JPH08508464A - Cathepsin D is an amyloidogenic protease in Alzheimer's disease - Google Patents

Cathepsin D is an amyloidogenic protease in Alzheimer's disease

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Abstract

(57)【要約】 アルツハイマー症のβ−アミロイドタンパク質の前駆物質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビター、例えばアスパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤおよびキモトリプシン様セリンプロテアーゼのインヒビターを用いて、β−アミロイドタンパク質の生成を調節する方法；前記アミロイド前駆タンパク質の減成を行うのに必要な特異性を有する分子のプロテアーゼ活性を生体外で検出する方法；前記アミロイド前駆タンパク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビターを同定する検定法；ならびに同定されたインヒビターおよびアルツハイマー症の治療に用いる治療薬としてのこれらインヒビターの用途を開示する。   (57) [Summary] A method of modulating β-amyloid protein production using an inhibitor of a protease specific for a precursor of Alzheimer's β-amyloid protein, such as an inhibitor of aspartic protease, cathepsin D and chymotrypsin-like serine protease; A method for detecting in vitro the protease activity of a molecule having the specificity required to effect degradation of amyloid precursor protein; an assay method for identifying a protease inhibitor specific for said amyloid precursor protein; Disclosed are inhibitors and the use of these inhibitors as therapeutic agents for the treatment of Alzheimer's disease.

Description

【発明の詳細な説明】 カテプシンＤはアルツハイマー病におけるアミロイド生成プロテアーゼである 発明の背景 本出願は、1992年５月11日提出の米国特許第07/880,914号の一部継続である19 92年12月16日提出の米国特許第07/995,660号の一部継続である。 １）産業上の利用分野 本発明は、アルツハイマー病（以後“AD”と記す）ベータアミロイドタンパク 質に対する前駆体をプロセッシングする特異性を有するタンパク質分解酵素を同 定するための方法；ベータアミロイドタンパク質に対する前駆体に特異的なプロ テアーゼの阻害剤を同定するための方法；並びにベータアミロイドタンパク質に 対する前駆体に特異的なプロテアーゼの阻害剤、例えばアスパラギン酸プロテア ーゼ、カテプシンＤ、及びキモトリプシン様セリンプロテアーゼを用いてベータ アミロイドタンパク質の生成を調節するための方法に関する。 ２）関連技術の説明 本検定は、AD患者の脳におけるアミロイド性ペプチドの生成速度を制御するプ ロテアーゼの同定に有益である。このように、それらはこのようなタンパク質を 単離するために用い得るし、並びにADの療法として用い得るプロテアーゼ阻害剤 を同定するのにも用い得る。アスパラギン酸プロテアーゼ、即ちアミロイド前駆 体タンパク質（以後“APP”と記す）をプロセッシングするための主なアミロイ ド原性プロテアーゼとしてのカテプシンＤを同定するための検定の適 用を以下に説明する。APPホロタンパク質に対するアミロイド前駆体を生成し得 る二次セリンプロテアーゼの部分的特性表示が提供される。 ADは、通常は前頭、頭頂及び後頭皮質における進行性萎縮を特徴とする脳の進 行性変性疾患である。ADの臨床的発現としては、進行性記憶障害、言語及び視覚 空間識別力の喪失、並びに行動欠損が挙げられる（McKhan et al.，1986，Neuro logy，34:939）。全体的認識障害は、大脳半球全体に見出されるニューロン細胞 の変性によるものである（Price，1986，Annu．Rev．Neurosci．9:489）。 病理学的には、AD患者の剖検脳の原発性の顕著な特徴は、（１）神経繊維のも つれの蓄積を含むニューロン神経細胞形質から成る病変；（２）脳血管性アミロ イド沈着物；及び（３）神経炎斑である。脳血管性アミロイド（Wong et al.，1 985，PNAS，82:8729）及び神経炎斑（Masters et al.，1985，PNAS，82:4249） はともに、単に“Ａ４”又は“ベータアミロイド”と呼ばれる独特のペプチドを 含有する。 ベータアミロイドは、相対分子量4,500の不溶性の高度に凝集する小ポリペプ チドであり、39〜42個のアミノ酸から成る。証拠のいくつかのラインは、AD病変 の病因におけるベータアミロイドの役割を支持する。例えばベータアミロイド及 び関連断片はPC−12細胞株に対して有毒であり（Yanker et al.，1989，Science ，245:417）、ニューロンの一次培養に対して有毒であり（Yanker et al.，1990 ，Science，250:279）、そして齧歯類の脳におけるニューロン変性及び齧歯類に おける対応する記憶喪失反応を引き起こす（Flood et ａl.，1991，PNAS，88:33 63；Kowall et al.，1991，PNAS，88:7247）ことが示されている。しかしながら 最も強力な証拠は、ある種の形態の家族性アルツハイマー病（FAD）と同時分離 するアミノ酸置換の ホロアミロイド前駆体タンパク質（以後、“APP”と呼ぶ）内の部位から得られ る。APP内のベータアミロイドペプチド配列に対してＮ末端（Mullant et al.，1 992，Nature Genetics，1:345）又はＣ末端（Goate et al.，1991，Nature，349 :704；Yoshioka et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.，178:1141；nur rell et al.，1991，Science，254:97；及びChartier-Harlin et al.，1991，Na ture，353:844）に位置するこれらの点突然変異は、断片を含有するベータアミ ロイドの内部タンパク質分解性放出の速度を変えることによりFADを引き起こす ことを示唆する（Mullan等及びChartier-Harline等。ともに上記）。 Kang等（1987，Nature，325:733）は、大型前駆体タンパク質から生じるとし て並びにその一部としてベータアミロイドタンパク質を記載する。この前駆体を 同定するために、公知のベータアミロイド配列から選定されたオリゴヌクレオチ ドを用いてそのタンパク質をコードする全長相補的DNAクローンを単離し、シー ケンシングした。予測された前駆体は695この残基を含有したが、これは一般に “APP 695”（アミロイド前駆体タンパク質695）と呼ばれる。 APPタンパク質をコードする遺伝子を引き続きクローニングした結果、Ａ４領 域が２つの隣接するエクソン上にコードされた（Lemaire et al.，1989，Nuclei c Acids Res.，17:517）が、これはＡ４蓄積が択一的にスプライシングされたmR NAの直接発現の結果である可能性を除外する。これは、Ａ４蓄積がAPP内のペプ チド領域に対してＮ及びＣ末端の部位でのAPPの異常タンパク質分解性分解に起 因しなければならないことを意味する。 APP 695はヒト脳中に見出されるAPPの最も多量にある形態であるが、しかし他 に３つの形態、即ちAPP 714，APP 751及びAPP 770が存在する（Tanzi et al.，1 988，Nature，351:528；Ponte et al .，1988，Nature，331:525；及びKitaguchi et al.，1988，Nature，331:530） 。異長同形態がヒト第21染色体上に位置する単一APPからの別のスプライシング から生じる（Goldgaber et al.，1987，Science，235:877；及びTanzi et al.， 1987，Science，235:880）。 APP 751及びAPP 770は56アミノ酸Kunitz阻害剤ドメインを含有し、これはウシ 膵臓トリプシン阻害剤と40％の相同を共有する。これらの形態のAPPはともにプ ロテアーゼ阻害活性を有し（Kitaguchi et al.，1988，Nature，311:530；及びS mith et al.，1990，Science，248:1126）、これらの形態の少なくとも１つがお そらくは以前にプロテアーゼNexin 11として同定されたものである（Oltersdorf et al.，1989，Nature，341:144；Van Nostrand et al.，1989，Nature，341:5 46）。 アミロイド前駆体タンパク質に関する生理学的役割は、未だ確証されていない 。それは、細胞表面受容体（Kang et al.，1987，Nature，325:733）、付着分子 （Schubert et al.，1989，Neuron，3:689）、成長又は栄養因子（Saitoh et al .，1989，Cell，58:615:Araki et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.， 181:265；及びMilward et al.，1992，Neuron，9:129）、創傷治癒の調節体（Va n Nostrand et al.，1990，Science，248:745；及びSmith et al.，1990，Scien ce，248:1126）であるか、又は細胞骨格系においてある役割を演じる（Refolo e t al.，1991，J．Neuroscience，11:3888）と提唱されている。 多数の研究が行なわれてADにおける変更APP発現の役割が調べられたが、しか し結果は相容れないものであった（例えば検討文献：Unterbeck et al.，1990， Review of Biological Research in Aging，Wiley-Liss，Inc.，4:139参照）。 異形態のAPPの相対量の変化がアミロイド蓄積に依るものか否か を調べるための研究も行なわれた。このような研究の結果は、同じく紛らわしい ものであったが、しかしAPPを含有するKunitzドメインの相対発現レベルがADで は上昇するという結論を支持した（Johnson et al.，1990，Science，248:854） 。したがって上昇APP 751を発現するトランスジェニック動物は皮質及び海馬ベ ータアミロイド反応性沈着物を示すことが判明した（Quen et al.，1991，Natur e，352:239）。 最新研究は、Ａ４のＮ末端から全長APPのＣ末端に伸びるAPP断片（約100個の アミノ酸から成るため、以後“Ｃ−100断片”と呼ぶ）も、in vitro（Dyrks et al.，1988，EMBO J.，7:949）及びトランスフェクト化細胞（Wolf et al.，1990 ，EMBO J.，9:2079；及びMaruyama et al.，1990，Nature，347;566）の両方で の凝集が可能であることを示した。トランスフェクト化Ｐ19細胞におけるＣ−10 0断片の過剰発現は細胞毒性を引き起こすことが示された（Fuckuchi et al.，19 92，Biochem．Biophys．Res．Comm.，182:165）。 さらに、ベータアミロイド及びＣ末端領域をともに含有するＣ末端断片はヒト 脳中に存在することが示され（Estus et al.，1992，Science，255:726）、トラ ンスフェクト化細胞株における研究はこれらの断片がエンドソーム−ライソソー ム経路で産生され得ることを示唆する（Golde et al.，1992，Science，255:728 ）。 全体として、上記の報告は、Ａ４領域のＮ末端でのAPPの単一タンパク質分解 性切断がADに伴う病態生理学的症状を引き起こすに十分であることを示唆する。 一次細胞及び細胞株（ADトランスフェクト体を含む）の培養が、ベータアミロイ ド（１〜４２アミノ酸）と同じＮ末端を有しおそらく全長ベータアミロイドを包 含する３〜４kDaのペプチドを分泌することを最近の研究は示している（Haas et al.，1992，Nature，349:322；及びShoji et al.，1992，Science， 258:126）。このようなペプチドはさらに、AD及び非AD患者の脳脊髄液（以後“C SF”と記す）中に見出された（Scubert et al.，1992，Nature，359:325；及びS hoji et al.，1992、同上）。 APPは、APP細胞外ドメインの分泌のために生理学的経路中のＡ４領域内の部位 でも切断される（Esch et al.，1990，Science，248:1122；及びWang et al.，1 991，J．Biol．Chem.，266:16960）。この経路はいくつかの細胞株で働き、必然 的にＡ４、即ち前駆体のアミロイド領域の破壊を引き起こす。このような経路は ヒト脳でも働いているという証拠が得られている（Palmert et al.，1989，Bioc hem．Biophys．Res．Comm.，165:182）。 APPの正常の非病理的プロセッシングに関与する酵素は、“セクレターゼ”と 呼ばれている。セクレターゼ作用に起因するＣ末端断片はＣ−100断片（上記） より17アミノ酸だけ小さく、以後“生理学的Ｃ末端断片”と呼ぶ。 Ａ４の正味の病理学的蓄積はAPP分解の病理学的及び生理学的経路の相対的活 性により制御されると仮定されている。 したがって、ADに苦しむ人々の脳中のベータアミロイドの蓄積を説明する下記 のようないくつかの可能性が存在する： （１）アミロイド原性領域の破壊に伴うセクレターゼの活性又はレベルの不足 ； （２）病理学的経路のプロテアーゼに曝露されるようになり得るようなAPPの 細胞分類の変更； （３）病理学的プロテアーゼのレベルの増大； （４）そうでなければ産生されるのと同様に速くアミロイドを分解する分解酵 素のレベルの不足；又は （５）APPアミノ酸配列の突然変異により引き起こされる病理学的タンパク質 分解性分解に対するAPPの感受性の増大。 他と比べて、細胞中のAPP分類の調節についてはほとんど知られていない。ク ンパク質キナーゼＣ活性の変化による少なくとも一部のリン酸化の変化がAPP通 行の変化を引き起こし、最後にAPPプロセッシングの変化を引き起こすという仮 説が育ちつつある（Buxbaum et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:6 003）。したがって、細胞リン酸化を変えることを意図した治療は、APPのＣ末端 断片のパターンの定性的及び定量的変化の両方を引き起こした。 アミロイド原性APPプロセッシングは最初はエンドソーム−ライソソーム事象 であると示唆された（Golde et al.，1992，Science，255:728；及びC．Haas et al.，1992，Nature，357:500）が、しかしベータアミロイド生成における分泌 経路内又は原形質膜でのプロテアーゼの参加と一致して、択一的にプロセッシン グされた形態の分泌APP（Suebert et al.，1993，Nature，361:260）と一緒に培 養細胞によりベータアミロイドが放出されるという最新の証拠がある（C．Haas et al.，1992，Nature，359:322；及びShoji et al.，1992，Science，258:126 ）。近年、スウェーデン型のFADに関連したAPP 695を発現するトランスフェクト 化細胞株が野生型APPでトランスフェクトされた細胞より６〜８倍速くベータア ミロイド様断片を放出することが示された（Citron et al.，1992，Nature，360 :672；並びにCai et al.，1993，Science，259:514；及び1992，Neuroscience L ett.，144:42）が、しかしロンドン（Ｖ〜Ｉ）突然変異の効果についての同様の 研究はアミロイド放出に及ぼす作用を示さなかった（Cai等。同上参照）。いく つかの場合において、培養細胞によるアミロイド放出は、APP前駆体のバリン594 （参照１によるナンバリング）で始まるＮ末端を有する異常形態のベータアミロ イドを含有する（C．Haas et al.，1992，Nature，359:322；Busciglio et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90；2092）が、この意味 は不明である。阻害剤の作用は、これらの系におけるベータアミロイド産生にお ける酸性細胞区画の参加を圧倒的に支持する（Shoji et al.，1992，Science，2 58:126；Busciglio et al.，Pro．Natl．Acad．Sci．USA，90:2092；及びHaas e t al.，1993，J．Biol．Chem.，268:3021）が、これはある種のシステイン又は セリンの関与の欠如を示唆する（Shoji et al.，1992，Science，258:126；Busc iglio et al.，Pro．Natl．Acad．Sci．USA，90:2092；及びHaas et al.，1993 ，J．Biol．Chem.，268:3021）。 近年、Nitsch等（1992，Science，258:304）は、ある種のアセチルコリン受容 体型による細胞株のトランスフェクションとその後の受容体活性化が、タンパク 質キナーゼ活性の変化により生じると結論される工程におけるAPPプロセッシン グ及び分泌の増大を引き起こすことを示した。リン酸化の変化に関する役割に関 係がある上に、この後者の研究はADに特徴的なコリン作動性神経機能におけるプ ラーク病態と確立された心の動揺との間の連関を提示する。 上記の観察にもかかわらず、細胞分類のあらゆる根元的変化に対する平衡を元 に戻し得る選択的及び特異的治療薬の設計を可能にするにはAPP分類についての 知識は不十分である。 ベータアミロイドは（単数又は複数の）プロテアーゼの直接作用により生成さ れねばならない。Ｃ−100又はベータアミロイド生成に関与するいわゆる“病的 ”脳プロテアーゼ（単数又は複数）の同定は、アミロイド蓄積を遮断するよう意 図された治療用プロテアーゼ阻害剤を開発するための努力における必須段階であ る。このような酵素の同定には、脳抽出物中に存在する他の脳タンパク質分解酵 素の存在下でプロテアーゼの活性を特異的に測定させるこのようなプロテアーゼ の活性に対する特異的検定の開発を要する。 次いで、このような検定を用いてプロテアーゼ精製中にプロテア ーゼを検出する。最後に、本検定を用いて、鉛治療化合物に対する薬学的スクリ ーニングに必要とされるような酵素の強力な阻害剤の作用を測定することができ る。 いくつかの研究がセクレターゼ及びうわさの病的プロテアーゼの両方の精製及 び特性表示を試みた。初期の研究は、APP内の予期される切断部位を模倣しただ けの合成ペプチド基質を特徴とする検定を用いた。このような検定は精製プロテ アーゼのin vitro活性を測定するには有用であるが、それらはプロテアーゼ精製 をモニタリングするのに必要とされるようなプロテアーゼの混合物中でのあるプ ロテアーゼの検出を可能にするのに十分な特異性をめったに有していない。した がって、これらのペプチダーゼ検定は必要なプロテアーゼ特異性を提供できず、 このように定量化されたペプチダーゼ活性を用いても、ヒト脳組織から候補APP プロセッシング酵素活性の精製をうまく追跡できなかった。本開示に先立って、 いずれの工程に関しても信用できる候補プロテアーゼ（単数又は複数）は出現し ていないし、種々の研究の結果は相容れないものであった。 例えば、多数の有用な研究が、病的プロテアーゼは：ラインゾーム起源である （Cataldo et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:3861；及びHaas et al.，1992，Nature，357:500）；カルシウム依存性カテプシンＧ様セリンプロ テアーゼ又は金属依存性システインプロテアーゼ（Razzaboni et al.，1992，Br ain Res.，589:207；及びAbrahams et al.，1991，Ao．N.Y．Acad．Sci.，640:1 61）；カルパインＩ（Siman et al.，1990，J．Neuroscience，10:2400）；多触 媒性プロテアーゼ（Ishiura et al.，1989，FEBS．Lett.，257:388）；セリンプ ロテアーゼ（Nelson et al.，1990，J．Biol．Chem.，265:3836）；トロンビン （Igarashi et al.，1992，Biochem．Biophys．Res．Comm.，185:1000）；ある いは亜鉛金属−ペプチ ダーゼ（WIPO出願WO92/07068(Athena Neurosciences，Inc.)）であると提案して いる。 同様の不一致はセクレターゼの同定に際しても生じており、その主張を以下に 示す：金属−ペプチダーゼ（McDcrmott et al.，1991，Biochem．Biophys．Res ．Comm.，179:1148）；アセチルコリネラーゼ関連プロテアーゼ（Small et al. ，1991，Biochemistry，30:10795）；カテプシンＢ（Tagawa et al.，Biochem． Biophys．Res．Comm.，177:377）；又は広範な亜部位特異性を有する原形質膜関 連プロテアーゼ（Sisodia，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:6075；及び Maruyama et al.，1991，Biochem．Biophys．Res．Comm.，179:1670）。 APPプロセッシング酵素の性質を同定するための過去及び現在の尽力が一般に 実を結ばないのは、使用した検定の特異性が不十分であったこと、並びに脳組織 に関連したプロテアーゼの複雑な異種性が原因であった。 本発明の要約 本開示は、組換え体APPのタンパク質分解性分解を基礎にした特異的検定を反 応生成物の免疫化学的検出と組み合わせて用いてAPPプロセッシング酵素のいく つかを同定する方法を記載する。本発明の検定は、APPからのベータアミロイド の生成にある役割を演じるための正確な特異性及び適切な局在性を有するヒト脳 プロテアーゼを同定する。 ここに開示した検定の書式は、同定プロテアーゼとともに、大量のサンプルを 合理的に処理し、検出の免疫化学的方法により良好な感受性を生じる。さらに本 検定の簡便性により、実験室の技術者が容易に常用し得るし、一貫した再現可能 な結果が生じ得る。これら の並びにその他の改良を以下に記す。 本発明の一目的は、AD患者を治療するために用い得る薬剤を見出すための方法 を提供することである。前述のように、39〜42アミノ酸ペプチドベータアミロイ ドを産生するためのAPPのタンパク質分解性分解は、アミロイド斑形成の病態生 理学的工程の第一段階である。証拠のいくつかのラインは、AD脳中に見出される 神経変性特徴におけるベータアミロイド及びアミロイド斑の原因的役割を指し示 す。これらを以下に示す： （ｉ）変性中のニューロンを伴う斑物質及び異栄養性神経突起の同時局在化（ Price et al.，1989，BioEssays，10:69で検討されている）； （ii）ベータアミロイドが培養中のニューロンに対して有毒であり得る証拠（ Yankner et al.，1990，Science，250:270）； （iii）ベータアミロイドがニューロン変性に関連し、ある種の動物モデルで 試験した場合に記憶を変えたという証拠（Flood et al.，1991，PNAS，88:3363 ；及びKowall et al.，1991，PNAS，88:7247）； （iv）APPにおける点突然変異を有するある種の形態の遺伝性ADの同時分離（C oate et al.，1991，Nature，349:704；Yoshioka et al.，1991，Biochem．Biop hys．Res．Comm.，178:1141；Chartier-Harlin et al.，1991，Nature，353:844 ；Murrell et al.，1991，Science，254:97；及びMullan et al.，1992，Nature Genetics，1:345）。 したがって、APPのベータアミロイドへのタンパク質分解性変換は、ADの病因 における必須段階であり、例えば治療介在のための重要な標的であると思われる 。関連したプロテアーゼ活性の同定、並びに適切なin vitroすに検定の開発は、 したがってAD患者における アミロイド斑形成を遮断するための治療として用い得る治療用プロテアーゼ阻害 剤の開発に必ず先要である。 本発明は、タンパク質分解性ベータアミロイド生成の阻害剤を発明するのに用 い得る２つの開発に関する： （１）ホロAPP基質、及びAPPを分解する高度精製プロテアーゼ又はAPPを分解 し得る未同定プロテアーゼを含有する粗製生物抽出物のいずれかを包含するin v itro検定；並びに （２）上記（１）に記載のin vitro検定系とともに用いた場合にアミロイド性 又は前アミロイド性APP C末端断片を精製し得るヒト脳からの特異的プロテアー ゼの同定及び精製。 本検定は、Ｃ末端APP断片を産生するためのin vitro APP分解活性の検出を可 能にする。粗製生物抽出物とともに用いた場合、本検定を用いて検出活性に関与 するプロテアーゼの精製をモニタリングし得るし、又はそのプロテアーゼを特性 表示し得る。 さらに、精製プロテアーゼ又は未同定APP分解酵素活性を含有する粗製生物抽 出物とともに用いた場合、本検定を用いて検定混合物中で同時インキュベートさ れる化学又は生物化合物によるAPPプロセッシング活性の阻害を測定しうる。そ れにより同定される阻害化合物は、AD患者に特徴的なin vivoアミロイド斑形成 の治療用阻害剤としての使用法を有する。 上記（２）により同定されるプロテアーゼとしては、アスパラギン酸プロテア ーゼ、カテプシンＤ、及びカテプシンＧとは異なり、Ｎ−［トシル−Ｌ−フェニ ルアラニン−クロロメチルケトン（“TPCK”）及びアルファー２ アンチプラス ミン、並びにジャガイモからのキモトリプシン阻害剤により阻害されるキモトリ プシン様セリンプロテアーゼが挙げられる。カテプシンＤの同定は特に有意であ る。カテプシンＤは、それぞれ10.0kDa及び5.6kDaの大きさのＣ−100及 びベータアミロイド様断片を生成し得ることを我々は明示する。 この発見により、上記（１）に記載のin vitro検定又は本発明に記載されてい るようなより簡単な高スルーブットペプチダーゼ検定を用いてその活性の阻害剤 を探究するためにあらゆる精製又は単離カテプシンＤが使用できる。 さらに、カテプシンＤの特異性並びに特異的アスパラギン酸プロテアーゼ阻害 剤の設計については多くが公知であるため、アミロイド原性プロテアーゼとして のカテプシンＤの同定は、確立された方法を用いた特異的カテプシンＤ阻害剤の 開発並びに確立されたカテプシンＤ阻害剤の利用をともに可能にする。 さらに、カテプシンＤは意外にも、Glu（593）−Val（594）（ナンバリングは Kang等（上記）に依る）間のペプチド結合でAPPを加水分解することを下記に示 す。カテプシンＤの好ましい特異性は、普通は、疎水性残基間に認められる。こ の情報は、カテプシンＤ阻害剤の設計にさらに用い得る。 上記のように、それによって同定される阻害化合物は、AD患者に特徴的なin v ivoアミロイド斑形成の治療用阻害剤としての使用法を有する。 本発明の使用により同定されたAPP分解酵素を精製し、使用して： （ｉ）プロテアーゼの同時局在化をAD脳病態とさらに相関させるのに必要な免 疫化学試薬を開発し；そして （ii）対応するプロテアーゼを単離し得る。次にクローン化cDNAを用いてプロ テアーゼ過剰発現の作用を査定し得るADのためのトランスジェニック動物モデル を構築する。 本発明の使用により同定されるAPP分解酵素阻害剤はさらに、例えばアフィニ ティークロマトグラフィーによるAPP分解酵素の精製 における配位子として有用である。カラムは一般に、必要な場合には炭化水素ス ペーサーアームを介して間接的に、酵素阻害剤が取り付けられた不活性マトリッ クス、例えばアガロースで包む。次に酵素を含有する組成物をカラムに適用し、 他のすべてのタンパク質が通過し、廃棄される間に、阻害剤により止められる。 次に酵素の特性を変え、もはや阻害剤と結合できないpHでの変形緩衝剤を用いて 溶離することにより、又は阻害剤を置換する競争的対配位子の使用により、酵素 をカラムから遊離させる。どちらの場合も、酵素はカラムを通過して収集され、 ここに至っては他のタンパク質は存在しない。さらに詳しくは、例えばT．Palme r，Understanding Enzymes，1991，Ellis Horwood，New York，3rd Edition（こ の記載内容は、参照により本明細書中に含めるものとする）を参照して頂きたい 。 合成ペプチド基質を組み込んだ検定は高度精製プロテアーゼ製剤のin vitro酵 素学的研究に有用であるが、しかし一般的に過多のプロテアーゼを含有する粗製 生物抽出物中の所望のプロテアーゼ活性の選択的検出を可能にするには不十分な 特異性を有する。例えば、脳組織は広範なそして種々のペプチドプロセッシング 及び分解酵素が豊富であるが、このことは、合成ペプチド基質を用いて特異的脳 APP分解プロテアーゼを単離する努力がなぜ首尾よく行かなかったかを説明し得 る（上記背景の項を参照）。 したがって下記の実施例３では、合成ペプチド検定により、特異化検定条件下 でＣ末端断片を産生するためのAPPを分解できないいくつかのペプチダーゼの同 定がなされ、APP分解プロテアーゼのパターンはいかなる点でも脳ペプチダーゼ の対応するパターンに類似しないことが示される。 この問題のさらに限定的なアプローチは、ホロAPPの基質として の使用、並びにプロテアーゼ含有分画を用いたインキュベーション後のその特異 的分解を査定する方法である。このために、本発明は、脳プロテアーゼ分画によ る組換え体APPの酵素分解がAPPのＣ末端領域に対する抗体を用いたイムノプロッ トによりモニタリングされるような方法を記載する。 我々の検定手順は、全長ベータアミロイドペプチドを含むのに十分なサイズの APPからのＣ末端断片の生成に焦点を合わせている（内部タンパク質分解を要す る工程。Ａ４領域に対するＮ末端）。 ヒト脳組織（非AD対照又はAD）を均質化し、次いで慣用的超遠心分離を用いて 可溶性分画（以後“Ｓ”）、1,500ｇ後ペレット（以後“Ｐ−２”）及びミクロ ソーム分画（以後“Ｍ”）に亜分別する。膜性Ｍ及びＰ−２分画をTriton X-100 製剤で可溶化する。その結果生じるＭ及びＰ−２、並びにＳ分画からの可溶性分 画を次に別々にMono−Ｑ強陰イオン交換カラム上でクロマトグラフィー処理する と、異なる脳プロテアーゼが分離する。 ベータアミロイドのＮ末端周囲のアミノ酸配列をまねた合成ペプチドを用いて 、Ｍ、可溶性及びＰ−２分画からの精製による個々のモノ−Ｑ分画のペプチダー ゼ活性を査定する。ペプチダーゼ活性の別々のピークの回収に基づいてカラム分 画の連続プールを作る。 ペプチダーゼ活性のプールを用いて、トランスフェクト化CHO細胞株から精製 された高度精製組換え体APPのタンパク質分解性分解の検出のための検定条件を 確立する。APP C末端ドメイン又はベータアミロイド領域に向けられる抗体を用 いてＣ末端APP断片を置くイムノプロット検定を開発する。本検定を用いて、全 長ベータアミロイドを潜在的に含有するのに十分大きいサイズのAPP C末端断片 を生成することができる６つの潜在的に異なるタンパク質分解活性を同定する。 モノ−Ｑプール間のAPP分解活性の回収が段階２で確 立されたペプチダーゼ活性プロフィールとよく相関することは見出されなかった 。阻害剤研究により、APP分解活性にはセリン及びアスパラギン酸プロテアーゼ 活性の両方が含まれることが明らかになった。 酵素精製をモニタリングするためにペプチダーゼ検定を用いることは断念され ている。組換え体APPのより大きな供給は、バキュロウイルス特定昆虫細胞系中 での発現により得られ、タンパク質精製中のAPP分解活性をモニタリングするた めの主要な方法としてのAPP分解検定の使用を可能にする。主なアスパラギン酸 プロテアーゼ活性は、Ｐ−２分画のモノ−Ｑ精製からの分画中で同定される。 さらなる精製及び特性表示実験は、酵素がカテプシンＤである個とを立証する 。カテプシンＤは、5.6kDaのベータアミロイド様断片を生成するホロAPPを加水 分解することが示されている。 アプロチニンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて、上記 で同定されたアプロチニン感受性APP分解活性を単離しようとした。11，14及び1 8kDaの特異的Ｃ末端断片を生成するためにAPPを分解し得るキモトリプシン様セ リンプロテアーゼ活性を一部精製するが、これは免疫化学的手段により全長ベー タアミロイドを含有することが示された。 この手順により、APPのアミロイド原性分解にある役割を演じる可能性が高い いくつかの脳プロテアーゼ活性をわれわれは同定した。本明細書に記載した同定 又は非同定活性の各々を、APP分解検定とともに用いて、治療的価値を有する選 択的プロテアーゼ阻害剤をスクリーニングした。 本明細書中で用いる場合、“APP基質”という用語は、生物供給源からの単離 又は精製により得られるかあるいはAPP又はその類似体、及びタンパク質又はそ の一部の消化により得られる断片、APPタ ンパク質の一部をコードする遣伝子の発現によりエンドソーム−ライソソームれ る断片、及びAPPの一部に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含めた あらゆるこのようなタンパク質の断片をコードするクローン化遣伝子の発現によ り得られるか否かにかかわらず、全長APPを意味する。 本発明の検定のためのAPP基質は、種々の形態で試験試薬として提供される。A PP 695に好ましくは由来するか、又はそのアミノ酸配列に少なくとも一部対応す るけれども、他のAPP同型（上記）の誘導体又は類似体が、同様に本発明の方法 に用いるために意図される。APP 695は、Schubert等（1989，Proc．Natl．Acad ．Scj．USA，86:2066）が記載しているように、天然供給源から生化学的分離又 は精製により、あるいはタンパク質又はその機能性部分をコードする組換え体DN Aクローンの発現（knops et al.，1991，J．Biol．Chem.，266:7285；及びBhasi n et al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:10307）により得られる。 APPタンパク質の断片は、関連するタンパク質分解試験サンプル活性（上記） による認識及び切断に十分なアミノ酸の配列を包含する。生物物質からのAPPの 単離は、通常、クロマトグラフィー、特にアフィニティークロマトグラフィーの ような慣用的技術による精製を包含する。精製APP又はその断片を用いてモノク ローナル又はポリクローナル抗体を調製し、次いでこれを慣用的手法によるアフ ィニティー精製に用い得る。その結果生じた精製APP物質をさらに処理し、例え ば化学的又は酵素消化により断片化し得る。関連するタンパク質分解試験サンプ ル活性（上記）に対する所望の感受性に関してスクリーニングすることにより、 有用な断片を同定する。 前述のように、APP基質は、APP又はその一部をコードする組換え体DNAクロー ンの発現により調製し得る。クローン化APP遣伝子 は、それ自体天然でも合成でもよく、天然遣伝子は、公知のアミノ酸配列を基礎 にした変性プローブを用いてcDNA又はゲノムライブラリーから得られる（Kang e t al.，1987，Nature，325:733）。適切な組換え体DNAを得るための他の方法、 並びにクローン化遣伝子を発現するための方法は、当業者には明らかである。 試験サンプルの存在下でのAPP基質のタンパク質分解性切断の検出には、種々 の便利な方法が適用できる。目下のより好ましい方法のいくつかを以下に示すが 、しかしながらこれについての本発明の特徴から逸脱しない限りこの工程に多数 の他の方法を用い得ることは当業者には認識される。概して、このためには、AP P基質のタンパク質分解性切断の発生を検出できるあらゆる方法を用い得る。こ のことは切断が単一産生種、例えば光学的反応性物質、例えば着色又は蛍光染料 を生じるようにAPP基質の適切な設計によりもたらされる。 別の主なアプローチとしては、イムノアッセイによるといったような、１つ又 はそれ以上の切断生成物の感受性検出が含まれる。現在、このような切断生成物 は好ましくはAPP基質のＣ末端断片デある；しかしながら、サンプルとのインキ ュベーション時に出現するあらゆる断片が検出の対象である。 病的タンパク質分解活性の特徴である１つ又はそれ以上の切断生成物の検出は 、多数の方法により達成し得る。下記の実施例でさらに実証されるこのような方 法の１つは、ウエスターンブロットとして一般に公知の手順を包含する。典型的 には、試験サンプルと一緒にAPPをインキュベーション後に、ゲル電気泳動を実 施して成分を分離して反応混合物を生じる。次に分離タンパク質成分をニトロセ ルロース膜のような固体マトリックスに移す。 APP分解に特徴的な断片に特異的な抗体を次に膜に固定された成 分と反応させ、二次酵素標識化抗体抱合体の付加により検出する。その結果生じ た結合抱合体の位置選定を酵素標識のための色原性基質で発現させる。 一般に有用な試験系を受けることが可能な種々のイムノアッセイ書式は、APP 断片の検出に適用できる。典型的には、APP基質を試験サンプルと一緒にインキ ュベートし、その結果生じた無傷APPを固定化させ（例えば固相上に捕獲するこ とにより）、あるいは試験サンプルを固定化形態のAPP基質と一緒にインキュベ ートする。次に固定化APP基質をAPP基質の一部に対する抗体試薬と反応させるこ とによりタンパク質分解性切断を検出して、APP基質から切断し、又は切断部位 を限定する。 抗体試薬は、全抗体又はFab又はFab′のような抗原結合部位を含む抗体断片を 包含し得るし、モノクローナル型であっても又はポリクローナル型であってもよ い。固定化相と結合した抗体試薬の検出は、特徴的タンパク質分解性切断の非存 在示す。逆に、固定化相と結合している抗体がないことは、APP切断を示す。抗 体試薬の結合の検出は、一般に標識化形態のこのような抗体試薬の使用、あるい は二次又は抗−抗体、即ち標識された抗体の使用を伴う。 APPの捕獲又は固定化は、多数の方法で達成し得る。抗体は、切断可能な断片 上にないAPPのエピトープに特異的に産生される。このような抗体を固定化し、 使用して無傷面APPを捕獲又は固定化し得る。あるいは、配位子又はハプテンをA PPに共有的に付着させて、対応する固定化受容体又は抗体を用いてAPPを捕獲又 は固定化し得る。このために有用な典型的配位子：受容体対は、ビオチン：アビ ジンである。このために有用なハプテンの例は、フルオレセイン及びジギトキシ ゲニンである。 APP基質が固定化又は捕獲される固相は、微小滴定プレートウエ ル、試験管、ストリップ、ビーズ、粒子等を含めた種々の物質から成る。特に有 用な固相は、磁性又は常磁性粒子である。このような粒子を誘導化して、簡単な 化学反応により種々の化合物と結合し得る化学的に活性な基を含有させることが できる。粒子を入れた容器に磁石を近づけて粒子を懸濁液から取り除く。かくし てやっかいな遠心分離又は濾過に依らずに粒子を繰り返し洗浄して、検定手順を 十分に自動化するための基礎を提供する。 一次又は二次抗体試薬のための標識は、当業界で十分公知のものから選択し得 る。このような標識のいくつかは、蛍光又は化学発光性標識、放射性同位元素で あり、そしてより好ましくはこのための酵素はアルカリ性ホスファターゼ、ペル オキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。これらの酵素は種々の条件下で 安定であり、高触媒回転率を有し、簡単な色原性基質を用いて検出し得る。 APP基質のタンパク質分解性切断は、クロマトグラフィー法によっても検出さ れ、APP断片が分離され、次いで検出される。高圧液体クロマトグラフィー（HPL C）はこの点で特に有用である。この方法を用いるに際しては、蛍光標識したAPP 基質を調製する。試験サンプルとともにインキュベーション後、反応混合物をク ロマトグラフィーカラムにかけて、蛍光性断片対無傷APPの移動の示差速度を観 察する。 本発明はさらにAD罹患患者を治療するための方法であって、このような患者に 単独の又は非毒性不活性の製薬上許容可能な賦形剤との混和物中のアスパラギン 酸プロテアーゼのそのために有効な量の阻害剤を投与することを包含する方法に 関する。 本発明はさらに、非毒性不活性の製薬上許容可能な賦形剤との混和物中のアス パラギン酸プロテアーゼのこのような阻害剤を含有する製剤処方物に関する。 本発明はさらに、用量単位でのこのような製剤処方物を包含する。これは、処 方物が個別パーツ、例えば錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル、坐薬及 びアンプルの形態で存在し、その阻害剤含量は分画又は多数回に分けた個々の投 与量に対応することを意味する。用量単位は、例えば１，２，３又は４回分に分 けた量、あるいは個々の用量の１／２、１／３又は１／４を含有し得る。個別用 量は、好ましくは１回の投与で与えられる、そして通常は１日用量の全部、１／ ２、１／３又は１／４に対応する活性化合物の量を含有する。 非毒性、不活性の製薬上許容可能な賦形剤により、固体、半固体又は液体希釈 剤、充填剤及び全タイプの処方物補助剤が考えられる。 言及し得る好ましい製剤処方物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピ ル、顆粒、坐薬、溶液、懸濁液及び乳濁液、ペースト、軟膏、ゲル、クリーム、 ローション、散粉及びスプレーである。錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、 ピル及び顆粒は、例えば（ａ）充填剤及び増量剤、例えばデンプン、ラクトース 、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えばカ ルボキシメチルセルロース、アルジネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン 、（ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシ ウム及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液抑制剤、例えばパラフィン、（ｆ）吸収促 進剤、例えば第四アンモニウム化合物、（ｇ）浸潤剤、例えばセチルアルコール 及びグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸収剤、例えばカオリン及びベント ナイト、（ｉ）滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マ グネシウム及び固体ポリエチレングリコール、あるいは上記（ａ）〜（ｉ）に列 挙した物質の混合物のような通例の賦形 剤に加えて阻害剤を含有し得る。 錠剤、糖衣錠、カプセル、カプレット、ピル及び顆粒は、任意に乳白剤を含有 する通例のコーティング及びシェルで提供し得るし、それらが阻害剤のみを又は 好ましくは腸管のある部分に、任意に遅延方式で放出し得るような組成物であっ てもよい。用い得る包埋組成物の例は、高分子物質及びワックスである。 阻害剤はさらに微小カプセル封入体形態で、適切な場合には１つ又はそれ以上 の上記賦形剤とともに存在し得る。 坐薬は、阻害剤の他に、通例の水溶性又は水不溶性賦形剤、例えばポリエチレ ングリコール、脂肪、例えばカカオ脂肪及び高級エステル（例えばＣ10脂肪酸を 有するＣ14−アルコール）、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。 軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば 動物性及び植物性脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、 セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ 酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。 散粉及びスプレーは、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えばラクトース、タル ク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又は これらの物質の混合物を含有し得る。スプレーはさらに通例の推進剤、例えばク ロロフルオロカーボンを含有し得る。 溶液及び乳濁液は、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば溶剤、可溶化剤及び 乳化剤、例えば水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカルボ ネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロ ピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、 特に綿実油、 落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロー ル、グリセロールホルマル、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレン グリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、又はこれらの物質の混合物を含 有し得る。 非経口投与のために、溶液及び乳濁液は血液と等張の滅菌形態であってもよい 。 懸濁液は、阻害剤の他に、通例の賦形剤、例えば液体希釈剤、例えば水、エチ ルアルコール又はプロピレングリコール、及び懸濁剤、例えばエトキシル化イソ ステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステ ル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及 びトラガカントゴム、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。 上記の処方形態は、着色剤、防腐剤、並びに香り−及び風味改良添加剤、例え ばペパーミント油及びユーカリ油、並びに甘味剤、例えばサッカリン又はアスパ ルタムを含有し得る。 阻害剤は総混合物の約0.1〜99.5重量％、好ましくは約0.5〜95重量％の濃度で 上記の製剤処方物中に存在する必要がある。 上記の製剤処方物は多数の阻害剤を含有し得るが、この場合、上記製剤処方物 中の阻害剤の総量は、総混合物の約0.1〜99.5重量％、好ましくは約0.5〜95重量 ％である。本発明の処方物は、本発明の阻害剤に加えて他の活性成分を含有し得 る。 上記の製剤処方物は、公知の方法により、例えば単数又は複数の活性化合物を 単数又は複数の賦形剤と混合することにより、通例の方法で調製し得る。 上記の処方物は、経口的に、経直腸的に、経頬的に、非経口的に（静脈内、筋 肉内又は皮下に）、槽内に、膣内に、腹腔内に又は局所的に（散粉、軟膏又は滴 剤）投与し得る。適切な処方物は、注射 液、経口治療様の溶液及び懸濁液、ゲル、ポアーオン処方物、乳濁液、軟膏又は 滴剤である。眼科用及び皮膚科用処方物、銀塩及び他の塩、耳用滴剤、眼用軟膏 、粉末又は溶液を局所治療に用い得る。さらに、ゲル、粉末、散粉、錠剤、持続 性放出錠剤、プレミックス、濃縮物、顆粒、ペレット、カプセル、カプレット、 エアゾール、スプレー及び吸入物を用いることができる。阻害剤はさらに、他の キャリヤー物質、例えばプラスチック（例えば局所治療用のプラスチックの鎖） 、コラーゲン又は骨セメント中に組み込み得る。 作用部位は脳であるため、阻害剤は血管脳関門を通過しなければならない。こ れには、いくつかの場合には、例えば親液性キャリヤーとの結合により、又は親 液性置換基、例えば炭化水素、例えば長鎖アルキル基、アルケニル基、例えばビ ニル等の導入により、阻害剤の親液性が増大されることが必要である。親液性を 増大するためのこのような修飾は、慣用的であって、当業者の技術の範囲内であ る。例えば、R.B．Silverman，“The Organic Chemistry of Drug Design and D rug Action”，1992，Academic Press，San Diego（この記載内容はすべて参照 により本明細書中に含めるものとする）の特に361〜364ページを参照して頂きた い。親液性増大を達成するためのあらゆる慣用的方法が意図される。適切な親液 性キャリヤーの例としては、N．Bodor等が創案し、Silverman（同上）が362ペー ジで考察している可逆的酸化還元剤供給系がある。N．Bodor et al.，1983，Pha rmacol．Ther.，19:337；及びN．Bodor，1987，Ann．N.Y．Acad．Sci.，507:289 （これらの記載内容はすべて参照により本明細書中に含めるものとする）も参照 のこと。 概して、24時間毎に体重１kg当たり約0.5〜500mg／kg、好ましくは５〜100mg ／kgの総量で、適切な場合には何回かに分けて投与する形態で、阻害剤を投与し て、所望の結果を達成するのが有益で ある。個々の用量は、好ましくは約１〜約80mg／kg、特に３〜30mg／kgの量で阻 害剤を含有する。しかしながら、言及した用量から逸脱する、特に疾病の性質及 び重症度の、処方物の性質の、医薬剤の投与の、並びに投与実施の期間又は間隔 の関数としてそうする必要があるかもしれない。したがって、ある場合には、上 記量以下の阻害剤で処理に十分であるかも知れないが、他の場合には専門的知識 に基づいてあらゆる専門家が上記量の阻害剤を容易に確定し得る。定義 本明細書中で用いるアミノ酸の３文字又は１文字での略語を下記に示す： 図面の簡単な説明 図１ａ〜１ｆは、ADヒト皮質亜分画と比較した場合の対照のペプチダーゼ活性 の二次元等値線ブロットを示す。 Ｐ−２，Ｓ及びＭ分画のイオン交換（モノ−Ｑ）分離により、実施例１にした がって亜分画を調製した。Mono−Ｑ分画によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val- Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）の酵素的 切断を実施例３に記載されているように実施した。各ブロットは、同一インキュ ベーション条件下で各モノ−Ｑ分画（縦座標）のインキュベーションにより得ら れる各蛍光性物質（横座標）の相対量を示す。物質の量は、等値線により垂直に 示す。等値線が多い程、特定の物質の量も多いことを示す。対照Ｓ（ａ）、AD Ｓ（ｂ）、対照Ｍ（ｃ）、AD Ｍ（ｄ）、対照Ｐ−２（ｅ）、AD Ｐ−２（ｆ） からのモノ−Ｑ分画に分析を施した。３つのADプロットの右手縦座標上のローマ 数字は、実施例３に記載のプール領域の位置を示し、次に実施例８にしたがって これを検定すると、有意APP分解活性を含有することが判明した。 図２ａ〜２ｆは、AD皮質に由来するＭ，Ｓ、又はＰ−２分画のイオン交換分離 からの選択モノ−Ｑに関連したAPP 695分解活性のイムノブロット分析を示す。 プールは、実施例３に記載されているようなペプチダーゼ活性のそれらの含量 を基礎にして作った。イムノブロット検定は、実施例８に記載されているように 実施した。以下のプールに関する代表的 検定を示す： 図２ａ： Ｐ−２プールＶに関連した活性： APPは、レーン２〜６の各々に 認められた。PMTI 73からのＣ−100（レーン１）、無Ｐ２−Ｖブランク（レーン ２）、Ｐ２−Ｖ（レーン３）、Ｐ２−Ｖ＋EDTA（レーン４）、Ｐ２−Ｖ＋メタノ ール（レーン５）、及びＰ２−Ｖ＋メタノールに溶解したペプスタチンＡ（レー ン６）。 図２ｂ： ＭプールIIIに関連した活性：APPは、レーン２〜７に認められた。 PMTI 73からのＣ−100（レーン１）、Ｍ−III＋シスタチンＣ（レーン２）、Ｍ −III＋アプロチニン（レーン３）、Ｍ−III＋カプトプリル（レーン４）、Ｍ− III＋EGTA（レーン５）、Ｍ−III＋Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-As p-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（レーン６）、阻害 剤を伴わないＭ−III（レーン７）、及び予染分子量マーカー（レーン８）。 図２ｃ： ＳプールＩに関連した活性： APPは、レーン２〜６の各々に認め られた。Ｓ−Ｉ＋Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-net-Asp-Ala-Glu-Phe-Ar g-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（レーン２）、Ｓ−Ｉ＋EGTA（レーン ３）、Ｓ−Ｉ＋カプトプリル（レーン４）、Ｓ−Ｉ＋アプロチニン（レーン５） 、Ｓ−Ｉ＋シスタチン（レーン６）、及びPMTI 73からのＣ−100（レーン７）。 レーン１は予染分子量マーカーを含有する。 図２ｄ： AD Ｐ−２の分離からの個々のモノ−Ｑ分画中で回収した活性： Ｐ−２プールVIIが他所で観察される伝導領域に対応するモノ−Ｑ分画38〜43を 個別にAPP分解活性に関して調べた。各分画に関しては、組換え体APP 695の非存 在下（−）又は存在下（＋）の両方でインキュベーションを実施した。分画番号 は、図２上に記してある。使用したＣ−100基準は、PMTI 100からのものであ った。Mrは分子サイズマーカーを示す。 図２ｅ： PMTI 73又はPMTI 100により向けられるＣ−100生成物の移動位置の 比較：PMTI 73（レーン１及び３）及びPMTI 100（レーン２及び４）のタンパク 質生成物を分子マーカー（レーン５）と比較して示す。 図２ｆ： 生成物形成の典型的時間経過：APP＋Ｍ−IIIを、ｔ＝０時間（レー ン１）、５時間（レーン２）、20.5時間（レーン３）、44.5時間（レーン４）及 び55時間（レーン５）に分析した。分子量マーカー（レーン６）、Ｃ−100 PMTI 73（レーン７）及びＭ−IIIを伴わないAPP（レーン８）を示す。 上記図２ａ〜２ｆの各々に関しては、移動は上から下までであった。２ｅ〜２ ｄ及び２ｆでは、上実線矢印はホロAPPの移動位置を示し、下実線矢印はＣ−100 の移動位置を示す。図２ｄでは、二重線矢印は酵素により生じたＣ−100断片の 推定上のオリゴマーの移動の位置を示す。全阻害剤の濃度は後述の表４に列挙す る。 図３ａ及び３ｂは、ゲル濾過によりＰ−２ VIIプールをさらに精製した結果を 示す。 図３ａ： モノ−Ｑ10/10クロマトグラフィーからのＰ２プールVII分画をプー ルし、0.25mlに濃縮して、150mM NaClを含有する10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5中で 平衡させた縦配列の２つのSuperose 6HR 10/30カラムに適用した。0.3ml／分の 流速で溶離を実施し、カラム溶離液を280nmでモニタリングした。分画（0.24ml ）を収集し、イムノブロットを用いてペプチダーゼ活性及びAPP分解検定を施し た。矢印は、APP分解活性が回収されたクロマトグラムの領域の位置を示す。Ｋ −Ｍ（黒丸）及びＭ−Ｄ（白丸）結合切断に関連したペプチダーゼ活性も示す。 クロマトグラフィーは22℃で実施した。 図３ｂ： 公知の分子量を有する指示標準タンパク質に対するAPP分解活性の 移動を用いて、実施例８に列挙したAPP分解プロテアーゼのMr見掛けを算出した 。 図４は、ベータアミロイドペプチドに対して生じたネズミ類モノクローナル抗 体のペプチドエピトープマッピングを示す。微小滴定プレートを合成APP 695（5 97〜638）（ベータアミロイド１〜42）50ngで覆い、遮断して、次に予インキュ ベート（室温で６０分）した１00μｌのＣ286.8Ａ（80ngのIgG）とともに指示濃 度の競争相手ペプチドの存在下又は非存在下でインキュベートした。ペプチド１ 〜７はペプチド配列番号：１と呼ばれることに留意。室温で60分インキュベーシ ョン後、プレートを洗浄し、結合抗体の量を、標準手法（Wunderlich et-al.，1 992，J．of Immumol．Methods，147:1）にしたがってホースラディッシュペルオ キシダーゼ−結合ヤギ抗マウスポリクローナル抗体で展開することにより確定し た。プレートに結合する抗体の％競合（％Ｃ）を、以下の等式を用いて450nmで の吸光率データから算出した： 図５： ヒト脳Ｐ−２亜分画の精製からのイオン交換分画で回収されたAPP 69 5プロセッシング活性。123分画すべてをカラムから収集した。最初の32分画は負 荷及び洗浄相に対応した。塩勾配は分画33で開始した。分画３〜18（パネルａ） 、21〜32（パネルｂ）、33〜38（パネルｃ）及び39〜44（パネルｄ）のスクリー ンを示す。各分画に関して、APP 695基質の非存在下（−）及び存在下（＋）で インキュベーションを実施した。０又は24時間に関するAPP 695のインキュベー ションは、適切な場合には位置を示す。インキュベーションは以下のように実施 した：バキュロ由来ホロAPP 695（80nm ）を、100mM Mes緩衝液pH6.5，0.008％（ｖ／ｖ）Triton X-100，160mn NaCl，6 .7mM Tris（APPストックから）を含有する総量15μｌ中の各カラム分画５μｌと ともにインキュベートした。SDS-PAGEサンプル緩衝液を付加することにより24時 間後に反応を終了させた。実施例８に記載されているように、実施例６のＣ末端 ポリクローナル抗血清を用いてイムノブロットを展開させた。矢印は生成断片の 位置を示す。分画45〜86も調べたが、しかし相対的に低い活性しか示さなかった （したがって図示していない）。ピークＡ及びＢは、主要活性の位置を示す。 図６は、ゲル濾過におけるＰ−２由来APP分解活性の精製結果を示す：カテプ シンＤの溶離との相関。パネル（ａ）Superose 6HRカラム上でのＰ−２ピークＢ の精製に関する280nm溶離プロフィール。パネル（ｂ）及び（ｃ）実施例５に記 載されているようにして必然的に確定される溶離分画49〜60における対応するAP P C末端プロセッシング活性。矢印は主要生成帯の位置を示す。パネル（ｄ）及 び（ｅ）カテプシンＤ（１／300希釈液）に対するウサギポリクローナル抗体を 用いた溶離分画のイムノブロット分析。矢印は免疫反応帯の移動位置を示す。ヒ ト肝臓カテプシンＤも比較のために分析した。 図７は、Ｐ−２亜分画から単離されたプロテアーゼ活性のプロテアーゼ阻害剤 特異性を示す。反応（32μｌ）はAPP付加により37℃で開始して、その後の初期 成分条件を達成した：ゲル濾過の15〜25kDa領域からのＰ−２酵素（2.54μｇ／m l）分画（図６）；96mM Mes緩衝液pH6.5中のAPP（168nM）。15μｌの３ｘサンプ ル緩衝液を付加することにより26時間後に反応を終了させて、APP C末端に対す るウサギポリクローナル抗血清の１／1000希釈液を用いてイムノブロット分析し た。以後の阻害剤付加の効果を示す；阻害剤無含有 （レーン７及び20）、１mM EDTA（レーン５）；エタノール中の400μＭ PMSF（ レーン９）；エタノール単独（レーン11）；100μＭＥ−64（レーン13）；10μ ｇ／mlアプロチニン（レーン22）；DMSO中の100μＭペプタチンＡ（レーン26） ；DMSOのみ（レーン24）。０時間（レーン２及び30）及び26時間（レーン３及び 28）のAPPインキュベーションの効果も示す。レーン４，８，12，19，23及び27 はＣ−100標準を含有した。予染分子量マーカーはレーン１及び29に存在する。1 8及び28kDaのＣ末端生成物断片の位置を矢印で示す。 図８は、APP C末端ドメインに対する抗体を用いてモニタリングしたカテプシ ンＤ触媒APP切断の時間経過を示す。パネル（ａ）は、86μＭペプスタチンＡの 非存在下（レーン10〜14）又は存在下（レーン４〜８）でのカテプシンＤによる APPタンパク質分解の時間経過を示す。APPは単独でも（レーン１〜３）インキュ ベーションした。数値は反応開始後の時間（時間）を示す。反応は、APPを付加 することにより37℃で開始し、以下の初期成分濃度を達成した：MeS緩衝液pH6.5 中のAPP（82nM）、カテプシンＤ（9.2μｇ／ml）、ペプスタチンを含有しないサ ンプルには、同量の溶媒（1.3％ｖ／ｖメタノール）を入れた。ｔ＝０，43，84 ，140及び215分で、アリコート（15μｌ）を除去して7.5μｌのSDS-PAGEサンプ ル緩衝液と混合し、APP C末端ドメインに対するウサギ抗血清を用いてイムノブ ロット分析した。18及び28kDaの反応生成物の位置を矢印で示す。 図９は、Ｐ−２由来酵素又はカテプシンＤによるAPP C末端プロセッシングのp H及びイオン強度依存性を示す。バネル（ａ）は、カテプシンＤ及びＰ−２酵素 で観察されたpH依存性を示す（ピークＢ、図５、ゲル濾過クロマトグラフィー後 、図６）。パネル（ｂ）は 、pH6.5での両酵素に関するイオン強度依存性を示す。反応は、酵素付加により3 7℃で開始し、以下の初期成分濃度を達成した：カテプシンＤ（9.2μｇ／ml）又 は図６からのＰ−２酵素（11.7μｇ／ml）、酢酸ナトリウム、MeS及びTris-HCl の各々中に100mM、及び精製APP（79nM）。ｔ＝０及び３時間で、アリコート（15 μｌ）を除去して7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液と混合し、実施例８にしたがっ てＣ末端ポリクローナル抗血清を用いてイムノブロット分析した。28，18及び14 kDaの反応生成物の位置を矢印で示す。 図10は、Superose 6HR上でさらに精製後のカテプシンＤ及びＰ−２酵素（ピー クＢ、図５）によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe- Arg-NH2（配列番号：７）の切断を示す。反応を酵素／阻害剤付加により37℃で 開始し、それにより以下のｔ＝０成分濃度を達成した：酢酸塩、MeS及びTris pH 5.0の各々中に130mMを包含するカクテル緩衝液中にカテプシンＤ（2.8μｇ／ml ）又は図６からのＰ−２酵素（17.5μｇ／ml）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（58μ Ｍ）、カプトプリル（0.3mM）。サンプルはペプスタチンＡ（３％ｖ／ｖ最終メ タノール中に213μＭ）又は最終的に等濃度のメタノールのみを含有した。０， ２，４，８及び24時間で、12％（ｖ／ｖ）TFA（10μｌ）を付加して反応を終了 させて、実施例２及び３にしたがってHPLC分析を施した。以下のものに関する代 表的痕跡を示す：Ｐ−２酵素、ｔ＝０時間（パネルＡ）；Ｐ−２酵素、ｔ＝24時 間（パネルＢ）；Ｐ−２酵素＋ペプスタチンＡ、ｔ＝24時間（パネルＣ）；カテ プシンＤ、ｔ＝０時間（パネルＤ）；カテプシンＤ、ｔ＝24時間（パネルＥ）； 及びカテプシンＤ＋ペプスタチンＡ、24時間（パネルＦ）。 図11は、カテプシンＤ及びＰ−２酵素（ピークＢ）によるＮ−ダンシル−Ile- Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2（配列 番号：７）切断のpH依存性を示す。反応条件は本質的に図10に記載されていると おりであったが、但しカクテル緩衝液は指示pH値に調整し、インキュベーション 時間はＰ−２酵素に関しては23時間、カテプシンＤに関しては５時間であった。 （ａ）カテプシンＤによる切断、及び（ｂ）Ｐ−２酵素による切断。-Glu-Val- （黒丸）及び-Met-Asp-（白丸）結合での切断率を各場合で示す。 図12は、カテプシンＤによるAPPの予備的消化からの反応生成物のSDS-PAGE分 析である。パネル（ａ）は帯切断前のコーマシーcoomassie染色したエレクトロ ブロットの写真であり、パネル（ｂ）は、帯切断後の対応するブロットであり、 パネル（ｃ）はパネル（ａ）及び（ｂ）に示したものに対する一連の平行する反 応の対応するイムノブロット分析（モノクローナル286.8Ａの１／100希釈液）で ある。（ａ）における反応は、基質付加により37℃で開始して、それにより以下 の初期成分濃度を達成した：30mM NaClを含有する40mM酢酸ナトリウムpH5.0中に APP（15.6μＭ）、カテプシンＤ（0.17μＭ，7.145μｇ／ml）。ｔ＝16時間で、 反応混合物を高速真空により15μｌに濃縮し、7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液と 混合し、SDS-PAGE処理した。（ｃ）における反応は、本質的に同一方法で実施し たが、但しAPP濃度は3.2μＭに下げた。両実験（ａ及びｃにおける）に関しては 、完全インキュベーション系を用いて（レーン３）、カテプシンＤの非存在下で （レーン４、同一緩衝液付加直後にカテプシンＤをあらためて加えた）実施した 。各場合のレーン５は、カテプシンＤのみの対照を含有し、一方レーン６は移動 基準として精製APPを含有した。予染分子量マーカーはレーン１に存在する。（ ｃ）では、主要免疫反応生成物の位置を矢印で示す。 図13は、ベータアミロイドのＮ末端に対するモノクローナル抗体を用いてモニ タリングしたカテプシンＤ触媒APP分解の時間経過を 示す。APP付加により37℃で反応を開始して、それにより以下の初期成分濃度を 達成した：83mM酢酸ナトリウムpH5.0中にAPP（448μＭ）、カテプシンＤ（30μ Ｍ）、含有する場合にはペプスタチンＡ（97.2μＭ）。指示時点で、アリコート （20μｌ）を取り出して、10μｌの３ｘ SDS-PAGEサンプル緩衝液と混合し、モ ノクローナル抗体286.8Ａ（1／100）を用いてイムノブロット分析した。反応は ペプスタチンＡ（メタノールに溶解して供給）の非存在下（−）で又は存在下（ ＋）で実施した。サンプルにはすべて2.7％（ｖ／ｖ）メタノールを入れた。レ ーン１及び12は予染Mrマーカーを含有した。レーン10及び18はＣ−100 Mrマーカ ーを含有した。レーン11及び13はカテプシンＤを含まずにそれぞれ０及び21時間 インキュベートしたAPPを含有した。主要生成物断片を矢印で示す。 図14は、カテプシンＤ及びＰ−２由来酵素（ピークＢ）による合成ペプスタチ ンの加水分解の時間経過におけるアミノ酸置換の効果を示す。反応を基質付加に より37℃で開始して、以下の初期成分濃度を達成した：Tris，MeS及び酢酸塩緩 衝液pH5.0の各々中の135mM緩衝液中にカテプシンＤ（2.5μｇ／ml）又はＰ−２ ピークＢ酵素（7.5μｇ／ml）、Ｎ−ダンシル−ペプチド（58μＭ）、カプトプ リル（0.3mM）で、ペプスタチンＡ（213μＭ）、塩化ナトリウム（75mM）を含有 してもよい。種々の時点でアリコート（30μｌ）を取り出して、TFA中で12.5％ に調整して、RP−HPLC分析した。その後の基質／プロテアーゼ組合せに関する加 水分解の時間経過を示す： （ａ）カテプシンＤによるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH2（配列番号：７）； （ｂ）カテプシンＤによるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH2（配列番号：３）； （ｃ）Ｐ−２酵素（ピークＢ、図５、ゲル濾過後、図６）による Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2（配列番号 ：７）； （ｄ）Ｐ−２酵素（ピークＢ、図５）によるＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val- Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2（配列番号：３）。 Ｅ−Ｖ結合（矩形、パネルＡ及びＣ）、Ｍ−Ｄ結合（中黒菱形、Ａ及びＣ）で の、又は保持時間4.4分で代謝生成物を生じるため（Ｂ及びＤ）の切断を示す。 図15は、アプロチニンセファロース上での可溶化Ｐ−２分画の精製を示す。実 施例１にしたがって実験を実施した。（ａ）は典型的Ａ280nm溶離プロフィール であり、そして（ｂ）は溶離分画におけるAPPプロセッシング活性に関するイム ノブロット検定（APPのＣ末端ドメインに対するウサギ抗血清）である。矢印は 主要APP分解生成物の移動を示す。酸性溶離からの分画８〜13における破壊生成 物の出現に留意。 図16は、モノ−Ｑ上のＰ−２由来アプロチニン結合プロテアーゼの精製を示す 。（ａ）はＡ280nm溶離プロフィールであり、そして（ｂ）は検出のためにウサ ギ抗Ｃ末端APP抗血清（１／1000希釈液）を用いた溶離分画の活性を示し、そし て（ｃ）はMab 286.8Ａ（1.61mg／ml精製IgGの／100希釈液）を用いた溶離分画 の活性を示す。３つの矢印は、11，14及び18kDa Ｃ末端APP分解生成物の移動を 示す。 図17は、プールＹセリンプロテアーゼにより触媒されるAPP分解のpH及びイオ ン強度依存性を示す。パネル（ａ）は、pH依存性を示す。37℃で反応を開始して 、以下のｔ＝０成分濃度を達成した：指示pHに調整した酢酸塩、nes及びTrisの 各々中に32mMを包含するカクテル緩衝液中のプールＹプロテアーゼ（図16からの ５μｌの分画16）、APP（38nM）。反応混合物（16μｌ）は、7.5μｌの３ｘサン プル緩衝液を付加することにより２時間後に反応を終結した。本質的には実施例 ８に記載の通りに、APP C末端ドメインに対するウサギポリクローナル抗血清を 用いて、イムノブロットを展開させた。レーン１及び12は予染Mrマーカーを含有 した。レーン９はＣ−100を含有し、レーン10及び11はプールＹを含まずにpH6.5 でそれぞれ０及び３時間インキュベートしたAPPを含有した。パネル（ｂ）は、 イオン強度依存性を示す。反応は本質的に（ａ）と同様に実施したが、但し緩衝 液は指示モル濃度の塩化ナトリウムを含有する95mM MeS pH6.5であった。プール Ｙの非存在下（レーン２〜７）又は存在下（レーン９〜14）でのAPP切断を、各 濃度の塩化ナトリウムに関して示す。レーン１及び８はそれぞれMrマーカー及び Ｃ−100基準を含有した。矢印は11，14及び18kDaのAPP断片の移動を示す。 図18は、プールＹプロテアーゼの阻害剤選択性を示す。酵素付加により37℃で 反応を開始して、16μｌの容量中の以下の初期成分濃度を達成した：30mM Mes緩 衝液pH6.5中のsuperdex 75カラム上での精製後のプールＹ ＃３〜５（14μｇ／ ml）、APP（35nM）。7.5μｌの３ｘサンプル緩衝液を付加することにより反応を 終結させた。実施例８にしたがって、APP C末端ドメインに対するウサギ抗血清 を用いて、イムノブロットを展開させた。以下の阻害剤に関するデータを示す： パネル（ａ）メタノール中の860μＭ PMSF（レーン４）、メタノール中の400μ Ｍペプスタチン（レーン６）、５mMベンズアミジン（レーン８）、350μＭ Ｅ −64（レーン９）、7.7mM EDTA（レーン10）、15μＭアプロチニン（レーン11） 、及び0.1％（ｗ／ｖ）デオキシコレート（レーン15）。以下の対照も処理した ：阻害剤無含有（レーン12）、エタノール（レーン３）、メタノール（レーン５ ）、プールＹのみ（レーン２）、０時点での（レーン13）及び４時間目（レーン 14）のAPPのみ。レーン１及び７ はそれぞれ予染Mrマーカー及びＣ−100標準を示す。パネル（ｂ）1.8μＭアルフ ァ−１−抗キモトリプシン（レーン２）、156μＭTLCK（レーン３）、46μＭキ モトリプシン阻害剤Ｉ（レーン４）、119μＭキモトリプシン阻害剤II（レーン ５）、４μＭアルファ−２−抗血清（レーン６）、51μＭアルファ−１−抗トリ プシン（レーン７）、DMSO中に投与される98μＭキモスタチン（レーン10）、15 3μＭメタノール性TPCK（レーン12）。対照を以下に示す：阻害剤無含有（レー ン８）、DMSO（レーン11）、及びメタノール（レーン13）。予染分子量マーカー 及びＣ−100標準をレーン１及び９にそれぞれ適用した。矢印は11，14及び18kDa のAPP分解生成物を示す。 図19は、１）DMSOもDMSO＋10μＭペプスタチンＡもHEK293細胞の成長に影響を 及ぼさず（パネルＡ）、２）DMSO＋ペプスタチンＡで処理した後期対数相培養か ら収穫した条件付きの培地は、DMSOのみで処理した培養より有意に低いレベルの 15kDa APP C末端断片を示す（パネルＢ）。パネルＡ HEK293細胞（ATCC CRL 157 3、懸濁培養に適している）を、MoAb培地（JRH Bioscience，Lenexa，Kansas） ＋0.2％ｖ／ｖウシ胎児血清400ml（中黒矩形）を含入するローラーボトル中に植 えつけた。別のローラーは0.01％ｖ／ｖDMSO（中白矩形）又は0.01％DMSO＋10μ ＭペプスタチンＡ（中黒菱形）を含入した。細胞増殖は、５％ CO2／95％大気中 で37℃であった。トリパンブルー処理サンプル中の生育可能細胞数を血球計で定 量し、時間により一定パーセンテージ（60％）であった。対数相の終了時（７日 目に矢印で位置を示した）に条件付き培地を収穫して、BeckmanGs−６ベンチト ップ遠心分離器中で1500RPMで遠心分離して、固定化抗ベータアミロイドモノク ローナル抗体（C286.8A）のカラム上でクロマトグラフィー処理した。 パネルＢ ウサギ抗APP C末端抗血清を用いたイムノブロット。レーン１ 予 染分子量マーカー；レーン２〜７は、DMSO処理細胞からの培地の精製からの分画 １〜６のそれぞれの分析である；レーン９〜14はDMSO／ペプスタチンＡ処理細胞 からの培地の精製からの分画１〜６のそれぞれの分析である。レーン８はＣ−10 0標準を含有し（実施例５，PMTI 100から）、そしてレーン15は実施例７の方法 ２により精製した組換え体ホロAPP 695を含有した。DMSOのみ処理からの分画５ 及び６は、DMSO／ペプスタチンＡ処理における対応する分画からは存在しない15 kDa帯を含有した。さらに詳しくは実施例12の本文に記載されている。 図20は、APPプロセッシング活性を有するアスパラギン酸プロテアーゼのヒト 脳からの精製を要約する。 ａ）モノ−Ｑ HR10／10カラム上での可溶化Ｐ−２ 分画（140mgタンパク質）の精製に関する溶離プロフィール。タンパク質濃度（ 白丸）、伝導（破線）及び10μＭペプスタチンＡの非存在下（黒丸）又は存在下 （白三角）でのＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH2からのＮ−ダンシル−ISEを、 各収集分画に関して示す。 ｂ）MAb 286.8Ａを用いたAPP加水分解に関するイム ノブロット検定：レーン１ Ｃ−100標準；レーン２ 単独でインキュベートし た１（ｂ）からのプール分画24〜45（４℃で2.0〜5.3mmho）；レーン３ APPと ともにインキュベートしたプール分画；レーン４ プール分画＋APP＋10μＭ最 終ペプスタチンＡ。矢印は生成物断片を示す。 ｃ）競合的EIAによるMAb 286.8 Ａのエピトープマッピング。ヒトAPP 695のアミノ酸645〜695を含有するペプチ ド、ベータアミロイドの他の指示セグメントのＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFRHDDDD （１〜７）を、C286.8Aと免疫原との結合を遮断する能力に関して試験した。ベ ータアミロイド１〜42，１〜28，１〜16及びＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFRHDDDD（ １〜７ を含有）はC286.8A結合用量を依存的に阻害し、一方12〜28，25〜35及び645〜69 5は阻害せず、したがってC286.8Aに関する反応性エピトープをＡ４領域のＮ末端 ７アミノ酸に局在化した（APP 597〜603）。 ｄ）カテプシンＤに対するウサギ ポリクローナル抗体の１／300希釈液を用いた活性分画のイムノブロット分析。 APPプロセッシング：31μｇ／mlの均質ホロAPP 695（実施例７の方法２にした がって調製）を酢酸塩、Mes及びTris pH4.0，0.002％（ｖ／ｖ）Triton X-100及 び30mM外生NaClの各々中に40mMを含有する総量15μｌ中の５μｌの各カラム分画 とともにインキュベートした。SDS-PAGEサンプル緩衝液を付加して最終的に１ｘ として反応を24時間後に終了させて、10〜20％アクリルアミド勾配トリクリンゲ ル（Novex）上で100Ｖに一定に保って電気泳動し、次いでProblott膜（Applied Biosystems）上で電気プロティング処理した。アルカリ性ホスファターゼと結合 した適切な二次抗体を用いて標準サンドイッチ法により、ブロットをモノクロー ナル抗体C286.8Aを用いて最終50μｇ／mlで展開した。組換え体Ｃ−100を本方法 に記載されているように調製した。 ペプチダーゼ：カラム分画のアリコート（20μｌ）を10μｌの反応混合物に加 えて以下の初期成分濃度を達成した：50mM酢酸ナトリウムpH５を包含するカクテ ル緩衝液中に合成Ｎ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH2（58μＭ）、カプトプリル（ 0.2mM）、メタノール（0.3ｖ／ｖ）、及び含まれている場合にはメタノールに溶 解したペプスタチンＡ（10μＭ）。40μＭペプスタチンＡ 10μｌの付加により 、24時間後に反応を停止させた。酵素的生成物を検出し、RP−HPLCにより定量し た（実施例２）。 図21は、ヒトカテプシンＤに対する固定化抗体が溶液からヒト脳APP分解活性 を選択的に除去することを示す。 ａ）対照（実線） 及び抗カテプシンＤ（破線）カラムに関するＡ280nm溶離プロフィール。番号を 振った矢頭は以下を示している：１ 付加の開始；２ 平衡緩衝液で洗浄；３ 100mMグリシンpH2.2で溶離；４ 50mM塩酸ジエタノールアミンpH11で溶離；５ 100mMグリシン，0.5％（ｖ／ｖ）Triton X-100で溶離。 ｂ）APPプロセッシン グ活性を、抗CD（＋）又は対照（−）からの選択無効分画（１〜27）に関して、 並びにアプリセート（Ｑプール）、精製カテプシンＤ（CD）又はAPP単独に関し て示す。APP加水分解活性は、分画40より上では検出されなかった。 ｃ）21倍 に濃縮した又はカテプシンＤに対するポリクローナル抗体に向けてグリシン／ト リトン溶離物（分画80〜89、８倍に濃縮）をプールした流動分画９のイムノブロ ット反応性。濃縮は10％（ｖ／ｖ）TCAを用いた沈殿により行なった。 クロマトグラフィー：記載（T.T．Ngo et al.，1992，Chromatography，597:1 01）の通りに強ALクロマトグラフィーにより対照及び抗カテプシンＤウサギ抗血 清を精製し、標準方法（R．Axen et a1.，1967，Nature，214:1302）によりCnBr 活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia）と結合させた。APPプロセッシング活性を 含有した図21ｂからの等量（44mlの100mM NaClを含有する110mM重炭酸ナトリウ ムpH8.1中に4.1mgタンパク質）のプール分画を固定化抗カテプシンＤ IgG又は固 定化対照IgGの同サイズカラム（4.2ml樹脂）に平行して適用した。カラムを各々 、500mlのNaClを含有する28mlの100mM NaHCO3 pH8.3，28mlの100mMグリシンpH2. 5，40mlの50mM塩酸ジエタノールアミンpH11、及び最後に0.5％（ｖ／ｖ）Triton X-100を含有する30mlの100mMグリシンpH2.5で引き続き洗浄した。産又は塩基中 に回収された分画をTrisで中和した。0.5ml／分の流速でクロマトグラフィーを 実施して、２mlの分画を全体で収集した。全操作は４℃で行なった。 APPプロセッシング：均質ハロAPP 695（最終31μｇ／ml）を酢酸塩、Mes及びT ris pH4.0，0.002％（ｖ／ｖ）Triton X-100及び40mM外生NaClの各々中に40mMを 含有する総量15μｌ中の５μｌの各カラム分画とともにインキュベートした。SD S-PAGEサンプル緩衝液を付加して反応を24時間後に終了させて、モノクローナル 抗体286.8Ａで展開させたイムノブロットにより分析した。矢印は生成物断片を 示す。高度精製ヒトカテプシンＤは、最終1.27μｇ／mlで酵素的インキュベーシ ョン中に存在した。 図22は、カテプシンＤに対する固定化抗体がAPP類似ペプチドを分解するヒト 脳ペプチダーゼを吸着する個とを示す。 ａ）及びｂ）Ｎ−ダンシル−ISEVKMDA EFR−NH2の分解における流動分画及びプール化グリシン／トリトン溶離物（分画 80〜89、図21ａ、21倍に濃縮）中のそれぞれのペプチダーゼ活性。 ｃ）及びｄ ）Ｎ−ダンシル−ISEVNLDAEFR−NH2加水分解に関する対応するデータ。ａ）では 、流動分画のＥ−Ｖ加水分解活性（丸）を示す。ｃ）では、Ｌ−Ｄ加水分解を示 す。結合対照（中黒記号）又は抗カテプシンＤ IgG（中白記号）を含有するカラ ムから回収された分画からの活性を示す。三角形は、インキュベーション終了時 に残存する議論の余地のない基質の量に及ぼす10μＭペプスタチンＡの効力を示 す。ｂ）及びｄ）では、ペプスタチンＡの非存在下（中白棒グラフ）又は存在下 （中黒棒グラフ）で活性を測定した。 方法： カラム分画（20μｌ）の付加により37℃で反応を開始して、30μｌ中 の以下の初期成分濃度を達成した：酢酸塩、Mes及びTris pH5.0の各々中に40mM を含有するカクテル緩衝液中のペプチド基質（58μＭ）、カプトプリル（0.28mM ）、メタノール（0.1％ｖ／ｖ）。含まれる場合、ペプスタチンは最終濃度10μ Ｍである。最終10μＭペプスタチンＡの付加により20時間後に反応を終了させて 、実施例２にしたがってＣ−10，RP−HPLC分析を施した。 図23は、初期割当が表５に報告されているために、なされたカテプシンＤによ るAPP 695の加水分解から生成されたベータアミロイド断片の配列割り当ての更 新された要約を示す。 ａ）イムノブロット（図12Ｃから得たイムノブロットレ ーン：レーン１ βAPP 695のみ；レーン２ βAPP 695＋CD）上でのC286.8A免 疫反応性に対するβAPP由来断片のＮ末端配列。矢印は、イムノブロット帯と、C 286.8Aエピトープを含有するに十分な配列及びサイズを有するシーケンシングブ ロットの対応するセグメントにおいて同定された断片とを結びつける。下部のケ ースの文字は、不定配列割当を意味する。APP 695アミノ酸ナンバリングは、kan g等（1987，Nature，325:733）に依る。 ｂ）C286.8Aエピトープを含有する（ 斜線入り）又はしない（中白）全回収断片を含むベータAPP 695断片化パターン 。各断片の長さは、断片当たりの残基の概算数に比例して描かれ、指示断片サイ ズ（SDS-PAGE）から算出され、平均残基質量は110であると思われた。いくつか の断片サイズに及ぼすグリコシル化の潜在的作用は、説明されない。成熟βAPP 695（影を付けたセグメント）中のβAPの位置も示す。ｂ）では、加水分解され た結合は、βAPP 695残基に対応した：122〜123（Ｆ−Ｖ）；303〜304（Ｙ−Ｌ ）；405〜406（Ｌ−Ｑ）；459〜460（Ｌ−Ｒ）；532〜533（Ｌ−Ｐ）；549〜550 （Ｆ−Ｇ）；593〜594（Ｅ−Ｖ）。 方法： 実施例12に記載されているように反応を実施した。完全インキュベー ションに特異的な断片を含有する、又は平行イムノブロットにおけるCD−依存性 免疫反応帯と同時移動するコーマシー染色した電気ブロットのセグメントを切り 出し、次いで気相においてApplide Biosystems 477Ａ型タンパク質シーケンサー 上でシーケンシングした。80％のβAPPをより小さな断片に加水分解した。12.7 pmolの検出可能なＮ末端配列を産生するのと平衡するβAPPの量をゲルに適用し た。 本発明の詳細な説明 以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１．ヒト脳プロテアーゼ単離 プロテアーゼ単離のために、２つの一般的アプローチを取った。初期の研究で は、下記の“方法１”に記載したようにして脳プロテアーゼ活性を単離した。そ の結果生じるイオン交換クロマトグラフィーから得られた酵素活性の特性表示を 実施例３及び８に記載し、組換え体CHO細胞由来APPを分解できる（実施例８）が しかしペプチダーゼとして相対的に不活性である（実施例３）６つの異なる活性 の同定がなされた。 ６つの活性の内の１つはその後カテプシンＤと同定され（実施例９）、ゲル濾 過上でのそのクロマトグラフィーによりさらに特徴表示された。 アフィニティー精製を試みるための代替アプローチにおいて、実施例８（表４ ）、“方法２”に記載のヒト脳セリンプロテアーゼのいくつかを実行した。この 手法は、初期段階でアプロチニンセファロースを用いたセリンプロテアーゼのア フィニティー精製を基礎にし、APP C末端プロセッシングに関する能力を示すセ リンプロテアーゼ（実施例10）の同定を成す。 方法１： （ｉ）亜細胞（sub-cellulor）分別 ４名の別々の年齢に見合ったAD患者か らのヒト前頭皮質極９領域の切片を凍結（−70℃）しながら計量し、４℃で0.32 Ｍのスクロース150mlに加えて、鋏で細 切した。バッチ中で100ml Elvehjemガラステフロン陶器を用いて懸濁液を均質化 した（10リターンストローク）。併合ホモジネートをSorval SS-34ローター中で 遠心分離した。 密でないペレットを取り出して、再均質化し、上記のように遠心分離した。各 抽出のための上清を併合し、Sorval SS-34ローター中で15,000ｇで30分遠心分離 した。その結果生じた“Ｐ−２”ペレットを攪拌しながら100mlの氷冷0.32Ｍス クロース中に再懸濁し、−70℃で保存した。最後の回転からの上清を15,000ｇで 60分遠心分離して上清又は可溶性分画（“Ｓ”）、及びミクロソーム分画（“Ｍ ”）を産生して、これを60mlの0.32Ｍスクロース中に再懸濁した。Ｓ及びＭはと もに−70℃で保存した。 （ii）可溶化 膜性対照又はAD亜分画（Ｐ−２又はＭ）を以下の条件を調整 して可溶化した：50mM Tris-HCl緩衝液pH7.5を含有する２％（ｖ／ｖ）Triton X -100。４℃で3.5時間攪拌後、懸濁液をBeckman 70 Tiローター中で105,000ｇで6 0分遠心分離した。以下の最終タンパク質濃度をＰ−２（3.9〜4.0mg／ml）；及 びＭ（1.4〜1.6mg／ml）に関する可溶化に用いた。可溶化上清を後に使用するた めに−70℃で保存した。可溶性分画は洗剤では処理しなかったが、しかしストッ ク１Ｍ緩衝液の付加によりTris-HCl pH7.5中に50mMに調整した。 （iii）イオン交換クロマトグラフィー 50ml Rheodyneステンレス製ループ インジェクター7125型を備え、モノQ HR10／10カラム（Pharmacia，Piscataway ，NJ）に接続したGilson勾配液体クロマトグラフ（305及び306型ポンプ）を用い てクロマトグラフィーを実施した。Pharmacia UV-M検出器及びKippen-zonenチャ ートレコーダーを用いて、280nmでカラム溶離液の吸光度をモニタリングした。 Ｐ−２、ミクロソーム（Ｍ）又は可溶性（Ｓ）タンパク質分画をカラム上に載 せ、２ml／分の流速で、50mM Tris-HCl pH7.5で平衡させた。次にカラムを、溶 離液中のＡ280nmがゼロに低減し、その時点でカラム流速が４ml／分に増大する まで平衡緩衝液で洗浄した。 タンパク質を以下のように溶離した： 溶媒：Ａ＝50mM Tris-HCl pH7.5 Ｂ＝50mM Tris-HCl pH7.5（１Ｍ NaCl含有） 計画：０〜50％ Ｂ 70分間 50％ Ｂを10分間保持 50〜100％ Ｂ 10分間 100％ Ｂを10分間保持 再平衡 ４ml分画をクロマトグラフィー全体で収集した。以下のタンパク質付加を１回 のカラム処理当たり適用した：Ｐ−２ 97mg（対照）及び95mg（AD）；Ｓ 50mg （対照）及び68mg（AD）；並びにＭ 36mg（対照）及び31mg（AD）。 初期研究では、Ａ280nm、総タンパク質（Bradford検定）及びペプチダーゼ活 性に関して溶離分画をモニタリングした（実施例２及び３に記載されているよう に）。ペプチダーゼ活性を基礎にして作ったプールを次に調製し（実施例３）、 CHO細胞由来APP C末端的 に処理するそれらの能力に関して試験した（実施例８に記載）。 しかしながら、さらなる試験のすべてにおいて、バキュロウイルス特定発現に より得られる組換え体APPのＣ末端プロセッシングに関するそれらの能力に関し て、溶離分画を別々に試験した（実施例９）。 （iv）ゲル濾過クロマトグラフィー ゲル濾過の典型的例を図３に示す。さ らに一般的には、以下のようにクロマトグラフィーを実施する。Ｐ−２の精製さ らの、APP C末端プロセッシング活性を含有するモノ−Ｑ分画をプールし、0.25m l未満に濃縮して、10mM Tris-HCl緩衝液pH7.5で平衡させ、150mM NaClを含有す る縦配列の２つのSepharose 6HRカラムに適用した。終始0.3ml／分の流速を用い た。Ａ280nm、総タンパク質（Bradford検定）、ペプチダーゼ活性、及び組換え 体APPのＣ末端プロセッシングに関する活性に関して溶離分画をモニタリングし た。 方法２： （ｉ）亜細胞分別 上記の方法１に記載されているようにしてこれを実施し た。 （ii）可溶化 本質的に上記の方法１に記載されているのと同様に実施した 。 （iii）アプロチニン−Sepharoseクロマトグラフィー 上記の可溶性（230m g）、Ｐ−２（216mg）又はミクロソーム（47mg）分画を、予め20mM Tris-HCl緩 衝液pH7.0で平衡させたアプロチニンSepharose（Sigma、カタログ番号42268，1- 5×10cm）のカラムに適用した。一旦カラムを負荷し、平衡緩衝液（100ml）で洗 浄して、次に500mM塩化ナトリウムを含有する60mlの50mM酢酸ナトリウム緩衝液p H5.0で溶離した。流速は終始1.0mL／分であった。溶離分画（４ml）を280nmでモ ニタリングし、Bradford検定を用いて分析し、バキ ュロウイルス系中での発現により得られる組換え体APPを用いて、実施例８に記 載されているようにAPP C末端プロセッシング活性に関して調べた。活性分画は 、抗APP C末端抗体を用いてイムノブロット上で検出可能な11，14及び18kDa（お よそ）断片を形成し得る（抗体産生の方法に関しては実施例６参照）。 （iv）イオン交換クロマトグラフィー アプロチニン−Sepharose上のＰ− ２分画の精製からの活性分画をプールし、50mM Tris-HCl pH7.5に対して透析し て、透析緩衝液で予め平衡させたモノ−Ｑカラム（HR５／５）に適用した。いっ たん負荷し、上記の方法１と本質的に同様に、カラムを溶離した。活性分画（２ ml）をＡ280nm、総タンパク質（Bradford検定）に関して、並びにバキュロウイ ルス由来APP C末端プロセッシングに関するそれらの能力に関して、モニタリン グした。APP分解活性の広範なピークが観察され、これはAPP C末端抗体並びにベ ータアミロイドペプチドのＮ末端に向けられるモノクローナル抗体の両方と反応 する11，14及び18kDa APPC末端断片を形成し得る（抗体産生の方法に関しては実 施例６参照）。 活性分画を含有する領域と交わるＡ280nmプロフィールに基づいて、活性の３ つのプールを明白なＡ280nmピークと各々重ねて調製した。プールは以下の伝導 範囲を包含した：プールＸ（12.2〜14.4mmho）、プールＹ（14.9〜18.9mmho）及 びプールＺ（20.2〜22.9mmho）。 （ｖ）ゲル濾過クロマトグラフィー プールＸ，Ｙ及びＺを各々２ml（プー ルＸ及びＹ）又は3.6ml（プールＺ）に濃縮し、150mM塩化ナトリウムを含有する 50mM Tris-HCl pH7.5で予め平衡させたSuperdex 75カラム（Pharmacia，Piscata way，NJ）に別々に適用した。いったん負荷し、平衡緩衝液でカラムを溶離した 。終始1.0 ml／分の流速でクロマトグラフィーを実施した。Ａ280nm、総タンパク質（Bradf ord検定）に関して、及びバキュロ発現APPのＣ末端プロセッシングに関して分画 （１ml）をモニタリングした。各々のいかの標準タンパク質のクロマトグラフィ ーによりゲル濾過を測定した：チログロブリン（570kDa）、ウシガンマグロブリ ン（158kDa）、オバルブミン（44kDa）、ミオグロビン（17.5kDa）及びビタミン Ｂ12（1.35kDa）。 実施例２．ペプチダーゼ検定開発 “細胞外”ドメイン（単数又は複数）とベータアミロイドペプチド領域のＮ末 端との間の接合部でのAPP加水分解に適した特異性を有するヒト脳組織中のエン ドプロテアーゼの高スループット検出を可能にするようにペプチダーゼ検定を開 発した。選択した技術は、RP-HPLC分離による蛍光性ペプチド生成物質のその後 の検出、及び後カラム蛍光検出とともに、ダンシル化ペプチド基質を用いた。 ペプチド基質配列の進化： ヒトAPPのベータアミロイドペプチド配列のＮ末 端領域周囲に観察されたのと同様のアミノ酸配列を含有する蛍光的標識化ドデカ ペプチド基質を、固相ペプチド合成により調製した。ペプチドは、Fmoc／NMP-Ho BL化学物質を用いてApplied Biosystems 430A型ペプチド合成機上に合成した（F ields et al.，1990，Int．J．Pepeide Protein Res-，35：161；Knorr et al. ，1989，Totrahedron Letters，30：1927）。通常は、ペプチドを切断し、90％ トリフルオロ酢酸、４％チオアニソール、２％エタンジチオール、及び４％液化 フェノール中で室温で２時間脱保護化した。 しかしながら、ペプチドＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His（配列番号：２）は、粗製組織分画とともにインキュベートした 場合、望ましくないカルボキシペプチダー ゼ消化を受けることが判明した。カルボキシペプチダーゼ消化を弱めるために、 以下の修飾基質を設計した：Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH2（配列番号：７）及びＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met -Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）。 この後者のペプチドは、粗製組織分画の存在下でさえカルボキシペプチダーゼ 消化に対して相対的に不感受性であり、実施例３のペプチダーゼプロファイリン グ研究に用いた。さらに精製した酵素分画を用いて、Ｃ末端アルファアミド基質 （配列番号：７）を実施例９のペプチダーゼ試験に用いた。下記の実施例３のHP LCプロトコールを用いて、いずれかのペプチドの分解をモニタリングした。 実施例３．正常対照及びAD脳の亜分画におけるペプチダーゼ活性の測定 （ｉ）インキュベーション 実施例１に記載されたカラム分画のアリコート （20μｌ）を10μｌの反応混合物と一緒にインキュベートして、以下の成分濃度 を達成した：Mes，Tris-HCl及び酢酸塩pH6.5の各々中に100mMを含むカクテル緩 衝液中にＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-As p-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）（50μＭ）、カプトプリル（300μＭ）。 イオン交換分画を用いたインキュベーションを37℃で24時間実施し、その後TF A中に最終濃度３％（ｖ／ｖ）に調整することにより反応を終わらせた。 （ii）タンパク質分解性生成物のHPLC定量 二液溶媒供給、加熱カラムコン パートメント及びオートインジェクターで完全なものになるHewlet-Packard HP 1090を用いてHPLC分析を実施した。イン−ラインGilson 121型フィルター蛍光計 （310〜410nmで励起、480〜520nmで放射）をHPLC chem-station（DOSシリーズ） 及びデータ 分析に適したソフトウエアとともに用いて、蛍光検出（カラム後）を実施した。 上記の酸性化インキュベーション混合物のアリコート（通常10μｌ）をガード Ｃ18 ５μＭガード（20×4.6mm）を取り付けたHypersil ５μＭ Ｃ18カラム （100×4.6nm）上に射出した。27％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する100mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH6.5を用いて平等な分離を達成した。合成ペプチド生成 物の移動による同定及び比較、その構造をPTC−アミノ酸分析及びFAB−MSにより 確証した（下記の表２参照）。 さらに、上記の表２に列挙したある代謝物質の保持時間は、HPLC作動時に変わ りやすいため、Ｎ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg- His（配列番号：２）の切断に閏して実施例２に引用したものとは異なる。例え ば表２に列挙したデータを反映する試験は、HPLCカラムと一列にガードカラムを 用いてクロマトグラフィーを実施したため、相対的に長い保持時間を有する。 全実験において、実験サンプルと平衡して合成生成物標準の分析 により酵素的生成物の保持時間の日々の変化に対してHPLCカラムを度盛りした。 HP CHEMステーションデータ獲得ソフトウエアを用いて、個々のイオン交換分画 のタンパク質分解性代謝物質プロフィールに関するデータを収集した。 ６つの切断生成物の各々に関する曲線下の面積及びそれらの保持時間をピーク 表ファイルに保存する。全ピーク表をつき合わせてEXCEL（プログラム言語Ｃで 書いたカスタムユーティリティーを使用）で（６xn）エリア配列に移す（ここで 、ｎ＝モノ−Ｑ分画の数）。配列の各列はモノＱ分画からの単一ペプチダーゼ分 析を示す。ゼロをデータの各カラム間に挿入して人工的に列方向の値の勾配を確 立する。 SpyGlassはこの配列をとり、生成した物質に関するモノＱ分画数、切断Ｖ及び 面積％が３軸である３次元面に変換する。手動でSpyGlassプログラム内に設定さ れる以下の判定基準にしたがって等値線を限定する：一次等値線は、特定物質へ の1.5％基質変換が観察されたブロットの連続領域と接続する。同様に、連続等 値線は５％，10％，20％，30％，40％及び50％の領域と接続し、基質変換も示さ れた。その結果生じた等値線プロットは、分画数が縦座標にかかり、ペプチド結 合切断Ｖが横座標上にあり、生成物質の量が等値線により示される脳ペプチダー ゼ地図を示す。 対照及びAD脳亜分画のペプチダーゼプロファイリングの結果： 図１は、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに亜分別を施した対照並び にAD P-2，Ｓ及びＭ分画によりＮ−ダンシルペプチド基質の切断に関して得られ たペプチダーゼプロフィールの比較を示す。分析により、対照及びAD脳の亜分画 全体の洗剤的に異なる多数のペプチダーゼ活性が同定できる。 各分析（図１のａ〜ｆ）に関して、各ペプチド結合での切断に関 する活性の量はシリーズを通じて低減した：Ｖ−Ｋ＞Ｋ−Ｍ＞Ｍ−Ｄ＞Ｓ−Ｅ＞ Ｅ−Ｖ。しかしながらＫ−Ｍ及びＭ−Ｄ切断は、Ｃ−100生成を引き起こすAPP加 水分解の部位を示しているという見込みが大きいために、最も興味深い。1.6分 で回収された代謝物質は、おそらく過酸化水素による基質の処理が同一保持時間 （rt）を有する物質を生じるので、基質中のスルホキシドへのメチオニン酸化に よるものと思われる。1.0及び1.3及び3.3分のrtで生成される代謝物質は、現在 のところ同定されていない。 Ｋ−Ｍ切断に関しては、対照及びADに関する酵素のスペクトル及びピーク活性 についての活性の全レベルはシリーズを通して低下した：Ｐ−２＞Ｓ＝Ｍ。これ は、ADにおけるＭ−Ｄ切断に関しても真実であるが、一方対照分画に関してはそ の順序はＳ＞Ｐ−２＝Ｍであった。 ADにおいて認められた最も豊冨なペプチダーゼピーク（１つより多い等値線に より境されるもののみ）に関しては、以下の数の明白に決定されたペプチダーゼ ピークを区別し得る：Ｐ−２ ３つのＫ−Ｍピーク及び１つのＭ−Ｄピーク；Ｍ ３つのＫ−Ｍピーク及び２つのＭ−Ｄピーク；Ｓ Ｋ−Ｍピークなし、１つの Ｍ−Ｄピーク。対応する対照及びAD間のより多くのピークのレベル間の定性的比 較により、１つの顕著な差異のみが明らかにされた。差異はミクロソーム分画で 観察され、個の場合対照Ｍプロフィールは単−Ｍ−Ｄ生成物を分画75周囲に含有 し、一方ADプロフィールでは、同一領域は明らかにダブレットを含有した。 正常及び疾病状態集団におけるペプチダーゼ間の考え得る変異のために、対照 及びAD間のペプチダーゼレベルの定量的差異を際立たせる点はほとんどない。 要するに、少ペプチダーゼ形態のレベルにおける対照及びAD分画 間の定性的又は有意に定量的な差異が存在し得るということを無視することはで きないけれども、全体的プロフィールは、１つだけの明白な差異がペプチダーゼ 活性のより多くのピークにはあきらかである。 （iii）別個のプール中へのペプチダーゼ活性の統合 Ｎ−ダンシル−Ile-S er-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１ ）基質を用いて得られたペプチダーゼ活性プロフィールを基礎にして、Ｐ−２， Ｓ及びＭ分画のイオン交換分離からのカラム分画を隣接するプール中に統合した （Ｍに関しては12プール、Ｐ−２に関しては13プール、Ｓに関しては14プール） 。各場合にAD及び対照分画に関するクロマトグラフィープロフィールの同一領域 をプールするよう注意し、YSI35型伝導計を用いて各プールの電導度をモニタリ ングすることにより工程の精度を検査した。 プール中は分画を４℃に維持し、−70℃で保存した。Amicon Centriprep-10膜 を用いて各ペプチダーゼを濃縮した。濃縮前に、各Centriprep膜を50mM Tris-HC l，pH7.5中で洗浄した。５ml以上の容量を含有するペプチダーゼプールに関して は、15ml Centriprepを用いた。これらのプールをDu Pont Sorval卓上遠心分離 機上で2700rpmで約40分間濃縮した。４ml未満を含有するプールは、２ml Centri prepを用いて、Du Pont Sorval RC遠心分離機（SS34ローター）上で5000rpmで約 40分間濃縮した。 遠心分離後、各濃縮プールを等量の50mM Tris-HCl，pH7.5で洗浄した。遠心分 離工程中はプールを４℃に維持し、−70℃で保存した。プールを、電導度（cond uctance）及び最終濃縮容量とともに下記の表３に列挙する。 実施例４．組換え体APP 695の発現 本実施例は、ホロAPP 695を発現し、次いで実施例７に記載のように精製し、 次いで実施例８〜10に記載されているようにAPP分解検定のための組換え体基質 として用いる方法を記載する。２つのアプローチを用いた。 最初にCHO細胞発現系を用いてAPP 695を生成した。基質としてAPPのこの供給 源を用いた実験には、ヒト脳Ｐ−２，Ｓ及びＭ分画の精製からのモノ−Ｑ分画の 連続プールで検出可能な６つの異なるプロテアーゼ活性を同定させる初期活性測 定が含まれた。これらの試験は実施例８に記載する。 次いで、バキュロウイルス特定系を用いた発現により、組換え体APP 695を得 た。それにより生じたより多量のAPP 695により、実施例９及び10に略記したよ り詳細な試験の実施が可能になり、ある種のAPP分解酵素の同定が成された。 発現の両方法を以下に示す： 方法１：ホロAPP 695を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株の 開発 （ｉ）ベクター構築 FC−４（Kang等、上記）からのAPP 695cDNAの公知の2 .36kb NruI／Spel断片を大腸菌E.coli DNAポリメラーゼＩの大型断片により充填 して、pMTI−５（Ｔ３プロモーター下でのAPP 695）を生じるKS Bluescript M13 ＋（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）のSmalクローニング部位中に 盲端挿入した。次に新規の最適KozakコンセンサスDNA配列を、オリゴ： 5′-CTCTAGAACTAGTGGGTCGACACGATGCTGCCCGGTTTG-3′（配列番号：８）によりPMT I−39を作るために、特定部位の突然変異誘発を用いて作った（Kunkel et．al. ，1987，Methods in Enzymology，154：367）。次にこのプラスミドを特定部位 の突然変異誘発（Kunkel等、同上）より変更して、位置614のバリンをグルタメ ードに変えた（開放読み枠はKang等（同上）にしたがってナンバリングした）。 最適Kozakコンセンサス配列及びValのGluへの突然変異を含有する全長APP cDN Aを次に、NotI及びHindIII部分消化によりPMTI−39から切り出す。次いで2.36kb APP 695断片をゲル精製して、NotI／HindIII切断pcNAINeo（Invitrogen Corp. ，San Diego，CA）に結紮して、PMTI90を作り、このなかでAPP 695発現がCM部位 プロモーターの制御下で起きる。ValのGluへの突然変異は確証済配列であり、ベ クターを用いてCHO細胞を安定的に形質転換する。 （ii）APP 695 matenesを発現する安定CHO細胞株の生成。 APP 695構築物によるトランスフェクションのためにチャイニーズハムスター卵 巣Ｋ−１細胞（ATCC CCL61）を用いた。APP 695及びネオマイシン薬剤耐性マー カーを含有する20μｇの発現プラスミドを0.5mlのPBS中の１×107CHO細胞中に、 Bio-Rad Gene Apparatus（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）を用いて電気 穿孔によりトランスフェクトした。25μｆキャパシタンスで1200Ｖの単一パルス を細胞に施した。 電気穿孔後、細胞を氷中で10分間インキュベートし、遠心分離により収集した 。細胞ペレットをAlpha MEn，10％ウシ胎児血清中に５×104細胞／mlの密度で再 懸濁し、１mlアリコートを24ウエル組織培養クラスタープレートの各ウエル中に 分布させた。48時間インキュベーション後、１mg／mlのGeneticin（GIBCO-BRL， Grand Island，NY）を含有する培地１mlを付加してネオマイシン薬剤耐性マーカ ーを含有する細胞を選択して、インキュベーションを続け、薬剤含有倍地を１週 間に２回変えた。 ウエスタンブロットにより、薬剤耐性細胞をAPP 695発現に関して試験した。A PP 695発現に対して陽性な細胞を限定希釈によりクローニングし、個々のクロー ンを単離して、APP 695発現に関して調べた。APP 695発現に対して陽性なクロー ンを亜培養し、APP 695発現細胞の大規模産生とその後の組換え体タンパク質の 単離のためにローラーボトルに広げた。 方法２：バキュロウイルス感染昆虫細胞を用いた組換え体ホロAPP 695の発現 （ｉ）組換え体ベクターの構築 バキュロウイルスベクターpVL1392（Invit rogen）をXba I（ポリリンカー中）で切断し、pMTI−39からのグル単離2.36kb X ba I断片と結紮した（Bluescript M13 SmaI部位へのAPP 695 NruI／SpcI，Ｔ３ 配向、Smal／NruIプラント融合部位に新規のKozak及びXbaI部位を用いる）。こ れによりpMTI 103が生じる：これをDH５α中に形質転換し、Amp上で選択して、 プラスミドDNAのリチウムprepをトランスフェクション用に作った。 （ii）細胞及びウイルス American Type Culture Collection（ATCC）から 購入したSpodoptera frugiperda（Sf9）を懸濁培養として28℃で、10％ウシ胎児 血清を含有するTNMFH培地（Summers，M.D.，and Smith，G.E.，1987，A Manual of Methods for Baculovi rus Vectors and Insect Cell Procedures，Bulletin no．1555，Texas Agriｃ ．Exp．Stn．and Texas A & M Univ.，University Station，TX）中で増殖させ た。野生型AcMNPV DNAは、Invitrogen，SanDiego，CAから購入した。 （iii）DNA トランスフェクション及びプラーク検定 リン酸カルシウム法 （Summers et al.，1987，同上）を用いてSf９細胞中に精製プラスミドDNA（４ μｇ）及び直鎖ウイルスDNA（１μｇ）を同時トランスフェクションすることに よる相同組換えにより、外来DNAをポリヘドリン遺伝子座のAcMNPVのゲノム中に 挿入した。トランスフェクト化細胞により放出されたウイルスを２ラウンドのプ ラーク検定（Summer et al.，1987,同上）により精製し、組換え体ウイルスをポ リヘドリン陰性プラークに関する肉眼的スクリーニングにより同定した。次に精 製組換え体ウイルス培養をウエスタンブロットにより昆虫細胞中にAPPを産生す るそれらの能力に関してスクリーニングした。 （iv）組換え体タンパク質産生 10％ウシ胎児血清を含有するTMNFH培地中 で懸濁培養として１×106細胞／mlで増殖させたSf９細胞の５リットルバッチを 、１のM.O.I.で組換え体ウイルスで感染させた。感染24時間後に細胞を収穫し、 細胞溶解物を組換え体タンパク質の精製のために調製した。 実施例５．哺乳類細胞の一過性感染による組換え体Ｃ−100標準の産生のため の発現ベクターの開発 Ｃ−100ペプチド断片は、Ａ４ペブチドのＮ末端から全長APPのＣ末端に及ぶAP PのＣ末端部分を含有する（上記 背景の項参照）。Ｃ−100断片は、Ａ４ペプチ ドの最終的形成を引き起こす初期分解生成物を意味する。 本発明の一態様において、組換え体Ｃ−100を発現するHela S3 細胞（ATCC CCL 2.2）からの細胞溶解物を、脳分画でインキュベートしていた組 換え体APPサンプルと平衡してイムノブロット検定で分析し、モノ−Ｑクロマト グラフィーにより亜分画化した（実施例３参照）。Ｃ−100断片の移動及び検出 は、概してＣ末端APP断片の免疫検出のために病的プロテアーゼ並びに陽性対照 により生成される物質の発生に関するサイズマーカーとして役立つ。 酵素的に生成した物質のサイズとＣ−100断片のサイズの比較は、酵素的に生 成した断片がＡ４ペプチドのＮ末端近くの、あるいはセクレターゼにより触媒さ れるようにＡ４セグメント内での切断から得られるか否かについての見識を提供 し得る。 （ｉ）プラスミド構築 ２つの方法を用いてＣ−100発現のためのプラスミ ドを作製した。各プラスミドはPMTI73又はPMTI100として別々に同定される。 PMTI73構築： 市販のプラスミドPUC−19をEcoRIで消化してそのポリリンカー を制限した。市販PWE16を次に消化済PUC19中に挿入して、PMTI2300を作った。PM TI2301は、オリゴヌクレオチドアダプターを用いてBamHI／HindIII消化後にPMTI 2300から得た。APPのEcoRIプロモーター断片を、盲端結紮によりPMTI2301のHind III部位に挿入して、PMTI2307を生成した。 PC−４（Kang等。上記）からのBamHI断片をPMTI2307のBamHI部位に結紮してPM TI2311を生成した。FC−４からのXhoI断片をPnTI2311のXhoI部分に挿入して、PM TI2312を生成した。マウス金属チオニン−１遺伝子のEcoRIゲノムクローンから の2.2kb BglII／EcoRI断片をPMTI2312のClaI部位中に挿入することにより、PMTI 2323を作った。微小遺伝子PMTI2337を生成するために、PMTI2323のKpnI及びBglI I部位間の配列を欠失させて、合成オリゴヌクレオチドアダプター sp−スペー サー−４を用いてクローンを結紮した。 PMTI2337をBamHI／SpcIで切断し、断片をBluescript KS（1）（Stratagene） のBamHI／XbaI制限部位中に結紮して、PMTI2371を生成した。PMTI2371をHindIII ／NotIで切断して、APP695の末端100アミノ酸をコードする0.7kb断片を放出させ た。この挿入物をpcDNAINEO（Invitrogen Corp.）のHindIII／NotI部位に結紮し て、プラスミドPMTI73を作った。 PMTI 100構築： PMTI90（実施例４、方法１参照）をXbaI／HindIIIで切断し てこれもAPP695の末端100アミノ酸をコードする0.6kb断片を放出させ、これをpc DNAINEOのXbaI／HindIII部位に結紮して、PMTI100を作った。各場合、ベクター 、挿入物及びプラスミドを当業者に公知の方法で精製した。 （ii）Ｃ−100断片のトランスフェクション及び発現 ６ウエルコースター クラスター（直径3.5cm）を各ウエル中に５×105細胞のHela Sl細胞を使用の24 時間前に植えつけることにより、Ｃ−100標準の小規模発現のための調製を開始 した。 十分量のワクシニアウイルスVTE７−３をトリプシン処理して多数の20プラー ク形成単位／細胞を感染させ、等量の粗製憂いするストック及び0.25mg／mlトリ プシンを混合し、次いで激しく攪拌した。トリプシン処理ウイルスを10分間隔で 攪拌しながら、37℃で30分インキュベートした。凝集塊が残存した場合、インキ ュベーション混合物を０℃に冷却して、音波処理水浴中で30秒間音波処理した。 冷却音波処理を凝集塊が検出されなくなるまで繰り返した。 Hela S1細胞を入れた各ウエルが0.5mlのウイルスを有するに十分な血清無含有 DMEMでトリプシン処理ウイルスを希釈した。培地を吸い出して、次いで細胞をウ イルスに30分間感染させて、10分間隔で揺すってウイルスをかき混ぜた。 感染終了の約５分前に、新鮮なトランスフェクション混合物を以 下のように調製した：各ウエルに対して、0.015mlのリポフェクチン試薬（Bethe sda Research Labs，Gaithersburg，MD）をポリスチレン試験管中のOPTIMUM（Be thesda Research Labs，Gaithersburg，MD）に加え、静かに混合した。攪拌はし なかった。ついで３μｇのCsCl精製DNAを加えて、静かに混合した。 ウイルス混合物を細胞から吸い出して、次にトランスフェクション溶液を導入 した。その結果生じた混合物を37℃で３時間インキュベートした。次に各ウエル を１mlのOPTIMUMで覆って、CO2インキュベーター中で37℃で一夜インキュベート した。 遠心分離によりトランスフェクション後20時間に細胞を収穫し、１％Triton X -100，10μｇ／ml BPTI，10μｇ／mlロイペプチン、200mM NaCl，10mM HEPES， １mM CaCl2，１mM MgCl2，１mM EDTAを含有し、pH7.5に調整した溶解緩衝液0.2m lを加えて、氷上で溶解物を調製した。光学顕微鏡で完全溶解をモニタリングし 、直ちに収穫した。溶解は１分未満で完全に起きて、この段階での遅延はゼラチ ン状塊を生じる核の溶解を引き起こした。 組換え体溶解物を後に使用するために−20℃で保存した。好ましくは、組換え 体溶解物は、凍結前に、２−メルカプトエタノールを欠いた（３ｘ）SDS−PAGE サンプル緩衝液中で１：50に希釈すべきである。 APP C末端抗体によるSDS−PAGE／イムノブロットを用いたPMTI73又はPMTI100 による発現によって産生されたタンパク質のサイズの比較を実施した（図２ｃ） 。試験は、PMTI100が単一免疫反応帯の発現に向けられ、一方PMTI73は小分子サ イズの２つの主要帯の発現に向けられることを示した。中間サイズの弱い帯も、 多量でゲルに適用した場合に（図２ａ〜２ｄ）、PMTI73中に明らかであった。 PMTI100タンパク質を多量にSDS−PAGEゲルに適用すると、一連 のぼんやりした帯（例えば図２ｄ）が現れる。明白なMr11.7kDaのＣ−100モノマ ーの強い帯の他に、Mr25.5kDa，35kDa及び45kDaでぼんやりした帯が観察され、 これはそれぞれＣ−100モノマーの二量体、三量体及び四量体凝集物に寄与する 。Mr18.9kDaの別のかすかな帯も観察される。同様の現象は、文献でも同様の解 釈で報告されている（Dyrks et al.，1988，EMBO J.，７；949）。 PMTI73により生成される最大の３つの帯は、PMTI100に関して観察される単一 帯よりわずかに大きかった。PMTI73発現からの最大帯は、単一ペプチド配列が初 期翻訳物質から切断されて、Ｎ末端で５つの余分のアミノ酸を含有するＣ−100 断片を産生した。 実施例６．免疫化学試薬の生成 ３つの異なる免疫化学試薬を本発明の試験に用いた。 （ｉ）APPのＣ末端を認識するウサギポリクローナル抗血清を得て、実施例８ に記載の検定条件にしたがってタンパク質分解的プロセッシングにより生成した Ｃ末端APP断片のイムノブロット検出のために用いた。 （ii）APPのＣ末端を認識するアフィニティー精製抗体を調製して、バキュロ ウイルス特定系で発現されるAPPのアフィニティー精製のためのイムノアフィニ ティーカラムを合成するために用いた（実施例７参照）。 （iii）ベータアミロイドペプチドのＮ末端を認識するマウスモノクローナル 抗体を生成し、ホロAPP695のタンパク質分解性消化により生成されるＣ末端APP 断片が全長ベータアミロイドペプチドを含有するか否かを測定するためにイムノ ブロット検定に用いた（特定の適用に関しては実施例９及び10参照）。 ３つの免疫化学物質の各々の生成方法を以下に示す： （ｉ）APPのＣ末端に対するウサギポリクローナル抗血清 抗血清をヒトAPP695のＣ末端ドメインに引き出して、Buxbaum等（1990，Proc ．Natl．Acad．Sci.，87：6003）の方法にしたがって調製した。APP695のCOOH末 端領域に対応する合成ペプチド（以後“β APP 645−694”と呼ぶ）をYale Univ ersity，Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility，New Haven，CTから得 た。 β APP 645−694を用いてウサギを免疫化して、ポリクローナル抗体を引き出 した。ヒトAPP695のアミノ酸19〜695を含有する融合タンパク質を発現する大腸 菌E.coliの溶解物のイムノブロット分析により、血清をスクリーニングした。組 換え体融合タンパク質に対して免疫反応性である血清を、連続的in vitro転写（ Stratagene，La Jolla，CAから購入したキット）及び翻訳（Promega Corp.，Mad ison，WIから購入した網状赤血球溶解キット）によりβ APP 645−694 cDNAから 産生した〔36Ｓ〕メチオニン標識化APP695に対する免疫沈降活性に関してさらに スクリーニングした。 （ii）ホロAPPの精製のためのポリクローナル抗体アフィニティーカラム 合成APP C末端ペプチド免疫原の精製： Ｎ末端にシステイン残基を有するAPP （649−695）のＣ末端に及ぶ粗製合成ペプチド（Ｐ−142）80〜90mgを、HPLCに より精製した（収率42％；34mg）。アミノ酸分析、Ｎ末端配列分析及び飛行質量 分光測定のレーザー着脱時間Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrome tryは、精製ペプチドが全長及びＮ末端で剪頭されたペプチドの混合物（１／２ 全長／剪頭）であることを示した。 精製Ｐ−142免疫原によるウサギの免疫化： HPLC精製ペプチドAPP（649−695 ）を用いてウサギを免疫化した。２羽のウサギは各々、完全フロイントアジュバ ント中の125μｇのペプチドで、その後不完全フロイントアジュバント中の同量 のペプチドの増強により、 ３週間間隔で初期試験を施した。９か月間に14の採血標本を収集し、16〜32週目 の採血に関してAbの最適産生を観察した（ワクシニアＣ−100及びCHO APPを用い たウエスタン分析で示された）。この期間の採血を90〜100mlの抗血清のおよそ の量に対してプールした。 抗血清の精製のための免疫化APP649−695アフィニティーマトリックスの調製 ： BSAによるPierce Imject活性化免疫原抱合キットを用いて、9.7mgの精製ペ プチドAPP（649−695）をマレイミド活性化BSAと結合させた。Ellman試薬で測定 すると、約40％のペプチド（3.88mg）がBSAと結合した。BSA結合ペプチドを、ゲ ル濾過により非結合ペプチドから分離した（キットからの精製緩衝液＝83mM NaH2 PO4 pH7.2；900mM NaCl）。ゲル濾過カラムからのプール化無効容量（2.9mg Ｐ −142がBSAと抱合／12.5ml）を１ｇ（3.5ml）のCNBr活性化セファロースと結合 させた（＞90％のペプチド抱合体が標準Pharmaciaプロトコールにより結合）。 残りの部位をエタノールアミンで遮断した。セファロースアフィニティーマトリ ックスを1.0×3.5cmガラスカラム中に包装した。 APP（649−695）アフィニティーカラムを用いたウサギポリクローナル抗体の 精製 ： 最適Ab産生の採血からの併合ウサギ抗血清をプールし（100ml／3.9ｇタ ンパク質）、洗浄緩衝液（100mM NaHCO3 pH8.3；750mn NaCl）で１：１（ｖ／ｖ ）希釈して、ペプチドアフィニティーカラム上に1.0ml／分で４℃で負荷した。 負荷（200ml）後、Ａ280が０に戻るまで洗浄緩衝液（75ml）でカラムを洗浄下。 IgGを100mMグリシンpH2.5（40ml）で溶離した。１分分画を、100μｌの1.0Ｍ Tr is-HCl pH8.0を入れた試験管中に収集した。中和低pHIgG溶離物をプールし（34m l；14.7mg）、1.0リットルの100mM NaHCO3 pH8.3；500mM NaClに対して４℃で透 析した。 イムノアフィニティーカラムの調製： 精製ウサギIgGとセファロースSepharo seとの結合 5.0ｇのCnBr Sepharoseを50mlの結合緩衝液（100mM NaHCO3 pH8.3 ；500mM NaCl）で活性化し、オルビトロン上で４℃で21時間、透析済IgGプール と混合した。結合後、樹脂を浸漬ガラスフィルターを通して結合緩衝液で１回、 その後100mlの遮断緩衝液（100mM NaHCO3 pH8.3：500mM NaCl；1.0Ｍエタノール アミン）で３回洗浄した。結合緩衝液（100ml）、次いで低pH緩衝液（100mM NaO Ac pH4.0；500mM NaCl）による２つの連続した中間洗浄工程、並びに結合緩衝液 （100ml）による最終洗浄により樹脂調製は完了する。結合は、総量17.5mlの樹 脂の87％に認められた（0.727mg IgG／ml樹脂）。 （iii）ベータアミロイドペプチドに対するモノクローナル抗体の生成及びエ ピトープマッピング ハイブリドーマ法 以下の２つの合成ペプチドの混合物を多数回注射するこ とにより、Balb／ｃマウスを免疫化した： １）ベータアミロイドを含有するホ ロAPP695のアミノ酸597〜638（ナンバリングはKang等、同上による）、及び２） Ｃ末端ドメインを含有するAPP295アミノ酸645−695。標準手法（Herzenberg et al.，1978,：D.M.Weir（Ed-），Handbook of Experimental Immunology，pp 25. 1-25.7，Blackwell Scientific Publicatins，Oxford，UK）を用いて、固定化動 物からのSplenoytesをＸ63／Ag8.653マウス骨髄腫細胞と融合させた。その結果 生じたハイブリッドからの上清を、ベータアミロイドペプチド免疫原を微小滴定 プレートと結合させるEIAを用いて抗ペプチド特異的抗体の存在に関してハイブ リッドを試験した。免疫原として用いた合成ペプチドと反応する抗体を分泌する 培養を、限定希釈により２回クローニングし、それらのアイソタイプを記載（Wu nderlin et al_，1992，J_ of Immunol．Method s，147：1）通りに確定した。分泌IgGを、使いつくした培養液のプロテインＡア フィニティークロマトグラフィーによりクローン化ハイブリドーマ細胞の血清無 含有発酵プロスから精製した。 エピトープマッピング 抗ペプチドモノクローナル抗体の１つであるC286.8 Aと呼ばれるIgG 2bは、EIA並びにイムノブロット検定により、合成ベータアミロ イドペプチドとの良好な反応性を示した。モノクローナルのエピトープ反応性を 、競合EIAを用いて測定した。ヒトAPP695のアミノ酸597−612，597−624，597− 638，608−624，621−631及び645−695（ナンバリングはKang等による）を含有 する合成ペプチド、並びにＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）を、C286.8AのAPP597−638と の結合を遮断する能力に関して試験した。 抗体により認識されるペプチドは、溶液中の抗体で予備インキュベートした場 合には、微小滴定プレートと結合するベータアミロイドとのその後の反応に有用 な抗体の溶液濃度を低下させる。このような実験の結果は、図４に示し、本明細 書で後述する。 ペプチドAPP597−612，597−624，597−638及びＮ−ダンシル−Ile-Ser-Glu-V al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp（配列番号：１）のみが 、用量依存様式でのC286.8A結合を阻害し得た。これらのペプチドは、それぞれ ベータアミロイド配列のアミノ酸１−16，１−28，１−42及び１−７を含有する （Ｎ末端アスパラギン酸残基からナンバリング）。あらゆるベータアミロイド配 列、例えばAPP649−695を欠く、又はベータアミロイドペプチド配列12−28又は2 5−35（それぞれAPP608−624及びAPP621−631）を含有するペプチドは、モノク ローナル抗体の相同抗原との結合を阻害しなかった。これらの結果は、このモノ クローナル抗体に関する反 応性エピトープが、少なくとも一部、ヒトAPPのＡ４領域、即ちAPP597−601の最 初の７個のアミノ酸中に存在することを示す。 実施例７．組換えホロ−APP695の精製 APP C末端プロセシングの最初の試験は、上記実施例４に述べたようにしてCHO 細胞で発現された組換えAPP695を用いて行い、次いで下記の方法１のようにして 精製した。この基質を用いる特性決定の試験は後記実施例８で説明し、この試験 によって、Ｃ末端のプロセシングを行うことができる可能性のある六つの異なる APP減成酵素が同定された。 次にバキュロウイルスの発現系を成長させ（実施例４参照）、CHO発現系が達 成可能なレベルより高いレベルのAPPを得た。バキュロウイルス系由来のホロ−A PP695の精製は下記の方法２で述べる。バキュロウイルス由来の精製したホロ−A PP695は、下記実施例９と10で述べるプロテアーゼ特性決定試験を行うのに使用 した。 特にことわらない限り、ステップはすべて０〜４℃で行った。ホロ−APP695の 検出は、特に下記実施例８に記載されているように、抗ヒトAPP695C末端抗体を 用い免疫ブロット分析法によって行った。 方法１．安定にトランスフェクトされたCHO細胞由来のホロ−APP695の精製 （ａ）形質膜の単離。ローラーボトル内でのCHO細胞の連続培養で得た全細胞ペ レット（179ｇ）（実施例４参照）を遠心分離（1500ｇ×５分間）で収集し、塩 化ナトリウム（30mM）、塩化マグネシウム（１mM）、EDTA（10mM）、PMSF（200 μｇ／ml）、Ｅ−64（42μｇ／ml）およびペプスタチン（3.8μｇ／ml）を含有 する50mMトリス−HCl緩衝液（pH8.0）中に再懸濁させて全容積を600mlにした。 この細胞を、テフロンポッター（10回の戻り工程）を用いてホモジナイズし 、次いで41％スクロースを含有しプロテアーゼインヒビターのEDTA，PMSF，Ｅ− 64およびペプスタチンを含有していないホモジナイゼーション緩衝液10ml中で層 分離させた（25ml／遠心分離管）。Beckman SW−28ローター内で遠心分離（26,8 00RPM×60分間）を行ってから、中間層を注意深く取り出し（合計量約150ml）、 同容積のホモジナイゼーション緩衝液（プロテアーゼインヒビターを除く）で希 釈し、テフロンポッター（３回の戻りストローク）を用いて再懸濁させ、次いで 上記のようにして再び遠心分離して、しっかり固まったペレットを得た。上澄み 液をデカントし、次いでペレットを５mMトリスHCl pH8.0に再懸濁させ全容積100 mlにした（テフロンポッター、３回戻りストローク）。再び遠心分離（Beckman 70 Tiローター中50,000RPM×60分間）に付し、ペレットを50mMトリスHCl，pH8.0 中に再懸濁させて全容積を57mlにした。 （ｂ）形質膜の可溶化。上記の再懸濁させたCHO形質膜標品の37mlづつを、プロ テアーゼインヒビターと原液の20％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100の混合物に順次 添加して、上記のホモジナイゼーション緩衝液中（全可溶化容積45ml）、次の成 分濃度：EDTA（１mM）、Ｅ−64（24μｇ／ml）、PMSF（53μｇ／ml）、ペプスタ チンＡ（11μｇ／ml）およびトリトンＸ−100（最終的に2.2％ｖ／ｖ）にした。 この混合物を４℃て30分間ゆるやかに振盪させ、次いで非可溶化物質を遠心分離 （Beckman 70 Tiローター中50,000RPM×40分間）で除いた。可溶化されたホロ− APPを含有する上澄み液を、0.45μＭのディスクフィルターで濾過した。 （ｃ）強力なアニオン交換クロマトグラフィによる、可溶化APP695の精製。ホロ −APP695を含有する上記上澄み液を同容積の蒸留水で希釈し、0.1％トリトンＸ −100を含有する20mMトリス−HCl緩衝液pH8.0で予め平衡化したMono-Q HR 10／1 0カラムに加えた。負荷 してから、全容積210mlの平衡緩衝液に０〜１ＭのNaClを含有する直線勾配液で カラムを溶離した。流量は終止３ml／minに維持した。17〜22mmho（４℃）の伝 導率の範囲内で溶離するタンパク質は、大部分の免疫反応性APP695を含有してお り、これを合して0.025％のトリトンＸ−100を含有する５mMトリス−HCl pH8.0 の２ｌに対しし４時間透析し、次いで遠心分離（Beckman SW 28ローター中26,80 0RPM×60分間）によってわずかの濁りを除いて清澄にした。 （ｄ）ヘパリンアガロースクロマトグラフィ。上記の清澄試料を、透析緩衝液で 予め平衡化したヘパリンアガロースのカラム（15×1.6cm）に加えた。負荷中は 、カラムの頂部１／３内に淡褐色のバンドが生成した。負荷してから５分間づつ 画分を集めた（流量は終止１ml／minにした）。カラムは、塩化ナトリウムの最 終濃度を連続的に０，150，300，600および2000mMに調節した平衡緩衝液85mlで 段階的に溶離した。免疫で検出可能な（immunodetectable）ホロ−APPの大部分 は600mM NaClで溶出し、次の定量的画分は300mMで回収された。300mMと600mMのN aClで回収されたAPPは別々に集めて、−80℃で別々に貯蔵した。以下の試験で使 用したAPPはその300mM NaClによる画分由来のAPPである。300mMヘパリンアガロ ース溶出液由来の部分的に純品のAPPの収量は、湿潤CHO細胞ペレット１ｇ当り5. 5μｇであった（ブラドフォード検定法）。この標品中のAPPは、SDS PAGEによる 分析に基づいて純度が約25％であると判定した。 方法２．組換えバキュロウイルスでインフェクトされた昆虫細胞由来のホロ−AP P695の精製 （ａ）細胞ペレットの可溶化。二つの５Ｌづつの発酵実験から収穫した細胞ペレ ットを含し（全重量8.9ｇの検出可能なタンパク質）、下記のインヒビター：ペ プスタチンＡ（25μｇ／ml）；ロイペプ チン（25μｇ／ml）キモスタチン（25μｇ／ml）；アンチパイン（25μｇ／ml） ；アプロチニン（25μｇ／ml）；ベンズアミジン（４mg／ml）；PMSF（0.87mg／ ml）およびEDTA（25mM）を含有する0.32Ｍスクロース160mlに添加し、次いでテ フロンポッター（10回戻りストローク）によってホモジナイズした。そのホモジ ネートを遠心分離（Beckman 70 Tiローター中、105,000ｇで１時間）に付し、得 られたペレットを、0.5Ｍ NaClおよび先に述べたのと同じインヒビターを同じ濃 度で含有する10mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）160ml中に、テフロンポッター（1 0回戻りストローク）を使用して再懸濁させた。軽く音波処理を行った後（Brans on Sonifier Cell，２分間、パワーレベル４）、トリトンＸ−100を最終濃度５ ％（ｖ／ｖ）まで添加し、次にその懸濁液を４℃で20分間ゆっくり撹拌した。そ の混合物を遠心分離（Beckman Ti 70ローター中、50,000RPM，60分間）に付し、 そしてヘパリンアガロースクロマトグラフィにかける第一上澄み液（574mgのタ ンパク質）を注意深く取り出した。ペレットを、0.5Ｍ NaClおよび上記の各イン ヒビターを上記の濃度で含有する10mMトリス−HCl緩衝液（pH7.5）160mlに、テ フロンポッター（20回戻りストローク）を使って再懸濁させた。上記のように、 ５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−100で可溶化し次いで遠心分離して第二の可溶化上 澄み液（683mgのタンパク質）を得た。 （ｂ）ヘパリン−アガロースの放射状フロークロマトグラフィー。上記（ａ）で 得た上澄み液の両方を、以下のようにしてヘパリンアガロースで別個に精製した 。これら上澄み液に精製水と１ＭトリスpH9.5を加えて希釈し、容積を3.5Ｌにし 、コンダクタンスを1.8mmhoにおよびpHを8.0にし、パックされた樹脂250mlが入 っていてかつ0.1％トリトンＸ−100を含有する５mMトリス−HCl緩衝液pH8.0で予 め平衡化されたSuperflow250カラム（Sepragen社）に注入 した。負荷してから、上記カラムを平衡緩衝液３Ｌで洗浄し、次いで600mM NaCl を含有する平衡緩衝液で溶離した。30ml／minの流量を全体にわたって使用した 。45mlづつの画分を、Ａ280nmで全タンパク質について監視し（ブラドフォード 検定法）、免疫反応性APPのレベルを、実施例６ｉ）の抗APP C末端抗血清に対す る免疫ブロット法で検出した。有意なAPPを含有する画分を合して、抗体アフィ ニティークロマトグラフィーに付した。 （ｃ）抗体アフィニティークロマトグラフィー。第一上澄み液（276mgのタンパ ク質を含有している）と第二上澄み液（113mgのタンパク質を含有）をヘパリン アガロースで精製して600mM NaClで溶離したプールを合して、pHを8.3に調節し 、次いで実施例６ii）に記載されているようにセファロースに結合されたアフィ ニティー精製Ｃ末端抗体が入っていて、500mM NaCl，0.1％トリトンＸ−100を含 有する100mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH8.3で予め平衡化された抗体アフィニティ ーカラム（10.5×1.5cm）に加えた。クロマトグラフィーは全体にわたって１ml ／分の流量で実施した。負荷してからカラムを70mlの平衡緩衝液で洗浄し、次い で0.1％のトリトンＸ−100を含有する100mMグリシンpH2.4の50mlで溶離した。５ mlつづの画分を収集して各々１Ｍトリス−HCl（pH8.0）0.5ml中に入れ、Ａ250nm で全タンパク質を監視し（ブラドフォード検定法）、前記ののようにして免疫で 検出可能なAPPを検出した。有意なAPPを含有する画分を合した。この合したヘパ リンアガロース溶出液を、合計５回アフィニティ精製法に付した。連続精製の各 工程から回収したAPPのプールを合してAPPの合計量は９mgになった。 （ｄ）強い陰イオン交換クロマトグラフィ。抗体アフィニティクロマトグラフィ からの組合せ分画（タンパク質9.0mg）を、0.025％（体積／体積）のトリトンＸ −100及び150mMのNaClを含むpH8.0 の20mMのトリス−HCl緩衝液で予め平衡化されたモノ−QHR５／５カラムに適用し た。ひとたび装荷した後、カラムを合計70mlの中で線形0.15〜１ＭのNaCl勾配で 溶出させた。全体にわたり0.5ml／分の流速を使用した。有意で免疫検出可能なA PPを含む溶出された分画を組合せ、使用するまで−80℃でアリュート中に保存し た。APPの最終調製物は、クーマシーブリリアントブルーで現像されたSDS−PAGE に基づいて95％以上の純度を有しており、理論上の組成と86％の一致の範囲内に あるアミノ酸組成を示し、成熟タンパク質について以下のＮ末端配列を示した： Leu-Glu-Val-Pro-Thr-Asp-Gly-Asn-Gly-Leu-、２回の５Ｌ発酵ランからのペレッ トから5.6mgの精製タンパク質が得られた。 アミノ酸分析は、基本的に他の文献中で記述されている通りに行なった（Dupo nt，D.R.，Keim，P.S.，Chui，A.H.，Bello，R．Bozzini，M．及びWilson，K.J. ，「アミノ酸分析に対する広範なアプローチ」、Techniques in Protein Chemis try内、編集：Tony E．Hugli，Academic Press，284〜294(1989)）。２時間160 ℃で2.0％のフェノールと共に６Ｎの塩酸を用いて蒸気相内のアルゴンの下で試 料を加水分解した。オンライン式130Ａ型分離システム及びネルソン分析用2600 型クロマトグラフィソフトウェアを用いて、Applied Biosystemsの420Ａ型デリ ヴィタイザー（Derivitizer）上でフェニルチオカルバモイル−アミノ酸分析を 行なった。 例８．ヒト脳プロテアーゼ下位分画を触媒としたAPP695の分解の検出のための イムノブロット検定 （ａ）基質APPを用いたインキュベーション （ｉ）所要量の２Ｍの保存緩衝液を付加することによりpH6.5のMES緩衝液中の最 終的な140mMにまで調整された組換え型ヒトAPP695（10.75μｌ）を用いて、37℃ で24時間、（例１に記述されていると おりの段階から得られたイオン交換分画又は濃縮された分画プール（例３）の５ μｌアリュートをインキュベートする。インキュベーション中の最終的緩衝液濃 度は95mM，pH6.5であった。インキュベーション時間中、APP695のいくつかのタ ンパク質分解による劣化が起こり、より低いMrフラグメントを生み出す。 （ii）36％（体積／体積）のグリセロール及び12％（体積／体積）のSDS，10％ （体積／体積）の２−メルカプトエタノール及び微量のブロモフェノールブルー トラッキング用染料を含む1.5ＭのトリスHCl，pH8.45といった３ｘのLaemlie SD S−PAGE試料緩衝液を7.5μｌ付加することによって、タンパク質分解反応を終結 させた。試料を加熱し（100℃×87分）、次に冷却させた。 （ｂ）SDSPAGE分析： 10〜20％のアクリルアミド勾配トリシンゲルのウエルに対して、反応混合物（ 15μｌ）を適用した（日常的には、厚み1.0mmの15ウエルNovexプレキャストゲル 、Novex Experimental Technology，San Diego，CA）。ゲルを恒常電圧条件下で 、そして50Ｖにて、試料がゲルの中に入るまで走行させ、入った時点で電圧を10 0Ｖにまで上昇させた。トラッキング用染料がゲル底面から0.5cm以内のところに 達した時点で、電気泳動を中断させた。Mrが３〜195kDaの範囲内にある予め染色 されたMr標識を用いて（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD） 、ゲルを較正した。高分子量と低分子量の標識を含むキットを各々10マイクロリ ットルずつ10μｌの３ｘ試料緩衝液と混合し、（ａ）（ii）項に記載されている とおりに処理した。予め染色された標識としてはキット内に以下の分子量標識タ ンパク質が存在していた：ミオシンＨ鎖（196kDa）；ホスホリラーゼＢ（106kDa ）；ウシ血清アルブミン（71kDa）；オバルブミン（45.3kDa）；炭酸脱水酵素（ 29.1kDa）；ベーターラクトグロブリン（ 18.1kDa）；リゾチーム（14.4kDa）；ウシトリプシン阻害物質（5.8kDa）；及び インシュリンＡ及びＢ鎖（３KDa）。 （ｃ）イムノブロット法、 （ｉ）その後ゲルを小型トランスブロット電気泳動セル（Biorad labs，Richmon d，CA）に移した。150mMのグリシン及び20％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むpH8. 5の20mMのトリスHCl緩衝液といった４℃に維持したトランスファ緩衝液を用いて 、100Ｖ（恒常）で１時間ProBlott（TM）膜（Applied Biosystems．Foster City ，CA）上でタンパク質を電気ブロットに付した。 （ii）ProBlott膜をとり出し、150mMのNaClを含むpH8.0の10mMのトリスHCl緩衝 液中の５％（重量／体積）の脱脂粉乳という組成の15mlの遮断用緩衝液内に１時 間室温で放置した。 （ｄ）APP及びＣ末端分解産物の免疫検出： 合成ヒトAPP695C−末端ペプチド免疫原に対して惹起されたウサギポリクロー ナル抗血清の１：1000希釈液を含む15mlの遮断用緩衝液に膜を移し、一晩４℃で インキュベートした。 ５分間穏やかに振とうさせながら連続三回の15mlの体積の遮断用緩衝液で、膜 を洗い流した。次に、アルカリ性ホフファターゼでカップリングされたヤギ抗ウ サギIgGの１：1000希釈液（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）を含む15mlの 遮断用緩衝液に膜を移し、90分間室温でインキュベートした。その後、10分間穏 やかに振とうさせながら、連続三回の15mlの体積の遮断用緩衝液を用いて、膜を 洗い流した。 次に、100mMのNaCl及び５mMのMgCl2を含むpH9.5の100mMのトリスHClを含むア ルカリ性ホスファターゼ緩衝液を各々15mlの体積で５分間、連続三回用いて、膜 を洗浄した。次に100mMのNaCl，５mMのMgCl2及び50μｌのBCIP基質（50mg／ml， Promega，Madison， WI）そして99μｌのNBT基質（50mg／ml，Promega）を含むpH9.5の100mMのトリス HCl 15mlを用いて、暗所でゲルをインキュベートした。低いMrの免疫反応性バン ドが見かけ上さらに強まることが全くなくなるまでインキュベーションを続行し た（標準的には室温で３時間）。次にゲルを脱イオン水で洗い流し、乾燥させた 。 APP695を酵素的に分解してＣ−末端断片を生ずる細分画ヒトAD皮質のモノ−Ｑプ ールの能力の分析 実施例３に記載するＰ−２，Ｓおよびｍプールの各々を前述のイムノブロット アッセイにかけた。真性のAPP基質分子の使用と組み合わせた、免疫原検出法の 特異性は、高度に精製された酵素調製物を使用する必要性を回避する、比較的粗 製の生物学的抽出物中のAPP分解性酵素の活性を検出する選択的方法を提供する 。こうして、部分的に精製したプールのあるものは、時間依存的態様でＣ−末端 APP断片を形成できるタンパク質分解活性を有した。ヒトAD脳のイムノブロット 分析の代表例は、Ｐ−２Ｖ（パネルａ）、Ｍ III（パネルｂ）およびＳＩ（パネ ルｃ）について、ならびにＰ−２VIIプール（パネルｄ）のプール前の個々の画 分については第１図に示されている。 プールＭ IIIについて、例えば、第２ｆ図に描写されているような、時間過程 の実験は、これらの断片が時間０に基質または酵素画分の中に存在しないことを 示した。さらに、基質単独のインキュベーションはそれらを形成しなかった（例 えば、第２ａ図、レーン２、第２ｄ図、レーン２、第２ｆ図、レーン８を参照の こと）。バンドの大きさの範囲は、酵素画分に依存して、Mrがほぼ11.5kDa〜25k Daの間で変化したが、反応において形成した異なる生成物の数は驚くほど少なか った。pH6.5において、合計39のADプールのうちの８つはこのような活性を有す ることが発見された。プールはｉ）脳 の細分画、ii）カラムの溶離のイオン強度、およびiii）定性的APP切断パターン に基づいて互いに区別することができた。 ６つの選択したプール（「Ｍ−III，Ｍ−VIII，Ｓ−Ｉ，Ｓ−III，Ｐ−２Ｖ、 およびＰ−２VII」と表示する）は有意なAPP分解活性を有することが発見された 。対応する対照脳プールはまた、多少の上記の活性を含有したが、活性のレベル が対照プールとADプールとの間で異なるか否かを決定することは不可能であった 。上記の６プールの各々は11kDaのAPPのＣ−末端断片を形成できる酵素活性を有 した。 MRが11.5kDaのタンパク質分解生成物はとくに興味あるものであった。なぜな ら、それは、それ以上の研究において、通常主要な免疫検出可能なＣ−末端生成 物であり、そしてベータ−アミロイドペプチドのｎ−末端アスパルテートで開始 しそして全長の分子（Ｃ−100断片）のＣ−末端に延長するオープンリーディン グフレームからなるAPPの組換えＣ−末端断片と共移動することが発見されたか らである。この共移動は第２ｄ図に例示されている。この意味は、11.5kDaのバ ンドがＡ４領域のＮ−末端またはその付近のAPPの内部タンパク質分解生成物で あること、およびこの断片を形成できる前述のプロテアーゼ活性は、アミロイド 発生ペプチドの発生において生体内である役割を演ずることができることにある 。 第２ｄ図は、少なくともＰ２プールVIIの場合において、APPタンパク質分解の 11.5kDaのＣ−末端の酵素生成物は凝集することができることを示す。PMTI100推 進Ｃ−100標準と共移動するMr11.5kDa、および18kDaの断片におけるペプチドの バンドの出現に加えて、Mr24.3，27.4および35.5kDaに他のバンドが出現する。2 4.3および35.5kDaのバンドは、Ｃ−100断片の、それぞれ、二量体および三量体 について期待されるMrをもち、そして凝集のためであるＣ −100における対応するかすかなバンドとほぼ共移動する（詳細については実施 例５を参照のこと）。 第２ａ図〜第２ｃ図は、また、古典的プロテアーゼインヒビターの作用を検査 するためにこのアッセイを使用できることを示す助けをする。例えば、第２ａ図 から明らかなように、Ｐ−２Ｖはメタノールにより部分的に阻害されそしてメタ ノール性ペプスタチンＡにより完全に阻害されるが、Ｍ−III（第２ｂ図）およ びＳ−Ｉ（第２ｃ図）の両方はアプロチニンおよびシステインにより完全に阻害 される。こうして、このアッセイは、１つの態様において、APP分解酵素の新規 な生体外インヒビターについて探索に適用される。これにより同定される効力の ある化合物を、適当に動物モデル、例えば、APPまたはそのベータ−アミロイド 含有断片を過度に発現するようにデザインされたトランスジェニック動物を使用 して生体内の効能について試験する。 下表４は、ペプチド生成物の大きさ、生成物の形成についての見掛けのpH依存 性、および商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターの作用を包含する、モ ノ−Ｑ画分から回収されるAPP分解活性の６つの主要なプールの性質のいくつか を要約する。 活性のいくつかはアルカリ性の範囲の最適なpHを有し、そしてリソソームのカ テプシンの作用のためであるように思われなかった。この観察は意味がある。な ぜなら、いく人かの研究者らは、病理学的APPのプロセシングはエンドソーム− リソソームの経路内でプロテアーゼにより実施されると報告したからである（Ca taldoら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：3861；Benowitzら、1989，E xperimental Neurology，106：37；Coleら、1989，Neurochem．Res．14：933） 。この経路内の酵素は活性pH最適値を示すことが期待されるであろう。 入手可能なデータに基づいて、Ｍ−IIIおよびＳ−Ｉはすべての列挙した基準 により高度に類似し、そして多分ＳおよびＭ画分の各々の同一の酵素の交差汚染 を表す。したがって、ヒト能がAPPを分解して11.5kDaのＣ−100様生成物断片を 生ずることができる最小５つの異なるプロテアーゼ活性を含有する可能性がある 。 表４が示すように、活性のいくつかは試験したインヒビターのいずれかによる 阻害に対して不感受性であり、そしてこれらの酵素は異常なグループの構成員を 表すことができる。Ｍ−IIIおよびＳＩにおける11.5kDaのＣ−100断片の形成に 関係する活性はセリンまたはシステイン型であるか、あるいは異常なグループの 構成員を表す。あるいは、これらの画分はセリンおよびシステインの両方のプロ テアーゼを含有することができ、両方の酵素はＣ−100の生産において絶対的（ 順次の）役割を演ずる。P2Vはアスパラギン酸プ ロテアーゼ活性およびセリンプロテアーゼ活性の両方を含有するP2VIIはPMSFに 向かうその感受性に基づくセリンプロテアーゼ活性を含有する。しかしながら、 引き続く研究において、ペプスタチン阻害可能な活性が認められ、表４における セリンプロテアーゼ活性と一緒にアスパラギン酸プロテアーゼのＰ２中の共局在 化を示した。Ｓ IIIまたはＭ VIIIにおける酵素活性のいずれも試験したイン ヒビターのいずれに対しても感受性ではなかった。いずれの場合においても、実 施例３において使用したＮ−ダンシルペプチド基質を使用する酵素プールの共イ ンキュベーションによるAPP分解の阻止を証明することができなかった。 APP活性（実施例８）とモノ−Ｑプールのペプチダーゼ活性（実施例３および 第１図）の回収を比較すると、２つの活性の間に相関関係がほとんど存在しない ことが明瞭に示される。こうして、APP分解活性は比較的ペプチダーゼ活性をほ とんど示さないプールの中に大部分含有された。これが示唆するように、APP分 解活性は劣ったペプチダーゼであり、そして活性のために無傷の折りたたまれた APP基質を必要とすることがあるか、あるいは選択したペプチドは病理学的APPプ ロセシングの誤った位置を表す（しかしその可能性は少ない）。それにもかかわ らず、この発見は他の研究者らがペプチド基質に基づくアッセイを使用して普通 のAPP分解酵素の同定に成功しなかった理由を説明する。 上の考察から、本発明のアッセイはヒト脳からの特定のAPP分解酵素の単離を 可能とするために十分な特異性を有すると結論される。 それ以上の研究において、Ｐ−２VII関連APPアーゼの回収を追跡するためにイ ムノブロットアッセイをわれわれは使用した。研究はこのプールに集中された。 なぜなら、それは６つの特徴づけられ た活性の最大の発生量を表し、かつアミロイド的であると思われるＣ−末端断片 を発生したからである。それはＰ−２細分画のイオン交換分離から回収可能な主 要な活性を表し、そしてペプチダーゼ活性の主ピークと一致しない勾配中の一点 において溶離される。 APPアーゼを表示するＰ−２VII画分をプールし、そして２つの直列のスパロー ス（Superose）12カラム（ファーマシア）の大きさ排除クロマトグラフィーにか けた。溶離された画分中のペプチダーゼおよびAPPアーゼを分析した（第３ａ図 ）。Ｋ−Ｍ切断活性は一部分オーバーラップすると思われたが、Ｍ−Ｄ活性のピ ークは再びまたAPPアーゼのピークと一致しなかった。既知の分子量のマーカー に対するクロマトグラフィーの目盛り定めは、Ｐ−２VII画分のAPPアーゼ活性に ついて±6.5kDaの不確実さをもつ31.6KDaの見掛けのメジアンMrを生じた（第３ ｂ図）。 実施例９ APPC−末端のプロセシング酵素としてのカテプシンＤの同定 実施例４、方法２、に記載するバキュロウイルスの発現系、および実施例７、 方法２、の精製系を使用することによって、より大きい量のホロ−APP695が得ら れたので、ペプチダーゼ活性に基づいて作った画分のプール中のAPP分解酵素の 含量を評価する（実施例８において実施したように）よりむしろ、ヒト脳酵素の 精製からの個々のカラムの画分中のAPP分解酵素の回収を追跡することができる ようになった。 実施例１の方法に従う可溶化Ｐ−２画分の精製からの個々のモノ−Ｑ画分につ いて、APP分解酵素活性の含量を第５図に示す。モノ−Ｑクロマトグラフィーに かけた可溶性およびミクロソームの画分の同様な分析と比較したとき、酵素のＣ −末端APP断片についての相対的染色強度はモノ−ＱからのＰ−２細分画におい て首尾一貫し て最大であった。Ｐ−２におけるAPP分解活性は、２つの明確な移動ピークとし てモノ−Ｑから回収された（ＡおよびＢ、第５図）。 ピークＡは、われわれの初期の研究において見られるように、負荷および低い イオン強度の洗浄において、すなわち、Ｐ−２Ｖの回収にほぼ相当する領域にお いて溶離される（表４）が、ピークＢはＰ−２VII活性が前に観察されたプール した領域とオーバーラップし（表４）、そしてセリンおよびアスパラギン酸プロ テアーゼ活性の両方からなることが示された。同様な大きさの分解生成物はMrほ ぼ28，18および14および＜11kDaにおいてピークＡおよびＢの両方の活性をもつ ことが観察されたが、18kDaバンドの相対的染色強度はピークＡよりピークＢに おいて非常に大きかった。ピークＢをプールし、そして実施例１、方法１に記載 するようにスパロース（Superose）６HRで精製した。溶離された画分は２つの定 性的に明確な型の活性を含有し、これらはそれらの溶離のプロフィルがオーバー ラップした。もとのピークＢの画分で観察されたものに最も密接に類似するAPP 破壊パターンを生成する活性（第５図）が、ゲル濾過からの画分51〜56において 回収され（第６ｂ図および第６ｃ図）、15〜25kDaの見掛けのMrと一致した。こ の溶離のピークの前に、主として18kDaの破壊生成物を形成する活性の溶離が存 在し、そしてこれは多分より大きい見掛けのMrのプロテアーゼにより触媒される 。この後者の活性は、実施例８、表４におけるＰ−２VIIプール中の前述のセリ ンプロテアーゼ活性に多分相当する。ピークＢ（および15〜25kDaのMr領域内の ）のゲル濾過精製からの活性画分は古典的プロテアーゼインヒビターによる阻害 について試験した（第７図）。これらの研究により、ピークＢ活性はペプスタチ ンＡにより定量的阻害により決定してアスパラギン酸プロテアーゼにより大きく 触媒されることが確証された。 比較的わずかのヒトアスパラギン酸プロテアーゼが知られている。同定された ものは、カテプシンＤおよびＥ、およびペプシンを包含する。観察された活性が これらの酵素のいくつかに相当することができる可能性を試験するために、バキ ュロ誘導ホロ−APPを酵素的に分解するそれらの能力について、ヒトレニンの商 業的調製物（カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州サンディエゴ、カ タログNo.553864）、およびヒトカテプシンＤ、およびヒトカテプシンＤ（ヒト 肝臓、カルビオケム（Calbiochem）、サンディエゴ、カタログNo.219401）を検 査した。 ヒトカテプシンＤ（カタログNo.219401、カルビオケム（Calbiochem）、カリ フォルニア州サンディエゴ）は、銀染色で展開したSDS−PAGE上で電気泳動的に 均質であり、カテプシンＤの理論的組成とのすぐれた（93％の）一致を示すアミ ノ酸組成を示した。すべてのＮ−末端はカテプシンＤに相当し、主要な配列は成 熟プロテアーゼの軽鎖（GPIPEVLKNY）および重鎖（GGVKVERQVF）に相当する当量 モル量で存在する。 レニンは不活性であった（示されていない）が、カテプシンＤはAPPを選択的 に切断して、モノ−Ｑからの前述のＰ−２ピークＢ（第５図）で観察されたもの と同様なＣ−末端分解生成物のパターンを生成する。こうして、商業的カテプシ ンＤ調製物は時間依存的方式でホロ−APPを分解して近似Mr18および28kDaの主要 なＣ−末端生成物を生成した。ペプスタチンＡによる活性の阻害はこの反応にお けるカテプシンＤの関与を確証した（第８図）。 ヒトカテプシンＤに対する商標的ポリクローナル抗体を入手し（ダコ・コーポ レーション（Dako Corp.）、カリフォルニア州カーピンテリア、カタログNo．A5 61）、そしてイムノブロット上のヒトカテプシンＤに対して反応性であり、Mr27 〜28kDaの免疫反応性バン ドを発生することが発見された。この抗体をイムノブロットアッセイにおいて使 用して、Ｐ−２、可能性またはミクロソームの画分のモノ−Ｑ精製からのクロマ トグラフィーの画分が免疫反応性カテプシンＤを含有するかどうかを検査した。 抗体はイムノブロット上のヒトレニンと交差反応しなかった。 有意な量のカテプシンＤがＰ−２のモノ−Ｑ画分（第20ｄ図）およびAPP分解 活性を有する可溶性画分（データは示されていない）において観察された。興味 あることには、Ｐ−２のモノ−Ｑ画分の分析においてカテプシンＤの反応性の２ つのクロマトグラフィー的に明確なピークが観察され、それらの各々はピークＡ およびＢと一致した（示されていない）。ピークＡ活性に関連する免疫反応性ア スパラギン酸プロテアーゼ、カテプシンＤは、実施例８のＰ２Ｖが前に同定され た領域と一致した。これが示唆するように、ピークＡおよびＢはカテプシンＤの 多数の形態のためであることができる。カテプシンＤの多数の形態はどこかに記 載し、そして単一の遺伝子生成物の翻訳後の修飾の差に帰属された。Ｐ−２のピ ークＢ（第５図）のそれ以上の精製からのゲル濾過カラムの画分のイムノブロッ トアッセイは、カテプシンＤの免疫反応性の存在がAPP分解活性のピークと正確 に一致することを示した（第６ｂ図）。 カテプシンＤの免疫反応性との共移動性およびカテプシンＤに対する分解性AP Pの類似性に加えて、ゲル濾過によりさらに精製したピークＢのプロテアーゼは 、Ｃ−末端のAPP分解存在の形成についてのカテプシンＤと同一のpH最適値（pH ４〜５）およびイオン強度の依存性を示した（第９図）。最後に、Ｐ−２画分に おいて観察された免疫反応性バンドは、バイオラド・ミニフォル（Biorad ninip hor）クロマトグラフィー系の分離用IEFにかけたとき、カテプシンＤについて報 告したのもに類似するpI（４〜６）を示した（示され ていない）。集合的に、ヒト脳Ｐ−２のモノ−Ｑ画分後に観察されるペプスタチ ン感受性APPプロテアーゼ活性はカテプシンＤの作用のためであるという事実を 、これらのデータが強く支持する。 次いで、ピークＢプロテアーゼ（ゲル濾過により精製した）およびカテプシン Ｄのペプチダーゼ活性を、基質として合成ペプチドＮ−ダンシル-Ile-Ser-Glu-V al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2（配列識別番号：７）を使用して比較した 。両方の酵素はこのペプチドを時間依存性方式で非常に遅い速度にかかわらず加 水分解した。両方の酵素について、主要な切断は-Glu-Val-結合において観察さ れ、そしてより少ない程度に-Met-Asp-結合において観察された（第10図）。第1 0図において、Met-Asp切断生成物の大部分をさらに描写した24時間の時点までに Glu-Val生成物に変換されたことに注意すべきである。期待されるように、カテ プシンＤおよびＰ−２酵素調製物により触媒されるペプチダーゼ反応の両方はペ プスタチンＡにより阻害された。 両方の酵素はGlu-Val-結合における加水分解のための酸性最適値をpH４に示し た（第１図）。-Met-Asp-における加水分解は、また、カテプシンＤで酸性最適 値（＜pH3.0）を示したが、Ｐ−２酵素では、２つの最適値が観察され（pH3.0お よびpH7.0において）、これは多分中性のpH最適値での反応における追加の汚染 性Ｐ−２プロテアーゼの沈澱のためであった（第11図）。カテプシンＤは通常疎 水性残基の間で加水分解する。しかしながら、酸性pHにおいて、AspおよびGlu側 鎖のプロトン化（中性の）形態はプロテアーゼのサブサイト結合の要件を満足す るために十分な疎水性であるように思われる。Asp側鎖のpKaはGlu残基よりいっ そう酸性であり、そして第11図において検査したpH範囲を通じてGlu残基より少 ない程度にプロトン化されるであろう。これはカテプシンＤでは-Met-Asp-結 合においてより低い切断速度、および-Glu-Val-結合と比較したとき、この部位 における切断についてより低いpH最適値におけるヒント（hint）を説明すること ができる。 イムノブロットアッセイにおけるモノクローナル抗体C286.8Aを使用する他の 研究により、Ｐ−２酵素活性がカテプシンＤのためであることが確証された。わ れわれのいっそう最近の研究において、この活性は可溶化Ｐ−２画分のイオン交 換クロマトグラフィーからの塩の勾配で初期のかなり狭い数の画分にわたって溶 離された単一のピークとして回収された（第20ａ図）。APP695を生体外で加水分 解して15〜38kDaの大きさの範囲の断片を形成し（第20ｂ図）、それらのすべて はベータ−アミロイドの最初の７つのＮ−末端残基を認識するネズミモノクロー ナル抗体（C286.8A）に対して反応した（第20ｃ図）。プールした画分の活性は1 0μＭのペプスタチンＡ、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビターにより完全 に阻害された（第20ｂ図）が、他のプロテアーゼの阻害、例えば、EDTA（１mM） 、PMSF（0.4mM）、Ｅ−64（0.1mM）、およびアプロチニン（10μｇ／ml）により 影響を受けなかった（示されていない）。APP分解活性は、APP模倣Ｎ−ダンシル −ISEVKMDAEFR−NH2を−Ｅ−Ｖ−結合において加水分解するペプスタチン感受性 プロテアーゼの溶離と一致した（第20ａ図）。カテプシンＤは、20kDaのカテプ シンＤ軽鎖のイムノブロット分析により判定して、ホロ−APPおよびペプチド分 解活性と共溶離した（第20ｄ図）。 高度に純粋なカテプシンＤはホロ−APPを分解して、Ｐ−２アスパラギン酸プ ロテアーゼ活性を使用して観察されたものと区別できないC286.8A免疫反応性生 成物（第21ｂ図）のパターンを生成した（第21ｂ図）。免疫吸着実験を実施して 、Ｐ−２アスパラギン酸プロテアーゼとカテプシンＤとの間の可能な免疫学的同 一性を検査し た。それらのAPP分解活性に基づいてプールしたイオン交換画分（第20ａ図）を 、カテプシンＤに対するイムノアフィニティー精製した抗体のカラムか、あるい は精製した対照を含有する対照カラムに等しい量で適用した。２つのカラムのた めのＡ280の溶離のプロフィルを重ねることができた（第21ａ図）。対照カラム からの貫流画分は、最初の空隙後に適用したプールと同一レベルのAPP分解活性 を含有した（すなわち、画分５以降、第21ｂ図）。対照的に、APP分解活性は抗 カテプシンＤカラムからの貫流から画分９（追加の5.7空隙体積）まで本質的に 存在せず、そして画分27（31空隙体積）までの適用したプールの中に存在するレ ベルに等しいレベルに到達しなかった。抗カテプシンＤカラムからの貫流中のAP P分解活性のこの損失は、固定化されたのと同一の抗カテプシンＤ抗体で検出さ れた免疫反応性カテプシンＤの軽鎖（20kDa）および重鎖（27kDa）の消耗と一致 した（第21ｃ図）。カテプシンＤの免疫反応性は抗カテプシンＤカラムから回収 されたが、0.5％のトリトンＸ−100を含めたとき100mMのグリシンpH2.5を使用す る溶離により対照カラムから回収されなかった。免疫反応性カテプシンＤに相当 するバンド以外のタンパク質バンドはこの溶離において検出されなかったことに 注意すべきである（第21ｃ図）。これにより、吸着されたAPP分解活性がカテプ シンＤそれ自体以外の免疫学的に交差反応性のプロテアーゼから生ずる可能性は ありそうに思われない。不都合なことには、微量のみのAPP分解酵素活性が抗カ テプシンＤカラムから回収された（示されていない）。これは多分この活性が中 和された溶離緩衝液により阻害されたためである：溶離緩衝液の組成物は、また 、精製されたカテプシンＤによるホロ−APPの分解を定量的に阻害した（示され ていない）。 ヒトカテプシンＤに対する固定化されたポリクローナル抗体は、 また、イオン交換プールの中に存在するAPPペプチド加水分解活性を免疫吸着し た（第22図）。部分的加水分解の条件下に、イオン交換プールはダンシル−ISEV KMDAEFR-NH2をＭ−ＤおよびＥ−Ｖの両方の結合において切断した（第20図にお けるように延長したインキュベーションの条件下に、Ｍ−Ｄ切断からの生成物は 二次タンパク質分解によりＥ−Ｖ生成物に究極的に変換された）。APP分解活性 を使用するときのように、Ｅ−Ｖ（第22ａ図）およびＭ−Ｄ（示されていない） 結合の切断の蛍光生成物を生ずるペプチダーゼ活性は、最初に、対照IgGカラム からの貫流の画分５の中に現れたが、画分12〜13まで抗カテプシンＤカラムから 本質的に見られなかった（第22ａ図）。低いレベルのＭ−ＤおよびＥ−Ｖペプチ ダーゼ活性は引き続いて抗カテプシンＤカラムから回収されたが、グリシン／ト リトンpH2.5を使用する溶離により対照IgGカラムから回収されたなかった（第22 ｂ図）。貫流の中に、あるいは酸性溶離により回収されたペプチダーゼ活性の各 々はペプスタチンＡにより完全に阻害された。いわゆるスウェーデンのFADにお いて観察されたAPP位置の対応するペプチド模倣（Ｎ−ダンシル−ISEVNLDAEFR-N H2）を使用する並行実験において、同様な結果が得られた（第22ｃ図および第22 ｄ図）。しかしながら、この後者のペプチドでは、蓄積する主要な蛍光生成物が Ｌ−Ｄ結合の切断から生じた。このペプチドの蓄積速度は非常に速かったので、 この反応に利用可能な基質のすべてはインキュベーション時間内によく消耗され 、第22ｃ図の貫流画分の中に異なる活性の低い評価に導いた。再び、貫流の中に 、あるいは溶離により回収されたペプチダーゼ活性はペプスタチンＡにより阻害 された。ペプチダーゼは、野性型APP模倣基質におけるＭ−Ｄ結合の切断につい て観察された速度より速い見掛け速度でスウェーデンのペプチド模倣の中に存在 するＬ−Ｄ結合を加水分解した。 期待されるように、他の基質のカテプシンＤの加水分解について報告されたも のとおおよそ一致した切断に相当するいくつかの生成物が観察された（Moriyama ら、1980，J．Biochem．88：619）。報告 されたカテプシンＤを除外して、カテプシンＤ特異性はバンド３の主要な生成物 、およびバンド５の小さい生成物を形成する-Glu-Val-切断、バンド１および２ の-Leu-Arg-切断生成物を含んだ（表５）。 APP593-594における-Glu-Val結合の切断は、ペプスタチン阻害性反応において ペプチド基質（前述したような）中の対応する結合を切断するカテプシンＤの観 察された能力と一致した。カテプシンＤは通常ある種の疎水性残基の対の間を加 水分解する。Glu-Val結合における切断は、予期されなかったが、グルタメート 残基の側鎖のプロトン化（pKa＝4.25）のために酸性（pH５）条件下に多分起こ り、それを中性とする。 事実、-Glu-側鎖の18％はpH5.0においてプロトン化されるであろうと結論する ことができる。このような酸性条件はリソゾームまたは分泌顆粒中で起こるか、 あるいは組織の損傷のときに、か、あるいはヒポキシアまたは虚血後に誘発され ることがある。 最も有意には、カテプシンＤは、普通の形態のベータ−アミロイドのＮ−末端 と称される-Asp-残基に対してＮ−末端の３アミノ酸残基を-Glu-Val-結合におい て異形加水分解により、5.6kDaの生成物（バンド３、表５）を発生した。この断 片はカテプシンＤを使用しないインキュベーションから取ったブロットの同等の 区画の中に存在しなかった。さらに、この断片は全長のベータ−アミロイドペプ チドを含有する正しい大きさ（5.6kDa）を有し、そしてその発生はカテプシンＤ が、また、ベータ−アミロイドペプチドのＣ−末端領域に密接する第２部位にお いてAPPを切断しなくてはならないことを示唆する。 事実、このようなＣ−末端の切断のための前駆体基質は、また、バンド５にお いて同定され、これはMr（10.0kDa）を示した。この断 片の配列が示唆するように、それはＣ−末端ドメインのすべてでないにしても、 大部分を含有し、そしてそれはAPP593−594における単一の-Glu-Val-切断により 発生した。 APP695は、カテプシンＤ切断のための理想的な基質であったと思われ、しかも カテプシンＤにより切断されなかった多数の他のペプチド結合を含有する。それ らが加水分解されなかったという事実は、折りたたまれたAPP構造内のカテプシ ンＤに対するアクセスから離れた、これらの部位の高度の隔離を反映する：疎水 性対の大部分は疎水性APPタンパク質コアに位置することが期待されるであろう 。同一の考察は、カテプシンＤにより加水分解されることが示された部位（表５ ）が最適なカテプシンＤ認識モチーフを常に含有しなかった理由を説明する。タ ンパク質表面上に位置するためには、このような部位はカテプシンＤが触媒する 切断のために理想的であるより大きい程度の極性または電荷を含有しなくてはな らないであろう。これに関して、５つの内部の切断部位のうちの３つは２つのプ ロリン残基を含有し、それらの各々は切断容易な結合の８残基内に存在したこと は注目に値する。このような残基はしばしば二次構造中の破壊に関連するか、あ るいはタンパク質表面にしばしば見出される屈曲（turns）に関連する。 平行のイムノブロット（第12ｃ図）において、生成物のペプチドのいくつか（ 矢印の位置）はベータ−アミロイドのＮ−末端残基に対するモノクローナル抗体 C286.8A）と反応した。これらは第12ａ図（表５）中のバンド３と同一の位置に おいて移動するMr5.6におけるバンド、第12ａ図（表５）中のバンド５と共移動 するMr９〜10kDaの間のタブレット、およびMr14kDaにおけるタブレット、および 第12ａ図中のバンド６と共移動する16〜18kDaにおけるタブレット、Mr40kDaにお けるバンドを含んだ。配列決定したバンド（表５） のうちで、バンド３，５および６のみが第12ｃ図により検出されたバンドと共移 動した。これに一致して、表５中のこれらの同一の３バンドのみは適当なＮ−末 端配列をもち、そしてベータ−アミロイドのエピトープを含有する大きさであっ た。 第12図に記載するベータ−アミロイドの免疫反応性分解生成物の時間的順序の 形成を、わずかに異なるモル比のカテプシンＤおよびAPP（第13図）下に、ペプ チダーゼ活性の不存在または存在の両方において実施した。インヒビターの不存 在下に、低分子量断片の時間依存性蓄積が観察され、これは、それぞれ、Mrほぼ 16〜18および28kDaにおけるバンドの形成で最初に開始された。２時間において 、Mrほぼ40kDaにおけるバンドが観察された。16〜18および40kDaのバンドは２時 間を越えてさらに増強されたが、28kDaのバンドの強度は時点を越えて一定に止 まった。16〜18および40kDaの強度は８時間を越えてさらに増加した。８時間と2 1時間との間に、Mrほぼ14，10および5.6kDaにおいて検出可能なバンドの強度の 実質的な増加が存在した。これらの後者の３つのバンドは16〜18または40kDaと 平行に増強しなかったので、14，10および5.6kDaのバンドは16〜18または40kDa のバンドのいずれかまたはすべての二次的分解から誘導された可能性が存在する 。第13図に記載する16〜18または40kDaのバンドは、表５中に列挙しかつ第12ｃ 図に示す同一のMrバンドに相当した。第13図において観察されるバンドのすべて はペプチダーゼ活性により阻害され、それらがカテプシンＤの作用により発生し たことを確証した。 第23図は、表５が作成されて以来同定されたものを包含するように、カテプシ ンＤにより形成されたAPP断片の配列の更新を提供する。それは、また、第12ｃ 図において観察される特定のC286.8A免疫反応性バンドに配列を関係づける。各C 286.8A免疫反応性バンド について、配列決定ブロットの対応するセグメントは、C286.8Aエピトープを含 有しかつこうしてイムノブロットのバンドを説明するために十分な大きさおよび 配列の１または２以上の断片を生じた（第23ａ図）。成熟βAPPのＮ−末端の外 に、CDを使用する消化は７つの異なる切断から生ずるβAPPのＮ−末端を生じ（ 第23ｂ図）、これらはカテプシンＤの報告された特異性とおおよそ一致した（A ．Moriyamaら、1990，J．Biochem．88：619；J．van Noortら、1989，J．Biol． Chem．264：14159；およびM．Tanjiら、1991，Biochem．Biophys．Res．Comm．1 76：798）。断片化パターン（第23ｂ図）が示唆するように、5.5kDaの断片はよ り大きい前駆体、例えば、38kDaのペプチド、あるいは第13図のさらに特徴づけ られない一時的28kDaの断片の漸進的Ｎ−末端およびＣ−末端の減少により起こ る。5.5kDaの免疫反応性断片は同一配列をもつ10〜12kDaの断片から直接誘導す ることができるであろう。これらの断片およびMr15〜16の断片の両方は、βAPの 全長のコピーを含有するために十分な大きさを有するように思われる。明らかな ように、他の生成物、例えば、10〜12kDaの免疫反応性断片のそれ以上のプロセ シングから生ずる生成物は、多分それ以上の分解、あるいはエレクトロブロッテ ィングの間の損失のために、検出されないままであることがある。 アルツハイマー病のアミロイド−シスにおける主要なプロテアーゼとしてカテ プシンＤの関係は、ここで、アルツハイマー病に関してなされた他の観察を説明 する。第１に、APPがリゾチームの中に蓄積しそしてそこでプロセシングされて アミロイドを有する断片を生ずるという増大すう証拠が存在する（Haasら、1992 ，Nature，357：500）。アミロイドの沈積はリソソームの酸性pHにおいて好適で ある（Burdickら、1992，J．Biol．Chem．267：546）。第２に、カテプシンＤは リソソームのプロテアーゼであるが、また、アルツハイ マーの脳におけるアミロイドの沈積に関連する有意なレベルで存在することが組 織化学的に示された（Cataldoら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3861 ）。 第３に、培養において細胞により解放されるベータ−アミロイドは残基Val594 で開始する小さいＮ−末端配列からなり（Haasら、1992，Nature，359：322）こ の配列はベータ−アミロイド１−42において普通に見られるAsp597で開始するよ り豊富な配列に対してＮ−末端の３アミノ酸である。小さい配列は、多分、位置 593−594、すなわち、カテプシンＤにより特定のタンパク質分解を行うことが現 在示されたのと同一部位、における-Glu-Val-結合の直接的内部タンパク質分解 により発生する。ここで、カテプシンＤは-Glu-Val-および-Met-Asp-の両方の結 合を加水分解するので、それはHaasらにより配列決定されたベータ−アミロイド 断片の両方を形成するために必要な特異性を有することが強調される。 第４に、システインプロテアーゼのインヒビターＥ−64およびロイベプチンは LC−99細胞によるベータ−アミロイドの解放に影響を及ぼさないが、一般的リソ ソームのインヒビターはこの解放をブロックし（Shojiら、1992，Science，258 ：126）、これらの細胞によるベータ−アミロイドの形成はシステインプロテア ーゼ以外のリソソームの酵素により触媒されることを示した。このような反応の ための残りの候補のプロテアーゼは、それらの研究において使用したシステイン プロテアーゼインヒビターにより阻害されない。 さらに、APPはベータ−アミロイドのＣ−末端と膜アンカー配列との間の疎水 性残基のストレッチを含有する。この領域におけるペプチド結合のあるものはカ テプシンＤにより加水分解されることができるであろう。事実、位置645−646に おける-Leu-Val-結合は、PEPTIDESORTコンピュータープログラムにより、可能な カテプシ ンＤ認識部位であるとして強調される。この部位は、家族性アルツハイマー病（ FAD）のある形態と共分離することが示された３つの点突然変異の位置に密接す る。この領域内の切断ならびに位置593−594における-Glu-Val-結合は、表５に おけるバンド３の大きさを説明することができるであろう。この部位におけるFA D突然変異は、この領域内のカテプシンＤによるAPP切断速度を増強することがで きるであろう。 最後に、位置595〜596における-Lys-Met-から-Asn-Leu-への二重突然変異は、 また、FADと共分離する。この突然変異は、特定のアミロイド発生プロテアーゼ が-Lys-Met-結合付近の切断のための特異性をもって存在する可能性をなくする ように思われる。なぜなら、その突然変異はこのような酵素による切断を増強す るよりむしろ妨害することが期待されるであろうからである。むしろ、ベータ− アミロイドを生ずる一次的内部タンパク質分解がこのジペプチドに隣接して、好 ましいそれに対してＮ−末端で起こる可能性を増加する。Glu-Val-結合は、Ｓ１ およびＳ１′位置において影響を受けないで残った、最も近いＮ−末端部位を表 す。 考えられるところでは、-Glu-Val-の切断容易な結合へのＳ２′およびＳ３′ 部位における-Asn-Leu-の突然変異はカテプシンＤによる切断を増強することが できるであろう。これが真実であるかどうか試験するために、基質Ｎ−ダンシル -Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2（配列識別番号：７）、お よびＫ−Ｍ対がNLで置換され、これにより前述のFAD突然変異を模擬する、同様 なペプチドを加水分解するカテプシンＤおよびＰ−２酵素の能力をわれわれは比 較した。両方の酵素はより長い時間のフレームでＭ−ＤおよびＥ−Ｖ結合におい て野生型ペプチドを切断したが、第14図に示す短いインキュベーション時間で非 常にわずかの切断が観察さ れた。対照的に、両方の酵素による突然変異ペブチドの切断は、野生型ペプチド を使用して観察されたより30〜50倍速い開始速度で起こった。すべき発生した単 一の代謝物質は4.4分の保持時間を示し、そして野生型ペプチドを使用して前に 見られなかった。この生成物を引き続いて精製し、そして質量スペクトル〔Ｍ− Ｈ〕+＝907およびアミノ酸組成の分析の組み合わせにより、Ｎ−ダンシル−ISEV NL（配列識別番号：９）と同定された。したがって、生成物は基質のＬ−Ｄ結合 の間の加水分解から生じなくてはならない。カテプシンＤによるこの切断は、ま た、ベータ−アミロイドの主要な形態において見出されるものと同一であるＮ− 末端をもつペプチドを遊離し、そしてアミロイド発生プロテアーゼカテプシンＤ によりいっそう急速に切断される部位を提供することによって、この特定の初期 の発現FADにおいて観察される−NL−突然変異がベータ−アミロイド形成速度を 増大するメカニズムを提供する。生じうるベータ−アミロイド蓄積速度の増加は 、このAPP突然変異に連鎖したアルツハイマー病の初期の発現形態を誘発するこ とができるであろう。 アルツハイマー病の重大な候補としてのカテプシンＤの同定は、この病気のた めの治療的インヒビターの開発の努力を有意に促進する。例えば、特定のカテプ シンＤインヒビターはベータ−アミロイドの毒性の蓄積を阻止することによって 治療的利益を提供することができるであろう。ここにおいて提供する新しい情報 は、他のアスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、レニンおよびHIV−プロテアー ゼの新規なインヒビターのデザインのために達成されたように、堅固に結合性の インヒビターを合理的にデザインするために、それを比較的に簡単とする。 あるいは、カテプシンＤは次に生体外ペプチダーゼアッセイを使用して高い処 理量のスクリーンにおける使用に適合させて、化学的 ライブラリーのランダムまたは半ランダム探索により治療的インヒビターを同定 することができる。このような目的のために適当なアッセイは、本発明の実施例 ２および３に記載するＮ−ダンシル−ペプチドのアッセイを包含することができ る。 実施例10 Ｃ−末端のAPPのプロセシングに対する特異性をもつセリンプロテア ーゼの同定 第４図は、ヒト脳が組換えAPPのＣ−末端をプロセシングすることができるセ リンプロテアーゼを含有すること、およびある場合においてこれらのセリンプロ テアーゼがアプロチニンで阻害可能であったことを示す。このようなプロテアー ゼのいっそう円滑な単離を試みるために、初期の工程としてアプロチニン−セフ ァローズによるアフィニティー精製組み込んだ別の単離の計画を提出した（実施 例１、方法２）。 Ｐ−２画分のそれ以上の精製のためのこの手順の適用は、APP分解活性の単離 において有望であった（第１５図）。酸性溶離によりアプロチニン−セファロー ズのカラムから回収された活性画分をモノ−Ｑカラムでさらに精製した（第１６ 図）。活性画分（第16ａ図）は、APPのＣ−末端に対するモノクローナル抗体を 使用するイムノブロットにより分析したとき（第16ｂ図）、11kDa，14kDaおよび 18kDaのAPPのＣ−末端を形成する能力を示した。最小の生成物は組換えＣ−100 標準と共移動した。抗ベータ−アミロイドモノクローナル抗体を使用する活性画 分中のAPP分解の再アッセイは、同一の３つの生成物のバンドの検出に導いた（ 第16ｂ図）。抗体C286.8Aは、実施例６（iii）におけるように、ベータ−アミロ イドのペプチドの最初の７アミノ酸残基を認識するので、この実験はすべての３ つの生成物が全長のベータ−アミロイドを含有したことを示す。 これらの生成物のペプチドの１または２以上はアミロイドである か、あるいはベータ−アミロイド領域に対してＣ−末端のこれらのペプチドをさ らにプロセシングすることによってベータ−アミロイドを生ずることができるで あろう。したがって、これらの存在の形成に関係するセリンプロテアーゼはアミ ロイド−シスにおいてある役割を演ずることができるであろう。 前述の11，14および18kDaの生成物のバンドを形成した酵素活性はモノ−Ｑか ら広いピークとして溶離し、そして多分２以上のプロテアーゼの作用から生じた であろう。モノ−ＱカラムからのA280nm吸収性成分の回収に基づいて、プールＸ ，ＹおよびＺと呼ぶタンパク質分解活性の３つの異なるプローブをモノ−Ｑカラ ムから調製した（方法２、実施例１）。 スーパーデックス75上の各プールのクロマトグラフィーの間に空隙体積から、 見掛けMr＞75kDaと一致する、酵素活性回が収された（データは示されていない ）が、クロマトグラフィーの間の可能なタンパク質凝集を除外することができな い。プールＹはSDS−PAGEで分析したとき最も純粋なプールを表し、そしてほぼ1 00kDaのMrに主要な染色されたバンドを示した。プールＹをそれ以上の特性決定 のために選択した。プールＹによるAPPの加水分解のためのpH依存性はpH７〜９ の最適値を示し（第17ａ図）、そして酵素活性は塩化ナトリウム濃度を42mMを越 えて増加することによって徐々に阻害された（第17ｂ図）。酵素のインヒビター の感受性の研究（第18ａ図）により、それがセリンプロテアーゼであり、PMSFお よびアプロチニンにより阻害されるが、ペプスタチンＡ，Ｅ−64またはEDTAによ り影響を受けないことが確証された（第18ａ図）。セリンプロテアーゼインヒビ ターのベンズアミジンは酵素に対する作用をもたず、それがトリプシン様エンド プロテアーゼでありえないことを示唆した。この酵素は、Ｓ１サブサイトに中性 の疎水性残基を含有する基 質の切断に対する特異性をもつキモトリプシンの族である可能性が強い。 したがって、それ以上のインヒビターの研究（第18ｂ図）は、プールＹの活性 がキモトリプシンインヒビターII、アルファー２−抗プラスミンおよびTPCKによ り強く阻害されることを示した。弱い阻害は、また、キモスタチンおよびアルフ ァ−１−抗キモトリプシンで観察されたが、TLCKはまったく阻害しなかった。カ テプシンＧは他の研究者らによりAPPのプロセシングにおいてある役割を演ずる ことが示唆されたが、カテプシンＧに対するポリクローナル抗体を使用するプー ルＹプロテアーゼ画分のイムノブロット分析はこのセリンプロテアーゼを検出す ることができなかった。11，14および18kDaのＮ−末端の配列決定は切断部位を 同定し、そして既に進行している。 実施例11 治療的カテプシンＤインヒビターのデザイン この実施例はSchechterら、1967，Biochem．Biophys．Res．Comm．27：157の 名称を利用してペプチドの特異性を記載し、ここで切断容易な結合をフランキン グする基質中のアミノ酸を酵素により切断されるペプチド結合に関するそれらの 位置に従い番号をつける。切断容易な結合に対してＮ−末端のペプチド基質のア ミノ酸側鎖は切断容易な結合から増加する距離で連続的にＰ１〜Ｐｎと番号をつ ける。切断容易な結合に対してＣ−末端のペプチド基質のアミノ酸側鎖は連続的 にＰ１′〜Ｐｎ′と番号をつける。Ｐ１およびＰ１′アミノ酸側鎖は切断すべき ペプチド結合の形成に関係するアミノ酸に相当する。側鎖Ｐ１〜ＰｎおよびＰ１ ′〜Ｐｎ′は、それぞれ、酵素のサブサイトＳ１〜ＳｎおよびＳ１′〜Ｓｎ′の 対応する部位との特異的相互作用を形成することをもくろむ。Ｐ側鎖と対応する Ｓサブサイトとの間の相互作用はプロテアーゼ−基質複合体の安 定化のための結合エネルギーに寄与し、こうして相互作用に対する特異性を付与 する。 ペプチド模倣インヒビターの開発のために取ったアプローチは、実施例２およ び３のｎ−ダンシルペプチド基質のアッセイ、あるいは実施例８に記載するホロ −APP分解のアッセイを利用して、精製たカテプシンＤと組み合わせて、酵素学 的測定を行うことができる。 生体外のカテプシンＤによりタンパク質分解切断のために最適なペプチド長さ および配列の定量。配列Dns-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2 （配列識別番号：７）のドデカペプチドを使用して出発して、酵素加水分解の ための見掛けの反応速度論的パラメーターへのＮ−末端またはＣ−末端からのペ プチドの短縮の効果を酸性のpHおよび最適なイオン強度で決定する。最適な長さ のペプチド中の各位置におけるアミノ酸の変動の加水分解のKmおよびVmaxへの効 果を決定する。 インヒビターの合成。最適な切断に必要な必須アミノ酸配列（上の１ａ，ｂから ）、および適当なスペーサーを含有するペプチド模倣化合物を合成する。これら のペプチド中のアミノ酸配列はAPP基質中の切断部位付近に観察されるもの、例 えば、Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp（配列識別番号：４）およびTrp-His-S er-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser（配列識別番号：５）と同一であるか、あるいはカテプ シンＤの生体外の阻害についてのそれらの効能の研究に基づいてカテプシンＤに 対する最適な結合を付与することが発見されたものから選択することができるで あろう。Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp（配列識別番号：４）およびTrp-His -Ser-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser（配列識別番号：５）の場合において、Ｐ１およびＰ １′は、それぞれ、Ｅ−ＶおよびＦ−Ｇである。 上の配列または最適なカテプシンＤ阻害を示す配列（Ｎ−および／またはＣ− 置換を含有する、より短い変異型を包含する）を含有するペプチドインヒビター を合成し、ここでＰ１およびＰ１′の間のペプチド結合のCO−NH−原子は次の標 準のスペーサーの群により置換されておりそして適当な合成ルートを使用してそ れらの任意の可能な立体化学的立体配置を得る；還元されたアミド、ヒドロキシ 同配体、ケトン同配体、ジヒドロキシ同配体、スタチン類似体、ホスホネートま たはホスホンアミド、逆アミド。これらのインヒビターの大部分はトランジショ ン状態の類似体として機能するであろう。 本発明の生体外アッセイ（Ｎ−ダンシル−ペプチドアッセイまたはホロ−APP 分解アッセイ）のいずれかを使用して決定されたこれらの第１世代の化合物の効 能は、次のいずれかまたはすべてにより最適化することができるであろう： （ｉ）フランキングアミノ酸残基の付加または欠失； （ii）インヒビター中の各位置におけるアミノ酸側鎖の型（ＤまたはＬ）の変 更； （iii）ブロッキング基、例えば、Bocまたはアセチル（Ｎ−末端）、またはＯ −Me、Ｏ−ベンジル、Ｎ−ベンジル（Ｃ−末端）を使用するＮ−またはＣ−末端 の置換。 上の方法に従い合理的に開発されたインヒビターの外に、他の既知のカテプシ ンＤインヒビターの全体または一部分をアルツハイマー病のための治療的インヒ ビターとして、あるいはインヒビターの効能の最適化およびアルツハイマー病の 治療のために新しい誘導体の開発のための出発点として使用できるであろう。こ のようなインヒビターは次のものを包含する：１−デオキシノジリミシン（Lema nskyら、1984，J．Biol．Chem．259：10129）；ジアゾアセチル−ノ ルロイシンメチルエステル（Keilovaら、1970，Febs Lett．９：348）；Gly-Glu -Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu（配列識別番号：６）（Gubenseckら、1976，Feb s Lett．71：42）：カイチュウ属（Ascaris）からのペプシンインヒビター（Kei lovaら、1972，Biochim．Biophys．Acta．284：461）；ペプスタチン（Yamamoto ら、1978，European Journal of Biochemistry，92：499）。 実施例12 培養において維持されたヒト胎児の腎（HEK）293細胞によるAPPC−末 端の断片の形成へのペプスタチンＡ、カテプシンＤのインヒビターの作用 次の実施例は、生体外のカテプシンＤによりAPP695から形成されることが示さ れたもの（実施例９）と同一の大きさ（15kDa）のAPPのＣ−末端断片を形成しそ して組織培養培地の中に解放するHEK293細胞の能力を、ペプスタチンＡ、カテプ シンＤ活性が生体外で阻害することを示す。HEK細胞はトランスフェクションさ れたAPP695からベータ−アミロイドを解放することが知られており、それゆえア ミロイド発生APPプロセシングに必要なプロテアーゼを含有する〔C．Haassら、1 992，Nature，359：322〕。したがって、これらの細胞はベータ−アミロイド形 成の研究のための許容された細胞モデルを提供する。これらの細胞の中に存在す るAPP751/770の内因性レベルは下に概説する研究のための基質として働いた。わ れわれは400mlの懸濁培養においてHEK293細胞を成長させた。いくつかの培養物 は、DMSO溶媒単独（0.01％ｖ／ｖ最終）を含有したか、あるいはDMSO＋10μＭ最 終のペプスタチンＡを含有した。第19ａ図から明らかなように、DMSOまたはDMSO ＋ペプスタチンのいずれも、使用したこれらの物質の濃度においてHEK293細胞の 成長速度に悪影響を及ぼさなかった。DMSOまたはDMSO＋ペプスタチンＡで処理し た細胞から後期対数期に取った培地のアリコート（185ml）を、推奨される手順 〔Axen R．ら、1967，Nature，214：1302〕によりCNBr活性化セファローズ４Ｂ （ファーマシア）を使用してセファローズ４Ｂ上に固定化したモノクローナルC2 86.8A（実施例６）の同一大きさのカラム（1.5×５cm）の上に通した。負荷の前 に、カラムを500mMのNaClを含有する100mMの重炭酸ナトリウム緩衝液pH8.3で平 衡化した。HEK293細胞により組織培養培地の中に解放されたAPP断片を含有する ベータ−アミロイドは固定化モノクローナル抗体に結合し、そして引き続いて0. 025％ｖ／ｖのトリトンＸ−100を含有する100mMのグリシンpH2.4で洗浄すること によって１ml／分でカラムから溶離された。溶離された画分（４ml）を実施例８ のイムノブロット手順にかけて、カラムに結合しそして引き続いてカラムから溶 離されたAPP断片を検出した。イムノブロット検出は実施例６方法ｉ）の抗Ｃ− 末端抗体を使用して実施した。この手順により検出された画分はベータ−アミロ イドのＮ−末端のペプタペプチド配列（固定化C286.8Aへの結合を説明するため に）ならびにＣ−末端ドメインまたはその一部分（抗Ｃ−末端抗体との反応性を 説明するために）を含有しなくてはならないであろう。 第19ｂ図は、DMSOのみまたはDMSO＋ペプスタチンＡの存在下に成長させた細胞 からの培地を負荷した固定化C286.8Aのカラムからの溶離画分の中に回収された Ｃ−末端断片の量を比較する。クロマトグラフィーを平行に同一条件下に実施し た。理解できるように、ペプスタチンＡを使用する処理はイムノブロットにより 検出できる溶離された15〜16kDaのAPP誘導断片の量を有意に減少した。この断片 はＮ−末端配列Ｇ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ Ｐ−Ａ−（表５および第23図）をもつカテ プシンＤにより生体外で形成された断片と同一大きさであり、そしてベータ−ア ミロイドのある形態に相当するＮ−末端をもつ同様な5.6kDaの断片の細胞の形成 における中間体を表すこ とができるであろう。生体外でカテプシンＤにより形成される他のAPP断片はこ の実験において検出されなかった。検出されなかった断片は、検出限界より下に 存在したか、あるいは他のプロテアーゼにより細胞中でさらに分解した可能性が ある。この実験が示すように、HEK293細胞。すなわち、細胞のアミロイド形成の 特徴を示す許容される細胞系は、カテプシンＤにより生体外で形成されたAPP695 断片に類似する少なくとも１つのAPP断片を作りかつ解放し、そしてこの断片の 形成は無毒の投与量のカテプシンＤインヒビターにより阻害される。こうして、 カテプシンＤのペプチドに基づくインヒビターは細胞のAPPのプロセシングを変 更するとき実用性を有する。 実施例13：阻害の研究 カテプシンＤによるＮ−ダンシル−ISEVKMDAEFR−NH2の生体外加水分解を使用 して、レニンおよびHIV−プロテアーゼインヒビターのプログラムから選択され た250のペプチド化合物を、ヒトカテプシンＤを阻害するそれらの能力について スクリーニングした。これらのうちで、下表６において同定された化合物は効力 のあるカテプシンＤ阻害の効能を示した。 表６に記載する番号に対応するインヒビターの構造を下表７に表 す： ここにおけるすべての式において、略号BOCはｔ−ブトキシカルボニルを表す 。 以上のインヒビターは次のようにして製造することができる：インヒビター１ ，２，３，４，５，10および20はドイツ国特許出願（DE）第4,215,874号、1992 年５月14日出願（これは米国特許出願第08 /059,488号、1993年５月10日出願に相当する）に記載されている。これらの出願 の両方をここに引用によって加える。インヒビターは抗ウイルス剤、ことにHIV プロテアーゼインヒビターであると開示されている。インヒビター１は次のよう にして製造した： 第１工程：10mlの無水ジクロロメタン中の614mg（2.20mmol）の（２Ｒ）−Ｎ −（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−アミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン −２−イル）〕酢酸（欧州特許（EP）第412 350号）および337mg（2.20mmol）の １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）の撹拌した０℃に冷却した溶液を43 4mg（2.10mmol）のジシクロヘキシルカーボジイミド（DDC）で処理し、そしてこ の混合物を５分間撹拌する。次いで、10mlのジクロロメタン中の1.10ｇ（2.20mm ol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−〔５−アミノ−６−シクロヘキシル ４ ヒドロキシ−２−（１−メチル）エチル−ヘキサノイル〕｝−Ｓ−イソロイ シニル−２−ピリジルメチルアミド二塩酸塩（欧州特許（EP）第437 729号）お よび0.88ml（8.0mmol）のＮ−メチルモルホリンの溶液を滴々添加する。冷却浴 を除去し、そして反応混合物を室温において２時間撹拌する。反応の終わりを薄 層クロマトグラフィーにより決定する。生ずる尿素を濾過により除去し、濾液を 真空濃縮し、そして粗組成物を90ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタン95： ５）のクロマトグラフィーにより精製する。1.29ｇ（理論値の88％）の化合物： が淡い粉末として得られる。 第２工程：17mlの無水ジオキサン中の塩化水素ガスの４Ｎ溶液中の2.41ｇ（3. 28mmol）の上の化合物21の溶液を０℃において30分間する。次いで15mlのトルエ ンを添加し、そしてこの混合物を真空濃縮する。この方法をさらに２回反復し、 次いで残留物をエーテルで粉砕し、吸引濾過し、そして高真空下に水酸化カリウ ム（KOII）の存在下に乾燥すると、2.29ｇ（理論値の98％）の化合物： が無色の粉末として得られる。 第３工程：20mlの無水ジクロロメタン中の0.80ｇ（2.40mmol）の（２Ｓ）−３ −ｔ−ブトキシカルボニル−２−（１−ナフチルメチル）−プロピオン酸（H．B uhlmayerら、1988，J．Med．Chem．31：1839に従い製造した）および0.40ｇ（2. 64ｇ（2.64mmol）のHOBTの撹拌し、０℃に冷却した溶液を0.52ｇ（2.52mmol）の DCCで処理し、そして５分間撹拌する。次いで30mlのジクロロメタン中の1.55ｇ （2.19mmol）の上の化合物22および0.96ml（8.74mmol）のＮ−メチルモルホリン の溶液を滴々添加し、そして反応混合物を室温において２時間撹拌する。生ずる 尿素を濾過により除去し、濾液を真空濃縮し、そして粗生成物を、必要に応じて 、360ｇのシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール95：５）のクロマトグラフ ィーにより精製すると、586mg（理論値の28％）の非極性（２Ｒ）異性体が無色 の粉末としておよび690mg（33％）の極性（２Ｓ）一異性体がまた無色の粉末と して得られる。 インヒビター２，３，４，10および20は同様に適当な酸を適当なアミン塩酸塩 （これらは既知であるか、あるいは普通の手段により製造することができる）と カップリングすることによって製造することができる。インヒビター３および20 の集合において、式： を有する化合物から出発することが必要であろう。化合物23の製造は化合物21の それに類似するが、249mg（0.89mmol）の（２Ｒ）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボ ニル）−２−アミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン−２−イル）〕酢酸（欧 州特許（EP）第412 350号）および440mg（0.81mmol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ ，５Ｓ）−〔５−アミノ−６−シクロヘキシル−４−ヒドロキシ−２−（２−プ ロペニル）−ヘキサノイル〕｝−Ｓ−イソロイシニル−２−ピリジルメチルアミ ド二塩酸塩（欧州特許（EP）第437 729号）から出発し、そして粗生成物を24ｇ のシリカゲル（ジクロロメタン：メタノール９：１）のクロマトグラフィーによ り、553mg（93％）の化合物23が淡い粉末として得られる。次いでアミン塩酸塩 の製造は化合物22に類似するが、560mg（0.91mmol）の化合物23から出発する 。452mg（91％）のアミン塩酸塩が無色の粉末として得られる。 インヒビター10は式： の出発物質を必要とするであろう。化合物24の製造は化合物21のそれに類似する が、258mg（0.92mmol）の（２Ｒ）−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−ア ミノ−２−〔２−（１，３−ジチオラン−２−イル）〕酢酸（欧州特許（EP）第 412 350号）および500mg（0.84mmol）の１−｛（２Ｒ，Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−〔５ −アミノ−６−シクロヘキシル−４−ビドロキシ−２−（２−フェニル）−ヘキ サノイル〕｝−Ｓ−イソロイシニル−２−ピリジルメチルアミド二塩酸塩（欧州 特許（EP）第437 729号）から出発し、そして粗生成物を20ｇのシリカゲル（ジ クロロメタン：メタノール９：１）のクロマトグラフィーにより、593mg（90％ ）の化合物24が非晶質粉末として得られる。次いでアミン塩酸塩の製造は化合物 22に類似するが、589mg（0.75mmol）の化合物23から出発する。484mgのアミン塩 酸塩が無色の粉末として得られる。 インヒビター７は公開された欧州特許出願（EP）第0 472 077号（これは1992 年２月26日に公開され、そしてその内容全体をここに引用によって加える）から 知られている。このインヒビターはその 中にHIVプロテアーゼ活性をもつインヒビターとして開示されている。 インヒビター８は公開された欧州特許出願（EP）第0 441 912号（これは1991 年８月14日に公開され、そしてその内容全体をここに引用によって加える）から 知られている。このインヒビターはそのレニンのインヒビターとして開示されて いる。 インヒビター９，15，16および19は公開された欧州特許出願（EP）第0 472 07 8号（これは1992年２月26日に公開され、そして1992年９月15日に発行された米 国特許第5,147,865号に等しい）から知られている。両方の刊行物の内容全体を ここに引用によって加える。これらのインヒビターはその中にHIVプロテアーゼ 活性をもつインヒビターとして開示されている。 インヒビター11および12はドイツ国特許出願（DE）第41 26 485号（これは199 1年８月10日に出願され、そして1992年７月24日に出願された米国特許出願第07/ 920,216号に対応する）に記載されている。３件の刊行物の開示全体をここに引 用によって加える。これらのインヒビターはその中にHIVプロテアーゼ活性をも つインヒビターとして開示されている。これらのインヒビターの両方は次のよう にして製造することができる： 第一ステップ 無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、5 .00ｇ（20.21mmol）の（Ｓ）−２−（tert−ブトキシカルボニルアミノ−１−フ ェニルブテ−３−エン〔J．R．Lulyら、J．Org．Chem．52巻、1487頁、1987年〕 を溶解した溶液を、室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し、得られ た混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留物を少量 のエーテルと共に研和（trituate）し、吸引して濾別し、高真空下KOHで乾燥し て、下記化合物3.69ｇ（理論量の99％）を無色の結晶 として得る。 第二ステップ 無水ジクロロメタン40mlに、Ｎ−（tert−ブトキシカルボニル ）−Ｌ−バリン4.81ｇ（22.13 mmol）とHOBT3.29ｇ（24.35mmol）を溶解し攪拌 して得た溶液を０℃まで冷却し、次いでDDC5.29ｇ（25.65mmol）で処理し５分間 撹拌する。次に、ジクロロエタン30mlに、3.70ｇ（20.12mmol）の化合物25と8.8 5ｇ（80.48mmol）のＮ−メチルモルホリンを溶解して得た溶液を滴下して加える 。冷却浴を外し反応混合物を室温で２時間撹拌する。反応が終了したことは薄層 クロマトグラフィーで測定した。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃 縮し、次いでその粗生成物をシリカゲル450ｇ（ジクロロメタン：メタノール95 ：５）によって精製して下記化合物6.07ｇ（理論量の87％）を無色泡状物として 得る。 第三ステップ 無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、6 .08ｇ（17.53mmol）の化合物26を溶解して得た溶液を室温で30分間撹拌する。次 にトルエン15mlを添加し、得られた混合 物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留物を少量のエー テルで研和し、吸引して濾別し、高真空下KOHで乾燥して、下記化合物4.90ｇ（ 理論量の99％）を無色粉末として得る。 第四ステップ 1.50ｇ（4.47mmol）の（２Ｓ）−３−tert−ブチルスルホニル −２−（１−ナフチルメチル）−プロピオン酸〔H．B って製造した〕と0.66ｇ（4.92mmol）のHOBTを、15mlの無水ジクロロメタンに溶 解し撹拌して得た溶液を０℃まで冷却し、次いでDCC0.97ｇ（4.69mmol）で処理 し５分間撹拌する。次に、1.15ｇ（4.07mmol）の化合物27と1.80ml（16.27mmol ）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン10mlに溶解した溶液を滴下して加え 、反応混合物を室温で１時間撹拌する。生成した尿素を濾過して除き、濾液を減 圧で濃縮し、次いでその粗生成物を、シリカゲル270ｇのクロマトグラフィー（ ジクロロメタン：メタノール95：５）で精製して下記の化合物2.01ｇ（理論量の 88％）を無色泡状物として得る。 第五ステップ ジクロロメタン中に化合物28を加え撹拌して得た懸濁液を０℃ まで冷却し、次いで２当量のｍ−クロロ過安息香酸（MCPBA）（80％濃度）で処 理し、上記温度で２時間撹拌する。さらに１当量のMCPBAを添加し次いでその混 合物をさらに１時間室温で撹拌する。次に酢酸エチルを添加しその反応混合物を 10％Na2SO3溶液のに加えて撹拌する。有機層を分取し、NaHCO3溶液で３回洗浄し 次いでMgSO4で乾燥する。溶媒を減圧蒸発させた後、残留物を少量のエーテル／ ペンタンと共に研和（trituate）して下記の化合物を無色の粉末として得る。 第六ステップ 化合物29、および（２Ｓ）−２−（トリフルオロメチル）−ピ ロリジン〔G．V．Shustovら、Isvest．Akad．Nauk． SSSR，1422，1987年（英文）参照〕（インヒビター11を製造する場合）または（ ２Ｓ）−２−（トリフルオロメチル）−ピペリジン（インヒビター13を製造する 場合）をｎ−プロパノールに溶解した溶液を、高温下圧力容器内で撹拌する。反 応混合物を冷却した後、減圧で濃縮し次にシリカゲルのクロマトグラフィーにか ける。ｎ−ペンテンと共に研和したした後インヒビターを得る。 インヒビター５と６は前掲のヨーロッパ特許第0441912号の一般教示事項に入 っており、この特許に教示されている製造図式にしたがって製造することができ る。したがってインヒビター５は下記のようにして製造することができる。 第一ステップ Ｌ−フェニルアラニン300ｇ（1.91mol）を、ジオキサン360ml および水360mlの混合物中に懸濁させる。ジ−tertブチルジカーボネート432.9ｇ （1.98mol）を撹拌しながらpH9.8で添加する。このpHは約975mlの４Ｎ NaOHで一 定に維持する。16時間後、反応混合物をエーテルで抽出し、その水性層を、クエ ン酸を用いてpHを３〜４に調節し、次いでエーテルで２回および酢酸エチルで２ 回洗浄する。有機相を合し次に水で３回洗浄する。ロータリーエバポレーターで 濃縮し次いでジエチルエーテル／ヘキサンから結晶化させて下記の化合物291.6 ｇ（60.7％収率）を得る。 第二ステップ 265ｇ（1.0mol）の化合物30を２Ｌのメタノールに溶解し、20 ｇの５％Rh／Ｃで40気圧下５時間水素化する。触媒を 吸引しながらセライトで濾別し、メタノールで洗浄し、得られた溶液を濃縮する 。下記の化合物271ｇ（100％収率）が得られる。 第三ステップ 163.0ｇ（0.601mol）の化合物31と40.3ｇ（0.661mol）のＮ， Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンを２Ｌの塩化メチレン室温で溶解する。０℃で 、303.5ｇ（3.005mol）のトリエチルアミンを滴下して加える（pHは約８）。塩 化メチレンにnPPaを溶解した50％濃度の溶液390.65ml（0.601mol）を最高−10℃ で滴下して加える。得られた混合物を一夜25℃まで昇温させ、16時間撹拌する。 その反応混合物を濃縮し、残留物に飽和重炭酸塩溶液500mlを加え、次いでその 混合物を25℃で20分間撹拌する。酢酸エチルで３回抽出した後、有機相をNa2SO4 で乾燥し次いで濃縮する〔粗収量：178ｇ（94.6％）〕。この粗物質をシリカゲ ルのクロマトグラフィ（移動相系CH2Cl2：CH3OH 98：２）に付して下記の化合物 36.6ｇを得る。 第四ステップ 窒素雰囲気下、炎をあてて乾燥した装置内で、63 .7ｇ（0.21mol）の化合物32をアルミナで処理したエーテル1.5Ｌに溶解し、０℃ でLiAlH4 10ｇ（0.263mol）を少しづつ添加し、次にその混合物を０℃で20分間 撹拌する。次に50ｇ（0.367mol）のKHSO4の水（１Ｌ）溶液を０℃で注意深く滴 下して加える。相分離が起こり、水性相をジエチルエーテル300mlづつで３回抽 出し、次いで合した有機相を、３Ｎ HClで３回、NaHCO3溶液で３回次にNaCl溶 液で２回洗浄する。有機相をNa2SO4で乾燥し濃縮する。下記の化合物45ｇ（84.1 ％収率）を回収した。 この化合物33は直ちに処理するかまたは１〜２時間−24℃で貯蔵する。 第五ステップ 14.6ｇ（35mmol）の“インスタントイリド（instant ylide） ”（Fluka 69500）を、90mlの無水テトラヒドロフラン中に懸濁させる。氷中で 冷却しながら20℃〜25℃の反応温度で、無テトラヒドロフラン45mlに9.0ｇ（35m mol）の化合物33を溶解した溶液を滴下して加える。その反応混合物を15分間撹 拌し、氷250ml中に注入し、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン３：１ 150mlづつを用い て２回抽出する。Na2SO4で乾燥し濃縮した後、残留物をシリカゲルのクロマトグ ラフィー（移動相エーテル：ヘキサン７：３）に付して下記の化合物3.2ｇ（40. 0％収率）が得られる。 第六ステップ 202.4ｇ（0.8mol）の化合物34を1000mlのメシチレンに溶解し 、水トラップを用いて140℃まで加熱する。この温度で、197ｇ（1.6mol）のＮ− ベンジルヒドロキシルアミンと1.6molのアセトアルデヒドのメシチレン800ml中 混合物を２時間かけて滴下して加える。４時間と８時間の反応時間が経過した後 、メシチレン中、同じ量のＮ−ベンジルヒドロキシルアミンとエチルアルデヒド を滴下する。全反応時間の16時間が経過した後、混合物を濃縮し、残留物にジエ ーテルを添加し、得られた混合物を１ＭのKHSO4溶液で洗浄する。Na2SO4で乾燥 し濃縮した後、残留物をシリカゲルのクロマトグラフィー（移動相エーテル：ヘ キサン３：７）にかける。下記の化合物が得られる。 第七ステップ 18.1ｇ（45mmol）の化合物35（ジアステレオマー Ｃ）をメタノール300mlに溶解する。14.2ｇ（225mmol）のギ酸アンモニウムを添 加した後、装置をN2で充分にフラッシュし次いで3.6ｇのパラジウム／炭（10％ ）を添加する。得られた混合物を還流しながら３時間撹拌する。冷却し、続いて 濾過によって触媒を除き、溶液を濃縮し、酢酸エチルに溶解し、次いで飽和重炭 酸塩溶液で２回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、 次いで高真空度下で乾燥する。下記の化合物11.36ｇが得られる。 第八ステップ 6.6ｇ（21mmol）の化合物36を塩化メチレン500mlに溶解する。 水分を遮断して（CaCl2管）、無水ペンタン酸〔塩化メチレン50ml中の、2.16ｇ （21mmol）のペンタン酸と2.16ｇ（10.5mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミ ドとで製造し濾過して得られる〕を塩化メチレンに溶解した溶液を室温で添加す る。３時間後、濃縮を行い続いて酢酸エチル中に投入し、飽和重炭酸塩溶液で洗 浄し次いで硫酸ナトリウムで乾燥する。濾過し濃縮し、次いで高真空下で乾燥す る。8.0ｇ（理論量の95.2％）の下記の化合物が得られる。 第九ステップ 7.57ｇ（19mmol）の化合物37を、４Ｎ塩酸／ジオキサン70ml中 で、水分を遮断して30分間撹拌する。得られた溶液を濃縮しジエチルエーテルと 混合し次いで蒸発乾固する。高真空下で乾燥した後、生成した塩酸塩5.54ｇ（16 .5mmol）、HOBT 4.46ｇ（33mmol）およびBoc-Val-OH 16.5mmolを塩化メチレン50 0mlに溶解する。０℃まで冷却した後、Ｎ−メチルモルホリンを用いてpHを8.5に 調節し、次いで3.57ｇ（17.3mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加す る。20℃で16時間経過後、尿素を濾別し、溶液を濃縮し、酢酸エチルに投入し、 次いで飽和重炭酸塩溶液で洗浄する。酢酸ナトリウムで乾燥し、続いて濃縮し高 真空度下で乾燥する。下記の化合物が得られる。 第十ステップ 1.8mmolの化合物38を11mlの４Ｎ塩酸／ジオキサン中で30分間 撹拌する。得られた溶液を濃縮し、ジエチルエーテル と混合し次いで蒸発乾固する。高真空度下で乾燥した後、生成した塩酸塩1.8mmo lを塩化メチレン50mlに溶解し、０℃まで冷却する。BOC−フェニルアラニン1.8m molを添加した後、トリエチルアミンでpHを約８に調節し、次に875.2mg（1.98mm ol）のベンゾトリアゾリルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘ キサフルオロホスフェートを添加する。室温で16時間反応させ、続いて濃縮し、 酢酸エチル中に投入し次に飽和重炭酸塩溶液で３回洗浄する。インヒビター５が 粗製形態で得られ次いでシリカゲルのクロマトグラフィーにかける。 インヒビター６は、第八ステップにおいて、無水３−メチルペンタン酸〔塩化 メチレン50ml中、21mmolの３−メチルペンタン酸と2.16ｇ（10.5mmo1）のジシク ロヘキシルカルボジイミドとで製造し濾過して得られる〕を塩化メチレンに溶解 した溶液を使用することを除いて、インヒビター５と類似の方法で得られる。 インヒビター17は前掲のヨーロッパ特許第0472077号の一般教示事項に入って おり、この特許に教示されている製造図式にしたがって製造することができる。 したがってインヒビター17は下記のようにして製造できる。 第一ステップ 無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、5 .07ｇ（20.00mmol）の（Ｓ）−２−（tert−ブトキシカルボニルアミノ−１−シ クロヘキシルブテ−３−エン〔J．R．Lulyら、J．Org．Chem.,52巻、1487頁、19 87年〕を溶解して得た溶液を室温で30分間撹拌する。次にトルエン15mlを添加し 、得られた混合物を減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次いで残留 物を少量のエーテルで研和し、吸引濾別し、次いで高真空度下KOHで乾燥する。 下記の化合物3.76ｇ（理論量の99％）が無色の結晶として得られる。 第二ステップ 4.63ｇ（21.3mol）のＮ−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ −バリンと3.29ｇ（24.35mmol）のHOBTとを40mlの無水ジクロロメタンに溶解し た溶液を攪拌し０℃まで冷却し、次いで5.29ｇ（25.65mmol）のDDCで処理し、次 いでその混合物を５分間撹拌する。3.60ｇ（19.00mmol）の化合物39および8.85m l（80.48mmol）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン30mlに溶解した溶液を 滴下して加える。冷却浴を外し、反応混合物を室温で２時間撹拌する。反応の完 了は薄層クロマトグラフィーで測定する。生成した尿素を濾過して除き、濾液を 減圧で濃縮し、次いで粗生成物を450ｇのシリカゲル（ジクロロメタン／メタノ ール95：５）のクロマトグラフィーで精製する。4.33ｇ（理論量の65％）の下記 化合物が無色の結晶として得られる。 第三ステップ 無水ジオキサンに気体塩化水素を溶解した４Ｎ溶液100mlに、4 .32ｇ（12.30mmol）の化合物40を溶解した溶液を室温で30分間撹拌する。次にト ルエン15mlを添加し、得られた混合物を 減圧で濃縮する。この工程をさらに２回繰返し、次に残留物を少量のエーテルで 研和し、吸引濾別を行い高真空度下KOHで乾燥する。3.37ｇ（理論の95％）の下 記の化合物が無色の粉末として得られる。 第四ステップ 4.47mmolのBoc−Ｌ−シクロヘキシルアラニン〔M．C．Khosla ら、J．Med．Chem.,15巻、792頁、1972年〕と0.66ｇ（4.92mmol）のHOBTとを無 水ジクロロメタン15mlに懸濁させて撹拌し０℃に冷却し、次いで0.97ｇ（4.69mm ol）のDCCで処理し得られた混合物を５分間撹拌する。次に、4.07mmolの化合物4 1と1.80ml（16.27mmol）のＮ−メチルモルホリンをジクロロメタン10mlに溶解し た溶液を滴下して加え、次いでその反応混合物を室温で１時間撹拌する。生成し た尿素を濾過して除き、濾液を減圧で濃縮し、次にその粗生成物を270ｇのシリ カゲル（ジクロロメタン：メタノール95：５）のクロマトグラフィーにかける。 下記化合物が得られる。 第五ステップ 0.60mmolの化合物42をジクロロメタン３mlに入れ撹拌して調製 し０℃まで冷却した懸濁液を、２当量のｍ−クロロ過安息香酸（80％濃度）で少 しづつ処理し、得られた混合物を上記温度で２時間撹拌する。次いで、さらに１ 当量のｍ−クロロ過安息香酸を添加し、続いてその混合物を室温で１時間撹拌す る。酢酸エチル10mlを添加し、その反応混合物を20mlの10％濃度のNa2SO3の溶液 に入れて撹拌する。有機相を分取し、NaHCO3溶液10mlで３回洗浄し次いでMgSO4 で乾燥する。溶媒を減圧で蒸発させた後、残留物を少量のエーテル／ペンタンで 研和し、インヒビター17が得られる。 インヒビター14は、1991年７月24日に公開されかつ米国特許第5,145,951号（1 992年９月８日に発行された）に対応するヨーロッパ特許願公開第0437729号によ って公知である。これら両刊行物の全内容は本願に援用するものである。このイ ンヒビター14はこれら刊行物に、HIVプロテアーゼ活性のインヒビターとして開 示されている。 インヒビター18は、1990年12月27日に公開され、かつ1992年４月28に出願され 現在係属中の米国特許願第07/876,697号（1990年５月16日に出願されすでに放棄 された米国特許願第07/524,779号の継続出願である）に対応するヨーロッパ特許 願公開第0403828号によって公知である。これらの三つの出願の全開示事項は本 願に援用するものである。このインヒビター18はこれら出願に、HIVプロテアー ゼ活性のインビターとして開示されている。 本願の明細書と特許請求の範囲は例示のために記載されているので本発明を限 定せず、そして本発明の思想と範囲を逸脱することなく各種の改変と変更を行う ことができることは分かるであろう。具体的に述べると、上記出願に開示されて いる他のインヒビターも本願で述べているように有用である。本願の特許請求の 範囲にはこれ らの他の実施態様も含まれる。 配列表 一般情報 出願人：タンブリーニ，ポール ピー；ベンツ，ギュンター； ヘビッヒ，ディエター 発明の名称：カテプシンＤはアルツハイマー症でアミロイドを生 成するプロテアーゼである 配列の数：９ 通知送付先 受取人：Miles Inc． 住所：モーガン・レーン・400 都市名：ウェストヘーブン 州名：コネティカット 国名：米国 郵便番号(ZIP)：06516 コンピュータの読出し可能なフォーム 媒体の種類：ディスケット、3.50インチ、800Kb記憶 コンピュータ：Sharp PC 4600 オペレーティングシステム：MS−DOS ソフトウェア：Word Perfect 5.1 本件出願のデータ 出願番号：割り当てられていない 出願日： 分類：割り当てられていない。 原出願のデータ 出願番号：07/995,660 出願日：1992年12月16日 原出願のデータ 出願番号：07/880,914 出願日：1992年５月11日 弁護士／弁理士の情報 氏名：パメラ エイ シモントン 登録番号：31,060 名簿番号：MTI 224.2 通信の情報 電話番号：(203)937−2340 ファクシミリ番号：(203)937−2975 配列番号：１ 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：２ 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：３ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：７ 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 配列番号：８ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 刊行物の情報 著者：カングら 雑誌名：Nature 巻数：325 頁数：733 発行時：1987年 配列 配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列 Detailed Description of the Invention Cathepsin D is an amyloidogenic protease in Alzheimer's disease BACKGROUND OF THE INVENTION   This application is a continuation of a part of US Patent No. 07 / 880,914 filed May 11, 1992 19 This is a partial continuation of US Patent No. 07 / 995,660 filed December 16, 1992.   1) Industrial application fields   The present invention relates to Alzheimer's disease (hereinafter referred to as “AD”) beta amyloid protein A proteolytic enzyme with specificity for processing the precursor to the protein Method for determining; precursor-specific pro for beta-amyloid protein Methods for identifying inhibitors of thease; as well as beta-amyloid protein Inhibitors of proteases specific for the corresponding precursor, eg aspartate protea , Cathepsin D, and chymotrypsin-like serine protease A method for modulating the production of amyloid protein.   2) Description of related technology   This assay is a process that controls the rate of amyloidogenic peptide production in the brain of AD patients. Useful for identifying Rotase. Thus, they have such proteins Protease inhibitors that can be used to isolate as well as used as a therapy for AD Can also be used to identify Aspartic protease, amyloid precursor Main amyloid for processing body protein (hereinafter referred to as "APP") Suitability of the assay to identify cathepsin D as a denogenic protease The application will be described below. Can produce amyloid precursors to APP holoprotein A partial characterization of secondary serine proteases is provided.   AD is a brain progression that is usually characterized by progressive atrophy in the frontal, parietal and occipital cortex. It is a degenerative disease. Clinical manifestations of AD include progressive memory impairment, language and vision. Loss of spatial discernment, as well as behavioral deficits (McKhan et al. , 1986, Neuro logy, 34: 939). Global cognitive impairment is a neuronal cell found throughout the cerebral hemisphere (Price, 1986, Annu. Rev. Neurosci. 9: 489).   Pathologically, the primary salient features of the autopsy brain of AD patients are (1) Lesions consisting of neuronal neuronal traits, including accumulating strains; (2) cerebrovascular amylo Id deposits; and (3) neuritic plaques. Cerebrovascular amyloid (Wong et al. ， 1 985, PNAS, 82: 8729) and neuritic plaque (Masters et al. , 1985, PNAS, 82: 4249) Together with a unique peptide called simply "A4" or "beta amyloid" contains.   Beta amyloid is an insoluble, highly aggregated, small polypeptid with a relative molecular weight of 4,500. Tide, which consists of 39 to 42 amino acids. Some lines of evidence are AD lesions Support a role for beta amyloid in the etiology of. For example beta amyloid And related fragments are toxic to the PC-12 cell line (Yanker et al. , 1989, Science , 245: 417) and toxic to primary cultures of neurons (Yanker et al. , 1990 , Science, 250: 279), and on neuronal degeneration and rodents in the rodent brain. Cause a corresponding amnestic response in (Flood et al. , 1991, PNAS, 88:33 63; Kowall et al. , 1991, PNAS, 88: 7247). However The strongest evidence is co-segregation with some form of familial Alzheimer's disease (FAD) Amino acid substitution Obtained from a site within the holoamyloid precursor protein (hereinafter referred to as "APP") It N-terminal to the beta amyloid peptide sequence in APP (Mullant et al. ， 1 992, Nature Genetics, 1: 345) or C-terminal (Goate et al. , 1991, Nature, 349 : 704; Yoshioka et al. , 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 178: 1141 ； nur rell et al. , 1991, Science, 254: 97; and Chartier-Harlin et al. , 1991, Na ture, 353: 844). Causes FAD by altering the rate of Lloyd's internal proteolytic release (Mullan et al. And Chartier-Harline et al., Both above).   Kang et al. (1987, Nature, 325: 733) reportedly originated from large precursor proteins. And as part thereof, beta amyloid protein. This precursor Oligonucleotides selected from known beta amyloid sequences for identification To isolate a full-length complementary DNA clone encoding the protein I did the sequencing. The predicted precursor contained 695 this residue, which generally It is called "APP 695" (amyloid precursor protein 695).   As a result of subsequent cloning of the gene encoding the APP protein, The region was encoded on two adjacent exons (Lemaire et al. , 1989, Nuclei c Acids Res. , 17: 517), which is an alternatively spliced mR of A4 accumulation. Exclude possible consequences of direct expression of NA. This is because A4 accumulation is Caused by abnormal proteolytic degradation of APP at N- and C-terminal sites relative to the tide region Means that it must be attributed.   APP 695 is the most abundant form of APP found in the human brain, but other Exists in three forms, APP 714, APP 751 and APP 770 (Tanzi et al. ， 1 988, Nature, 351: 528; Ponte et al . , 1988, Nature, 331: 525; and Kitaguchi et al. , 1988, Nature, 331: 530) . Alternative splicing from a single APP whose heteromorphic form is located on human chromosome 21. (Goldgaber et al. , 1987, Science, 235: 877; and Tanzi et al. , 1987, Science, 235: 880).   APP 751 and APP 770 contain a 56 amino acid Kunitz inhibitor domain, which is a bovine Shares 40% homology with pancreatic trypsin inhibitor. Both of these forms of APP are It has a lotase inhibitory activity (Kitaguchi et al. , 1988, Nature, 311: 530; and S mith et al. , 1990, Science, 248: 1126), at least one of these forms Sora was previously identified as the protease Nexin 11 (Oltersdorf  et al. , 1989, Nature, 341: 144; Van Nostrand et al. , 1989, Nature, 341: 5 46).   Physiological role for amyloid precursor protein remains unconfirmed . It is a cell surface receptor (Kang et al. , 1987, Nature, 325: 733), Adhesion molecules (Schubert et al. , 1989, Neuron, 3: 689), growth or trophic factors (Saitoh et al. . , 1989, Cell, 58: 615: Araki et al. , 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 181: 265; and Milward et al. , 1992, Neuron, 9: 129), a regulator of wound healing (Va n Nostrand et al. , 1990, Science, 248: 745; and Smith et al. ， 1990 ， Scien ce, 248: 1126) or play a role in the cytoskeletal system (Refolo e t al. , 1991, J. Neuroscience, 11: 3888).   Numerous studies have investigated the role of altered APP expression in AD, but only However, the results were inconsistent (for example, review literature: Unterbeck et al. , 1990, Review of Biological Research in Aging, Wiley-Liss, Inc. , 4: 139).   Whether changes in the relative amount of heteromorphic APP are due to amyloid accumulation A study was also conducted to find out. The results of such studies are also misleading However, the relative expression level of the Kunitz domain containing APP in AD was Supported the conclusion that it will rise (Johnson et al. , 1990, Science, 248: 854) . Therefore, transgenic animals expressing elevated APP 751 are found in the cortex and hippocampus. It was found to show amyloid-reactive deposits (Quen et al. , 1991, Natur e, 352: 239).   The latest study shows that an APP fragment (approximately 100 Since it consists of amino acids, it will be referred to as "C-100 fragment" hereinafter) in vitro (Dyrks et al. al. , 1988, EMBO J. , 7: 949) and transfected cells (Wolf et al. , 1990 EMBO J. , 9: 2079; and Maruyama et al. , 1990, Nature, 347; 566) It was shown that the aggregation of C-10 in transfected P19 cells Overexpression of the 0 fragment was shown to cause cytotoxicity (Fuckuchi et al. , 19 92, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 182: 165).   Furthermore, a C-terminal fragment containing both beta amyloid and a C-terminal region is human. It has been shown to be present in the brain (Estus et al. , 1992, Science, 255: 726), Tiger Studies in transfected cell lines show that these fragments are endosomal-lysosomal. Suggest that it can be produced by the murine pathway (Golde et al. , 1992, Science, 255: 728 ).   Overall, the above reports show a single proteolytic cleavage of APP at the N-terminus of the A4 region. We suggest that sexual amputation is sufficient to cause the pathophysiological symptoms associated with AD. Cultures of primary cells and cell lines (including AD transfectants) It has the same N-terminus as the amino acid (1-42 amino acids) and probably contains full-length beta amyloid. Recent studies have shown that it secretes a 3-4 kDa peptide containing (Haas et al.  al. , 1992, Nature, 349: 322; and Shoji et al. , 1992, Science, 258: 126). Such peptides may also be used in cerebrospinal fluid (hereinafter "C") of AD and non-AD patients. "SF") (Scubert et al. , 1992, Nature, 359: 325; and S hoji et al. , 1992, ibid.).   APP is a site within the A4 region in the physiological pathway for secretion of the APP extracellular domain. But it is cut off (Esch et al. , 1990, Science, 248: 1122; and Wang et al. ， 1 991, J. Biol. Chem. , 266: 16960). This pathway works in several cell lines and is Cause A4, the destruction of the amyloid region of the precursor. Such a route is There is evidence that it also works in the human brain (Palmert et al. , 1989, Bioc hem. Biophys. Res. Comm. , 165: 182).   The enzyme involved in the normal non-pathological processing of APP is "secretase". being called. The C-terminal fragment resulting from the secretase action is the C-100 fragment (above). It is 17 amino acids smaller and is hereinafter referred to as the "physiological C-terminal fragment".   The net pathological accumulation of A4 is the relative activity of the pathological and physiological pathways of APP degradation. It is assumed to be controlled by sex.   Therefore, the following describes the accumulation of beta-amyloid in the brain of people suffering from AD: There are several possibilities like:   (1) Lack of secretase activity or level due to destruction of amyloidogenic region ;   (2) of APP that may become exposed to pathological pathway proteases Change of cell classification;   (3) increased levels of pathological proteases;   (4) Degradation fermentation that degrades amyloid as fast as it would otherwise be produced Lack of elementary level; or   (5) Pathological protein caused by mutation of APP amino acid sequence Increased sensitivity of APP to degradative degradation.   Little is known about the regulation of APP sorting in cells, as compared to others. Ku At least some changes in phosphorylation due to changes in protein kinase C activity are It causes a line change and finally causes a change in APP processing. The theory is growing (Buxbaum et al. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6 003). Therefore, therapies intended to alter cellular phosphorylation would be It caused both qualitative and quantitative changes in the pattern of the fragments.   Amyloidogenic APP processing is initially an endosomal-lysosomal event Was suggested (Golde et al. , 1992, Science, 255: 728; and C.I. Haas et  al. , 1992, Nature, 357: 500), but secretion in beta-amyloid formation Alternative to the processin, consistent with the participation of proteases in the pathway or at the plasma membrane. Secreted APP in a blocked form (Suebert et al. , 1993, Nature, 361: 260) There is current evidence that beta-amyloid is released by vegetative cells (C. Haas et al. , 1992, Nature, 359: 322; and Shoji et al. , 1992, Science, 258: 126 ). Transfection expressing APP 695 associated with Swedish FAD in recent years The activated cell line was 6-8 times faster in beta than the cells transfected with wild-type APP. It has been shown to release myloid-like fragments (Citron et al. , 1992, Nature, 360 : 672; and Cai et al. , 1993, Science, 259: 514; and 1992, Neuroscience L. ett. , 144: 42), but similar on the effects of the London (VI) mutation. Studies have shown no effect on amyloid release (Cai et al., Supra). Go In some cases, amyloid release by cultured cells was impaired by the APP precursor valine 594. Unusual form of beta amylo with N-terminus beginning with (numbering according to reference 1) Containing an id (C. Haas et al. , 1992, Nature, 359: 322; Busciglio et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90; 2092) means this Is unknown. The action of inhibitors affects beta-amyloid production in these systems. Overwhelmingly supports the participation of acidic cell compartments (Shoji et al. , 1992, Science, 2 58: 126; Busciglio et al. , Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2092; and Haas e. t al. , 1993, J. Biol. Chem. , 268: 3021), but this is a kind of cysteine or Suggests a lack of serine involvement (Shoji et al. , 1992, Science, 258: 126; Busc iglio et al. , Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2092; and Haas et al. 1993 , J. Biol. Chem. , 268: 3021).   Recently, Nitsch et al. (1992, Science, 258: 304) reported that some acetylcholine receptors Transfection of cell lines by body type and subsequent receptor activation is In the process concluded to be caused by changes in cytoplasmic kinase activity It has been shown to cause increased secretion and secretion. The role of phosphorylation changes In addition, this latter study suggests that in the cholinergic neuronal function characteristic of AD. We present a link between Lark's pathology and established agitation.   Notwithstanding the above observations, the equilibrium for any fundamental change in cell classification is To enable the design of selective and specific therapeutic agents that can be returned to Knowledge is inadequate.   Beta amyloid is produced by the direct action of protease (s). I have to do it. So-called “pathological” involved in C-100 or beta amyloid formation "Identification of brain protease (s) is intended to block amyloid accumulation. An essential step in the effort to develop the illustrated therapeutic protease inhibitors It To identify such enzymes, other brain proteolytic enzymes present in brain extracts were identified. Such a protease that specifically measures the activity of the protease in the presence of the enzyme Development of a specific assay for the activity of   Such an assay can then be used during protease purification during protease purification. Detect the enzyme. Finally, this assay was used to test the pharmaceutical screen for lead therapeutic compounds. It is possible to measure the action of potent inhibitors of enzymes as required for It   Several studies have purified and purified both secretase and rumor pathogenic proteases. And characteristic display were tried. Early studies mimicked an expected cleavage site within APP An assay featuring a synthetic peptide substrate was used. Such assays are Although useful for measuring in vitro activity of ases, they are Some proteases in a mixture of proteases as required to monitor It rarely has sufficient specificity to allow detection of Rotase. did Therefore, these peptidase assays do not provide the required protease specificity, Using such quantified peptidase activity, candidate APP from human brain tissue is also obtained. The purification of processing enzyme activity could not be followed successfully. Prior to the present disclosure, No credible candidate protease (s) has emerged for any of the steps No, and the results of various studies were inconsistent.   For example, a number of useful studies have shown that pathogenic proteases are of rhizosomal origin: (Cataldo et al. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3861; and Haas et  al. , 1992, Nature, 357: 500); calcium-dependent cathepsin G-like serine pro Thease or metal-dependent cysteine protease (Razzaboni et al. , 1992, Br ain Res. , 589: 207; and Abrahams et al. , 1991, Ao. N. Y. Acad. Sci. 640: 1 61); Calpain I (Siman et al. , 1990, J. Neuroscience, 10: 2400); Multi-touch Amphipathic protease (Ishiura et al. , 1989, FEBS. Lett. , 257: 388); Serimp Rotease (Nelson et al. , 1990, J. Biol. Chem. , 265: 3836); thrombin (Igarashi et al. , 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 185: 1000); Yes Cuttlefish-Peptic Dase (WIPO application WO92 / 07068 (Athena Neurosciences, Inc. )) There is.   Similar discrepancies have also arisen in the identification of secretases, whose claims are Shown: Metal-peptidase (McDcrmott et al. , 1991, Biochem. Biophys. Res ． Comm. , 179: 1148); acetyl corinase-related protease (Small et al. , 1991, Biochemistry, 30: 10795); Cathepsin B (Tagawa et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm. , 177: 377); or plasma membrane function with broad subsite specificity. Ren Protease (Sisodia, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6075; and Maruyama et al. , 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 179: 1670).   Past and present efforts to identify the nature of APP processing enzymes are generally What bears no success is the lack of specificity of the assay used, as well as brain tissue. It was due to a complex heterogeneity of proteases associated with. Summary of the invention   The present disclosure counters specific assays based on the proteolytic degradation of recombinant APP. Use of APP processing enzymes in combination with immunochemical detection of reaction products A method for identifying Tsukuba is described. The assay of the present invention is based on beta amyloid from APP. Brain with precise specificity and proper localization to play a role in the production of Identify the protease.   The assay format disclosed here allows for large samples with identified proteases. It processes reasonably and gives good sensitivity by immunochemical methods of detection. Further books Due to the simplicity of the assay, it can be easily routinely used by laboratory technicians and is consistently reproducible. Different results can occur. these And other improvements will be described below.   One object of the present invention is a method for finding agents that can be used to treat AD patients. Is to provide. As mentioned above, the 39-42 amino acid peptide beta amyloid Proteolytic degradation of APP to produce amyloid plaques This is the first step in the physical process. Several lines of evidence are found in AD brain Pointing to the causative role of beta amyloid and amyloid plaques in neurodegenerative features You These are shown below:   (I) Colocalization of plaque material and dystrophic neurites with degenerating neurons ( Price et al. , 1989, BioEssays, 10:69);   (Ii) Evidence that beta-amyloid may be toxic to neurons in culture ( Yankner et al. , 1990, Science, 250: 270);   (Iii) beta-amyloid is associated with neuronal degeneration in some animal models Evidence of altered memory when tested (Flood et al. , 1991, PNAS, 88: 3363 ; And Kowall et al. , 1991, PNAS, 88: 7247);   (Iv) Simultaneous segregation of certain forms of hereditary AD with point mutations in APP (C oate et al. , 1991, Nature, 349: 704; Yoshioka et al. , 1991, Biochem. Biop hys. Res. Comm. , 178: 1141; Chartier-Harlin et al. , 1991, Nature, 353: 844 Murrell et al. , 1991, Science, 254: 97; and Mullan et al. , 1992, Nature  Genetics, 1: 345).   Therefore, the proteolytic conversion of APP into beta amyloid is the etiology of AD. Is an essential step in, and appears to be an important target for, for example, therapeutic intervention . Identification of relevant protease activities, as well as development of appropriate in vitro sonoassays, Therefore in AD patients Therapeutic protease inhibition that can be used as a treatment to block amyloid plaque formation It is always necessary to develop a drug.   The present invention is useful for inventing inhibitors of proteolytic beta amyloid production. Two possible developments:   (1) Degradation of holo-APP substrate and highly purified protease or APP that degrades APP Containing any of the crude biological extracts containing potential unidentified proteases in v itro test; and   (2) Amyloid when used with the in vitro assay system described in (1) above Or a specific protector from human brain capable of purifying the pre-amyloid APP C-terminal fragment Identification and purification of ze.   This assay can detect in vitro APP degradation activity to produce C-terminal APP fragments. Noh. Involved in detection activity using this assay when used with crude biological extracts Purification of a protease that is capable of monitoring Can be displayed.   In addition, a crude biological extract containing purified protease or unidentified APP-degrading enzyme activity. When used with source, use this assay to co-incubate in the assay mixture. Inhibition of APP processing activity by a given chemical or biological compound can be measured. So Inhibitory compounds identified by this method are characteristic of in vivo amyloid plaque formation in patients with AD. It has a use as a therapeutic inhibitor of.   The protease identified by the above (2) includes aspartic acid protea , Cathepsin D, and cathepsin G, unlike N- [tosyl-L-phenyl] Lualanine-Chloromethyl Ketone (“TPCK”) and Alpha-2 Antiplus Chymotry inhibited by Min and chymotrypsin inhibitor from potato Examples include the pusin-like serine protease. Identification of cathepsin D is particularly significant It Cathepsin D is 10. 0kDa and 5. 6kDa size C-100 and We have demonstrated that and can generate beta-amyloid-like fragments.   Based on this discovery, the in vitro assay described in (1) above or the present invention has been described. Inhibitors of their activity using a simpler high-throughbut peptidase assay such as Any purified or isolated cathepsin D can be used to explore   Furthermore, the specificity of cathepsin D and specific inhibition of aspartic protease Many are known for drug design, so Of cathepsin D in Escherichia coli was confirmed using specific methods to identify specific cathepsin D inhibitors. It enables both development and use of established cathepsin D inhibitors.   Furthermore, cathepsin D is surprisingly Glu (593) -Val (594) (numbering is Shown below is the hydrolysis of APP with a peptide bond between Kang et al. (Supra). You The preferred specificity of cathepsin D is usually found between hydrophobic residues. This Information can be further used to design cathepsin D inhibitors.   As noted above, the inhibitor compounds identified thereby are associated with the in v characteristic of AD patients. ivo for use as a therapeutic inhibitor of amyloid plaque formation.   The APP degrading enzyme identified by the use of the present invention has been purified and used:   (I) Necessity to further correlate colocalization of proteases with AD brain pathology Develop epidemiological reagents; and   (Ii) The corresponding protease can be isolated. The cloned cDNA is then used to A transgenic animal model for AD capable of assessing the effects of thease overexpression To build.   APP degrading enzyme inhibitors identified by the use of the present invention may further include, for example, Affini Purification of APP-degrading enzyme by T-chromatography Is useful as a ligand in. The column is generally a hydrocarbon column if needed. Indirectly, via an pacer arm, an inert matrix with enzyme inhibitors attached. Wrap in a box, for example, agarose. Then the composition containing the enzyme is applied to the column, It is stopped by the inhibitor while all other proteins pass through and are discarded. Then change the properties of the enzyme and use a deformation buffer at pH that can no longer bind the inhibitor. Enzymes by elution or by the use of competitive counter-ligands to displace the inhibitor Is released from the column. In both cases, the enzyme is collected through the column, There are no other proteins at this point. More specifically, for example, T. Palme r, Understanding Enzymes, 1991, Ellis Horwood, New York, 3rd Edition The content of is included in this specification by reference). .   Assays incorporating synthetic peptide substrates are in vitro fermentations of highly purified protease preparations. Useful for elementary studies, but generally crude containing excess protease Insufficient to allow selective detection of desired protease activity in biological extracts Has specificity. For example, brain tissue has extensive and diverse peptide processing. It is also abundant in degradative enzymes, which means that specific brain Can explain why efforts to isolate APP-degrading proteases have failed (See background section above).   Therefore, in Example 3 below, by the synthetic peptide assay, under the specificity assay conditions. Of several peptidases that cannot cleave APP to produce a C-terminal fragment in Has been established, the pattern of APP-degrading proteases is brain peptidase at any point. It is shown that it is not similar to the corresponding pattern of.   A more limited approach to this problem is as a substrate for holo-APP And its specificity after incubation with protease-containing fractions It is a method of assessing static decomposition. To this end, the present invention is based on brain protease fractionation. Enzymatic degradation of recombinant APP with an immunoprotein using an antibody against the C-terminal region of APP. Describe the method as monitored by the supplier.   Our assay procedure is of sufficient size to include the full-length beta amyloid peptide. Focus on C-terminal fragment generation from APP (requires internal proteolysis) Process. N-terminal to the A4 region).   Homogenize human brain tissue (non-AD control or AD), then use conventional ultracentrifugation Soluble fraction (hereinafter “S”), pellet after 1,500 g (hereinafter “P-2”) and micro Sub-fractionation into some fraction (hereinafter "M"). Membrane M and P-2 fractions were added to Triton X-100 Solubilized in formulation. The resulting M and P-2, and soluble fractions from the S fraction The fractions are then separately chromatographed on a Mono-Q strong anion exchange column. And different brain proteases separate.   Using a synthetic peptide that mimics the amino acid sequence around the N-terminus of beta amyloid Of individual mono-Q fractions by purification from P, M, soluble and P-2 fractions Xe activity is assessed. Column separation based on recovery of separate peaks of peptidase activity. Make a continuous pool of drawings.   Purified from a transfected CHO cell line using a pool of peptidase activity Assay conditions for the detection of proteolytic degradation of highly purified recombinant APP Establish. Use antibodies directed to the APP C-terminal domain or beta amyloid region And develop an immunoplot assay that places the C-terminal APP fragment. Using this test, APP C-terminal fragment large enough to potentially contain long beta amyloid We identify six potentially different proteolytic activities that can produce Recovery of APP degradation activity between mono-Q pools was confirmed in step 2. Not found to correlate well with established peptidase activity profile . Inhibitor studies show that APP degradation activity is associated with serine and aspartic proteases. It was revealed that both activities were involved.   The use of peptidase assays to monitor enzyme purification has been abandoned. ing. A larger supply of recombinant APP is available in baculovirus specific insect cell lines. Was obtained by expression in E. coli and monitored for APP degradation activity during protein purification. Allows the use of APP degradation assay as the primary method for Main aspartic acid Protease activity is identified in the fraction from the Mono-Q purification of the P-2 fraction.   Further purification and characterization experiments demonstrate that the enzyme is cathepsin D . Cathepsin D is 5. Hydrolyze holo-APP, which produces a 6-kDa beta-amyloid-like fragment It has been shown to decompose.   Using aprotinin sepharose affinity chromatography, Attempts were made to isolate the aprotinin-sensitive APP degrading activity identified in. 11, 14 and 1 A chymotrypsin-like sequence capable of degrading APP to generate a specific C-terminal fragment of 8 kDa. The phosphoprotease activity is partially purified, which is a full-length probe by immunochemical means. It was shown to contain taamyloid.   This procedure is likely to play a role in the amyloidogenic degradation of APP We have identified several brain protease activities. Identification described herein Alternatively, each of the unidentified activities can be used in conjunction with the APP degradation assay to select for therapeutic value. Alternative protease inhibitors were screened.   As used herein, the term "APP substrate" refers to isolation from biological sources. Or obtained by purification, or APP or its analogs, and protein or its A fragment obtained by digesting a part of Expression of a gene encoding a part of the protein And a synthetic peptide having an amino acid sequence corresponding to a part of APP. Expression of a cloned gene encoding a fragment of any such protein It means a full-length APP, whether or not it can be obtained.   The APP substrate for the assay of the present invention is provided as a test reagent in various forms. A It is preferably derived from PP 695 or corresponds at least in part to its amino acid sequence. However, other APP isoforms (above) derivatives or analogues may also be used in the method of the invention. Intended to be used for. APP 695 is described in Schubert et al. (1989, Proc. Natl. Acad ． Scj. USA, 86: 2066), biochemical separation from natural sources or Is a purified DN or a recombinant DN encoding a protein or a functional part thereof. Expression of A clone (knops et al. , 1991, J. Biol. Chem. , 266: 7285; and Bhasi n et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10307).   APP protein fragments are associated with relevant proteolytic test sample activity (above) It includes a sequence of amino acids sufficient for recognition and cleavage by. APP from biological material Isolation is usually by chromatography, especially affinity chromatography. Purification by such conventional techniques. Use purified APP or its fragments to Ronal or polyclonal antibodies are prepared and then affixed by conventional techniques. It can be used for infinity purification. The resulting purified APP material is further processed, eg For example, it can be fragmented by chemical or enzymatic digestion. Related proteolysis test sump By screening for the desired susceptibility to the Identify useful fragments.   As mentioned above, the APP substrate is a recombinant DNA clone encoding APP or a part thereof. Can be prepared by expression of Cloned APP message May be natural or synthetic in itself, and the natural gene is based on a known amino acid sequence. Can be obtained from a cDNA or genomic library using modified denatured probes (Kang e t al. , 1987, Nature, 325: 733). Other methods for obtaining suitable recombinant DNA, As well as methods for expressing cloned genes will be apparent to those of skill in the art.   Various methods have been used to detect proteolytic cleavage of APP substrates in the presence of test samples. The convenient method of can be applied. Below are some of the more preferred methods at present: However, many steps are involved in this process without departing from the features of the present invention. Those skilled in the art will recognize that other methods of can be used. Generally, for this, AP Any method that can detect the occurrence of proteolytic cleavage of the P substrate can be used. This This means that cleavage is a mono-productive species, such as optically reactive substances, such as colored or fluorescent dyes. Proper design of the APP substrate to produce   Another main approach is to use one or more, such as by immunoassay. Includes further sensitive detection of cleavage products. Currently, such cleavage products Is preferably the C-terminal fragment of the APP substrate; however, the ink with the sample All fragments that appear during incubation are targets for detection.   Detection of one or more cleavage products characteristic of pathological proteolytic activity is Can be achieved in a number of ways. Those who are further demonstrated in the examples below One of the methods involves a procedure commonly known as Western blot. Typical Perform gel electrophoresis after incubating APP with test sample. Apply to separate the components and produce a reaction mixture. Next, the separated protein components are Transfer to a solid matrix such as a lulose membrane.   An antibody specific for the fragment characteristic of APP degradation was then immobilized on the membrane. It is detected by addition of secondary enzyme-labeled antibody conjugate. As a result The location of the bound conjugate is expressed with a chromogenic substrate for enzyme labeling.   A variety of immunoassay formats that can undergo generally useful test systems are available in APP Applicable to fragment detection. Typically, the APP substrate is inked with the test sample. And immobilize the resulting intact APP (eg, capture it on a solid phase). Or by incubating the test sample with the APP substrate in immobilized form. To start. The immobilized APP substrate is then reacted with an antibody reagent against a portion of the APP substrate. And detect proteolytic cleavage and cleave from the APP substrate, or the cleavage site To limit.   The antibody reagent is a whole antibody or an antibody fragment containing an antigen binding site such as Fab or Fab ′. And may be monoclonal or polyclonal. Yes. Detection of antibody reagents bound to the immobilized phase is in the absence of characteristic proteolytic cleavage. Present Conversely, the absence of antibody bound to the immobilization phase indicates APP cleavage. Anti Detection of binding of bodily reagents generally involves the use of such antibody reagents in labeled form, or Involves the use of secondary or anti-antibodies, ie labeled antibodies.   Capture or immobilization of APP can be accomplished in a number of ways. Antibodies are cleavable fragments It is produced specifically for an epitope of APP that is not above. Immobilize such antibodies, It can be used to capture or immobilize intact surface APP. Alternatively, the ligand or hapten is A Covalently attached to PP and captured or captured APP using the corresponding immobilized receptor or antibody. Can be fixed. A typical ligand: receptor pair useful for this purpose is biotin: avi It's Jin. Examples of haptens useful for this are fluorescein and digitoxy. It is Genin.   The solid phase on which the APP substrate is immobilized or captured is a microtiter plate wafer. It consists of a variety of materials, including cables, test tubes, strips, beads, particles, etc. Especially yes Suitable solid phases are magnetic or paramagnetic particles. By derivatizing such particles, a simple It is possible to include chemically active groups that can bond to various compounds by chemical reactions. it can. The particles are removed from the suspension by bringing the magnet close to the container containing the particles. Hiding Repeatedly wash the particles without resorting to tedious centrifugation or filtration It provides the basis for full automation.   Labels for the primary or secondary antibody reagents may be selected from those well known in the art. It Some of these labels are fluorescent or chemiluminescent labels, radioisotopes. And, and more preferably, the enzyme for this is alkaline phosphatase, peroxidase. Oxidase and β-galactosidase. Under various conditions these enzymes It is stable, has high catalytic turnover, and can be detected using simple chromogenic substrates.   Proteolytic cleavage of APP substrates can also be detected by chromatographic methods. The APP fragment is isolated and then detected. High pressure liquid chromatography (HPL C) is particularly useful in this regard. When using this method, fluorescently labeled APP Prepare the substrate. After incubation with the test sample, the reaction mixture is Apply a chromatographic column to observe the differential rate of migration of fluorescent fragments versus intact APP. Sympathize.   The present invention further provides a method for treating a patient suffering from AD, wherein Asparagine alone or in admixture with non-toxic inert pharmaceutically acceptable excipients To a method comprising administering a so effective amount of an inhibitor of an acid protease Related.   The invention further provides asbestos in admixture with non-toxic inert pharmaceutically acceptable excipients. It relates to a pharmaceutical formulation containing such an inhibitor of p-partic acid protease.   The invention further encompasses such pharmaceutical formulations in dosage units. This is Parabolic parts are individual parts such as tablets, dragees, capsules, caplets, pills, suppositories and And in the form of ampoules, the inhibitor content of which is fractionated or divided into multiple individual doses. It is meant to correspond to a given amount. Dosage unit is divided into, for example, 1, 2, 3 or 4 It may contain a dose, or 1/2, 1/3 or 1/4 of an individual dose. For individual The amount is preferably given in a single dose, and usually the total daily dose, 1 / It contains an amount of active compound corresponding to 2, 1/3 or 1/4.   Solid, semi-solid or liquid dilution with non-toxic, inert pharmaceutically acceptable excipients Agents, fillers and all types of formulation auxiliaries are conceivable.   Preferred pharmaceutical formulations which may be mentioned are tablets, dragees, capsules, caplets, tablets. , Granules, suppositories, solutions, suspensions and emulsions, pastes, ointments, gels, creams, Lotions, dusts and sprays. Tablets, dragees, capsules, caplets, Pills and granules are for example (a) fillers and extenders such as starch, lactose , Sucrose, glucose, mannitol and silicic acid, (b) binders such as Ruboxymethylcellulose, alginate, gelatin and polyvinylpyrrolidone , (C) wetting agents such as glycerol, (d) disintegrating agents such as agar, calcium carbonate. Um and sodium carbonate, (e) solution inhibitors such as paraffin, (f) absorption enhancers Promoters such as quaternary ammonium compounds, (g) wetting agents such as cetyl alcohol And glycerol monostearate, (h) absorbents such as kaolin and vents Night, (i) lubricants such as talc, calcium stearate, stearate Gnesium and solid polyethylene glycol, or the above (a) to (i) Customary shaping such as a mixture of substances listed In addition to the agent, it may contain an inhibitor.   Tablets, dragees, capsules, caplets, pills and granules optionally contain opacifier Customary coatings and shells, which may contain only the inhibitor or Preferably, the composition is such that it can be released to a part of the intestinal tract, optionally in a delayed manner. May be. Examples of embedding compositions that can be used are polymeric substances and waxes.   Inhibitors are also in the form of microencapsulations, where appropriate in one or more Of the above excipients.   Suppositories include, in addition to the inhibitors, customary water-soluble or water-insoluble excipients such as polyethylene. Glycols, fats such as cocoa fat and higher esters (eg CTenFatty acids Have C14-Alcohol), or mixtures of these substances.   Ointments, pastes, creams and gels include, in addition to the inhibitors, customary excipients such as Animal and vegetable fats, waxes, paraffins, starches, tragacanth gums, Cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica It may contain acids, talc and zinc oxide, or mixtures of these substances.   Dusts and sprays include, in addition to the inhibitors, customary excipients such as lactose, talc. Powder, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate and polyamide powder, or It may contain mixtures of these substances. The spray may also be a customary propellant, for example It may contain lorofluorocarbons.   Solutions and emulsions include, in addition to the inhibitor, customary excipients such as solvents, solubilizers and Emulsifiers such as water, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbo Nate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, pro Pyrene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oil, Especially cottonseed oil, Peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycero , Glycerol formal, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene Contains glycol and fatty acid esters of sorbitan, or mixtures of these substances. Can have.   For parenteral administration, solutions and emulsions may be in sterile form which is isotonic with blood. .   Suspensions may contain, in addition to the inhibitor, customary excipients such as liquid diluents such as water, ethanol. Alcohol or propylene glycol, and suspending agents such as ethoxylated iso Stearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan ester , Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar and agar And tragacanth gum, or mixtures of these substances.   The above formulation forms include colorants, preservatives, and aroma- and flavor-improving additives, such as For example peppermint oil and eucalyptus oil, and sweeteners such as saccharin or aspa It may contain rutam.   The inhibitor is present at a concentration of about 0.1-99.5% by weight of the total mixture, preferably about 0.5-95% by weight. Must be present in the above pharmaceutical formulation.   The above pharmaceutical formulation may contain a number of inhibitors, in which case the above pharmaceutical formulation The total amount of inhibitors in the mixture is about 0.1-99.5% by weight of the total mixture, preferably about 0.5-95%. %. The formulations of the present invention may contain other active ingredients in addition to the inhibitors of the present invention. It   The above-mentioned pharmaceutical formulations are prepared according to known methods, for example, with one or more active compounds. It may be prepared in a customary manner by mixing it with the excipient or excipients.   The above formulations may be administered orally, rectally, buccally, parenterally (intravenously, intramuscularly). Meat or subcutaneously, in the tank, in the vagina, intraperitoneally or topically (powder, ointment or drops). Agent) can be administered. Suitable formulation is injection Liquids, oral therapeutic solutions and suspensions, gels, pour-on formulations, emulsions, ointments or It is a drop. Ophthalmic and dermatological formulations, silver salts and other salts, ear drops, eye ointments , Powders or solutions may be used for topical treatment. In addition, gels, powders, dusts, tablets, persistent Sex-release tablets, premixes, concentrates, granules, pellets, capsules, caplets, Aerosols, sprays and inhalants can be used. Inhibitors are Carrier materials, eg plastics (eg chains of plastics for topical treatment) , Collagen or bone cement.   Since the site of action is the brain, the inhibitor must cross the blood-brain barrier. This This may in some cases be, for example, by conjugation with a lyophilic carrier, or Liquid substituents such as hydrocarbons such as long chain alkyl groups, alkenyl groups such as bis. It is necessary to increase the lyophilicity of the inhibitor by introducing nil or the like. Lyophilic Such modifications to increase are routine and within the skill of one in the art. It For example, R.B. Silverman, “The Organic Chemistry of Drug Design and D rug Action ”, 1992, Academic Press, San Diego (See all contents Pp. 361-364, in particular). Yes. Any conventional method for achieving lyophilicity is contemplated. Suitable lyophilic Examples of sexual carriers include N.I. Created by Bodor and others, Silverman (same as above) 362 pages There is a reversible redox agent supply system discussed in Section II. N. Bodor et al., 1983, Pha rmacol. Ther., 19: 337; Bodor, 1987, Ann. N.Y. Acad. Sci., 507: 289 See also (All of these descriptions are incorporated herein by reference) That.   Generally, about 0.5 to 500 mg / kg body weight every 24 hours, preferably 5 to 100 mg Administration of the inhibitor in the form of total doses / kg / dose, if appropriate in several doses. And it is beneficial to achieve the desired result is there. The individual doses are preferably administered in amounts of about 1 to about 80 mg / kg, especially 3 to 30 mg / kg. Contains harmful agents. However, deviations from the mentioned doses, especially of the nature of the disease The severity of the drug, the nature of the formulation, the administration of the pharmaceutical agent, and the duration or interval of administration You may need to do so as a function of. Therefore, in some cases, above Less than the stated amount of inhibitor may be sufficient for treatment, but in other cases expertise Based on the above, any expert can easily determine the above amount of inhibitor.Definition   The three-letter or one-letter abbreviations for amino acids used herein are shown below: Brief description of the drawings   1a-1f show control peptidase activity as compared to AD human cortical subfractions. 2D contour plot of   Made into Example 1 by ion exchange (mono-Q) separation of P-2, S and M fractions. Then, a subfraction was prepared. N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-by Mono-Q fractionation Enzymatic of Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) Cleavage was performed as described in Example 3. Each blot should contain the same Obtained by incubation of each mono-Q fraction (ordinate) under basation conditions The relative amount of each fluorescent substance (abscissa) is shown. The amount of substance is Show. The greater the number of contour lines, the greater the amount of the specific substance. Control S (a), AD S (b), control M (c), AD M (d), control P-2 (e), AD P-2 (f) Analysis was performed on the Mono-Q fraction from Rome on the right-hand ordinate of three AD plots The numbers indicate the location of the pool area described in Example 3, then according to Example 8. This was assayed and found to contain significant APP degrading activity.   2a to 2f are ion exchange separations of M, S, or P-2 fractions derived from AD cortex. Shows immunoblot analysis of APP 695 degradation activity associated with selected Mono-Q from.   The pools have their content of peptidase activity as described in Example 3. Made on the basis of. The immunoblot assay was performed as described in Example 8. Carried out. Representative of the following pools Show the test:   Figure 2a: Activity associated with P-2 pool V: APP in each of lanes 2-6. Admitted. C-100 from PMTI 73 (lane 1), no P2-V blank (lane 2), P2-V (lane 3), P2-V + EDTA (lane 4), P2-V + methano Lane (lane 5), and Pepstatin A (ray) dissolved in P2-V + methanol. 6).   Figure 2b: M pool III related activity: APP was found in lanes 2-7. C-100 from PMTI 73 (lane 1), M-III + cystatin C (lane 2), M -III + aprotinin (lane 3), M-III + captopril (lane 4), M- III + EGTA (lane 5), M-III + N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-As p-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) (lane 6), inhibition M-III without agent (lane 7), and pre-stained molecular weight marker (lane 8).   Figure 2c: Activity associated with S Pool I: APP is observed in each of lanes 2-6. Was done. S-I + N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-net-Asp-Ala-Glu-Phe-Ar g-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) (lane 2), SI + EGTA (lane 3), SI + captopril (lane 4), SI + aprotinin (lane 5) , SI + cystatin (lane 6), and C-100 from PMTI 73 (lane 7). Lane 1 contains the pre-stained molecular weight marker.   Figure 2d: Activity recovered in individual mono-Q fractions from the separation of ADP-2: P-2 pool VII was assigned to the mono-Q fractions 38-43 corresponding to the conduction region observed elsewhere. Individually examined for APP degrading activity. Recombinant APP 695 was absent in each fraction. Incubations were performed both in the presence (−) or the presence (+). Fraction number Are marked on FIG. The C-100 standard used is from PMTI 100. It was. Mr indicates a molecular size marker.   Figure 2e: Transfer position of C-100 product directed by PMTI 73 or PMTI 100 Comparison: PMTI 73 (lanes 1 and 3) and PMTI 100 (lanes 2 and 4) proteins Quality products are shown in comparison with molecular markers (lane 5).   Figure 2f: Typical time course of product formation: APP + M-III for t = 0 hours (ratio). 1), 5 hours (lane 2), 20.5 hours (lane 3), 44.5 hours (lane 4) And 55 hours (lane 5). Molecular weight marker (lane 6), C-100 PMTI  73 (lane 7) and APP without M-III (lane 8) are shown.   For each of Figures 2a-2f above, the migration was from top to bottom. 2e-2 In d and 2f, the upper solid line arrow indicates the movement position of the holo APP, and the lower solid line arrow indicates C-100. Indicates the moving position of. In FIG. 2d, the double arrow indicates the enzymatically generated C-100 fragment. The position of putative oligomer migration is indicated. The concentrations of all inhibitors are listed in Table 4 below. It   Figures 3a and 3b show the results of further purification of the P-2 VII pool by gel filtration. Show.   Figure 3a: Pool P2 pool VII fraction from Mono-Q10 / 10 chromatography. Solution, concentrated to 0.25 ml, in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCl. Applied to two Superose 6HR 10/30 columns in equilibrium tandem. 0.3 ml / min Elution was performed at flow rate and the column eluent was monitored at 280 nm. Fraction (0.24 ml ) Was collected and subjected to peptidase activity and APP degradation assay using immunoblot. It was The arrow indicates the position of the region of the chromatogram in which APP degradation activity was recovered. K Also shown is the peptidase activity associated with -M (filled circles) and MD (open circles) bond cleavage. Chromatography was performed at 22 ° C.   Figure 3b: APP degradation activity against indicator standard proteins of known molecular weight. Migration was used to calculate the Mr apparent for the APP-degrading proteases listed in Example 8. .   Figure 4 is a murine monoclonal antibody raised against beta amyloid peptide. Figure 3 shows peptide epitope mapping of the body. Synthesize microtiter plate APP 695 (5 97-638) (beta-amyloid 1-42) 50 ng, block, then pre-incubate Concentrate with 100 μl of C286.8A (80 ng IgG) that had been baked (60 min at room temperature). Incubation was performed in the presence or absence of varying competitor peptides. Peptide 1 Note that ~ 7 is referred to as peptide SEQ ID NO: 1. 60 minutes incubation at room temperature After that, the plate was washed and the amount of bound antibody was determined by standard method (Wunderlich et-al., 1 992, J. of Immumol. Horseradish Peru according to Methods, 147: 1) Confirmed by developing with oxidase-conjugated goat anti-mouse polyclonal antibody It was The% competition (% C) of antibody bound to the plate was determined at 450 nm using the following equation: Calculated from the extinction coefficient data for:   Figure 5: APP 69 recovered in the ion exchange fraction from the purification of human brain P-2 subfraction. 5 Processing activity. All 123 fractions were collected from the column. The first 32 fractions are negative Corresponding to load and wash phase. The salt gradient started at fraction 33. Fractionation 3-18 (panel a) , 21-32 (panel b), 33-38 (panel c) and 39-44 (panel d) screens Indicate the For each fraction, in the absence (-) and presence (+) of APP 695 substrate Incubation was performed. Incubation of APP 695 for 0 or 24 hours The location indicates the position where appropriate. Incubation is performed as follows Did: Baculo-derived holo APP 695 (80nm ), 100 mM Mes buffer pH 6.5, 0.008% (v / v) Triton X-100, 160 mn NaCl, 6 5 μl of each column fraction in a total volume of 15 μl containing .7 mM Tris (from APP stock) Incubated together. 24 hours by adding SDS-PAGE sample buffer The reaction was terminated after a while. The C-terminus of Example 6, as described in Example 8. Immunoblots were developed with polyclonal antisera. The arrow indicates the generated fragment Indicates the position. Fractions 45-86 were also examined, but showed relatively low activity (Hence not shown). Peaks A and B indicate the location of major activity.   Figure 6 shows the purification results of P-2 derived APP degrading activity in gel filtration: catheps Correlation with elution of SynD. Panel (a) P-2 peak B on Superose 6HR column 280 nm elution profile for purification of. Panel (b) and (c) described in Example 5 Corresponding AP in elution fractions 49-60 that are necessarily determined as listed P C-terminal processing activity. The arrow indicates the position of the main production zone. Panel (d) and (E) Cathepsin D (1/300 dilution) against rabbit polyclonal antibody Immunoblot analysis of the eluted fractions used. The arrow indicates the movement position of the immune reaction zone. Hi Liver cathepsin D was also analyzed for comparison.   FIG. 7: Protease inhibitor of protease activity isolated from P-2 subfraction Shows specificity. The reaction (32 μl) was started at 37 ° C by the addition of APP and then the initial stage Component conditions were achieved: P-2 enzyme from the 25-25 kDa region of gel filtration (2.54 μg / m l) Fractionation (Figure 6); APP (168 nM) in 96 mM Mes buffer pH 6.5. 15 μl of 3x sump Reaction is terminated after 26 hours by the addition of buffer solution to the APP C-terminus. Immunoblot analysis using 1/1000 dilution of rabbit polyclonal antiserum It was Shows the effect of subsequent addition of inhibitor; inhibitor-free (Lanes 7 and 20), 1 mM EDTA (lane 5); 400 μM PMSF in ethanol ( Lane 9); ethanol alone (lane 11); 100 μME-64 (lane 13); 10 μ g / ml aprotinin (lane 22); 100 μM peptatin A in DMSO (lane 26) DMSO only (lane 24). 0 hours (lanes 2 and 30) and 26 hours (lane 3 and The effect of 28) APP incubation is also shown. Lanes 4, 8, 12, 19, 23 and 27 Contained the C-100 standard. Pre-stained molecular weight markers are present in lanes 1 and 29. 1 The positions of the 8 and 28 kDa C-terminal product fragments are indicated by arrows.   FIG. 8 shows cathepsies monitored using an antibody against the APP C-terminal domain. 3 shows the time course of cleavage of APP D-catalyzed APP. Panel (a) shows 86 μM pepstatin A By cathepsin D in the absence (lanes 10-14) or in the presence (lanes 4-8) The time course of APP protein degradation is shown. APP can be used alone (lanes 1-3) I masturbated. The numerical value indicates the time (hour) after the start of the reaction. Reaction add APP The following initial component concentrations were achieved by starting at 37 ° C: MeS buffer pH 6.5. Of APP (82 nM), cathepsin D (9.2 μg / ml), and pepstatin-free The sample was charged with the same amount of solvent (1.3% v / v methanol). t = 0,43,84 At 140 and 215 minutes, remove aliquots (15 μl) and remove 7.5 μl of SDS-PAGE sample. Immunoprecipitate with rabbit antiserum against APP C-terminal domain Lot analyzed. The positions of the 18 and 28 kDa reaction products are indicated by arrows.   FIG. 9 shows p of APP C-terminal processing by P-2 derived enzyme or cathepsin D. Shows H and ionic strength dependence. Bunnell (a) is a cathepsin D and P-2 enzyme PH dependence observed in (peak B, FIG. 5, after gel filtration chromatography) , FIG. 6). Panel (b) Shows the ionic strength dependence for both enzymes at pH 6.5. The reaction is 3 Starting at 7 ° C., the following initial ingredient concentrations were achieved: Cathepsin D (9.2 μg / ml) or Is the P-2 enzyme (11.7 μg / ml), sodium acetate, MeS and Tris-HCl from FIG. 100 mM in each, and purified APP (79 nM). Aliquots (15 μl) was removed and mixed with 7.5 μl of 3 × sample buffer, according to Example 8. Were immunoblotted with C-terminal polyclonal antisera. 28, 18 and 14 The position of the reaction product of kDa is indicated by an arrow.   Figure 10 shows cathepsin D and P-2 enzymes (Pea) after further purification on Superose 6HR. B-Fig. 5) N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe- Arg-NH2This shows the cleavage of (SEQ ID NO: 7). Reaction at 37 ° C with enzyme / inhibitor addition Started, thereby achieving the following t = 0 component concentrations: acetate, MeS and Tris pH Cathepsin D (2.8 μg / ml) in cocktail buffer containing 130 mM in each of 5.0 ) Or P-2 enzyme from FIG. 6 (17.5 μg / ml), N-dansyl-peptide (58 μm). M), captopril (0.3 mM). The sample is pepstatin A (3% v / v final method). 213 μM) in the tanol) or finally only an equal concentration of methanol was contained. 0, At 2, 4, 8 and 24 hours, 12% (v / v) TFA (10 μl) was added to complete the reaction. Then, HPLC analysis was performed according to Examples 2 and 3. Fees for Shows traces: P-2 enzyme, t = 0 h (panel A); P-2 enzyme, t = 24 h. Between (panel B); P-2 enzyme + pepstatin A, t = 24 hours (panel C); Pusin D, t = 0 hours (panel D); Cathepsin D, t = 24 hours (panel E); And cathepsin D + pepstatin A, 24 hours (panel F).   FIG. 11 shows N-dansyl-Ile-by cathepsin D and P-2 enzymes (peak B). Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2(Array No .: 7) Shows pH dependence of cleavage. The reaction conditions are essentially as described in Figure 10. However, the cocktail buffer was adjusted to the indicated pH value and incubated. The time was 23 hours for the P-2 enzyme and 5 hours for cathepsin D. (A) Cathepsin D cleavage, and (b) P-2 enzyme cleavage. -Glu-Val- The cleavage rates at (black circles) and -Met-Asp- (white circles) bonds are shown in each case.   Figure 12 is an SDS-PAGE analysis of reaction products from preliminary digestion of APP with cathepsin D. Analysis. Panel (a): Electro-stained by Coomassie coomassie before band cutting Is a photograph of a blot, panel (b) is the corresponding blot after banding, Panel (c) is a series of parallel antiparallels to those shown in panels (a) and (b). By corresponding immunoblot analysis (1/100 dilution of 286.8A monoclonal) is there. The reaction in (a) is initiated at 37 ° C. by substrate addition, whereby The initial component concentration of: was achieved in 40 mM sodium acetate pH 5.0 containing 30 mM NaCl. APP (15.6 μM), cathepsin D (0.17 μM, 7.145 μg / ml). t = 16 hours, The reaction mixture was concentrated to 15 μl by high speed vacuum and 7.5 μl of 3x sample buffer. Mixed and SDS-PAGE treated. The reactions in (c) are carried out in essentially the same way. However, the APP concentration was lowered to 3.2 μM. For both experiments (in a and c) , Using the complete incubation system (lane 3) in the absence of cathepsin D (Lane 4, cathepsin D was added again immediately after adding the same buffer). . Lane 5 in each case contains a cathepsin D only control, while lane 6 is migrating. It contained purified APP as a reference. The pre-stained molecular weight marker is in lane 1. ( In c), the position of the major immune reaction product is indicated by an arrow.   FIG. 13 shows that a monoclonal antibody against the N-terminus of beta amyloid was used to The time course of the catalyzed APP decomposition of catalyzed D Show. Start the reaction at 37 ℃ by adding APP, and Achieved: APP (448 μM), Cathepsin D (30 μM in 83 mM sodium acetate pH 5.0 M), and if present, pepstatin A (97.2 μM). Aliquot at the time of instruction Remove (20 μl), mix with 10 μl of 3x SDS-PAGE sample buffer and Immunoblot analysis was performed using the Noclonal antibody 286.8A (1/100). The reaction is In the absence (-) or presence of pepstatin A (dissolved in methanol and fed) +). All samples contained 2.7% (v / v) methanol. Les Zones 1 and 12 contained the pre-stained Mr marker. Lanes 10 and 18 are C-100 Mr markers Contained. Lanes 11 and 13 contain 0 and 21 hours without cathepsin D, respectively. Contains incubated APP. The major product fragment is indicated by the arrow.   FIG. 14 is a synthetic peptistase by cathepsin D and P-2 derived enzymes (peak B). The effect of amino acid substitution on the time course of hydrolysis of amino acid is shown. Reaction to substrate addition Starting at 37 ° C, the following initial constituent concentrations were achieved: Tris, MeS and acetate relaxation. Cathepsin D (2.5 μg / ml) or P-2 in 135 mM buffer in each of pH 5.0. Peak B enzyme (7.5 μg / ml), N-dansyl-peptide (58 μM), captop Ril (0.3 mM), contains pepstatin A (213 μM), sodium chloride (75 mM) May be. Aliquots (30 μl) were removed at various time points and placed in TFA at 12.5% And adjusted to RP-HPLC analysis. Subsequent additions regarding substrate / protease combinations Show the time course of water splitting:   (A) N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- with cathepsin D Glu-Phe-Arg-NH2(SEQ ID NO: 7);   (B) N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala- with cathepsin D Glu-Phe-Arg-NH2(SEQ ID NO: 3);   (C) By P-2 enzyme (peak B, FIG. 5, after gel filtration, FIG. 6) N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2(Sequence number : 7);   (D) N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-by P-2 enzyme (peak B, FIG. 5) Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2(SEQ ID NO: 3).   E-V bond (rectangle, panels A and C), MD bond (middle black diamond, A and C) Or (B and D) cleavage to give metabolites with a retention time of 4.4 minutes.   Figure 15 shows purification of solubilized P-2 fraction on aprotinin sepharose. Real The experiment was carried out according to Example 1. (A) Typical A280 nm elution profile And (b) is the immunoassay for APP processing activity in the eluate fraction. Noblot assay (rabbit antiserum against C-terminal domain of APP). Arrow The migration of major APP degradation products is shown. Breakdown formation in fractions 8-13 from acidic elution Pay attention to the appearance of things.   Figure 16 shows the purification of P-2 derived aprotinin-binding protease on Mono-Q. . (A) is the A280 nm elution profile, and (b) is the rabbit for detection. The activity of the eluate fractions obtained with the GI anti-C-terminal APP antiserum (1/1000 dilution) was shown. (C) is an elution fraction using Mab 286.8A (1.61 mg / ml purified IgG / 100 dilution) Shows the activity of. The three arrows indicate the migration of 11, 14 and 18 kDa C-terminal APP degradation products. Show.   Figure 17 shows the pH and Io of APP degradation catalyzed by pool Y serine proteases. Strength dependence. Panel (a) shows pH dependence. Start the reaction at 37 ℃ The following t = 0 component concentrations were achieved: acetate, nes and Tris adjusted to the indicated pH. Pool Y protease in cocktail buffer containing 32 mM each (from Figure 16 5 μl fraction 16), APP (38 nM). The reaction mixture (16 μl) was 7.5 μl of 3x Sun. The reaction was terminated after 2 hours by adding pull buffer. Essentially an example Rabbit polyclonal antisera directed against the APP C-terminal domain as described in 8. Was used to develop an immunoblot. Lanes 1 and 12 contain pre-stained Mr markers did. Lane 9 contains C-100, lanes 10 and 11 are pool Y free and have a pH of 6.5. Containing APP incubated for 0 and 3 hours, respectively. Panel (b) is Shows ionic strength dependence. The reaction was carried out essentially as in (a) except that the buffer was used. The solution was 95 mM MeS pH 6.5 containing the indicated molarity of sodium chloride. Swimming pool APP cleavage in the absence (lanes 2-7) or presence (lanes 9-14) of Y Indicated for concentrations of sodium chloride. Lanes 1 and 8 are Mr marker and It contained the C-100 standard. Arrows indicate migration of 11, 14 and 18 kDa APP fragments.   FIG. 18 shows the inhibitor selectivity of pool Y protease. At 37 ° C due to enzyme addition The reaction was initiated to achieve the following initial component concentrations in a volume of 16 μl: 30 mM Mes Pool Y # 3-5 after purification on superdex 75 column in buffer pH 6.5 (14 μg / ml), APP (35 nM). Reactions were added by adding 7.5 μl of 3x sample buffer. I ended it. Rabbit antiserum to APP C-terminal domain according to Example 8 Was used to develop the immunoblot. Data are shown for the following inhibitors: Panel (a) 860 μM PMSF in methanol (lane 4), 400 μ in methanol M pepstatin (lane 6), 5 mM benzamidine (lane 8), 350 μM E -64 (lane 9), 7.7 mM EDTA (lane 10), 15 μM aprotinin (lane 11) , And 0.1% (w / v) deoxycholate (lane 15). The following controls were also treated : No inhibitor (lane 12), ethanol (lane 3), methanol (lane 5) ), Pool Y only (lane 2), time 0 (lane 13) and 4th hour (lane) 14) APP only. Lanes 1 and 7 Indicate the pre-stained Mr marker and C-100 standard, respectively. Panel (b) 1.8 μM Alf 1-anti-chymotrypsin (lane 2), 156 μM TLCK (lane 3), 46 μM key Motrypsin inhibitor I (lane 4), 119 μM chymotrypsin inhibitor II (lane 5) 4 μM alpha-2-antiserum (lane 6), 51 μM alpha-1-anti bird Pusin (lane 7), 98 μM chymostatin (lane 10), 15 administered in DMSO 3 μM methanolic TPCK (lane 12). Controls are shown below: no inhibitor (ray 8), DMSO (lane 11), and methanol (lane 13). Pre-stained molecular weight marker And C-100 standards were applied to lanes 1 and 9, respectively. Arrows are 11, 14 and 18kDa The APP degradation product of is shown.   Figure 19 shows that 1) DMSO and DMSO + 10 μM pepstatin A affect the growth of HEK293 cells. No (panel A), 2) DMSO + pepstatin A treated late log phase culture The conditioned medium harvested from the cultures produced significantly lower levels of cultures treated with DMSO alone. A 15 kDa APP C-terminal fragment is shown (panel B). Panel A HEK293 cells (ATCC CRL 157 3, suitable for suspension culture), MoAb medium (JRH Bioscience, Lenexa, Kansas) Plant in a roller bottle containing 400 ml of + 0.2% v / v fetal bovine serum (middle black rectangle). I got it. Another roller is 0.01% v / v DMSO (white square) or 0.01% DMSO + 10μ M Pepstatin A (middle black diamond) was included. Cell growth is 5% CO2/ 95% in the atmosphere Was 37 ° C. Determine the number of viable cells in trypan blue-treated samples with a hemacytometer Weighed and was a constant percentage (60%) over time. At the end of the logarithmic phase (7 days The conditioned medium was harvested (indicated by an arrow in the eye) and the Beckman Gs-6 ventilated. Immobilized anti-beta amyloid monoc was centrifuged at 1500 RPM in a centrifuge. Chromatography was performed on a column of local antibody (C286.8A).   Panel B Immunoblot with rabbit anti-APP C-terminal antiserum. Lane 1 Staining molecular weight markers; lanes 2-7 are fractions from purification of medium from DMSO-treated cells Analysis of each of 1-6; lanes 9-14 are DMSO / Pepstatin A treated cells. Is an analysis of each of Fractions 1-6 from the purification of the medium from. Lane 8 is C-10 0 standard (from Example 5, PMTI 100) and lane 15 is the method of Example 7. It contained recombinant holo-APP 695 purified by 2. Fraction 5 from DMSO only processing And 6 are absent from the corresponding fractions in DMSO / Pepstatin A treatment 15 It contained the kDa band. Further details are given in the text of Example 12.   Figure 20: Human aspartate protease with APP processing activity Summarize the purification from the brain. a) Solubilized P-2 on Mono-Q HR10 / 10 column Elution profile for purification of fractions (140 mg protein). Protein concentration ( (White circle), conduction (dashed line) and absence (black circle) or presence of 10 μM pepstatin A (White triangle) N-dansyl-ISEVKMDAEFR-NH2N-Dancil-ISE from Shown for each collection fraction. b) Immunity for APP hydrolysis using MAb 286.8A Noblot assay: Lane 1 C-100 standard; Lane 2 incubated alone Pool fractions 24-45 (2.0-5.3 mmho at 4 ° C) from 1 (b); with lane 3 APP Pooled fractions co-incubated; lane 4 pooled fraction + APP + 10 μM max Terminal pepstatin A. Arrows indicate product fragments. c) MAb 286.8 by competitive EIA Epitope mapping of A. Pepti containing amino acids 645-695 of human APP 695 N-dansyl-ISEVKMDAEFRHDDDD of other indicated segment of beta, beta amyloid (1-7) were tested for their ability to block the binding of C286.8A to the immunogen. Be Data amyloid 1-42, 1-28, 1-16 and N-dansyl-ISEVKMDAEFRHDDDD ( 1-7 ) -Dependently inhibited C286.8A binding dose, while 12-28, 25-35 and 645-69. 5 does not inhibit the reaction of C286.8A to the N-terminus of the A4 region. It was localized to 7 amino acids (APP 597-603). d) Rabbit against cathepsin D Immunoblot analysis of active fractions with 1/300 dilution of polyclonal antibody.   APP processing: 31 μg / ml of homogeneous holo APP 695 (as in method 2 of Example 7) (Prepared in advance) with acetate, Mes and Tris pH 4.0, 0.002% (v / v) Triton X-100 and And 5 μl of each column fraction in a total volume of 15 μl containing 40 mM in each of 30 mM exogenous NaCl Incubated with. Add SDS-PAGE sample buffer and finally add 1x The reaction was terminated after 24 hours as a 10-20% acrylamide gradient triclinogen. Electrophoresed on a Novex, keeping constant at 100 V, then on a Problott membrane (Applied Electroplating on Biosystems). Combines with alkaline phosphatase Monochrome blots using standard sandwich method with appropriate secondary antibody The final antibody was developed at 50 μg / ml with the null antibody C286.8A. Recombinant C-100 Prepared as described in.   Peptidase: Add an aliquot of column fraction (20 μl) to 10 μl reaction mixture. In addition, the following initial component concentrations were achieved: 50% sodium acetate pH 5 Synthetic N-dansyl-ISEVKMDAEFR-NH2(58 μM), captopril ( 0.2 mM), methanol (0.3 v / v) and, if included, in methanol Solved pepstatin A (10 μM). By adding 10 μl of 40 μM pepstatin A The reaction was stopped after 24 hours. Detect enzymatic products and quantify by RP-HPLC (Example 2).   FIG. 21 shows that an immobilized antibody against human cathepsin D was used to decompose human brain APP from solution. Is selectively removed. a) Control (solid line) And A280 nm elution profile for anti-cathepsin D (dashed line) column. Number Shaved arrowheads indicate: 1 start of addition; 2 wash with equilibration buffer; 3 Elute with 100 mM glycine pH 2.2; 4 Elute with 50 mM diethanolamine hydrochloride pH 11; 5 Elute with 100 mM glycine, 0.5% (v / v) Triton X-100. b) APP processing Activity against anti-CD (+) or control (-) selective null fractions (1-27) And aprisate (Q pool), purified cathepsin D (CD) or APP alone Shown. APP hydrolysis activity was not detected above fraction 40. c) 21 times To Polyclonal Antibodies Concentrated or Cathepsin D Immunoblot of flow fraction 9 pooled with liton eluate (fractions 80-89, 8x concentrated) Reactivity. Concentration was performed by precipitation with 10% (v / v) TCA.   Chromatography: Description (T.T.Ngo et al., 1992, Chromatography, 597: 1) Control and anti-cathepsin D rabbit anti-blood by strong AL chromatography as per 01). Purification of CnBr by standard method (R. Axen et a1., 1967, Nature, 214: 1302) It was coupled with activated Sepharose 4B (Pharmacia). APP processing activity Contains an equal amount from Figure 21b (110 mM sodium bicarbonate containing 44 ml 100 mM NaCl). Pooled fraction of 4.1 mg protein in pH 8.1) immobilized anti-cathepsin D IgG or solid fraction. Normalized control IgG was applied in parallel to the same size column (4.2 ml resin). Each column , 28 ml 100 mM NaHCO3 containing 500 ml NaCl3 pH 8.3, 28 ml 100 mM glycine pH 2. 5,40 ml of 50 mM diethanolamine hydrochloride pH 11, and finally 0.5% (v / v) Triton  Subsequent washes with 30 ml of 100 mM glycine pH 2.5 containing X-100. In production or in base The fractions collected in 1. were neutralized with Tris. Chromatography at a flow rate of 0.5 ml / min Performed and collected 2 ml fractions in total. All operations were performed at 4 ° C.   APP processing: Homogeneous halo APP 695 (final 31 μg / ml) with acetate, Mes and T ris pH4.0, 0.002% (v / v) Triton X-100 and 40 mM in each of 40 mM exogenous NaCl Incubated with 5 μl of each column fraction in a total volume of 15 μl contained. SD The reaction was terminated after 24 hours by adding S-PAGE sample buffer, and the Analyzed by immunoblot developed with antibody 286.8A. Arrows show product fragments Show. Highly purified human cathepsin D was enzymatically incubated at a final concentration of 1.27 μg / ml. Existed all over.   FIG. 22 shows that an immobilized antibody against cathepsin D degrades APP-like peptides in humans. And those that adsorb brain peptidase. a) and b) N-dansyl-ISEVKMDA EFR-NH2Fractionation and degradation of pooled glycine / triton eluate (fractionation 80-89, Fig. 21a, 21-fold concentrated) respectively. c) and d ) N-dansyl-ISEVNLDAEFR-NH2Corresponding data on hydrolysis. In a) Shows the EV hydrolysis activity (circles) of the fluidized fraction. c) shows LD hydrolysis. You Color containing bound control (middle black symbol) or anti-cathepsin D IgG (middle white symbol) The activity from the fractions collected from the murine is shown. The triangle indicates the end of incubation Shows the efficacy of 10 μM pepstatin A on the amount of indisputable substrate remaining in You In b) and d), in the absence (middle white bar graph) or presence of pepstatin A The activity was measured with (middle black bar graph).   Method: Initiate reaction at 37 ° C by adding column fraction (20 μl) in 30 μl The following initial component concentrations of were achieved: 40 mM in each of acetate, Mes and Tris pH 5.0. Peptide substrate (58 μM), captopril (0.28 mM) in cocktail buffer containing ), Methanol (0.1% v / v). When included, pepstatin has a final concentration of 10μ It is M. The reaction was terminated 20 hours after the final addition of 10 μM pepstatin A. C-10, RP-HPLC analysis was performed according to Example 2.   FIG. 23 shows cathepsin D made because the initial assignment was reported in Table 5. Of the sequence assignment of the beta amyloid fragment generated from the hydrolysis of APP 695 Here is the updated summary. a) Immunoblots (immunoblots obtained from Figure 12C) Lane: Lane 1 βAPP 695 only; Lane 2 βAPP 695 + CD) C286.8A exemption N-terminal sequence of βAPP-derived fragment against epidemiological reactivity. The arrow indicates the immunoblot band and C A sequencing block with sufficient sequence and size to contain the 286.8A epitope. Combine the fragments identified in the corresponding segment of the lot. Bottom ke The letter "ce" means an indeterminate array assignment. APP 695 amino acid numbering is kan g, etc. (1987, Nature, 325: 733). b) contains the C286.8A epitope ( Beta APP 695 fragmentation pattern including all recovered fragments (hatched) or not (middle white) . The length of each fragment is drawn in proportion to the approximate number of residues per fragment, Calculated from SDS-PAGE, the average residue mass appeared to be 110. A few The potential effects of glycosylation on the fragment size of Escherichia coli are not explained. Mature βAPP The position of βAP in 695 (shaded segment) is also shown. In b) it is hydrolyzed Binding corresponded to βAPP 695 residues: 122-123 (FV); 303-304 (YL ); 405 to 406 (LQ); 459 to 460 (LR); 532 to 533 (LP); 549 to 550 (FG); 593-594 (EV).   MethodThe reaction was carried out as described in Example 12. Complete incubator CD-dependence in fragment-specific or parallel immunoblots Cut a segment of a Comassie-stained electroblot that co-migrates with the immunoreactive zone Applide Biosystems 477A Protein Sequencer in the Gas Phase Sequenced above. 80% βAPP was hydrolyzed into smaller fragments. 12.7 Apply an amount of βAPP to the gel in equilibrium to produce pmol of detectable N-terminal sequence. It was Detailed Description of the Invention   The invention is described in more detail in the following examples.   Example 1. Human brain protease isolation   Two general approaches were taken for protease isolation. In early research Isolated brain protease activity as described in "Method 1" below. So Characterization of the enzymatic activity obtained from the resulting ion exchange chromatography As described in Examples 3 and 8, recombinant CHO cell-derived APP can be degraded (Example 8). However, six different activities that are relatively inactive as peptidases (Example 3) Was identified.   One of the six activities was subsequently identified as cathepsin D (Example 9) and gel filtration It was further characterized by its chromatography above.   In an alternative approach to attempting affinity purification, Example 8 (Table 4 ), Some of the human brain serine proteases described in "Method 2" were performed. this The procedure is based on the use of aprotinin sepharose at the initial stage. Based on finity purification, a cell showing the ability for APP C-terminal processing. The identification of the phosphoprotease (Example 10) is made.   Method 1:   (I) Sub-cellulor fractionation 4 AD patients of different ages Sections of human frontal cortex pole 9 region were weighed while freezing (-70 ° C), and then 0.32 at 4 ° C. In addition to 150 ml of M sucrose, use scissors to I cut it. Homogenize suspension in 100 ml Elvehjem glass Teflon ware in batch Yes (10 return strokes). Combined homogenate in Sorval SS-34 rotor It was centrifuged.   The loose pellet was removed, rehomogenized and centrifuged as above. each Combine the supernatants for extraction and centrifuge for 30 minutes at 15,000 g in a Sorval SS-34 rotor. did. The resulting "P-2" pellet is stirred with 100 ml of ice-cold 0.32M spray. Resuspended in sucrose and stored at -70 ° C. Supernatant from the last spin at 15,000 g After centrifugation for 60 minutes, the supernatant or soluble fraction (“S”) and microsome fraction (“M”) )) And resuspended in 60 ml 0.32M sucrose. S and M It was stored at -70 ° C.   (Ii) Solubilization Membrane control or AD subfraction (P-2 or M) was adjusted under the following conditions Solubilized by: 2% (v / v) Triton X containing 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 -100. After stirring for 3.5 hours at 4 ° C, the suspension is stirred at 105,000g in a Beckman 70 Ti rotor for 6 It was centrifuged for 0 minutes. The following final protein concentrations were P-2 (3.9-4.0 mg / ml); and And M (1.4-1.6 mg / ml). The solubilized supernatant was used later Therefore, it was stored at -70 ° C. The soluble fraction was not treated with detergent, but The pH was adjusted to 50 mM in Tris-HCl pH 7.5 by the addition of 1 M buffer.   (Iii) Ion exchange chromatography 50 ml Rheodyne stainless steel loop Equipped with injector type 7125, Mono Q HR10 / 10 column (Pharmacia, Piscataway , NJ) connected to a Gilson gradient liquid chromatograph (type 305 and 306 pumps) Chromatography was performed. Pharmacia UV-M detector and Kippen-zonen chamber A column recorder was used to monitor the absorbance of the column eluent at 280 nm.   P-2, microsome (M) or soluble (S) protein fractions are loaded onto the column And equilibrated with 50 mM Tris-HCl pH 7.5 at a flow rate of 2 ml / min. Next, melt the column. The A 280 nm in the syneresis is reduced to zero, at which point the column flow rate is increased to 4 ml / min. Washed with equilibration buffer up to.   The protein was eluted as follows:   Solvent: A = 50 mM Tris-HCl pH7.5         B = 50 mM Tris-HCl pH7.5 (containing 1M NaCl)   Plan: 0-50% B 70 minutes         Hold 50% B for 10 minutes         50-100% B 10 minutes         Hold 100% B for 10 minutes         Rebalance   4 ml fractions were collected throughout the chromatography. Add the following proteins once Applied per column treatment of: P-2 97 mg (control) and 95 mg (AD); S 50 mg (Control) and 68 mg (AD); and M 36 mg (control) and 31 mg (AD).   Initial studies showed A280nm, total protein (Bradford assay) and peptidase activity. The elution fraction was monitored for sex (as described in Examples 2 and 3). To). A pool made on the basis of peptidase activity was then prepared (Example 3), CHO cell-derived APP C-terminal Were tested for their ability to treat (described in Example 8).   However, in all further studies, baculovirus specific expression The ability of the resulting recombinant APPs for C-terminal processing The elution fractions were tested separately (Example 9).   (Iv) Gel filtration chromatography A typical example of gel filtration is shown in FIG. It In addition, chromatography is generally performed as follows. Purification of P-2 Pooled mono-Q fractions containing APP C-terminal processing activity, Concentrate to <1 and equilibrate with 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCl. Applied to two Sepharose 6HR columns in a vertical array. Use a flow rate of 0.3 ml / min throughout It was A280nm, total protein (Bradford assay), peptidase activity, and recombination The elution fraction was monitored for activity on C-terminal processing of body APP. It was   Method 2:   (I) Subcellular fractionation This was carried out as described in Method 1 above. It was   (Ii) Solubilization was carried out essentially as described in Method 1 above. .   (Iii) Aprotinin-Sepharose chromatography Soluble (230 m g), P-2 (216 mg) or microsome (47 mg) fractions were previously diluted with 20 mM Tris-HCl. Aprotinin Sepharose (Sigma, Catalog No. 42268, 1-equilibrium equilibrated with buffer pH 7.0) 5 x 10 cm) column. Load the column once and wash with equilibration buffer (100 ml). 60 ml of 50 mM sodium acetate buffer p containing 500 mM sodium chloride. Elute with H5.0. The flow rate was 1.0 mL / min throughout. The elution fraction (4 ml) was filtered at 280 nm. Nitrate, analyze using Bradford test, As described in Example 8 using recombinant APP obtained by expression in a Urovirus system. The APP C-terminal processing activity was examined as listed. The active fraction is , 11, 14 and 18 kDa (or In particular, fragments can be formed (see Example 6 for methods of antibody production).   (Iv) Ion exchange chromatography Aprotinin-P- on Sepharose The active fractions from the purification of the two fractions were pooled and dialyzed against 50 mM Tris-HCl pH 7.5. And applied to a Mono-Q column (HR5 / 5) pre-equilibrated with dialysis buffer. Ichi The column was loaded and the column was eluted essentially as in Method 1 above. Active fraction (2 ml) for A280 nm, total protein (Bradford assay), and baculovirus For their ability to process APP-terminals from Ruth, monitorin I'm sorry A broad peak of APP degrading activity was observed, which is the APP C-terminal antibody as well as the beta. Reaction with both monoclonal antibodies directed against the N-terminus of the amyloid peptide Can form 11, 14 and 18 kDa APPC terminal fragments that See Example 6).   Based on the A 280 nm profile that intersects the region containing the active fraction, Two pools were prepared, each overlaid with a distinct A280 nm peak. The pool is less conductive Range included: Pool X (12.2 to 14.4 mmho), Pool Y (14.9 to 18.9 mmho) and Pool Z (20.2-22.9mmho).   (V) Gel Filtration Chromatography Pools X, Y and Z are each 2 ml (pool Concentrates X and Y) or 3.6 ml (Pool Z) and contains 150 mM sodium chloride Superdex 75 column (Pharmacia, Piscata) pre-equilibrated with 50 mM Tris-HCl pH 7.5 way, NJ). Once loaded, elute column with equilibration buffer . 1.0 from beginning to end Chromatography was performed at a flow rate of ml / min. A280nm, total protein (Bradf ord assay) and C-terminal processing of baculo-expressing APP (1 ml) was monitored. Chromatography of standard proteins of each squid Gel filtration was measured by: thyroglobulin (570 kDa), bovine gamma globulin (158kDa), ovalbumin (44kDa), myoglobin (17.5kDa) and vitamins B12(1.35kDa).   Example 2. Peptidase test development   "Extracellular" domain (s) and N-terminus of beta amyloid peptide region En in human brain tissue with suitable specificity for APP hydrolysis at the junction between the edges Open peptidase assay to allow high throughput detection of deprotease Fired. The technique of choice was the subsequent detection of fluorescent peptide products by RP-HPLC separation. The dansylated peptide substrate was used in conjunction with the detection of and post-column fluorescence detection.   Evolution of peptide substrate sequence: N-terminus of beta-amyloid peptide sequence of human APP Fluorescently labeled dodeca containing amino acid sequences similar to those observed around the edge region. Peptide substrates were prepared by solid phase peptide synthesis. Peptide is Fmoc / NMP-Ho Synthesized on Applied Biosystems 430A peptide synthesizer using BL chemistry (F ields et al., 1990, Int. J. Pepeide Protein Res-, 35: 161; Knorr et al. , 1989, Totrahedron Letters, 30: 1927). Usually cleaves peptides to 90% Trifluoroacetic acid, 4% thioanisole, 2% ethanedithiol, and 4% liquefaction Deprotected in phenol at room temperature for 2 hours.   However, the peptide N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His (SEQ ID NO: 2) was incubated with the crude tissue fraction If undesired carboxypeptider It was found to undergo digestive digestion. To weaken carboxypeptidase digestion, The following modified substrate was designed: N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala- Glu-Phe-Arg-NH2(SEQ ID NO: 7) and N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met -Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1).   This latter peptide allows carboxypeptidases even in the presence of crude tissue fractions. Peptidase profilin of Example 3 which is relatively insensitive to digestion It was used for the study. Using the further purified enzyme fraction, C-terminal alpha amide substrate (SEQ ID NO: 7) was used in the peptidase test of Example 9. HP of Example 3 below The LC protocol was used to monitor the degradation of either peptide.   Example 3. Measurement of peptidase activity in normal control and subfractions of AD brain.   (I) Incubation Aliquots of the column fractions described in Example 1 (20 μl) was incubated with 10 μl of reaction mixture to give the following component concentrations: Achieved the following results: cocktail relaxation containing 100 mM in each of Mes, Tris-HCl and acetate pH 6.5. N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-As in buffer p-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) (50 μM), captopril (300 μM).   Incubation with ion exchange fractionation was carried out at 37 ° C for 24 hours, followed by TF The reaction was terminated by adjusting the final concentration in A to 3% (v / v).   (Ii) HPLC determination of proteolytic products Two-component solvent supply, heating column con Complete with compartments and autoinjector Hewlet-Packard HP HPLC analysis was performed using 1090. In-line Gilson 121 type filter fluorometer (Excitation at 310-410 nm, emission at 480-520 nm) HPLC chem-station (DOS series) And data Fluorescence detection (post column) was performed with the appropriate software for analysis.   Guard an aliquot (usually 10 μl) of the above acidified incubation mixture Hypersil 5μM C18 column with C18 5μM guard (20 x 4.6mm) Ejected above (100 x 4.6 nm). 100 mM containing 27% (v / v) acetonitrile Equal separation was achieved with sodium acetate buffer pH 6.5. Synthetic peptide production Identification and comparison by movement of substances, its structure by PTC-amino acid analysis and FAB-MS Confirmed (see Table 2 below).   In addition, the retention times for some of the metabolites listed in Table 2 above varied during HPLC operation. N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg- It differs from that quoted in Example 2 due to the cleavage of His (SEQ ID NO: 2). example For example, tests that reflect the data listed in Table 2 include an HPLC column and a guard column in one row. It has a relatively long retention time because it was used to perform chromatography.   Analysis of synthetic product standards in equilibrium with experimental samples in all experiments The HPLC column was calibrated against daily changes in retention time of the enzymatic product. Individual ion exchange fractionation using HP CHEM station data acquisition software Data were collected on the proteolytic metabolite profile of.   Peak area under the curve and their retention time for each of the 6 cleavage products Save to a table file. EXCEL (in programming language C Move to (6xn) area array by using the custom utility I wrote (here , N = number of mono-Q fractions). Each row of the sequence contains a single peptidase from the Mono Q fraction. Shows the analysis. Insert zeros between each column of data to artificially establish the gradient of column values. Stand up.   SpyGlass takes this sequence and determines the Mono Q fraction, cleavage V and Convert to a three-dimensional surface whose area% is triaxial. Manually set in the SpyGlass program Limit the isolines according to the following criteria: Connect with the continuous region of the blot where 1.5% substrate conversion of was observed. Similarly, continuous etc. Value lines connect with 5%, 10%, 20%, 30%, 40% and 50% regions and also show substrate conversion It was The resulting contour plot shows the number of fractions on the ordinate and the peptide Brain Peptider with combined cut V on the abscissa and the amount of product produced by contour lines The map is shown.   Results of peptidase profiling of control and AD brain subfractions:   Figure 1 shows the control sequence further subfractionated by ion exchange chromatography. Was obtained for the cleavage of N-dansyl peptide substrate by AD P-2, S and M fractions. Figure 3 shows a comparison of different peptidase profiles. Sub-fractionation of control and AD brain by analysis A number of peptidase activities that are overall detergent-distinct can be identified.   For each assay (FIGS. 1a-f), the cleavage at each peptide bond was considered. The amount of active activity was reduced throughout the series: VK> KM> MD> SE> E-V. However, K-M and M-D cleavages do not add APP that causes C-100 production. Most interesting because of the great likelihood that it will indicate the site of water splitting. 1.6 minutes The metabolites recovered in Yields a substance with (rt), which allows for the oxidation of methionine to sulfoxide in the substrate. It seems to be due to. Metabolites produced at rt of 1.0 and 1.3 and 3.3 min are currently However, it has not been identified.   For KM cleavage, the spectral and peak activity of the enzyme with respect to control and AD The overall level of activity for P. was decreased throughout the series: P-2> S = M. this Is true for MD cleavage in AD, while it is true for control fractions. The order was S> P-2 = M.   The most abundant peptidase peaks found in AD (more than one contour The following numbers of unambiguously determined peptidases The peaks can be distinguished: P-2 3 KM peaks and 1 MD peak; M   3 KM peaks and 2 MD peaks; no SK-M peaks, 1 MD peak. Qualitative ratio between levels of more peaks between corresponding controls and AD The comparison revealed only one significant difference. The difference is in the microsome fraction Observed, in some cases control M profile contains single-MD product around fraction 75 However, in the AD profile, the same regions clearly contained doublets.   Because of possible mutations between peptidases in normal and diseased populations, controls There are few points that highlight the quantitative difference in peptidase levels between AD and AD.   In short, control and AD fractions at the level of oligopeptidase form It is not possible to ignore that there can be qualitative or significantly quantitative differences between But the overall profile is that there is only one obvious difference, peptidase More peaks of activity are apparent.   (Iii) Integration of peptidase activity into separate pools N-dansyl-Ile-S er-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1 ) P-2, based on the peptidase activity profile obtained with the substrate The column fractions from the ion exchange separation of the S and M fractions were combined in the adjacent pool. (12 pools for M, 13 pools for P-2, 14 pools for S) . Same region of the chromatographic profile for the AD and control fractions in each case Be careful of pooling and monitor the conductivity of each pool using a YSI35 conductivity meter. The accuracy of the process was inspected.   Fractions were kept at 4 ° C in the pool and stored at -70 ° C. Amicon Centriprep-10 membrane Was used to concentrate each peptidase. Prior to concentration, each Centriprep membrane was treated with 50 mM Tris-HC. l, washed in pH 7.5. Regarding peptidase pool containing a volume of 5 ml or more Used 15 ml Centriprep. Du Pont Sorval tabletop centrifugation of these pools It was concentrated on the machine at 2700 rpm for about 40 minutes. Pools containing less than 4 ml are 2 ml Centri Approximately 5000 rpm on Du Pont Sorval RC centrifuge (SS34 rotor) using prep Concentrated for 40 minutes.   After centrifugation, each concentrated pool was washed with an equal volume of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. Centrifuge The pool was maintained at 4 ° C during the detaching step and stored at -70 ° C. The pool is filled with conductivity (cond uctance) and final concentrated volume are listed in Table 3 below.   Example 4. Expression of recombinant APP 695   This example expresses holoAPP 695 and then purified as described in Example 7, Recombinant substrate for APP degradation assay as described in Examples 8-10 The method used as is described. Two approaches were used.   First, APP 695 was generated using the CHO cell expression system. This supply of APP as a substrate For experiments with the source, the mono-Q fractions from the purification of human brain P-2, S and M fractions were used. Initial activity assay to identify 6 different protease activities detectable in serial pools Included. These tests are described in Example 8.   Recombinant APP 695 was then obtained by expression using the baculovirus specific system. It was Due to the higher amount of APP 695 that resulted, it was abbreviated in Examples 9 and 10. More detailed tests have become possible and the identification of certain APP degrading enzymes has been achieved.   Both methods of expression are shown below:   Method 1: Chinese hamster ovary (CHO) cell line expressing holo-APP 695 development of   (I) Vector construction Known 2 of APP 695 cDNA from FC-4 (Kang et al., Supra). Packing a .36kb NruI / Spel fragment with a large fragment of E. coli DNA polymerase I Resulting in pMTI-5 (APP 695 under T3 promoter) KS Bluescript M13 + (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) in the Smal cloning site The blind end was inserted. Next, a novel optimal Kozak consensus DNA sequence was oligo-: PMT with 5'-CTCTAGAACTAGTGGGTCGACACGATGCTGCCCGGTTTG-3 '(SEQ ID NO: 8) It was made using site-directed mutagenesis to make I-39 (Kunkel et. Al. , 1987, Methods in Enzymology, 154: 367). Next, place this plasmid in the specific site Mutagenesis (Kunkel et al., Ibid.) To valine position 614. (The open reading frame is numbered according to Kang et al. (Id.)).   Full-length APP cDN containing an optimal Kozak consensus sequence and a Val to Glu mutation A is then excised from PMTI-39 by NotI and HindIII partial digests. 2.36kb  The APP 695 fragment was gel purified and NotI / HindIII cleaved pcNAINeo (Invitrogen Corp. , San Diego, CA) to make PMTI90, in which APP 695 expression is CM site. It occurs under the control of a promoter. Mutation of Val to Glu is a confirmed sequence and CHO cells are used to stably transform CHO cells.   (Ii) Generation of stable CHO cell line expressing APP 695 matenes. Chinese hamster egg for transfection with APP 695 construct Nest K-1 cells (ATCC CCL61) were used. APP 695 and neomycin drug resistant mer 20 μg of expression plasmid containing Ker was added to 1 × 10 5 in 0.5 ml of PBS.7In CHO cells, Electricity using the Bio-Rad Gene Apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) Transfected by perforation. Single pulse of 1200V with 25μf capacitance Was applied to the cells.   After electroporation, cells were incubated in ice for 10 minutes and harvested by centrifugation . 5x10 cell pellet in Alpha MEn, 10% fetal calf serumFourReincubate at a density of cells / ml Suspend and a 1 ml aliquot into each well of a 24-well tissue culture cluster plate Distributed. After incubation for 48 hours, 1 mg / ml Geneticin (GIBCO-BRL, Neomycin drug resistance marker by adding 1 ml of medium containing Grand Island, NY) -Containing cells are selected, the incubation is continued, and the medium containing the drug is added for 1 week. I changed twice in between.   Drug resistant cells were tested for APP 695 expression by Western blot. A Cells positive for PP 695 expression were cloned by limiting dilution and isolated into individual clones. Were isolated and examined for APP 695 expression. Claws positive for APP 695 expression Subcultured to produce APP 695 expressing cells on a large scale and subsequent recombinant protein Spread in roller bottles for isolation.   Method 2: Expression of recombinant holo-APP 695 using baculovirus-infected insect cells   (I) Construction of recombinant vector Baculovirus vector pVL1392 (Invit rogen) was cleaved with Xba I (in polylinker) and glu-isolated from pMTI-39 2.36 kb X Ligated with ba I fragment (APP 695 NruI / SpcI, T3 to Bluescript M13 SmaI site) Orientation, using new Kozak and XbaI sites for Smal / NruI plant fusion sites). This This results in pMTI 103: which was transformed into DH5α and selected on Amp, A lithium prep of plasmid DNA was made for transfection.   (Ii) Cells and viruses from the American Type Culture Collection (ATCC) Suspended culture of purchased Spodoptera frugiperda (Sf9) at 28 ℃ at 10% fetal calf TNMFH medium containing serum (Summers, M.D., and Smith, G.E., 1987, A Manual of Methods for Baculovi rus Vectors and Insect Cell Procedures, Bulletin no. 1555, Texas Agric ． Exp. Stn. and Texas A & M Univ., University Station, TX) It was Wild-type AcMNPV DNA was purchased from Invitrogen, SanDiego, CA.   (Iii) DNA transfection and plaque assay Calcium phosphate method (Summers et al., 1987, supra) using purified plasmid DNA (4 μg) and linear viral DNA (1 μg) By homologous recombination, the foreign DNA was inserted into the genome of AcMNPV at the polyhedrin locus. Inserted. The virus released by the transfected cells was treated with 2 rounds of virus. Purified by the Lark assay (Summer et al., 1987, ibid.), Recombinant virus was purified. It was identified by macroscopic screening for rihedrin negative plaques. Next time Production of APP in insect cells by Western blotting of recombinant virus culture Were screened for their ability to   (Iv) Recombinant protein production In TMNFH medium containing 10% fetal calf serum 1 x 10 as a suspension culture in6A 5 liter batch of Sf9 cells grown at cells / ml The cells were infected with the recombinant virus at a MOI of 1. Cells were harvested 24 hours after infection, Cell lysates were prepared for purification of recombinant proteins.   Example 5. For the production of recombinant C-100 standard by transient infection of mammalian cells Of expression vector   The C-100 peptide fragment extends from the N-terminus of A4 peptide to the C-terminus of full-length APP. It contains the C-terminal part of P (see background section above). C-100 fragment is A4 pepti Means the initial decomposition products that lead to the final formation of the crystals.   In one aspect of the invention, Hela S3 expressing recombinant C-100. Cell lysates from cells (ATCC CCL 2.2) were incubated in the brain fraction. Equilibrium with the recombinant APP sample was analyzed by immunoblot assay and analyzed by mono-Q chromatography. It was subfractionated by chromatography (see Example 3). Migration and detection of C-100 fragments Is a pathogenic protease as well as a positive control for immunodetection of C-terminal APP fragments. Serves as a size marker for the generation of substances produced by.   A comparison of the size of the enzymatically produced material with the size of the C-100 fragment is performed enzymatically. The fragment formed is near the N-terminus of the A4 peptide or catalyzed by secretase. Provide insights on whether or not to benefit from cutting within the A4 segment as You can   (I) Plasmid Construction Plasmids for C-100 expression using two methods. Was made. Each plasmid is separately identified as PMTI73 or PMTI100.   PMTI73 construction: A commercially available plasmid PUC-19 was digested with EcoRI to form its polylinker. Restricted. Commercially available PWE16 was then inserted into digested PUC19 to make PMTI2300. PM TI2301 is PMTI after BamHI / HindIII digestion with oligonucleotide adapter Got from 2300. The EcoRI promoter fragment of APP was added to the Hind of PMTI2301 by blind ligation. Insertion into the III site generated PMTI2307.   The BamHI fragment from PC-4 (Kang et al., Supra) was ligated into the BamHI site of PMTI2307 to PM. Generated TI2311. Insert the XhoI fragment from FC-4 into the XhoI part of PnTI2311 to Produced TI2312. From EcoRI genomic clone of mouse metal thionine-1 gene By inserting the 2.2 kb BglII / EcoRI fragment of PMTI23 into the ClaI site of PMTI2312. Made 2323. To generate the microgene PMTI2337, KpnI and BglI of PMTI2323 By deleting the sequence between the I sites, the synthetic oligonucleotide adapter sp-space was deleted. Clones were ligated using Sir-4.   PMTI2337 is cut with BamHI / SpcI and the fragment is Bluescript KS (1) (Stratagene) Was ligated into the BamHI / XbaI restriction site to generate PMTI2371. PMTI2371 to HindIII Cleave with / NotI to release a 0.7 kb fragment encoding the terminal 100 amino acids of APP695 It was The insert was ligated into the HindIII / NotI sites of pcDNAINEO (Invitrogen Corp.). The plasmid PMTI73 was constructed.   PMTI 100 built: PMTI90 (see Example 4, Method 1) was digested with XbaI / HindIII Also released a 0.6 kb fragment encoding the terminal 100 amino acids of APP695, which was PMTI100 was made by ligating to the XbaI / HindIII site of DNAINEO. Vector in each case The inserts and plasmids were purified by methods known to those skilled in the art.   (Ii) Transfection and expression of C-100 fragment 6 well coaster 5 x 10 clusters (3.5 cm diameter) in each wellFive24 cells of Hela Sl cells used Start preparation for small-scale expression of C-100 standard by seeding before time did.   A sufficient amount of vaccinia virus VTE7-3 was trypsinized and treated with 20 platters. Equivalent amount of crude depleted stock and 0.25 mg / ml bird that infects spore-forming units / cells. The psin was mixed and then stirred vigorously. Trypsinized virus at 10 minute intervals Incubated for 30 minutes at 37 ° C with agitation. If agglomerates remain, the ink The incubation mixture was cooled to 0 ° C. and sonicated in a sonicated water bath for 30 seconds. The cooling sonication was repeated until no aggregates were detected.   Each well containing Hela S1 cells is serum-free enough to have 0.5 ml of virus The trypsinized virus was diluted with DMEM. Aspirate the medium and then wash the cells. The virus was infected for 30 minutes and shaken at 10 minute intervals to stir the virus.   Approximately 5 minutes before the end of infection, add fresh transfection mixture. Prepared as follows: 0.015 ml of Lipofectin reagent (Bethe sda Research Labs, Gaithersburg, MD) with OPTIMUM (Be thesda Research Labs, Gaithersburg, MD) and mixed gently. Agitated chopsticks There wasn't. Then 3 μg of CsCl purified DNA was added and mixed gently.   Aspirate virus mixture from cells, then introduce transfection solution did. The resulting mixture was incubated at 37 ° C for 3 hours. Then each well Cover with 1 ml of OPTIMUM, CO2Incubate overnight at 37 ° C in an incubator did.   Cells were harvested 20 hours after transfection by centrifugation and 1% Triton X -100, 10 μg / ml BPTI, 10 μg / ml leupeptin, 200 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, Lysis buffer 0.2m containing 1mM EDTA and adjusted to pH 7.5 Lysates were prepared on ice by adding l. Monitor complete lysis with a light microscope , Harvested immediately. Dissolution occurred completely in less than 1 minute and the delay at this stage was gelatinous. It caused the lysis of nuclei giving rise to a lump.   Recombinant lysates were stored at -20 ° C for later use. Preferably, recombination Body lysates were (3x) SDS-PAGE lacking 2-mercaptoethanol before freezing. It should be diluted 1:50 in sample buffer.   PMTI73 or PMTI100 using SDS-PAGE / immunoblot with APP C-terminal antibody A comparison of the size of the proteins produced by the expression by H. . Studies have shown that PMTI100 directs the expression of a single immune response zone, while PMTI73 shows small molecule support. It was shown to be directed to the expression of two major zones of Iz. Even a medium-sized weak belt, It was apparent in PMTI73 when applied to gels in high amounts (FIGS. 2a-2d).   Large amounts of PMTI100 protein applied to SDS-PAGE gels yielded a series of A hazy strip (eg, Figure 2d) appears. Outstanding Mr 11.7kDa C-100 monomer In addition to strong bands, vague bands with Mr25.5kDa, 35kDa and 45kDa were observed, This contributes to dimer, trimer and tetramer aggregates of C-100 monomer, respectively. . Another faint strip of Mr 18.9kDa is also observed. Similar phenomena are found in the literature with similar solutions. It has been reported by Buddha (Dyrks et al., 1988, EMBO J., 7; 949).   The largest three bands produced by PMTI73 are the single bands observed for PMTI100. It was slightly larger than the obi. The largest band from PMTI73 expression is the first single peptide sequence. C-100, which is cleaved from the phase-translating material and contains five extra amino acids at the N-terminus Produced fragments.   Example 6. Generation of immunochemical reagents   Three different immunochemical reagents were used in the tests of the invention.   (I) A rabbit polyclonal antiserum recognizing the C-terminal of APP was obtained, and Produced by proteolytic processing according to the assay conditions described in Used for immunoblot detection of C-terminal APP fragment.   (Ii) Prepare an affinity-purified antibody that recognizes the C-terminal of APP and Immunoaffinity for affinity purification of APP expressed in virus-specific systems Used to synthesize a tea column (see Example 7).   (Iii) Mouse monoclonal that recognizes the N-terminus of beta amyloid peptide C-terminal APP produced by proteolytic digestion of holo-APP695, which produces antibodies To determine whether the fragment contains the full length beta amyloid peptide, immuno Used in blot assays (see Examples 9 and 10 for specific applications).   The method of producing each of the three immunochemicals is shown below:   (I) Rabbit polyclonal antiserum against C-terminal of APP   Extracting antiserum into the C-terminal domain of human APP695, Buxbaum et al. (1990, Proc ． Natl. Acad. Sci., 87: 6003). APP 695 COOH end Synthetic peptide corresponding to the end region (hereinafter referred to as “β APP 645-694”) is Yale Univ. Obtained from ersity, Protein and Nucleic Acid Chemistry Facility, New Haven, CT It was   Immunize rabbits with β APP 645-694 to elicit polyclonal antibodies did. Large intestine expressing a fusion protein containing amino acids 19-695 of human APP695 Sera were screened by immunoblot analysis of lysates of E. coli. set Sera that are immunoreactive to the recombinant fusion protein are serially transferred in vitro ( Kit purchased from Stratagene, La Jolla, CA) and translation (Promega Corp., Mad from β APP 645-694 cDNA by reticulocyte lysis kit purchased from ison, WI) Produced [36S] Further on immunoprecipitation activity against methionine-labeled APP695 Screened.   (Ii) Polyclonal antibody affinity column for purification of holo-APP   Purification of synthetic APP C-terminal peptide immunogen: APP having a cysteine residue at the N-terminal 80-90 mg of the crude synthetic peptide (P-142) extending to the C-terminus of (649-695) was subjected to HPLC. It was further purified (yield 42%; 34 mg). Amino acid analysis, N-terminal sequence analysis and flight mass Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrome The try is a mixture of purified peptides (1/2 with a truncated peptide at the N-terminus). (Full length / shear).   Immunization of rabbits with purified P-142 immunogen: HPLC purified peptide APP (649-695 ) Was used to immunize rabbits. Each of the two rabbits is a complete Freund Ajuba. 125 μg of peptide in each fraction, followed by the same amount in incomplete Freund's adjuvant By enhancing the peptide of Initial tests were performed at 3-week intervals. Collected 14 blood samples during 9 months, 16-32 weeks The optimum production of Ab was observed with respect to the blood sampling of (using vaccinia C-100 and CHO APP. Western analysis showed). Blood collection for this period should be approximately 90-100 ml of antiserum. Pooled for the amount of.   Preparation of immunized APP 649-695 affinity matrix for purification of antisera : 9.7 mg of purified peptide using Pierce Imject activated immunogen conjugation kit with BSA Peptide APP (649-695) was coupled with maleimide activated BSA. Measured with Ellman's reagent Then, about 40% of the peptide (3.88 mg) bound to BSA. BSA-binding peptide Separated from unbound peptide by filtration (purification buffer from kit = 83 mM NaH2 POFour pH 7.2; 900 mM NaCl). Pooling ineffective volume from gel filtration column (2.9 mg P -142 conjugated with BSA / 12.5 ml) bound to 1 g (3.5 ml) CNBr activated sepharose (> 90% peptide conjugate bound by standard Pharmacia protocol). The remaining site was blocked with ethanolamine. Sepharose affinity matri The box was packaged in a 1.0 x 3.5 cm glass column.   Rabbit polyclonal antibody using APP (649-695) affinity column Refining : Pooled pooled combined rabbit antisera from blood collection for optimal Ab production (100 ml / 3.9 g). Protein), washing buffer (100 mM NaHCO3 pH 8.3; 750mn NaCl) 1: 1 (v / v) ) Diluted and loaded onto a peptide affinity column at 1.0 ml / min at 4 ° C. After loading (200 ml), wash the column with wash buffer (75 ml) until A280 returns to 0. IgG was eluted with 100 mM glycine pH 2.5 (40 ml). Fraction of 1 fraction was added to 100 μl of 1.0M Tr Collected in a test tube containing is-HCl pH 8.0. Pool the neutralized low pH IgG eluates (34 m l; 14.7mg), 1.0 liter of 100mM NaHCO3 pH8.3; permeation at 4 ℃ against 500mM NaCl Was analyzed.   Preparation of immunoaffinity column: Purified rabbit IgG and Sepharose Sepharo binding with se   5.0 g of CnBr Sepharose was added to 50 ml of binding buffer (100 mM NaHCO 33 pH 8.3 500 mM NaCl), dialyzed IgG pool on orbitron at 4 ° C for 21 hours Mixed with. After binding, the resin is passed through an immersion glass filter once with binding buffer, Then 100 ml of blocking buffer (100 mM NaHCO 33 pH 8.3: 500 mM NaCl; 1.0 M ethanol Amine) and washed 3 times. Binding buffer (100 ml), then low pH buffer (100 mM NaO Ac pH4.0; 500 mM NaCl) in two consecutive intermediate washing steps, as well as binding buffer A final wash with (100 ml) completes the resin preparation. Bonded trees with a total volume of 17.5 ml It was found in 87% of the fat (0.727 mg IgG / ml resin).   (Iii) Generation of monoclonal antibody against beta-amyloid peptide and Pitope mapping   Hybridoma method    Multiple injections of a mixture of the following two synthetic peptides Balb / c mice were immunized with: 1) h containing beta-amyloid Amino acids 597 to 638 of APP695 (numbering according to Kang et al., Ibid.), And 2) APP 295 amino acids 645-695 containing the C-terminal domain. Standard method (Herzenberg et al., 1978 ,: D.M.Weir (Ed-), Handbook of Experimental Immunology, pp 25. 1-25.7, Blackwell Scientific Publicatins, Oxford, UK) Splenoytes from E.coli were fused with X63 / Ag8.653 mouse myeloma cells. as a result The supernatant from the resulting hybrid was microtitered with beta-amyloid peptide immunogen. Hive for the presence of anti-peptide specific antibody using EIA bound to plate I tested the lid. Secretes antibodies that react with synthetic peptides used as immunogens The cultures were cloned twice by limiting dilution and their isotypes described (Wu nderlin et al_, 1992, J_ of Immunol. Method s, 147: 1) as determined. Secreted IgG was used up in protein A Serum-free cloned hybridoma cells by finity chromatography Purified from the contained fermentation broth.   Epitope mapping    C286.8, one of the anti-peptide monoclonal antibodies IgG 2b, called A, is a synthetic beta-amyloid by EIA and immunoblot assays. It showed good reactivity with the id peptide. Epitope reactivity of monoclonal , Measured using competitive EIA. Amino acids 597-612, 597-624, 597- of human APP695 Contains 638, 608-624, 621-631 and 645-695 (numbering by Kang et al.) Synthetic peptide, and N-dansyl-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Gl u-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) was named as APP597-638 of C286.8A. Was tested for its ability to block binding.   Peptides recognized by the antibody can be isolated by preincubation with the antibody in solution. , Useful for subsequent reaction with beta amyloid that binds to the microtiter plate Solution concentration of various antibodies. The results of such an experiment are shown in FIG. It will be described later in the book.   Peptides APP597-612, 597-624, 597-638 and N-dansyl-Ile-Ser-Glu-V Only al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1) , Was able to inhibit C286.8A binding in a dose dependent manner. These peptides are Contains amino acids 1-16, 1-28, 1-42 and 1-7 of the beta amyloid sequence (Numbering from N-terminal aspartic acid residue). Any beta amyloid Columns lacking, for example APP 649-695, or beta amyloid peptide sequence 12-28 or 2 Peptides containing 5-35 (APP608-624 and APP621-631, respectively) were It did not inhibit the binding of the lonal antibody to the homologous antigen. These results are Anti-clonal antibody The responsive epitope is at least in part in the A4 region of human APP, that is, at the top of APP597-601. It is shown to be present in the first 7 amino acids. Example 7. Purification of recombinant holo-APP695   The first test of APP C-terminal processing was CHO as described in Example 4 above. Performed with recombinant APP695 expressed in cells and then as in method 1 below Purified. A characterization test using this substrate is described in Example 8 below, and this test Depending on the 6 different possible C-terminal processing APP degrading enzyme has been identified.   Then the baculovirus expression system was grown (see Example 4) and the CHO expression system was reached. Got a higher level APP than you can achieve. Holo-A derived from baculovirus system Purification of PP695 is described in Method 2 below. Purified holo-A from baculovirus PP695 was used to perform the protease characterization tests described in Examples 9 and 10 below. did.   Unless otherwise noted, all steps were performed at 0-4 ° C. Holo-app 695 Detection was carried out using anti-human APP695 C-terminal antibody, as described in Example 8 below. Used by immunoblot analysis. Method 1. Purification of holo-APP695 from stably transfected CHO cells (A) Isolation of plasma membrane. Whole cell pellets obtained by continuous CHO cell culture in roller bottles. Lett (179 g) (see Example 4) was collected by centrifugation (1500 g x 5 minutes) and salted. Sodium chloride (30 mM), magnesium chloride (1 mM), EDTA (10 mM), PMSF (200 μg / ml), E-64 (42 μg / ml) and pepstatin (3.8 μg / ml) Was resuspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to a total volume of 600 ml. The cells were homogenized using a Teflon potter (10 return steps). , Followed by 41% sucrose, a protease inhibitor EDTA, PMSF, E- Layer in 10 ml of homogenization buffer without 64 and pepstatin Separated (25 ml / centrifuge tube). Centrifuge in a Beckman SW-28 rotor (26,8 00RPM x 60 minutes), then carefully remove the middle layer (total volume about 150ml), Dilute with the same volume of homogenization buffer (excluding protease inhibitors) Resuspend using a Teflon potter (3 return strokes), then Centrifugation again as above gave a solid pellet. Skim The liquid was decanted, then the pellet was resuspended in 5 mM Tris-HCl pH 8.0 to a total volume of 100. It was set to ml (Teflon potter, 3 return strokes). Centrifuge again (Beckman 50,000 RPM x 60 minutes in 70 Ti rotor) and pellets 50 mM Tris HCl, pH 8.0 Resuspended in to a total volume of 57 ml. (B) Solubilization of plasma membrane. Add 37 ml of each of the resuspended CHO plasma membrane preparations described above. Sequentially add a mixture of 20% (v / v) Triton X-100 of the theatase inhibitor and the stock solution. In the homogenization buffer described above (total solubilization volume 45 ml), add Concentration: EDTA (1 mM), E-64 (24 μg / ml), PMSF (53 μg / ml), Pepster Tin A (11 μg / ml) and Triton X-100 (finally 2.2% v / v). The mixture was shaken gently at 4 ° C for 30 minutes, then the unsolubilized material was centrifuged. (50,000 RPM for 40 minutes in a Beckman 70 Ti rotor). Solubilized holo The supernatant containing APP was filtered through a 0.45 μM disc filter. (C) Purification of solubilized APP695 by strong anion exchange chromatography. Holo -The above supernatant containing APP695 was diluted with an equal volume of distilled water to give 0.1% Triton X Mono-Q HR 10/1 pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing -100 Added to column 0. load Then, a linear gradient containing 0-1M NaCl in a total volume of 210 ml of equilibration buffer. The column was eluted. The flow rate was maintained at 3 ml / min at the end. Transmission of 17-22mmho (4 ℃) Proteins eluting within the conductivity range contained most of the immunoreactive APP695. 5 mM Tris-HCl pH8.0 containing 0.025% Triton X-100 in total. Dialyzed against 2 liters of the solution for 4 hours and then centrifuged (26,80 in Beckman SW 28 rotor. It was clarified with 0 RPM x 60 min) to remove slight turbidity. (D) Heparin agarose chromatography. Add the above clarified sample to dialysis buffer. It was added to a column of pre-equilibrated heparin agarose (15 x 1.6 cm). Under load , A light brown band was formed in the top 1/3 of the column. 5 minutes each after loading Fractions were collected (flow ended at 1 ml / min). The column should be filled with sodium chloride. With 85 ml of equilibration buffer whose final concentration was continuously adjusted to 0, 150, 300, 600 and 2000 mM. Elute stepwise. Most of the immunodetectable holo-APP Was eluted at 600 mM NaCl and the next quantitative fraction was collected at 300 mM. 300mM and 600mM N APP recovered with aCl was collected separately and stored separately at -80 ° C. Used in the following tests The APP used is the APP derived from the 300 mM NaCl fraction. 300 mM heparin agaro The yield of partially pure APP from the glucose eluate was 5. per gram of wet CHO cell pellet. It was 5 μg (Bradford assay). APP in this standard is based on SDS PAGE Purity was determined to be approximately 25% based on analysis. Method 2. Holo-AP from insect cells infected with recombinant baculovirus Purification of P695 (A) Solubilization of cell pellet. Cell pellets harvested from two 5 L fermentation experiments (Total weight of 8.9 g detectable protein) containing the following inhibitors: Putatin A (25 μg / ml); Leupep Chin (25 μg / ml) Chymostatin (25 μg / ml); Antipain (25 μg / ml) Aprotinin (25 μg / ml); benzamidine (4 mg / ml); PMSF (0.87 mg / ml) ml) and 160 ml of 0.32 M sucrose containing EDTA (25 mM) and then the Homogenized with Fron Potter (10 return strokes). That homology The nate was centrifuged (105,000 g for 1 hour in a Beckman 70 Ti rotor) to obtain The resulting pellet was treated with 0.5 M NaCl and the same inhibitor as previously described at the same concentration. Teflon potter (1 ml) in 160 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing Resuspension was performed using 0 return strokes). After light sonication (Brans on Sonifier Cell, 2 minutes, power level 4), Triton X-100 final concentration 5 % (V / v), then the suspension was stirred slowly at 4 ° C. for 20 minutes. So The mixture was subjected to centrifugation (50,000 RPM, 60 minutes in a Beckman Ti 70 rotor), Then, the first supernatant liquid (574 mg of the sample) to be subjected to heparin agarose chromatography. Carefully extracted. Pellet the pellet with 0.5 M NaCl and To 160 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing the inhibitor at the above concentration, It was resuspended using a front potter (20 return strokes). as mentioned above, Solubilized with 5% (v / v) Triton X-100 and then centrifuged to a second solubilization A clear liquid (683 mg of protein) was obtained. (B) Radial flow chromatography of heparin-agarose. In (a) above Both of the resulting supernatants were separately purified on heparin agarose as follows. . These supernatants were diluted by adding purified water and 1M Tris pH 9.5 to make the volume 3.5 L. , Conductance to 1.8mmho and pH to 8.0, 250ml of packed resin And 5 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 0.1% Triton X-100. Injection into an equilibrated Superflow 250 column (Sepragen) did. After loading, the column was washed with 3 L of equilibration buffer, then 600 mM NaCl Elution with equilibration buffer containing A flow rate of 30 ml / min was used throughout . Fractions of 45 ml were monitored for total protein at A280 nm (Bradford Assay), levels of immunoreactive APP against anti-APP C-terminal antiserum of Example 6i) Immunoblotting. Fractions containing significant APP were combined to give antibody affinity. Subjected to Nity chromatography. (C) Antibody affinity chromatography. First supernatant liquid (276 mg of tamper (Containing protein) and the second supernatant (containing 113 mg of protein) with heparin The pools, purified on agarose and eluted with 600 mM NaCl, were combined to adjust the pH to 8.3. , And then affiie bound to Sepharose as described in Example 6ii). Contains Nity purified C-terminal antibody and contains 500 mM NaCl, 0.1% Triton X-100. Antibody Affinity Pre-Equilibrated with 100 mM Sodium Bicarbonate Buffer pH 8.3 Column (10.5 x 1.5 cm). Chromatography is 1 ml throughout It was carried out at a flow rate of / min. After loading, wash the column with 70 ml of equilibration buffer, then Was eluted with 50 ml of 100 mM glycine pH 2.4 containing 0.1% Triton X-100. 5 ml fractions were collected and placed in 0.5 ml of 1M Tris-HCl (pH 8.0), and the A250nm For total protein (Bradford assay) and immunized as described above. Detectable APP detected. Fractions containing significant APP were combined. This combined hepa The phosphorus agarose eluate was subjected to the affinity purification method 5 times in total. Each of the continuous purification The total amount of APP was 9 mg when the pools of APP recovered from the process were combined. (D) Strong anion exchange chromatography. Antibody affinity chromatography 0.025% (volume / volume) of Triton X from the combined fraction (9.0 mg of protein) from PH 8.0 with 100 and 150 mM NaCl Applied to a Mono-QHR 5/5 column pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer. It was Once loaded, the column was loaded with a linear 0.15-1M NaCl gradient in a total of 70 ml. It was eluted. A flow rate of 0.5 ml / min was used throughout. Significant and immunodetectable A Combine the eluted fractions containing PP and store in alute at -80 ° C until use. It was The final APP preparation is SDS-PAGE developed with Coomassie Brilliant Blue. Have a purity of more than 95% based on the theoretical composition and 86% agreement One amino acid composition was shown and the following N-terminal sequences were shown for the mature protein: Leu-Glu-Val-Pro-Thr-Asp-Gly-Asn-Gly-Leu-Peret from two 5L fermentation runs 5.6 mg of purified protein was obtained from the yeast.   Amino acid analysis was performed essentially as described in other literature (Dupo nt, D.R., Keim, P.S., Chui, A.H., Bello, R. Bozzini, M. And Wilson, K.J. , "Extensive approaches to amino acid analysis", Techniques in Protein Chemis In try, edit: Tony E. Hugli, Academic Press, 284-294 (1989)). 2 hours 160 Test with 6N hydrochloric acid with 2.0% phenol at ℃ under argon in vapor phase. The material was hydrolyzed. Online type 130A separation system and 2600 for Nelson analysis Using Applied Chromatography Software, Applied Biosystems Model 420A Delivers Phenylthiocarbamoyl-amino acid analysis on the Derivitizer I did.   Example 8. For the detection of APP695 degradation catalyzed by human brain protease subfractions Immunoblot assay (A) Incubation with the substrate APP (I) Addition of the required amount of 2M storage buffer to remove the maximum amount of MES buffer at pH 6.5. Using recombinant human APP695 (10.75 μl) adjusted to final 140 mM, 37 ° C. 24 hours, (as described in Example 1 5 of the ion exchange fractions or concentrated fraction pools (Example 3) obtained from the cage stage Incubate μl allot. Final buffer concentration during incubation The degree was 95 mM, pH 6.5. During the incubation period, some taps of APP695 Degradation by protein degradation occurs, producing lower Mr fragments. (Ii) 36% (vol / vol) glycerol and 12% (vol / vol) SDS, 10% (Volume / volume) 2-mercaptoethanol and trace amount of bromophenol blue 3x Laemlie SD such as 1.5M Tris HCl, pH 8.45 with tracking dye Terminate the proteolytic reaction by adding 7.5 μl of S-PAGE sample buffer Let The sample was heated (100 ° C x 87 minutes) and then allowed to cool. (B) SDS PAGE analysis:   For the wells of a 10-20% acrylamide gradient Tricine gel, the reaction mixture ( 15 μl) was applied (on a daily basis, a 15-well Novex precast gel with a thickness of 1.0 mm) , Novex Experimental Technology, San Diego, CA). Gel under constant voltage conditions Then, the sample was run at 50 V until it entered the gel, at which time the voltage was adjusted to 10 It was raised to 0V. The tracking dye is within 0.5 cm from the bottom of the gel When reached, electrophoresis was discontinued. Pre-stained with Mr within the range of 3 to 195 kDa Using the labeled Mr (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) , The gel was calibrated. Kits containing high and low molecular weight labels, 10 microliters each Mix each with 10 μl of 3x sample buffer as described in paragraph (a) (ii) Treated as follows. Pre-stained labels include the following molecular weight labeling tags in the kit: Proteins were present: myosin heavy chain (196 kDa); phosphorylase B (106 kDa) ); Bovine serum albumin (71 kDa); Ovalbumin (45.3 kDa); Carbonic anhydrase ( 29.1kDa); beta-lactoglobulin ( 18.1kDa); lysozyme (14.4kDa); bovine trypsin inhibitor (5.8kDa); and Insulin A and B chains (3 KDa). (C) immunoblotting, (I) The gel was then loaded onto a small trans-blot electrophoresis cell (Biorad labs, Richmon d, CA). PH containing 150 mM glycine and 20% (v / v) methanol pH 8. Using transfer buffer kept at 4 ° C, such as 5 of 20 mM Tris-HCl buffer , 100 V (constant) for 1 hour ProBlott (TM) membrane (Applied Biosystems. Foster City , CA) and electroblotted the proteins. (Ii) Take out the ProBlott membrane and add 10 mM Tris-HCl buffer at pH 8.0 containing 150 mM NaCl. 1 hour in a 15 ml blocking buffer of 5% (weight / volume) skim milk powder in the liquid It was left at room temperature for a while. (D) Immunodetection of APP and C-terminal degradation products:   Rabbit polychrome elicited against a synthetic human APP695C-terminal peptide immunogen Transfer the membrane to 15 ml of blocking buffer containing 1: 1000 dilution of null antiserum and overnight at 4 ° C. Incubated.   Membrane with 15 ml volume of blocking buffer for 3 consecutive times with gentle shaking for 5 minutes. Washed away. Next, goat anti-coupling coupled with alkaline hofhatase. 15 ml of 1: 1000 dilution of heron IgG (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) Membranes were transferred to blocking buffer and incubated for 90 minutes at room temperature. Then relax for 10 minutes While gently shaking the membrane, use the blocking buffer with a volume of 15 ml three times in succession. Washed away.   Then 100 mM NaCl and 5 mM MgCl 22Containing 100 mM Tris HCl at pH 9.5. Membranes were prepared using Lucali phosphatase buffer in 15 ml volumes for 5 minutes each in triplicate. Was washed. Next, 100 mM NaCl and 5 mM MgCl2And 50 μl of BCIP substrate (50 mg / ml, Promega, Madison, WI) and 99 μl NBT substrate (50 mg / ml, Promega) at 100 mM Tris pH 9.5. The gel was incubated in the dark with 15 ml of HCl. Low Mr Immunoreactive Van Incubation is continued until there is no apparent (Typically 3 hours at room temperature). The gel was then rinsed with deionized water and dried . Fractionated human AD cortical mono-Q plaques that enzymatically cleave APP695 to generate C-terminal fragments. Analysis   Each of the P-2, S and m pools described in Example 3 was immunoblotted as described above. Subjected to assay. Of immunogen detection methods combined with the use of authentic APP substrate molecules Specificity is a relatively crude, which avoids the need to use highly purified enzyme preparations. To provide a selective method for detecting the activity of APP degrading enzymes in biological extracts of . Thus, some of the partially purified pools have a C-terminal in a time-dependent manner. It had proteolytic activity capable of forming APP fragments. Immunoblot of human AD brain Typical examples of analysis are P-2V (panel a), M III (panel b) and SI (panel). Individual images before the pool of P-2VII pool (panel d). Minutes are shown in FIG.   For the pool M III, the time course, eg as depicted in FIG. 2f. Experiments showed that at time 0 these fragments were not present in the substrate or enzyme fractions. Indicated. Moreover, incubation of the substrates alone did not form them (eg See, for example, Figure 2a, Lane 2, Figure 2d, Lane 2, Figure 2f, Lane 8. thing). The band size range depends on the enzyme fraction and the Mr is approximately 11.5 kDa to 25kDa. It varied between Da, but the number of different products formed in the reaction was surprisingly low It was. Eight out of a total of 39 AD pools have such activity at pH 6.5 Was discovered. Pool i) brain Subfractions, ii) ionic strength of column elution, and iii) qualitative APP cleavage patterns Could be distinguished from each other based on.   Six selected pools (“M-III, M-VIII, S-I, S-III, P-2V, And P-2VII ") was found to have significant APP degrading activity. . The corresponding control brain pool also contained some of the above activities, but the level of activity It was not possible to determine whether the difference between the control pool and the AD pool . Each of the above 6 pools has an enzymatic activity capable of forming a C-terminal fragment of 11 kDa APP. did.   The proteolytic product with an MR of 11.5 kDa was of particular interest. Why Et al., In further studies, it is usually the major immunodetectable C-terminal generation. And starts with the n-terminal aspartate of the beta-amyloid peptide Open readin that extends to the C-terminus of the full-length molecule (C-100 fragment) Was it found to co-migrate with the recombinant C-terminal fragment of APP that consists of a glam frame? It is. This co-migration is illustrated in Figure 2d. This means that the 11.5 kDa bandwidth Is an internal proteolysis product of APP at or near the N-terminus of the A4 region. And the aforementioned protease activity capable of forming this fragment is amyloid To play an in-vivo role in the development of developmental peptides .   Figure 2d shows APP proteolysis in at least P2 pool VII. The 11.5 kDa C-terminal enzyme product is shown to be capable of aggregation. PMTI100 Of the peptides in the Mr11.5kDa and 18kDa fragments that co-migrate with the C-100 standard. In addition to the appearance of bands, other bands appear at Mr 24.3, 27.4 and 35.5 kDa. 2 The 4.3 and 35.5 kDa bands are the dimer and trimer of the C-100 fragment, respectively. Has the expected Mr of, and is due to aggregation C Almost co-migrated with the corresponding faint band at -100 (see details for implementation See Example 5).   Figures 2a-2c also test the action of classical protease inhibitors. To help show that this assay can be used to: For example, Figure 2a As can be seen from the figure, P-2V is partially inhibited by methanol and meta It is completely inhibited by the nodal pepstatin A, but is inhibited by M-III (Figure 2b) And S-I (Fig. 2c) are completely inhibited by aprotinin and cysteine. To be done. Thus, this assay, in one embodiment, is a novel APP degrading enzyme. Applied to the search for various in vitro inhibitors. Of the potency identified by this A compound is administered in an appropriate animal model, such as APP or its beta-amyloid. Use transgenic animals designed to overexpress the containing fragment Then, the in vivo efficacy is tested.   Table 4 below shows the size of the peptide product, the apparent pH dependence of product formation. And the action of commercially available protease inhibitors. Some of the six major pool properties of APP degrading activity recovered from the No-Q fraction To summarize.   Some of the activities have optimum pH in the alkaline range, and lysosomal caps It did not seem to be due to the action of Tepsin. This observation makes sense. What If so, some researchers say that the processing of pathological APP is endosome- It was reported to be carried out by proteases within the lysosomal pathway (Ca taldo et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3861; Benowitz et al., 1989, E. xperimental Neurology, 106: 37; Cole et al., 1989, Neurochem. Res. 14: 933) . Enzymes within this pathway would be expected to show an active pH optimum.   Based on available data, M-III and SI are all listed criteria Cross-contamination of the same enzyme in each of the S and M fractions, which is more highly similar to Represents Therefore, human activity degraded APP to yield a 11.5 kDa C-100-like product fragment. May contain a minimum of 5 different protease activities that can occur .   As Table 4 shows, some of the activity depends on any of the inhibitors tested. Insensitive to inhibition, and these enzymes recruit members of the abnormal group Can be represented. For the formation of the 11.5 kDa C-100 fragment in M-III and SI The activity involved may be of the serine or cysteine type, or of an abnormal group Represents a member. Alternatively, these fractions contain both serine and cysteine It can contain thease and both enzymes are absolute (in the production of C-100 Play a role). P2V is aspartic acid P2VII containing both Rotase and Serine protease activity It contains serine protease activity based on its sensitivity towards. However, In subsequent studies, pepstatin-inhibitable activity was observed and is shown in Table 4. Colocalization of aspartic protease in P2 with serine protease activity Was shown. Ins that were tested for either enzyme activity in S III or M VIII It was not sensitive to any of the inhibitors. In either case, the actual A pool of enzyme pools using the N-dansyl peptide substrate used in Example 3 We could not prove that the inhibition of APP degradation by incubation was prevented.   APP activity (Example 8) and peptidase activity of mono-Q pool (Example 3 and Comparing the recoveries of Figure 1) there is little correlation between the two activities Is clearly shown. Thus, APP degrading activity is relatively peptidase active. It was mostly contained in the pool, which is not shown. APP minutes as this suggests Delytic activity is poor peptidase, and folded intact for activity Peptides that may require an APP substrate, or selected peptides, may Represents the wrong location for processing (but unlikely). Also kawaka Notably, this finding was commonly found by other researchers using peptide substrate-based assays. The reason for the unsuccessful identification of the APP degrading enzyme is explained.   From the above considerations, the assay of the present invention allows the isolation of specific APP degrading enzymes from human brain. It is concluded that it has sufficient specificity to enable.   In a further study, we would like to investigate the recovery of P-2VII-related APPases. We used the Munoblot assay. Research was concentrated in this pool. Because it is characterized by 6 C-terminal fragment that represents the highest abundance of active activity and appears to be amyloid-like Because it occurred. It is mainly recoverable from ion exchange separation of P-2 subfractions. A point in the gradient that represents the activity of interest and does not coincide with the main peak of peptidase activity Is eluted at.   Pool P-2VII fractions displaying APPase, and two in-line Sparrows For size exclusion chromatography on a Superose 12 column (Pharmacia) I did. Peptidase and APPase in the eluted fractions were analyzed (Fig. 3a). ). Although the KM cleavage activity appeared to partially overlap, the MM cleavage activity Kurk again did not coincide with the APPase peak. Markers of known molecular weight Chromatographic calibration for the P-2VII fraction was based on APPase activity. This resulted in an apparent median Mr of 31.6 KDa with an uncertainty of ± 6.5 kDa (3rd (Fig. b). Example 9 Identification of cathepsin D as an APPC-terminal processing enzyme   A baculovirus expression system as described in Example 4, Method 2, and Example 7, A larger amount of holo-APP695 was obtained by using the purification system of Method 2. Of the APP-degrading enzyme in the pool of fractions made based on peptidase activity. Rather than assess the content (as done in Example 8), The recovery of APP-degrading enzymes in individual column fractions from purification can be followed It became so.   The individual mono-Q fractions from the purification of the solubilized P-2 fraction according to the method of Example 1 The content of APP degrading enzyme activity is shown in FIG. For mono-Q chromatography When compared to similar analyzes of the soluble and microsomal fractions applied, the enzyme C -Relative staining intensity for terminal APP fragments is in P-2 subfractions from Mono-Q Consistently Was the largest. The APP degrading activity in P-2 is represented by two distinct migration peaks. Recovered from Mono-Q (A and B, FIG. 5).   Peak A is loaded and low, as seen in our earlier studies In ionic strength cleaning, that is, in an area almost equivalent to the recovery of P-2V. Elution (Table 4), but peak B shows the pool in which P-2VII activity was previously observed. Overlapping regions (Table 4), and serine and aspartate pro It was shown to consist of both thease activities. Degradation products of similar size are Has both peak A and B activity at 28, 18 and 14 and <11 kDa However, the relative staining intensity of the 18kDa band changed from peak A to peak B. It was very big. Peak B was pooled and described in Example 1, Method 1. Was purified with Superose 6HR as described above. The eluted fractions were It contains sexually defined types of activity, which may cause their elution profile to I wrapped APP most closely resembling that observed in the original Peak B fraction The activity that produces a disruption pattern (Figure 5) was observed in fractions 51-56 from gel filtration. Recovered (Figures 6b and 6c), consistent with an apparent Mr of 15-25 kDa. This There is an elution of activity that mainly forms the 18 kDa breakdown product before the elution peak of Exists, and is probably catalyzed by a larger apparent Mr protease . This latter activity is due to the above-mentioned serine in the P-2VII pool in Example 8, Table 4. Probably corresponds to protease activity. Peak B (and within the Mr region of 15-25 kDa) Active fraction from gel filtration purification of) was inhibited by classical protease inhibitors Was tested (FIG. 7). These studies show that peak B activity is Greater than the aspartic protease as determined by quantitative inhibition It was confirmed to be catalyzed.   Relatively few human aspartic proteases are known. Identified Those include cathepsins D and E, and pepsin. The observed activity is To test the possibility that some of these enzymes could represent, Due to their ability to enzymatically degrade the huro-derived holo-APP, the quotient of human renin Commercial preparation (Calbiochem, California, San Diego, CA) Talog No.553864), human cathepsin D, and human cathepsin D (human Liver, Calbiochem, San Diego, Catalog No. 219401) I checked.   Human Cathepsin D (Catalog No.219401, Calbiochem), Cali (San Diego, PA) was electrophoresed on SDS-PAGE developed by silver staining. Homogeneous, showing excellent (93%) agreement with the theoretical composition of cathepsin D. The no acid composition was shown. All N-termini correspond to cathepsin D and the major sequence is Equivalent amount corresponding to light chain (GPIPEVLKNY) and heavy chain (GGVKVERQVF) of mature protease Present in molar amounts.   Renin was inactive (not shown), but cathepsin D selectively selected APP Observed at the above-mentioned P-2 peak B (Fig. 5) from Mono-Q after being cleaved into Produces a pattern of C-terminal degradation products similar to. Thus, commercial cathepsies D preparation decomposed holo-APP in a time-dependent manner to produce major Mr18 and 28 kDa proteins. A new C-terminal product was produced. Inhibition of activity by pepstatin A is associated with this reaction. The involvement of cathepsin D in cerebrum was confirmed (Fig. 8).   We obtained a proprietary polyclonal antibody against human cathepsin D (Dako Corp. Dako Corp., Carpinteria, CA, Catalog No. A5 61), and is reactive to human cathepsin D on the immunoblot, ~ 28kDa immunoreactive van It has been discovered that it causes a dead air. Use this antibody in immunoblot assays. For chromatin from mono-Q purification of P-2, a potential or microsomal fraction It was examined whether the topographical fractions contained immunoreactive cathepsin D. The antibody did not cross-react with human renin on the immunoblot.   Significant amount of cathepsin D is P-2 mono-Q fraction (Fig. 20d) and APP degradation It was observed in the active soluble fraction (data not shown). Interest There is, in the analysis of the mono-Q fraction of P-2, the reactivity of cathepsin D 2 Two chromatographically distinct peaks were observed, each of which was peak A And B (not shown). Immunoreactivity associated with peak A activity The sparagic protease, cathepsin D, was previously identified as P2V in Example 8. Coincided with the area. As this suggests, peaks A and B are of cathepsin D It can be for multiple forms. Many forms of cathepsin D are noted somewhere Listed and assigned to differences in post-translational modifications of single gene products. P-2 P Of the gel filtration column fractions from the further purification of syrup B (Fig. 5). Assay showed that the presence of cathepsin D immunoreactivity was consistent with peak APP degrading activity. (Fig. 6b).   Cathepsin D co-migrating with immunoreactivity and degrading AP for cathepsin D In addition to the P similarity, the peak B protease further purified by gel filtration is , The same pH optimum as cathepsin D for the formation of C-terminal APP degradants (pH 4 to 5) and dependence of ionic strength (Fig. 9). Finally, in the P-2 fraction The immunoreactive bands observed in the biorad miniphor (Biorad ninip hor) for cathepsin D when subjected to preparative IEF in a chromatographic system It showed a pI (4-6) similar to that reported (shown Not). Collectively, pepstati observed after the Mono-Q fraction of human brain P-2 The fact that the insulin-sensitive APP protease activity is due to the action of cathepsin D , These data strongly support.   Then peak B protease (purified by gel filtration) and cathepsin Synthetic peptide N-dansyl-Ile-Ser-Glu-V using the peptidase activity of D as a substrate al-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2(SEQ ID NO: 7) was used for comparison . Both enzymes add this peptide in a time-dependent manner, albeit at a very slow rate. Water decomposed. For both enzymes, the major cleavage was observed at the -Glu-Val- bond. And to a lesser extent in -Met-Asp-binding (Fig. 10). First By Figure 24, most of the Met-Asp cleavage products were further depicted in Figure 0 by the 24 hour time point. Note that it was converted to the Glu-Val product. As you would expect, Both peptidase reactions catalyzed by the Psin D and P-2 enzyme preparations It was inhibited by putatin A.   Both enzymes show an acidic optimum at pH 4 for hydrolysis in the Glu-Val-bond (Fig. 1). -Met-Asp- hydrolysis is also optimal with cathepsin D Although a value (<pH3.0) was shown, two optimal values were observed for the P-2 enzyme (pH3.0 and And pH 7.0), this is probably additional contamination in the reaction at neutral pH optimum. This was due to precipitation of the sex P-2 protease (Fig. 11). Cathepsin D is usually sparse Hydrolyzes between aqueous residues. However, at acidic pH, Asp and Glu side The protonated (neutral) form of the chain meets the requirements for protease subsite binding It seems to be hydrophobic enough to. The pKa of Asp side chain is better than that of Glu residue. So acidic and less than the Glu residue throughout the pH range tested in Figure 11. Will be protonated to a lesser extent. This is cathepsin D-Met-Asp-binding Cleavage rate is lower in this case, and this site when compared to -Glu-Val-bond Explaining the hint at lower pH optimum for cleavage in Can be.   Others using monoclonal antibody C286.8A in immunoblot assays Studies have established that P-2 enzyme activity is due to cathepsin D. Wow In our more recent work, this activity is due to ion exchange in the solubilized P-2 fraction. The salt gradient from the exchange chromatography dissolves over a fairly narrow number of initial fractions. It was collected as a single separated peak (Fig. 20a). In vitro hydrolyzed APP695 To form fragments in the size range 15-38 kDa (Fig. 20b), all of which Is a murine monochrome that recognizes the first seven N-terminal residues of beta-amyloid It reacted with the null antibody (C286.8A) (Fig. 20c). The pooled fraction has an activity of 1 Complete with 0 μM pepstatin A, an aspartic protease inhibitor (Fig. 20b), but inhibition of other proteases such as EDTA (1 mM) , PMSF (0.4 mM), E-64 (0.1 mM), and aprotinin (10 μg / ml) Not affected (not shown). APP degradation activity is APP mimicking N-dansyl −ISEVKMDAEFR−NH2Sensitivity to Hydrolyze Amino Acids at the -EV-Bond Consistent with the elution of protease (Fig. 20a). Cathepsin D is a 20 kDa cathepsin The holo-APP and peptide fractions were determined by immunoblot analysis of the syn D light chain. Co-eluted with deactivity (Fig. 20d).   Highly pure cathepsin D degrades holo-APP to give P-2 aspartate C286.8A immunoreactive organisms indistinguishable from those observed using Rotase activity A pattern of products (Fig. 21b) was generated (Fig. 21b). Perform immunoadsorption experiments , A possible immunological homology between P-2 aspartate protease and cathepsin D. Inspecting one sex It was Based on their APP degrading activity, pooled ion exchange fractions (Fig. 20a) , A column of immunoaffinity-purified antibody against cathepsin D, or Was applied in equal amounts to a control column containing a purified control. Two columns It was possible to superimpose the profile of the elution of A280 (Fig. 21a). Control column The flow-through fraction from the same level of APP degradation activity as the pool applied after the first void (Ie fraction 5 onwards, FIG. 21b). In contrast, APP degradation activity is Essentially from flow-through from cathepsin D column to fraction 9 (additional 5.7 void volume) Absent and present in the applied pool up to fraction 27 (31 void volumes). Did not reach a level equal to Bell. Flowing AP from anti-cathepsin D column This loss of P-degrading activity was detected with the same anti-cathepsin D antibody that was immobilized. Consistent with depletion of light chain (20 kDa) and heavy chain (27 kDa) of immunoreactive cathepsin D (Fig. 21c). Cathepsin D immunoreactivity recovered from anti-cathepsin D column However, 100 mM glycine pH 2.5 was used when 0.5% Triton X-100 was included. It was not recovered from the control column due to the elution. Corresponds to immunoreactive cathepsin D Protein bands other than the Note that (Fig. 21c). As a result, the adsorbed APP decomposition activity is The possibility that it may arise from immunologically cross-reactive proteases other than SynD itself It doesn't seem likely. Unfortunately, only a small amount of APP degrading enzyme activity is Recovered from the Tepsin D column (not shown). This is probably this activity is medium Because it was inhibited by the solubilized elution buffer: the composition of the elution buffer also , Quantitatively inhibited the degradation of holo-APP by purified cathepsin D (shown. Not).   The immobilized polyclonal antibody against human cathepsin D It also immunoadsorbs the APP peptide hydrolytic activity present in the ion exchange pool. (Fig. 22). Under conditions of partial hydrolysis, the ion exchange pool was dansyl-ISEV. KMDAEFR-NH2Was cleaved at both MD and EV bonds (see Figure 20). Under conditions of such a prolonged incubation, the product from MD cleavage is Ultimately converted to an EV product by secondary proteolysis). APP decomposition activity EV (Fig. 22a) and MD (not shown), as when using The peptidase activity, which yields a fluorescent product of the cleavage of the bond, was first detected in the control IgG column. From the anti-cathepsin D column up to fractions 12-13. Essentially none (Figure 22a). Low levels of MD and EV peptides The dase activity was subsequently recovered from the anti-cathepsin D column, but It was not recovered from the control IgG column by elution using Riton pH 2.5 (22nd (Fig. b). Each of the peptidase activities recovered in the flow-through or by acidic elution Each was completely inhibited by pepstatin A. In the so-called Swedish FAD The corresponding peptidomimetic of the APP position observed (N-dansyl-ISEVNLDAEFR-N H2In parallel experiments with similar results were obtained (Figs. 22c and 22c). (Fig. d). However, with this latter peptide, the major fluorescent product that accumulates is Resulting from cleavage of the LD bond. The accumulation rate of this peptide was very fast, All of the substrates available for this reaction are well depleted within the incubation time. , 22c led to a low evaluation of the different activities in the flow-through fraction. Once again in the flow , Or the peptidase activity recovered by elution was inhibited by pepstatin A Was done. Peptidases are responsible for cleavage of MD bonds in wild-type APP mimetic substrates. Exists in Swedish peptidomimetics at apparent velocities faster than those observed The resulting L-D bond was hydrolyzed.   As expected, the hydrolysis of other substrates, cathepsin D, was also reported. Several products were observed, which corresponded to cleavages that roughly corresponded to (Moriyama Et al., 1980, J. Biochem. 88: 619). report Cathepsin D specificity is the major product of band 3, with the exception of cathepsin D , And a small product of band 5-Glu-Val-cleavage, bands 1 and 2 Of the -Leu-Arg-cleavage product (Table 5).   Cleavage of the -Glu-Val bond in APP593-594 is associated with a pepstatin inhibitory response. View of cathepsin D cleaving the corresponding bond in a peptide substrate (as described above) Consistent with the perceived ability. Cathepsin D normally adds between certain pairs of hydrophobic residues. Water decomposes. Cleavage at the Glu-Val bond was unexpected but glutamate Probably under acidic (pH 5) conditions due to protonation (pKa = 4.25) of the side chain of the residue. And make it neutral.   In fact, we conclude that 18% of -Glu- side chains will be protonated at pH 5.0 be able to. Such acidic conditions occur in lysosomes or secretory granules, Or at the time of tissue damage, or after hypoxia or ischemia Sometimes.   Most significantly, cathepsin D is the N-terminus of the common form of beta-amyloid. -Glu-Val-bonding 3 amino acid residues N-terminal to -Asp-residue Heterologous hydrolysis yielded a 5.6 kDa product (band 3, table 5). This disconnect One piece is an equivalent of a blot taken from an incubation without cathepsin D. It was not in the compartment. In addition, this fragment contains the full-length beta-amyloid pep It has the correct size containing tide (5.6 kDa) and its development is cathepsin D Is also at a second site in close proximity to the C-terminal region of the beta-amyloid peptide. Suggest that you have to disconnect the APP.   In fact, the precursor substrate for such C-terminal cleavage is also in band 5. Was identified and showed an Mr (10.0 kDa). This disconnect As the fragment sequence suggests, it is not all of the C-terminal domain, Contains the majority, which is due to a single -Glu-Val-cleavage in APP593-594. Occurred.   APP695 appeared to be an ideal substrate for cathepsin D cleavage, and It contains a number of other peptide bonds that were not cleaved by cathepsin D. That The fact that they were not hydrolyzed suggests that the cathepsions within the folded APP structure are Reflects the high degree of sequestration of these sites away from access to protein D: hydrophobic Most of the sex pairs would be expected to be located in the hydrophobic APP protein core . The same considerations apply to sites shown to be hydrolyzed by cathepsin D (Table 5). ) Did not always contain the optimal cathepsin D recognition motif. Ta Such sites are catalyzed by cathepsin D in order to be located on the protein surface. It must contain a greater degree of polarity or charge that is ideal for cleavage. Will not. In this regard, three of the five internal cleavage sites have two Contains lorin residues, each of which was within 8 residues of the scissile bond Is notable. Such residues are often associated with disruptions in secondary structure Rui are associated with the turns that are often found on the protein surface.   In a parallel immunoblot (Fig. 12c) some of the product peptides ( (Arrow position) is a monoclonal antibody against the N-terminal residue of beta-amyloid C286.8A). These are in the same position as band 3 in Figure 12a (Table 5). Co-migrated with the band in Mr5.6 that migrates at band 5, band 5 in Figure 12a (Table 5). A tablet between Mr 9 and 10 kDa, and a tablet at Mr 14 kDa, and Tablets at 16-18 kDa co-migrating with band 6 in Figure 12a, at Mr 40 kDa. Including a kicking band. Bands sequenced (Table 5) Of these, only bands 3, 5 and 6 co-migrated with the bands detected by Figure 12c. Moved. Consistent with this, only these three identical bands in Table 5 are suitable N-terminals. It has a terminal sequence and is large enough to contain the beta-amyloid epitope. It was   Figure 12 shows the time sequence of the immunoreactive degradation products of beta-amyloid described in Figure 12. The formation of pepsin was carried out under slightly different molar ratios of cathepsin D and APP (Fig. 13). Performed both in the absence and in the presence of the Tidase activity. Absence of inhibitor A time-dependent accumulation of low-molecular-weight fragments was observed, which was approximately It started first with the formation of bands at 16-18 and 28 kDa. In 2 hours , Mr of approximately 40 kDa was observed. 16-18 and 40kDa band at 2 o'clock The intensity of the 28 kDa band remained constant over time, though it was further enhanced over time. wait. The 16-18 and 40 kDa intensities were further increased over 8 hours. 8 hours and 2 The intensity of the detectable bands at Mr around 14, 10 and 5.6kDa during 1 hour There was a substantial increase. These latter three bands are 16-18 or 40 kDa The bands at 14, 10 and 5.6 kDa were 16-18 or 40 kDa because they were not enhanced in parallel. May have been derived from secondary degradation of any or all of the bands . The 16-18 or 40 kDa bands listed in Figure 13 are listed in Table 5 and are listed in Table 12c. It corresponds to the same Mr band shown in the figure. All of the bands observed in Figure 13 Are inhibited by peptidase activity and they are generated by the action of cathepsin D. I confirmed that.   FIG. 23 shows that the cathepsics should include those identified since Table 5 was created. It provides an update of the sequence of the APP fragment formed by D. It is also the 12c The sequence is related to the particular C286.8A immunoreactive band observed in the figure. Each C 286.8A immunoreactive band For, the corresponding segment of the sequencing blot contained the C286.8A epitope. And of sufficient size to thus explain the immunoblot bands and One or more fragments of the sequence were generated (Fig. 23a). Outside the N-terminus of mature βAPP In addition, digestion with CD resulted in the N-terminus of βAPP resulting from seven different cleavages ( (Fig. 23b), which are roughly in agreement with the reported specificity of cathepsin D (A ． Moriyama et al., 1990, J. Biochem. 88: 619; van Noort et al., 1989, J. Am. Biol. Chem. 264: 14159; and M.M. Tanji et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1 76: 798). As the fragmentation pattern (Fig. 23b) suggests, the 5.5 kDa fragment was Larger precursors, such as the 38 kDa peptide, or further characterization of Figure 13. Not caused by a gradual decrease of the N- and C-termini of a transient 28 kDa fragment. It The 5.5kDa immunoreactive fragment is directly derived from a 10-12kDa fragment with identical sequences. Could be Both these fragments and the Mr15-16 fragment It appears to be large enough to contain a full length copy. evident As such, other products, such as the further processing of immunoreactive fragments of 10-12 kDa The products resulting from the sings are probably further decomposed or electroblotted. It may go undetected due to a loss during reading.   Catheter as a major protease in amyloidosis of Alzheimer's disease The relationship of pushin D here describes another observation made regarding Alzheimer's disease. To do. First, APP accumulates in lysozyme and is processed there There is growing evidence that it produces fragments with amyloid (Haas et al., 1992). , Nature, 357: 500). Amyloid deposition is favorable at lysosomal acidic pH (Burdick et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 546). Second, cathepsin D It is a lysosomal protease, but also Alzhai Are present at significant levels associated with deposition of amyloid in the brain of mars. Tissue Chemistry (Cataldo et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3861. ).   Thirdly, beta-amyloid released by cells in culture has the residue Val594. It consists of a small N-terminal sequence starting at (Haas et al., 1992, Nature, 359: 322). Sequence starts at Asp597, which is commonly found in beta-amyloid 1-42. 3 amino acids N-terminal to the richer sequence. Small arrays are probably positions 593-594, namely cathepsin D, is known to perform specific proteolysis. Direct internal proteolysis of the -Glu-Val- bond at the same site as shown. Caused by. Here, cathepsin D binds to both -Glu-Val- and -Met-Asp-. Since it hydrolyzes the peptide, it is a beta-amyloid sequenced by Haas et al. It is emphasized that it has the required specificity to form both fragments.   Fourth, the cysteine protease inhibitor E-64 and leupeptin It does not affect beta-amyloid release by LC-99 cells, but Inhibitors of the some block this release (Shoji et al., 1992, Science, 258). : 126), the formation of beta-amyloid by these cells It was shown to be catalyzed by a lysosomal enzyme other than protease. Of such a reaction The remaining candidate proteases for cysteine used in those studies Not inhibited by protease inhibitors.   Furthermore, APP is a hydrophobic peptide between the C-terminus of beta-amyloid and the membrane anchor sequence. Contains stretches of sex residues. Those with peptide bonds in this region are It could be hydrolyzed by Tepsin D. In fact, at positions 645-646 In-Leu-Val-coupling is possible with the PEPTIDESORT computer program Cathepsie It is emphasized that it is a D recognition site. This site is associated with familial Alzheimer's disease ( Close to the position of three point mutations shown to cosegregate with some forms of FAD) It Cleavage within this region and the -Glu-Val-bond at positions 593-594 are shown in Table 5. One could explain the size of the band 3 in. FA at this site The D mutation can enhance the rate of APP cleavage by cathepsin D within this region. It will be possible.   Finally, the -Lys-Met- to -Asn-Leu- double mutation at positions 595-596, It also co-separates with FAD. This mutation is associated with a specific amyloidogenic protease Eliminate the possibility that exists with specificity for cleavage near the -Lys-Met- bond Seems to be. Because the mutation enhances cleavage by such enzymes It would be expected to interfere rather than Rather, beta The primary internal proteolysis that gives rise to amyloid is adjacent to this dipeptide and favors On the contrary, it increases the likelihood of occurring at the N-terminus. Glu-Val-bond is S1 And the nearest N-terminal site left unaffected at the S1 ′ position. You   Conceivably, S2 'and S3' to the scissile bond of -Glu-Val-. -Asn-Leu-mutation at the site could enhance cathepsin D cleavage You can do it. To test if this is the case, the substrate N-dansyl -Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2(Sequence identification number: 7) And the KM pair are replaced by NL, which mimics the FAD mutation described above. We compared the ability of cathepsin D and P-2 enzymes to hydrolyze various peptides. Compared. Both enzymes have a longer time frame for smelling MD and EV bonds. The wild-type peptide was cleaved by the A slight cut is always observed It was In contrast, cleavage of the mutant peptide by both enzymes resulted in the wild-type peptide Occurred at an initiation rate 30-50 times faster than that observed using Should occur One metabolite showed a retention time of 4.4 minutes, and was I couldn't see it. The product is subsequently purified and the mass spectrum [M- H]+= 907 and analysis of amino acid composition, N-dansyl-ISEV It was identified as NL (SEQ ID NO: 9). Therefore, the product is the LD binding of the substrate. It must result from hydrolysis during. This cleavage by cathepsin D And N-, which is identical to that found in the predominant form of beta-amyloid. Releases peptides with termini and amyloidogenic protease cathepsin D This particular initial by providing a site that is more rapidly cleaved by -NL-mutation observed in FAD-expressing FAD affects the rate of beta-amyloid formation Provide an increasing mechanism. The possible increase in beta-amyloid accumulation rate is , Can induce the early expression form of Alzheimer's disease linked to this APP mutation. You will be able to   The identification of cathepsin D as a significant candidate for Alzheimer's disease has led to the identification of this disease. Significantly facilitates the efforts of developing therapeutic inhibitors for For example, a specific cathep SynD Inhibitors By Blocking Toxic Accumulation Of Beta-Amyloid It could provide therapeutic benefit. New information provided here Are other aspartic proteases such as renin and HIV-protears. Tightly binding, as achieved for the design of a novel inhibitor of To make an inhibitor rationally designed, make it relatively simple.   Alternatively, cathepsin D is then processed high using an in vitro peptidase assay. Suitable for use in rational screens, chemical Identify therapeutic inhibitors by random or semi-random search of libraries can do. Assays suitable for such purposes are described in the Examples of the Invention. The N-dansyl-peptide assay described in 2 and 3 can be included. It Example 10 Serine Protea with Specificity for Processing C-Terminal APP Identification   Figure 4 shows that human brain is capable of processing the C-terminus of recombinant APP. Containing phosphoproteases, and in some cases these serine pro It shows that thease could be inhibited by aprotinin. Such protea As a first step, aprotinin-ceph Proposed another isolation plan incorporating affinity purification by Arrows (implementation Example 1, method 2).   The application of this procedure for the further purification of the P-2 fraction is the isolation of APP degrading activity. Was promising (Fig. 15). Aprotinin-Sepharo by acidic elution The active fraction collected from the column of S.Z. was further purified on a Mono-Q column (16th Figure). The active fraction (Fig. 16a) contained a monoclonal antibody against the C-terminal of APP. When analyzed by the immunoblot used (Fig. 16b), 11kDa, 14kDa and The ability to form the C-terminus of 18 kDa APP was demonstrated. Minimal product is recombinant C-100 Moved with the standard. Active fraction using anti-beta-amyloid monoclonal antibody Re-assay of APP degradation in minutes led to the detection of three identical product bands ( (Fig. 16b). Antibody C286.8A was added to beta-amilo as in Example 6 (iii). This experiment recognizes all 3 amino acid residues because it recognizes the first 7 amino acid residues of the id peptide. It is shown that one product contained full-length beta-amyloid.   One or more of the peptides of these products are amyloid Alternatively, place these peptides C-terminal to the beta-amyloid region. Can be processed to give beta-amyloid. Ah Therefore, the serine proteases involved in the formation of these entities are It could play a role in Lloyd-Cys.   Is the enzyme activity that formed the above-mentioned 11, 14 and 18 kDa product bands mono-Q? Elute as a broad peak and probably resulted from the action of more than one protease Will. Based on the recovery of A280 nm absorbing components from the Mono-Q column, pool X , Q and Y, and three different probes of proteolytic activity, called mono-Q color. (Method 2, Example 1).   From the void volume during chromatography of each pool on Superdex 75, Enzyme activity times were collected, consistent with an apparent Mr> 75 kDa (data not shown) ) Could not rule out possible protein aggregation during chromatography Yes. Pool Y represents the purest pool when analyzed by SDS-PAGE and is approximately 1 A major stained band was shown in Mr of 00 kDa. More characteristics of pool Y Selected for. The pH dependence for hydrolysis of APP by pool Y is pH 7-9 (Fig. 17a), and the enzyme activity exceeded the sodium chloride concentration of 42 mM. It was gradually inhibited by the increase (Fig. 17b). Enzyme inhibitors A study of the susceptibility of P. And aprotinin, but with pepstatin A, E-64 or EDTA It was confirmed that it was not affected (Fig. 18a). Serine protease inhibitor Tar benzamidine has no effect on the enzyme, which is the trypsin-like endo It suggested that it could not be a protease. This enzyme is neutral to the S1 subsite Groups containing hydrophobic residues of It is likely to be a family of chymotrypsins with specificity for quality cleavage.   Therefore, further inhibitor studies (Fig. 18b) indicate that activity of pool Y With chymotrypsin inhibitor II, alpha-2-antiplasmin and TPCK It was shown to be more strongly inhibited. Weak inhibition also refers to chymostatin and alf 1-antichymotrypsin, but did not inhibit TLCK at all. Mosquito Tepsin G plays a role in the processing of APP by other researchers However, it was suggested that using a polyclonal antibody against cathepsin G Immunoblot analysis of the Le Y protease fraction detects this serine protease I couldn't. Sequencing of the 11, 14 and 18 kDa N-termini identified cleavage sites. Have identified and are already in progress. Example 11 Design of therapeutic cathepsin D inhibitors   This example is described in Schechter et al., 1967, Biochem. Biophys. Res. Comm. 27: 157 of The name is used to describe the specificity of the peptide, in which the frangible Those amino acids in the substrate Number according to position. The peptide substrate N-terminal to the scissile bond The mino acid side chains are sequentially numbered P1-Pn at increasing distances from the scissile bond. Kick The amino acid side chain of the peptide substrate at the C-terminus is contiguous to the scissile bond Are numbered P1 'to Pn'. P1 and P1 'amino acid side chains should be cleaved Corresponds to the amino acids involved in peptide bond formation. Side chains P1-Pn and P1 ′ To Pn ′ represent the subsites S1 to Sn and S1 ′ to Sn ′ of the enzyme, respectively. It is intended to form a specific interaction with the corresponding site. Corresponds to the P side chain The interaction with the S subsite is responsible for the safety of the protease-substrate complex. Contributes to the binding energy for normalization and thus gives specificity to the interaction To do.   The approach taken for the development of peptidomimetic inhibitors is described in Example 2 and 3 and n-dansyl peptide substrate assay, or the holo described in Example 8. -Using an assay for APP degradation, in combination with purified cathepsin D, enzymology Measurement can be performed.   Optimal peptide length for proteolytic cleavage by cathepsin D in vitro And sequence quantification. Sequence Dns-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-NH2 Starting with the dodecapeptide (SEQ ID NO: 7), the enzymatic hydrolysis To the apparent kinetic parameters for N-terminal or C-terminal The effect of peptide shortening is determined at acidic pH and optimal ionic strength. Optimal length Of Hydrolysis of Amino Acids at Different Positions on Km and Vmax in Various Peptides Determine the fruit. Inhibitor synthesis. Essential amino acid sequences required for optimal cleavage (from 1a and b above) ), And a peptidomimetic compound containing a suitable spacer. these Of the amino acid sequence in the peptide of Escherichia coli is observed near the cleavage site in the APP substrate, eg For example, Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp (SEQ ID NO: 4) and Trp-His-S er-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser (SEQ ID NO: 5) or a cathep To cathepsin D based on studies of their efficacy in inhibiting synD in vitro You can choose from those found to give the optimal binding to Ah Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp (SEQ ID NO: 4) and Trp-His -Ser-Phe-Gly-Ala-Asp-Ser (SEQ ID NO: 5), P1 and P 1'is EV and FG, respectively.   The above sequences or sequences showing optimal cathepsin D inhibition (N- and / or C- Peptide inhibitors containing substitutions, including shorter variants) Where CO-NH-atom of the peptide bond between P1 and P1 'is Has been replaced by a group of associated spacers and using the appropriate synthetic route. Obtain any of these possible stereochemical configurations; reduced amides, hydroxy Isosteres, ketone isosteres, dihydroxy isosteres, statin analogues, phosphonates Or phosphonamide, reverse amide. Most of these inhibitors are transitional. It will function as an analog of the active state.   In vitro assay of the invention (N-dansyl-peptide assay or holo-APP The efficacy of these first generation compounds determined using any of the Noh could be optimized by any or all of the following:   (I) addition or deletion of flanking amino acid residues;   (Ii) Changes in the type (D or L) of the amino acid side chain at each position in the inhibitor Change;   (Iii) blocking groups such as Boc or acetyl (N-terminal), or O N- or C-terminal using -Me, O-benzyl, N-benzyl (C-terminal) Replacement.   Besides the reasonably developed inhibitors according to the above method, other known cathepsics Therapeutic inhibitors for Alzheimer's disease in whole or in part Optimizing the efficacy of inhibitors as a bitter and in Alzheimer's disease It could be used as a starting point for the development of new derivatives for therapy. This Inhibitors such as include: 1-deoxynojirimysin (Lema nsky et al., 1984, J. Am. Biol. Chem. 259: 10129); diazoacetyl-no Leleucine methyl ester (Keilova et al., 1970, Febs Lett. 9: 348); Gly-Glu -Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu (SEQ ID NO: 6) (Gubenseck et al., 1976, Feb. s Lett. 71:42): pepsin inhibitor from Ascaris (Kei) lova et al., 1972, Biochim. Biophys. Acta. 284: 461); Pepstatin (Yamamoto Et al., 1978, European Journal of Biochemistry, 92: 499). Example 12 APPC-terminal by human fetal kidney (HEK) 293 cells maintained in culture Effects of inhibitors of pepstatin A, cathepsin D on the formation of end fragments   The following example shows that it is formed from APP695 by cathepsin D in vitro. It formed a C-terminal fragment of APP of the same size (15 kDa) as the one prepared in Example 9). The ability of HEK293 cells to release into tissue culture medium by It is shown that syn D activity is inhibited in vitro. HEK cells were transfected It is known to release beta-amyloid from APP 695, which is Contains proteases required for myloidogenic APP processing [C. Haass et al., 1 992, Nature, 359: 322]. Therefore, these cells are in beta-amyloid form. It provides an accepted cell model for adult studies. Present in these cells The endogenous level of APP751 / 770 served as a substrate for the studies outlined below. Wow We grew HEK293 cells in 400 ml suspension culture. Some cultures Either contained DMSO solvent alone (0.01% v / v final) or DMSO + 10 μM max. It contained the final pepstatin A. As is clear from Figure 19a, DMSO or DMSO Both + pepstatin and HEK293 cells at the concentrations of these substances used It did not adversely affect the growth rate. Treated with DMSO or DMSO + pepstatin A Aliquots (185 ml) of medium taken in late logarithmic phase from live cells, recommended procedure [Axen R. Et al., 1967, Nature, 214: 1302] by CNBr-activated Sepharose 4B. Monoclonal C2 immobilized on Sepharose 4B using (Pharmacia) 86.8A (Example 6) was passed over the same size column (1.5 x 5 cm). Before load In addition, the column was flushed with 100 mM sodium bicarbonate buffer pH 8.3 containing 500 mM NaCl. Equilibrated. Contains APP fragments released into tissue culture medium by HEK293 cells Beta-amyloid binds to the immobilized monoclonal antibody and is subsequently 0. Washing with 100 mM Glycine pH 2.4 containing 25% v / v Triton X-100 Was eluted from the column at 1 ml / min. The eluted fraction (4 ml) was used in Example 8 Immunoblot procedure for binding to the column and subsequent lysis from the column. Separated APP fragments were detected. Immunoblot detection was performed using the anti-C-of Example 6, method i). Performed using a terminal antibody. The fractions detected by this procedure are beta-amilo. Id N-terminal peptapeptide sequence (to illustrate binding to immobilized C286.8A And C-terminal domain or a portion thereof (reactivity with anti-C-terminal antibody Would have to be included to explain).   Figure 19b shows cells grown in the presence of DMSO alone or DMSO + pepstatin A. Recovered in the eluate fraction from the column of immobilized C286.8A loaded with medium from Compare the amount of C-terminal fragment. Chromatography was performed in parallel under the same conditions. It was As can be seen, treatment with pepstatin A was by immunoblot It significantly reduced the amount of eluted APP-derived fragment of 15-16 kDa that was detectable. This fragment Is a categorical having the N-terminal sequence G-A-D-S-V P-A- (Table 5 and FIG. 23) Is the same size as the fragment formed in vitro by Psin D, and Cell formation of a similar 5.6 kDa fragment with an N-terminus corresponding to some forms of myloid. Represents an intermediate in You will be able to Other APP fragments formed by cathepsin D in vitro Was not detected in the experiment. The undetected fragments are below the detection limit. May have been present or further degraded in the cell by other proteases is there. As this experiment shows, HEK293 cells. That is, the formation of amyloid in cells A characteristic permissive cell line is APP695 formed in vitro by cathepsin D. Make and release at least one APP fragment similar to the fragment, and Formation is inhibited by non-toxic doses of cathepsin D inhibitor. Thus Peptide-based inhibitors of cathepsin D alter cellular processing of APP. It has practicability when it is added. Example 13: Inhibition studies   N-dansyl-ISEVKMDAEFR-NH with cathepsin D2Using in vitro hydrolysis of Selected from a program of renin and HIV-protease inhibitors 250 peptide compounds for their ability to inhibit human cathepsin D Screened. Of these, the compounds identified in Table 6 below There was an effect of inhibiting cathepsin D.   The structures of the inhibitors corresponding to the numbers listed in Table 6 are shown in Table 7 below. You:   In all formulas herein, the abbreviation BOC represents t-butoxycarbonyl. .   The above inhibitor can be prepared as follows: Inhibitor 1 , 2, 3, 4, 5, 10 and 20 are German patent applications (DE) 4,215,874, 1992 Filed May 14, 2014 (This is US patent application No. 08 / 059,488, corresponding to the application filed on May 10, 1993). These applications Both are added here by quoting. Inhibitors are antiviral agents, especially HIV It is disclosed to be a protease inhibitor. Inhibitor 1 is as follows Manufactured by:   First step: 614 mg (2.20 mmol) of (2R) -N in 10 ml of anhydrous dichloromethane -(T-Butoxycarbonyl) -2-amino-2- [2- (1,3-dithiolane 2-yl)] acetic acid (European Patent (EP) 412 350) and 337 mg (2.20 mmol) A stirred solution of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) cooled to 0 ° C. Treated with 4 mg (2.10 mmol) dicyclohexylcarbodiimide (DDC), and The mixture of is stirred for 5 minutes. Then 1.10 g (2.20 mm in 10 ml dichloromethane) 1-{(2R, S, 4S, 5S)-[5-amino-6-cyclohexyl of ol) 4 hydroxy-2- (1-methyl) ethyl-hexanoyl]}-S-isoleu Cinyl-2-pyridylmethylamide dihydrochloride (European Patent (EP) 437 729) and And 0.88 ml (8.0 mmol) of a solution of N-methylmorpholine are added dropwise. Cooling bath Is removed and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours. Thin the end of the reaction Determined by layer chromatography. The resulting urea is removed by filtration and the filtrate is Concentrate in vacuo and crude composition 90 g silica gel (dichloromethane: methane 95: Purify by chromatography in 5). 1.29 g (88% of theory) of compound: Is obtained as a pale powder.   Second step: 2.41 g (3.%) in 4N solution of hydrogen chloride gas in 17 ml of anhydrous dioxane. A solution of compound 21 above (28 mmol) at 0 ° C. for 30 minutes. Then 15 ml of Torue Is added and the mixture is concentrated in vacuo. Repeat this method two more times, The residue is then triturated with ether, suction filtered and potassium hydroxide under high vacuum. 2.29 g (98% of theory) of the compound when dried in the presence of KOII (KOII): Is obtained as a colorless powder.   3rd process: 0.80 g (2.40 mmol) of (2S) -3 in 20 ml of anhydrous dichloromethane -T-Butoxycarbonyl-2- (1-naphthylmethyl) -propionic acid (H.B. uhlmayer et al., 1988, J. Am. Med. Chem. 31: 1839) and 0.40 g (2. A stirred solution of 64 g (2.64 mmol) HOBT and cooled to 0 ° C. was added with 0.52 g (2.52 mmol) Treat with DCC and stir for 5 minutes. Then 1.55 g in 30 ml dichloromethane Compound 22 above (2.19 mmol) and 0.96 ml (8.74 mmol) of N-methylmorpholine Is added dropwise and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours. Arise Urea was removed by filtration, the filtrate was concentrated in vacuo and the crude product was Chromatograph of 360 g of silica gel (dichloromethane: methanol 95: 5) After purification by EE, 586 mg (28% of theory) of the non-polar (2R) isomer are colorless And 690 mg (33%) of the polar (2S) monoisomer as a colorless powder Obtained.   Inhibitors 2, 3, 4, 10 and 20 are likewise suitable acids with suitable amine hydrochlorides. (These are either known or can be manufactured by conventional means) and It can be produced by coupling. Inhibitors 3 and 20 In the set of, the expression: It may be necessary to start with the compound having Compound 23 was prepared by Similar to that, but 249 mg (0.89 mmol) of (2R) -N- (t-butoxycarbohydrate) Nyl) -2-amino-2- [2- (1,3-dithiolan-2-yl)] acetic acid (Europe State Patent (EP) 412 350) and 440 mg (0.81 mmol) of 1-{(2R, S, 4S , 5S)-[5-Amino-6-cyclohexyl-4-hydroxy-2- (2-p- Lopenyl) -hexanoyl]}-S-isoleucinyl-2-pyridylmethylami Starting from dodihydrochloride (European Patent (EP) 437 729) and 24 g of crude product Chromatography on silica gel (dichloromethane: methanol 9: 1). This gives 553 mg (93%) of compound 23 as a pale powder. Then amine hydrochloride Is similar to compound 22, but starting from 560 mg (0.91 mmol) of compound 23 . 452 mg (91%) of amine hydrochloride are obtained as a colorless powder.   Inhibitor 10 has the formula: Would require the starting material of Preparation of compound 24 is similar to that of compound 21 258 mg (0.92 mmol) of (2R) -N- (t-butoxycarbonyl) -2-a Mino-2- [2- (1,3-dithiolan-2-yl)] acetic acid (European Patent (EP) No. 412 No. 350) and 500 mg (0.84 mmol) of 1-{(2R, S, 4S, 5S)-[5 -Amino-6-cyclohexyl-4-vidroxy-2- (2-phenyl) -hex Sanoyl]}-S-isoleucinyl-2-pyridylmethylamide dihydrochloride (Europe Patent (EP) 437 729) and the crude product is treated with 20 g of silica gel (di Chromatography with chloromethane: methanol 9: 1) yielded 593 mg (90%). Compound 24 of)) is obtained as an amorphous powder. Then amine hydrochloride production Similar to 22, but starting from 589 mg (0.75 mmol) of compound 23. 484 mg amine salt The acid salt is obtained as a colorless powder.   Inhibitor 7 was published in European Patent Application (EP) 0 472 077 (this is 1992 Published February 26, 2013, and the entire content is added here by reference) Are known. This inhibitor is It is disclosed therein as an inhibitor having HIV protease activity.   Inhibitor 8 was published in European Patent Application (EP) 0 441 912 (this is 1991 Published August 14, 2012, and the entire content is added here by reference) Are known. This inhibitor was disclosed as an inhibitor of its renin There is.   Inhibitors 9, 15, 16 and 19 are published European Patent Application (EP) No. 0 472 07 Issue 8 (This was published on February 26, 1992 and issued on September 15, 1992 in the United States. Equivalent to national patent No. 5,147,865). The entire contents of both publications Add here by quoting. These inhibitors include HIV protease It is disclosed as an active inhibitor.   Inhibitors 11 and 12 are from German Patent Application (DE) 41 26 485 (this is 199 US Patent Application No. 07 / filed on August 10, 1st, and filed on July 24, 1992 (Corresponding to issue No. 920,216). The entire disclosures of the three publications are here Add by These inhibitors also have HIV protease activity in them. One inhibitor is disclosed. Both of these inhibitors are Can be manufactured by:   First step  To 100 ml of a 4N solution of gaseous hydrogen chloride dissolved in anhydrous dioxane, add 5 .00 g (20.21 mmol) of (S) -2- (tert-butoxycarbonylamino-1-f Enylbute-3-ene [J. R. Luly et al. Org. Chem. 52, 1487, 1987) The solution in which is dissolved is stirred for 30 minutes at room temperature. Then add 15 ml of toluene to obtain The combined mixture is concentrated under reduced pressure. Repeat this step two more times, then remove small amount of residue. Trituate with ether, suck off, filter off and dry under high vacuum over KOH. The following compound 3.69g (99% of theory) as colorless crystals Get as.   Second step  N- (tert-butoxycarbonyl) was added to 40 ml of anhydrous dichloromethane. ) -L-valine 4.81 g (22.13 mmol) and HOBT 3.29 g (24.35 mmol) were dissolved and stirred. The resulting solution was cooled to 0 ° C. and then treated with 5.29 g (25.65 mmol) DDC for 5 minutes. Stir. Next, in 30 ml of dichloroethane, 3.70 g (20.12 mmol) of compound 25 and 8.8 A solution obtained by dissolving 5 g (80.48 mmol) of N-methylmorpholine was added dropwise. . The cooling bath is removed and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours. It is a thin layer that the reaction is completed It was measured by chromatography. The urea formed is filtered off and the filtrate is concentrated under reduced pressure. The crude product was then condensed with 450 g of silica gel (dichloromethane: methanol 95%). : 5) and 6.07 g (87% of theory) of the following compound as a colorless foam obtain.   Third step  To 100 ml of a 4N solution prepared by dissolving gaseous hydrogen chloride in anhydrous dioxane, 6 The solution obtained by dissolving 0.08 g (17.53 mmol) of compound 26 is stirred at room temperature for 30 minutes. Next Toluene (15 ml) was added to the resulting mixture. The material is concentrated under reduced pressure. This process is repeated two more times, then the residue is washed with a small amount of acetone. Triturate, suction and filter off, dry under high vacuum with KOH to give 4.90 g ( 99% of theory) is obtained as a colorless powder.   Fourth step  1.50 g (4.47 mmol) of (2S) -3-tert-butylsulfonyl -2- (1-naphthylmethyl) -propionic acid [H. B Was dissolved in 15 ml of anhydrous dichloromethane, and 0.66 g (4.92 mmol) of HOBT was dissolved in 15 ml of anhydrous dichloromethane. Dissolve and stir to cool the resulting solution to 0 ° C., then treat with 0.97 g (4.69 mmol) DCC. And stir for 5 minutes. Next, 1.15 g (4.07 mmol) of compound 27 and 1.80 ml (16.27 mmol) ) Of N-methylmorpholine in 10 ml of dichloromethane was added dropwise. The reaction mixture is stirred at room temperature for 1 hour. The urea formed is filtered off and the filtrate is reduced. Concentrate under pressure and then chromatograph the crude product on 270 g of silica gel ( 2.01 g (theoretical amount) of the following compound after purification with dichloromethane: methanol 95: 5) 88%) as a colorless foam.   Fifth step  Compound 28 was added to dichloromethane and stirred to obtain a suspension, which was stirred at 0 ° C. And then treated with 2 equivalents of m-chloroperbenzoic acid (MCPBA) (80% concentration). And stir at the above temperature for 2 hours. Add another equivalent of MCPBA and mix The mixture is stirred for another hour at room temperature. Then ethyl acetate was added and the reaction mixture was 10% Na2SO3Add to the solution and stir. Separate the organic layer and wash with NaHCO3Wash 3 times with solution Then MgSOFourTo dry. After evaporation of the solvent under reduced pressure, the residue was washed with a little ether / Trituate with pentane to give the following compound as a colorless powder.   6th step  Compound 29, and (2S) -2- (trifluoromethyl) -pi Rolidine [G. V. Shustov et al., Isvest. Akad. Nauk. SSSR, 1422, 1987 (in English)] (when manufacturing inhibitor 11) or ( 2S) -2- (trifluoromethyl) -piperidine (produces inhibitor 13 A solution of (in case) dissolved in n-propanol is stirred in a pressure vessel at high temperature. Anti The reaction mixture was cooled, concentrated under reduced pressure and then chromatographed on silica gel. Kick The inhibitor is obtained after trituration with n-pentene.   Inhibitors 5 and 6 are included in the general teachings of European Patent No. 0441912, cited above. And can be manufactured according to the manufacturing scheme taught in this patent. It Therefore, the inhibitor 5 can be produced as follows.   First step  L-phenylalanine 300g (1.91mol), dioxane 360ml And 360 ml of water in a mixture. Di-tert butyl dicarbonate 432.9g (1.98 mol) is added with stirring at pH 9.8. This pH is adjusted with about 975 ml of 4N NaOH. Keep constant. After 16 hours, the reaction mixture was extracted with ether and the aqueous layer was quenched. The pH was adjusted to 3-4 with acid and then twice with ether and two times with ethyl acetate. Wash twice. The organic phases are combined and then washed 3 times with water. On a rotary evaporator Concentrated and crystallized from diethyl ether / hexane to give compound 291.6 g (60.7% yield) are obtained.   Second step  Dissolve 265 g (1.0 mol) of compound 30 in 2 L of methanol, Hydrogenate with 5% Rh / C of g under 40 atmospheres for 5 hours. Catalyst Filter off with Celite with suction, wash with methanol and concentrate the resulting solution. . 271 g (100% yield) of the following compound are obtained.   Third step  163.0 g (0.601 mol) of compound 31 and 40.3 g (0.661 mol) of N, Dissolve O-dimethylhydroxylamine in 2 L of methylene chloride at room temperature. At 0 ° C , 303.5 g (3.005 mol) of triethylamine is added dropwise (pH is about 8). salt 390.65 ml (0.601 mol) of a 50% concentration solution of nPPa dissolved in methylene chloride at a maximum of -10 ° C. Add it dropwise. The resulting mixture is warmed to 25 ° C. overnight and stirred for 16 hours. The reaction mixture was concentrated, to the residue was added 500 ml of saturated bicarbonate solution, then the The mixture is stirred at 25 ° C for 20 minutes. After extracting 3 times with ethyl acetate, the organic phase is washed with Na2SOFour Dry at room temperature and concentrate [crude yield: 178 g (94.6%)]. This crude material is Chromatography (mobile phase system CH2Cl2: CH3The following compounds attached to OH 98: 2) 36.6 g are obtained.   Fourth step  Under a nitrogen atmosphere, in a device that was exposed to flame and dried, 63 0.7 g (0.21 mol) of compound 32 was dissolved in 1.5 L of ether treated with alumina, LiAlH4 10 g (0.263 mol) was added in small portions at room temperature and the mixture was then added at 0 ° C for 20 minutes. Stir. Then 50 g (0.367 mol) of KHSOFourCarefully drop a solution of water in 1 L at 0 ° C. Add it down. Phase separation occurs and the aqueous phase is extracted three times with 300 ml of diethyl ether each time. The combined organic phases were discharged and then combined with 3N HCl three times, NaHCO 3.33 times with solution and then with NaCl Wash twice with liquid. The organic phase is Na2SOFourDry and concentrate. 45 g of the following compound (84.1 % Yield).   This compound 33 is either processed immediately or stored at -24 ° C for 1-2 hours.   Fifth step  14.6g (35mmol) of "instant ylide" "(Fluka 69500) is suspended in 90 ml of anhydrous tetrahydrofuran. In ice While cooling, at a reaction temperature of 20 ° C to 25 ° C, 9.0 g (35 m (mol) of compound 33 is added dropwise. The reaction mixture is stirred for 15 minutes. Stir and pour into 250 ml of ice, using 150 ml of ethyl acetate / n-hexane 3: 1. And extract twice. Na2SOFourAfter drying with water and concentration, the residue was chromatographed on silica gel. Raffy (mobile phase ether: hexane 7: 3) was added to 3.2 g (40. 0% yield) is obtained.   6th step  202.4 g (0.8 mol) of compound 34 was dissolved in 1000 ml of mesitylene. , Heat to 140 ° C using a water trap. At this temperature, 197 g (1.6 mol) of N- Benzylhydroxylamine and 1.6 mol of acetaldehyde in 800 ml mesitylene The mixture is added dropwise over 2 hours. After 4 and 8 hours reaction time , N-benzylhydroxylamine and ethyl aldehyde in mesitylene in the same amount Is dripped. After 16 hours of the total reaction time, the mixture was concentrated and the residue was washed with water. Ether and add the resulting mixture to 1M KHSO.FourWash with solution. Na2SOFourDried in After concentration and concentration, the residue is chromatographed on silica gel (mobile phase ether: hexane). Xant 3: 7). The following compounds are obtained.   7th step  18.1 g (45 mmol) of compound 35 (diastereomer C) is dissolved in 300 ml of methanol. Add 14.2g (225mmol) ammonium formate After adding the2Flush thoroughly with 3.6 g of palladium / charcoal (10% ) Is added. The resulting mixture is stirred at reflux for 3 hours. Cool down, then The catalyst was removed by filtration, the solution was concentrated and dissolved in ethyl acetate, then saturated bicarbonate Wash twice with acid salt solution. The organic phase is dried over sodium sulphate, filtered and concentrated, It is then dried under high vacuum. 11.36 g of the compound below is obtained.   8th step  6.6 g (21 mmol) of compound 36 are dissolved in 500 ml of methylene chloride. Block water (CaCl2Tube), pentanoic acid anhydride [2.16 g in 50 ml of methylene chloride] (21 mmol) pentanoic acid and 2.16 g (10.5 mmol) dicyclohexylcarbodiimid It is prepared by filtration and obtained by filtration] and added at room temperature to a solution of methylene chloride. It After 3 hours, concentrate and then pour into ethyl acetate and wash with saturated bicarbonate solution. Clean and dry over sodium sulfate. Filter, concentrate, then dry under high vacuum. It 8.0 g (95.2% of theory) of the following compound are obtained.   9th step  7.57 g (19 mmol) of compound 37 in 70 ml of 4N hydrochloric acid / dioxane Then, shut off the water and stir for 30 minutes. The resulting solution was concentrated and diluted with diethyl ether. Mix and then evaporate to dryness. After drying under high vacuum, 5.54 g (16 .5 mmol), 4.46 g (33 mmol) of HOBT and 16.5 mmol of Boc-Val-OH in 50 methylene chloride. Dissolve in 0 ml. After cooling to 0 ° C, adjust the pH to 8.5 with N-methylmorpholine. Adjust and then add 3.57 g (17.3 mmol) dicyclohexylcarbodiimide It After 16 hours at 20 ° C, urea was filtered off, the solution was concentrated and poured into ethyl acetate, It is then washed with saturated bicarbonate solution. Dry over sodium acetate, then concentrate to Dry under vacuum. The following compounds are obtained.   Tenth step  1.8 mmol of compound 38 in 11 ml of 4N hydrochloric acid / dioxane for 30 minutes Stir. The resulting solution is concentrated and diethyl ether And then evaporated to dryness. After drying under high vacuum, the resulting hydrochloride salt 1.8mmo l is dissolved in 50 ml of methylene chloride and cooled to 0 ° C. BOC-phenylalanine 1.8m After adding mol, adjust the pH to about 8 with triethylamine, then 875.2 mg (1.98 mm ol) benzotriazolyloxy-tris (dimethylamino) -phosphonium Add oxafluorophosphate. React for 16 hours at room temperature, then concentrate, Pour into ethyl acetate and then wash 3 times with saturated bicarbonate solution. Inhibitor 5 Obtained in crude form and then chromatographed on silica gel.   Inhibitor 6 was prepared by reacting 3-methylpentanoic acid [chloride 21 mmol 3-methylpentanoic acid and 2.16 g (10.5 mmo1) disic in 50 ml of methylene Manufactured by filtration with lohexyl carbodiimide and obtained by filtration] in methylene chloride Obtained in an analogous manner to Inhibitor 5, except using the above solution.   Inhibitor 17 is included in the general teachings of the above-mentioned European Patent No. 0472077. And can be manufactured according to the manufacturing scheme taught in this patent. Therefore, the inhibitor 17 can be produced as follows.   First step  To 100 ml of a 4N solution of gaseous hydrogen chloride dissolved in anhydrous dioxane, add 5 0.07 g (20.00 mmol) of (S) -2- (tert-butoxycarbonylamino-1-si) Chlohexylbut-3-ene [J. R. Luly et al. Org. Chem., 52, 1487, 19 87 years] is stirred for 30 minutes at room temperature. Then add 15 ml of toluene The resulting mixture is concentrated under reduced pressure. Repeat this step two more times, then leave The product is triturated with a little ether, filtered off with suction and then dried under high vacuum over KOH. 3.76 g (99% of theory) of the compound below are obtained as colorless crystals.   Second step  4.63 g (21.3 mol) of N- (tert-butoxycarbonyl) -L -Dissolve valine and 3.29 g (24.35 mmol) HOBT in 40 ml anhydrous dichloromethane. The stirred solution was cooled to 0 ° C. and then treated with 5.29 g (25.65 mmol) DDC, then Then stir the mixture for 5 minutes. 3.60 g (19.00 mmol) of compound 39 and 8.85 m A solution of l (80.48 mmol) N-methylmorpholine in 30 ml dichloromethane was added. Add dropwise. The cooling bath is removed and the reaction mixture is stirred at room temperature for 2 hours. Reaction complete Is measured by thin layer chromatography. The urea formed is filtered off and the filtrate is removed. Concentrate under reduced pressure and then concentrate the crude product on 450 g of silica gel (dichloromethane / methanol). 95: 5). 4.33g (65% of theory) below The compound is obtained as colorless crystals.   Third step  To 100 ml of a 4N solution prepared by dissolving gaseous hydrogen chloride in anhydrous dioxane, 4 A solution of 0.32 g (12.30 mmol) of compound 40 is stirred for 30 minutes at room temperature. Next Add 15 ml of Ruen and mix the resulting mixture. Concentrate under reduced pressure. This process is repeated two more times, then the residue is washed with a little ether. Grind, filter by suction, and dry with KOH under high vacuum. Below 3.37g (95% of theory) The compound mentioned is obtained as a colorless powder.   Fourth step  4.47 mmol of Boc-L-cyclohexylalanine [M. C. Khosla Et al., J. Med. Chem., Vol. 15, p. 792, 1972] and 0.66 g (4.92 mmol) of HOBT. Suspend in 15 ml water dichloromethane, stir and cool to 0 ° C, then 0.97 g (4.69 mm ol) with DCC and the resulting mixture is stirred for 5 minutes. Then 4.07 mmol of compound 4 1 and 1.80 ml (16.27 mmol) N-methylmorpholine were dissolved in 10 ml dichloromethane. Solution is added dropwise and then the reaction mixture is stirred at room temperature for 1 hour. Generate The urea was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure, then the crude product was added to 270 g of silica. Chromatography on a kagel (dichloromethane: methanol 95: 5). The following compounds are obtained.   Fifth step  Prepared by adding 0.60 mmol of compound 42 to 3 ml of dichloromethane and stirring. Then, the suspension cooled to 0 ° C. was diluted with 2 equivalents of m-chloroperbenzoic acid (80% concentration). It is treated slowly and the mixture obtained is stirred at the above temperature for 2 hours. Then one more An equivalent amount of m-chloroperbenzoic acid is added, followed by stirring the mixture at room temperature for 1 hour. It 10 ml of ethyl acetate was added and the reaction mixture was mixed with 20 ml of 10% strength Na2SO3Solution of And stir. The organic phase is separated and3Wash 3 times with 10 ml of solution and then MgSOFour To dry. After evaporation of the solvent under reduced pressure, the residue was taken up with a little ether / pentane. Trituration gives inhibitor 17.   Inhibitor 14 was published on July 24, 1991 and is incorporated by reference in US Pat. No. 5,145,951 (1 Corresponding to European Patent Application Publication No. 0437729, issued September 8, 992) Is well known. The entire contents of both of these publications are incorporated herein by reference. This a Inhibitor 14 was found in these publications as an inhibitor of HIV protease activity. It is shown.   Inhibitor 18 was published on December 27, 1990 and filed on April 28, 1992 Currently pending US Patent Application No. 07 / 876,697 (filed May 16, 1990, already abandoned) European patent corresponding to U.S. patent application Ser. No. 07 / 524,779 It is known from Japanese Patent Application No. 0403828. All disclosures of these three applications are It is used as a request. This inhibitor 18 has been identified in these applications as HIV Protea It is disclosed as an inactive bitter.   The specification and claims of the present application are provided for the purpose of illustration and do not limit the invention. And make various modifications and changes without departing from the spirit and scope of the present invention. You will see that you can. Specifically, it is disclosed in the above application. Other inhibitors are also useful as described herein. Claim of the present application This in the range Other embodiments are also included. Sequence listing general information   Applicants: Tambrini, Paul Pea; Benz, Gunter;           Hebig, Dieter   Title of invention: Cathepsin D produces amyloid in Alzheimer's disease               Is a protease   Number of sequences: 9   Notification destination     Recipient: Miles Inc.     Address: Morgan Lane 400     City name: West Haven     State name: Connecticut     Country name: United States     Postal Code (ZIP): 06516   Computer readable form     Media Type: Diskette, 3.50 inch, 800Kb memory     Computer: Sharp PC 4600     Operating system: MS-DOS     Software: Word Perfect 5.1   Data of the application     Application number: not assigned     Filing date:     Classification: Not assigned.   Original application data     Application number: 07 / 995,660     Filing date: December 16, 1992   Original application data     Application number: 07 / 880,914     Filing date: May 11, 1992   Lawyer / patent attorney information     Name: Pamela A Simonton     Registration number: 31,060     Roster Number: MTI 224.2   Communication information     Phone number: (203)937-2340     Facsimile number: (203)937-2975 SEQ ID NO: 1 Array length: 16 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 2 Array length: 12 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 3 Array length: 11 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 4 Sequence length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 5 Sequence length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 6 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 7 Array length: 11 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array SEQ ID NO: 8 Array length: 39 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA Publication information   Author: Kang et al.   Magazine Name: Nature   Volume: 325   Number of pages: 733   Published: 1987 Array SEQ ID NO: 9 Sequence length: 6 Sequence type: Amino acid Topology: linear Array

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＥＤ 9450−4Ｈ Ｃ０７Ｆ 9/572 Ｚ Ｃ０７Ｆ 9/572 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 6807−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 8310−2Ｊ 33/561 33/561 9159−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 207/08 // Ｃ０７Ｄ 207/08 9284−4Ｃ 211/60 211/60 7329−4Ｃ 303/36 303/36 9455−4Ｃ 339/06 339/06 7602−4Ｃ 409/12 ２１１ 409/12 ２１１ 7602−4Ｃ ２１３ ２１３ 7602−4Ｃ 409/14 ２１３ 409/14 ２１３ 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 8517−4Ｈ 7/08 7/08 8517−4Ｈ 14/81 14/81 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ (72)発明者 ベンツ，ギュンター ハンス ハインツ ヘルベルト アメリカ合衆国，コネチカット 06437, ギルフォード，シルバン ヒルズ ロード 81 (72)発明者 ハービッヒ，ディーター ドイツ連邦共和国，デー―42115 ブッペ ルタル，クルマヘールシュトラーセ 82 (72)発明者 ドレイヤー，ロバート ノーマン アメリカ合衆国，コネチカット 06492, ウォーリングフォード，イースト センタ ー ストリート 838─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 45/00 AED 9450-4H C07F 9/572 Z C07F 9/572 9152-4B C12N 9/99 C12N 9/99 6807-4B C12Q 1/37 C12Q 1/37 8310-2J G01N 33/53 D G01N 33/53 8310-2J 33/561 33/561 9159-4C C07D 207/08 // C07D 207/08 9284-4C 211 / 60 211/60 7329-4C 303/36 303/36 9455-4C 339/06 339/06 7602-4C 409/12 211 409/12 211 211602-2C 213 213 7602-4C 409/14 213 409/14 213 8517 -4H C07K 7/06 C07K 7/06 8517-4H 7/08 7/08 8517-4H 14/81 14/81 9455-4C A61K 37/02 ADD (72) Inventor Benz, Gunter Hanns Heinz Herbert United States, Netticat 06437, Guildford, Sylvan Hills Road 81 (72) Inventor Harbich, Dieter Germany, De-42115 Buppertal, Kurmaherstraße 82 (72) Inventor Dreyer, Robert Norman United States, Connecticut 06492, Wallingford, East Center Street 838

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．アルツハイマー症のβ−アミロイドタンパク質の前駆物質に対して特異的 な少なくとも一つのプロテアーゼのインヒビターによってβ−アミロイドタンパ ク質の生成を調節する方法。 ２．前記インヒビターが、アスパラギン酸プロテアーゼ類およびセリンプロテ アーゼ類に対して特異的なインヒビターからなるインヒビター群から選択される 請求の範囲１記載の方法。 ３．アスパラギン酸プロテアーゼ類の前記インヒビターがカテプシンＤを特異 的に阻害する請求項２記載の方法。 ４．セリンプロテアーゼ類の前記インヒビターが、α−２−アンチプラスミン 、キモトリプシンインヒビターIIまたはTPCKで阻害され、かつｐ７〜９において 、11，14および18kDaのAPPのＣ末端フラグメントを形成するセリンプロテアーゼ を特異的に阻害する請求の範囲２記載の方法。 ５．前記インヒビターが、１−デオキシノジリマイシン、ジアゾアセチル−ノ ルロイシンメチルエステル、Gly-Glu-Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu（配列番号 ：６）、回虫ペプシンインヒビターおよびペプスタチンからなる群から選択され る請求の範囲３記載の方法。 ６．前記インヒビターが、下記化合物 からなる群から選択される請求の範囲１記載の方法。 ７．カテプシンＤのインヒビターの治療量を投与することを含んでなる、アル ツハイマー症のアミロイドプラークの生成を防止する方法。 ８．前記インヒビターが、還元型（reduced）アミド類、ヒドロキシアイソス ター（isoster）、ケトンアイソスター、ジヒドロキシアイソスター類、スタチ ン類似体類、ホスホネート類、ホスホンアミド類および逆性（reversed）アミド 類からなる群から選択される反応性スペーサーを含有する遷移状態類似体である 請求の範囲７記載の方法。 ９．前記インヒビターが下記化合物： からなる群から選択される請求の範囲７記載の方法。 10．（ａ）カテプシンＤが触媒として活性である条件下で、カテプシンＤを、 カテプシンＤが切断できるペプチド基質とともにインキュベートして第一インキ ュベート試料を生成させ； （ｂ）インヒビターになる可能性がある物質の存在下で、カテプシンＤを、カテ プシンＤが切断できるペプチド基質とともにインキュベートして第二インキュベ ート試料を生成させ； （ｃ）所定の期間に生成するペプチド生成物の量を分析して、前記第一インキュ ベート試料と前記第二インキュベート試料の生成物の生成速度を計算し； （ｄ）インヒビターになる可能性がある物質の存在下で観察される 減少した酵素活性を計算することを含んでなり、その減少が阻害活性を示す； カテプシンＤのインヒビターの同定方法。 11．前記カテプシンＤがヒトカテプシンＤである請求の範囲10記載の方法。 12．前記ペプチド基質がＮ−ダンシル化されている請求の範囲10記載の方法。 13．アミロイド前駆タンパク質を分解できる分子のタンパク質分解活性の測定 方法であって； （ａ）ヒトから生理学的試料を入手し； （ｂ）上記試料中の、アミロイド前駆タンパク質を分解するプロテアーゼが触媒 として活性である条件下、アミロイド前駆タンパク質基質の存在下で上記試料を インキュベートし； （ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベートを終った混合物の一部分を用いてゲルを 形成し； （ｄ）ステップ（ｃ）のゲルを電気泳動に付して、別個のポリペプチド成分を示 す電気泳動移動パターンを得て； （ｅ）ステップ（ｄ）の前記成分を膜にブロットし； （ｆ）ステップ（ｅ）で得た前記ブロットされた膜を、抗アミロイド前駆タンパ ク質抗体と接触させ； （ｇ）前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体を認識しかつ検出可能なリガンドに 結合されている第二抗体と、前記ブロットされた膜を反応させ；次いで （ｈ）β−アミロイドペプチド配列を含有するのに充分な大きさのフラグメント に対応する領域におけるブロットの染色強度を検査する； ことを含んでなる測定方法。 14．前記生理学的試料が、脳の組織および脳脊髄液からなる群から選択される 請求の範囲13記載の方法。 15．前記生理学的試料がカテプシンＤを含有している請求の範囲14記載の方法 。 16．さらに、前記の生理学的試料を処理して、粗製ホモジネート、可溶性画分 、または界面活性剤で可溶化された膜の画分を得ることを含んでいる請求の範囲 13記載の方法。 17．前記アミロイド前駆タンパク質基質が、点変異を含有する遺伝子配列から 翻訳される請求の範囲13記載の方法。 18．前記アミロイド前駆タンパク質基質が、アミロイド前駆タンパク質のＣ末 端部分に対応する請求の範囲13記載の方法。 19．前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体が、β−アミロイドペプチドおよび アミロイド前駆タンパク質のＣ末端フラグメントからなる群から選択されるペプ チドを認識する請求の範囲13記載の方法。 20．前記Ｃ末端フラグメントが、組換えＣ−100もしくはβ−アミロイドのサ イズマーカーと同時移動することによって検出されるようなＣ−100もしくはβ −アミロイドのペプチドフラグメントを含有している請求項19記載の方法。 21．アミロイド前駆タンパク質に対して特異的なプロテアーゼのインヒビター を同定する方法であって； （ａ）生理学的試料をヒトから得て； （ｂ）上記試料の一部および選択されたアミロイド前駆タンパク質基質で第一イ ンキュベート試料を形成し、次いで前記試料の第二の部分、前記の選択されたア ミロイド前駆タンパク質基質および被験インヒビターで第二インキュベート試料 を形成し； （ｃ）予め決められた期間が経過した後、ステップ（ｂ）のインキ ュベーションを停止し； （ｄ）ステップ（ｃ）のインキュベーションを停止された反応混合物の一部を用 いてゲルを形成し； （ｅ）ステップ（ｄ）のゲルを電気泳動に付して、別個のポリペプチド成分を示 す電気泳動移動パターンを得て； （ｆ）ステップ（ｅ）の前記成分を膜にブロットし； （ｇ）ステップ（ｆ）で得た前記膜を、抗アミロイド前駆タンパク質抗体と接触 させ； （ｈ）前記抗アミロイド前駆タンパク質抗体を認識しかつ検出可能なマーカーに 結合されている第二抗体と、前記ブロットされた膜を反応させ； （ｉ）β−アミロイドの配列を含有するのに充分な大きさのフラグメントに対応 する領域におけるブロットの染色強度を検査し；次いで （ｊ）前記の第一と第二のインキュベート試料から観察される同じサイズのバン ドの染色強度を比較する； ことを含んでなる方法。 22．アミロイド前駆タンパク質に対して特異的な前記プロテアーゼがカテプシ ンＤである請求の範囲21記載の方法。[Claims] 1. A method of modulating β-amyloid protein production by an inhibitor of at least one protease specific for a precursor of Alzheimer's β-amyloid protein. 2. The method of claim 1 wherein said inhibitor is selected from the group of inhibitors consisting of inhibitors specific for aspartic proteases and serine proteases. 3. The method of claim 2, wherein said inhibitor of aspartic proteases specifically inhibits cathepsin D. 4. Said inhibitors of serine proteases specifically inhibit the serine proteases which are inhibited by α-2-antiplasmin, chymotrypsin inhibitor II or TPCK and which in p7-9 form C-terminal fragments of APP of 11, 14 and 18 kDa. The method according to claim 2, wherein the inhibition occurs. 5. The group consisting of 1-deoxynojirimycin, diazoacetyl-norleucine methyl ester, Gly-Glu-Gly-Phe-Leu-Gly-Asp-Phe-Leu (SEQ ID NO: 6), roundworm pepsin inhibitor and pepstatin A method according to claim 3 selected from 6. The inhibitor is the following compound The method of claim 1 selected from the group consisting of: 7. A method of preventing the formation of Alzheimer's amyloid plaque comprising administering a therapeutic amount of an inhibitor of cathepsin D. 8. The inhibitor comprises the group consisting of reduced amides, hydroxy isosters, ketone isosteres, dihydroxy isosteres, statin analogues, phosphonates, phosphonamides and reversed amides. 8. The method of claim 7, which is a transition state analog containing a reactive spacer selected from: 9. The inhibitor is the following compound: The method according to claim 7, which is selected from the group consisting of: Ten. (A) under conditions where cathepsin D is catalytically active, cathepsin D is incubated with a peptide substrate that can be cleaved by cathepsin D to produce a first incubated sample; (b) of potential inhibitors. In the presence, cathepsin D is incubated with a peptide substrate capable of cleaving cathepsin D to produce a second incubated sample; (c) the amount of peptide product produced in a given period of time is analyzed to determine the first incubation. Calculating the rate of product formation of the sample and the second incubated sample; and (d) calculating the reduced enzymatic activity observed in the presence of a potential inhibitor. Shows an inhibitory activity; a method for identifying an inhibitor of cathepsin D. 11. 11. The method according to claim 10, wherein the cathepsin D is human cathepsin D. 12. 11. The method according to claim 10, wherein the peptide substrate is N-dansylated. 13. A method for measuring the proteolytic activity of a molecule capable of degrading an amyloid precursor protein; (a) obtaining a physiological sample from human; (b) a protease in the sample which decomposes the amyloid precursor protein is active as a catalyst. Incubating the sample in the presence of amyloid precursor protein substrate under certain conditions; (c) forming a gel with a portion of the mixture that has been incubated in step (b); (d) the gel in step (c) Is subjected to electrophoresis to obtain an electrophoretic migration pattern showing distinct polypeptide components; (e) the component of step (d) is blotted onto a membrane; (f) the component obtained in step (e). Contacting the blotted membrane with an anti-amyloid precursor protein antibody; (g) recognizing and detecting said anti-amyloid precursor protein antibody The blotted membrane is reacted with a second antibody bound to a ligand; and (h) the intensity of staining of the blot in the region corresponding to the fragment of sufficient size to contain the β-amyloid peptide sequence. Inspecting; a measuring method comprising: 14. 14. The method of claim 13, wherein the physiological sample is selected from the group consisting of brain tissue and cerebrospinal fluid. 15. 15. The method of claim 14, wherein the physiological sample contains cathepsin D. 16． 14. The method of claim 13, further comprising treating the physiological sample to obtain a crude homogenate, a soluble fraction, or a detergent-solubilized membrane fraction. 17. 14. The method of claim 13, wherein the amyloid precursor protein substrate is translated from a gene sequence containing a point mutation. 18. 14. The method of claim 13, wherein the amyloid precursor protein substrate corresponds to the C-terminal portion of the amyloid precursor protein. 19. 14. The method of claim 13, wherein the anti-amyloid precursor protein antibody recognizes a peptide selected from the group consisting of β-amyloid peptide and a C-terminal fragment of amyloid precursor protein. 20. 20. The method of claim 19, wherein the C-terminal fragment contains a C-100 or β-amyloid peptide fragment as detected by co-migration with recombinant C-100 or β-amyloid size marker. . twenty one. A method of identifying an inhibitor of a protease specific for amyloid precursor protein; (a) obtaining a physiological sample from human; (b) a portion of said sample and a selected amyloid precursor protein substrate. Forming a single incubated sample, and then forming a second incubated sample with a second portion of said sample, said selected amyloid precursor protein substrate and test inhibitor; (c) after a predetermined period of time has elapsed, Stopping the incubation of step (b); (d) forming a gel with a portion of the reaction mixture stopped of incubation of step (c); (e) subjecting the gel of step (d) to electrophoresis To obtain an electrophoretic migration pattern indicative of distinct polypeptide components; (f) the components of step (e) are loaded onto the membrane. (G) contacting the membrane obtained in step (f) with an anti-amyloid precursor protein antibody; (h) a second marker that recognizes the anti-amyloid precursor protein antibody and is bound to a detectable marker. Reacting the blotted membrane with two antibodies; (i) examining the blot for staining intensity in the region corresponding to a fragment large enough to contain the sequence of β-amyloid; and (j) Comparing the staining intensity of bands of the same size observed from the first and second incubated samples of. twenty two. 22. The method of claim 21, wherein the protease specific for amyloid precursor protein is cathepsin D.
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