JPH09103300A - Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rna - Google Patents
Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rnaInfo
- Publication number
- JPH09103300A JPH09103300A JP7264468A JP26446895A JPH09103300A JP H09103300 A JPH09103300 A JP H09103300A JP 7264468 A JP7264468 A JP 7264468A JP 26446895 A JP26446895 A JP 26446895A JP H09103300 A JPH09103300 A JP H09103300A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- mycobacterium tuberculosis
- mycobacterium
- rna polymerase
- tuberculosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は臨床診断における、
結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のリファンピシ
ン耐性獲得に関与する突然変異が高頻度で起こる領域を
含むRNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子断片を特
異的に増幅することが可能なオリゴヌクレオチドおよび
その用途、ならびに上記オリゴヌクレオチドを用いて増
幅されたDNA断片の利用方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to clinical diagnosis,
Oligonucleotide capable of specifically amplifying an RNA polymerase β subunit gene fragment containing a region in which a mutation involved in acquisition of resistance to rifampicin of Mycobacterium tuberculosis occurs frequently, its use, and the above oligonucleotide The present invention relates to a method of using a DNA fragment amplified by using.
【0002】[0002]
【従来の技術】結核菌(Mycobacterium tuberculosis)
は抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌であり、結核菌症
など重篤な疾病を引き起こす病原菌である。結核菌症と
しては肺結核が圧倒的に多い。結核菌はほとんど全ての
臓器に結核性病変を起こし、結核性胸膜炎、結核性髄膜
炎、カリエス、腸結核、腎結核、関節結核などを起こ
す。感染源は患者であり、飛沫感染などによって経気道
的に感染する。2. Description of the Related Art Mycobacterium tuberculosis
Is a Gram-positive bacillus that has anti-acidic properties and is a pathogen that causes serious diseases such as tuberculosis. Pulmonary tuberculosis is by far the most common tuberculosis disease. Mycobacterium tuberculosis causes tuberculous lesions in almost all organs, including tuberculous pleurisy, tuberculous meningitis, caries, intestinal tuberculosis, renal tuberculosis, and joint tuberculosis. The source of infection is the patient, which is transmitted through the respiratory tract by droplet infection or the like.
【0003】近年、結核治療に抗結核薬リファンピシン
が使われるようになり、結核菌症の治癒率は上昇の傾向
にある。リファンピシンは結核菌のRNAポリメラーゼ
βサブユニットに作用してその働きを抑制し、結核菌の
生育を阻害することで抗菌性を示す。しかし、RNAポ
リメラーゼβサブユニットの一部に変異が生じてリファ
ンピシンが作用できなくなると、その結核菌はリファン
ピシンに対して耐性を獲得するようになる。このような
リファンピシン耐性菌は、結核菌症の治療を困難にす
る。感染している結核菌のリファンピシン耐性の有無を
迅速に検出することは、治療薬を選択する上で重要な指
標となり得る。現在、リファンピシンをはじめとする結
核菌の薬剤耐性検査は培養法にて行われている。しか
し、一般に結核菌は生育が遅く、培養にはかなりの時間
を要する。通常、直接法では4〜8週、間接法において
は8〜16週を要する。このため、迅速なリファンピシ
ン耐性の検出方法が望まれている。In recent years, the anti-tuberculosis drug rifampicin has been used for the treatment of tuberculosis, and the cure rate for tuberculosis disease tends to increase. Rifampicin acts on the RNA polymerase β subunit of Mycobacterium tuberculosis, suppresses its action, and inhibits the growth of Mycobacterium tuberculosis, thereby exhibiting antibacterial properties. However, when a part of the RNA polymerase β subunit is mutated and rifampicin cannot act, the tubercle bacillus becomes resistant to rifampicin. Such rifampicin-resistant bacteria make treatment of tuberculosis disease difficult. Prompt detection of the resistance of infected M. tuberculosis to rifampicin can be an important indicator in selecting therapeutic agents. Currently, drug resistance tests of tubercle bacilli such as rifampicin are conducted by a culture method. However, Mycobacterium tuberculosis generally grows slowly and requires a considerable amount of time for cultivation. Usually, the direct method requires 4 to 8 weeks, and the indirect method requires 8 to 16 weeks. Therefore, a rapid method for detecting resistance to rifampicin is desired.
【0004】リファンピシン耐性結核菌は、RNAポリ
メラーゼβサブユニットをコードする遺伝子中の約69
塩基対中にアミノ酸変異を伴う突然変異を有することが
報告されている(Lancet;341巻647頁1993
年、Antimicrobial Agents andChemotherapy;37巻1
0号2054頁1993年、J.Cliical Microbiolog
y;32巻1095頁1994年)。結核菌にリファン
ピシン耐性を付与する突然変異は、特定のアミノ酸の変
異に限られず、この69塩基対領域に広範囲に分布して
いることが知られている。Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis has about 69 genes in the gene encoding the RNA polymerase β subunit.
It has been reported to have mutations accompanied by amino acid mutations in base pairs (Lancet; 341: 647, 1993).
Year, Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Vol. 37, 1
0, page 2054, 1993, J. Cliical Microbiolog
y; 32, p. 1095, 1994). It is known that the mutation that confers resistance to rifampicin to Mycobacterium tuberculosis is not limited to the mutation of a specific amino acid, but is widely distributed in this 69 base pair region.
【0005】これらの研究成果を踏まえ現在、臨床検体
中に存在する微量の結核菌のリファンピシン耐性に関係
するRNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子断片を、
PCR(ポリメラーゼチェインリアクション)を用いて
増幅し、その断片中の遺伝子変異より、リファンピシン
耐性の有無を推定する方法の開発が注目されている。変
異の検出法としては、直接シークエンス法、SSCP
(Single-strand conformation polymorphism)法、オ
リゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョン法、RFLP法などが考えられている。これらの方
法を用いることによって、約2日間以内に結核菌のリフ
ァンピシンに対する耐性の有無を推定することが可能と
なる。Based on these research results, a small amount of RNA polymerase β subunit gene fragment related to resistance to rifampicin of Mycobacterium tuberculosis present in clinical specimens is
The development of a method for estimating the presence or absence of rifampicin resistance based on the gene mutation in the fragment amplified by PCR (polymerase chain reaction) has attracted attention. Mutations can be detected by direct sequence method, SSCP
(Single-strand conformation polymorphism) method, hybridization method using an oligonucleotide probe, RFLP method and the like are considered. By using these methods, it becomes possible to estimate the presence or absence of resistance of M. tuberculosis to rifampicin within about 2 days.
【0006】しかし、臨床の検体より抽出したDNA
は、結核菌以外の種々の微生物由来のDNAを含んでい
ることが多いので、結核菌の遺伝子のみを特異的に増幅
し解析する必要がある。特に、結核菌以外のマイコバク
テリウム属の細菌は遺伝子配列の相同性が高く、同時に
増幅される可能性を十分考慮しておく必要がある。However, DNA extracted from clinical specimens
Often contains DNAs derived from various microorganisms other than Mycobacterium tuberculosis, so it is necessary to specifically amplify and analyze only the gene of Mycobacterium tuberculosis. In particular, bacteria belonging to the genus Mycobacterium other than Mycobacterium tuberculosis have high homology in gene sequences, and it is necessary to fully consider the possibility of simultaneous amplification.
【0007】結核菌以外のマイコバクテリウム属細菌に
よって引き起こされる疾病は非定型抗酸菌症と呼ばれ、
結核菌症と似た症状を示すことがあることが知られてい
る。その中でも、マイコバクテリウム・カンサシイ、マ
イコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イ
ントラセルラーレなどによる非定型抗酸菌症はその頻度
が高い。また、種々の臨床材料より、起病性のないマイ
コバクテリウム属細菌も数多く分離されている。このこ
とは、種々のマイコバクテリウム属細菌が臨床検体中に
含まれている可能性を示唆している。また、解析用の蒸
留水などから何らかの抗酸菌DNAが検出されたという
報告もあり、環境からの混入も十分注意しなければなら
ない。Diseases caused by Mycobacterium other than Mycobacterium tuberculosis are called atypical mycobacteriosis,
It is known that it may show symptoms similar to tuberculosis. Among them, the atypical mycobacteriosis caused by Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, etc. has a high frequency. Moreover, many non-pathogenic bacteria of the genus Mycobacterium have been isolated from various clinical materials. This suggests that various Mycobacterium may be contained in the clinical specimen. In addition, there is a report that some acid-fast bacterium DNA was detected in distilled water for analysis, etc., and attention must be paid to contamination from the environment.
【0008】現在までに報告されている結核菌RNAポ
リメラーゼβサブユニット遺伝子増幅用オリゴヌクレオ
チド(Lancet;341巻647頁1993年、Antimicr
obial Agents and Chemotherapy;37巻10号205
4頁1993年、J.CliicalMicrobiology;32巻10
95頁1994年)は、マイコバクテリウム属間で比較
的保存されている配列を用いているため、少なくとも数
種類のマイコバクテリウム属細菌の遺伝子もまた同様に
増幅することが明らかである。実際、報告されている配
列を用いて増幅を行った場合、マイコバクテリウム・カ
ンサシイなどをはじめとするいくつかの主要な非定型抗
酸菌においても、目的DNAの増幅が確認され得る。こ
のようにして増幅された結核菌以外のRNAポリメラー
ゼβサブユニット遺伝子は、結核菌と少なくともいくつ
かの異なる遺伝子配列を含んでいることが確認されてお
り、臨床検体を解析するにあたり判定が困難なケースが
生じることが予想される。これらのことを考慮すると、
臨床検体を材料とした場合、特に高感度解析において
は、結核菌に特異性の高いオリゴヌクレオチドを用いる
増幅によって得られるDNA断片を用いて解析を行うこ
とが、非常に重要であると考えられる。[0008] Oligonucleotides for amplifying the RNA polymerase β subunit gene of Mycobacterium tuberculosis reported so far (Lancet; 341: 647, 1993, Antimicr
obial Agents and Chemotherapy; Vol. 37, No. 10, 205
P. 4, 1993, J. Cliical Microbiology; 32 Volume 10
(P. 95, 1994) uses sequences that are relatively conserved among Mycobacterium species, so it is clear that at least some Mycobacterium bacterium genes are amplified as well. In fact, when amplification is performed using the reported sequence, amplification of the target DNA can be confirmed even in some major atypical mycobacteria such as Mycobacterium kansasii. It has been confirmed that the RNA polymerase β subunit genes other than Mycobacterium tuberculosis thus amplified contain at least some gene sequences different from those of Mycobacterium tuberculosis, which makes determination difficult when analyzing clinical samples. Cases are expected to occur. With these things in mind,
When a clinical sample is used as a material, it is considered very important to perform analysis using a DNA fragment obtained by amplification using an oligonucleotide highly specific to Mycobacterium tuberculosis, particularly in high-sensitivity analysis.
【0009】[0009]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、結核
菌(Mycobacterium tuberculosis)のリファンピシン耐
性獲得に関与する突然変異が高頻度で起こる領域を含む
RNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子断片を、特異
的に増幅するための新規なオリゴヌクレオチドおよびそ
の用途、ならびに上記オリゴヌクレオチドを用いて増幅
されたDNA断片の利用方法を提供することである。The object of the present invention is to specifically target an RNA polymerase β subunit gene fragment containing a region in which a mutation involved in acquisition of resistance to rifampicin of Mycobacterium tuberculosis occurs frequently. It is intended to provide a novel oligonucleotide for amplification, its use, and a method of using a DNA fragment amplified using the above-mentioned oligonucleotide.
【0010】[0010]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、結核菌
(Mycobacterium tuberculosis)とその他のマイコバク
テリウム属細菌のRNAポリメラーゼβサブユニット遺
伝子に関して検討を重ねた結果、結核菌にほぼ特異的な
核酸配列を得、それを用いた遺伝子増幅法を確立し、本
発明を完成させるに至った。[Means for Solving the Problems] As a result of repeated studies on the RNA polymerase β subunit genes of Mycobacterium tuberculosis and other Mycobacterium, the present inventors have found that they are almost specific to Mycobacterium tuberculosis. The present invention has been completed by obtaining a nucleic acid sequence, establishing a gene amplification method using the nucleic acid sequence.
【0011】本発明は、配列番号1または2に示される
核酸配列もしくは該配列に相補的な核酸配列のうち、少
なくとも連続した15残基よりなる核酸配列を含有す
る、結核菌(Mycobacterium Tuberculosis)RNAポリ
メラーゼβサブユニット遺伝子増幅用オリゴヌクレオチ
ドである。上記オリゴヌクレオチドは、修飾物により修
飾されていてもよい。この修飾物は、好ましくは、ラジ
オアイソトープ、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ジゴ
キシゲニンである。The present invention comprises Mycobacterium tuberculosis RNA containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 contiguous residues of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or the nucleic acid sequences complementary to the sequences. This is an oligonucleotide for amplifying a polymerase β subunit gene. The above oligonucleotide may be modified with a modified product. This modified product is preferably a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin, or digoxigenin.
【0012】本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを
用いる結核菌RNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子
を増幅する方法である。The present invention is also a method for amplifying the Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit gene using the above-mentioned oligonucleotide.
【0013】本発明はまた、試料中の核酸を上記オリゴ
ヌクレオチドを用いて増幅し、得られたDNA断片を試
料として該DNA断片中の塩基置換の有無を解析する方
法である。The present invention is also a method for amplifying nucleic acid in a sample using the above-mentioned oligonucleotide, and analyzing the presence or absence of base substitution in the DNA fragment using the obtained DNA fragment as a sample.
【0014】[0014]
【発明の実施の形態】本発明者らは、現在までに既に決
定されている大腸菌、シュードモナス属細菌、マイコバ
クテリウム属細菌などの配列、および発明者らにより明
らかとなったいくつかのマイコバクテリウム属細菌のR
NAポリメラーゼβサブユニット遺伝子の配列を参考に
して、各種間の遺伝子配列の相同性の理論的検証および
実験的検証を重ねた結果、結核菌(Mycobacterium tube
rculosis)のリファンピシン耐性獲得に関与する突然変
異が高頻度で起こる領域を含むRNAポリメラーゼβサ
ブユニット遺伝子断片を増幅するための特異的なオリゴ
ヌクレオチド配列(配列番号1および2)を見いだし
た。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present inventors have already determined the sequences of Escherichia coli, Pseudomonas bacteria, Mycobacterium bacteria, etc., and some mycobacteria revealed by the present inventors. R of Umbrella
As a result of repeated theoretical and experimental verification of homology of gene sequences among various species with reference to the sequence of the NA polymerase β subunit gene, Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis)
We have found specific oligonucleotide sequences (SEQ ID NOS: 1 and 2) for amplifying an RNA polymerase β subunit gene fragment containing a region in which a mutation involved in acquisition of rifampicin resistance of rculosis) occurs frequently.
【0015】すなわち、本発明は、結核菌(Mycobacter
ium tuberculosis)のリファンピシン耐性獲得に関与す
る突然変異が高頻度で起こる領域を含むRNAポリメラ
ーゼβサブユニット遺伝子断片を特異的に増幅するオリ
ゴヌクレオチドである。That is, the present invention relates to Mycobacteria
It is an oligonucleotide that specifically amplifies an RNA polymerase β subunit gene fragment containing a region in which mutations involved in acquisition of resistance to rifampicin of (ium tuberculosis) occur frequently.
【0016】上記オリゴヌクレオチドは、配列番号1ま
たは2に記載の核酸配列(但し、Aはアデニン、Cはシ
トシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任意
の位置のTはウラシル(U)と置換されていてもよい)
の一部または全部、または、それらの相補配列の一部ま
たは全部を含有する。The above-mentioned oligonucleotide is a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 (where A is adenine, C is cytosine, G is guanine, T is thymine, and T at any position is uracil (U). ) May be substituted)
Or a part or all of their complementary sequences.
【0017】本発明のオリゴヌクレオチドは、DNA増
幅用のプライマーとして使用され得る。本発明のオリゴ
ヌクレオチドはまた、シークエンス解析を行う場合のプ
ライマーとしても使用され得る。このオリゴヌクレオチ
ドは、配列番号1または2に記載の配列またはそれらの
相補配列の全域を使用する必要はない。配列表の配列お
よびその相補配列に由来する適度な長さの配列が、PC
R反応条件などに合わせて解離温度(Tm値)などを計
算することにより決定され得る。しかし、プライマーに
十分な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した
15塩基、さらに望ましくは少なくとも連続した20塩
基の長さが必要である。プライマーが十分な特異性を有
するためにはまた、3’末端の塩基は、配列表の配列に
記載の3’末端の塩基を用いることが望ましい。使用す
る条件、目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にあ
る程度の置換を行ってもよい場合があることは当業者に
容易に予想できる。また、プライマーの特異性に影響を
及ぼさない程度に、結核菌の配列に従ってプライマーの
5’側をさらに延長して使用することも容易に予想でき
る。The oligonucleotides of the present invention can be used as primers for DNA amplification. The oligonucleotides of the present invention can also be used as primers when performing sequence analysis. The oligonucleotide need not use the entire sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or their complementary sequences. Sequences of an appropriate length derived from the sequences in the sequence listing and their complementary sequences are
It can be determined by calculating the dissociation temperature (Tm value) according to the R reaction conditions and the like. However, in order for the primer to have sufficient specificity, a length of at least 15 contiguous bases, more preferably at least 20 contiguous bases, is required. In order for the primer to have sufficient specificity, it is desirable to use the 3'-terminal base described in the sequence in the sequence listing as the 3'-terminal base. It can be easily predicted by those skilled in the art that some substitutions may be made in the oligonucleotide depending on the conditions to be used, the purpose and the like. Further, it can be easily expected to further extend the 5 ′ side of the primer according to the sequence of Mycobacterium tuberculosis so as not to affect the specificity of the primer.
【0018】本発明者らはオリゴヌクレオチド設計にあ
たり、オリゴヌクレオチドの3’末端に相補するターゲ
ット遺伝子中の塩基が突然変異を起こした変異体もまた
存在することを考慮して、変異する確率の少ない塩基
を、オリゴヌクレオチドの3’末端の塩基として設定し
た。ポリメラーゼのプライマーとなるオリゴヌクレオチ
ドの3’末端の塩基は、ポリメラーゼ反応の起点とな
る。このため、ターゲット遺伝子の配列が変異すると、
ポリメラーゼ反応の効率は極端に低下することとなる。
実際、配列番号1に示されるオリゴヌクレオチドの3’
末端の塩基(T)に相当する結核菌遺伝子のT(プラス
鎖)が、AもしくはGに変異すると、TTGによりコー
ドされるロイシンは、メチオニン(ATG)もしくはバ
リン(GTG)として翻訳される。また、配列番号2に
示されるオリゴヌクレオチドの3’末端(T)に相補す
る結核菌遺伝子のA(プラス鎖)が、CもしくはTに変
異した場合、GAAによりコードされるグルタミン酸は
アスパラギン酸(GACまたはGAT)として翻訳され
る。このTTGによりコードされるロイシンおよびGA
Aによりコードされるグルタミン酸は、アミノ酸レベル
においては、種を通じほぼ完全に保存されている。この
ことは、これらアミノ酸がタンパク質の機能を維持する
上で重要な役割を担っており、突然変異によりこれらの
アミノ酸が他のアミノ酸に変異した場合、そのクローン
は自然淘汰により消滅する可能性が高いことを意味して
いる。よって、上記オリゴヌクレオチドを用いる増幅に
より、存在し得るほぼ全ての結核菌由来のRNAポリメ
ラーゼβサブユニット遺伝子を普遍的に増幅し得ると考
えることができる。In designing the oligonucleotide, the present inventors consider that there is also a mutant in which the base in the target gene complementary to the 3'end of the oligonucleotide is mutated, and the probability of mutation is low. The base was set as the base at the 3'end of the oligonucleotide. The base at the 3'end of the oligonucleotide that serves as a polymerase primer serves as the starting point of the polymerase reaction. Therefore, if the sequence of the target gene is mutated,
The efficiency of the polymerase reaction will be extremely reduced.
In fact, 3'of the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 1
When the T (plus chain) of the Mycobacterium tuberculosis gene corresponding to the terminal base (T) is mutated to A or G, leucine encoded by TTG is translated as methionine (ATG) or valine (GTG). Moreover, when A (plus chain) of the Mycobacterium tuberculosis gene complementary to the 3'end (T) of the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is mutated to C or T, the glutamic acid encoded by GAA is aspartic acid (GAC). Or GAT). Leucine and GA encoded by this TTG
The glutamic acid encoded by A is almost completely conserved across species at the amino acid level. This means that these amino acids play an important role in maintaining the function of the protein, and when these amino acids are mutated to other amino acids by mutation, the clone is likely to disappear by natural selection. It means that. Therefore, it can be considered that almost all the RNA polymerase β subunit genes derived from M. tuberculosis that can exist can be universally amplified by the amplification using the above-mentioned oligonucleotide.
【0019】上記オリゴヌクレオチドは、修飾物によっ
て修飾され得る。この修飾物は、好ましくは放射性物
質、蛍光物質、発光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンな
ど公知の標識である。標識の様式は、末端標識または配
列の中間の標識のいずれでもよい。The above-mentioned oligonucleotide can be modified with a modified product. This modified product is preferably a known label such as a radioactive substance, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin and digoxigenin. The form of labeling may be either end labeling or labeling in the middle of the sequence.
【0020】本発明は、上記オリゴヌクレオチドを用い
る結核菌RNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子の増
幅方法を包含する。The present invention includes a method for amplifying Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit gene using the above-mentioned oligonucleotide.
【0021】本発明はまた、試料中の核酸を上記オリゴ
ヌクレオチドを用いて増幅し、得られたDNA断片を試
料として、このDNA断片中の塩基置換の有無を解析す
る方法を包含する。The present invention also includes a method of amplifying nucleic acid in a sample using the above-mentioned oligonucleotide, and using the obtained DNA fragment as a sample to analyze the presence or absence of base substitution in this DNA fragment.
【0022】本発明において、DNA増幅の対象は、喀
痰、肺洗浄液、胸水、胃液、血液などの各種臨床材料中
の結核菌由来のDNAであるが、単離、培養された菌体
のDNAを増幅することも含まれることはいうまでもな
い。また、本発明における試料には、上記の各種臨床材
料や培養菌体の他、これらより単離および精製された核
酸なども含まれる。In the present invention, the target of DNA amplification is DNA derived from Mycobacterium tuberculosis in various clinical materials such as sputum, lung lavage fluid, pleural effusion, gastric juice and blood. It goes without saying that amplification is also included. Further, the sample in the present invention includes the above-mentioned various clinical materials and cultured bacterial cells, as well as nucleic acids isolated and purified from these.
【0023】DNA増幅に用いられ得るプライマーとし
ては、上述の全てのオリゴヌクレオチドが挙げられる。
このDNA増幅には、一般的にPCR(ポリメラーゼチ
ェインリアクション)法が用いられ得る。上述したよう
に、臨床検体からの結核菌RNAポリメラーゼβサブユ
ニットの増幅には、配列番号1および2にそれぞれ示さ
れるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いられ
得る。しかし、配列番号1および2にそれぞれ示される
オリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増幅
されたDNAを、さらに配列番号1および2にそれぞれ
示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することに
よって、より高感度の増幅が可能となることが予想され
る。この時使用する外側のプライマーは、結核菌特異的
であることが望ましいが、特異性の低いプライマーも使
用し得る。Primers that can be used for DNA amplification include all the oligonucleotides described above.
A PCR (polymerase chain reaction) method can be generally used for this DNA amplification. As described above, the combination of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 can be preferably used for the amplification of Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit from a clinical sample. However, by further reamplifying the DNA amplified by the primers outside the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 with the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively, a higher sensitivity can be obtained. It is expected that amplification will be possible. The outer primer used at this time is preferably specific to Mycobacterium tuberculosis, but a primer having low specificity can also be used.
【0024】また、増幅において、配列番号1および2
にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを
用いることが重要である。このことは、増幅反応の特異
性は、使用する2つのオリゴヌクレオチドの相乗効果が
重要であることによる。また、さらに特異性を高めるに
は、増幅に使用するプライマーの濃度をできるだけ低く
抑えることも重要である。In amplification, SEQ ID NOS: 1 and 2
It is important to use the combination of oligonucleotides shown in each. This is because the specificity of the amplification reaction depends on the synergistic effect of the two oligonucleotides used. Further, in order to further increase the specificity, it is important to keep the concentration of the primer used for amplification as low as possible.
【0025】現在までに報告されている、RNAポリメ
ラーゼβサブユニットのリファンピシン耐性にかかわる
領域を増幅する方法(Lancet;341巻647頁199
3年、Antimicrobial Agents and Chemotherapy;37
巻10号2054頁1993年、J.Cliical Microbiol
ogy;32巻1095頁1994年)は、マイコバクテ
リウム属にかなり共通した配列を有するオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いてPCR増幅を行うため
に、結核菌に対する特異性が低い。特に臨床検体(喀痰
など)から結核菌のRNAポリメラーゼ遺伝子を直接増
幅する場合、他のマイコバクテリウム属細菌などの遺伝
子もまた増幅する可能性がある。臨床の場で応用するに
当たっては十分このことを考慮しなければならない。本
発明は、結核菌のRNAポリメラーゼβサブユニット遺
伝子のリファンピシン耐性にかかわる領域を特異的に増
幅することを可能とし、臨床検体などを用いた場合の問
題点を解決した。A method for amplifying a region of the RNA polymerase β subunit involved in resistance to rifampicin, which has been reported so far (Lancet; 341: 647, 199).
3rd year, Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 37
Volume 10, page 2054, 1993, J. Cliical Microbiol
ogy; 32: 1095, 1994) has low specificity for M. tuberculosis because it performs PCR amplification using an oligonucleotide having a sequence quite common to the genus Mycobacterium as a primer. In particular, when the RNA polymerase gene of Mycobacterium tuberculosis is directly amplified from a clinical sample (sputum, etc.), genes of other Mycobacterium bacteria may also be amplified. This must be taken into consideration when applying it in the clinical setting. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention makes it possible to specifically amplify a region related to rifampicin resistance of the RNA polymerase β subunit gene of Mycobacterium tuberculosis, and has solved the problem when using a clinical sample or the like.
【0026】本発明者らは、配列番号1および2にそれ
ぞれ示される配列を有するオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いて、結核菌(Mycobacterium tuberculos
is)のリファンピシン耐性獲得に関与する突然変異が高
頻度で起こる領域を含むRNAポリメラーゼβサブユニ
ット遺伝子断片を、PCRにより特異的に増幅すること
が可能であることを、実験的に確認した。具体的には、
配列番号1および2にそれぞれ示されるオリゴヌクレオ
チドの組み合わせをプライマーとして用いて、14種類
のマイコバクテリウム属細菌のDNAを試料としてPC
R増幅実験を行った。その結果、ヒト型結核菌(Mycoba
cterium tuberculosis)および同じ結核菌群に分類され
るウシ型結核菌(Mycobacterium vobis)にのみ、RN
Aポリメラーゼβサブユニット遺伝子の増幅が確認され
た。また、マイコバクテリウム属以外の大腸菌、黄色ブ
ドウ球菌などの臨床材料より頻繁に分離され得る細菌の
DNAには、目的遺伝子の増幅は認められなかった。ウ
シ型結核菌(Mycobacterium vobis)は、ヒト型結核菌
(Mycobacterium tuberculosis)と共に結核菌群に分類
される細菌であり、同様の起病性を有している。ウシ型
結核菌は、rRNAをコードする遺伝子を用いた遺伝子
型解析においてもヒト型と区別することは非常に難しい
ことが知られており、RNAポリメラーゼβサブユニッ
ト遺伝子の構造もまたヒト型結核菌と酷似していること
が推測される。しかし、ウシ型結核菌による疾病は非常
にまれであり、臨床材料に混入している可能性は極めて
低いといえる。The present inventors have used the oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 as primers to prepare Mycobacterium tuberculos.
It was experimentally confirmed that an RNA polymerase β subunit gene fragment containing a region in which a mutation involved in the acquisition of rifampicin resistance of (is) frequently occurs can be specifically amplified by PCR. In particular,
Using the combinations of oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 as primers, DNAs of 14 species of Mycobacterium were used as samples for PC.
An R amplification experiment was performed. As a result, Mycobacterium tuberculosis (Mycoba
cterium tuberculosis) and Mycobacterium vobis that are classified into the same group of Mycobacterium tuberculosis
Amplification of the A polymerase β subunit gene was confirmed. In addition, amplification of the target gene was not found in DNA of bacteria other than Mycobacterium, such as Escherichia coli and Staphylococcus aureus, which can be frequently isolated from clinical materials. Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium vobis) is a bacterium that is classified into the Mycobacterium tuberculosis group together with human tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), and has the same pathogenicity. It is known that M. bovis is very difficult to distinguish from human even in genotyping using a gene encoding rRNA, and the structure of the RNA polymerase β subunit gene is also M. tuberculosis. It is speculated that it is very similar to. However, the disease caused by Mycobacterium bovis is extremely rare, and it can be said that the possibility of contamination with clinical materials is extremely low.
【0027】本発明で用いられる増幅DNAの解析方法
には、種々の解析方法が含まれる。種々の解析方法とし
ては、直接シークエンス法、SSCP(Single-strand
conformation polymorphism)法、オリゴヌクレオチド
プローブを用いたハイブリダイゼーション解析などが挙
げられる。その中でも、直接シークエンス法は、起こり
得る全ての変異の検出が可能であり、最も望ましい方法
である。しかし、直接シークエンス法は操作が煩雑であ
る。一度に多量の検体を解析する場合には、SSCP法
またはオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーシ
ョン解析などの簡便法を用いる方が良い場合も考えられ
る。The amplified DNA analysis method used in the present invention includes various analysis methods. Various analysis methods include direct sequence method, SSCP (Single-strand
conformation polymorphism) method, hybridization analysis using an oligonucleotide probe, and the like. Among them, the direct sequencing method is the most desirable method because it can detect all possible mutations. However, the direct sequence method is complicated in operation. When analyzing a large amount of samples at one time, it may be better to use a simple method such as SSCP method or hybridization analysis using an oligonucleotide.
【0028】本発明における直接シークエンス法とは、
増幅により得られたDNA断片を鋳型にして、ダイデオ
キシ法のような塩基配列決定法によりシークエンス解析
を行う方法である。この方法は、従来の増幅DNAをベ
クターにクローニングして解析する方法に比べ簡便であ
るため、より臨床検査に向く方法である。本発明におけ
る直接シークエンス法は、具体的には、本発明の配列番
号1および2にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて増幅して得られたDNA断片を
鋳型にして、シークエンス解析を行う方法である。シー
クエンス用のプライマーとしては、上記配列番号1およ
び2にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドが、用途に
応じて用いられ得る。その増幅配列中に含まれる任意の
配列を有するオリゴヌクレオチドもまた、プライマーと
して用いられ得る。さらに、標識のような修飾物で修飾
されたプライマーもまた用いられ得る。標識としては、
ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、ビオチン、
ジゴキシゲニンなどが挙げられる。シークエンス用プラ
イマーは、標識の有無に関わらずシークエンス解析に良
好に用いられることが理解され得る。この方法を用いる
ことによって、起こり得る全ての変異の解析が可能とな
る。今後、上記遺伝子の変異の種類とリファンピシンに
対する耐性の度合、すなわち最小発育阻止濃度との詳細
な関係が明らかとなることで、この解析が明確な診断の
基準となり得ることが予想される。The direct sequence method in the present invention is
In this method, a DNA fragment obtained by amplification is used as a template for sequence analysis by a nucleotide sequence determination method such as the dideoxy method. Since this method is simpler than the conventional method of cloning amplified DNA in a vector and analyzing it, it is more suitable for clinical examination. The direct sequencing method of the present invention is specifically a method of performing a sequence analysis using a DNA fragment obtained by amplification using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 of the present invention as a primer, as a template. Is. As a sequence primer, the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 can be used depending on the application. Oligonucleotides with any of the sequences contained in the amplified sequence can also be used as primers. Furthermore, a primer modified with a modification such as a label can also be used. As a sign,
Radioisotope, fluorescent substance, luminescent substance, biotin,
Examples include digoxigenin. It can be seen that the sequencing primer is well used for sequence analysis with or without labeling. By using this method, all possible mutations can be analyzed. It is expected that this analysis may serve as a clear diagnostic criterion by clarifying the detailed relationship between the types of mutations of the above genes and the degree of resistance to rifampicin, that is, the minimum inhibitory concentration.
【0029】本発明におけるSSCP法とは、増幅によ
り得られたDNA断片を熱変性により一本鎖状態とし、
中性アクリルアミドゲルにて電気泳動を行ない、その易
動度の差から突然変異の有無の判定を行う方法である
(Genomics;5巻874頁1989年)。具体的には、
本発明の配列番号1および2にそれぞれ示されるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いた増幅により得ら
れたDNA断片を、熱変性して一本鎖状態にし、厳密な
温度制御のもとで中性アクリルアミドゲルにて電気泳動
を行い、その移動度の差からRNAポリメラーゼβサブ
ユニット中の突然変異の有無を判定する方法である。上
記SSCP法において、標識のような修飾物で修飾され
たオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることに
よって、より高感度な解析が可能となる。標識として
は、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、ビオチ
ン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。この方法によっ
て、より簡便に変異の有無を検出し得る。しかし、この
SSCP法では変異の位置を同定できない。このため、
変異が検出されると、直接シークエンス法にて解析して
変異の位置の同定を行う必要がある。The SSCP method in the present invention is the DNA fragment obtained by amplification is heat-denatured into a single-stranded state,
This is a method of performing electrophoresis on a neutral acrylamide gel and determining the presence or absence of mutation from the difference in mobility (Genomics; Vol. 5, pp. 874, 1989). In particular,
The DNA fragments obtained by amplification using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 of the present invention as primers are heat-denatured into a single-stranded state, and subjected to strict temperature control under neutral acrylamide gel. In this method, electrophoresis is performed and the presence or absence of mutation in the RNA polymerase β subunit is determined from the difference in mobility. In the above SSCP method, by using an oligonucleotide modified with a modified product such as a label as a primer, more sensitive analysis can be performed. Examples of the label include radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, biotin, digoxigenin and the like. By this method, the presence or absence of mutation can be detected more easily. However, this SSCP method cannot identify the position of the mutation. For this reason,
When a mutation is detected, it is necessary to analyze it by direct sequencing to identify the position of the mutation.
【0030】本発明におけるハイブリダイゼーション解
析とは、増幅によって得られたDNA断片と種々の変異
を有するオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、
ハイブリダイゼーションの有無より変異部位の同定を行
う方法である。具体的には、本発明の配列番号1および
2にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドをプライマー
とした増幅により得られたDNA断片を、種々の変異を
含むオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさ
せ、そのハイブリダイゼーションの有無より変異の同定
を行う方法である。この方法によって、迅速に変異位置
が同定され得る。しかし、全ての変異に対して解析する
ことは困難であることが予想される。よって、ハイブリ
ダイゼーション解析は、いくつかの主要なタイプの選別
などに使用すべきである。Hybridization analysis in the present invention means to hybridize a DNA fragment obtained by amplification with an oligonucleotide having various mutations,
This is a method of identifying a mutation site based on the presence or absence of hybridization. Specifically, the DNA fragments obtained by amplification using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 of the present invention as primers are hybridized with oligonucleotide probes containing various mutations, and the presence or absence of hybridization thereof is detected. This is a method for identifying mutations more. By this method, the mutation position can be rapidly identified. However, it is expected that it will be difficult to analyze all mutations. Therefore, hybridization analysis should be used, such as for some major types of selection.
【0031】以上の方法を単独または組み合わせて用い
ることにより、従来直接法では4〜8週、間接法では8
〜16週もの時間を要していたリファンピシン耐性試験
が、約2日以内に実施可能になる。By using the above methods alone or in combination, the conventional direct method takes 4 to 8 weeks and the indirect method gives 8 weeks.
The rifampicin resistance test, which took ~ 16 weeks, can be performed within about 2 days.
【0032】[0032]
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。The effects of the present invention will be further clarified by exemplifying embodiments of the present invention.
【0033】(実施例1) (1)オリゴヌクレオチドの合成 結核菌RNAポリメラーゼβサブユニット増幅用オリゴ
ヌクレオチドの合成は、ABI社DNAシンセサイザー
392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号
1および2にそれぞれ示される配列を有するオリゴヌク
レオチドを合成することにより行った。手法はABI社
マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で55℃にて一夜実施した。精製はHPL
C(ベックマン製)を用い、精製逆相クロマトカラム
(ナカライテスク製)にて実施した。Example 1 (1) Synthesis of Oligonucleotides The oligonucleotides for amplifying Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit were synthesized by a phosphoamidite method using a DNA synthesizer type 392 manufactured by ABI, and SEQ ID NO: 1 and It was carried out by synthesizing oligonucleotides having the sequences shown in 2 respectively. The procedure was according to the manual of ABI, and various oligonucleotides were deprotected with ammonia water at 55 ° C. overnight. HPL for purification
Using C (manufactured by Beckman), a reversed phase chromatography column (manufactured by Nakarai Tesque) was used.
【0034】(2)試料の調製 以下に示す細菌より分離されたDNAをPCRの試料と
して使用した。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養
後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによ
って菌種がすでに同定されているものである。マイコバ
クテリウム属細菌は、小川培地上のコロニー(一白金
耳)を、Kekkaku;67巻795頁1992年記載の方
法に従ってDNAの調製を行い、PCR反応液中、最終
濃度約1ng/μlになるように使用した。これら抽出さ
れたDNAは、それぞれrRNAをコードする遺伝子を
増幅ターゲットとしたPCRの定性試験によりその増幅
を確認することにより、DNAの質のチェックを実施し
た。その他の細菌については、それぞれのDNA抽出・
精製の常法に従って調製したものを、PCR反応液中、
最終約1ng/μlになるように使用した。これらも他の
領域をターゲットとしたPCRにより、DNAの質の確
認を行った。(2) Preparation of sample DNA isolated from the bacteria shown below was used as a sample for PCR. All of the bacteria are clinical isolates, and after cultivation, the bacterial species have already been identified by the shape of colonies and various conventional biochemical tests. For the bacterium of the genus Mycobacterium, a colony (one platinum loop) on an Ogawa medium is prepared according to the method described in Kekkaku; Vol. 67, p. 795, 1992, and the final concentration is about 1 ng / μl in the PCR reaction solution. Used as. The quality of the extracted DNA was checked by confirming its amplification by a qualitative PCR test using a gene encoding rRNA as an amplification target. For other bacteria, extract each DNA
What was prepared according to a conventional purification method was used in a PCR reaction solution,
The final volume was about 1 ng / μl. These also confirmed the quality of DNA by PCR targeting other regions.
【0035】 1.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 2.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 3.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 4.ヒト型結核菌(Mycobacterium tubercu1osis) 5.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 6.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 7.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 8.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 9.ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 10.ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis) 11.マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium
kansasii) 12.マイコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium ma
rinum) 13.マイコバクテリウム・シミアエ(Mycobacterium si
miae) 14.マイコバクテリウム・ゴードナエ(Mycobacterium
gordonae) 15.マイコバクテリウム・スルガイ(Mycobacterium sz
ulgai) 16.マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium av
ium) 17.マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobac
terium intracellulare) 18.マイコバクテリウム・ガストリー(Mycobacterium
gastri) 19.マイコバクテリウム・ノンクロモゲニク(Mycobacte
rium nonchromogenicu) 20.マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobact
erium fortuitum) 21.マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacteriu
m smegmatis) 22.マイコバクテリウム・セロネイ(Mycobacterium ch
elonei) 23.黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) 24.大腸菌(Escherichia coli)。1. Mycobacterium tuberculosis 1. Mycobacterium tuberculosis 3. 3. Mycobacterium tuberculosis 4. 4. Mycobacterium tubercu1osis 5. Mycobacterium tuberculosis 6. 7. Mycobacterium tuberculosis 7. 7. Mycobacterium tuberculosis 8. Mycobacterium tuberculosis 9. Mycobacterium tuberculosis 10. Mycobacterium bovis 11. Mycobacterium kansashii
kansasii) 12. Mycobacterium malynum
rinum) 13. Mycobacterium siemia
miae) 14. Mycobacterium godonae
gordonae) 15. Mycobacterium sz
ulgai) 16. Mycobacterium avium
ium) 17. Mycobacterium intracellulare
terium intracellulare) 18. Mycobacterium Gustry
gastri) 19. Mycobacterium non-chromogenic
rium nonchromogenicu) 20. Mycobactidium fortuitum
erium fortuitum) 21. Mycobacteriu
m smegmatis) 22. Mycobacterium cheronei
elonei) 23. Staphylococcus aureus 24. Escherichia coli.
【0036】(3)PCR 配列番号1および2に示されるオリゴヌクレオチドを、
それぞれPCRの上流プライマーおよび下流プライマー
として用いた。反応液組成は、プライマー各0.1μM、0.
15mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTPおよびTaq DNAポリメラ
ーゼ(AmpliTaq:ロシュ製)40単位/ml、および1倍
濃度の添付バッファー(ロシュ製)である。実際の使用
にあたっては、2倍濃度の反応組成液25μlを調製
し、等量のサンプルDNA溶液を添加し50μlとし
て、以下の反応に供した。(3) PCR The oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 were
They were used as upstream and downstream primers for PCR, respectively. The composition of the reaction solution is 0.1 μM for each primer and 0.
15 mM of dATP, dCTP, dGTP, dTTP and Taq DNA polymerase (AmpliTaq: manufactured by Roche) 40 units / ml, and a 1-fold concentration attached buffer (manufactured by Roche). In actual use, 25 μl of the reaction composition solution having a double concentration was prepared, and an equal amount of the sample DNA solution was added to make 50 μl, which was then used in the following reaction.
【0037】反応条件は以下の通りである: 熱変性: 94℃、20秒 アニーリング: 65℃、20秒 伸長反応: 72℃、45秒 上記に示されるサイクルを40回行った。これらの操作
はパーキン−エルマー/シータス(Perkin-Elmer/Cetu
s)社のDNAサーマルサイクラー(GeneAmp9600R)を
用いて行った。The reaction conditions are as follows: Heat denaturation: 94 ° C., 20 seconds Annealing: 65 ° C., 20 seconds Extension reaction: 72 ° C., 45 seconds The above cycle was repeated 40 times. These operations are Perkin-Elmer / Cetu
s) DNA thermal cycler (GeneAmp9600R).
【0038】(4)検出 10μlの反応液を2%アガロースゲルにて電気泳動
し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下で
の蛍光をポラロイドフィルムにて検出した。泳動の条件
は、定電圧100V、30分にて行った。操作方法並び
に他の条件はManiatisらのMolecular Cloning(1982
年)に記載の方法に従った。反応液の他に分子量マーカ
ーも同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出され
たDNA断片の長さを算出した。(4) Detection 10 μl of the reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide, and then fluorescence under UV irradiation was detected with a polaroid film. The electrophoresis conditions were a constant voltage of 100 V and 30 minutes. The procedure and other conditions are described in Maniatis et al. Molecular Cloning (1982
Year). In addition to the reaction solution, a molecular weight marker was also electrophoresed at the same time, and the length of the detected DNA fragment was calculated by comparing the relative mobilities.
【0039】(5)結果 アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色
した後、紫外線照射下での蛍光をポラドイドフィルムに
て検出し、約258塩基対のバンドを確認した。その結
果、以下の表1に示すように、ヒト型結核菌9株全部お
よびウシ型結核菌に目的バンドが確認された。しかし、
他のマイコバクテリウム属細菌、黄色ブドウ球菌、およ
び大腸菌には目的バンドは確認できなかった。(5) Results After agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, fluorescence under UV irradiation was detected with a poradoid film, and a band of about 258 base pairs was confirmed. As a result, as shown in Table 1 below, target bands were confirmed in all 9 strains of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis. But,
No target band was confirmed in other Mycobacterium, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli.
【0040】[0040]
【表1】 [Table 1]
【0041】以上のことから、本発明によるオリゴヌク
レオチドをPCRに用いることにより、ヒト型およびウ
シ型結核菌のRNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子
断片を特異的に増幅できることが分かった。このことよ
り、結核菌群以外のマイコバクテリウム属細菌および黄
色ブドウ球菌、大腸菌などの含まれる臨床検体(喀痰、
胸水、肺洗浄液など)より、結核菌のRNAポリメラー
ゼβサブユニット遺伝子断片のみを特異的に増幅するこ
とが可能となることが分かった。From the above, it was found that by using the oligonucleotide according to the present invention for PCR, the RNA polymerase β subunit gene fragment of human type and Mycobacterium bovis can be specifically amplified. From this, clinical specimens (sputum, sputum, etc.) containing Mycobacterium bacteria other than the Mycobacterium tuberculosis group and Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc.
Pleural effusion, lung lavage fluid, etc.) was found to be capable of specifically amplifying only the RNA polymerase β subunit gene fragment of Mycobacterium tuberculosis.
【0042】(実施例2) (1)臨床喀痰からのDNAの抽出 以下に示す臨床喀痰1mlを遠心チューブに取り、等量の
NALC−NaOH(0.05Mクエン酸三ナトリウム、2
%水酸化ナトリウム、0.5%N-アセチル-L-システイン)
を添加し攪拌後、室温にて15分間放置した。その処理済
み検体溶液に、0.067Mのリン酸緩衝液48mlを添加・混
和し、3,500gで室温にて15分間遠心分離を行った。遠
心後、上清をデカンテーションにて除き、得られた沈澱
を1mlの上記リン酸緩衝液に懸濁し、前処理液とした。
DNAの抽出はSputum specimen preparation kit(ロ
シュ製)を用い、添付の説明書に従って前処理液100μl
より抽出を行った。このキッ卜を用いた抽出液にはまだ
かなり不純物が含まれていることが予想されたため、フ
ェノール・クロロフォルム処理およびエタノール沈澱を
行い、さらに精製されたDNAを以下の増幅に用いた: 1.喀痰1 低濃度感染例 2.喀痰2 低濃度感染例 3.喀痰3 高濃度感染例。Example 2 (1) Extraction of DNA from clinical sputum 1 ml of the clinical sputum shown below was placed in a centrifuge tube, and an equal amount of NALC-NaOH (0.05 M trisodium citrate, 2
% Sodium hydroxide, 0.5% N-acetyl-L-cysteine)
Was added, and the mixture was stirred and then left at room temperature for 15 minutes. To the treated sample solution, 48 ml of 0.067 M phosphate buffer was added and mixed, and the mixture was centrifuged at 3,500 g for 15 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed by decantation, and the obtained precipitate was suspended in 1 ml of the above phosphate buffer solution to give a pretreatment solution.
For DNA extraction, use the Sputum specimen preparation kit (Roche) and follow the attached instructions to prepare 100 μl of pretreatment solution.
More extraction was performed. It was expected that the extract using this kit would still contain significant impurities, so phenol-chloroform treatment and ethanol precipitation were performed and the further purified DNA was used for the following amplification: Sputum 1 Low-concentration cases 2. Sputum 2 Low-concentration cases 3. Sputum 3 high-concentration cases.
【0043】(2)PCR 実施例1の(3)と同一の条件で実施した。また同時
に、ヒト型結核菌(野生株)より抽出したDNAおよび
蒸留水についても同様の増幅を行い、コントロールとし
た。(2) PCR The PCR was carried out under the same conditions as (3) of Example 1. At the same time, DNA and distilled water extracted from Mycobacterium tuberculosis (wild strain) were similarly amplified and used as a control.
【0044】(3)検出 実施例1の(4)と同一の条件で実施した。(3) Detection It was carried out under the same conditions as (4) of Example 1.
【0045】(4)結果 PCR終了後、アガロースゲル電気泳動し、エチジウム
ブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光をポラロ
イドフィルムに検出した。その結果、今回検討した全て
の検体に約258塩基対の単一バンドが検出された(図
1)。このことより、本発明のプライマーを用いて臨床
検体からRNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子を増
幅できることが分かった。喀痰1および2は、rRNA
をターゲットとしたPCR定性試験から検出限界に近い
検体であることが判明している試料である。よって、本
発明のプライマーを用いた増幅によって、臨床検体中に
低濃度で存在する場合でも、結核菌のRNAポリメラー
ゼβサブユニット遺伝子を臨床検体中から増幅できるこ
とが証明された。(4) Results After completion of PCR, agarose gel electrophoresis was performed, and after staining with ethidium bromide, fluorescence under UV irradiation was detected on a polaroid film. As a result, a single band of about 258 base pairs was detected in all the samples examined this time (Fig. 1). From this, it was found that the RNA polymerase β subunit gene can be amplified from a clinical sample using the primer of the present invention. Sputum 1 and 2 are rRNA
It is a sample that has been proved to be a sample close to the detection limit by a PCR qualitative test targeting at. Therefore, it was proved that the amplification using the primer of the present invention can amplify the RNA polymerase β subunit gene of Mycobacterium tuberculosis from a clinical sample even when it is present at a low concentration in the clinical sample.
【0046】(実施例3) (1)増幅DNAの精製 実施例2において以下に示す試料より得られたPCR増
幅溶液40μlに、等量の7.5M酢酸アンモニウム、倍量
のイソプロパノールを添加し、室温にて10分間放置し
た後に、12,000r.p.mで室温にて15分間遠心分離し
た。上清をデカンテーションにて除いた後、70%冷エ
タノール溶液1mlを加え、混和した後、再び12,000r.p.
mにて5分間遠心し、上清を除き、沈澱を20μlの蒸留
水に溶解した: 1.ヒト型結核菌(野生株) 2.喀痰1 3.喀痰2 4.喀痰3。Example 3 (1) Purification of Amplified DNA To 40 μl of the PCR amplification solution obtained from the sample shown below in Example 2, an equal amount of 7.5M ammonium acetate and an equal amount of isopropanol were added, and the mixture was cooled to room temperature. After standing for 10 minutes at 12,000 rpm, it was centrifuged at room temperature for 15 minutes at room temperature. After removing the supernatant by decantation, 1 ml of 70% cold ethanol solution was added and mixed, and then 12,000 rp was added again.
Centrifuge at m for 5 minutes, remove the supernatant and dissolve the precipitate in 20 μl of distilled water: Mycobacterium tuberculosis (wild strain) 2. Sputum 1 3. Sputum 2 4. Sputum 3.
【0047】(2)シークエンス反応・電気泳動 (1)において精製したDNA断片のシークエンス解析
は、ビオチン化ダイデオキシヌクレオチドおよび耐熱性
ポリメラーゼを用いた非RIサイクルシークエンシング
キットSequencing high-Plus-(東洋紡製)を用いて実
施した。シークエンスプライマーは配列番号1のオリゴ
ヌクレオチドを用い、反応液中0.2pmol/μlとなるよう
に調製した。また、他の反応組成(デオキシヌクレオチ
ド、△TthDNAポリメラーゼ、反応緩衝液)の濃度はキッ
トの添付書に従った。反応組成液13μlに(1)にて調
製したDNA溶液を4μlを加え攪拌後、4本のマイク
ロチューブに4μlづつ分注し、それぞれキット添付の
4種のビオチン化ダイデオキシヌクレオチド(G、A、
T、およびC)を2μlづつ添加し、以下に示す反応条
件にてシークエンス反応を実施した。添付の反応停止液
を加えて反応を停止した後、80℃で2分間熱変性し、
それぞれ3μlを30×40cmのゲル板にて作成した5
0%尿素を含む6%アクリルアミドゲルに供し、40W
・1.5時間電気泳動を行った。(2) Sequencing reaction / electrophoresis Sequence analysis of the DNA fragment purified in (1) was carried out by non-RI cycle sequencing kit Sequencing high-Plus- (manufactured by Toyobo) using biotinylated dideoxynucleotide and thermostable polymerase. ) Was used. As the sequence primer, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 was used, and it was prepared to be 0.2 pmol / μl in the reaction solution. In addition, the concentrations of other reaction compositions (deoxynucleotide, ΔTth DNA polymerase, reaction buffer) were in accordance with the kit attachment. 4 μl of the DNA solution prepared in (1) was added to 13 μl of the reaction composition solution, and after stirring, 4 μl of each was dispensed into 4 microtubes, and each of the 4 biotinylated dideoxynucleotides (G, A,
2 μl of each of T and C) was added, and a sequence reaction was carried out under the reaction conditions shown below. After stopping the reaction by adding the attached reaction stop solution, heat denaturation at 80 ° C for 2 minutes,
3 μl of each was prepared on a 30 × 40 cm gel plate 5
Apply to 6% acrylamide gel containing 0% urea, 40W
-Electrophoresis was performed for 1.5 hours.
【0048】反応条件は以下の通りである: i) 熱変性 :95℃、30秒 アニーリング・伸長反応:60℃、120秒 ii) 熱変性 :95℃、30秒 アニーリング :60℃、30秒 伸長反応 :72℃、120秒 ここで、i)のサイクルを15回、ii)のサイクルを1
5回(トータル30回)行った。The reaction conditions are as follows: i) heat denaturation: 95 ° C., 30 seconds annealing / extension reaction: 60 ° C., 120 seconds ii) heat denaturation: 95 ° C., 30 seconds annealing: 60 ° C., 30 seconds extension Reaction: 72 ° C., 120 seconds, where i) is cycled 15 times and ii) is cycled 1 time.
It was performed 5 times (30 times in total).
【0049】(3)検出 シークエンスの検出は上記シークエンスキットの添付試
薬を用いて行った。以下にその方法を示す。泳動終了
後、一方のゲル板を剥し取り、プロトコールに従ってゲ
ル中のDNAをキット添付のナイロン膜に転写した。そ
の後、膜上に転写されたビオチン標識されたDNAを、
ストレプトアビジン試薬およびビオチン化アルカリフォ
スファターゼ試薬と反応させた。膜を洗浄バッファーに
て洗浄した後に、発光基質PPDと反応させ、アルカリ
フォスファターゼの活性を利用した化学発光により、泳
動分離されたビオチン化ダイデオキシヌクレオチドを取
り込んだDNAバンドの位置をX線フィルム上に検出し
た。その後、X線フィルム上のラダー状のバンドを解読
し、それぞれの遺伝子配列を比較した(図2)。(3) Detection Detection of the sequence was carried out using the reagents attached to the above sequence kit. The method is shown below. After the electrophoresis was completed, one of the gel plates was peeled off, and the DNA in the gel was transferred to the nylon membrane attached to the kit according to the protocol. Then, the biotin-labeled DNA transferred onto the membrane was
Reacted with streptavidin reagent and biotinylated alkaline phosphatase reagent. After washing the membrane with a washing buffer, it is reacted with a luminescent substrate PPD, and the chemiluminescence utilizing the activity of alkaline phosphatase causes the position of the DNA band incorporating the biotinylated dideoxynucleotide separated by electrophoresis to be located on the X-ray film. Detected. After that, the ladder-like band on the X-ray film was read, and the gene sequences of each were compared (FIG. 2).
【0050】(4)結果 X線フィルム上のバンドを解読した結果、喀痰2の症例
のリファンピシン耐性獲得に関与する領域に野生株の配
列には見られない一塩基置換(C→T)が確認された。
この突然変異により、RNAポリメラーゼβサブユニッ
トのアミノ酸番号531のセリンはロイシンヘ変異して
いることが予想された。このタイプの変異は既に報告
(Lancet;341巻647頁1993年)されており、
この患者に感染している結核菌はリファンピシンに対し
耐性を示すことが推測された。(4) Results As a result of decoding the band on the X-ray film, a single nucleotide substitution (C → T) not found in the sequence of the wild strain was confirmed in the region involved in the acquisition of rifampicin resistance in the case of sputum 2. Was done.
Due to this mutation, serine at amino acid number 531 of the RNA polymerase β subunit was predicted to be mutated to leucine. This type of mutation has already been reported (Lancet; 341: 647, 1993).
It was speculated that the Mycobacterium tuberculosis infecting this patient is resistant to rifampicin.
【0051】また、実際にこの喀痰より分離された分離
株を用い、リファンピシンに対する最小発育阻止濃度を
測定したところ128〜256ng/mlという値を示
し、明らかに耐性株であることが確認された。When the minimum inhibitory concentration against rifampicin was measured using the isolate actually isolated from the sputum, the value was 128 to 256 ng / ml, and it was confirmed that the strain was obviously resistant.
【0052】このことより、臨床検体中に存在する結核
菌のリファンピシン耐性に関与する遺伝子変異を迅速か
つ高感度で解析できることが証明された。From this, it was proved that the gene mutation involved in the rifampicin resistance of Mycobacterium tuberculosis existing in the clinical specimen can be analyzed rapidly and with high sensitivity.
【0053】[0053]
【発明の効果】本発明により、臨床検体から簡便、迅
速、かつ特異的に結核菌のRNAポリメラーゼβサブユ
ニット遺伝子断片を増幅し得る。このDNA断片は結核
菌のリファンピシン耐性獲得に関与する領域を含んでお
り、この増幅DNA中の変異を解析することで菌のリフ
ァンピシンに対する耐性の有無を推定し得る。本発明の
配列またはその相補配列の一部または全部を有するオリ
ゴヌクレオチドは、DNA増幅反応およびシークエンス
反応のプライマーとして用い得る。この発明により、従
来、数週間もかかった培養による薬剤感受性試験に比べ
て時間を大幅に短縮することができ、簡便でかつ再現性
のある確実な結果が得られる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the RNA polymerase β subunit gene fragment of Mycobacterium tuberculosis can be amplified easily, rapidly and specifically from a clinical sample. This DNA fragment contains a region involved in the acquisition of resistance to rifampicin of Mycobacterium tuberculosis, and the presence or absence of resistance to rifampicin of the bacterium can be estimated by analyzing the mutation in this amplified DNA. An oligonucleotide having a part or all of the sequence of the present invention or its complementary sequence can be used as a primer for a DNA amplification reaction and a sequencing reaction. According to the present invention, the time can be greatly shortened as compared with the conventional drug susceptibility test by culturing, which takes several weeks, and simple and reproducible and reliable results can be obtained.
【0054】[0054]
【0055】[0055]
【配列番号:1】 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosi
s)RNAポリメラーゼ遺伝子の配列と相補的な配列を
有する。[SEQ ID NO: 1] Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Determine features Method: S Other characteristics: Mycobacterium tuberculosi
s) It has a sequence complementary to the sequence of RNA polymerase gene.
【0056】 配列 GAGGCGATCA CACCGCAGAC GT 22Sequence GAGGCGATCA CACCGCAGAC GT 22
【0057】[0057]
【配列番号:2】 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:両形態 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置:1..22 特徴を決定した方法:S 他の特徴:ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosi
s)RNAポリメラーゼ遺伝子の配列と相補的な配列を
有する。[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 22 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Both forms Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features Location: 1..22 Determine features Method: S Other characteristics: Mycobacterium tuberculosi
s) It has a sequence complementary to the sequence of RNA polymerase gene.
【0058】 配列 GATGTTGGGC CCCTCAGGGG TT 22Sequence GATGTTGGGC CCCTCAGGGG TT 22
【図1】実施例2の結果を示すアガロースゲル電気泳動
写真である。FIG. 1 is an agarose gel electrophoresis photograph showing the results of Example 2.
【図2】ヒト型結核菌(野生株)と実施例3の各試料と
の遺伝子配列の比較を示す図である。FIG. 2 shows comparison of gene sequences of Mycobacterium tuberculosis (wild strain) and each sample of Example 3.
Claims (5)
もしくは該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも
連続した15残基よりなる核酸配列を含有する、結核菌
(Mycobacterium Tuberculosis)RNAポリメラーゼβ
サブユニット遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド。1. A Mycobacterium Tuberculosis RNA polymerase β containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 contiguous residues of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or a nucleic acid sequence complementary to said sequence.
Oligonucleotide for subunit gene amplification.
修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載
の結核菌RNAポリメラーゼβサブユニット遺伝子増幅
用オリゴヌクレオチド。2. The oligonucleotide for amplifying Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit gene according to claim 1, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide modified with a modified product.
物質、発光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンである、請
求項2に記載の結核菌RNAポリメラーゼβサブユニッ
ト遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド。3. The oligonucleotide for amplifying Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit gene according to claim 2, wherein the modified product is a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin, and digoxigenin.
オチドを用いる結核菌RNAポリメラーゼβサブユニッ
ト遺伝子を増幅する方法。4. A method for amplifying a Mycobacterium tuberculosis RNA polymerase β subunit gene using the oligonucleotide according to claim 1 or 2.
のオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、得られたDNA
断片を試料として該DNA中の塩基置換の有無を解析す
る方法。5. A DNA obtained by amplifying a nucleic acid in a sample using the oligonucleotide according to claim 1 or 2.
A method of analyzing the presence or absence of base substitution in the DNA using a fragment as a sample.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7264468A JPH09103300A (en) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rna |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7264468A JPH09103300A (en) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rna |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09103300A true JPH09103300A (en) | 1997-04-22 |
Family
ID=17403646
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7264468A Pending JPH09103300A (en) | 1995-10-12 | 1995-10-12 | Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rna |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH09103300A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003512084A (en) * | 1999-10-27 | 2003-04-02 | ゼニス ライフ サイエンス カンパニー リミテッド | Methods for diagnosis and identification of gene fragments and tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria species |
KR100446850B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-09-04 | 이혜영 | A method for identifying Micobacteria tuberculosis and non-tuberculosis Micobacteria, together with detecting resistance to an antituberculsis drug of Micobacteria obtained by mutation of rpoB gene |
-
1995
- 1995-10-12 JP JP7264468A patent/JPH09103300A/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003512084A (en) * | 1999-10-27 | 2003-04-02 | ゼニス ライフ サイエンス カンパニー リミテッド | Methods for diagnosis and identification of gene fragments and tuberculosis and non-tuberculous mycobacteria species |
KR100446850B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-09-04 | 이혜영 | A method for identifying Micobacteria tuberculosis and non-tuberculosis Micobacteria, together with detecting resistance to an antituberculsis drug of Micobacteria obtained by mutation of rpoB gene |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2007125032A (en) | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistant genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories | |
JP2540023B2 (en) | Detection and identification of mycobacteria | |
US20130065232A1 (en) | Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
US10669591B2 (en) | Selective detection of Haemophilus influenzae | |
Dilworth et al. | Comparison of polymerase chain reaction for IS6110 and Amplicor in the diagnosis of tuberculosis. | |
KR101425149B1 (en) | Improved method for diagnosing Mycobacterium tuberculosis using one-tube nested real-time PCR | |
US20060088833A1 (en) | Detection of mycobacteria in clinical material | |
JPH09103300A (en) | Oligonucleotide for amplifying beta-subunit gene in polymerase for bacillus tuberculosis rna | |
AU2004221678B2 (en) | Method and kit for a specific detection of M.tuberculosis | |
WO2013132443A1 (en) | Real-time pcr detection of mycobacterium tuberculosis complex | |
JPH07155200A (en) | Oligonucleotide for detecting bacterium belonging to genus of mycobacterium and identifying species | |
JP2902054B2 (en) | Methods for detecting Mycobacterium tuberculosis | |
JPH06133775A (en) | Dna coding dnaj protein of microorganism of genus mycobacterium, probe for specifically recognizing the dna and detection of microorganism of genus mycobacterium | |
WO2024053642A1 (en) | Method for detecting fusobacterium nucleatum and method for detecting fusobacterium nucleatum nucleatum | |
US7074568B2 (en) | Molecular diagnosis of atypical mycobacterial infections | |
JP2006158220A (en) | Oligonucleotide primer for detecting mycoplasma pneumoniae | |
Xu et al. | The increasing role of DNA molecular technologies in infection control-related medical bacteriology: what the infection prevention specialist needs to know | |
WILLIAMS | 13 PCR and Diagnosis of Tuberculosis | |
JP2007075018A (en) | Method for detecting campylobacter coli | |
Class et al. | Patent application title: ASSAYS AND KITS FOR SEROTYPING PSEUDOMONAS AERUGINOSA AND OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES USEFUL IN SUCH METHODS AND KITS Inventors: Thomas Emrich (Iffeldorf, DE) Thomas Emrich (Iffeldorf, DE) Michael Rudolf (Ittigen, CH) Holger Koch (Zurich, CH) Assignees: Kenta Biotech AG | |
JP2004033090A (en) | Method for detecting vibrio vulnificus | |
Williams | PCR and Diagnosis of Tuberculosis | |
JP2004057058A (en) | Method for detecting prevotella intermedia | |
JP2004057007A (en) | Method for detecting campylobacter rectus | |
JP2004057057A (en) | Method for detecting prevotella nigrescens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050411 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050805 |