JPH0856677A - ファージミドの集合、ファージミドを有する大腸菌細胞の集合、前記集合から生産されるファージミド粒子、ファージミド粒子の集合、ファージミド粒子の集合の分離方法、並びにリガンドタンパク質 - Google Patents

ファージミドの集合、ファージミドを有する大腸菌細胞の集合、前記集合から生産されるファージミド粒子、ファージミド粒子の集合、ファージミド粒子の集合の分離方法、並びにリガンドタンパク質

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JPH0856677A
JPH0856677A JP7140935A JP14093595A JPH0856677A JP H0856677 A JPH0856677 A JP H0856677A JP 7140935 A JP7140935 A JP 7140935A JP 14093595 A JP14093595 A JP 14093595A JP H0856677 A JPH0856677 A JP H0856677A
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protein
conglomerate
bacteriophage
ligand
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ジョン・コリンズ
Roettgen Peter
ペーター・ロエットゲン
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 種々の領域が広い面積に広がっている大きな
分子を使用する従来のシステムを相補う代りのシステム
と見なすべき、コンパクトな標的部位を目指したリガン
ドを提供する。 【構成】 本発明によるファージの集合は、プロモータ
と、リガンドタンパク質がプロセスした状態に於いて４
０乃至６０のアミノ酸残基とバクテリオファージタンパ
ク質とを含むようにする、リガンドタンパク質同志の融
合用遺伝子と、少なくとも１個の転写終結配列と、一本
鎖バクテリオファージから誘導された複製起点と、プラ
スミド複製起点と、任意の少なくとも１個の選択マーカ
ーとを含む。更に本発明は前記ファージミドの集合を代
表する大腸菌クローン又は細胞、所定の目標分子に対し
て強い結合特性を示すファージミド粒子を分離するプロ
セス、本発明の集合の使用、及び前記プロセスで得られ
たファージミド粒子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ファージミドの集合、
ファージミドを有する大腸菌の集合、前記集合から生産
されるファージミド粒子、ファージミド粒子の集合、フ
ァージミド粒子の集合の分離方法、並びにリガンドタン
パク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近抗体の自然の生産の際に生ずる構造
の広いレパートリーを真似るか又は直接使用する実験シ
ステムが開発され、このレパートリーは、免疫グロブリ
ンの短い鎖と長い鎖とを混合することによる、又普通は
内在性抗原と交差反応するために除去される変異体をも
含む野性型レパートリー（例えばIgM)を取り入れること
による追加の結合性成分の導入によって拡大された。
【０００３】更にM13-融合ファージの上に現れた突然変
異好中球エラスターゼを選択して、タンパク質を目指し
た方向に進化させる報告もある(23)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしこの公知のシス
テムの安定性には問題がある。本発明の目的は、種々の
領域が広い面積に広がっている大きな分子を使用する従
来のシステムを相補う代りのシステムと見なすべき、コ
ンパクトな標的部位を目指したリガンドを選択すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の基礎となったこ
の問題は、本発明の一実施態様によれば、プロモータ、
リガンドタンパク質がプロセスした状態に於いて４０乃
至６０のアミノ酸残基と繊維状一本鎖ＤＮＡバクテリオ
ファージタンパク質とを含むようにする、リガンドタン
パク質同志の融合用遺伝子コード少なくとも１個の転写
終結配列、繊維状一本鎖ＤＮＡバクテリオファージから
誘導された複製起点、プラスミド複製起点、及び任意の
少なくとも１個の選択マーカーを含むファージミドの集
合により解決された。
【０００６】好ましい一実施態様によれば、前記ファー
ジミドに対しプロモータとしてλＰ L - プロモータが用
いられる。
【０００７】好ましくは、前記リガンドタンパク質はヒ
ト膵臓分泌性トリプシンインヒビター(hPSTI) の変異体
又はウシ膵臓トリプシンインヒビター (bPTI) の変異体
である。
【０００８】hPSTI と bPTI とに関しては次の従来技術
を引用する。 hPSTI:イギリス特許(A) 第 8 700 204号、 bPTI: Markland等、Gene, 109 (1991) 13-19及びMarks
等、J. Biol. Chem.,261 (1986) 7115-7118。
【０００９】前記リガンドタンパク質は、トリプシン阻
害ループがランダムに修飾され、特にアミノ酸１７乃至
２３の領域の中でランダムに修飾されたhPSTI の変異体
であってもよい。
【００１０】本発明のもう一つの実施態様は、前記ファ
ージミドがプラスミドの形で含まれている、本発明のフ
ァージミドの集合を代表する大腸菌クローン又は細胞の
集合を提供する。
【００１１】前記大腸菌のクローン又は細胞が、大腸菌
ＷＫ６及び特に大腸菌 WK6 (λ)mutS のようなλリプレ
ッサーを含む菌株に属することが好ましい。
【００１２】本発明のもう一つの実施態様は、ファージ
ミド粒子の集合を提供し、その場合ファージミド粒子は
本発明の大腸菌のクローン又は細胞の集合から生産され
る。
【００１３】本発明のもう一つの実施態様は、所定の標
的分子に対して強い結合特性を有するファージミド粒子
を分離するための方法を提供する。この方法は次の段階
を特徴とする、(a) 本発明のファージミド粒子の集合
を、前記標的分子の存在の許で、それ自体は公知の親和
性増強方法により処理し、(b) 結合性の強いファージ
ミド粒子のサブ集合を大腸菌によりそれ自体は公知の方
法で増幅し、(c) 段階(a) と(b) とを任意に繰り返
し、(d) 前記標的分子に対して強い結合特性を示す１
個又は少数のファージミド粒子を分離する。
【００１４】本発明のもう一つの実施態様は、所定の標
的分子に対して強い結合特性を示すファージミド粒子を
提供する。この場合のファージミド粒子は本発明の前記
プロセスによって得られる。所定の標的分子としてαキ
モトリプシン又はエラスターゼのようなプロテアーゼに
対して強い結合特性を示すファージミド粒子が好まし
い。
【００１５】最後に本発明のもう一つの実施態様は、本
発明のファージミド粒子から誘導することができ、バク
テリオファージ pIII タンパク質のようなバクテリオフ
ァージタンパク質が同時に生成することのない、次の方
法で生産することのできる精製リガンドタンパク質を提
供する、ハイブリッドタンパク質のタンパク質分解によ
る切断、リガンドタンパク質のためのコード領域とバク
テリオファージ pIII タンパク質のようなバクテリオフ
ァージタンパク質のためのコード領域との間に停止コド
ンを導入、又はリガンドタンパク質遺伝子又はその一部
をその他の発現ベクターへサブクローニング。
【００１６】〔発明の構成〕本発明を更に良く理解でき
るように先ず次の用語を説明する。 ファージミドとファスミド：これは同一である。 繊維状一本鎖バクテリオファージ：M13, fd 及び f1 が
一本鎖バクテリオファージの例で、これらは少数の塩基
の突然変異が異なっているだけで、事実上相互に交換可
能である。 重感染：バクテリオファージによる重感染とは既にファ
ージミドを有する細菌培養にバクテリオファージを更に
追加することである。細胞の感染の際、バクテリオファ
ージは一本鎖の複製に必要な機能と一本鎖ＤＮＡ産物の
パッケージングに必要な被覆タンパク質とを提供し、こ
れらの粒子は媒体の中に分泌される。このプロセスの間
培養細胞は溶解せず、従って一方では両方の細菌クロー
ン、他方ではバクテリオファージとファージミド粒子を
同じ培養から分離できる。 リガンド：これは特定の標的分子に特異的に結合できる
分子のことである。本発明の文脈に於いてはリガンドは
ファージミド粒子の表面に現れる。特定の部位でリガン
ドのための遺伝子をランダムに突然変異することによ
り、リガンド変異体の大きなライブラリーが作られる。 パニング：パニングとは標的分子を被覆した表面にファ
ージミドを吸着するプロセスのことで、このプロセスに
はその後の強く結合したファージミドを例えば弱酸を加
えて洗浄して特異的に溶離することが含まれる。
【００１７】ここでファージミドとは、プラスミド複製
起点の他に、一本鎖バクテリオファージから誘導された
第二の複製起点を含む細菌プラスミドのことである。そ
のようなファージミドを有する細胞は、M13 又はその誘
導体のようなヘルパーバクテリオファージによる重感染
に於いて一本鎖複製モードを介して [ファージミドを]
複製することができ、その結果がバクテリオファージ被
覆タンパク質により被覆された感染性粒子の中にパッケ
ージされた一本鎖ファージミドＤＮＡである。このよう
にしてファージミドＤＮＡを（ｉ）二本鎖ＤＮＡをプラ
スミドの形で有する安定な細菌クローンの中に、又は
（ii）重感染した培養の上清からのバクテリオファージ
状の粒子として形成できる。後者の場合の粒子はそのＤ
ＮＡをＦ性線毛を有する大腸菌株の中に（感染のための
公知の前提条件として）注入することができ、そこで粒
子自体がプラスミドとして再形成される。特殊の産物、
即ちリガンドを表示するために使用できるファージミド
の特徴は、表示すべき産物のための遺伝子とバクテリオ
ファージ被覆タンパク質遺伝子との間の融合から成る遺
伝子がファージミドの上に存在していることである。そ
のようなバクテリオファージ被覆タンパク質遺伝子の一
例が gpIIIで、これはファージ M13又は fd の被覆タン
パク質III(p III ）用の遺伝子である。これは、M13 類
似のファージによる重感染の際にファージミド粒子の生
産に於いて、リガンドがバクテリオファージ被覆タンパ
ク質を介して、リガンドをコードする遺伝子に物理的に
結合している上清の中で生成する。特異の部位に於いて
リガンド遺伝子をランダムに突然変異誘発することよ
り、本発明は数千万のリガンド変異体を含むファージミ
ドのライブラリーを提供する。本発明の考え方は、これ
らのリガンド変異体の内には特定の標的分子に特異的結
合親和性を有する変異体がある筈だということである。
結合性の強いファージミドのサブセットは、これを例え
ば標的分子を被覆した表面に結合し、弱く結合した大部
分のファージミドを洗い流すことによって選択できる。
この特異的に強く結合した集団を次に例えば弱酸により
溶離する。このファージミドの濃縮したサブ集団は大腸
菌の中での再感染と培養とにより増幅することができ
る。このような結合と増幅の組合せの繰り返しにより、
標的分子に対して強い特異的結合特性を有する少数の変
異体リガンドが濃縮される。
【００１８】換言すれば、数千万の突然変異の産物を含
む分子のレパートリーは、遺伝子と遺伝子産物との物理
的吸着に基づいて同時に選択できるような形で生産する
ことができ、選択と増幅とのサイクルを繰り返すことに
より特定の標的分子に対して強い親和性を有する新規の
タンパク質の濃縮が可能である。遺伝子と遺伝子産物と
のこのカップリングは、一本鎖ファージ（ファージミ
ド）の複製起点を含むプラスミドをヘルパーファージに
よる重感染の際にファージタンパク質で被覆した粒子の
中に詰め込むことができる、一本鎖バクテリオファージ
増殖システムの使用に基づいている。このファージミド
は、ファージ被覆タンパク質の一つとファージミドが詰
め込まれる粒子の表面に現れるようになる第二の成分と
の間の融合から成る遺伝子産物をコードすることができ
る。
【００１９】
【実施例】次に図１乃至８と実験データを基にして本発
明を更に詳細に説明する。
【００２０】図１, 図２： pSKAN8 の生成。ファージミ
ドpMAMPF3-PSTI4 の大きなHindIII-XbaI (部分XbaI) 断
片を、YOL-抗原『付箋』を含むリンカー領域と pIII リ
ーダにより短くなったpIIIコード領域とを含むプラスミ
ドpSEX40の小さいHindIII-XbaI断片 (Breitling 等 199
1)に連結した。pANDRE-13 のHindIII による切断、S1-
ヌクレアーゼによる付着末端の除去及び再結合により欠
失産物pANDRE13-4を生産したが、その中でPSTIと pIII
遺伝子はフレームの中にある。ベクターpSKAN8を形成す
るために、突然変異を二つの位置で導入した。即ち、PS
TIコード配列の末端に於ける停止コドンの突然変異 (TG
AATT→TTAATT) と SacI 切断部位5'からPSTIコード領域
内の計画した超可変部位までの形成 (AACGAACTGAAC→AA
CGAGCTCAAC) である。プライマー # 533と # 528との存
在の許で ss[一本鎖] pANDRE13-4鋳型の上に形成した 2
05 bp[塩基対] PCR 反応産物を SalI と SacI とにより
切断して 132 bp の断片 (F1) とした。同様にプライマ
ー # 1255 と # 529とを使用して ss pANDRE 13-4 鋳型
の上で PCRにより 224 bp の断片を形成し、これをSacI
と EcoRVとにより切断した (F2) 。断片 F1 と F2 と
を SalI-EcoRV で切断した pANDRE13-4 に連結し、こう
して形成したプラスミドを pANDRE13-7 と命名した。停
止コドンは次のように除去した。PCR 増幅を、突然変異
プライマー #1243 (15 pmole) 、5'プライマー # 529
(20 pmole) 及び 3' プライマー # 1255 (10 pmole)に
より 1 pmole未満の ss pANDRE 13-4 の所で実施した。
生成した 225 bp の産物 [最初の中間産物] を SacI と
EcoRVとにより切断して 174 bp の断片とし、これを S
acI-EcoRV により切断した pANDRE13-7 の中に挿入し、
F+株の大腸菌 WK6 (λ)mutS に転換した (Dower 等、19
88) 。バクテリオファージとパッケージしたファージミ
ドの調製は公知の方法によった (Smith と Scott, 199
2) 。
【００２１】プライマー デオキシリボヌクレオチド:#
1243 CTGAGAATTCACCTTCTTCATGAATTAAGCACGGACC;# 526
CATGAATTCCGCACGGACC; # 527 GGTCCGTGCGGAATTCATG;#
527 GGTCCGTGCGGAATTCATG;# 528 * CCGTTGAGCTCGTTGTA
GCATTTAGCTTCACG;# 533 GCATTGGAATTCTACAACTTGC;# 12
55 GGGATTTTGCTAAACAAC 。 図３： pSKAN8 の構築の間に修飾された配列。 図４： pSKAN8 配列の重要な特徴。プライマー結合部位
を示す。
【００２２】図５：SacI-KpnI 領域を置き換えるための
３組の超可変部カセットを限定したPCR 増幅 (５サイク
ル）により形成した。それぞれバンク HyA, HyB 及びHy
C 用のオリゴヌクレオチド # 531, # 532 又は # 4334
( 各1pmole) の 20 μl をプライマー # 529及び # 121
2 ( 各 20 pmole)で増幅した。この PCR- 反応生成物を
SacIとKpnIとで切断し、ベクター [即ち pSKAN8](3 pmo
le) とカセット [即ちSacI/KpnI 制限断片] (10 pmole)
とを 50 μl の連結混合物として使用してpSKAN8に挿入
できた。野性型ベクター配列を、フェノール／クロロホ
ルム／エタノールで抽出してリガーゼを除去してから、
連結混合物の BglII切断 (図４参照) により選択的に除
去した。少量のアリコートを用いて大腸菌 WK6(λ)mut
S への電気穿孔法によりトランスフォメーションを実施
した。クローンをアンピシリン LB プレートの上に塗布
して希釈後単一のクローンを数えた。収率は pSKAN8-Hy
Aに対してＤＮＡ pmole当たり 1.0 (±0.43) ×106 ク
ローン、全体で 8.38 ×10 6 クローン、又 pSKAN8-HyB
に対して 1.57 ×107 クローン、 pSKAN8-HyCに対して
全体で 7×106 クローンで、三つの全てのバンクから合
計3.11×107 クローンが得られた。
【００２３】使用したオリゴヌクレオチド: # 529 GCTA
CAACGAGCTCAACGGTTGC;# 531 GCTACAACGAGCTCAACGGTTGC
(NNK)7 NNKTGCGGTACCGACGGTGACACTTACCC;# 532 GCTACAA
CGAGCTCAACGGTTGC(NNK)6 NNKTGCGGTACCGACGGTGACACTTAC
CC;# 4334 GCTACAACGAGCTCAACGGTTGC(NNK) 6 GTTTGCGGT
ACCGACGGTGACACTTACCC;# 1212 GGGTAAGTGTCACCGTCGGTA
CCGCA; ここで N = A, C, G 又は T; K = T 又は G (トリプト
ファンとメチオニンコドンを許容するが、停止コドンの
確率を元の値の 33 % に減少、即ち停止コドンの最終の
確率は 64 コドン中に１、或いは変異遺伝子の９個中に
約１個となる）。SacIとKpnIとの部位を下線で示した。
【００２４】図６： pIII と HPSTI-pIII 融合タンパク
質を示すファージ調製品のウエスタンブロット。レーン
１と６: 予め染色した分子量マーカー; レーン２と７:
M13K07ファージ; レーン３と８: pSKAN8ファージミド;
レーン４と９: HyA ファージミド; レーン５と10: HyB
ファージミド。ファージミドは M13K07 ヘルパーファー
ジを用いて大腸菌細胞からパッケージされた。得られた
ファージ粒子をPEG-沈殿法により集めた。ファージタン
パク質を Schraeger と Jagow (1987) の SDS-PAGE (10
% T; 3 % Cゲル) により分離し、ニトロセルロースの
上に移した。左側のブロットは、単一特異性の抗 PSTI
ラビット血清 (Merk社の診断研究部からの贈与) によ
り、右側のブロットは pIII に対するモノクローナル抗
体 (M. Tesarの私信) によりインキュベートした。タン
パク質はペルオキシダーゼを標識した第二抗体 (Biora
d) で染色した。
【００２５】図７：バンクHyA とHyB の超可変領域内の
アミノ酸分布。アミノ酸分布は表１のデータから計算
し、計算した分布を、各コドンの位置１と２に於けるヌ
クレオチドのランダム分布と各コドンの第三の位置に於
けるＧとＴとの１：１の分布とから予想されるアミノ酸
頻度と比較した。
【００２６】図８：全体のバンクHyA とHyB の配列。各
バンクからの大腸菌細胞の１部分を接種として使用し、
M13K07ヘルパーファージにより重感染した。ファージミ
ドDNA をPEG-沈殿法とフェノール抽出 (Smith と Scot
t, 1992) により精製し、Sanger等 (1977) の方法でプ
ライマー # 1255 により配列を決定した (図４) 。オー
トラジオグラムがコードストランド (5'から3'の方向、
上から下) を示し、超可変領域内に (NNG/T)8 と (NNG/
T)7 とのパターンが見られる。
【００２７】
【表１】
【００２８】各バンクのランダムの単一クローンからの
ファージミドDNA の配列を Sanger等(1977)の方法で決
定した。バンクHyA の25クローン (200 コドン) とバン
クHyB の22クローン (154 コドン) との配列データを考
慮した。
【００２９】ヒト膵臓分泌性トリプシンインヒビター遺
伝子と M13 pIII タンパク質遺伝子との融合を含むファ
ージミド pSKAN8 を形成した。配列 (NNT/G)7 又は (NN
T/G) 8 とを含むカセットを、hPSTI のトリプシン阻害ル
ープ (アミノ酸 17 〜23) の中のアミノ酸コード領域を
ランダム化するのに使用した。数千万の個々のクローン
がmutS大腸菌株の中に生成し、こうしてそれぞれ pSKAN
8-HyA 及び pSKAN8-HyB と名付けたファージミドバンク
が形成された。ハイブリッドタンパク質、即ち、PSTI-
変異体-pIII が統計的にファージミド粒子当たり１〜２
分子の頻度で現れ、即ち粒子中の全 pIII タンパク質の
三分の一を占めると推定された。
【００３０】このようにして、物理的に充分特性が規定
されたヒト膵臓分泌性トリプシンインヒビター(hPSTI)
をコードするハイブリッド遺伝子で、バクテリオファー
ジ M13の pIII 遺伝子に融合したコンパクトな56個のア
ミノ酸タンパク質を含むファージミドが構築された。こ
のファージミドは二本鎖プラスミドDNA として、或いは
一本鎖ヘルパーファージによる感染の際にプラスストラ
ンドの一本鎖DNA としてパッケージされて増殖すること
ができる。
【００３１】この粒子の上のハイブリッドタンパク質の
正しい折り畳みと性状とを固定化したトリプシン (変異
していない pSKAN8)への特異的吸着と固定化した抗PSTI
血清へのパニングにより試験した。
【００３２】標的分子としてのαキモトリプシンに強く
結合する突然変異体の選択により、４個の新しい特異的
キモトリプシンインヒビターが得られた。これは本シス
テムの一般的な機能性と適用可能性とを示している。
【００３３】
【発明の効果】例えば免疫グロブリンの性状を有するフ
ァージミドと比較して、bPTI又はhPSTI は特に応用面に
於いて次のような利点が考えられる。 − エピトープ結合が比較的小さいので短い保存領域、
特に部分的に膜受容体に隠されているような領域を標的
にすることができる。 − 突然変異の領域のみが抗原性で、大部分のタンパク
質が翻訳後の修飾部位のない正しく折り畳んだヒトタン
パク質であるようなワクチンの抗原性成分の生産も考え
られる。
【００３４】本発明のバンクは同様なバンクの場合より
も多くの突然変異密度の組合せと種々の短い領域とを示
す。107 個の変異体の抗体バンクは例えば各CDR-ループ
に対して僅か数十から100 程度の異なる突然変異体を有
する。小さい標的の場合、即ち５乃至６個のアミノ酸の
相互作用が例えば30乃至40Åの線形断面の範囲で行われ
るような場合には、特異性のリガンドを本発明のバンク
から選択する確率は他のバンクの場合よりも遙に高い筈
である。この点に関して、本発明は、標的分子の表面の
大きな面積を認識する特異性リガンドを形成する目的の
他のバンクを相補うものと見なすことができる。
【００３５】〔材料と方法〕ＰＣＲ、限定切断及び連結
の後でＤＮＡをその都度精製するためにフェノール・ク
ロロホルム抽出とエタノール沈殿とが使用された。プラ
スミドＤＮＡの予備的精製には塩化セシウム臭化エチジ
ウム超遠心分離を用いた。バクテリオファージとパッケ
ージしたファージミドとは上述のように調製した。
【００３６】 プライマー・デオキシリボヌクレオチド： 1243 [5'-CTGAGAATTCACCTTCTTCATGAATTAAGCACGGACC-3'] 526 [5'-CATGAATTCCGCACGGACC-3'] 527 [5'-GGTCCGTGCGGAATTCATG-3'] 528 * [5'-CCGTTGAGCTCGTTGTAGCATTTAGCTTCACG-3'] 533 [5'-GCATTGGAATTCTACAACTTGC-3'] 1255 [5'-GGGATTTTGCTAAACAAC-3'] プライマー・オリゴ 528, 529, 1243 及び 533は PCR-
反応に於いて前述の比率で組み合わせた。
【００３７】合成用の超可変 SacI-KpnI- カセットは次
の通りであった。 529 [5'-GCTACAACGAGCTCAACGGTTGC-3'] 531 [5'-GCTACAACGAGCTCAACGGTTGC(NNK)8 TGCGGTACCGACGGTGACACTTACCC-3'] SacI KpnI 532 [5'-GCTACAACGAGCTCAACGGTTGC(NNK) 7 TGCGGTACCGACGGTGACACTTACCC-3'] 1212 [3'-ACGCCATGGCTGCCACTGTGAATGGG-5'] K =チミジン又はグアニジン (トリプトファンとメチオ
ニンコドンを許容するが、停止コドンの確率を元の値の
33 % に減少、即ち停止コドンの最終の確率は64コドン
中に１、或いは変異遺伝子の９個中に約１となる）。
【００３８】〔開始ベクター pSKAN8 の生産〕プラスミ
ド pMAMPF3-hPSTI (図１) は一つの発現プラスミドで、
その中でリーダーペブチドの生産、分泌、及び正しい切
断が生ずるように、合成ヒト膵臓分泌性トリプシンイン
ヒビター hPSTIの最初のアミノ酸に OmpA-リーダーが融
合してある。
【００３９】このプラスミドを、hPSTI 遺伝子の発現シ
ステムの供与体、プラスミド複製機能及び M13ファージ
複製起点 (大きなHindII-XbaI[部分切断] 断片) として
使用した。プラスミド pSEX40 （図１）は M13 pIII 遺
伝子産物用の発現ベクターであるが、これを pIII 遺伝
子 (小さいHindIII-XbaI断片) 用の供与体として使用し
た。結合産物 (図１) は hPSTI遺伝子と pIII 遺伝子と
を正しく並列して保有しているが、 hPSTI遺伝子の末端
に尚停止コドンを含み、又種々の読取りフレームを備
え、これはHindIII 付着末端の欠失により連結し得る。
この生成したプラスミドを pANDRE-13と名付けた。Hind
III による pANDRE-13の切断、S1- ヌクレアーゼによる
付着末端の除去と再連結により欠失産物 pANDRE-13-4
(図１、図３) が得られ、その中で hPSTI遺伝子と pIII
遺伝子とはフレームの中である。この点は、プライマ
ー 1255 を使用した二本鎖DNA に就いてのMn++−緩衝配
列決定により確認された。
【００４０】ベクターpSKAN8( 図２) を形成し、そこに
超可変カセットが挿入できるように、突然変異を尚二つ
の位置に導入する必要があった。即ち hPSTIコード配列
の末端に於ける停止コドンの突然変異 (TGAATT→TTAAT
T) と SacI 切断部位5'からhPSTI コード領域内の突然
変異部位までの形成 (AACGAACTGAAC→AACGAGCTCAAC) で
ある。プライマー 533と 528との存在の元で一本鎖 pAN
DRE 13-4鋳型の上に形成した 205 bp PCR 反応産物を S
alI と SacI とにより切断して 132 bp の断片(F1)とし
た。同様にプライマー 1255 と 529とを使用して一本鎖
pANDRE 13-4鋳型の上での PCRにより 224 bp の断片を
形成し、これを SacI-EcoRV により切断した(F2)。 Sal
I-EcoRV で切断した pANDRE13-4 に断片 F1 と F2 とを
連結し、こうして形成したプラスミドは正しい位置に S
acI-部位を含む。これを pANDRE 13-7と命名した。
【００４１】停止コドンの除去には次のような方法を用
いた。PCR 増幅を、突然変異プライマー 1243 (15 pmol
e)、5'プライマー 529 (20 pmole) 及び 3' プライマー
1255 (10 pmole)により 1 pmole未満の ss pANDRE 13-
4 の所で実施した。生成した225 bpの産物を SalI と E
coRVとにより切断して 174 bp の断片とし、これをSacI
-EcoRVにより切断した pANDRE13-7 の中にクローニング
し、大腸菌WK6(λ) mutSに転換した。この正しい産物は
97 bp EcoRI断片の欠如により容易に試験でき、その後
の配列決定により確認された。
【００４２】〔遺伝子バンク pSKAN8-HyA と pSKAN8-Hy
B との生産〕超可変部カセットを非常に限定した PCR増
幅 (５サイクル）により形成した。バンクA 用にはプラ
イマー 531 (1 pmole)、529 (20 pmole)、1212 (1 pmol
e)を20 μl 使用した。続いてこの PCR- 反応生成物を
SacI 及び KpnI で切断してpSKAN8 に挿入し、それぞれ
バンク pSKAN8-HyA と pSKAN8-HyB とを得た。野性型ベ
クター配列を、フェノール／クロロホルムで抽出してリ
ガーゼを除去してから、連結混合物の BglII切断により
選択的に除去した。トランスフォメーションを大腸菌 W
K6 (λ)mutS への電気穿孔法により別々に実施し、F +
株の所で次の収率を得た。 pSKAN8-HyA: 5 pmole トランスフォーメーションに付き
1.0 (σ = 0.43)×106, 全体で 6.5×10
6 クローン pSKAN8-HyB: 0.6 ( σ = 0.35)×106 クローン
【００４３】クローンを全てプレートの上に塗布し、計
数し、10 %のグリセリンを加えたLB培地に集めて凍結し
た。各バンクに対して１mlの分割量をプールし、109 の
M13KO7ヘルパーファージを加えた 500mlの LB 培地に接
種した。上清をPEG 沈殿法で100 倍以上に濃縮し、ペレ
ットを洗浄してから再懸濁し、更に追加の滅菌段階とし
て遠心した。このパッケージングした懸濁液を４℃で保
存した。
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play library of random decapeptides (ランダムデカ
ペプチドのファージ表示ライブラリーの中の生化学的多
様性), Gene 128, 13-17.
【００５０】27. Duebel,S., Breitling,F., Fuchs,P.,
Braunagel,M., Klewinghaus,I. andLittle,M.(1993) A
family of vectros for surface display and product
ionof antibodies (抗体を表面に表示し生産するための
ベクターのグループ), Gene128, 97-101. 28. Garrard,L.J. and Henner,D.J.(1993) Selection o
f an anti-IGF-1 Fabfrom a Fab phage library create
d by mutagenesis of multiple CDR loops (多重 CDR
ループの突然変異誘発により形成された Fabファージラ
イブラリーからの抗IGF-1 Fab の選択), Gene 128, 103
-109. 29. Kay,B.K., Adey,N.B., He,Y.-S., Manfredi,J.P.,
Mataragnon,A.H. andFowlkes,D.M.(1993) An M13 phage
library displaying random 38-aminoacid peptides a
s a source of novel sequences with affinity to sel
cted targets(選択した標的に親和性のある新しい配列
の起源としてのランダム38アミノ酸ペプチドを表示する
M13ファージライブラリー), Gene 128, 59-65 30. Makowski,L.(1933) Structural constraints on th
e display of foreignpeptides on filamentous bacter
iophages ( 繊維状バクテリオファージ上の異質ペプチ
ドの出現に及ぼす構造的束縛), Gene 128, 5-11
【００５１】31. Matthews,D.J. and Wells,J.A.(1993)
Substrat phage: Selection of Protease substrates
by monovalent phage display (基質ファージ: 一価フ
ァージの出現によるプロテアーゼ基質の選択), Science
260, 1113-1117. 32. McLafferty,M.A., Kent,R.B., Ladner,R.C. and Ma
rkland,W.(1993) M13bacterriophage displaying disul
phide-constrained microproteins (二硫化物拘束のミ
クロタンパク質を表示する M13 バクテリオファージ),
Gene 128 , 29-36. 33. Pannekoek,H., van Meijer,M., Schleef,R.R., Los
kutoff,D.J. and Bar-bas III,C.F.(1993) Functional
display of human plasminogen-activator in-hibitor-
1 (PAI-1) on phages: novel perspectives for struct
ure function analysis by error-prone DNA synthesis
(ファージに対するヒトプラスミノーゲン活性因子イン
ヒビター-1 (PAI-1) の機能的表示: 誤り易いDNA-合成
による構造機能分析に対する新しい見通し), Gene 128,
135-140. 34. Pinilla,C., Appel,J.R. and Houghten,R.A.(1993)
Synthetic peptide combinatorial libraries (SPCL
s): identification of the antigenic determinant of
β-endorphin recognised by monoclonal antibody 3E7
(合成ペプチド結合性ライブラリー (SPCLs): モノクロ
ナール抗体 3E7により認識されたβエンドルフィンの抗
原決定基の同定), Gene 128, 71-76.
【００５２】35. Smith,G.P., Schultz,D.A. and Ladbu
ry,J.E.(1993) A ribonuclease S-peptide antagonist
discovered with a bacteriophage display library (
バクテリオファージ表示ライブラリーにより見いだされ
たリボヌクレアーゼ S -ペプチドアンタゴニスト), Gen
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Malmborg,A.-C., Ayala, M., Danielsson,L. and Borre
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ay of antibody fragments on filamentous bacterioph
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peronin 支援のファージ表示), BioTechnol. 11, 503
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mmunological properties of foreign peptides in mul
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状バクテリオファージの上の多重表示に於ける異質ペプ
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or for antibody screening ( 抗体スクリーニング用表
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braries of peptides and proteinsdisplayed on filam
entous phage ( 繊維状ファージに表示されるペプチド
とタンパク質のライブラリー), Meth.Enz. 217, 228-25
7. 41. Schaegger,H. and von Jagow,G.(1987) Tricine-so
dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropho
resis for the separation of proteins in therange f
rom 1 to 10 kDa (1-10 KDaの範囲のタンパク質の分離
用のトリシン・ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動), Anal. Biochm. 166 368-379. 42. Sanger,F., Nicklen,S. and Coulson,A.R.(1977) D
NA sequencing with chain-terminating inhibitors(チ
ェーン終結インヒビターによる DNAの配列決定), Proc.
Natl.Acad.Sci. USA 74, 5463-5467.
【図面の簡単な説明】
【図１】pANDRE13 の生成を説明する図である。
【図２】pSKAN8 の生成を説明する図である。
【図３】pSKAN8 の構築の間に修飾された配列を説明す
る図である。
【図４】pSKAN8 配列の重要な特徴を説明する図であ
る。
【図５】SacI-KpnI領域を置き換えるための３組の超可
変部カセットの図である。
【図６】pIII とHPSTI-pIII融合タンパク質を示すファ
ージ調製品のウエスタンブロットの図である。
【図７】バンクHyA とHyB の超可変領域内のアミノ酸分
布の図である。
【図８】全体のバンクHyA とHyB の配列の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジョン・コリンズ ドイツ連邦共和国 ブラウンシュヴァイ ク、マシェローダー・ヴェーク １ (72)発明者 ペーター・ロエットゲン ドイツ連邦共和国 ブラウンシュヴァイ ク、マシェローダー・ヴェーク １ (54)【発明の名称】 ファージミドの集合、ファージミドを有する大腸菌細胞の集合、前記集合から生産されるファー ジミド粒子、ファージミド粒子の集合、ファージミド粒子の集合の分離方法、並びにリガンドタ ンパク質

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の成分を含むファージミドの集合、 プロモータ、 リガンドタンパク質がプロセスした状態に於いて４０乃
    至６０のアミノ酸残基と繊維状一本鎖ＤＮＡバクテリオ
    ファージタンパク質とを含むようにする、リガンドタン
    パク質同志の融合用遺伝子コード少なくとも１個の転写
    終結配列、 繊維状一本鎖ＤＮＡバクテリオファージから誘導された
    複製起点、 プラスミド複製起点、及び任意の少なくとも１個の選択
    マーカー。
  2. 【請求項２】 プロモータがλＰL −プロモータである
    ことを特徴とする請求項１記載のファージミドの集合。
  3. 【請求項３】 前記リガンドタンパク質がヒト膵臓分泌
    性トリプシンインヒビター(hPSTI) の変異体又はウシ膵
    臓トリプシンインヒビター (bPTI) の変異体であること
    を特徴とする請求項１又は２記載のファージミドの集
    合。
  4. 【請求項４】 前記リガンドタンパク質は、トリプシン
    阻害ループがランダムに修飾され、特にアミノ酸１７乃
    至２３の領域の中でランダムに修飾されたhPSTI の変異
    体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに
    記載のファージミドの集合。
  5. 【請求項５】 前記ファージミドがプラスミドの形で含
    まれている、請求項１〜４のいずれかに記載のファージ
    ミドの集合を代表する大腸菌クローン又は細胞の集合。
  6. 【請求項６】 前記大腸菌のクローン又は細胞が、大腸
    菌ＷＫ６及び特に大腸菌WK6(λ)mutS のようなλリプレ
    ッサーを含む菌株に属することを特徴とする請求項５記
    載の大腸菌クローン又は細胞の集合。
  7. 【請求項７】 請求項５又は６記載の大腸菌クローン又
    は細胞の集合から生産されるファージミド粒子の集合。
  8. 【請求項８】 次の段階を特徴とする、所定の標的分子
    に対して強い結合特性を有するファージミド粒子を分離
    するための方法、(a) 請求項６又は７記載のファージ
    ミド粒子の集合を、標的分子の存在の許で、それ自体は
    公知の親和性増強方法により処理し、(b) 結合性の強
    いファージミド粒子のサブ集合を大腸菌によりそれ自体
    は公知の方法で増幅し、(c) 段階(a) と (b)とを任意
    に繰り返し、(d) 前記標的分子に対して強い結合特性
    を示す１個又は少数のファージミド粒子を分離する。
  9. 【請求項９】 所定の標的分子に対して強い結合特性を
    示す、請求項８記載の方法により得られたファージミド
    粒子。
  10. 【請求項１０】 所定の標的分子としてαキモトリプシ
    ン又はエラスターゼのようなプロテアーゼに対して強い
    結合特性を示す、請求項９記載のファージミド粒子。
  11. 【請求項１１】 請求項９又は１０記載のファージミド
    粒子から、バクテリオファージｐIII タンパク質のよう
    なバクテリオファージタンパク質が同時に生産すること
    のない、次の方法で生産することのできる精製リガンド
    タンパク質、 前記融合（ハイブリッドタンパク質）のタンパク質分解
    による切断、 リガンドタンパク質のためのコード領域とバクテリオフ
    ァージタンパク質のためのコード領域との間に停止コド
    ンを導入、又はリガンドタンパク質遺伝子又はその一部
    をその他の発現ベクターへサブクローニング。
JP7140935A 1994-06-07 1995-06-07 ファージミドの集合、ファージミドを有する大腸菌細胞の集合、前記集合から生産されるファージミド粒子、ファージミド粒子の集合、ファージミド粒子の集合の分離方法、並びにリガンドタンパク質 Pending JPH0856677A (ja)

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