶＥＧＦmＲＮＡから直接に、すなわち反
応の一次産物として生じたものであるか否かを確かめる
ために、以下に示すように、２.６２μMの９量体のラン
ダム配列オリゴ核酸、及び０.０６U/μlのＲＮase Ｈを
用い、その生成を経時的に調べた。
【００１６】ランダムスクリーニング法による結果 以上の結果をもとにＶＥＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス
核酸の標的部位を確定するために、反応混合液中の９量
体のランダム配列オリゴ核酸(天然型及びホスホロチオ
エート型)の濃度を２.６２μM、ＲＮase Ｈを０.０６U/
μlとして上記反応を繰り返した。即ち、３７℃で反応
を行い、１分、５分、３０分、９０分、１８０分の反応
時間で得られた断片を調べた。図３の結果を得た場合と
同様にEDTAを添加して反応を止め、後処理して得た結果
を図５に示す。レーン１からレーン５までは、天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸存在下であり、反応時間は順に１
分、５分、３０分、９０分、１８０分の場合である。レ
ーン６及びレーン７はそれぞれコントロールであり、レ
ーン６は、ランダム配列オリゴ核酸が存在しない(ＲＮa
se Ｈは存在する)場合であり、レーン７はＲＮase Ｈが
存在しない(天然型ランダム配列オリゴ核酸は存在する)
場合である。反応時間は、レーン６、７のいずれも１８
０分である。レーン８から１２は、９量体のホスホロチ
オエート型ランダム配列オリゴ核酸存在下であり、反応
時間が順に１分、５分、３０分、９０分、１８０分の場
合である。図５で示されるように、コントロール(レー
ン６：ランダム配列オリゴ核酸が存在しないとき、およ
びレーン７：ＲＮase Ｈが存在しないとき)では、上述
の２４ntの断片が確認されないが、天然型ランダム配列
オリゴ核酸存在下においては、５分の反応で、ホスホロ
チオエート型ランダム配列オリゴ核酸存在下において
は、９０分の反応で検出され始めた。更に、反応を続行
すると、該断片の量が増加すると共に、より小さな断片
の量も増大していることがわかる。以上の結果より、こ
の２４ntの断片は、ＲＮase Ｈにより、ＶＥＧＦmＲＮ
Ａから直接に、すなわちＶＥＧＦmＲＮＡの一次産物と
して生じた断片であると確認された。又、この断片は、
天然型又はホスホロチオエート型の９量体ランダム配列
オリゴ核酸のいずれを用いても生じることがわかる。そ
こで更に、６量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸を用
いて、上述と同様の反応を３７℃で２時間行った。図３
の結果を得た場合と同様にＥＤＴＡを添加して反応を止
め、後処理して得た結果を図６に示す。図６でレーン２
は６量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸６量体を加え
た場合であり、レーン３は比較のため９量体の天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸を加えた場合であり、いずれの場
合にも０.０６U/μlのＲＮase Ｈが共存する。レーン４
は対照として、ＲＮase Ｈ非存在下で９量体の天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸を加えた場合、レーン５は対照と
して、天然型ランダム配列オリゴ核酸非存在下で０.０
６U/μlのＲＮase Ｈを加えた場合である。さらに、レ
ーン１は、サイズマーカーであり、配列番号３に示す３
０量体ＲＮＡの5'末端を32Ｐの放射性同位元素でＶＥＧ
ＦmＲＮＡと同様の操作法で標識したものである。図６
からわかるように６量体の天然型ランダム配列オリゴ核
酸を用いても、９量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸
の場合と同じ位置に、強度は弱いもののバンドが検出さ
れることがわかった(矢印で示す)。また、６量体のホス
ホロチオエート型ランダム配列オリゴ核酸を用いて上と
同様な実験を行った場合にも同様の部位で切断されるこ
とがわかった。次に、９量体または６量体の天然型また
はホスホロチオエート型のランダム配列オリゴ核酸存在
下、ＲＮase Ｈで塩基番号６１番目付近が切断される
(塩基番号６１番目の3'末端側付近で切断される)ことを
再確認するために、さらに塩基番号６１番目より下流に
存在する切断部位をより明確に求めるために、上述の5'
末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡの代わりに3'末端標識化Ｖ
ＥＧＦmＲＮＡを使用し、以下の反応混合液を用いて同
様に実験を行った。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン すなわち、この反応混合液を３７℃で５分〜２４０分保
った後に、0.5M ＥＤＴＡを１μl添加して反応を停止
し、図３の結果を得た場合と同様な後処理をして得た実
験結果を図７に示す。レーン１〜レーン３までは対照で
あり、レーン１はＲＮase Ｈおよびランダム配列オリゴ
核酸ともに非存在下、レーン２はランダム配列オリゴ核
酸非存在下(ＲＮase Ｈ存在下)、レーン３はＲＮase Ｈ
非存在下(ランダム配列オリゴ核酸存在下)である。レー
ン４〜レーン８までは９量体ランダム配列オリゴ核酸
(２.６２μM)とＲＮase Ｈ(０.０６U/μl)が存在してお
り、反応時間が順に５分、３０分、６０分、１２０分、
２４０分の場合である。図７からわかるように、反応時
間６０分から塩基番号６１番目付近での切断に相当する
断片(矢印１で示す)が検出された。また、同時に塩基番
号４８０番目付近に相当する断片(矢印２で示す)も検出
された。従って、この結果より、5'末端標識化ＶＥＧＦ
mＲＮＡを用いた場合に検出された塩基番号６１番目で
の切断片は、3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを用いた場
合においても同様に検出され、該部位は切断を受けやす
い部位であることが確認出来た。更に、3'末端標識化Ｖ
ＥＧＦmＲＮＡを用いることによって、塩基番号４８０
番目付近での切断も同様に受けやすいことがわかった。
次に、実際に細胞実験や動物実験で用いる際のアンチセ
ンス核酸の鎖長を考慮に入れ、それらと同一または同程
度の鎖長である２０量体の天然型ランダム配列オリゴ核
酸を用いて同様の反応を行った。反応混合液中の２０量
体のランダム配列オリゴ核酸の濃度を２.６２μM 、Ｒ
Ｎase Ｈを０.００６U/μl として３７℃で反応を行っ
た。なお、使用するＲＮase Ｈ量は、９量体のランダム
配列オリゴ核酸を用いて行った実験の場合と同濃度(０.
０６U/μl)を用いた場合、早い速度で切断反応が進行
し、経時変化を追跡することが困難であったため、従来
の１／１０の量である０.００６U/μlとした。そして、
反応時間は１０秒、１０分、１２０分とし、図３の結果
を得た場合と同様の後処理を行った。その結果を図８に
示す。レーン１及び２は、サイズマーカーであり、ラン
ダム配列オリゴ核酸の代わりに、アンチセンス核酸とし
て、Ａ０６１Ｆ(配列番号４)、Ａ２０６Ｆ(配列番号
５)、Ａ２９１Ｆ(配列番号６)、Ａ４２６Ｆ(配列番号
７)、Ａ４５４Ｆ(配列番号８)、Ａ４８５Ｆ(配列番号
９)を 1種類ずつ以下の反応混合液を用いて３７℃で１
２０分保った後、得られた反応混合液の３種類を等量ず
つ混ぜ、図３の結果を得た場合と同様な後処理を行って
得た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン 具体的には、レーン１はＡ０６１Ｆ、Ａ２０６Ｆ及びＡ
４８５Ｆのそれぞれの存在下で切断した反応混合液をさ
らに混合した物を、レーン２はＡ２９１Ｆ、Ａ４２６Ｆ
及びＡ４５４Ｆのそれぞれの存在下で切断した反応混合
液をさらに混合した物を電気泳動した場合である。レー
ン３〜５は９量体ランダム配列オリゴ核酸存在下であ
り、反応時間が順に、１０秒、１０分、１２０分であ
る。レーン６〜８は２０量体ランダム配列オリゴ核酸存
在下であり、反応時間が順に１０秒、１０分、１２０分
である。レーン９〜１２はそれぞれ対照であり、ランダ
ム配列オリゴ核酸非存在下(ＲＮase Ｈ存在下、レーン
９)、ＲＮase Ｈ非存在下(レーン１０は９量体のランダ
ム配列オリゴ核酸存在下、レーン１１は２０量体のラン
ダム配列オリゴ核酸存在下)、およびランダム配列オリ
ゴ核酸及びＲＮase Ｈともに非存在下(レーン１２)であ
る。図８からわかるように、４８０番目付近で切断され
たバンド(矢印１)は用いるランダム配列オリゴ核酸の鎖
長が２０量体の場合には反応初期(１０秒)から検出され
た。ランダム配列オリゴ核酸の鎖長が９量体の場合に
は、反応時間１０秒での検出はできないが、反応時間１
０分では弱いが検出可能であり、１２０分ではより強く
現れていることが確認できた。また、６１番目付近での
切断によるバンド(矢印２)も、２０量体のランダム配列
オリゴ核酸を用いた場合、１０分で微かに検出可能であ
り、１２０分では顕著に検出できた。また、９量体のラ
ンダム配列オリゴ核酸を用いた場合にも、１０分で微か
に検出可能であり、１２０分では顕著に検出できた。切
断パターンの詳細は、２０量体もしくは９量体のランダ
ム配列オリゴ核酸を用いた場合で、多少の差はあるもの
の、塩基番号４８０番目付近、および６１番目付近にお
いて切断を受けやすいことは共通して言えることであ
る。以上の結果より、２０量体のランダム配列オリゴ核
酸を用いた場合には、塩基番号４８０番目付近が最も切
断を受けやすく、ついで塩基番号６１番目付近が切断を
受けやすいことがわかった。また、９量体のランダム配
列オリゴ核酸を用いた場合には、塩基番号４８０番目付
近と塩基番号６１番目付近がともに同程度に最も切断を
受けやすいことがわかった。なお、ここで用いたランダ
ム配列オリゴ核酸を蛇毒ホスホジエステラーゼで分解
し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化してヌクレオ
シドとし、それをＨＰＬＣで分析してその塩基組成(dC:
dT:dG:dAのモル比)を調べたところ、２０量体について
は、１.０：１.４：１.２：０.８であり、９量体につい
ては、１.０：１.６：２.１：０.７であった。２０量体
のランダム配列オリゴ核酸を用いた場合、および９量体
のランダム配列オリゴ核酸を用いた場合における切断部
位(４８０番目付近および６１番目付近)の切断の受けや
すさの違いや微細な点での切断パターンの違いの原因
は、オリゴ核酸の長さの違い、および塩基組成の違いに
よることが考えられる。
核酸の標的部位を確定するために、反応混合液中の９量
体のランダム配列オリゴ核酸(天然型及びホスホロチオ
エート型)の濃度を２.６２μM、ＲＮase Ｈを０.０６U/
μlとして上記反応を繰り返した。即ち、３７℃で反応
を行い、１分、５分、３０分、９０分、１８０分の反応
時間で得られた断片を調べた。図３の結果を得た場合と
同様にEDTAを添加して反応を止め、後処理して得た結果
を図５に示す。レーン１からレーン５までは、天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸存在下であり、反応時間は順に１
分、５分、３０分、９０分、１８０分の場合である。レ
ーン６及びレーン７はそれぞれコントロールであり、レ
ーン６は、ランダム配列オリゴ核酸が存在しない(ＲＮa
se Ｈは存在する)場合であり、レーン７はＲＮase Ｈが
存在しない(天然型ランダム配列オリゴ核酸は存在する)
場合である。反応時間は、レーン６、７のいずれも１８
０分である。レーン８から１２は、９量体のホスホロチ
オエート型ランダム配列オリゴ核酸存在下であり、反応
時間が順に１分、５分、３０分、９０分、１８０分の場
合である。図５で示されるように、コントロール(レー
ン６：ランダム配列オリゴ核酸が存在しないとき、およ
びレーン７：ＲＮase Ｈが存在しないとき)では、上述
の２４ntの断片が確認されないが、天然型ランダム配列
オリゴ核酸存在下においては、５分の反応で、ホスホロ
チオエート型ランダム配列オリゴ核酸存在下において
は、９０分の反応で検出され始めた。更に、反応を続行
すると、該断片の量が増加すると共に、より小さな断片
の量も増大していることがわかる。以上の結果より、こ
の２４ntの断片は、ＲＮase Ｈにより、ＶＥＧＦmＲＮ
Ａから直接に、すなわちＶＥＧＦmＲＮＡの一次産物と
して生じた断片であると確認された。又、この断片は、
天然型又はホスホロチオエート型の９量体ランダム配列
オリゴ核酸のいずれを用いても生じることがわかる。そ
こで更に、６量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸を用
いて、上述と同様の反応を３７℃で２時間行った。図３
の結果を得た場合と同様にＥＤＴＡを添加して反応を止
め、後処理して得た結果を図６に示す。図６でレーン２
は６量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸６量体を加え
た場合であり、レーン３は比較のため９量体の天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸を加えた場合であり、いずれの場
合にも０.０６U/μlのＲＮase Ｈが共存する。レーン４
は対照として、ＲＮase Ｈ非存在下で９量体の天然型ラ
ンダム配列オリゴ核酸を加えた場合、レーン５は対照と
して、天然型ランダム配列オリゴ核酸非存在下で０.０
６U/μlのＲＮase Ｈを加えた場合である。さらに、レ
ーン１は、サイズマーカーであり、配列番号３に示す３
０量体ＲＮＡの5'末端を32Ｐの放射性同位元素でＶＥＧ
ＦmＲＮＡと同様の操作法で標識したものである。図６
からわかるように６量体の天然型ランダム配列オリゴ核
酸を用いても、９量体の天然型ランダム配列オリゴ核酸
の場合と同じ位置に、強度は弱いもののバンドが検出さ
れることがわかった(矢印で示す)。また、６量体のホス
ホロチオエート型ランダム配列オリゴ核酸を用いて上と
同様な実験を行った場合にも同様の部位で切断されるこ
とがわかった。次に、９量体または６量体の天然型また
はホスホロチオエート型のランダム配列オリゴ核酸存在
下、ＲＮase Ｈで塩基番号６１番目付近が切断される
(塩基番号６１番目の3'末端側付近で切断される)ことを
再確認するために、さらに塩基番号６１番目より下流に
存在する切断部位をより明確に求めるために、上述の5'
末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡの代わりに3'末端標識化Ｖ
ＥＧＦmＲＮＡを使用し、以下の反応混合液を用いて同
様に実験を行った。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン すなわち、この反応混合液を３７℃で５分〜２４０分保
った後に、0.5M ＥＤＴＡを１μl添加して反応を停止
し、図３の結果を得た場合と同様な後処理をして得た実
験結果を図７に示す。レーン１〜レーン３までは対照で
あり、レーン１はＲＮase Ｈおよびランダム配列オリゴ
核酸ともに非存在下、レーン２はランダム配列オリゴ核
酸非存在下(ＲＮase Ｈ存在下)、レーン３はＲＮase Ｈ
非存在下(ランダム配列オリゴ核酸存在下)である。レー
ン４〜レーン８までは９量体ランダム配列オリゴ核酸
(２.６２μM)とＲＮase Ｈ(０.０６U/μl)が存在してお
り、反応時間が順に５分、３０分、６０分、１２０分、
２４０分の場合である。図７からわかるように、反応時
間６０分から塩基番号６１番目付近での切断に相当する
断片(矢印１で示す)が検出された。また、同時に塩基番
号４８０番目付近に相当する断片(矢印２で示す)も検出
された。従って、この結果より、5'末端標識化ＶＥＧＦ
mＲＮＡを用いた場合に検出された塩基番号６１番目で
の切断片は、3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを用いた場
合においても同様に検出され、該部位は切断を受けやす
い部位であることが確認出来た。更に、3'末端標識化Ｖ
ＥＧＦmＲＮＡを用いることによって、塩基番号４８０
番目付近での切断も同様に受けやすいことがわかった。
次に、実際に細胞実験や動物実験で用いる際のアンチセ
ンス核酸の鎖長を考慮に入れ、それらと同一または同程
度の鎖長である２０量体の天然型ランダム配列オリゴ核
酸を用いて同様の反応を行った。反応混合液中の２０量
体のランダム配列オリゴ核酸の濃度を２.６２μM 、Ｒ
Ｎase Ｈを０.００６U/μl として３７℃で反応を行っ
た。なお、使用するＲＮase Ｈ量は、９量体のランダム
配列オリゴ核酸を用いて行った実験の場合と同濃度(０.
０６U/μl)を用いた場合、早い速度で切断反応が進行
し、経時変化を追跡することが困難であったため、従来
の１／１０の量である０.００６U/μlとした。そして、
反応時間は１０秒、１０分、１２０分とし、図３の結果
を得た場合と同様の後処理を行った。その結果を図８に
示す。レーン１及び２は、サイズマーカーであり、ラン
ダム配列オリゴ核酸の代わりに、アンチセンス核酸とし
て、Ａ０６１Ｆ(配列番号４)、Ａ２０６Ｆ(配列番号
５)、Ａ２９１Ｆ(配列番号６)、Ａ４２６Ｆ(配列番号
７)、Ａ４５４Ｆ(配列番号８)、Ａ４８５Ｆ(配列番号
９)を 1種類ずつ以下の反応混合液を用いて３７℃で１
２０分保った後、得られた反応混合液の３種類を等量ず
つ混ぜ、図３の結果を得た場合と同様な後処理を行って
得た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン 具体的には、レーン１はＡ０６１Ｆ、Ａ２０６Ｆ及びＡ
４８５Ｆのそれぞれの存在下で切断した反応混合液をさ
らに混合した物を、レーン２はＡ２９１Ｆ、Ａ４２６Ｆ
及びＡ４５４Ｆのそれぞれの存在下で切断した反応混合
液をさらに混合した物を電気泳動した場合である。レー
ン３〜５は９量体ランダム配列オリゴ核酸存在下であ
り、反応時間が順に、１０秒、１０分、１２０分であ
る。レーン６〜８は２０量体ランダム配列オリゴ核酸存
在下であり、反応時間が順に１０秒、１０分、１２０分
である。レーン９〜１２はそれぞれ対照であり、ランダ
ム配列オリゴ核酸非存在下(ＲＮase Ｈ存在下、レーン
９)、ＲＮase Ｈ非存在下(レーン１０は９量体のランダ
ム配列オリゴ核酸存在下、レーン１１は２０量体のラン
ダム配列オリゴ核酸存在下)、およびランダム配列オリ
ゴ核酸及びＲＮase Ｈともに非存在下(レーン１２)であ
る。図８からわかるように、４８０番目付近で切断され
たバンド(矢印１)は用いるランダム配列オリゴ核酸の鎖
長が２０量体の場合には反応初期(１０秒)から検出され
た。ランダム配列オリゴ核酸の鎖長が９量体の場合に
は、反応時間１０秒での検出はできないが、反応時間１
０分では弱いが検出可能であり、１２０分ではより強く
現れていることが確認できた。また、６１番目付近での
切断によるバンド(矢印２)も、２０量体のランダム配列
オリゴ核酸を用いた場合、１０分で微かに検出可能であ
り、１２０分では顕著に検出できた。また、９量体のラ
ンダム配列オリゴ核酸を用いた場合にも、１０分で微か
に検出可能であり、１２０分では顕著に検出できた。切
断パターンの詳細は、２０量体もしくは９量体のランダ
ム配列オリゴ核酸を用いた場合で、多少の差はあるもの
の、塩基番号４８０番目付近、および６１番目付近にお
いて切断を受けやすいことは共通して言えることであ
る。以上の結果より、２０量体のランダム配列オリゴ核
酸を用いた場合には、塩基番号４８０番目付近が最も切
断を受けやすく、ついで塩基番号６１番目付近が切断を
受けやすいことがわかった。また、９量体のランダム配
列オリゴ核酸を用いた場合には、塩基番号４８０番目付
近と塩基番号６１番目付近がともに同程度に最も切断を
受けやすいことがわかった。なお、ここで用いたランダ
ム配列オリゴ核酸を蛇毒ホスホジエステラーゼで分解
し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化してヌクレオ
シドとし、それをＨＰＬＣで分析してその塩基組成(dC:
dT:dG:dAのモル比)を調べたところ、２０量体について
は、１.０：１.４：１.２：０.８であり、９量体につい
ては、１.０：１.６：２.１：０.７であった。２０量体
のランダム配列オリゴ核酸を用いた場合、および９量体
のランダム配列オリゴ核酸を用いた場合における切断部
位(４８０番目付近および６１番目付近)の切断の受けや
すさの違いや微細な点での切断パターンの違いの原因
は、オリゴ核酸の長さの違い、および塩基組成の違いに
よることが考えられる。
【００１７】オリゴＲＮＡ鎖存在下におけるランダムス
クリーニング 今回、９量体のランダム配列オリゴ核酸を用いた際に、
構造遺伝子の上流である塩基配列番号６１で切断される
ことがわかった。この部位は、mＲＮＡを調製するため
に天然由来のＶＥＧＦ遺伝子に対し、人工的に付加した
部位であり、細胞実験や動物実験におけるアンチセンス
核酸の標的部位としては適当ではない。このような部位
が最も切断されやすい部位として検出された場合に、こ
のような部位以外の切断部位を見いだすため、以下の実
験を行った。すなわち、切断部位およびその近傍に対し
て相補的な塩基配列を有するオリゴＲＮＡ鎖で切断部位
をブッロクし、該部位がＲＮase Ｈによって切断されな
いようにしてランダムスクリーニングを以下のように行
った。ＶＥＧＦmＲＮＡが塩基配列番号６１番目付近で
切断されないように、以下に示す反応混合液を用いて、
5'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡをあらかじめ１０倍量の
配列番号１０に示した１４量体のオリゴＲＮＡと３７℃
で１時間反応させた。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン その後、上記反応混合液に以下のものを添加して３７℃
で２時間反応させた。 RNase H(1.2U/μl) 2.0μl 9 量体ランダム配列オリゴ核酸(26.2μM) 2.0 そして、0.5M EDTAを 1μl添加し反応を停止した。図３
の結果を得た時と同様の後処理を行い得た結果を図９に
示す。レーン１〜５は、サイズマーカーである。すなわ
ち、レーン１はアンチセンス核酸としてＡ３１３Ｎ(配
列番号１１)の存在下で、レーン２はアンチセンス核酸
としてＡ２９９Ｎ(配列番号１２)の存在下で、以下の反
応混合液を用いて３７℃で１２０分保った後、図３の結
果を得た場合と同様な後処理を行って得た結果である。
レーン３〜５は、アンチセンス核酸として、Ａ０８９Ｎ
(配列番号１３)、Ａ０９５Ｎ(配列番号１４)、Ａ１７９
Ｎ(配列番号１５)、Ａ２１７Ｎ(配列番号１６)、Ａ２９
９Ｎ(配列番号１２)、Ａ３１３Ｎ(配列番号１１)を 1種
類ずつ以下の反応混合液を用いて３７℃で１２０分保っ
た後、得られた反応混合液をさらに３種類ずつ等量混
ぜ、図３の結果を得た場合と同様な後処理を行って得
た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン すなわち、レーン３はＡ０９５Ｎ、Ａ２１７Ｎ及びＡ３
１３Ｎの各々をアンチセンス核酸として用いて反応を行
い、得られた反応混合液をさらに等量ずつ混合し、それ
を電気泳動した結果であり、レーン４はＡ０９５Ｎ、Ａ
１７９Ｎ及びＡ２９９Ｎの各々をアンチセンス核酸とし
て用いて反応を行い、得られた反応混合液をさらに等量
ずつ混合し、それを電気泳動した結果であり、レーン５
はＡ０８９Ｎ、Ａ１７９Ｎ及びＡ３１３Ｎの各々をアン
チセンス核酸として用いて反応を行い、得られた反応混
合液をさらに等量ずつ混合し、それを電気泳動した結果
である。レーン６は対照であり、ＲＮase Ｈ及びランダ
ム配列オリゴ核酸(又はアンチセンス核酸)ともに非存在
下で反応を行った場合の混合物を電気泳動した結果であ
る。レーン７は１４量体ＲＮＡ非存在下、レーン８は１
４量体ＲＮＡ存在下である。図９に示すように、あらか
じめ１４量体のＲＮＡで切断部位をブロックしたことに
よって、塩基番号６１番目付近での切断(矢印１)が見ら
れなくなり、代わりに構造遺伝子内に５つの切断部位
(矢印２〜６)が検出された。
クリーニング 今回、９量体のランダム配列オリゴ核酸を用いた際に、
構造遺伝子の上流である塩基配列番号６１で切断される
ことがわかった。この部位は、mＲＮＡを調製するため
に天然由来のＶＥＧＦ遺伝子に対し、人工的に付加した
部位であり、細胞実験や動物実験におけるアンチセンス
核酸の標的部位としては適当ではない。このような部位
が最も切断されやすい部位として検出された場合に、こ
のような部位以外の切断部位を見いだすため、以下の実
験を行った。すなわち、切断部位およびその近傍に対し
て相補的な塩基配列を有するオリゴＲＮＡ鎖で切断部位
をブッロクし、該部位がＲＮase Ｈによって切断されな
いようにしてランダムスクリーニングを以下のように行
った。ＶＥＧＦmＲＮＡが塩基配列番号６１番目付近で
切断されないように、以下に示す反応混合液を用いて、
5'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡをあらかじめ１０倍量の
配列番号１０に示した１４量体のオリゴＲＮＡと３７℃
で１時間反応させた。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン その後、上記反応混合液に以下のものを添加して３７℃
で２時間反応させた。 RNase H(1.2U/μl) 2.0μl 9 量体ランダム配列オリゴ核酸(26.2μM) 2.0 そして、0.5M EDTAを 1μl添加し反応を停止した。図３
の結果を得た時と同様の後処理を行い得た結果を図９に
示す。レーン１〜５は、サイズマーカーである。すなわ
ち、レーン１はアンチセンス核酸としてＡ３１３Ｎ(配
列番号１１)の存在下で、レーン２はアンチセンス核酸
としてＡ２９９Ｎ(配列番号１２)の存在下で、以下の反
応混合液を用いて３７℃で１２０分保った後、図３の結
果を得た場合と同様な後処理を行って得た結果である。
レーン３〜５は、アンチセンス核酸として、Ａ０８９Ｎ
(配列番号１３)、Ａ０９５Ｎ(配列番号１４)、Ａ１７９
Ｎ(配列番号１５)、Ａ２１７Ｎ(配列番号１６)、Ａ２９
９Ｎ(配列番号１２)、Ａ３１３Ｎ(配列番号１１)を 1種
類ずつ以下の反応混合液を用いて３７℃で１２０分保っ
た後、得られた反応混合液をさらに３種類ずつ等量混
ぜ、図３の結果を得た場合と同様な後処理を行って得
た。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン すなわち、レーン３はＡ０９５Ｎ、Ａ２１７Ｎ及びＡ３
１３Ｎの各々をアンチセンス核酸として用いて反応を行
い、得られた反応混合液をさらに等量ずつ混合し、それ
を電気泳動した結果であり、レーン４はＡ０９５Ｎ、Ａ
１７９Ｎ及びＡ２９９Ｎの各々をアンチセンス核酸とし
て用いて反応を行い、得られた反応混合液をさらに等量
ずつ混合し、それを電気泳動した結果であり、レーン５
はＡ０８９Ｎ、Ａ１７９Ｎ及びＡ３１３Ｎの各々をアン
チセンス核酸として用いて反応を行い、得られた反応混
合液をさらに等量ずつ混合し、それを電気泳動した結果
である。レーン６は対照であり、ＲＮase Ｈ及びランダ
ム配列オリゴ核酸(又はアンチセンス核酸)ともに非存在
下で反応を行った場合の混合物を電気泳動した結果であ
る。レーン７は１４量体ＲＮＡ非存在下、レーン８は１
４量体ＲＮＡ存在下である。図９に示すように、あらか
じめ１４量体のＲＮＡで切断部位をブロックしたことに
よって、塩基番号６１番目付近での切断(矢印１)が見ら
れなくなり、代わりに構造遺伝子内に５つの切断部位
(矢印２〜６)が検出された。
【００１８】複数種のアンチセンス核酸鎖を用いた場合
のスクリーニング結果 ランダム配列オリゴ核酸を用いる以外に複数種のアンチ
センス核酸を用いて、同様なスクリーニングが行えるか
どうかを調べた。その為にまず、無細胞系の実験で、Ｖ
ＥＧＦの発現阻害が認められなかったアンチセンス核酸
とＶＥＧＦの発現阻害が見られ、それがアンチセンス核
酸効果によると考えられるアンチセンス核酸を用いた場
合とで違いが検出できるかどうかを調べた(後に述べる
無細胞転写翻訳系におけるアンチセンス核酸の効果の項
参照)。発現阻害が見られなかったものとして、ＶＥＧ
Ｆの塩基配列８３〜９６番目及び２７５〜２８８番目に
相補なアンチセンス核酸である、配列番号１７及び１８
に示すＡ０８３Ｎ及びＡ２７５Ｎを用いた(PCT/JP95/01
121参照)。アンチセンス核酸効果による発現阻害が見ら
れたアンチセンス核酸として、ＶＥＧＦの塩基配列９５
〜１０８番目、２３７〜２４０番目及び５０３〜５１０
番目に相補なアンチセンス核酸である配列番号１４、１
９、及び２に示すＡ０９５Ｎ、Ａ２３７Ｎ及びＡ５０３
Ｈを用いた(PCT/JP95/01121参照)。また、数種のアンチ
センス核酸存在下であっても切断部位を同様に検出でき
るかどうかを見るためにＡ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ
２３７Ｎの３種を等濃度ずつ混ぜたものを用いた。反応
混合液の組成は次のとおりである。 ＊複数種のアンチセンス核酸を混合して用いる場合は各
々のアンチセンス核酸濃度が１００nM(反応混合液中で
の濃度は各々が10nM)になるように調製した。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH=7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン この反応混合液を３７℃で２時間保った後、０.５M Ｅ
ＤＴＡ １μlを添加し反応を停止し、上述と同様の操作
を行った。その結果を図１０に示す。レーン１はＡ０８
３Ｎ、レーン２はＡ２７５Ｎ、レーン３はＡ０９５Ｎ、
そしてレーン４はＡ２３７Ｎを添加した場合である。レ
ーン５はＡ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎの３種
混合物を添加した場合であり、レーン６はＡ５０３Ｈを
添加した場合(Ａ５０３Ｈが mＲＮＡにハイブリ(対合)
したことによる切断箇所に矢印３)である。さらに、レ
ーン７は対照であり、アンチセンス核酸及びＲＮase Ｈ
ともに非存在下の場合である。図１０のレーン３及び４
に示すように、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎを添加した場
合には、それぞれがＶＥＧＦmＲＮＡに結合し該部位で
ＲＮase Ｈにより切断されると仮定した場合の大きさの
断片(それぞれ矢印１及び２)が確認された。一方、Ａ０
８３Ｎ及びＡ２７５Ｎを添加した場合には、各々のＶＥ
ＧＦmＲＮＡ結合部位に対応する切断産物が確認されな
かった。また、Ａ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎ
の３種を等量ずつ混合したものは、Ａ０９５Ｎ及びＡ２
３７Ｎのそれぞれに対応する切断産物が確認された。以
上の結果より、標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを用いたこの系
においては、単一種もしくは複数種のアンチセンス核酸
を用い、それらがアンチセンス核酸効果を示すか否かの
判断ができることがわかった。このことは、言い換えれ
ば、ここで述べた方法を用いて、単一種又は複数種のア
ンチセンス核酸の中で、有効なアンチセンス核酸を選出
できることを意味する。さらに、本実験方法では、複数
種のアンチセンス核酸の効果を単一の反応混合系で調べ
られることが実証されたといえる。
のスクリーニング結果 ランダム配列オリゴ核酸を用いる以外に複数種のアンチ
センス核酸を用いて、同様なスクリーニングが行えるか
どうかを調べた。その為にまず、無細胞系の実験で、Ｖ
ＥＧＦの発現阻害が認められなかったアンチセンス核酸
とＶＥＧＦの発現阻害が見られ、それがアンチセンス核
酸効果によると考えられるアンチセンス核酸を用いた場
合とで違いが検出できるかどうかを調べた(後に述べる
無細胞転写翻訳系におけるアンチセンス核酸の効果の項
参照)。発現阻害が見られなかったものとして、ＶＥＧ
Ｆの塩基配列８３〜９６番目及び２７５〜２８８番目に
相補なアンチセンス核酸である、配列番号１７及び１８
に示すＡ０８３Ｎ及びＡ２７５Ｎを用いた(PCT/JP95/01
121参照)。アンチセンス核酸効果による発現阻害が見ら
れたアンチセンス核酸として、ＶＥＧＦの塩基配列９５
〜１０８番目、２３７〜２４０番目及び５０３〜５１０
番目に相補なアンチセンス核酸である配列番号１４、１
９、及び２に示すＡ０９５Ｎ、Ａ２３７Ｎ及びＡ５０３
Ｈを用いた(PCT/JP95/01121参照)。また、数種のアンチ
センス核酸存在下であっても切断部位を同様に検出でき
るかどうかを見るためにＡ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ
２３７Ｎの３種を等濃度ずつ混ぜたものを用いた。反応
混合液の組成は次のとおりである。 ＊複数種のアンチセンス核酸を混合して用いる場合は各
々のアンチセンス核酸濃度が１００nM(反応混合液中で
の濃度は各々が10nM)になるように調製した。 （注）5 ×反応用緩衝液の組成 750mM 塩化ナトリウム 100mM Tris-HCl(pH=7.4) 7.5mM 塩化マグネシウム 5.0mM ジチオスレオトール 250μg/μl 牛血清アルブミン この反応混合液を３７℃で２時間保った後、０.５M Ｅ
ＤＴＡ １μlを添加し反応を停止し、上述と同様の操作
を行った。その結果を図１０に示す。レーン１はＡ０８
３Ｎ、レーン２はＡ２７５Ｎ、レーン３はＡ０９５Ｎ、
そしてレーン４はＡ２３７Ｎを添加した場合である。レ
ーン５はＡ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎの３種
混合物を添加した場合であり、レーン６はＡ５０３Ｈを
添加した場合(Ａ５０３Ｈが mＲＮＡにハイブリ(対合)
したことによる切断箇所に矢印３)である。さらに、レ
ーン７は対照であり、アンチセンス核酸及びＲＮase Ｈ
ともに非存在下の場合である。図１０のレーン３及び４
に示すように、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎを添加した場
合には、それぞれがＶＥＧＦmＲＮＡに結合し該部位で
ＲＮase Ｈにより切断されると仮定した場合の大きさの
断片(それぞれ矢印１及び２)が確認された。一方、Ａ０
８３Ｎ及びＡ２７５Ｎを添加した場合には、各々のＶＥ
ＧＦmＲＮＡ結合部位に対応する切断産物が確認されな
かった。また、Ａ０８３Ｎ、Ａ０９５Ｎ及びＡ２３７Ｎ
の３種を等量ずつ混合したものは、Ａ０９５Ｎ及びＡ２
３７Ｎのそれぞれに対応する切断産物が確認された。以
上の結果より、標識化ＶＥＧＦmＲＮＡを用いたこの系
においては、単一種もしくは複数種のアンチセンス核酸
を用い、それらがアンチセンス核酸効果を示すか否かの
判断ができることがわかった。このことは、言い換えれ
ば、ここで述べた方法を用いて、単一種又は複数種のア
ンチセンス核酸の中で、有効なアンチセンス核酸を選出
できることを意味する。さらに、本実験方法では、複数
種のアンチセンス核酸の効果を単一の反応混合系で調べ
られることが実証されたといえる。
【００１９】ＶＥＧＦの発現系 pＳＵ０２の発現系として、Ｐromega社製の兎網状赤血
球溶解物由来の転写翻訳系を利用した(PCT/JP95/01121
参照)。pＳＵ０２にはＶＥＧＦの構造遺伝子の上流にＳ
Ｐ６プロモーターが存在するので、pＳＵ０２を用いて
転写翻訳を行う際は、Ｐromega社製のＴＮＴTMＳＰ６ C
oupled Reticulocyte Lysate System。実験方法は、同
キットに添付の方法に従った。転写翻訳系の反応混合液
の組成は次の通りである。 35S-メチオニンは、Ａmersham社製のin vivo cell labe
lling grade(SJ1015,37TBq/mmol, 0.37MBq/ μl)を用
い、Ｐromega社キットに添付の方法で示されている量の
半分に相当する量(１μl)を添加した。また、滅菌水
は、１２１℃で１５分間処理したものを用いた。これら
及びpＳＵ０２以外の混合液組成物は、上述のＰromega
社キットに含まれているものである。上述の反応混合液
を３０℃又は３７℃で１〜２時間保ち、目的の蛋白質で
あるＶＥＧＦを１０〜１００ng得た。ＶＥＧＦ発現の確認 （１）酵素免疫測定法 マイクロタイタープレート(ポリスチレン製)にポリクロ
ーナル抗体(ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、
その産生物を兎に投与して得た抗体)を常法に従って固
定化した(PCT/JP95/01121参照)。ついで、上に記載のＶ
ＥＧＦ用の転写翻訳系混合液(３０℃で２時間反応させ
たもの)を３倍から９３７５倍に希釈した液を加え、室
温(約２５℃)で２時間放置した。この希釈液を除き、
０.１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液で
充分に洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識した前記ポリクローナル抗体を添加し、室温で１時
間放置した。前記洗浄液で充分に洗浄した後、基質であ
るオルト−ジアミノベンゼン溶液を加え、適度に発色す
るまで室温で放置した(約３０分)。その後、４９０nmに
おける吸光度を測定し、ＶＥＧＦの含有量を評価した。
結果を図１１に示す。プラスミドとしてpＳＵ０２を用
いた際、反応混合液の希釈倍率が小さい場合(３倍から
３７５倍希釈)の吸光度は、希釈倍率の大きい場合(１８
７５倍又は９３７５倍希釈)のそれにくらべ明らかに増
加した(図中の「○」)。このような現象は、ＶＥＧＦを産
生しないpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)をプラスミドとして用
いた反応混合液の場合には見られない(図１１に●で示
すが、同図において、すべての●は◎と重なる場所にあ
るため、実際には表示されていない)。即ち、この場合
は一定の吸光度の値を示し、その値は、pＳＵ０２を用
いた反応混合液を高希釈した場合の値及びコントロール
としてpＳＵ０２の代わりに水のみを加えて反応させた
反応混合液の場合の値(図中の「◎」)と実質的に等しい。
従って、pＳＵ０２を用いた反応混合液を低希釈した場
合の吸光度の増加は、ＶＥＧＦが転写翻訳系混合液に含
まれていたためと結論できる。なお、プラスミドとして
pＳＵ０２を用いた際、３倍希釈での吸光度の値は１５
倍希釈での値よりも小さい現象が観察された。これは反
応混合液中に、ＶＥＧＦとそのポリクローナル抗体との
反応を有意に阻害する物質が含まれていたことを示唆す
る。 （２）電気泳動法 次にＶＥＧＦが上述の転写翻訳系で生成することをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法)で確認した(PCT/JP95/01121参
照)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｐromega社の転写翻訳系キ
ットに添付されている手順書に従って、以下の通り行っ
た。転写翻訳系の反応混合液から５μlをとり、これに
２０μlの2-メルカプトエタノール含有のＳＤＳ Sample
緩衝液(Promega社の手順書に示す組成の混合溶液を使
用)を加えて密栓した。ついで、１００℃で２分間処理
を行い、蛋白質を変性させた。このうちの５μlをと
り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％又は１７.５％のポリアク
リルアミドゲル)で電気泳動を行った。その後、オート
ラジオグラフィーを行うために、ゲルを濾紙に移し、ゲ
ル乾燥装置を用いて８０℃で充分に乾燥させた。つい
で、暗室中でそのゲルをＸ線用フィルムと重ねてカセッ
トに入れ、１０時間から１００時間室温で放置したあ
と、Ｘ線用フィルムを現像した。その結果を図１２に示
す。レーン１及び３はプラスミドとしてpＳＵ０２を用
いたときのバンドを、レーン２及び４は、プラスミドと
してpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)を用いたときのバンドを示
す。また、レーン１及び２は転写翻訳系の反応を３０
℃、レーン３及び４は転写翻訳系の反応を３７℃で行っ
たものである。尚、分子量は、色素で標識した蛋白質の
分子量マーカー[Amersham社製のRainbowTMマーカー(高
分子量レンジ)]を同時に泳動し、その位置をもとに算定
した。プラスミドとしてpＳＵ０２を用いたときは、分
子量約１５kdにバンドが認められるが、pＰoly(Ａ)-luc
(ＳＰ６)をプラスミドとして用いたときは、上述のバン
ドはなく、かわりに分子量約６０kdの場所にバンドが見
られた。pＳＵ０２をプラスミドとしたときに生成する
ＶＥＧＦの分子量は、そのアミノ酸配列から１７.２kd
と計算でき、pＳＵ０２からＶＥＧＦが生成したことに
よることがわかった。
球溶解物由来の転写翻訳系を利用した(PCT/JP95/01121
参照)。pＳＵ０２にはＶＥＧＦの構造遺伝子の上流にＳ
Ｐ６プロモーターが存在するので、pＳＵ０２を用いて
転写翻訳を行う際は、Ｐromega社製のＴＮＴTMＳＰ６ C
oupled Reticulocyte Lysate System。実験方法は、同
キットに添付の方法に従った。転写翻訳系の反応混合液
の組成は次の通りである。 35S-メチオニンは、Ａmersham社製のin vivo cell labe
lling grade(SJ1015,37TBq/mmol, 0.37MBq/ μl)を用
い、Ｐromega社キットに添付の方法で示されている量の
半分に相当する量(１μl)を添加した。また、滅菌水
は、１２１℃で１５分間処理したものを用いた。これら
及びpＳＵ０２以外の混合液組成物は、上述のＰromega
社キットに含まれているものである。上述の反応混合液
を３０℃又は３７℃で１〜２時間保ち、目的の蛋白質で
あるＶＥＧＦを１０〜１００ng得た。ＶＥＧＦ発現の確認 （１）酵素免疫測定法 マイクロタイタープレート(ポリスチレン製)にポリクロ
ーナル抗体(ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、
その産生物を兎に投与して得た抗体)を常法に従って固
定化した(PCT/JP95/01121参照)。ついで、上に記載のＶ
ＥＧＦ用の転写翻訳系混合液(３０℃で２時間反応させ
たもの)を３倍から９３７５倍に希釈した液を加え、室
温(約２５℃)で２時間放置した。この希釈液を除き、
０.１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液で
充分に洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識した前記ポリクローナル抗体を添加し、室温で１時
間放置した。前記洗浄液で充分に洗浄した後、基質であ
るオルト−ジアミノベンゼン溶液を加え、適度に発色す
るまで室温で放置した(約３０分)。その後、４９０nmに
おける吸光度を測定し、ＶＥＧＦの含有量を評価した。
結果を図１１に示す。プラスミドとしてpＳＵ０２を用
いた際、反応混合液の希釈倍率が小さい場合(３倍から
３７５倍希釈)の吸光度は、希釈倍率の大きい場合(１８
７５倍又は９３７５倍希釈)のそれにくらべ明らかに増
加した(図中の「○」)。このような現象は、ＶＥＧＦを産
生しないpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)をプラスミドとして用
いた反応混合液の場合には見られない(図１１に●で示
すが、同図において、すべての●は◎と重なる場所にあ
るため、実際には表示されていない)。即ち、この場合
は一定の吸光度の値を示し、その値は、pＳＵ０２を用
いた反応混合液を高希釈した場合の値及びコントロール
としてpＳＵ０２の代わりに水のみを加えて反応させた
反応混合液の場合の値(図中の「◎」)と実質的に等しい。
従って、pＳＵ０２を用いた反応混合液を低希釈した場
合の吸光度の増加は、ＶＥＧＦが転写翻訳系混合液に含
まれていたためと結論できる。なお、プラスミドとして
pＳＵ０２を用いた際、３倍希釈での吸光度の値は１５
倍希釈での値よりも小さい現象が観察された。これは反
応混合液中に、ＶＥＧＦとそのポリクローナル抗体との
反応を有意に阻害する物質が含まれていたことを示唆す
る。 （２）電気泳動法 次にＶＥＧＦが上述の転写翻訳系で生成することをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法)で確認した(PCT/JP95/01121参
照)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｐromega社の転写翻訳系キ
ットに添付されている手順書に従って、以下の通り行っ
た。転写翻訳系の反応混合液から５μlをとり、これに
２０μlの2-メルカプトエタノール含有のＳＤＳ Sample
緩衝液(Promega社の手順書に示す組成の混合溶液を使
用)を加えて密栓した。ついで、１００℃で２分間処理
を行い、蛋白質を変性させた。このうちの５μlをと
り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％又は１７.５％のポリアク
リルアミドゲル)で電気泳動を行った。その後、オート
ラジオグラフィーを行うために、ゲルを濾紙に移し、ゲ
ル乾燥装置を用いて８０℃で充分に乾燥させた。つい
で、暗室中でそのゲルをＸ線用フィルムと重ねてカセッ
トに入れ、１０時間から１００時間室温で放置したあ
と、Ｘ線用フィルムを現像した。その結果を図１２に示
す。レーン１及び３はプラスミドとしてpＳＵ０２を用
いたときのバンドを、レーン２及び４は、プラスミドと
してpＰoly(Ａ)-luc(ＳＰ６)を用いたときのバンドを示
す。また、レーン１及び２は転写翻訳系の反応を３０
℃、レーン３及び４は転写翻訳系の反応を３７℃で行っ
たものである。尚、分子量は、色素で標識した蛋白質の
分子量マーカー[Amersham社製のRainbowTMマーカー(高
分子量レンジ)]を同時に泳動し、その位置をもとに算定
した。プラスミドとしてpＳＵ０２を用いたときは、分
子量約１５kdにバンドが認められるが、pＰoly(Ａ)-luc
(ＳＰ６)をプラスミドとして用いたときは、上述のバン
ドはなく、かわりに分子量約６０kdの場所にバンドが見
られた。pＳＵ０２をプラスミドとしたときに生成する
ＶＥＧＦの分子量は、そのアミノ酸配列から１７.２kd
と計算でき、pＳＵ０２からＶＥＧＦが生成したことに
よることがわかった。
【００２０】無細胞転写翻訳系におけるアンチセンス核
酸の効果 上に述べた方法を用い、ＶＥＧＦmＲＮＡに対するアン
チセンス核酸の効果を調べた(PCT/JP95/01121参照)。そ
の結果の一部を次に示す。 アンチセンス核酸 ＶＥＧＦの発現率 Ａ083 Ｎ（配列番号１７） ４６％ Ａ095 Ｎ（配列番号１４） ０ Ａ237 Ｎ（配列番号１９） ２ Ａ275 Ｎ（配列番号１８） ８５ Ａ503 Ｈ（配列番号２） １ この結果から明らかなように、Ａ０８３Ｎ及びＡ２７５
ＮによるＶＥＧＦ産生阻害効果に較べ、Ａ０９５Ｎ、Ａ
２３７Ｎ及びＡ５０３ＨによるＶＥＧＦ産生阻害効果は
著しかった。すなわち、アンチセンス核酸の標的部位を
探索する本発明の方法とは、アンチセンス核酸法の考え
に基づき、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体上のアンチセンス
核酸の標的部位を探索する方法である。なお、その部位
を含む６量体以上の塩基配列に対して相補的なアンチセ
ンス核酸はアンチセンス核酸効果が期待できる。アンチセンス核酸の調製 標識mＲＮＡ、ランダム配列のオリゴ核酸及びＲＮase
Ｈを用いた実験結果から、ＶＥＧＦの塩基配列の６１番
目及び４８０番目付近が切断されることがわかった。こ
のことは、これらの塩基を含む領域がアンチセンス核酸
の標的部位として有効であることを示唆する。そこで、
このことを確かめるために、２つの領域の内６１番目近
辺のアンチセンス核酸を数種合成し、兎網状赤血球溶解
物由来の転写翻訳系を用いて、ＶＥＧＦの産生阻害に及
ぼすアンチセンス核酸効果を調べた。反応条件は使用し
たアンチセンス核酸を除いて、前に用いた方法(PCT/JP9
5/01121参照)と同一である。その結果、該切断部位を含
むＡ０５７Ｎ(５７番目の塩基から７０番目の塩基に相
補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号２０)及びそ
の付近に結合するＡ０６２Ｎ(６２番目の塩基から７５
番目の塩基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番
号２１)はＶＥＧＦの産生を顕著に阻害したが、該切断
部位を含まないＡ０７２Ｎ(７２番目の塩基から８５番
目の塩基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号
２２)及びＡ０７７Ｎ(７７番目の塩基から９０番目の塩
基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号２３)
はＶＥＧＦの産生を阻害しなかった。以上のことより、
ＶＥＧＦの遺伝子の６１番目の塩基を含む領域に対する
アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦの発現を有効に阻害する
ことがわかった。
酸の効果 上に述べた方法を用い、ＶＥＧＦmＲＮＡに対するアン
チセンス核酸の効果を調べた(PCT/JP95/01121参照)。そ
の結果の一部を次に示す。 アンチセンス核酸 ＶＥＧＦの発現率 Ａ083 Ｎ（配列番号１７） ４６％ Ａ095 Ｎ（配列番号１４） ０ Ａ237 Ｎ（配列番号１９） ２ Ａ275 Ｎ（配列番号１８） ８５ Ａ503 Ｈ（配列番号２） １ この結果から明らかなように、Ａ０８３Ｎ及びＡ２７５
ＮによるＶＥＧＦ産生阻害効果に較べ、Ａ０９５Ｎ、Ａ
２３７Ｎ及びＡ５０３ＨによるＶＥＧＦ産生阻害効果は
著しかった。すなわち、アンチセンス核酸の標的部位を
探索する本発明の方法とは、アンチセンス核酸法の考え
に基づき、mＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体上のアンチセンス
核酸の標的部位を探索する方法である。なお、その部位
を含む６量体以上の塩基配列に対して相補的なアンチセ
ンス核酸はアンチセンス核酸効果が期待できる。アンチセンス核酸の調製 標識mＲＮＡ、ランダム配列のオリゴ核酸及びＲＮase
Ｈを用いた実験結果から、ＶＥＧＦの塩基配列の６１番
目及び４８０番目付近が切断されることがわかった。こ
のことは、これらの塩基を含む領域がアンチセンス核酸
の標的部位として有効であることを示唆する。そこで、
このことを確かめるために、２つの領域の内６１番目近
辺のアンチセンス核酸を数種合成し、兎網状赤血球溶解
物由来の転写翻訳系を用いて、ＶＥＧＦの産生阻害に及
ぼすアンチセンス核酸効果を調べた。反応条件は使用し
たアンチセンス核酸を除いて、前に用いた方法(PCT/JP9
5/01121参照)と同一である。その結果、該切断部位を含
むＡ０５７Ｎ(５７番目の塩基から７０番目の塩基に相
補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号２０)及びそ
の付近に結合するＡ０６２Ｎ(６２番目の塩基から７５
番目の塩基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番
号２１)はＶＥＧＦの産生を顕著に阻害したが、該切断
部位を含まないＡ０７２Ｎ(７２番目の塩基から８５番
目の塩基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号
２２)及びＡ０７７Ｎ(７７番目の塩基から９０番目の塩
基に相補的な１４量体の天然型ＤＮＡ：配列番号２３)
はＶＥＧＦの産生を阻害しなかった。以上のことより、
ＶＥＧＦの遺伝子の６１番目の塩基を含む領域に対する
アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦの発現を有効に阻害する
ことがわかった。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、目的とする蛋白質をコー
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ、特にmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆
体等上におけるアンチセンス核酸標的部位を効率よく確
定することが可能となった。また、ランダム配列オリゴ
核酸の代わりに複数種のアンチセンス核酸を用いること
によって、多数のアンチセンス核酸の中でより有効であ
る可能性が高いアンチセンス核酸を簡便に選出すること
ができるようになった。このことによって、治療剤、診
断剤、研究試薬の開発に有用な優れた効果を示すアンチ
センス核酸を容易に調製することができる。
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ、特にmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆
体等上におけるアンチセンス核酸標的部位を効率よく確
定することが可能となった。また、ランダム配列オリゴ
核酸の代わりに複数種のアンチセンス核酸を用いること
によって、多数のアンチセンス核酸の中でより有効であ
る可能性が高いアンチセンス核酸を簡便に選出すること
ができるようになった。このことによって、治療剤、診
断剤、研究試薬の開発に有用な優れた効果を示すアンチ
センス核酸を容易に調製することができる。
【００２２】
配列番号：１ 配列の長さ：７７４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ ｔｏ mＲＮＡ 配列： TTATGTATCA TACACATACG ATTTAGGTGA CACTATAGAA TACAAGCTTA 50 TGCATGCGGC CGCATCTAGA GGGCCCGGCC CCGGTCGGGC CTCCGAAACC 100 ATGAACTTTC TGCTGTCTTG GGTGCATTGG AGCCTTGCCT TGCTGCTCTA 150 CCTCCACCAT GCCAAGTGGT CCCAGGCTGC ACCCATGGCA GAAGGAGGAG 200 GGCAGAATCA TCACGAAGTG GTGAAGTTCA TGGATGTCTA TCAGCGCAGC 250 TACTGCCATC CAATCGAGAC CCTGGTGGAC ATCTTCCAGG AGTACCCTGA 300 TGAGATCGAG TACATCTTCA AGCCATCCTG TGTGCCCCTG ATGCGATGCG 350 GGGGCTGCTG CAATGACGAG GGCCTGGAGT GTGTGCCCAC TGAGGAGTCC 400 AACATCACCA TGCAGATTAT GCGGATCAAA CCTCACCAAG GCCAGCACAT 450 AGGAGAGATG AGCTTCCTAC AGCACAACAA ATGTGAATGC AGACCAAAGA 500 AAGATAGAGC AAGACAAGAA AAATGTGACA AGCCGAGGCG GTGAGCCGGG 550 CAGGAGGAAG GAGCCTCCCT CAGGGTTTCG GGAACCAGAT CCACTAGTTC 600 TAGATGCATG CTCGAGCGGC CGCCAGTGTG ATGGATATCT GCAGAATTCC 650 AGCACACTGG CCGTTACTAG TGGATCCGAG CTCCCAAAAA AAAAAAAAAA 700 AAAAAAAAAA AAAAACCGAA TTAATTCGTA ATCATGGTCA TAGCTGTTTC 750 CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCA 774 配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GCTCTATC 8 配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： mＲＮＡ 配列：GAAUACAAGC UUAUGCAUGC GGCCGCAUCU 30 配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GATGCG 6 配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ATGATT 6 配列番号：６ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GGTACT 6 配列番号：７ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GTTTGA 6 配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ATCTCT 6 配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GCATTC 6 配列番号：１０ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：UCUAGAUGCG GCCG 14 配列番号：１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ATGGCTTGAA GATG 14 配列番号：１２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TACTCGATCT CATC 14 配列番号：１３ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ATGGTTTCGG AGGC 14 配列番号：１４ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：AAGTTCATGG TTTC 14 配列番号：１５ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TCTGCCATGG GTGC 14 配列番号：１６ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TGAACTTCAC CACT 14 配列番号：１７ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TCGGAGGCCC GACC 14 配列番号：１８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TGGAAGATGT CCAC 14 配列番号：１９ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GCTGCGCTGA TAGA 14 配列番号：２０ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：TCTAGATGCG GCCG 14 配列番号：２１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GGCCCTCTAG ATGC 14 配列番号：２２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：ACCGGGGCCG GGCC 14 配列番号：２３ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列：GCCCGACCGG GGCC 14
【図１】 プラスミド(pＳＵ０２)のアガロースゲル電
気泳動の結果を示す写真である。
気泳動の結果を示す写真である。
【図２】 ＶＥＧＦmＲＮＡの紫外線吸収スペクトルを
示す図である。
示す図である。
【図３】 ＶＥＧＦの塩基配列５０３〜５１０番目に相
補的な配列をもつＡ503 Ｈ(８量体; 天然型)存在下にお
けるＲＮase ＨによるＶＥＧＦmＲＮＡの切断結果を示
す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
補的な配列をもつＡ503 Ｈ(８量体; 天然型)存在下にお
けるＲＮase ＨによるＶＥＧＦmＲＮＡの切断結果を示
す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図４】 ９量体ランダムオリゴ核酸の濃度とＲＮase
Ｈの濃度を変化させて、ＲＮase ＨによるＶＥＧＦmＲ
ＮＡの切断が検出できるかどうかを判定した結果を示す
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
Ｈの濃度を変化させて、ＲＮase ＨによるＶＥＧＦmＲ
ＮＡの切断が検出できるかどうかを判定した結果を示す
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図５】 ＶＥＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス核酸の標
的部位の確定が９量体ランダム配列オリゴ核酸(天然型
及びホスホロチオエート型)で可能か否かを判定した結
果を示す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真で
ある。
的部位の確定が９量体ランダム配列オリゴ核酸(天然型
及びホスホロチオエート型)で可能か否かを判定した結
果を示す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真で
ある。
【図６】 ＶＥＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス核酸の標
的部位の確定が６量体及び９量体天然型ランダム配列オ
リゴ核酸で可能か否かを判定した結果を示す変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の写真である。
的部位の確定が６量体及び９量体天然型ランダム配列オ
リゴ核酸で可能か否かを判定した結果を示す変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図７】 天然型９量体ランダムオリゴ核酸を用いＲＮ
ase Ｈによる3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡの切断部位
の検出を行った結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の写真である。
ase Ｈによる3'末端標識化ＶＥＧＦmＲＮＡの切断部位
の検出を行った結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の写真である。
【図８】 ＶＥＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス核酸の標
的部位の確定が２０量体ランダム配列オリゴ核酸(天然
型及びホスホロチオエート型)で可能か否かを判定した
結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真
である。
的部位の確定が２０量体ランダム配列オリゴ核酸(天然
型及びホスホロチオエート型)で可能か否かを判定した
結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真
である。
【図９】 オリゴＲＮＡ鎖であらかじめＶＥＧＦmＲＮ
Ａの切断部位をブッロクさせた状態で９量体天然型ラン
ダム配列オリゴ核酸によりアンチセンス核酸の標的部位
の確定が可能か否かを判定した結果を示す変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の写真である。
Ａの切断部位をブッロクさせた状態で９量体天然型ラン
ダム配列オリゴ核酸によりアンチセンス核酸の標的部位
の確定が可能か否かを判定した結果を示す変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図１０】 複数種のアンチセンス核酸を用いて、ＶＥ
ＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス核酸部位の確定が可能か
否かを判定した結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の写真である。
ＧＦmＲＮＡ上のアンチセンス核酸部位の確定が可能か
否かを判定した結果を示す変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の写真である。
【図１１】 ＶＥＧＦの発現を示す抗原抗体反応の結果
の図である。
の図である。
【図１２】 転写翻訳系でＶＥＧＦが生成することを示
すSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
すSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
Claims (11)
- 【請求項１】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡと複数のランダムな塩基配列を有するオリゴ核
酸とをハイブリダイズ(対合)させることによりアンチセ
ンス核酸の標的部位を確定し、該標的部位にハイブリダ
イズ(対合)する核酸を取得することを特徴とするアンチ
センス核酸の調製方法。 - 【請求項２】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡと複数のランダムな塩基配列を有するオリゴ核
酸とをハイブリダイズ(対合)させると共に核酸分解能を
有する物質でハイブリダイズ(対合)した箇所を分解させ
ることによりアンチセンス核酸の標的部位を確定し、該
標的部位にハイブリダイズ(対合)する核酸を取得するこ
とを特徴とするアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項３】 核酸分解能を有する物質がＲＮase Ｈで
あることを特徴とする請求項２のアンチセンス核酸の調
製方法。 - 【請求項４】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡがmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の全部又は一部で
あることを特徴とする請求項１又は２のアンチセンス核
酸の調製方法。 - 【請求項５】 目的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡがmＲＮＡ又はmＲＮＡ前駆体の全部又は一部で
あり、且つ一端が標識化されたものであることを特徴と
する請求項１又は２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項６】 ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸
が塩基数４〜３０のオリゴ核酸であることを特徴とする
請求項１又は２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項７】 ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸
が塩基数６〜２５のオリゴ核酸であることを特徴とする
請求項１又は２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項８】 ランダムな塩基配列を有するオリゴ核酸
がアンチセンス核酸として有効な核酸の塩基数と同一も
しくは同程度の長さであることを特徴とする請求項１又
は２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項９】 実質的に同一塩基数を有する複数のラン
ダムな塩基配列を有するオリゴ核酸を用いることを特徴
とする請求項１又は２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項１０】 標的部位の対象から除外すべき部位に
実質的に相補な塩基配列を持ち、核酸分解能を有する物
質による分解を受けない機能を有する核酸を併用し、目
的とする蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの塩基配
列の一部を標的部位の対象外とすることを特徴とする請
求項２のアンチセンス核酸の調製方法。 - 【請求項１１】 併用する核酸がオリゴリボヌクレオチ
ド又はメチルホスホネート型のオリゴデオキシリボヌク
レオチドであることを特徴とする請求項１０のアンチセ
ンス核酸の調製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19541996A JPH09154579A (ja) | 1995-10-03 | 1996-07-05 | アンチセンス核酸の調製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27975295 | 1995-10-03 | ||
| JP7-279752 | 1995-10-03 | ||
| JP19541996A JPH09154579A (ja) | 1995-10-03 | 1996-07-05 | アンチセンス核酸の調製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09154579A true JPH09154579A (ja) | 1997-06-17 |
Family
ID=26509103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19541996A Pending JPH09154579A (ja) | 1995-10-03 | 1996-07-05 | アンチセンス核酸の調製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09154579A (ja) |
-
1996
- 1996-07-05 JP JP19541996A patent/JPH09154579A/ja active Pending
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