JPH0856698A - トリ結核菌群の同定法 - Google Patents
トリ結核菌群の同定法Info
- Publication number
- JPH0856698A JPH0856698A JP6215248A JP21524894A JPH0856698A JP H0856698 A JPH0856698 A JP H0856698A JP 6215248 A JP6215248 A JP 6215248A JP 21524894 A JP21524894 A JP 21524894A JP H0856698 A JPH0856698 A JP H0856698A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mycobacterium avium
- amplification product
- dna
- pcr amplification
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位を含む
３００ｂｐのＤＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマ
ーを用いて、被検菌株の染色体ＤＮＡをポリメレースチ
ェインリアクション法（ＰＣＲ法）により増幅し、その
増幅産物を常法により分析することを特徴とするトリ結
核菌群 (Mycobacterium avium complex)の同定法。 【効果】 これまでトリ結核菌群の同定には、それぞれ
の菌種に特異的な試薬セットが必要であり、操作が煩雑
であったが、本発明によれば簡単に、しかも正確かつ迅
速にトリ結核菌群の群別、同定が可能である。
３００ｂｐのＤＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマ
ーを用いて、被検菌株の染色体ＤＮＡをポリメレースチ
ェインリアクション法（ＰＣＲ法）により増幅し、その
増幅産物を常法により分析することを特徴とするトリ結
核菌群 (Mycobacterium avium complex)の同定法。 【効果】 これまでトリ結核菌群の同定には、それぞれ
の菌種に特異的な試薬セットが必要であり、操作が煩雑
であったが、本発明によれば簡単に、しかも正確かつ迅
速にトリ結核菌群の群別、同定が可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トリ結核菌群の同定法
に関し、詳しくは遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位
のＤＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマーを用いて
トリ結核菌群の染色体ＤＮＡを増幅させ、得られた増幅
産物の分析からトリ結核菌群を同定する方法に関する。
に関し、詳しくは遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位
のＤＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマーを用いて
トリ結核菌群の染色体ＤＮＡを増幅させ、得られた増幅
産物の分析からトリ結核菌群を同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従
来、トリ結核菌群は血清凝集反応により、血清型１〜３
のトリ結核菌と４〜２８のイントラセルラーレ菌に型別
されているが、これらは生化学的性状が非常に類似して
いるため、医学・獣医学分野においてはトリ結核菌群と
して同一群にまとめて扱われてきた。しかし、トリ結核
菌群がトリの結核のみならず、動物及びヒトの抗酸菌
症，反芻獣のヨーネ病もしくはヒトのクローン病の原因
菌として重要視されるに伴い、その疫学的調査，病原因
子解明及び公衆衛生において、簡単で正確かつ迅速な同
定法の開発が要望されるようになってきた。
来、トリ結核菌群は血清凝集反応により、血清型１〜３
のトリ結核菌と４〜２８のイントラセルラーレ菌に型別
されているが、これらは生化学的性状が非常に類似して
いるため、医学・獣医学分野においてはトリ結核菌群と
して同一群にまとめて扱われてきた。しかし、トリ結核
菌群がトリの結核のみならず、動物及びヒトの抗酸菌
症，反芻獣のヨーネ病もしくはヒトのクローン病の原因
菌として重要視されるに伴い、その疫学的調査，病原因
子解明及び公衆衛生において、簡単で正確かつ迅速な同
定法の開発が要望されるようになってきた。
【０００３】そこで、これまでに多くの研究者らによっ
て様々なトリ結核菌群の同定法が提案されてきた。例え
ば、Schaeferら及びTsang らは血清凝集反応及び血清型
特異抗原の薄層クロマトグラフィーによる血清型別法を
確立し、血清型１〜３をトリ結核菌、４〜２８をイント
ラセルラーレ菌と型別した（Schaefer,W.B., MethodsMi
crobiol.,13:324-344.1980; Tsang,A.Y. ら, Int.J.Sys
t.Bacteriol.,33:285-292.1983)。一方、トリに対する
病原性やモルモットに対する皮内反応抗原（sensitine)
の型によって、Anz らはイントラセルラーレ菌を血清型
４〜６と８〜１１の中間型及び血清型７と１２〜２０の
イントラセルラーレ型に分類している（Anz.W.ら,Zbl.B
akt.,I.Abt.Orig. 215:536-549.1970)
て様々なトリ結核菌群の同定法が提案されてきた。例え
ば、Schaeferら及びTsang らは血清凝集反応及び血清型
特異抗原の薄層クロマトグラフィーによる血清型別法を
確立し、血清型１〜３をトリ結核菌、４〜２８をイント
ラセルラーレ菌と型別した（Schaefer,W.B., MethodsMi
crobiol.,13:324-344.1980; Tsang,A.Y. ら, Int.J.Sys
t.Bacteriol.,33:285-292.1983)。一方、トリに対する
病原性やモルモットに対する皮内反応抗原（sensitine)
の型によって、Anz らはイントラセルラーレ菌を血清型
４〜６と８〜１１の中間型及び血清型７と１２〜２０の
イントラセルラーレ型に分類している（Anz.W.ら,Zbl.B
akt.,I.Abt.Orig. 215:536-549.1970)
【０００４】その後、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列やこ
れに対するプローブ及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションの実験で、斎藤ら，Baess ら, Boedinghaus ら
及びWayne らによって、血清型１〜６，８〜１１及び２
１はトリ結核菌であり、血清型７と１２〜２０はイント
ラセルラーレ菌であり、さらにどちらにも属さない群が
あることが提案され、現在ではこれが定説となりつつあ
る（Saito,H.ら, J.Clin.Microbiol.,28:1694-1697.199
0; Baess,I., Acta Pathol.Microbiol.Scand.,91:201-2
03.1983; Boedinghaus,B. ら, FEMS Microbiol.Lett.,7
0:197-204.1990; Wayne,L.G.ら, Int.J.Syst.Bacterio
l.,43:482-489.1993)。また、両菌種を同定するため
に、各菌種に特異的なｒＲＮＡに対するプローブ法や抽
出された染色体ＤＮＡを用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション法が確立されている。なお、第３のどち
らにも属さない群の同定法は、従来の生化学的方法と血
清型別による方法のみである(Dranke T.A.ら, J.Clin.M
icrobiol.,25:1442-1445.1987; Kusunoki,S.ら, J.Cli
n.Microbiol.,29:1596-1603,1991)。
れに対するプローブ及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションの実験で、斎藤ら，Baess ら, Boedinghaus ら
及びWayne らによって、血清型１〜６，８〜１１及び２
１はトリ結核菌であり、血清型７と１２〜２０はイント
ラセルラーレ菌であり、さらにどちらにも属さない群が
あることが提案され、現在ではこれが定説となりつつあ
る（Saito,H.ら, J.Clin.Microbiol.,28:1694-1697.199
0; Baess,I., Acta Pathol.Microbiol.Scand.,91:201-2
03.1983; Boedinghaus,B. ら, FEMS Microbiol.Lett.,7
0:197-204.1990; Wayne,L.G.ら, Int.J.Syst.Bacterio
l.,43:482-489.1993)。また、両菌種を同定するため
に、各菌種に特異的なｒＲＮＡに対するプローブ法や抽
出された染色体ＤＮＡを用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション法が確立されている。なお、第３のどち
らにも属さない群の同定法は、従来の生化学的方法と血
清型別による方法のみである(Dranke T.A.ら, J.Clin.M
icrobiol.,25:1442-1445.1987; Kusunoki,S.ら, J.Cli
n.Microbiol.,29:1596-1603,1991)。
【０００５】本発明は、トリ結核菌とイントラセルラー
レ菌の染色体ＤＮＡを対象としてこれら２菌種の群別，
同定を簡便で正確かつ迅速に実施する方法を確立するこ
とを目的としている。
レ菌の染色体ＤＮＡを対象としてこれら２菌種の群別，
同定を簡便で正確かつ迅速に実施する方法を確立するこ
とを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は遺伝
子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位を含む３００ｂｐのＤ
ＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマーを用いて、被
検菌株の染色体ＤＮＡをポリメレースチェインリアクシ
ョン法（ＰＣＲ法）により増幅し、その増幅産物を常法
により分析することを特徴とするトリ結核菌群の同定法
に関する。
子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位を含む３００ｂｐのＤ
ＮＡ塩基配列を増幅する１対のプライマーを用いて、被
検菌株の染色体ＤＮＡをポリメレースチェインリアクシ
ョン法（ＰＣＲ法）により増幅し、その増幅産物を常法
により分析することを特徴とするトリ結核菌群の同定法
に関する。
【０００７】本発明では、遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の
挿入部位を含む３００ｂｐのＤＮＡ塩基配列を増幅する
１対のプライマーとして、Kunze らが報告した遺伝子挿
入配列ＩＳ９０１の挿入部位の前後３００ｂｐを特異的
に増幅するプライマーＢ（Kunze, Z.Mら,J.Clin.Microb
iol.,30:2366-2372(1992))を使用する。このプライマー
は下記の塩基配列で特定される。 ＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣ ＣＡＡＣＴＣＧＣＧＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ 上記１対のプライマーを用いて被検菌株であるトリ結核
菌群の菌株から抽出した染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により
増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を常法に従って分析す
ることによって、トリ結核菌とイントラセルラーレ菌を
簡単に正確かつ迅速に群別，同定することができる。
挿入部位を含む３００ｂｐのＤＮＡ塩基配列を増幅する
１対のプライマーとして、Kunze らが報告した遺伝子挿
入配列ＩＳ９０１の挿入部位の前後３００ｂｐを特異的
に増幅するプライマーＢ（Kunze, Z.Mら,J.Clin.Microb
iol.,30:2366-2372(1992))を使用する。このプライマー
は下記の塩基配列で特定される。 ＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣ ＣＡＡＣＴＣＧＣＧＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ 上記１対のプライマーを用いて被検菌株であるトリ結核
菌群の菌株から抽出した染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により
増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を常法に従って分析す
ることによって、トリ結核菌とイントラセルラーレ菌を
簡単に正確かつ迅速に群別，同定することができる。
【０００８】プライマーＢによるＰＣＲ増幅産物は、１
７７６ｂｐ，１０７０ｂｐ及び３００ｂｐの３種類の鎖
長を有する。このうち１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が
得られた菌株は、遺伝子挿入配列ＩＳ９０１が存在する
ことを示し、３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた菌
株は、遺伝子挿入配列ＩＳ９０１が挿入される部位の配
列が存在することを示す。また、１０７０ｂｐのＰＣＲ
増幅産物が得られた菌株は、イントラセルラーレ菌特異
的な未報告の遺伝子が存在することを暗示する。なお、
上記の３種類のＰＣＲ増幅産物の鎖長については、実際
の挿入認識配列部位に数ｂｐの長短がある場合もある。
７７６ｂｐ，１０７０ｂｐ及び３００ｂｐの３種類の鎖
長を有する。このうち１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が
得られた菌株は、遺伝子挿入配列ＩＳ９０１が存在する
ことを示し、３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた菌
株は、遺伝子挿入配列ＩＳ９０１が挿入される部位の配
列が存在することを示す。また、１０７０ｂｐのＰＣＲ
増幅産物が得られた菌株は、イントラセルラーレ菌特異
的な未報告の遺伝子が存在することを暗示する。なお、
上記の３種類のＰＣＲ増幅産物の鎖長については、実際
の挿入認識配列部位に数ｂｐの長短がある場合もある。
【０００９】以下に、本発明によるトリ結核菌群の同定
法の具体的手法を示すが、本発明はこれに限定されるも
のではない。 （１）ＤＮＡ抽出 まず、常法により被検菌株を酵素処理した後、ＳＤＳで
溶菌し、ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノ
ール沈澱で分離精製するか、あるいはバイオ・ラッド社
のインスタジーンＤＮＡ精製マトリックスを用いて、被
検菌株からＤＮＡを抽出する。 （２）ＤＮＡ増幅 遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位の前後３００ｂｐ
を特異的に増幅するプライマーＢを用いて、上記の方法
で抽出したＤＮＡからＰＣＲ法により、目的とするＤＮ
Ａを増幅し、特定のＰＣＲ増幅産物を得、そのサイズを
検討する。なお、プライマーの終濃度は１μＭとし、Ge
neAmp （商品名、PCR Reagent Kit 、宝酒造（株）製)
を用い、通常９４℃，１分、６８℃，１分、７２℃，１
分を１サイクルとする３６サイクルで標的ＤＮＡの増幅
を実行する。
法の具体的手法を示すが、本発明はこれに限定されるも
のではない。 （１）ＤＮＡ抽出 まず、常法により被検菌株を酵素処理した後、ＳＤＳで
溶菌し、ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノ
ール沈澱で分離精製するか、あるいはバイオ・ラッド社
のインスタジーンＤＮＡ精製マトリックスを用いて、被
検菌株からＤＮＡを抽出する。 （２）ＤＮＡ増幅 遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位の前後３００ｂｐ
を特異的に増幅するプライマーＢを用いて、上記の方法
で抽出したＤＮＡからＰＣＲ法により、目的とするＤＮ
Ａを増幅し、特定のＰＣＲ増幅産物を得、そのサイズを
検討する。なお、プライマーの終濃度は１μＭとし、Ge
neAmp （商品名、PCR Reagent Kit 、宝酒造（株）製)
を用い、通常９４℃，１分、６８℃，１分、７２℃，１
分を１サイクルとする３６サイクルで標的ＤＮＡの増幅
を実行する。
【００１０】（３）ＤＮＡ検出 ＰＣＲ増幅産物の２％アガロースゲル電気泳動を行い、
エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドの存在の
有無によりＰＣＲ増幅産物を検出する。なお、この際に
分子量マーカーも同時に電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物の
サイズの同定も行う。 （４）トリ結核菌群の同定 上記の電気泳動により判明したＰＣＲ増幅産物のサイズ
から、被検トリ結核菌群の同定を行う。すなわち、被検
菌株のＰＣＲ増幅産物が３００ｂｐまたは１７７６ｂｐ
の鎖長を有するものはトリ結核菌、ＰＣＲ増幅産物が１
０７０ｂｐの鎖長を有するものはイントラセルラーレ菌
と同定する。
エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドの存在の
有無によりＰＣＲ増幅産物を検出する。なお、この際に
分子量マーカーも同時に電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物の
サイズの同定も行う。 （４）トリ結核菌群の同定 上記の電気泳動により判明したＰＣＲ増幅産物のサイズ
から、被検トリ結核菌群の同定を行う。すなわち、被検
菌株のＰＣＲ増幅産物が３００ｂｐまたは１７７６ｂｐ
の鎖長を有するものはトリ結核菌、ＰＣＲ増幅産物が１
０７０ｂｐの鎖長を有するものはイントラセルラーレ菌
と同定する。
【００１１】本発明の方法による同定の対象は実用上、
トリの結核，動物及びヒトの抗酸菌症，反芻獣のヨーネ
病もしくはヒトのクローン病のいずれかの原因菌である
が、その他のトリ結核菌やイントラセルラーレ菌に対し
ても適用することができる。
トリの結核，動物及びヒトの抗酸菌症，反芻獣のヨーネ
病もしくはヒトのクローン病のいずれかの原因菌である
が、その他のトリ結核菌やイントラセルラーレ菌に対し
ても適用することができる。
【００１２】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 試験例１ この例では各種抗酸菌参照株について、プライマーＢを
用いて上記した方法により処理してＰＣＲ増幅産物を得
た後、該ＰＣＲ増幅産物の電気泳動法による分析からト
リ結核菌群の同定を行った。なお、比較のため、プライ
マーＢの代わりに遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の１１０８
ｂｐを特異的に増幅するプライマーＡ（Kunze ら, J.Cl
in.Microbiol.,30:2366-2372(1992)) またはトリ結核菌
の亜種であるヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. p
aratuberculosis)に特異的な遺伝子挿入配列ＩＳ９００
の２２９ｂｐを特異的に増幅するプライマーＣ（Vary
ら,J.Clin.Microbiol.,28:933-937(1990)）を用いて同
様にしてトリ結核菌群の同定を行った。
る。 試験例１ この例では各種抗酸菌参照株について、プライマーＢを
用いて上記した方法により処理してＰＣＲ増幅産物を得
た後、該ＰＣＲ増幅産物の電気泳動法による分析からト
リ結核菌群の同定を行った。なお、比較のため、プライ
マーＢの代わりに遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の１１０８
ｂｐを特異的に増幅するプライマーＡ（Kunze ら, J.Cl
in.Microbiol.,30:2366-2372(1992)) またはトリ結核菌
の亜種であるヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp. p
aratuberculosis)に特異的な遺伝子挿入配列ＩＳ９００
の２２９ｂｐを特異的に増幅するプライマーＣ（Vary
ら,J.Clin.Microbiol.,28:933-937(1990)）を用いて同
様にしてトリ結核菌群の同定を行った。
【００１３】結果を第１表に示した。表から明らかなよ
うに、血清型１〜３の菌株（５株中４株）由来のＤＮＡ
をプライマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ増幅産物に
は遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の保有を示す１７７６ｂｐ
の鎖長のものの存在が確認された。また、血清型１の残
りの１株と血清型４〜６，８〜１１および２１の菌株由
来のＤＮＡをプライマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ
増幅産物には遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位の存
在を示す３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認された。
うに、血清型１〜３の菌株（５株中４株）由来のＤＮＡ
をプライマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ増幅産物に
は遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の保有を示す１７７６ｂｐ
の鎖長のものの存在が確認された。また、血清型１の残
りの１株と血清型４〜６，８〜１１および２１の菌株由
来のＤＮＡをプライマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ
増幅産物には遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位の存
在を示す３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認された。
【００１４】さらに、その他の血清型７，１２〜１７，
１９および２０の菌株由来のＤＮＡからはプライマー
Ａ，ＣではＰＣＲ増幅産物が得られなかったが、プライ
マーＢにより約１０７０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ
た。以上の結果から、これらの菌株をトリ結核菌あるい
はイントラセルラーレ菌と同定することは、前述した斎
藤ら，Baess ら, Boedinghaus ら及びWayne らの報告と
矛盾はなかった。さらに、トリ結核菌の亜種であるヨー
ネ菌の参照株（ATCC19698)からはプライマーＣにより遺
伝子挿入配列ＩＳ９００の保有を示す２２９ｂｐ及びプ
ライマーＢにより３００ｂｐの増幅産物が得られた。ま
た、かってはヨーネ病とされていたが、最近の知見から
トリ結核菌とされるべきＰ−１８，Ｔｅｐｓ及びＰ−１
０株はプライマーＢにより遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の
保有を示す１７７６ｂｐの鎖長のＰＣＲ増幅産物が得ら
れた。
１９および２０の菌株由来のＤＮＡからはプライマー
Ａ，ＣではＰＣＲ増幅産物が得られなかったが、プライ
マーＢにより約１０７０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られ
た。以上の結果から、これらの菌株をトリ結核菌あるい
はイントラセルラーレ菌と同定することは、前述した斎
藤ら，Baess ら, Boedinghaus ら及びWayne らの報告と
矛盾はなかった。さらに、トリ結核菌の亜種であるヨー
ネ菌の参照株（ATCC19698)からはプライマーＣにより遺
伝子挿入配列ＩＳ９００の保有を示す２２９ｂｐ及びプ
ライマーＢにより３００ｂｐの増幅産物が得られた。ま
た、かってはヨーネ病とされていたが、最近の知見から
トリ結核菌とされるべきＰ−１８，Ｔｅｐｓ及びＰ−１
０株はプライマーＢにより遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の
保有を示す１７７６ｂｐの鎖長のＰＣＲ増幅産物が得ら
れた。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】図１は、血清型別の菌株由来ＤＮＡをプラ
イマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ増幅産物のサイズ
を検討したアガロース電気泳動の写真である。１７７６
ｂｐのバンドはＩＳ９０１のＤＮＡ塩基配列由来のバン
ドであり、３００ｂｐのバンドはＩＳ９０１が挿入する
部位の上流と下流それぞれ１５０ｂｐのＤＮＡ塩基配列
由来のバンドである。また、１７７６ｂｐと３００ｂｐ
の間のバンドはイントラセルラーレ菌に特異的なバンド
である。図１の各レーンは以下の菌株由来のＰＣＲ増幅
産物を示す。なお、（ ）内の数値は血清型を示す。 レーン１:ATCC 15769(1)，レーン２:11907-300(1),レー
ン３:14141-1395(2)，レーン４:6195(3), レーン５:128
-Germany(3),レーン６:13528-1079(4), レーン７:4443-
1237(5),レーン８:34540(6),レーン９:Manten 157(7),
レーン10:14658-1686(8), レーン11:6450-204(9), レー
ン12:1602-1965(10), レーン13:14186-1424(11),レーン
14:P42(12), レーン15:Chance(13),レーン16:P39(14)
イマーＢを用いて増幅して得たＰＣＲ増幅産物のサイズ
を検討したアガロース電気泳動の写真である。１７７６
ｂｐのバンドはＩＳ９０１のＤＮＡ塩基配列由来のバン
ドであり、３００ｂｐのバンドはＩＳ９０１が挿入する
部位の上流と下流それぞれ１５０ｂｐのＤＮＡ塩基配列
由来のバンドである。また、１７７６ｂｐと３００ｂｐ
の間のバンドはイントラセルラーレ菌に特異的なバンド
である。図１の各レーンは以下の菌株由来のＰＣＲ増幅
産物を示す。なお、（ ）内の数値は血清型を示す。 レーン１:ATCC 15769(1)，レーン２:11907-300(1),レー
ン３:14141-1395(2)，レーン４:6195(3), レーン５:128
-Germany(3),レーン６:13528-1079(4), レーン７:4443-
1237(5),レーン８:34540(6),レーン９:Manten 157(7),
レーン10:14658-1686(8), レーン11:6450-204(9), レー
ン12:1602-1965(10), レーン13:14186-1424(11),レーン
14:P42(12), レーン15:Chance(13),レーン16:P39(14)
【００１８】図２は、プライマーＢによるＰＣＲ増幅産
物について分子量測定用マーカーの各バンドと比較した
電気泳動写真である。レーン１はトリ結核菌群 ATCC 15
769(1) 由来の、レーン２はトリ結核菌群 11907-300
(1)由来の、レーン３はトリ結核菌群 P39 (14) 由来の
ＰＣＲ増幅産物を示す。なお、（ ）内の数値は血清型
を示す。レーン４は分子量マーカー pHYである。
物について分子量測定用マーカーの各バンドと比較した
電気泳動写真である。レーン１はトリ結核菌群 ATCC 15
769(1) 由来の、レーン２はトリ結核菌群 11907-300
(1)由来の、レーン３はトリ結核菌群 P39 (14) 由来の
ＰＣＲ増幅産物を示す。なお、（ ）内の数値は血清型
を示す。レーン４は分子量マーカー pHYである。
【００１９】図３は、上記のプライマーＢによる３００
ｂｐ，１０７０ｂｐ及び１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物
を制限酵素ＢｃｌＩ，ＨｉｎｆＩ及びＫｐｌＩで切断
し、切断の有無と切断断片の長さを測定するためアガロ
ース電気泳動した写真である。１０７０ｂｐのＰＣＲ増
幅産物の制限酵素切断パターンは３００ｂｐ及び１７７
６ｂｐのＰＣＲ増幅産物のパターンとは異なり、１０７
０ｂｐのＰＣＲ増幅産物がイントラセルラーレ菌に特異
的な産物であることが判明した。なお、図３の各レーン
は以下のように各ＰＣＲ増幅産物をそれぞれの制限酵素
で切断したことを示す。 １：pHY 分子量マーカー，２：1070bp BclＩ消化，３：
1070bp HinfI消化，４：1070bp KplＩ消化，５：1070bp
無処理，６：1776bp BclＩ消化，７：1776bpHinfI消
化，８：1776bp KplＩ消化，９：1776bp 無処理，10：
300bp BclＩ消化，11： 300bp HinfI消化，12： 300bp
KplＩ消化，13： 300bp 無処理，14：pHY 分子量マー
カー
ｂｐ，１０７０ｂｐ及び１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物
を制限酵素ＢｃｌＩ，ＨｉｎｆＩ及びＫｐｌＩで切断
し、切断の有無と切断断片の長さを測定するためアガロ
ース電気泳動した写真である。１０７０ｂｐのＰＣＲ増
幅産物の制限酵素切断パターンは３００ｂｐ及び１７７
６ｂｐのＰＣＲ増幅産物のパターンとは異なり、１０７
０ｂｐのＰＣＲ増幅産物がイントラセルラーレ菌に特異
的な産物であることが判明した。なお、図３の各レーン
は以下のように各ＰＣＲ増幅産物をそれぞれの制限酵素
で切断したことを示す。 １：pHY 分子量マーカー，２：1070bp BclＩ消化，３：
1070bp HinfI消化，４：1070bp KplＩ消化，５：1070bp
無処理，６：1776bp BclＩ消化，７：1776bpHinfI消
化，８：1776bp KplＩ消化，９：1776bp 無処理，10：
300bp BclＩ消化，11： 300bp HinfI消化，12： 300bp
KplＩ消化，13： 300bp 無処理，14：pHY 分子量マー
カー
【００２０】図４は、プライマーＢによるＰＣＲ増幅産
物１７７６ｂｐの制限酵素切断地図である。なお、１７
７６ｂｐは遺伝子挿入配列ＩＳ９０１とその挿入認識配
列の上流１５０ｂｐと下流１５０ｂｐよりなる。
物１７７６ｂｐの制限酵素切断地図である。なお、１７
７６ｂｐは遺伝子挿入配列ＩＳ９０１とその挿入認識配
列の上流１５０ｂｐと下流１５０ｂｐよりなる。
【００２１】実施例１ 豚抗酸菌症が発生した豚及び飼養環境から抗酸菌１２０
株を分離した。これらの菌株は使用するまで−８０℃に
保存され、使用前にミドルプルーク７Ｈ１１寒天培地
（ＯＡＤＣエンリッチメント添加）で継代してコロニー
を確認した。分離菌株は、斎藤らの方法（斎藤ら，臨床
検査，26:1539-1544(1982)）に従って生化学的性状検査
を行い、モノクローナル抗体を使った菌体凝集反応と血
清型特異的糖脂質の薄層クロマトグラムにより血清型を
決定し、菌株を同定した。
株を分離した。これらの菌株は使用するまで−８０℃に
保存され、使用前にミドルプルーク７Ｈ１１寒天培地
（ＯＡＤＣエンリッチメント添加）で継代してコロニー
を確認した。分離菌株は、斎藤らの方法（斎藤ら，臨床
検査，26:1539-1544(1982)）に従って生化学的性状検査
を行い、モノクローナル抗体を使った菌体凝集反応と血
清型特異的糖脂質の薄層クロマトグラムにより血清型を
決定し、菌株を同定した。
【００２２】（１）ＤＮＡ抽出 ２００μｌのバイオ・ラッド社のインスタジーンＤＮＡ
精製マトリックスに１〜１０個の被検菌株コロニーを浮
遊し、５６℃で３０分処理した。１０秒間ボルテックス
でミックスし、１００℃で８分処理した後、再度１０秒
間ボルテックスでミックスし、１７，０００×ｇで５分
遠心分離後、得られた上清をＤＮＡ抽出溶液とした。 （２）ＰＣＲの実施 プライマーＢを用いて、上記の方法で抽出したＤＮＡか
らＰＣＲ法により、目的とするＤＮＡを増幅し、特定の
ＰＣＲ増幅産物を得た。なお、ＰＣＲの条件は試験例１
と同様に行った。 （３）ＤＮＡ検出 ＰＣＲ増幅産物の２％アガロースゲル電気泳動を行い、
エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドを検出し
た。ＰＣＲ増幅産物の分布の結果を第２表に示した。表
から明らかなように、豚抗酸菌症由来抗酸菌１２０株中
トリ結核菌群１０７株と未同定３株から３００ｂｐのＰ
ＣＲ増幅産物が確認された。
精製マトリックスに１〜１０個の被検菌株コロニーを浮
遊し、５６℃で３０分処理した。１０秒間ボルテックス
でミックスし、１００℃で８分処理した後、再度１０秒
間ボルテックスでミックスし、１７，０００×ｇで５分
遠心分離後、得られた上清をＤＮＡ抽出溶液とした。 （２）ＰＣＲの実施 プライマーＢを用いて、上記の方法で抽出したＤＮＡか
らＰＣＲ法により、目的とするＤＮＡを増幅し、特定の
ＰＣＲ増幅産物を得た。なお、ＰＣＲの条件は試験例１
と同様に行った。 （３）ＤＮＡ検出 ＰＣＲ増幅産物の２％アガロースゲル電気泳動を行い、
エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドを検出し
た。ＰＣＲ増幅産物の分布の結果を第２表に示した。表
から明らかなように、豚抗酸菌症由来抗酸菌１２０株中
トリ結核菌群１０７株と未同定３株から３００ｂｐのＰ
ＣＲ増幅産物が確認された。
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例２ 神戸環境衛生研究所より分与されたヒト由来のトリ結核
菌群の１５菌株を用いて実施例１と同様に行った。ＰＣ
Ｒ増幅産物の分布の結果を第３表に示した。表から明ら
かなように、ヒト由来トリ結核菌群１５株中の血清型
１，２，８の７株及び未同定３株から３００ｂｐあるい
は１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、血清型１
５の２株から１０７０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確かめら
れた。
菌群の１５菌株を用いて実施例１と同様に行った。ＰＣ
Ｒ増幅産物の分布の結果を第３表に示した。表から明ら
かなように、ヒト由来トリ結核菌群１５株中の血清型
１，２，８の７株及び未同定３株から３００ｂｐあるい
は１７７６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確認され、血清型１
５の２株から１０７０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が確かめら
れた。
【００２５】
【表４】
【００２６】実施例３ ヨーネ病汚染牛群の糞便を常法に従いＨＰＣで処理し、
マイコバクチン加ハロルドの卵黄培地で３７℃にて６〜
１２週間培養し、検出されたコロニーをヨーネ病汚染牛
群由来野外分離抗酸菌株として２７株用い、実施例１と
同様に行った。ＰＣＲ増幅産物の分布の結果を第４表に
示した。表から明らかなように、２７株中２２株はトリ
結核菌の亜種であるヨーネ菌と同定された。この２２株
の全てにプライマーＢにより３００ｂｐのＰＣＲ増幅産
物が確認された。このことにより、ヨーネ菌を種レベル
で同定できることが確認された。羊や山羊のヨーネ病へ
の関与が疑われているシリバチカム菌（Mycobacterium
avium subsp. silvaticum)は遺伝子挿入配列ＩＳ９０１
を保有しているとの報告もあり、この亜種の同定に威力
を発揮する可能性がある。
マイコバクチン加ハロルドの卵黄培地で３７℃にて６〜
１２週間培養し、検出されたコロニーをヨーネ病汚染牛
群由来野外分離抗酸菌株として２７株用い、実施例１と
同様に行った。ＰＣＲ増幅産物の分布の結果を第４表に
示した。表から明らかなように、２７株中２２株はトリ
結核菌の亜種であるヨーネ菌と同定された。この２２株
の全てにプライマーＢにより３００ｂｐのＰＣＲ増幅産
物が確認された。このことにより、ヨーネ菌を種レベル
で同定できることが確認された。羊や山羊のヨーネ病へ
の関与が疑われているシリバチカム菌（Mycobacterium
avium subsp. silvaticum)は遺伝子挿入配列ＩＳ９０１
を保有しているとの報告もあり、この亜種の同定に威力
を発揮する可能性がある。
【００２７】
【表５】
【００２８】
【発明の効果】これまでトリ結核菌群の同定には、それ
ぞれの菌種に特異的な試薬セットが必要であり、操作が
煩雑であったが、本発明によれば簡単に、しかも正確か
つ迅速にトリ結核菌群の群別、同定が可能である。
ぞれの菌種に特異的な試薬セットが必要であり、操作が
煩雑であったが、本発明によれば簡単に、しかも正確か
つ迅速にトリ結核菌群の群別、同定が可能である。
【図１】 トリ結核菌群の各血清型参照株から抽出され
たＤＮＡをプライマーＢで増幅し、そのＰＣＲ増幅産物
をアガロースゲル電気泳動した結果の写真である。
たＤＮＡをプライマーＢで増幅し、そのＰＣＲ増幅産物
をアガロースゲル電気泳動した結果の写真である。
【図２】 プライマーＢによるＰＣＲ増幅産物をアガロ
ースゲル電気泳動し、その分子量を測定した結果の写真
である。
ースゲル電気泳動し、その分子量を測定した結果の写真
である。
【図３】 プライマーＢによるＰＣＲ増幅産物の制限酵
素切断パターンのアガロースゲル電気泳動写真である。
素切断パターンのアガロースゲル電気泳動写真である。
【図４】 プライマーＢによるＰＣＲ増幅産物１７７６
ｂｐの制限酵素切断地図である。
ｂｐの制限酵素切断地図である。
Ｂ：ＢｃｌＩ Ｈ：ＨｉｎｆＩ Ｋ：ＫｐｌＩ □：遺伝子挿入配列ＩＳ９０１ ■：上記挿入配列の挿入認識配列の上流１５０ｂｐと下
流１５０ｂｐ 矢印（→と←）：一対のプライマーＢ
流１５０ｂｐ 矢印（→と←）：一対のプライマーＢ
Claims (4)
- 【請求項１】 遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位を
含む３００ｂｐのＤＮＡ塩基配列を増幅する１対のプラ
イマーを用いて、被検菌株の染色体ＤＮＡをポリメレー
スチェインリアクション法（ＰＣＲ法）により増幅し、
その増幅産物を常法により分析することを特徴とするト
リ結核菌群 (Mycobacterium avium complex)の同定法。 - 【請求項２】 トリ結核菌群が、トリ結核菌（Mycobact
erium avium)及びイントラセルラーレ菌 (Mycobacteriu
m intracellulare) である請求項１記載の同定法。 - 【請求項３】 トリ結核菌由来のＰＣＲ増幅産物が、遺
伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位を含む３００ｂｐま
たは遺伝子挿入配列ＩＳ９０１の挿入部位及び遺伝子挿
入配列ＩＳ９０１を含む１７７６ｂｐの鎖長を有するも
のであり、イントラセルラーレ菌由来のＰＣＲ増幅産物
が遺伝子挿入配列ＩＳ９０１とは異なる制限酵素切断パ
ターンをもつ１０７０ｂｐの鎖長を有するものである請
求項１記載のトリ結核菌群の同定法。 - 【請求項４】 被検菌株がトリの結核，動物及びヒトの
抗酸菌症，反芻獣のヨーネ病もしくはヒトのクローン病
のいずれかの原因菌である請求項１記載のトリ結核菌群
の同定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06215248A JP3111213B2 (ja) | 1994-08-18 | 1994-08-18 | トリ結核菌群の同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06215248A JP3111213B2 (ja) | 1994-08-18 | 1994-08-18 | トリ結核菌群の同定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856698A true JPH0856698A (ja) | 1996-03-05 |
| JP3111213B2 JP3111213B2 (ja) | 2000-11-20 |
Family
ID=16669175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06215248A Expired - Lifetime JP3111213B2 (ja) | 1994-08-18 | 1994-08-18 | トリ結核菌群の同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3111213B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100805054B1 (ko) * | 2000-10-30 | 2008-02-20 | 켐트라 코포레이션 | 싸이징 조성물 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101432426B (zh) | 2006-05-02 | 2012-09-19 | 和光纯药工业株式会社 | 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法 |
| US9567647B2 (en) | 2006-12-18 | 2017-02-14 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of Mycobacterium avium and method for detection of Mycobacterium avium by using the primer or probe |
| EP2284262A4 (en) | 2008-05-28 | 2012-02-22 | Wako Pure Chem Ind Ltd | PRIMER AND PROBE FOR DETECTION OF MYCOBACTERIUM INTRACELLULARE, AND METHOD FOR DETECTION OF MYCOBACTERIUM INTRACELLULARE USING THE PRIMER OR PROBE |
-
1994
- 1994-08-18 JP JP06215248A patent/JP3111213B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY=1992 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100805054B1 (ko) * | 2000-10-30 | 2008-02-20 | 켐트라 코포레이션 | 싸이징 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3111213B2 (ja) | 2000-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Johnson et al. | Natural atypical Listeria innocua strains with Listeria monocytogenes pathogenicity island 1 genes | |
| Rodriguez et al. | Species-specific identification of Mycobacterium bovis by PCR | |
| Aranaz et al. | Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae subsp. nov.: a taxonomic study of a new member of the Mycobacterium tuberculosis complex isolated from goats in Spain | |
| Stinear et al. | Identification and characterization of IS 2404 and IS 2606: two distinct repeated sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR | |
| McNabb et al. | Assessment of partial sequencing of the 65-kilodalton heat shock protein gene (hsp65) for routine identification of Mycobacterium species isolated from clinical sources | |
| Coetsier et al. | Duplex PCR for differential identification of Mycobacterium bovis, M. avium, and M. avium subsp. paratuberculosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues from cattle | |
| Kubica et al. | Mycobacterium bovis subsp. caprae caused one-third of human M. bovis-associated tuberculosis cases reported in Germany between 1999 and 2001 | |
| Torriani et al. | Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis | |
| Englund et al. | Single PCR and nested PCR with a mimic molecule for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
| Magdalena et al. | Specific differentiation between Mycobacterium bovis BCG and virulent strains of the Mycobacterium tuberculosis complex | |
| Ventura et al. | Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences | |
| Miyamoto et al. | Enterotoxigenic Clostridium perfringens: detection and identification | |
| Magdalena et al. | Identification of a new DNA region specific for members of Mycobacterium tuberculosis complex | |
| Wilson et al. | Clinical application of PCR-restriction enzyme pattern analysis for rapid identification of aerobic actinomycete isolates | |
| Kumar et al. | Rapid detection of Mannheimia haemolytica in lung tissues of sheep and from bacterial culture | |
| Shimoji et al. | Use of an enrichment broth cultivation-PCR combination assay for rapid diagnosis of swine erysipelas | |
| Afshari et al. | Genotyping of Clostridium perfringens isolated from broiler meat in northeastern of Iran | |
| Magee et al. | Mycobacterium | |
| Sales et al. | Evaluation of molecular markers for the diagnosis of Mycobacterium bovis | |
| Castellanos et al. | Discovery of stable and variable differences in the Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis type I, II, and III genomes by pan-genome microarray analysis | |
| Thabet et al. | Transposition mechanism, molecular characterization and evolution of IS 6110, the specific evolutionary marker of Mycobacterium tuberculosis complex | |
| Marsh et al. | Genomic diversity in Mycobacterium avium: single nucleotide polymorphisms between the S and C strains of M. avium subsp. paratuberculosis and with M. a. avium | |
| Vera-Cabrera et al. | Phospholipase region of Mycobacterium tuberculosis is a preferential locus for IS 6110 transposition | |
| Eslami et al. | Identification of Listeria monocytogenes virulence factors in women with abortion by polymerase chain reaction | |
| Oliveira et al. | Identification of Mycobacterium avium genotypes with distinctive traits by combination of IS 1245-based restriction fragment length polymorphism and restriction analysis of hsp65 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |