JPH0859501A - 医薬組成物 - Google Patents
医薬組成物Info
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- JPH0859501A JPH0859501A JP6200775A JP20077594A JPH0859501A JP H0859501 A JPH0859501 A JP H0859501A JP 6200775 A JP6200775 A JP 6200775A JP 20077594 A JP20077594 A JP 20077594A JP H0859501 A JPH0859501 A JP H0859501A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 イノシトールリン酸化合物類のタンパク質な
どとの結合を調節する医薬の開発。 【構成】 Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓなるアミノ酸配列を少なくとも含
むペプチドあるいは該アミノ酸配列の一部を含むペプチ
ドを含む医薬組成物、もしくは当該ペプチドに対する抗
体を含む医薬組成物。 【効果】 本発明の医薬組成物は、イノシトールリン酸
化合物類がその結合する相手のタンパク質、ペプチドな
どと結合する際に、その結合を阻害する。それによっ
て、細胞内カルシウム（Ｃａ）放出糸が介在する広範な
生理作用によって惹起される様々な病態・疾患を予防・
治療することができる。
どとの結合を調節する医薬の開発。 【構成】 Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓなるアミノ酸配列を少なくとも含
むペプチドあるいは該アミノ酸配列の一部を含むペプチ
ドを含む医薬組成物、もしくは当該ペプチドに対する抗
体を含む医薬組成物。 【効果】 本発明の医薬組成物は、イノシトールリン酸
化合物類がその結合する相手のタンパク質、ペプチドな
どと結合する際に、その結合を阻害する。それによっ
て、細胞内カルシウム（Ｃａ）放出糸が介在する広範な
生理作用によって惹起される様々な病態・疾患を予防・
治療することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な、循環器系疾患、
炎症性疾患、精神・神経系疾患、内分泌系疾患、悪性腫
瘍・癌などの疾患に対する医薬、診断薬に関するもので
ある。さらに詳しくいえば、イノシトールリン酸化合物
類がその結合する相手のタンパク質、ペプチドなどと結
合する際に、その結合を阻害することによって、細胞内
カルシウム（Ｃａ）貯蔵小胞体からのＣａの放出などに
基づく広範な生理作用によって惹起される様々な病態・
疾患を予防・治療する医薬およびこれら生体反応が関係
する病態・疾患に対する診断薬に関するものである。
炎症性疾患、精神・神経系疾患、内分泌系疾患、悪性腫
瘍・癌などの疾患に対する医薬、診断薬に関するもので
ある。さらに詳しくいえば、イノシトールリン酸化合物
類がその結合する相手のタンパク質、ペプチドなどと結
合する際に、その結合を阻害することによって、細胞内
カルシウム（Ｃａ）貯蔵小胞体からのＣａの放出などに
基づく広範な生理作用によって惹起される様々な病態・
疾患を予防・治療する医薬およびこれら生体反応が関係
する病態・疾患に対する診断薬に関するものである。
【０００２】さらに上記の相手のタンパク質、ペプチド
がホスホリパーゼＣ並びにその断片ペプチドである場
合、イノシトールリン酸化合物類が結合するのを調節す
ることによって、ホスホリパーゼＣの作用を制御し、そ
れに引き続く情報伝達系、細胞内Ｃａ放出系などを介し
て惹起される様々な病態・疾患を予防・治療する医薬お
よびこれら生体反応が関係する病態・疾患に対する診断
薬に関するものである。
がホスホリパーゼＣ並びにその断片ペプチドである場
合、イノシトールリン酸化合物類が結合するのを調節す
ることによって、ホスホリパーゼＣの作用を制御し、そ
れに引き続く情報伝達系、細胞内Ｃａ放出系などを介し
て惹起される様々な病態・疾患を予防・治療する医薬お
よびこれら生体反応が関係する病態・疾患に対する診断
薬に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】イノシトール類、特にミオイノシトール
のリン酸エステル化合物は天然にフィチン酸として存在
する。フィチン酸はイノシトールヘキサ（六）リン酸化
合物である。また近年の細胞生物学の研究の進展によ
り、イノシトールトリ（三）リン酸（ＩＰ3 ）、イノシ
トールテトラ（四）リン酸（ＩＰ4 ）などの細胞内情報
伝達系における役割がかなり明らかにされてきた。
のリン酸エステル化合物は天然にフィチン酸として存在
する。フィチン酸はイノシトールヘキサ（六）リン酸化
合物である。また近年の細胞生物学の研究の進展によ
り、イノシトールトリ（三）リン酸（ＩＰ3 ）、イノシ
トールテトラ（四）リン酸（ＩＰ4 ）などの細胞内情報
伝達系における役割がかなり明らかにされてきた。
【０００４】即ちホルモンや増殖因子や各種の細胞外刺
激因子などのリガンド、アゴニストの刺激に対して、そ
れらに対応する受容体（レセプター）が反応して、ホス
ファチジルイノシトール等の加水分解に端を発するイノ
シトールリン脂質代謝が亢進し、ＩＰ3 ，ＩＰ4 などの
イノシトールリン酸化合物が細胞内に放出され代謝され
てゆく。ＩＰ3 については、細胞内Ｃａ貯蔵小胞体膜上
のＩＰ3 レセプターと結合し、このＩＰ3 レセプターが
構成する細胞内膜系Ｃａ放出チャンネルを介して、Ｃａ
が細胞質内に放出されることが明らかにされてきた。
激因子などのリガンド、アゴニストの刺激に対して、そ
れらに対応する受容体（レセプター）が反応して、ホス
ファチジルイノシトール等の加水分解に端を発するイノ
シトールリン脂質代謝が亢進し、ＩＰ3 ，ＩＰ4 などの
イノシトールリン酸化合物が細胞内に放出され代謝され
てゆく。ＩＰ3 については、細胞内Ｃａ貯蔵小胞体膜上
のＩＰ3 レセプターと結合し、このＩＰ3 レセプターが
構成する細胞内膜系Ｃａ放出チャンネルを介して、Ｃａ
が細胞質内に放出されることが明らかにされてきた。
【０００５】本発明者らはＩＰ3 ，ＩＰ4 等イノシトー
ルリン酸化合物の全化学合成に最初に成功し特許出願し
た（日本国特許番号１７３７３３０号）。またＩＰ3 ，
ＩＰ 4 等イノシトールリン酸化合物の各種誘導体を化学
合成し、ＩＰ3 アゴニストあるいはＩＰ3 アンタゴニス
トとしての生物活性を検索してきた（特願平１−２４５
１６１、特願平２−２１０２６３）。
ルリン酸化合物の全化学合成に最初に成功し特許出願し
た（日本国特許番号１７３７３３０号）。またＩＰ3 ，
ＩＰ 4 等イノシトールリン酸化合物の各種誘導体を化学
合成し、ＩＰ3 アゴニストあるいはＩＰ3 アンタゴニス
トとしての生物活性を検索してきた（特願平１−２４５
１６１、特願平２−２１０２６３）。
【０００６】さらにそれら各種誘導体をセファロースな
どに結合させたイノシトールリン酸化合物担持のセファ
ロースカラムを作製し特許出願した（特願平４−１７８
３９４）。そしてそのイノシトールリン酸化合物担持ア
フィニティーカラムを用いて、イノシトールリン酸化合
物結合タンパク質を動物の臓器抽出物等より分離・精製
する研究を行ってきた。そしてラット大脳抽出物より、
ＩＰ3 結合タンパク質として分子量１３０ＫＤと８５Ｋ
Ｄのタンパク質を単離することができ（Ｈｉｒａｔａ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
６５１８−６５２５，（１９９２））、それぞれの一部
ペプチド断片の構造解析を行ったところ、１３０ＫＤタ
ンパク質は、現在研究途上であるが、文献未知のタンパ
ク質であり、８５ＫＤタンパク質は本発明者らが別途Ｓ
ＨＲラット血管平滑筋細胞よりｐＣＤ２ベクターを用い
てｃＤＮＡライブラリーを構築し、クローニングしてい
たホスホリパーゼＣのδ１型アイソザイム（ＰＬＣ−δ
１）（Ｙａｇｉｓａｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｈｙｐ
ｅｒｔｅｎｓ．，９，９９７〜（１９９１））であるこ
とが明らかとなった。
どに結合させたイノシトールリン酸化合物担持のセファ
ロースカラムを作製し特許出願した（特願平４−１７８
３９４）。そしてそのイノシトールリン酸化合物担持ア
フィニティーカラムを用いて、イノシトールリン酸化合
物結合タンパク質を動物の臓器抽出物等より分離・精製
する研究を行ってきた。そしてラット大脳抽出物より、
ＩＰ3 結合タンパク質として分子量１３０ＫＤと８５Ｋ
Ｄのタンパク質を単離することができ（Ｈｉｒａｔａ，
Ｍ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，
６５１８−６５２５，（１９９２））、それぞれの一部
ペプチド断片の構造解析を行ったところ、１３０ＫＤタ
ンパク質は、現在研究途上であるが、文献未知のタンパ
ク質であり、８５ＫＤタンパク質は本発明者らが別途Ｓ
ＨＲラット血管平滑筋細胞よりｐＣＤ２ベクターを用い
てｃＤＮＡライブラリーを構築し、クローニングしてい
たホスホリパーゼＣのδ１型アイソザイム（ＰＬＣ−δ
１）（Ｙａｇｉｓａｗａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ｈｙｐ
ｅｒｔｅｎｓ．，９，９９７〜（１９９１））であるこ
とが明らかとなった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ＰＬＣ−δ１はホスフ
ァチジルイノシトール類を加水分解し、ＩＰ3等イノシ
トールポリリン酸類とジアシルグリセロールに変換する
酵素であるが、ＰＬＣ−δ１がＩＰ3 結合タンパク質で
あるということは、とりもなおさず反応産物であるＩＰ
3 がＰＬＣ−δ１酵素に結合し、この代謝反応系を制御
している可能性を示唆していることになるし、またＩＰ
3 はＰＬＣ−δ１とどのように結合しているのか、ＩＰ
3 はＰＬＣ−δ１のどのペプチド断片ドメインと結合す
るのかという問いが発せられる。
ァチジルイノシトール類を加水分解し、ＩＰ3等イノシ
トールポリリン酸類とジアシルグリセロールに変換する
酵素であるが、ＰＬＣ−δ１がＩＰ3 結合タンパク質で
あるということは、とりもなおさず反応産物であるＩＰ
3 がＰＬＣ−δ１酵素に結合し、この代謝反応系を制御
している可能性を示唆していることになるし、またＩＰ
3 はＰＬＣ−δ１とどのように結合しているのか、ＩＰ
3 はＰＬＣ−δ１のどのペプチド断片ドメインと結合す
るのかという問いが発せられる。
【０００８】この問いに解答を与えることは、ＰＬＣ類
の異常発現の病態、ＰＬＣ類の作用調節などホスファチ
ジルイノシトール代謝系の代謝調節を解明することにな
るし、更にはイノシトールリン酸化合物類と、イノシト
ールリン酸化合物類に対する細胞内Ｃａ貯蔵小胞体膜上
のレセプターとの結合に端を発する、Ｃａの放出などに
基づく広範な生理作用によって惹起される様々な病態・
疾患を制御できる方策を考案させるものと想到した。
の異常発現の病態、ＰＬＣ類の作用調節などホスファチ
ジルイノシトール代謝系の代謝調節を解明することにな
るし、更にはイノシトールリン酸化合物類と、イノシト
ールリン酸化合物類に対する細胞内Ｃａ貯蔵小胞体膜上
のレセプターとの結合に端を発する、Ｃａの放出などに
基づく広範な生理作用によって惹起される様々な病態・
疾患を制御できる方策を考案させるものと想到した。
【０００９】このような考察のもとに本発明者らはＰＬ
Ｃ−δ１を材料として、イノシトールリン酸化合物の結
合ペプチドドメイン、コアを鋭意探索した結果、そのコ
ア部位を絞り込み、その断片ペプチドを化学合成し、更
にはその断片ペプチドに対する抗体も作製し、その断片
ペプチド自身およびこの抗体が、イノシトールリン酸化
合物とＰＬＣ−δ１の結合を、濃度依存的に促進ないし
阻害することを明らかにするに及び、これら試剤が薬物
としてＰＬＣ活性はじめ生体のホスファチジルイノシト
ール代謝過程を調節・制御できる可能性を示し、本発明
を完成するに至った。
Ｃ−δ１を材料として、イノシトールリン酸化合物の結
合ペプチドドメイン、コアを鋭意探索した結果、そのコ
ア部位を絞り込み、その断片ペプチドを化学合成し、更
にはその断片ペプチドに対する抗体も作製し、その断片
ペプチド自身およびこの抗体が、イノシトールリン酸化
合物とＰＬＣ−δ１の結合を、濃度依存的に促進ないし
阻害することを明らかにするに及び、これら試剤が薬物
としてＰＬＣ活性はじめ生体のホスファチジルイノシト
ール代謝過程を調節・制御できる可能性を示し、本発明
を完成するに至った。
【００１０】即ち本発明の目的はイノシトールリン酸化
合物類が、その結合する相手のタンパク質、第１のペプ
チドなどと結合する際に、その結合を促進ないし阻害す
る第２のペプチドないしは、その結合を阻害する第２の
ペプチドに対する抗体を含む医薬組成物を提供すること
である。
合物類が、その結合する相手のタンパク質、第１のペプ
チドなどと結合する際に、その結合を促進ないし阻害す
る第２のペプチドないしは、その結合を阻害する第２の
ペプチドに対する抗体を含む医薬組成物を提供すること
である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上に記した
既にクローニングしたＰＬＣ−δ１遺伝子をグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのタンパク質
との融合タンパク質の形で、大腸菌等で発現させた。
既にクローニングしたＰＬＣ−δ１遺伝子をグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのタンパク質
との融合タンパク質の形で、大腸菌等で発現させた。
【００１２】そして大腸菌を破砕後、その上清をＩＰ3
等を担持したセファロースや樹脂にアプライし、０．５
Ｍ−食塩（ＮａＣｌ）溶液で洗浄した後、２Ｍ−ＮａＣ
ｌ溶液で吸着蛋白を溶出した。
等を担持したセファロースや樹脂にアプライし、０．５
Ｍ−食塩（ＮａＣｌ）溶液で洗浄した後、２Ｍ−ＮａＣ
ｌ溶液で吸着蛋白を溶出した。
【００１３】この分画あるいは更にゲルロ過を行った分
画のＩＰ3 結合活性とＳＤＳ−電気泳動パターンを調べ
ると、このレコンビナントＰＬＣ−δ１もＩＰ3 結合活
性を有し、天然のＰＬＣ−δ１と同じ８５ＫＤの位置に
バンドが泳動した。
画のＩＰ3 結合活性とＳＤＳ−電気泳動パターンを調べ
ると、このレコンビナントＰＬＣ−δ１もＩＰ3 結合活
性を有し、天然のＰＬＣ−δ１と同じ８５ＫＤの位置に
バンドが泳動した。
【００１４】そこで本発明者らはＰＬＣ−δ１分子のど
のドメイン、コアがＩＰ3 結合を担っているのかを調べ
るために、図１に示すような様々な欠失ミュータント
（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ２−６）を作り、同様に大腸菌
に発現させ、欠失ミュータントタンパクを得たり、ま
た、Ｆｕｌｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔを大腸菌に発現させ
て得たタンパクをトロンビンやトリプシンなどのプロテ
アーゼで消化したタンパクを得た。そして各々のタンパ
クを含有する試料について、ＩＰ3 結合（阻害）活性を
調べた。
のドメイン、コアがＩＰ3 結合を担っているのかを調べ
るために、図１に示すような様々な欠失ミュータント
（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ２−６）を作り、同様に大腸菌
に発現させ、欠失ミュータントタンパクを得たり、ま
た、Ｆｕｌｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔを大腸菌に発現させ
て得たタンパクをトロンビンやトリプシンなどのプロテ
アーゼで消化したタンパクを得た。そして各々のタンパ
クを含有する試料について、ＩＰ3 結合（阻害）活性を
調べた。
【００１５】ＩＰ3 結合（阻害）能を測定する系として
はたとえば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．
３，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む反応液を用いることができ
る。この反応液にＩＰ3 結合タンパクや阻害作用のある
分画を添加しその活性を測定する。１ｎＭ［3 Ｈ］ＩＰ
3 （２２．０００ｄｐｍ）を加えて総量を０．４５ｍｌ
とし、氷中で１５分間放置する。
はたとえば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．
３，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む反応液を用いることができ
る。この反応液にＩＰ3 結合タンパクや阻害作用のある
分画を添加しその活性を測定する。１ｎＭ［3 Ｈ］ＩＰ
3 （２２．０００ｄｐｍ）を加えて総量を０．４５ｍｌ
とし、氷中で１５分間放置する。
【００１６】５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌウシガンマグロ
ブリンと０．５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレング
リコール６０００を加えて氷中でさらに５分間放置す
る。
ブリンと０．５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレング
リコール６０００を加えて氷中でさらに５分間放置す
る。
【００１７】その後、１５．０００回転で５分間遠心し
て、上清を注意深く除き、沈殿に１ｍｌの０．１ＮＮａ
ＯＨを加えて沈殿を溶解する。
て、上清を注意深く除き、沈殿に１ｍｌの０．１ＮＮａ
ＯＨを加えて沈殿を溶解する。
【００１８】ついで、１０ｍｌのシンチゾールＥＸ−Ｈ
（同仁化学社製）とよく混和して液体シンチレーション
カウンターで測定する。
（同仁化学社製）とよく混和して液体シンチレーション
カウンターで測定する。
【００１９】非特異的結合は１μＭ非放射性ＩＰ3 を含
んだ条件で行い（通常は１５０−２００ｄｐｍ程度）、
活性から引き算をして特異的結合活性を求めることがで
きる。
んだ条件で行い（通常は１５０−２００ｄｐｍ程度）、
活性から引き算をして特異的結合活性を求めることがで
きる。
【００２０】図２に例示するが、各々のタンパクを含む
大腸菌の破砕上清そのもののＩＰ3結合活性をＡに示
し、大腸菌の破砕上清をグルタチオン−セファロースカ
ラムにかけ、グルタチオンで競合溶出させた分画のＩＰ
3 結合活性をＢに示し、また大腸菌の破砕上清をＩＰ3
担持担体カラムにアプライして、２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で
溶出させた分画のＩＰ3 結合活性をＣに示す。
大腸菌の破砕上清そのもののＩＰ3結合活性をＡに示
し、大腸菌の破砕上清をグルタチオン−セファロースカ
ラムにかけ、グルタチオンで競合溶出させた分画のＩＰ
3 結合活性をＢに示し、また大腸菌の破砕上清をＩＰ3
担持担体カラムにアプライして、２Ｍ−ＮａＣｌ溶液で
溶出させた分画のＩＰ3 結合活性をＣに示す。
【００２１】いずれのタンパク含有液を試験しても、Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ２および３由来のタンパクはＩＰ3 結
合活性が殆んど消失することがわかり、ＰＬＣ−δ１の
ＩＰ 3 結合性ドメインはアミノ末端から２２３番目まで
の範囲のタンパク部分にあることがわかった。
ｏｎｓｔｒｕｃｔ２および３由来のタンパクはＩＰ3 結
合活性が殆んど消失することがわかり、ＰＬＣ−δ１の
ＩＰ 3 結合性ドメインはアミノ末端から２２３番目まで
の範囲のタンパク部分にあることがわかった。
【００２２】一方Ｆｕｌｌ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔを大腸
菌に発現させ、その破砕上清をグルタチオン−セファロ
ースカラムにかけ、よく洗浄して、非特異的吸着タンパ
クを洗い去った後、トロンビン等で限定分解し、ＧＳＴ
とＰＬＣ−δ１との隔合部位を切断して、前述のように
８５ＫＤの分子サイズを持つＰＬＣ−δ１が得られた。
菌に発現させ、その破砕上清をグルタチオン−セファロ
ースカラムにかけ、よく洗浄して、非特異的吸着タンパ
クを洗い去った後、トロンビン等で限定分解し、ＧＳＴ
とＰＬＣ−δ１との隔合部位を切断して、前述のように
８５ＫＤの分子サイズを持つＰＬＣ−δ１が得られた。
【００２３】またこのトロンビン等のプロテアーゼ処理
により、ＰＬＣ−δ１タンパク中の特定の部位で開裂が
起こり、一部のペプチド断片が欠損したタンパクが得ら
れる可能性が考えられた。
により、ＰＬＣ−δ１タンパク中の特定の部位で開裂が
起こり、一部のペプチド断片が欠損したタンパクが得ら
れる可能性が考えられた。
【００２４】実際たとえば、トロンビンを用いた場合、
トロンビン量を増やしたり、あるいは処理時間を長目に
設定したりすると８５ＫＤ分子とともに７６ＫＤ分子も
併せて生成してきた。
トロンビン量を増やしたり、あるいは処理時間を長目に
設定したりすると８５ＫＤ分子とともに７６ＫＤ分子も
併せて生成してきた。
【００２５】この８５ＫＤ分子と７６ＫＤ分子とを分離
するため、この混合物をＤＥＡＥ−陰イオン交換樹脂カ
ラムなどにかけた。この結果を図３のＡに例示する。
するため、この混合物をＤＥＡＥ−陰イオン交換樹脂カ
ラムなどにかけた。この結果を図３のＡに例示する。
【００２６】各分画についてＳＤＳ−電気泳動を行うと
両分子が分離されることが分かる（Ｂ）。
両分子が分離されることが分かる（Ｂ）。
【００２７】各分画についてＩＰ3 結合活性とＰＬＣ−
δ１活性を併せて測定すると、７６ＫＤ分子はＩＰ3 結
合活性が欠落していることが明らかとなった。８５ＫＤ
および７６ＫＤの両分子のアミノ末端からの配列を決め
ると、８５ＫＤ分子は−５から始まり、-5ＧＳＲＳＴ1
ＭＤＳＧＲＤＦＰＴＬＨであり、一方７６ＫＤ分子はＰ
ＬＣ−δ１の６１番目から始まって61ＳＰＥＳＱＬＦＳ
ＩＥＤＩＱであった。
δ１活性を併せて測定すると、７６ＫＤ分子はＩＰ3 結
合活性が欠落していることが明らかとなった。８５ＫＤ
および７６ＫＤの両分子のアミノ末端からの配列を決め
ると、８５ＫＤ分子は−５から始まり、-5ＧＳＲＳＴ1
ＭＤＳＧＲＤＦＰＴＬＨであり、一方７６ＫＤ分子はＰ
ＬＣ−δ１の６１番目から始まって61ＳＰＥＳＱＬＦＳ
ＩＥＤＩＱであった。
【００２８】これらの結果からＰＬＣ−δ１のアミノ末
端から６０番目までにＩＰ3 結合性ドメインが存在する
と結論づけられた。
端から６０番目までにＩＰ3 結合性ドメインが存在する
と結論づけられた。
【００２９】そこでＰＬＣ−δ１の６０番目までのアミ
ノ酸配列を精査すると、３０番から４３番にかけて正に
荷電した塩基性アミノ酸のクラスターが存在することに
気づき、この１４個のアミノ酸残基のペプチドコアＫＶ
ＫＳＳＳＷＲＲＥＲＦＹＫを化学合成することにした。
ノ酸配列を精査すると、３０番から４３番にかけて正に
荷電した塩基性アミノ酸のクラスターが存在することに
気づき、この１４個のアミノ酸残基のペプチドコアＫＶ
ＫＳＳＳＷＲＲＥＲＦＹＫを化学合成することにした。
【００３０】ペプチド合成は固相法でも、液相法でも実
施しうる。アプライドバイオシステム４３１Ａペプチド
合成機などを用いて、所望のペプチドをＦｍｏｃ（Ｎ−
（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏ
ｎｙｌ）ｃｌｅａｖａｇｅｍｅｔｈｏｄなどの方法によ
り合成することが簡便である。
施しうる。アプライドバイオシステム４３１Ａペプチド
合成機などを用いて、所望のペプチドをＦｍｏｃ（Ｎ−
（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏ
ｎｙｌ）ｃｌｅａｖａｇｅｍｅｔｈｏｄなどの方法によ
り合成することが簡便である。
【００３１】ＰＬＣ−δ１（３０−４３）のペプチドの
他、Ｎ端にＣｙｓ残基を付加したペプチド、さらにこの
配列と組成は同じであるが配列の中に極性アミノ酸を均
等に分散するように設計した配列（ＷＫＳＲＦＫＳＥＲ
ＹＫＳＲＶ）のＮ端にＣｙｓ残基を付加したペプチドも
合成し、これらをＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４
３）、Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−
４３）と表わした。
他、Ｎ端にＣｙｓ残基を付加したペプチド、さらにこの
配列と組成は同じであるが配列の中に極性アミノ酸を均
等に分散するように設計した配列（ＷＫＳＲＦＫＳＥＲ
ＹＫＳＲＶ）のＮ端にＣｙｓ残基を付加したペプチドも
合成し、これらをＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４
３）、Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−
４３）と表わした。
【００３２】ＰＬＣ−δ１のこの１４残基の塩基性ペプ
チドコアとは構造的には無関係であるが、同じくらいの
大きさの塩基性ペプチドを対照ペプチドとして作製し
た。
チドコアとは構造的には無関係であるが、同じくらいの
大きさの塩基性ペプチドを対照ペプチドとして作製し
た。
【００３３】即ちラット肝臓ＵＤＰ−グルクロノシルト
ランスフェラーゼ（Ｉｙａｎａｇｉ，Ｔ．，ｅｔ ａ
ｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１５６０７−
１５６１４，（１９８６））の５１６−５２９残基に対
応するＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）：ＧＫＧＲＶＫ
ＫＳＨＫＳＫＴＨおよびラット肝臓ＵＤＰ−グルクロノ
シルトランスフェラーゼアイソフォームＡ−１８（Ｉｙ
ａｎａｇｉ，Ｔ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
６，２４０４８−２４０５２，（１９９１））の８５−
９８残基に対応するＵＤＰ−ＧＴ（８５−９８）：ＦＱ
ＮＥＮＶＴＡＡＦＶＥＬＧそしてヒトビタミンＤ３レセ
プター（Ｂａｋｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，３２９
４−３２９８，（１９８８））の１０６−１２０残基に
対応するＶｉｔＤ3 Ｒ（１０６−１２０）：ＭＩＬＫＲ
ＫＥＥＥＡＬＫＤＳＬを上記同様４３１Ａペプチド合成
機で合成した。
ランスフェラーゼ（Ｉｙａｎａｇｉ，Ｔ．，ｅｔ ａ
ｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１５６０７−
１５６１４，（１９８６））の５１６−５２９残基に対
応するＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）：ＧＫＧＲＶＫ
ＫＳＨＫＳＫＴＨおよびラット肝臓ＵＤＰ−グルクロノ
シルトランスフェラーゼアイソフォームＡ−１８（Ｉｙ
ａｎａｇｉ，Ｔ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
６，２４０４８−２４０５２，（１９９１））の８５−
９８残基に対応するＵＤＰ−ＧＴ（８５−９８）：ＦＱ
ＮＥＮＶＴＡＡＦＶＥＬＧそしてヒトビタミンＤ３レセ
プター（Ｂａｋｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，３２９
４−３２９８，（１９８８））の１０６−１２０残基に
対応するＶｉｔＤ3 Ｒ（１０６−１２０）：ＭＩＬＫＲ
ＫＥＥＥＡＬＫＤＳＬを上記同様４３１Ａペプチド合成
機で合成した。
【００３４】これら合成したペプチドはμ−Ｂｏｎｄａ
ｓｐｈｅｒｅ ５μ−Ｃ18−１００Åカラム（Ｗａｔｅ
ｒｓ，３．９×１５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣ等によ
り精製することができる。
ｓｐｈｅｒｅ ５μ−Ｃ18−１００Åカラム（Ｗａｔｅ
ｒｓ，３．９×１５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣ等によ
り精製することができる。
【００３５】これら合成したペプチドをＢＳＡ（ｂｏｖ
ｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ａｌｂｕｍｉｎ）やＫＬＨ（ｋ
ｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ
ｅ）とコンジュゲートさせ、前記同様にＩＰ3 結合活性
を調べると、図５に例示するようにＢＳＡ−Ｎ−Ｃｙｓ
−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）は量に応じてＩＰ3 結合
活性が増大してゆくが、対照のＢＳＡ−Ｎ−Ｃｙｓ−Ｐ
ＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）やＫＬＨ−Ｎ−
Ｃｙｓ−ＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）などの他の合
成ペプチドでは殆んど著明なＩＰ3 結合活性は観察でき
なかった。
ｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（ａｌｂｕｍｉｎ）やＫＬＨ（ｋ
ｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ
ｅ）とコンジュゲートさせ、前記同様にＩＰ3 結合活性
を調べると、図５に例示するようにＢＳＡ−Ｎ−Ｃｙｓ
−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）は量に応じてＩＰ3 結合
活性が増大してゆくが、対照のＢＳＡ−Ｎ−Ｃｙｓ−Ｐ
ＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）やＫＬＨ−Ｎ−
Ｃｙｓ−ＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）などの他の合
成ペプチドでは殆んど著明なＩＰ3 結合活性は観察でき
なかった。
【００３６】従ってＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチ
ド断片が、ＩＰ3 濃度１ｎＭという低濃度でも、特異的
に高親和にＩＰ3 結合活性を有していることが分かっ
た。
ド断片が、ＩＰ3 濃度１ｎＭという低濃度でも、特異的
に高親和にＩＰ3 結合活性を有していることが分かっ
た。
【００３７】一方、上記の３０−４３番目の領域内の塩
基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換したＰＬＣ−δ１を
ＧＳＴとの融合タンパクの形で得るべくｓｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、ＧＳＴ
−ＰＬＣ−δ１アナローグ融合タンパクを製造し、ＩＰ
3 結合能を同様にして調べたが、３０番目のＫをＥに、
３２番目のＫをＥに、３７番目のＲをＤに、３８番目の
ＲをＥに、４０番目のＲをＤに、４３番目のＫをＥに、
３７，３８番目の２つのＲをＤＥに変換したこれら融合
タンパク質にはＩＰ3 結合活性がないことが分かり、３
０−４３番目の本発明のペプチド断片の特異的なＩＰ3
結合能がさらに確証された。
基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換したＰＬＣ−δ１を
ＧＳＴとの融合タンパクの形で得るべくｓｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、ＧＳＴ
−ＰＬＣ−δ１アナローグ融合タンパクを製造し、ＩＰ
3 結合能を同様にして調べたが、３０番目のＫをＥに、
３２番目のＫをＥに、３７番目のＲをＤに、３８番目の
ＲをＥに、４０番目のＲをＤに、４３番目のＫをＥに、
３７，３８番目の２つのＲをＤＥに変換したこれら融合
タンパク質にはＩＰ3 結合活性がないことが分かり、３
０−４３番目の本発明のペプチド断片の特異的なＩＰ3
結合能がさらに確証された。
【００３８】ついで、Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０
−４３）とＫＬＨやＢＳＡとのコンジュゲートをウサギ
に免疫し、抗血清を得、さらにＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ
１（３０−４３）の結合した抗原カラムを通して、抗Ｐ
ＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチド精製ＩｇＧ抗体を得
た。さらにこのＩｇＧをパパイン処理してＦａｂ抗体を
得た。
−４３）とＫＬＨやＢＳＡとのコンジュゲートをウサギ
に免疫し、抗血清を得、さらにＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ
１（３０−４３）の結合した抗原カラムを通して、抗Ｐ
ＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチド精製ＩｇＧ抗体を得
た。さらにこのＩｇＧをパパイン処理してＦａｂ抗体を
得た。
【００３９】そしてこれら抗体が、レコンビナントＰＬ
Ｃ−δ１に対するＩＰ3 結合をどの程度阻害するかを検
討したところ、図６に例示するように、抗ＰＬＣ−δ１
（３０−４３）ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ抗体は量を増加させ
ても、ＰＬＣ−δ１のＩＰ3結合阻害はかからないまま
であったのに対して、抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）Ｆ
ａｂ−モノマー抗体は量をふやすにつれ、ＰＬＣ−δ１
へのＩＰ3 結合は顕著に阻害されることが分かり、ＰＬ
Ｃ−δ１（３０−４３）がＩＰ3 結合コアであることが
更に明らかにされた。この知見において、ｗｈｏｌｅ
ＩｇＧでは立体的に大きく、ＰＬＣ−δ１（３０−４
３）をとりまく環境には入れないと考えられた。
Ｃ−δ１に対するＩＰ3 結合をどの程度阻害するかを検
討したところ、図６に例示するように、抗ＰＬＣ−δ１
（３０−４３）ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ抗体は量を増加させ
ても、ＰＬＣ−δ１のＩＰ3結合阻害はかからないまま
であったのに対して、抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）Ｆ
ａｂ−モノマー抗体は量をふやすにつれ、ＰＬＣ−δ１
へのＩＰ3 結合は顕著に阻害されることが分かり、ＰＬ
Ｃ−δ１（３０−４３）がＩＰ3 結合コアであることが
更に明らかにされた。この知見において、ｗｈｏｌｅ
ＩｇＧでは立体的に大きく、ＰＬＣ−δ１（３０−４
３）をとりまく環境には入れないと考えられた。
【００４０】他方、ＰＬＣ−δ１（３０−４０）ペプチ
ド断片について同様の試験を行ったところ、本ペプチド
断片を共存させるとＰＬＣ−δ１へのＩＰ3 結合を促進
することが分かった。
ド断片について同様の試験を行ったところ、本ペプチド
断片を共存させるとＰＬＣ−δ１へのＩＰ3 結合を促進
することが分かった。
【００４１】これらの結果に加え、本発明のＰＬＣ−δ
１（３０−４０）ペプチドおよび該ペプチドに対するＩ
ｇＧのＦａｂ断片抗体のＰＬＣ−δ１活性に及ぼす効果
を調べたところ、ＰＬＣ−δ１（３０−４０）はＰＬＣ
−δ１活性を亢進すること、一方Ｆａｂ抗体はＰＬＣ−
δ１活性を抑制することが明らかにされた。
１（３０−４０）ペプチドおよび該ペプチドに対するＩ
ｇＧのＦａｂ断片抗体のＰＬＣ−δ１活性に及ぼす効果
を調べたところ、ＰＬＣ−δ１（３０−４０）はＰＬＣ
−δ１活性を亢進すること、一方Ｆａｂ抗体はＰＬＣ−
δ１活性を抑制することが明らかにされた。
【００４２】これら知見はこれら試剤が薬物として、ホ
スファチジルイノシトール代謝過程やＩＰ3 等イノシト
ールリン酸化合物が結合する種々のタンパク質を調節・
制御できる可能性を示唆するものである。
スファチジルイノシトール代謝過程やＩＰ3 等イノシト
ールリン酸化合物が結合する種々のタンパク質を調節・
制御できる可能性を示唆するものである。
【００４３】実際、ＰＬＣ−δ１（３０−４０）ペプチ
ドコアとＩＰ3 との結合は、他のリン酸化合物たとえば
Ｄ−１，４，５，６−イノシトール四リン酸（ＩＰ
4 ）、イノシトール六リン酸（ＩＰ6 ）、ＡＴＰなどの
添加によって置換・妨害されることも一方で明らかにさ
れ、ＰＬＣ−δ１のこのペプチドコアにおける各種生体
物質との相互作用が、本発明のＰＬＣ−δ１（３０−４
３）ペプチドや該ペプチドに対するＩｇＧのＦａｂ断片
抗体などの薬剤によって調節・制御できる可能性がある
ことも示唆される。
ドコアとＩＰ3 との結合は、他のリン酸化合物たとえば
Ｄ−１，４，５，６−イノシトール四リン酸（ＩＰ
4 ）、イノシトール六リン酸（ＩＰ6 ）、ＡＴＰなどの
添加によって置換・妨害されることも一方で明らかにさ
れ、ＰＬＣ−δ１のこのペプチドコアにおける各種生体
物質との相互作用が、本発明のＰＬＣ−δ１（３０−４
３）ペプチドや該ペプチドに対するＩｇＧのＦａｂ断片
抗体などの薬剤によって調節・制御できる可能性がある
ことも示唆される。
【００４４】なお本発明の抗体は必要に応じ、ヒト型抗
体にかえ提供することができる。
体にかえ提供することができる。
【００４５】本発明のＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプ
チドおよび該ペプチドに対する抗体を有効成分として含
有する医薬組成物、あるいは診断薬は、イノシトールリ
ン酸化合物類がその結合する相手のタンパク質、ペプチ
ドなどと結合する際に、その結合を阻害することによっ
て、細胞内カルシウム（Ｃａ）貯蔵小胞体からのＣａの
放出などに基づく広範な生理作用によって惹起される様
々な病態・疾患を予防・治療する医薬およびこれら生体
反応が関係する病態・疾患に対する診断薬として有用で
ある。
チドおよび該ペプチドに対する抗体を有効成分として含
有する医薬組成物、あるいは診断薬は、イノシトールリ
ン酸化合物類がその結合する相手のタンパク質、ペプチ
ドなどと結合する際に、その結合を阻害することによっ
て、細胞内カルシウム（Ｃａ）貯蔵小胞体からのＣａの
放出などに基づく広範な生理作用によって惹起される様
々な病態・疾患を予防・治療する医薬およびこれら生体
反応が関係する病態・疾患に対する診断薬として有用で
ある。
【００４６】また上記の相手のタンパク質、ペプチドが
ホスホリパーゼＣ並びにその断片ペプチドである場合、
イノシトールリン酸化合物類が結合するのを阻害するこ
とによって、ホスホリパーゼＣの作用を制御し、それに
引き続く情報伝達系、細胞内Ｃａ放出系などを介して惹
起される様々な病態・疾患を予防・治療する医薬および
これら生体反応が関係する病態・疾患に対する診断薬と
して有用である。
ホスホリパーゼＣ並びにその断片ペプチドである場合、
イノシトールリン酸化合物類が結合するのを阻害するこ
とによって、ホスホリパーゼＣの作用を制御し、それに
引き続く情報伝達系、細胞内Ｃａ放出系などを介して惹
起される様々な病態・疾患を予防・治療する医薬および
これら生体反応が関係する病態・疾患に対する診断薬と
して有用である。
【００４７】従ってこのような病態がかかわる循環器系
疾患、炎症性疾患、精神・神経系疾患、内分泌系疾患、
悪性腫瘍・癌などの疾患に対する医薬、診断薬として本
発明のペプチド断片および該ペプチド断片に対する抗体
は用いることができる。
疾患、炎症性疾患、精神・神経系疾患、内分泌系疾患、
悪性腫瘍・癌などの疾患に対する医薬、診断薬として本
発明のペプチド断片および該ペプチド断片に対する抗体
は用いることができる。
【００４８】本発明のペプチドあるいは該ペプチドに対
する抗体を有効成分とする医薬組成物は、必要に応じた
各種添加剤と混合することによって調製することができ
る。該添加剤としては、例えばアルブミン、ゼラチン、
デキストラン、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリソルベート系
等の非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油、脂肪酸アルコールエステル、ポリグリコールエー
テル、リン酸緩衝生理食塩水、各種アミノ酸、各種有機
酸、デキストロース、マンニトール、グルコース、キシ
リトール、乳酸、ショ糖、ガラクトース、フラクトー
ス、マルトース、サッカロース、ソルビトールなどの糖
類、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン
等を挙げることができ、これらの１種または２以上を組
み合せて用いることができる。 更に、本発明の医薬用
組成物は、製薬的に許容される担体等の添加剤として、
上記の例示物の他に、充填剤、結合剤、滑沢剤、温潤
剤、崩壊剤、乳濁および懸濁液、保存剤、希釈剤、甘味
剤あるいは芳香剤等として作用する各種物質を含有し得
る。
する抗体を有効成分とする医薬組成物は、必要に応じた
各種添加剤と混合することによって調製することができ
る。該添加剤としては、例えばアルブミン、ゼラチン、
デキストラン、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリソルベート系
等の非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油、脂肪酸アルコールエステル、ポリグリコールエー
テル、リン酸緩衝生理食塩水、各種アミノ酸、各種有機
酸、デキストロース、マンニトール、グルコース、キシ
リトール、乳酸、ショ糖、ガラクトース、フラクトー
ス、マルトース、サッカロース、ソルビトールなどの糖
類、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン
等を挙げることができ、これらの１種または２以上を組
み合せて用いることができる。 更に、本発明の医薬用
組成物は、製薬的に許容される担体等の添加剤として、
上記の例示物の他に、充填剤、結合剤、滑沢剤、温潤
剤、崩壊剤、乳濁および懸濁液、保存剤、希釈剤、甘味
剤あるいは芳香剤等として作用する各種物質を含有し得
る。
【００４９】これらの添加剤の例としては、とうもろこ
し澱粉、結晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシ
ウム、アルジネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロ
ース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラ
チン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロ
ピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が
挙げられる。
し澱粉、結晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシ
ウム、アルジネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロ
ース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラ
チン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロ
ピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が
挙げられる。
【００５０】なお、本発明の医薬組成物は、投薬の後の
活性成分の放出速度が所望に応じて制御されるように処
方しても良い。
活性成分の放出速度が所望に応じて制御されるように処
方しても良い。
【００５１】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等
の経口投与の場合、又は静脈内点滴もしくは注射、ある
いは筋肉内注射等の非経口投与の場合、本発明のペプチ
ドないし該ペプチドに対する抗体の有効量を、ブドウ糖
水溶液、等張食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解
し、バイアルまたはアンプルに密封することができる。
の経口投与の場合、又は静脈内点滴もしくは注射、ある
いは筋肉内注射等の非経口投与の場合、本発明のペプチ
ドないし該ペプチドに対する抗体の有効量を、ブドウ糖
水溶液、等張食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解
し、バイアルまたはアンプルに密封することができる。
【００５２】なお、バイアルまたはアンプル剤とした場
合には、その安定性を向上させるために、本発明のペプ
チドないし該ペプチドに対する抗体の凍結乾燥品をバイ
アルやアンプル内で調製しても良い。本発明のペプチド
ないし該ペプチドに対する抗体は軟膏剤としても投与す
ることができる。本発明の医薬組成物中での本発明のペ
プチドないし該ペプチドに対する抗体の含有量は、必要
に応じて適宜選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状
あたり、０．１μｇ〜２００ｍｇ程度とすることができ
る。
合には、その安定性を向上させるために、本発明のペプ
チドないし該ペプチドに対する抗体の凍結乾燥品をバイ
アルやアンプル内で調製しても良い。本発明のペプチド
ないし該ペプチドに対する抗体は軟膏剤としても投与す
ることができる。本発明の医薬組成物中での本発明のペ
プチドないし該ペプチドに対する抗体の含有量は、必要
に応じて適宜選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状
あたり、０．１μｇ〜２００ｍｇ程度とすることができ
る。
【００５３】
【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ＰＬＣ−δ１タンパク質遺伝子発現系の構築 ラットＰＬＣ−δ１の発現に用いたプラスミド：ｐＧＳ
Ｔ３／ＰＬＣ−δ１の構築は以下のように行った。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ＰＬＣ−δ１タンパク質遺伝子発現系の構築 ラットＰＬＣ−δ１の発現に用いたプラスミド：ｐＧＳ
Ｔ３／ＰＬＣ−δ１の構築は以下のように行った。
【００５４】ファルマシア社のグルタチオンＳトランス
フェラーゼ融合タンパク質遺伝子発現ベクター：ｐＧＥ
Ｘ−２ＴのマルチプルクローニングサイトをＢａｍＨＩ
部位ならびにＥｃｏＲＩ部位で切断し、ＢａｍＨＩ部位
を部分塩基導入したのち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII
（ＫＳ＋）（東洋紡）のマルチプルクローニングサイト
の一部（ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片の後ＸｈｏＩ部位を
部分塩基導入して前者の修飾ＢａｍＨＩ部位と相補性を
持たせたもの）を結合し、これをｐＧＳＴ３とした。
フェラーゼ融合タンパク質遺伝子発現ベクター：ｐＧＥ
Ｘ−２ＴのマルチプルクローニングサイトをＢａｍＨＩ
部位ならびにＥｃｏＲＩ部位で切断し、ＢａｍＨＩ部位
を部分塩基導入したのち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII
（ＫＳ＋）（東洋紡）のマルチプルクローニングサイト
の一部（ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片の後ＸｈｏＩ部位を
部分塩基導入して前者の修飾ＢａｍＨＩ部位と相補性を
持たせたもの）を結合し、これをｐＧＳＴ３とした。
【００５５】ラット（ＳＨＲ：Ｏｋａｍｏｔｏ−Ｋｙｏ
ｔｏ ｓｔｒａｉｎ）の胸部大動脈平滑筋細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー（ｐＣＤ２ベクター：阪大微生物病研究所
由来を使用）よりクローニングしたＰＬＣ−δ１のｃＤ
ＮＡをもつプラスミド、ＰＣＤ２／Ｓδ１、の５′転写
開始領域の直前に、ＳａｌＩ部位を導入するようにオリ
ゴヌクレオチドを設計し遺伝子増幅装置（ＰＣＲ）でこ
の部分を増幅した。この増幅ＤＮＡをＳａｌＩとＨｐａ
Ｉで切断して、翻訳枠を含む断片を切り出し、ＳａｌＩ
とＳｍａＩで切断したｐＴＶ１１９Ｎベクター（宝酒
造）に導入した。その後このコンストラクトをＳａｌＩ
とＳｍａＩで切断し、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切断し
ＨｉｎｄIII 部位を末端平滑化したｐＧＳＴベクターに
導入した。 実施例２ 欠失変異体遺伝子発現系の作製 プラスミド（ｐＧＳＴ３／ＰＬＣ−δ１：ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔ１）のＤＮＡ１μｇに対し次のような制限酵素処
理ならびに必要な場合にはＤＮＡ突出末端平滑化処理を
施した。Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ２に関してはＳａｌＩとＢ
ａｍＨＩ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ３に関してＳａｌＩとＸ
ｈｏＩ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ４に関してはＳａｃＩ、Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ５に関してはＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ、
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ６に関してはＥｃｏＲＩで処理し
た。なお反応液容量は１０μｌ、各制限酵素の量は約５
〜１０ユニット、反応条件は３７℃１時間とした。
ｔｏ ｓｔｒａｉｎ）の胸部大動脈平滑筋細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー（ｐＣＤ２ベクター：阪大微生物病研究所
由来を使用）よりクローニングしたＰＬＣ−δ１のｃＤ
ＮＡをもつプラスミド、ＰＣＤ２／Ｓδ１、の５′転写
開始領域の直前に、ＳａｌＩ部位を導入するようにオリ
ゴヌクレオチドを設計し遺伝子増幅装置（ＰＣＲ）でこ
の部分を増幅した。この増幅ＤＮＡをＳａｌＩとＨｐａ
Ｉで切断して、翻訳枠を含む断片を切り出し、ＳａｌＩ
とＳｍａＩで切断したｐＴＶ１１９Ｎベクター（宝酒
造）に導入した。その後このコンストラクトをＳａｌＩ
とＳｍａＩで切断し、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII で切断し
ＨｉｎｄIII 部位を末端平滑化したｐＧＳＴベクターに
導入した。 実施例２ 欠失変異体遺伝子発現系の作製 プラスミド（ｐＧＳＴ３／ＰＬＣ−δ１：ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔ１）のＤＮＡ１μｇに対し次のような制限酵素処
理ならびに必要な場合にはＤＮＡ突出末端平滑化処理を
施した。Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ２に関してはＳａｌＩとＢ
ａｍＨＩ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ３に関してＳａｌＩとＸ
ｈｏＩ、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ４に関してはＳａｃＩ、Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔ５に関してはＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ、
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ６に関してはＥｃｏＲＩで処理し
た。なお反応液容量は１０μｌ、各制限酵素の量は約５
〜１０ユニット、反応条件は３７℃１時間とした。
【００５６】その後反応産物をエタノール沈殿し、１０
μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍ
ＭＥＤＴＡに溶かし、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ２，５はＴ４
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ突出末端平滑化処理を
行ってから、またＣｏｎｓｔｒｕｃｔ３，４，６はその
ままＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応を
行った。
μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍ
ＭＥＤＴＡに溶かし、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ２，５はＴ４
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ突出末端平滑化処理を
行ってから、またＣｏｎｓｔｒｕｃｔ３，４，６はその
ままＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応を
行った。
【００５７】ライゲーション反応はこれらの溶液各０．
５μｌ（ＤＮＡ量にして約５０ｎｇ）を使用し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用い、全体量６μ
ｌ、１６℃、３０分の条件で行った。この溶液を大腸菌
ＤＨ５αのコンピタント細胞２００μｌと混ぜ、４２
℃、３０秒の熱ショックによってトランスフォーメーシ
ョンを行った。
５μｌ（ＤＮＡ量にして約５０ｎｇ）を使用し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造）を用い、全体量６μ
ｌ、１６℃、３０分の条件で行った。この溶液を大腸菌
ＤＨ５αのコンピタント細胞２００μｌと混ぜ、４２
℃、３０秒の熱ショックによってトランスフォーメーシ
ョンを行った。
【００５８】菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）入り
ＬＢ寒天培地に播き、生えてくるコロニーをそれぞれ増
殖させプラスミドＤＮＡを調製した。これらの中から、
プラスミドＤＮＡの制限酵素地図、また菌体を０．５ｍ
ＭＩＰＴＧによって４時間誘導した場合に発現するタン
パクの見かけ上の分子量、ならびに抗ＰＬＣ−δ１モノ
クローナル抗体による検出から、目的の欠失変異体であ
るかを検定することができる。 実施例３ レコンビナントＰＬＣ−δ１の発現 ｐＧＳＴ３／ＰＬＣ−δ１を大腸菌ＤＨ５αに形質導入
した。単一コロニーを１００ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＬＢ培地に播き、３７℃で１２時間培
養した。この培養液を９００ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＬＢ培地に加え、さらに１時間３７℃
で旋回培養を行った。この結果ＯＤ６００は０．９にな
った。この培養液を２０℃に冷却し、ＩＰＴＧを０．１
Ｍの終濃度になるように添加しＧＳＴ融合タンパクの発
現を誘導した。
ＬＢ寒天培地に播き、生えてくるコロニーをそれぞれ増
殖させプラスミドＤＮＡを調製した。これらの中から、
プラスミドＤＮＡの制限酵素地図、また菌体を０．５ｍ
ＭＩＰＴＧによって４時間誘導した場合に発現するタン
パクの見かけ上の分子量、ならびに抗ＰＬＣ−δ１モノ
クローナル抗体による検出から、目的の欠失変異体であ
るかを検定することができる。 実施例３ レコンビナントＰＬＣ−δ１の発現 ｐＧＳＴ３／ＰＬＣ−δ１を大腸菌ＤＨ５αに形質導入
した。単一コロニーを１００ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＬＢ培地に播き、３７℃で１２時間培
養した。この培養液を９００ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＬＢ培地に加え、さらに１時間３７℃
で旋回培養を行った。この結果ＯＤ６００は０．９にな
った。この培養液を２０℃に冷却し、ＩＰＴＧを０．１
Ｍの終濃度になるように添加しＧＳＴ融合タンパクの発
現を誘導した。
【００５９】２０℃にてさらに２０時間培養した。培養
液を３００ｍｌ容量の遠心管に分取し、３０００回転で
１０分間遠心した。細胞の沈渣を１０ｍｌの冷リン酸緩
衝液入り生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、硬質ガラス試
験管に移し、プローブ型超音波破砕機で氷上で破砕し
た。破砕条件は５０％間歇で４分間である。
液を３００ｍｌ容量の遠心管に分取し、３０００回転で
１０分間遠心した。細胞の沈渣を１０ｍｌの冷リン酸緩
衝液入り生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、硬質ガラス試
験管に移し、プローブ型超音波破砕機で氷上で破砕し
た。破砕条件は５０％間歇で４分間である。
【００６０】その後、１．２ｍｌの１０％トリトンＸ−
１００を添加し、よく攪拌した後、９７００回転（１０
０００×ｇ）で５分間遠心して上清１２ｍｌを得た。
１００を添加し、よく攪拌した後、９７００回転（１０
０００×ｇ）で５分間遠心して上清１２ｍｌを得た。
【００６１】この上清のタンパク濃度は３４．４ｍｇ／
ｍｌ、総タンパク量は４１２ｍｇであった。この上清に
対して１ｍｌのｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂ樹脂（５０％スラリー：Ｐｈａｒｍａｃｉａ
−ＬＫＢ）を加え、４℃で３時間穏やかに攪拌した。
ｍｌ、総タンパク量は４１２ｍｇであった。この上清に
対して１ｍｌのｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４Ｂ樹脂（５０％スラリー：Ｐｈａｒｍａｃｉａ
−ＬＫＢ）を加え、４℃で３時間穏やかに攪拌した。
【００６２】さらに３０００回転で１０分間遠心し樹脂
を回収した。この樹脂を１２．５ｍｌの冷ＰＢＳで三回
洗浄した後に、内径１ｃｍのミニカラムに充填した。３
ｍｌのＰＢＳでカラム内を３回洗浄した後、５０ｍＭｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），５ｍＭｇｌｕｔａｔｈｉ
ｏｎｅを１ｍｌずつ３回加え、それぞれの溶出液を分画
として回収した。
を回収した。この樹脂を１２．５ｍｌの冷ＰＢＳで三回
洗浄した後に、内径１ｃｍのミニカラムに充填した。３
ｍｌのＰＢＳでカラム内を３回洗浄した後、５０ｍＭｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５），５ｍＭｇｌｕｔａｔｈｉ
ｏｎｅを１ｍｌずつ３回加え、それぞれの溶出液を分画
として回収した。
【００６３】この操作で１３ｍｇのタンパクが樹脂から
遊離したが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）による分析によると、その大部分は推定
分子量約１０３ＫのＧＳＴ−ＰＬＣ−δ１融合タンパク
と判断された。
遊離したが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）による分析によると、その大部分は推定
分子量約１０３ＫのＧＳＴ−ＰＬＣ−δ１融合タンパク
と判断された。
【００６４】この溶出を行った後に、樹脂を３ｍｌの５
０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａ
Ｃｌで洗浄し、さらに３ｍｌの２．５ｍＭＣａＣｌ2 ，
５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５０ｍＭＮａ
Ｃｌを加えて平衡化した。
０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａ
Ｃｌで洗浄し、さらに３ｍｌの２．５ｍＭＣａＣｌ2 ，
５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５０ｍＭＮａ
Ｃｌを加えて平衡化した。
【００６５】この後、カラムの流出口を止め、０．５μ
ｇトロンビン（シグマ社）を含んだ２００μｌの２．５
ｍＭＣａＣｌ2 ，５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１５０ｍＭＮａＣｌを添加し、２５℃で１時間反
応させた。樹脂のベッド容量に対応する５００μｌずつ
５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮ
ａＣｌを６回加え、それぞれの溶出液を分画として回収
した。
ｇトロンビン（シグマ社）を含んだ２００μｌの２．５
ｍＭＣａＣｌ2 ，５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１５０ｍＭＮａＣｌを添加し、２５℃で１時間反
応させた。樹脂のベッド容量に対応する５００μｌずつ
５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮ
ａＣｌを６回加え、それぞれの溶出液を分画として回収
した。
【００６６】この操作ですべての分画を合わせると１４
ｍｇのタンパクが樹脂から遊離したが、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動による分析から、その大部分は推定
分子量約８５ＫＤａのタンパクであり、融合タンパクか
ら切り離されたＰＬＣ−δ１と判断された。 実施例４ ７５ＫＤａ分解産物の生成と分離 上記のトロンビン処理の際に２．５μｇのトロンビンを
含んだ２００μｌの２．５ｍＭＣａＣｌ2 ，５０ｍＭＴ
ｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌを添
加し、同様に反応させた。
ｍｇのタンパクが樹脂から遊離したが、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動による分析から、その大部分は推定
分子量約８５ＫＤａのタンパクであり、融合タンパクか
ら切り離されたＰＬＣ−δ１と判断された。 実施例４ ７５ＫＤａ分解産物の生成と分離 上記のトロンビン処理の際に２．５μｇのトロンビンを
含んだ２００μｌの２．５ｍＭＣａＣｌ2 ，５０ｍＭＴ
ｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌを添
加し、同様に反応させた。
【００６７】上記と同様に得られる画分中にはＳＤＳ−
ＰＡＧＥで推定分子量約８５ＫＤａのタンパクの他に、
推定分子量約７６ＫＤａのものが存在した。
ＰＡＧＥで推定分子量約８５ＫＤａのタンパクの他に、
推定分子量約７６ＫＤａのものが存在した。
【００６８】又は、上記のように精製した８５Ｋタンパ
ク溶液にＣａＣｌ2 を２．５ｍＭになるように加え、さ
らに０．５％（重量比）となるようにトロンビンを加
え、室温で２時間反応させるとＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５
Ｋタンパクのバンドが減少し、推定分子量約７６Ｋのバ
ンドが生成した。
ク溶液にＣａＣｌ2 を２．５ｍＭになるように加え、さ
らに０．５％（重量比）となるようにトロンビンを加
え、室温で２時間反応させるとＳＤＳ−ＰＡＧＥで８５
Ｋタンパクのバンドが減少し、推定分子量約７６Ｋのバ
ンドが生成した。
【００６９】このようにして得られる８５Ｋ／７５Ｋ混
合物（タンパク量で１ｍｇ）１ｍｌを２０ｍＭＴｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ，０．１ｍＭ
ＤＴＴに平衡化したのち、ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換
高速液体クロマトグラフィーで０．１−０．２ＭのＮａ
Ｃｌ濃度勾配で溶出分画した。溶出画分の代表的なもの
（各１ｍｌ）について、２５μｌを使用してＰＩＰ２を
基質としたＰＬＣ活性、また５０μｌを使用して［3
Ｈ］ＩＰ3 結合活性を調べた。 実施例５ 欠失変異体大腸菌発現系の破砕上清の調製：各欠失変異
体プラスミドを大腸菌（ＤＨ５α）に形質導入して得た
もののシングルコロニーを３ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＮＺＣＹＭ培地に播き、３７℃で１０
時間培養した。終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ
を入れ、さらに４時間３７℃で培養した。
合物（タンパク量で１ｍｇ）１ｍｌを２０ｍＭＴｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭＥＤＴＡ，０．１ｍＭ
ＤＴＴに平衡化したのち、ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換
高速液体クロマトグラフィーで０．１−０．２ＭのＮａ
Ｃｌ濃度勾配で溶出分画した。溶出画分の代表的なもの
（各１ｍｌ）について、２５μｌを使用してＰＩＰ２を
基質としたＰＬＣ活性、また５０μｌを使用して［3
Ｈ］ＩＰ3 結合活性を調べた。 実施例５ 欠失変異体大腸菌発現系の破砕上清の調製：各欠失変異
体プラスミドを大腸菌（ＤＨ５α）に形質導入して得た
もののシングルコロニーを３ｍｌのアンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）入りＮＺＣＹＭ培地に播き、３７℃で１０
時間培養した。終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ
を入れ、さらに４時間３７℃で培養した。
【００７０】培養液を２本の１．５ｍｌエッペンドルフ
チューブに分取し、５０００回転で１分遠心した。細胞
沈渣をチューブあたり１５０μｌの冷ＰＢＳに懸濁し、
バス型超音波破砕機（コスモバイオ）で４℃３分間破砕
した。その後、１５０００回転５分の遠心をかけ、上清
のタンパク量を定量した。破砕上清のうちタンパク量に
して１μｇを使用して、［3 Ｈ］ＩＰ3 結合活性を調べ
た。 実施例６ ＰＬＣ−δ１（３０−４０）ペプチドの合成 Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏ
ｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｅｔｈｏ
ｄによりペプチド合成を行った。配列にあるアミノ酸に
対して一残基あたり１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ
酸を使用した。
チューブに分取し、５０００回転で１分遠心した。細胞
沈渣をチューブあたり１５０μｌの冷ＰＢＳに懸濁し、
バス型超音波破砕機（コスモバイオ）で４℃３分間破砕
した。その後、１５０００回転５分の遠心をかけ、上清
のタンパク量を定量した。破砕上清のうちタンパク量に
して１μｇを使用して、［3 Ｈ］ＩＰ3 結合活性を調べ
た。 実施例６ ＰＬＣ−δ１（３０−４０）ペプチドの合成 Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏ
ｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｅｔｈｏ
ｄによりペプチド合成を行った。配列にあるアミノ酸に
対して一残基あたり１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ
酸を使用した。
【００７１】反応担体としてｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔ
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。合成終了後の乾燥レジンの重量は１．００ｇであっ
た。
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。合成終了後の乾燥レジンの重量は１．００ｇであっ
た。
【００７２】合成ペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ切断）を
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。室温で３時間スターラーで攪拌した。
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。室温で３時間スターラーで攪拌した。
【００７３】窒素ガスにてトリフルオロ酢酸を蒸発さ
せ、７０ｍｌの冷ジエチルエーテルで未反応物を抽出し
た。１分ほど攪拌し生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィ
ルター上に回収し、２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３
回ほど洗浄した。フィルター上のペプチドを４０ｍｌの
２Ｎ酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると４７１ｍｇの生
成物が得られた。
せ、７０ｍｌの冷ジエチルエーテルで未反応物を抽出し
た。１分ほど攪拌し生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィ
ルター上に回収し、２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３
回ほど洗浄した。フィルター上のペプチドを４０ｍｌの
２Ｎ酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると４７１ｍｇの生
成物が得られた。
【００７４】この生成物２００ｍｇを蒸留水に溶解し、
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が８１ｍｇ得られた。 実施例７ Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチドの合
成 実施例６同様に配列にあるアミノ酸に対して一残基あた
り１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を使用した。
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が８１ｍｇ得られた。 実施例７ Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチドの合
成 実施例６同様に配列にあるアミノ酸に対して一残基あた
り１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を使用した。
【００７５】反応担体としてｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔ
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。合成終了後の乾燥レジンの重量は１．０４ｇであっ
た。
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。合成終了後の乾燥レジンの重量は１．０４ｇであっ
た。
【００７６】合成ペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ切断）を
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。
【００７７】室温で３時間スターラーで攪拌した。窒素
ガスにてトリフルオロ酢酸を蒸発させ、７０ｍｌの冷ジ
エチルエーテルで未反応物を抽出した。１分ほど攪拌し
生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィルター上に回収し、
２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３回ほど洗浄した。
ガスにてトリフルオロ酢酸を蒸発させ、７０ｍｌの冷ジ
エチルエーテルで未反応物を抽出した。１分ほど攪拌し
生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィルター上に回収し、
２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３回ほど洗浄した。
【００７８】フィルター上のペプチドを４０ｍｌの２Ｎ
酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると４９３ｍｇの生成物
が得られた。
酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると４９３ｍｇの生成物
が得られた。
【００７９】この生成物２００ｍｇを蒸留水に溶解し、
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が３０ｍｇ得られた。 実施例８ Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）
ペプチドの合成 実施例６同様に配列にあるアミノ酸に対して一残基あた
り１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を使用した。
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が３０ｍｇ得られた。 実施例８ Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）
ペプチドの合成 実施例６同様に配列にあるアミノ酸に対して一残基あた
り１．０ｍＭのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸を使用した。
【００８０】反応担体としてｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔ
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。
ｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｐｏｌｙｓｔｙｒ
ｅｎｅ ｒｅｓｉｎ ２７７ｍｇを反応容器の中に入
れ、全自動ペプチド合成機（ＡＢＩ社：モデル４３１
Ａ）にてＦｍｏｃ法プログラムによる合成反応を行っ
た。
【００８１】合成終了後の乾燥レジンの重量は０．９７
ｇであった。合成ペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ切断）を
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。室温で３時間スターラーで攪拌した。
ｇであった。合成ペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ切断）を
行うためにこのレジンをガラスフラスコに入れ、氷上で
０．７５ｇのクロマトグラフィー用結晶フェノール、
０．２５ｍｌのエタンジチオール、０．５ｍｌのチオア
ニソール、０．５ｍｌの蒸留水、１０ｍｌのトリフルオ
ロ酢酸を加えた。室温で３時間スターラーで攪拌した。
【００８２】窒素ガスにてトリフルオロ酢酸を蒸発さ
せ、７０ｍｌの冷ジエチルエーテルで未反応物を抽出し
た。１分ほど攪拌し生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィ
ルター上に回収し、２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３
回ほど洗浄した。フィルター上のペプチドを４０ｍｌの
２Ｎ酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると５６０ｍｇの生
成物が得られた。
せ、７０ｍｌの冷ジエチルエーテルで未反応物を抽出し
た。１分ほど攪拌し生じた白色沈殿を３０μｍ孔のフィ
ルター上に回収し、２０ｍｌの冷ジエチルエーテルで３
回ほど洗浄した。フィルター上のペプチドを４０ｍｌの
２Ｎ酢酸を加え溶出し、凍結乾燥すると５６０ｍｇの生
成物が得られた。
【００８３】この生成物２００ｍｇを蒸留水に溶解し、
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が５７ｍｇ得られた。 実施例９ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）結合ペプチドの作製 １０ｍｇのＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎＶ：シグマ社）を
２ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解した。
μＢｏｎｄａｓｐｈａｒｅ５μ−Ｃ１８−１００Ａの逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社）にて精製した。２８０ｎｍに吸収を
持つ最大ピークを凍結乾燥すると９９％純粋なペプチド
が５７ｍｇ得られた。 実施例９ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）結合ペプチドの作製 １０ｍｇのＢＳＡ（ｆｒａｃｔｉｏｎＶ：シグマ社）を
２ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解した。
【００８４】１ｍｇのｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｂｅｎｚ
ｏｉｃ ａｃｉｄ，Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ（ＭＳＢ）を溶かした６７μｌの
Ｎ，Ｎ′−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅをゆっ
くりと添加し、チューブを室温で３０分旋回させた。
０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡
化したＢｉｏｒａｄ Ｐ−１０カラムにアプライし溶出
させ、活性化ＢＳＡの分画を分取し、タンパク定量を行
った。（全量２ｍｌ）。
ｏｉｃ ａｃｉｄ，Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉ
ｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ（ＭＳＢ）を溶かした６７μｌの
Ｎ，Ｎ′−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅをゆっ
くりと添加し、チューブを室温で３０分旋回させた。
０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡
化したＢｉｏｒａｄ Ｐ−１０カラムにアプライし溶出
させ、活性化ＢＳＡの分画を分取し、タンパク定量を行
った。（全量２ｍｌ）。
【００８５】この中に３．８ｍｇのＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ
−δ１（３０−４３）、またはＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ
１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）の水溶液１００μｌを加
え４℃で一晩振盪した。最終ＢＳＡ濃度が２ｍｇ／ｍｌ
になるようにＰＢＳを加えると、どちらの場合にも１ｍ
ｏｌＢＳＡあたり１３ｍｏｌのペプチドが結合したＢＳ
Ａ溶液５．８ｍｌを得た。 実施例１０ ＫＬＨ−Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）結合
ペプチドの作製 １０ｍｇのＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈ
ｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とクロスリンカーとしてＳｕｌｆ
ｏ−ＭＢＳ３ｍｇをｔｏｔａｌ ４ｍｌ ＰＢＳ中で室
温で１ｈ放置した。この間にＫＬＨ中のアミノ基にＳｕ
ｌｆｏ−ＭＢＳが結合する。遊離のＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ
を除くためゲルロ過を行った。
−δ１（３０−４３）、またはＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ
１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）の水溶液１００μｌを加
え４℃で一晩振盪した。最終ＢＳＡ濃度が２ｍｇ／ｍｌ
になるようにＰＢＳを加えると、どちらの場合にも１ｍ
ｏｌＢＳＡあたり１３ｍｏｌのペプチドが結合したＢＳ
Ａ溶液５．８ｍｌを得た。 実施例１０ ＫＬＨ−Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）結合
ペプチドの作製 １０ｍｇのＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈ
ｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とクロスリンカーとしてＳｕｌｆ
ｏ−ＭＢＳ３ｍｇをｔｏｔａｌ ４ｍｌ ＰＢＳ中で室
温で１ｈ放置した。この間にＫＬＨ中のアミノ基にＳｕ
ｌｆｏ−ＭＢＳが結合する。遊離のＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ
を除くためゲルロ過を行った。
【００８６】ＫＬＨ−ＳｕｌｆｏＭＢＳにペプチド５ｍ
ｇをまぜ合わせ、室温に２ｈ放置した。この間にペプチ
ドのＮ末に余分につけたＣｙｓがＳｕｌｆｏ−ＭＢＳに
結合してＫＬＨ−ｐｅｐｔｉｄｅが生成した。くっつか
なかったペプチドを除くため透析すると、１．７ｍｇ／
ｍｌの濃度で５ｍｌ位、ＫＬＨ−ｐｅｐｔｉｄｅが得ら
れた。 実施例１１ ＫＬＨ−Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）に対
する抗体作製 実施例１０で作製したＫＬＨ結合ＰＬＣ−δ１（３０−
４３）ペプチド含有溶液０．５ｍｌをＣＦＡ０．５ｍｌ
とまぜ合わせ、ウサギに注射した。以後２週間おきにＩ
ＣＦＡ０．５ｍｌとまぜ合わせ追加免疫した。
ｇをまぜ合わせ、室温に２ｈ放置した。この間にペプチ
ドのＮ末に余分につけたＣｙｓがＳｕｌｆｏ−ＭＢＳに
結合してＫＬＨ−ｐｅｐｔｉｄｅが生成した。くっつか
なかったペプチドを除くため透析すると、１．７ｍｇ／
ｍｌの濃度で５ｍｌ位、ＫＬＨ−ｐｅｐｔｉｄｅが得ら
れた。 実施例１１ ＫＬＨ−Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）に対
する抗体作製 実施例１０で作製したＫＬＨ結合ＰＬＣ−δ１（３０−
４３）ペプチド含有溶液０．５ｍｌをＣＦＡ０．５ｍｌ
とまぜ合わせ、ウサギに注射した。以後２週間おきにＩ
ＣＦＡ０．５ｍｌとまぜ合わせ追加免疫した。
【００８７】ブースターを２〜３回行ったところで抗血
清を集めた。予め、ペプチド−レジンと称する抗原カラ
ム（臭化酢酸（ＢｒＣＨ2 ＣＯＯＨ）のＮ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒをＥＡＨ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂレジンと混合。このレジンはアミ
ノ基を有しているのでレジンの先端にＢｒＣＨ2 ＣＯＮ
Ｈ----というように臭化酢酸が結合する。
清を集めた。予め、ペプチド−レジンと称する抗原カラ
ム（臭化酢酸（ＢｒＣＨ2 ＣＯＯＨ）のＮ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒをＥＡＨ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂレジンと混合。このレジンはアミ
ノ基を有しているのでレジンの先端にＢｒＣＨ2 ＣＯＮ
Ｈ----というように臭化酢酸が結合する。
【００８８】これにペプチドを混ぜるとＮ末に余分につ
けたＣｙｓがＢｒと置きかわって結合する。）を作製し
ておき、これに３０ｍｌの抗血清をかけ、０．１７Ｍ
ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）で溶出して、直
ちにＰＢＳに対して透析すると、０．１５ｍｇ／ｍｌで
２ｍｌ、計０．３ｍｇの抗ペプチド抗体が作製された。
けたＣｙｓがＢｒと置きかわって結合する。）を作製し
ておき、これに３０ｍｌの抗血清をかけ、０．１７Ｍ
ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）で溶出して、直
ちにＰＢＳに対して透析すると、０．１５ｍｇ／ｍｌで
２ｍｌ、計０．３ｍｇの抗ペプチド抗体が作製された。
【００８９】ついで、３００μｇのＩｇＧ抗体を３μｇ
ｐａｐａｉｎ（２０ｍＭ ＤＴＴの存在下）で３７
℃、１６ｈ処理した。混合物をゲルロ過して、分子量５
０Ｋ分画を集め、再び抗原カラムにかけた。０．１４ｍ
ｇ／ｍｌで０．４ｍｌ、計５６μｇのＦａｂ抗体が得ら
れた。 実施例１２ ＰＬＣ−δ１（３０−４３）１００ｍｇ、コンドロイチ
ン硫酸ナトリウム１０ｍｇ、乳糖１００ｍｇを５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに溶解し、濾過滅菌
して得た溶液を２．５ｍｌずつバイアルビンに充填し
た。これを凍結乾燥してペプチド製剤を製造した。 実施例１３ ヘパリン２ｍｇを実施例１２のコンドロイチン硫酸ナト
リウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施例１２と同様
に行なった。 実施例１４ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体の１％
水溶液を１０ｍｌバイアルに入れ凍結乾燥した。 実施例１５ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体および
ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテルの最終濃度
がそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌとなるように
リン酸緩衝液で調製したｐＨ６．５の製剤を得た。 実施例１６ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体および
ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルの最終濃
度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うにリン酸緩衝液で調製したｐＨ６．５の製剤を得た。 実験例１ キャリアタンパク結合ペプチドのＩＰ3 結合能 Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）−ＢＳＡ、Ｎ
−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）−ＫＬＨ、Ｎ−
Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）−Ｂ
ＳＡおよびＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）−ＫＬＨを
ＢＳＡあるいはＫＬＨにして最終量０〜８０μｇ／４５
０μｌになるように［3 Ｈ］ＩＰ3 結合アッセイ系（４
５０μｌ）に加え、その［3 Ｈ］ＩＰ3 結合量を測定し
た。
ｐａｐａｉｎ（２０ｍＭ ＤＴＴの存在下）で３７
℃、１６ｈ処理した。混合物をゲルロ過して、分子量５
０Ｋ分画を集め、再び抗原カラムにかけた。０．１４ｍ
ｇ／ｍｌで０．４ｍｌ、計５６μｇのＦａｂ抗体が得ら
れた。 実施例１２ ＰＬＣ−δ１（３０−４３）１００ｍｇ、コンドロイチ
ン硫酸ナトリウム１０ｍｇ、乳糖１００ｍｇを５ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌに溶解し、濾過滅菌
して得た溶液を２．５ｍｌずつバイアルビンに充填し
た。これを凍結乾燥してペプチド製剤を製造した。 実施例１３ ヘパリン２ｍｇを実施例１２のコンドロイチン硫酸ナト
リウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施例１２と同様
に行なった。 実施例１４ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体の１％
水溶液を１０ｍｌバイアルに入れ凍結乾燥した。 実施例１５ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体および
ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテルの最終濃度
がそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌとなるように
リン酸緩衝液で調製したｐＨ６．５の製剤を得た。 実施例１６ 濾過滅菌した抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体および
ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルの最終濃
度がそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うにリン酸緩衝液で調製したｐＨ６．５の製剤を得た。 実験例１ キャリアタンパク結合ペプチドのＩＰ3 結合能 Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）−ＢＳＡ、Ｎ
−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）−ＫＬＨ、Ｎ−
Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）−Ｂ
ＳＡおよびＵＤＰ−ＧＴ（５１６−５２９）−ＫＬＨを
ＢＳＡあるいはＫＬＨにして最終量０〜８０μｇ／４５
０μｌになるように［3 Ｈ］ＩＰ3 結合アッセイ系（４
５０μｌ）に加え、その［3 Ｈ］ＩＰ3 結合量を測定し
た。
【００９０】その結果を図５に示す。
【００９１】ＰＬＣ−δ１（３０−４３）のみが特異的
に［3 Ｈ］ＩＰ3 を結合することがわかる。 実験例２ ＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチドによる［3 Ｈ］Ｉ
Ｐ3 結合亢進効果：通常の［3 Ｈ］ＩＰ3 結合アッセイ
系に１０-10 〜１０-4Ｍに系列希釈したＰＬＣ−δ１
（３０−４３）を加え、精製した８５ＫＤａコンビナン
トＰＬＣ−δ１（０．５μｇ）存在下、あるいは非存在
下で［3 Ｈ］ＩＰ3 結合を解析した。ペプチドは１０μ
Ｍでコントロールの約１６０％、１００μＭでコントロ
ールの約４００％に［3 Ｈ］ＩＰ3 結合を上昇させた。
結果を図７に示す。
に［3 Ｈ］ＩＰ3 を結合することがわかる。 実験例２ ＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチドによる［3 Ｈ］Ｉ
Ｐ3 結合亢進効果：通常の［3 Ｈ］ＩＰ3 結合アッセイ
系に１０-10 〜１０-4Ｍに系列希釈したＰＬＣ−δ１
（３０−４３）を加え、精製した８５ＫＤａコンビナン
トＰＬＣ−δ１（０．５μｇ）存在下、あるいは非存在
下で［3 Ｈ］ＩＰ3 結合を解析した。ペプチドは１０μ
Ｍでコントロールの約１６０％、１００μＭでコントロ
ールの約４００％に［3 Ｈ］ＩＰ3 結合を上昇させた。
結果を図７に示す。
【００９２】このアッセイ系ではペプチドのみはポリエ
チレングリコールによって沈殿しないので（図７○）、
この結果は［3 Ｈ］ＩＰ3 を結合したペプチドがＰＬＣ
−δ１がアソシエートすることによって沈殿する、ある
いは高濃度のペプチド存在下ではペプチドとＰＬＣ−δ
１が複合体を形成し、この複合体がＩＰ3 結合に対する
高親和性を示すからだと考えられる。 実験例３ ＰＬＣ活性に対するペプチドならびにペプチドＢＳＡの
効果：Ｎ−ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）および
Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）
のＰＬＣ活性に対する影響を調べた。
チレングリコールによって沈殿しないので（図７○）、
この結果は［3 Ｈ］ＩＰ3 を結合したペプチドがＰＬＣ
−δ１がアソシエートすることによって沈殿する、ある
いは高濃度のペプチド存在下ではペプチドとＰＬＣ−δ
１が複合体を形成し、この複合体がＩＰ3 結合に対する
高親和性を示すからだと考えられる。 実験例３ ＰＬＣ活性に対するペプチドならびにペプチドＢＳＡの
効果：Ｎ−ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）および
Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）
のＰＬＣ活性に対する影響を調べた。
【００９３】ＰＩＰ2 −ＰＬＣ活性の測定は次のように
行った。
行った。
【００９４】５０μｌの反応溶液中には３７０Ｂｑ
（０．０１μＣｉ）の［3 Ｈ］ＰＩＰ2，２．５μｇＰ
ＩＰ2 ，２５μｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａ
ｎｏｌａｍｉｎｅを懸濁させた２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
ＮａＯＨ（ｐＨ７．２），０．０８％ｓｏｄｉｕｍ ｃ
ｈｏｌａｔｅ，０．８３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，２ｍＭ ＥＧＴＡ，０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ
2 を入れた。またＧＳＴアフィニティーカラムクロマト
グラフィーで精製したレコンビナントＰＬＣ−δ１（１
００ｎｇ）を反応溶液に入れた。
（０．０１μＣｉ）の［3 Ｈ］ＰＩＰ2，２．５μｇＰ
ＩＰ2 ，２５μｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａ
ｎｏｌａｍｉｎｅを懸濁させた２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／
ＮａＯＨ（ｐＨ７．２），０．０８％ｓｏｄｉｕｍ ｃ
ｈｏｌａｔｅ，０．８３ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，２ｍＭ ＥＧＴＡ，０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ
2 を入れた。またＧＳＴアフィニティーカラムクロマト
グラフィーで精製したレコンビナントＰＬＣ−δ１（１
００ｎｇ）を反応溶液に入れた。
【００９５】そしてペプチドの影響を見るために、最終
濃度３６μｇ／μｌになるようにＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−
δ１（３０−４３）あるいはＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１
（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）を添加した。反応はＣａＣ
ｌ2 を反応溶液中に終濃度２ｍＭＣａＣｌ2 になるよう
に加えることで開始し、３７℃１０分行った。
濃度３６μｇ／μｌになるようにＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−
δ１（３０−４３）あるいはＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１
（ｒａｎｄｏｍ３０−４３）を添加した。反応はＣａＣ
ｌ2 を反応溶液中に終濃度２ｍＭＣａＣｌ2 になるよう
に加えることで開始し、３７℃１０分行った。
【００９６】加水分解によって遊離するＩＰ3 を１ｍｌ
のｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｍｅｔｈａｎｏｌ／ＨＣｌ
（１００：１００：０．６）と０．３ｍｌの１ＮＨＣｌ
／５ｍＭ ＥＧＴＡで抽出分離し、水相に回収される分
を液体シンチレーション測定機で測定した。
のｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｍｅｔｈａｎｏｌ／ＨＣｌ
（１００：１００：０．６）と０．３ｍｌの１ＮＨＣｌ
／５ｍＭ ＥＧＴＡで抽出分離し、水相に回収される分
を液体シンチレーション測定機で測定した。
【００９７】
【表１】 表：ペプチドによるＰＩＰ2 −ＰＬＣ活性の亢進 ─────────────────────────────────── sample ＰＩＰ2 加水分解 （dpm/100ng enzyme/10min） ─────────────────────────────────── control(PLC-δ1 only) 5009 ± 872 (n＝4) …Ｐ＜0.005 +N-Cys-PLC-δ1(30-43) 36μg/ml 9768± 976 (n＝2) ……Ｐ＞0.2 +N-Cys-PLC-δ1(random30-43) 36μg/ml 6271±1629 (n＝2) 表に示すようにＮ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（ｒａｎｄｏ
ｍ３０−４３）は活性に対して影響を与えなかったが、
Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）はＰＬＣ−δ
１の酵素活性を有意に亢進した。 実験例４ 実施例３ｈ準じてＰＬＣ−δ１（５０ｎｇ）を用いて行
った、別の実験結果を図８ｈ示す。ＰＩＰ2−ＰＬＣ活
性がペプチドｈより修復されることがわかる。 実験例５ 本発明のペプチドの単回静脈投与毒性をラットを用いて
調べたところ、２０ｍｇ／ｋｇ投与でも死亡するラット
はいなかった。 実験例６ 本発明の抗体の単回静脈投与毒性をラットを用いて調べ
たところ、１００μｇ／ｋｇ投与でも死亡するラットは
いなかった。
ｍ３０−４３）は活性に対して影響を与えなかったが、
Ｎ−Ｃｙｓ−ＰＬＣ−δ１（３０−４３）はＰＬＣ−δ
１の酵素活性を有意に亢進した。 実験例４ 実施例３ｈ準じてＰＬＣ−δ１（５０ｎｇ）を用いて行
った、別の実験結果を図８ｈ示す。ＰＩＰ2−ＰＬＣ活
性がペプチドｈより修復されることがわかる。 実験例５ 本発明のペプチドの単回静脈投与毒性をラットを用いて
調べたところ、２０ｍｇ／ｋｇ投与でも死亡するラット
はいなかった。 実験例６ 本発明の抗体の単回静脈投与毒性をラットを用いて調べ
たところ、１００μｇ／ｋｇ投与でも死亡するラットは
いなかった。
【図１】ＧＳＴ−ＰＬＣ−δ１融合タンパク質およびト
ロンビン分解産物の構造とそれらの生物活性を示す図
ロンビン分解産物の構造とそれらの生物活性を示す図
【図２】ＧＳＴ−ＰＬＣ−δ１融合欠失タンパク質発現
大腸菌破砕溶液分画の［3 Ｈ］−イノシトール三リン酸
（ＩＰ3 ）結合能を示す図
大腸菌破砕溶液分画の［3 Ｈ］−イノシトール三リン酸
（ＩＰ3 ）結合能を示す図
【図３】トロンビン分解産物、８５Ｋおよび７６Ｋタン
パク質のイオン交換クロマトグラフィーによる分離を示
す図
パク質のイオン交換クロマトグラフィーによる分離を示
す図
【図４】ラット脳ＰＬＣ−δ１のアミノ酸配列の一部を
示す図
示す図
【図５】キャリアタンパク結合ペプチドの［3 Ｈ］−Ｉ
Ｐ3 結合能を示す図
Ｐ3 結合能を示す図
【図６】抗ＰＬＣ−δ１（３０−４３）抗体による、レ
コンビナントＰＬＣ−δ１への［3 Ｈ］−ＩＰ3 結合の
阻害を示す図
コンビナントＰＬＣ−δ１への［3 Ｈ］−ＩＰ3 結合の
阻害を示す図
【図７】ＰＬＣ−δ１（３０−４３）ペプチドによる［
3 Ｈ］ＩＰ3 結合亢進効果を示す図
3 Ｈ］ＩＰ3 結合亢進効果を示す図
【図８】ＰＩＰ2−ＰＬＣ活性のＰＬＣδ１（３０−４
３）ペプチドによる修飾を示す図
３）ペプチドによる修飾を示す図
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 39/395 ＡＡＡ Ｄ ＡＥＥ Ｎ // Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ 8318−4Ｈ 16/18 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ ＡＤＵ
Claims (6)
- 【請求項１】 イノシトールリン酸化合物類がその結合
する相手のタンパク質、第１のペプチドなどと結合する
際に、その結合を調節する第２のペプチドを含む医薬組
成物。 - 【請求項２】 イノシトールリン酸化合物類がその結合
する相手のタンパク質、第１のペプチドなどと結合する
際に、その結合を阻害する第２のペプチドに対する抗体
を含む医薬組成物。 - 【請求項３】 請求項１の第２のペプチドがＬｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
なるアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドあるいは該
アミノ酸配列の一部を含むペプチドである請求項１の医
薬組成物。 - 【請求項４】 請求項２の抗体が請求項３のペプチドに
対する抗体である請求項２の医薬組成物。 - 【請求項５】 請求項２の抗体がｗｈｏｌｅ ＩｇＧで
はなく、ｐａｐａｉｎ処理して作製したＩｇＧのＦａｂ
断片である医薬組成物。 - 【請求項６】 請求項５の請求項２の抗体が請求項４の
抗体である医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6200775A JPH0859501A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 医薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6200775A JPH0859501A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 医薬組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0859501A true JPH0859501A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=16429979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6200775A Pending JPH0859501A (ja) | 1994-08-25 | 1994-08-25 | 医薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0859501A (ja) |
-
1994
- 1994-08-25 JP JP6200775A patent/JPH0859501A/ja active Pending
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