【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビブリオ・バルニフィカスの新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子および該遺伝子を特異的に増幅するための試薬および該増幅方法ならびにビブリオ・バルニフィカスの検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）は腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）やコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）などと同じビブリオ科に属する病原細菌で、近年人食い細菌として注目されている。特に、免疫力の低下している患者、肝臓病や糖尿病の患者、治療のために鉄剤の投与を受けている貧血患者などがビブリオ・バルニフィカスに感染した場合は治療が遅れると感染が全身に広がり極めて死亡率が高く、早期診断および早期治療が極めて重要であることから該細菌の迅速な検出方法が望まれている。
【０００３】
ビブリオ・バルニフィカスを検出および同定する方法としては、市販の細菌同定キットを利用する手段が知られている。該キットは複数の生化学試験の結果から得られるプロファイルより細菌を同定する方法であり、結果の判明までに数日を要する。そこで現在、ビブリオ・バルニフィカスの遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて増幅する方法が注目されている。
【０００４】
しかしビブリオ科に属する細菌の種類が多い、すなわちビブリオ・バルニフィカスと類似した遺伝子を保有する近縁の細菌が多く存在するため、ＰＣＲ法によりビブリオ・バルニフィカスの遺伝子を特異的に増幅することは困難である。
現在までに報告されているＡｒｉａｓらのＰＣＲ法（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌・６１巻・３４７６−３４７８頁・１９９５年）では、ビブリオ・バルニフィカスの２３Ｓリボソーム遺伝子をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法にて増幅することにより該細菌の特異的な検出に成功している。Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法とはＰＣＲ法による遺伝子の増幅を２回繰り返す、すなわち第１回目のＰＣＲ法で得られた増幅ＤＮＡ断片を鋳型として第２回目のＰＣＲ法による増幅を行う方法であり、２回の増幅に異なるプライマーを用いることにより特異性を向上させることができる。
Ａｒｉａｓらの報告によると、該ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法により２４時間以内にビブリオ・バルニフィカスを検出することが可能となった。しかしビブリオ・バルニフィカスの検出に迅速性および簡便性が要求されていることを考慮すると、１回のＰＣＲ法により該細菌を特異的に増幅することが非常に効果的であると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ビブリオ・バルニフィカスに特異的な遺伝子領域を使用して、試料中の該遺伝子を特異的に増幅し、該細菌を迅速に検出するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するためにビブリオ・バルニフィカスおよび他のビブリオ属細菌の遺伝子に関して種々鋭意検討した結果、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列（１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域）が該菌株に特異的であることを見出し、それを用いた遺伝子増幅法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
ビブリオ・バルニフィカスには複数の１６Ｓリボソーム遺伝子および２３Ｓリボソーム遺伝子が存在するため、該細菌には１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域も複数箇所存在する。本発明者らは、ビブリオ・バルニフィカスには５種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域が存在することを発見した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域。
［２］配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号６または７に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［４］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［５］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号６および７に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［６］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［７］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号６および７に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［８］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［９］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［１０］試料中のビブリオ・バルニフィカスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのビブリオ・バルニフィカス、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系にて３５サイクルの遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域は、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列を解析して得たものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１から５）から選択されたＤＮＡ断片であって、少なくとも連続した１５塩基、好ましくは２０〜３５塩基よりなる核酸配列を含有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な５種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１から５）の間で配列が共通する部分からそれぞれ選択され、配列番号６および７に示される核酸配列（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用されるが、特に、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅用のプライマーとして使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しようとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択される。
また、本発明のオリゴヌクレオチドはシークエンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され得る。さらには、検出用プローブとしても使用可能である。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号６および７に示される塩基配列またはそれらの相補配列の全域を使用する必要はない。配列表の塩基配列およびその相補配列に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反応条件などに合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算することにより決定され得る。しかし、ＰＣＲの場合、プライマーに十分な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した１５塩基、さらに望ましくは、２０塩基の長さが必要である。プライマーが短いと、それに応じてアニール温度を下げることになるので特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。逆にプライマーが長すぎるとプライマー同士の非特異的な反応によりターゲットの増幅量が落ち、さらに余計なアニーリングにより特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。したがって、２５〜３０塩基程度が増幅量の面で有利だと考えられる。
【００１２】
プライマーが十分な特異性を有するためには、３’末端の塩基は配列表の核酸配列に示される３’末端の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置換を行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を及ぼさない程度に、１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の塩基配列に従って、プライマーの５’末端側をさらに延長して使用してもよい。
本発明では、上記少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを増幅用プライマーとして使用し、一方のプライマーの伸長生成物は、その相補体から分離された場合、他方のプライマーの鋳型となるように配列を選択する必要がある。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、生物の細胞内で行われる核酸合成反応を利用した方法またはデオキシリボヌクレオチドを化学的に反応させる方法などにより製造することが出来る。
【００１４】
本発明のＤＮＡ増幅方法に用いるプライマーとしては、配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有する、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域、好ましくは配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、あるいは、さらに好ましくは配列番号６または７に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチドなど、上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ法が用いられる。
【００１５】
本発明のＤＮＡ増幅方法において、上述したように、各種試料に存在するビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から、１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するには、配列番号６および７にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いられ得る。そして、配列番号６および７にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増幅されたＤＮＡを、さらに配列番号６および７にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することによって、より高感度の増幅が可能となることが予想される。このとき使用する外側のプライマーは、該１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に特異的であることが望ましいが、特異性の低いプライマーも使用し得る。
【００１６】
ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からの１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅において、配列番号６および７にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることが必要である。このことは、増幅反応における特異性には、使用する２つのオリゴヌクレオチドの相乗効果が重要であることによる。また、さらに特異性を高めるためには、増幅に使用するプライマーの濃度をできるだけ低く抑えることも重要である。
【００１７】
本発明のビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅用試薬は、具体的には、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマーを含むか、より好ましくは少なくとも２種のプライマーが、配列番号６および７に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等を含む。
【００１８】
本発明の増幅用試薬において、上記プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量を含む。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。
【００１９】
さらに、本発明の試薬には、ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を単離するための工程に適した緩衝液および当該ＤＮＡ断片を増幅するに適した緩衝液を併せて含めてもよい。さらに増幅したＤＮＡ断片を検出するための試薬も、検出法に併せて各種組み合わせておくこともできる。
【００２０】
本発明の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に必要なマグネシウム塩を併せて含むことができ、好ましくは０．５ｍＭ〜４ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの濃度範囲で添加できる。また、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に好ましい条件として、増幅反応中のｐＨを６．５〜９．０好ましくは７．０〜８．０に設定することが好ましい。
【００２１】
本発明において、増幅する遺伝子は、食品や海水など、あらゆる材料または環境中に存在する細菌由来の遺伝子であるが、単離培養された菌体の遺伝子を増幅することも含まれる。また、本発明における試料には、上記の各種材料や培養菌体の他、これらより単離および精製された核酸なども含まれる。
すなわち、本発明における試料としては、上記の各種材料を直接、用いる場合の他に、上記の各種材料の培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から単離された寒天培地上の菌体またはその培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸なども試料として用いられ得る。
【００２２】
本発明の細菌検出方法は、上記ＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。或いは、上記ＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。
【００２３】
本発明の細菌検出方法は、試料中のビブリオ・バルニフィカスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのビブリオ・バルニフィカスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片を得ることができる。
このとき、測定系中にはさらに、プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことができるが、反応阻害物を含ませることは好ましくない。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。最適な組合せの１つとしては、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系が挙げられる。
ビブリオ・バルニフィカスのＣＦＵは、該菌を生育に最適な条件で平板培養した場合に生じる該菌のコロニー数により定義される。
遺伝子増幅反応サイクルは、３５サイクルが増幅ＤＮＡ断片の収量の点で好ましいが、該増幅ＤＮＡ断片を検出し得る条件であれば特に制限はない。
【実施例】
以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。
【００２４】
実施例１
（１）オリゴヌクレオチドの合成
ビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１から５のいずれかに示される核酸配列から選択し、その配列は、配列番号６および７にそれぞれ示される。プライマー１：配列番号６のうち、１〜２８番目、プライマー２：配列番号７のうち、１〜２８番目
該オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成することにより得た。手法はＡＢＩ社のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃にて一夜実施した。精製はＨＰＬＣ（ベックマン製）を用い、逆相クロマトカラム（ナカライテスク製）にて実施した。
【００２５】
（２）試料の調製
ビブリオ科に属する細菌７株の菌体コロニーをそれぞれ直接、ＰＣＲの試料として使用した（表１参照）。寒天培地上の菌体コロニー１００，０００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を水１００μｌに懸濁し、そのうちの１μｌをＰＣＲに使用した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
（３）ＰＣＲ
配列番号６および７に示されるオリゴヌクレオチド（プライマー１および２）を、それぞれＰＣＲのプライマーとして用いた。反応液組成は、プライマー１および２をそれぞれ０．２μＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｄａｓｈ：東洋紡製）２５単位／ｍｌ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡製）である。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液（菌体コロニー懸濁液）１μｌを添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
熱変性： ９４℃、２０秒
アニーリング： ６０℃、５秒
伸長反応： ７４℃、３０秒
上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて行った。
【００２８】
（４）検出
増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
【００２９】
（５）結果
増幅ＤＮＡ断片の検出に用いたアガロースゲル電気泳動を図１に示す。
図１から明らかなように、上記増幅方法により、ビブリオ・バルニフィカス（レーン５〜７）についてのみ増幅ＤＮＡ断片が得られた。一般に、電気泳動でのエチジウムブロマイド染色による検出限界は１０ｎｇよりやや少なめであると言われていることから、増幅ＤＮＡ断片は１０ｎｇ以上あると推定される。すなわち、本発明の方法により、迅速かつ簡便なビブリオ・バルニフィカスの検出が可能であることを示している。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、あらゆる材料または環境中から簡便、迅速、かつ特異的にビブリオ・バルニフィカスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子を増幅し、該細菌を迅速に検出することができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ビブリオ科に属する細菌の菌体コロニー中の遺伝子から、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅したＤＮＡ断片を示す図面に代わる電気泳動写真である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel 16S-23S intergenic spacer region gene of Vibrio vulnificus, a reagent for specifically amplifying the gene, an amplification method thereof, and a method for detecting Vibrio vulnificus.
[0002]
[Prior art]
Vibrio vulnificus (Vibrio vulnificus) is a pathogenic bacterium belonging to the same Vibrio family as Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae, and has recently been attracting attention as a human-eating bacterium. In particular, patients with weakened immunity, patients with liver disease or diabetes, and anemia patients who are receiving iron preparations for treatment become infected with Vibrio vulnificus. Because of the extremely high mortality rate and the importance of early diagnosis and early treatment, a rapid method for detecting the bacterium is desired.
[0003]
As a method for detecting and identifying Vibrio vulnificus, a means using a commercially available bacterial identification kit is known. The kit is a method for identifying bacteria from a profile obtained from the results of a plurality of biochemical tests, and it takes several days to find out the results. Therefore, a method of amplifying the Vibrio vulnificus gene by using a PCR (polymerase chain reaction) method has attracted attention.
[0004]
However, since there are many types of bacteria belonging to the Vibrio family, that is, there are many closely related bacteria having genes similar to Vibrio vulnificus, it is difficult to specifically amplify the Vibrio vulnificus gene by PCR. is there.
In the PCR method of Arias et al. (Applied and Environmental Microbiology, Vol. 61, pp. 3476-3478, 1995) reported to date, the 23S ribosomal gene of Vibrio vulnificus is amplified by a nested PCR method. Successful specific detection of bacteria. The nested PCR method is a method in which amplification of a gene by the PCR method is repeated twice, that is, amplification by the second PCR method is performed using the amplified DNA fragment obtained by the first PCR method as a template. Specificity can be improved by using different primers for amplification.
According to the report of Arias et al., It became possible to detect Vibrio vulnificus within 24 hours by the nested PCR method. However, considering that rapid and simple detection of Vibrio vulnificus is required, specific amplification of the bacterium by a single PCR method is considered to be very effective.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for specifically amplifying the gene in a sample using a gene region specific to Vibrio vulnificus and rapidly detecting the bacterium.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted various studies on the genes of Vibrio vulnificus and other Vibrio spp. Bacteria in order to achieve the above object. As a result, the nucleic acid sequence existing between the 16S and 23S ribosomal genes of Vibrio vulnificus ( 16S-23S intergenic spacer region) was found to be specific to the strain, and a gene amplification method using the same was established, thereby completing the present invention.
[0007]
Since a plurality of 16S ribosomal genes and 23S ribosomal genes are present in Vibrio vulnificus, the bacteria also have a plurality of 16S-23S intergenic spacer regions. The present inventors have found that there are five types of 16S-23S intergenic spacer regions in Vibrio vulnificus.
[0008]
That is, the present invention has the following configuration.
[1] A 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus, having a nucleic acid sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1 to 5 or a nucleic acid sequence complementary to the sequence.
[2] An oligonucleotide comprising a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases of the nucleic acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 5 or a nucleic acid sequence complementary to the sequence.
[3] An oligonucleotide comprising a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases among the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7 or a nucleic acid sequence complementary to the sequence.
[4] A reagent for amplifying one or more DNA fragments from a DNA fragment of a 16S-23S intergenic spacer region of a bacterium, wherein at least two kinds of primers are any of SEQ ID NOS: 1 to 5 An oligonucleotide containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases of the nucleic acid sequence shown or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, wherein the extension product of one of the primers is separated from its complement A DNA amplification reagent comprising: a primer serving as a template for the other primer; a thermostable DNA polymerase; dNTPs; and a buffer.
[5] A reagent for amplifying one or more DNA fragments from a DNA fragment of a 16S-23S intergenic spacer region of a bacterium, wherein at least two kinds of primers are nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 6 and 7. An oligonucleotide containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases of a sequence or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, and when an extension product of one primer is separated from its complement, the other A DNA amplification reagent, comprising: a primer serving as a template of the primer, a thermostable DNA polymerase, dNTPs, and a buffer.
[6] A method for amplifying one or more DNA fragments from a DNA fragment of a 16S-23S intergenic spacer region of a bacterium, wherein at least two kinds of primers are any of SEQ ID NOs: 1 to 5 An oligonucleotide containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases of the nucleic acid sequence shown or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, wherein the extension product of one of the primers is separated from its complement And a DNA amplification method, which serves as a template for the other primer.
[7] A method for amplifying one or more DNA fragments from a DNA fragment of a 16S-23S intergenic spacer region of a bacterium, wherein at least two kinds of primers are nucleic acids represented by SEQ ID NOs: 6 and 7. An oligonucleotide containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases of a sequence or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, and when an extension product of one primer is separated from its complement, the other A DNA amplification method, which is used as a template for a primer.
[8] A method for detecting bacteria, comprising comparing the chain length of one or more amplified DNA fragments obtained by the DNA amplification method according to claim 6 or 7.
[9] A method for detecting bacteria, comprising digesting a DNA fragment obtained by the DNA amplification method according to claim 6 with a restriction enzyme, and comparing the chain length of the DNA fragment.
[10] A method for detecting Vibrio vulnificus in a sample, comprising 1,000 CFU of Vibrio vulnificus, 200 nM of primer, 50 U / ml of thermostable DNA polymerase, 200 μM of dNTP and a buffer, A method for detecting bacteria, wherein at least 10 ng of an amplified DNA fragment is obtained when 35 cycles of a gene amplification reaction are performed in a system containing no reaction inhibitor.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The novel 16S-23S intergenic spacer region of the present invention is obtained by analyzing a nucleic acid sequence existing between the 16S ribosomal gene and 23S ribosomal gene of Vibrio vulnificus.
The oligonucleotide of the present invention is a DNA fragment selected from a novel 16S-23S intergenic spacer region (SEQ ID NOS: 1 to 5), and comprises a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides, preferably 20 to 35 nucleotides. contains.
The oligonucleotides of the present invention are selected from portions having a common sequence among the five novel 16S-23S intergenic spacer regions (SEQ ID NOS: 1 to 5), respectively, and have the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 ( A represents adenine, C represents cytosine, G represents guanine, T represents thymine, and T at any position may be substituted with uracil (U).) Contains the sequence.
[0010]
Although the oligonucleotide of the present invention is used as a primer, it can be particularly used as a primer for gene amplification by a PCR method or the like. In that case, at least two oligonucleotides are used, the two primers define both ends of the nucleic acid sequence to be amplified, and when the extension product of one primer is separated from its complement, the other The base sequence is selected so as to be a template for the primer.
In addition, the oligonucleotide of the present invention can be used as a primer when performing sequence analysis. Furthermore, it can also be used as a detection probe.
[0011]
The oligonucleotide of the present invention does not need to use the entire base sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 or the complementary sequence thereof. An appropriate length sequence derived from the base sequence in the sequence listing and its complementary sequence can be determined by calculating the dissociation temperature (Tm value) or the like according to the PCR reaction conditions and the like. However, in the case of PCR, at least 15 contiguous bases, more preferably 20 bases, are required in order for primers to have sufficient specificity. It is thought that if the primer is short, the annealing temperature will be reduced accordingly, and the specificity tends to decrease. Conversely, if the primers are too long, the amplification of the target will decrease due to non-specific reactions between the primers, and the specificity will tend to decrease due to additional annealing. Therefore, about 25 to 30 bases are considered to be advantageous in terms of the amount of amplification.
[0012]
In order for the primer to have sufficient specificity, it is desirable to use the 3′-terminal base shown in the nucleic acid sequence in the sequence listing as the 3′-terminal base. Depending on the conditions used, the purpose, etc., some substitutions may be made in the oligonucleotide. In addition, the 5′-terminal side of the primer may be further extended according to the base sequence of the 16S-23S intergenic spacer region so as not to affect the specificity of the primer.
In the present invention, the above-mentioned at least two kinds of oligonucleotides are used as amplification primers, and the sequence of the extension product of one primer is selected so as to be a template of the other primer when separated from its complement. There is a need.
[0013]
The oligonucleotide of the present invention can be produced by a method utilizing a nucleic acid synthesis reaction carried out in cells of an organism or a method of chemically reacting deoxyribonucleotides.
[0014]
As a primer used in the DNA amplification method of the present invention, a 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus having a nucleic acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 5 or a nucleic acid sequence complementary thereto, preferably Is an oligonucleotide characterized by containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases among the nucleic acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, or more preferably Are all the above-mentioned oligonucleotides, such as an oligonucleotide characterized by containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases among the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7 or a nucleic acid sequence complementary to the sequence Is mentioned. For this gene amplification, a PCR method is generally used.
[0015]
In the DNA amplification method of the present invention, as described above, in order to amplify one or more DNA fragments from the DNA fragment of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus present in various samples, The combinations of the oligonucleotides shown in Nos. 6 and 7, respectively, can be suitably used. Then, the DNA amplified by the primers outside of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 is further reamplified by using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively, whereby a higher sensitivity is obtained. It is expected that amplification will be possible. The outer primer used at this time is desirably specific to the 16S-23S intergenic spacer region, but a primer with low specificity may also be used.
[0016]
In the amplification of one or more DNA fragments of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus, it is necessary to use a combination of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. This is because the synergistic effect of the two oligonucleotides used is important for the specificity in the amplification reaction. In order to further increase the specificity, it is important to keep the concentration of the primer used for amplification as low as possible.
[0017]
The reagent for amplifying one or more DNA fragments of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus of the present invention specifically includes at least two types of primers comprising SEQ ID NOS: 1 to 5 Among the nucleic acid sequences shown in any of the above or a nucleic acid sequence complementary to the sequence, containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive bases, randomly from a DNA fragment of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus. Oligonucleotides for amplifying one or more selected DNA fragments, the primers serving as templates for the other primer when the extension product of one primer is separated from its complement Or more preferably at least two primers are represented by SEQ ID NOs: 6 and 7 One selected from a DNA fragment of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus containing a nucleic acid sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides among nucleic acid sequences complementary to said sequence or a nucleic acid sequence complementary to said sequence. Or more oligonucleotides for amplifying the DNA fragment, the primer serving as a template for the other primer when the extension product of one primer is separated from its complement, DNA polymerase, dNTP , Buffer, and the like.
[0018]
In the amplification reagent of the present invention, the primer, the DNA polymerase, and the dNTP include an amount capable of sufficiently performing the amplification step.
The primer contains about 1 to 1000 nM. Among them, in order to enhance specificity, about 100 to 500 nM is more preferable, and about 200 nM is more preferable. DNA polymerase contains about 1 to 200 U / ml. About 20-100 U / ml is more preferable, and about 50 U / ml is more preferable. A variety of sources such as the genus Thermus, Pyrococcus, Thermococcus, and Escherichia coli are used, and more thermostable ones such as Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, and KOD DNA polymerase are used. preferable. Among them, KOD DNA polymerase or a DNA polymerase obtained by improving the enzyme is most preferable from the viewpoint of the amount of amplification and the reaction rate. dNTP contains about 50 to 500 μM. About 100-350 μM is more preferable, and about 200 μM is even more preferable.
[0019]
Further, the reagent of the present invention includes a buffer suitable for a step for isolating one or more randomly selected DNA fragments from the DNA fragment of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus. And a buffer suitable for amplifying the DNA fragment. Furthermore, various combinations of reagents for detecting the amplified DNA fragment can be used in accordance with the detection method.
[0020]
The reagent of the present invention can also contain a magnesium salt necessary for expressing the activity of DNA polymerase, and can be added preferably in a concentration range of 0.5 mM to 4 mM, more preferably 1 mM to 1.5 mM. As a preferable condition for expressing the activity of the DNA polymerase, the pH during the amplification reaction is preferably set to 6.5 to 9.0, preferably 7.0 to 8.0.
[0021]
In the present invention, the gene to be amplified is a gene derived from a bacterium present in any material or environment such as food or seawater, and also includes amplification of a gene of a bacterial cell isolated and cultured. In addition, the sample in the present invention includes, in addition to the various materials and cultured cells described above, nucleic acids isolated and purified therefrom.
That is, as a sample in the present invention, a culture solution of the above-mentioned various materials, or a nucleic acid roughly extracted or purified therefrom, in addition to a case where the above-mentioned various materials are directly used, can be used. Furthermore, cells on an agar medium isolated from the above-mentioned various materials or a culture solution thereof, or a nucleic acid roughly extracted or purified therefrom can also be used as a sample.
[0022]
The method for detecting bacteria of the present invention can be performed by comparing the chain lengths of one or more amplified DNA fragments obtained by the above DNA amplification method. Alternatively, it can be performed by digesting a DNA fragment obtained by the above-described DNA amplification method with a restriction enzyme and comparing the chain length of the DNA fragment.
[0023]
The bacterial detection method of the present invention is a method for detecting Vibrio vulnificus in a sample, wherein at least 10 ng of amplified DNA is obtained when a gene amplification reaction is performed in a system containing 1,000 CFU of Vibrio vulnificus. Fragments can be obtained.
At this time, the measurement system can further contain a primer, a thermostable DNA polymerase, dNTP and a buffer, but it is not preferable to include a reaction inhibitor.
The primer contains about 1 to 1000 nM. Among them, in order to enhance specificity, about 100 to 500 nM is more preferable, and about 200 nM is more preferable. DNA polymerase contains about 1 to 200 U / ml. About 20-100 U / ml is more preferable, and about 50 U / ml is more preferable. A variety of sources such as the genus Thermus, Pyrococcus, Thermococcus, and Escherichia coli are used, and more thermostable ones such as Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, and KOD DNA polymerase are used. preferable. Among them, KOD DNA polymerase or a DNA polymerase obtained by improving the enzyme is most preferable from the viewpoint of the amount of amplification and the reaction rate. dNTP contains about 50 to 500 μM. About 100-350 μM is more preferable, and about 200 μM is even more preferable. One optimal combination includes a system containing 200 nM primers, 50 U / ml thermostable DNA polymerase, 200 μM dNTPs and buffer, and no reaction inhibitors.
The CFU of Vibrio vulnificus is defined by the number of colonies of the bacterium generated when the bacterium is plated under optimal conditions for growth.
The gene amplification reaction cycle is preferably 35 cycles in terms of the yield of the amplified DNA fragment, but is not particularly limited as long as the amplified DNA fragment can be detected.
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples.
[0024]
Example 1
(1) Synthesis of oligonucleotide The oligonucleotide for amplifying one or more DNA fragments from the DNA fragment of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus is shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 5. Selected from the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. Primer 1: 1 to 28 of SEQ ID NO: 6, Primer 2: 1 to 28 of SEQ ID NO: 7 The oligonucleotide is synthesized by the phosphoramidite method using ABI DNA synthesizer type 392. Obtained by The procedure was performed according to the manual of ABI, and the deprotection of various oligonucleotides was performed overnight at 55 ° C. with aqueous ammonia. Purification was performed by HPLC (manufactured by Beckman) using a reversed-phase chromatography column (manufactured by Nacalai Tesque).
[0025]
(2) Preparation of Samples Cell colonies of seven strains belonging to the Vibrio family were directly used as PCR samples (see Table 1). 100,000 CFU (colony forming unit) of cell colonies on an agar medium was suspended in 100 μl of water, and 1 μl of the suspension was used for PCR.
[0026]
[Table 1]
[0027]
(3) PCR
The oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 (primers 1 and 2) were used as PCR primers, respectively. The reaction solution composition was such that primers 1 and 2 were 0.2 μM each, dATP and dGTP and dCTP and dTTP were 0.2 mM each, a thermostable DNA polymerase (KOD Dash: manufactured by Toyobo) 25 units / ml, and a 1-fold concentration. An amplification buffer (manufactured by Toyobo). In actual use, 1 μl of a sample solution (microbial cell colony suspension) was added to the reaction solution, and the reaction solution was adjusted to 50 μl and subjected to the following reaction. The reaction conditions are as follows:
Heat denaturation: 94 ° C., 20 seconds Annealing: 60 ° C., 5 seconds elongation reaction: 74 ° C., 30 seconds The above heat denaturation, annealing and extension reaction were repeated 30 times. These operations were performed using a DNA thermal cycler (GeneAmp2400) manufactured by PerkinElmer.
[0028]
(4) Detection 5 μl of the reaction solution after the amplification reaction was electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and the fluorescence under ultraviolet irradiation was detected. The electrophoresis was performed at a constant voltage of 100 V for 30 minutes. The procedure as well as other conditions followed the technique described in Maniatis et al., Molecular Cloning (1982). In addition to the reaction solution, a molecular weight marker was simultaneously electrophoresed, which was used as a reference when comparing the chain lengths of the detected DNA fragments.
[0029]
(5) Results FIG. 1 shows agarose gel electrophoresis used for detection of the amplified DNA fragment.
As is clear from FIG. 1, amplified DNA fragments were obtained only for Vibrio vulnificus (lanes 5 to 7) by the above amplification method. In general, the detection limit of ethidium bromide staining in electrophoresis is said to be slightly lower than 10 ng, and thus it is estimated that the amplified DNA fragment is at least 10 ng. That is, it shows that the method of the present invention enables quick and simple detection of Vibrio vulnificus.
[0030]
【The invention's effect】
According to the present invention, the gene of the 16S-23S intergenic spacer region of Vibrio vulnificus can be simply, rapidly and specifically amplified from any material or environment, and the bacterium can be rapidly detected.
[0031]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an electrophoretic photograph instead of a drawing showing a DNA fragment amplified from a gene in a bacterial cell colony belonging to the Vibrio family using the oligonucleotide of the present invention as a primer.
