JPH08231600A - Anti-tyrosinase monoclonal antibody f(ab')2 fragment - Google Patents
Anti-tyrosinase monoclonal antibody f(ab')2 fragmentInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトチロシナーゼ検知
に有用な、抗ヒトチロシナーゼ抗体、特に抗チロシナー
ゼモノクローナル抗体のF(ab’)2フラグメント、
その製造法及びそれを用いたチロシナーゼの検知法に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an anti-human tyrosinase antibody, particularly an F (ab ′) 2 fragment of an anti-tyrosinase monoclonal antibody, which is useful for detecting human tyrosinase.
The present invention relates to a method for producing the same and a method for detecting tyrosinase using the method.
【0002】[0002]
【従来の技術】チロシナーゼは生体内でメラニン色素を
生合成する上で最も重要な酵素であり、粗面小胞体のリ
ボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃
縮、活性化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノ
ソームへ選択的に転送されると考えられている。BACKGROUND OF THE INVENTION Tyrosinase is the most important enzyme in biosynthesis of melanin pigment in vivo. It is produced by the ribosome of the rough endoplasmic reticulum, and then concentrated and activated by the endoplasmic reticulum associated with the Golgi apparatus. It is thought to be selectively transferred to the more produced premelanosomes.
【0003】チロシナーゼの生合成が阻害されると、重
大な皮膚障害が起こることが知られており、例えば、色
素異常症は、チロシナーゼ自身の構造の変異やその生合
成過程での異常が原因であるといわれている。また、色
素異常症にはチロシナーゼのプレメラノソームへの選択
的転送の異常が関与している可能性もある。It is known that inhibition of tyrosinase biosynthesis causes serious skin disorders. For example, dyschromatosis is caused by structural changes in tyrosinase itself or abnormalities in its biosynthesis process. It is said that there is. It is also possible that dyschromatosis is involved in abnormal selective transfer of tyrosinase to premelanosomes.
【0004】このような疾病の診断あるいは原因の究明
には、チロシナーゼの構造や生体或は細胞に於ける挙動
を知ることがたいへん有益であると考えられ、かかる観
点から、従来よりチロシナーゼの挙動を知るための努力
がなされてきた。特に抗原・抗体反応を用いた方法は、
感度も高いことから種々の検討がなされてきており、チ
ロシナーゼに対する抗体の作製が古くからなされてき
た。[0004] It is considered very useful to know the structure of tyrosinase and the behavior of tyrosinase in living organisms or cells in order to diagnose such diseases or to investigate their causes. Efforts have been made to know. In particular, the method using the antigen-antibody reaction is
Because of its high sensitivity, various studies have been made, and preparation of antibodies against tyrosinase has been made for a long time.
【0005】この様な研究を踏まえ、本発明者らは抗チ
ロシナーゼモノクロナール抗体を作成し、チロシナーゼ
の検知に有益であることを見いだした。しかしながら代
表的な抗体分子であるイムノグロブリンG(IgG)
は、各種動物種によって異なっており、しかもタンパク
質で構成されているが故に、例えばマウス等のような動
物を用いて作成されたモノクロナール抗体をヒト等の他
種の動物に用いると、モノクロナール抗体が異物認識さ
れ、アレルギー等の原因になったりモノクロナール抗体
に対する抗体により中和無効化されてしまったりする可
能性が高く、これらの改良の余地があった。Based on such studies, the present inventors have prepared an anti-tyrosinase monoclonal antibody and found that it is useful for detecting tyrosinase. However, a typical antibody molecule, immunoglobulin G (IgG)
Vary depending on various animal species and are composed of proteins. Therefore, when a monoclonal antibody prepared using an animal such as a mouse is used for an animal of another species such as human, There is a high possibility that the antibody will be recognized as a foreign substance, cause allergies, or be neutralized and neutralized by the antibody against the monoclonal antibody, and there is room for improvement.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる状況に
鑑みて為されたものであり、異物認識されにくいチロシ
ナーゼの検知手段、及びそのために必要な、抗チロシナ
ーゼ抗体、特に抗チロシナーゼモノクローナル抗体F
(ab’)2フラグメント並びにその製造法を提供する
ことを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a means for detecting tyrosinase that is difficult to recognize a foreign substance, and an anti-tyrosinase antibody, particularly anti-tyrosinase monoclonal antibody F necessary for that purpose.
It is an object to provide an (ab ') 2 fragment and a method for producing the same.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ね、その過程において、チ
ロシナーゼのアミノ酸配列のうちチロシナーゼに非常に
類似した蛋白であるチロシナーゼ関連蛋白(TRP)に
は認められない配列を有するペプチドを抗原に用いるこ
とにより、チロシナーゼに特異的に結合するモノクロナ
ール抗体が得られた。ここで、IgGは抗原を認識し抗
原と結合する2つのFabフラグメント(この2つが結
合したものをF(ab’)2フラグメントと言う)と、
マーカーとなってマクロファージ等の生体側の免疫担当
細胞と結合するFcフラグメントとの2つの部分からな
っているが、本発明で目的としているチロシナーゼの検
知にはFcフラグメントは不要であろうことと、抗原と
の結合の強さはFabフラグメントよりもF(ab’)
2フラグメントの方が強いであろうことを勘案して、F
(ab’)2フラグメントがチロシナーゼの検知に有力
なツールになることを推測し、検討を重ねた結果、この
ことが裏付けられ発明を完成させた。Means for Solving the Problems The present inventor has conducted extensive studies to solve the above problems, and in the process, a tyrosinase-related protein (TRP) which is a protein very similar to tyrosinase in the amino acid sequence of tyrosinase. The monoclonal antibody that specifically binds to tyrosinase was obtained by using a peptide having a sequence not found in (1) as an antigen. Here, IgG refers to two Fab fragments that recognize an antigen and bind to the antigen (the two Fab fragments bound to each other are referred to as F (ab ′) 2 fragments),
It consists of two parts, an Fc fragment that serves as a marker and binds to immunocompetent cells on the living body side such as macrophages, but that the Fc fragment may not be necessary for the detection of tyrosinase, which is the object of the present invention. The strength of binding to the antigen is F (ab ') than that of the Fab fragment.
Considering that 2 fragments would be stronger, F
It was confirmed that the (ab ′) 2 fragment would be a powerful tool for detecting tyrosinase, and as a result of repeated studies, this was confirmed and the invention was completed.
【0008】すなわち、本発明は、チロシナーゼの少な
くとも一部を抗原として認識する抗チロシナーゼ抗体の
F(ab’)2フラグメントである。前記モノクローナ
ル抗体のチロシナーゼに対する認識部位としては、配列
番号1に示すアミノ配列の少なくとも一部が挙げられ
る。また、本発明のF(ab’)2フラグメントの具体
的態様としては、前記抗チロシナーゼ抗体が抗チロシナ
ーゼモノクローナル抗体である上記のF(ab’)2フ
ラグメント、前記モノクローナル抗体がIgGであり、
サブクラスがIgG1である上記のF(ab’)2フラグ
メント、分子量が90000〜120000である上記
のF(ab’)2フラグメント、さらにチロシナーゼが
ヒトチロシナーゼである上記のF(ab’)2フラグメ
ントが挙げられる。That is, the present invention is an F (ab ′) 2 fragment of an anti-tyrosinase antibody that recognizes at least a part of tyrosinase as an antigen. Examples of the recognition site for tyrosinase of the monoclonal antibody include at least a part of the amino sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, as a specific embodiment of the F (ab ′) 2 fragment of the present invention, the above-mentioned F (ab ′) 2 fragment in which the anti-tyrosinase antibody is an anti-tyrosinase monoclonal antibody, and the monoclonal antibody is IgG,
Above F (ab ') subclass is IgG 1 2 fragments, a molecular weight of 90,000 to 120,000 above F (ab') 2 fragment, the above F (ab ') 2 fragment is a further tyrosinase human tyrosinase Can be mentioned.
【0009】また本発明は、下記工程を含む上記のF
(ab’)2フラグメントの製造法を提供する。 (a)チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナー
ゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結
合物を用いて哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞
を取り出し、培養細胞と融合してハイブリドーマを作製
し、(b)チロシナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ
関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選択し、(c)前記ハイブリドーマを適
当な培地で培養した培養上清、あるいは前記ハイブリド
ーマをマウス腹腔内で培養して得られる腹水から抗体蛋
白を採取し、(d)前記抗体蛋白を蛋白分解酵素により
部分消化してF(ab’)2フラグメントとFcフラグ
メントとに切断し、F(ab’)2フラグメントを分離
する。The present invention also provides the above F including the following steps.
A method for producing an (ab ') 2 fragment is provided. (A) After immunizing a mammal with a conjugate of a carrier and a peptide having at least a part of the amino acid sequence having a low homology with the amino acid sequence of a tyrosinase-related protein among the amino acid sequences of tyrosinase, the animal is immunized. Spleen cells are removed and fused with cultured cells to prepare a hybridoma, and (b) a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to tyrosinase and does not bind to tyrosinase-related protein is selected, and (c) the hybridoma is appropriately selected. Antibody protein was collected from the culture supernatant obtained by culturing in a different medium, or ascites obtained by culturing the hybridoma in the abdominal cavity of a mouse, and (d) the antibody protein was partially digested with a proteolytic enzyme to produce F (ab '). Cleave into 2 and Fc fragments to separate the F (ab ') 2 fragment.
【0010】さらに本発明は、上記のF(ab’)2フ
ラグメント又はその検出のための標識を導入した標識化
F(ab’)2フラグメントを用いることを特徴とす
る、チロシナーゼの免疫学的検知法を提供する。Further, the present invention uses the above-mentioned F (ab ') 2 fragment or a labeled F (ab') 2 fragment introduced with a label for the detection thereof, for immunological detection of tyrosinase. Provide the law.
【0011】なお、本明細書において「チロシナーゼに
特異的に結合する」とは、チロシナーゼを抗原として特
異的に認識し、これに結合することをいう。ここで「特
異的に」とは、抗体に関する技術分野において慣用され
ている意味の他、特にヒトチロシナーゼには結合するが
TRPには実質的に結合しないことをいう。The term "specifically binds to tyrosinase" as used herein means to specifically recognize tyrosinase as an antigen and bind to it. The term “specifically” as used herein has the meaning conventionally used in the technical field relating to antibodies, and particularly means that it binds to human tyrosinase but does not substantially bind to TRP.
【0012】以下、本発明を詳細に説明する。The present invention will be described in detail below.
【0013】ヒトチロシナーゼに代表されるチロシナー
ゼのcDNA配列は既に知られており(Hiroaki Yamamo
to et. al., Jpn. J. Genet, 64, 121-135(1989))、ま
た、TRPのcDNA配列も既に知られている(Sigeki
Shibahara et. al., TohokuJ. exp. Med., 156, 403-4
14(1988))。本発明者らはこれらのcDNA配列をアミ
ノ酸配列に翻訳した結果、ヒトチロシナーゼのアミノ酸
配列のうち、配列番号1に示したアミノ酸配列を有する
部分が、TRPと相同性が低いことを見いだした。更
に、この部分は他の動物、例えばマウスのチロシナーゼ
の同領域とも完全には一致しないものの、相同性は高
い。The cDNA sequence of tyrosinase represented by human tyrosinase is already known (Hiroaki Yamamo
to et. al., Jpn. J. Genet, 64, 121-135 (1989)), and the TRP cDNA sequence is already known (Sigeki).
Shibahara et. Al., TohokuJ. Exp. Med., 156, 403-4
14 (1988)). As a result of translating these cDNA sequences into amino acid sequences, the present inventors have found that the portion of the amino acid sequence of human tyrosinase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has low homology with TRP. Furthermore, although this part does not completely match the same region of tyrosinase of other animals, for example, mouse, it has high homology.
【0014】本発明者らは、この点に注目し、上記配列
を有するペプチド(以下、「チロシナーゼに特異的なペ
プチド」ともいう)の合成を(株)ペプチド研究所に委
託した。入手したペプチドを用いて哺乳動物を免疫した
後、脾細胞を取り出し、これを培養細胞と融合すること
によりハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマに
チロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を生産させ
ることに成功した。さらに、その抗体に対し酵素処理を
施すことにより特異性および反応性の高い抗チロシナー
ゼ抗体F(ab’)2フラグメントを得た。Focusing on this point, the present inventors entrusted the peptide research institute to synthesize a peptide having the above sequence (hereinafter, also referred to as "tyrosinase-specific peptide"). After immunizing a mammal with the obtained peptide, spleen cells were taken out and fused with a cultured cell to prepare a hybridoma, and this hybridoma was successfully produced a monoclonal antibody specific for tyrosinase. Furthermore, by subjecting the antibody to enzyme treatment, an anti-tyrosinase antibody F (ab ′) 2 fragment with high specificity and reactivity was obtained.
【0015】以下に、モノクローナル抗体F(ab’)
2フラグメントの製造法の一例を、製造手順に沿って説
明する。Below, the monoclonal antibody F (ab ')
An example of the method for producing 2 fragments will be described along with the production procedure.
【0016】<1>抗原 哺乳動物を免疫する際に用いる抗原としては、ヒトチロ
シナーゼに特異的なアミノ酸配列を有するペプチドが好
適である。そのようなアミノ酸配列として、配列番号1
に示す配列が挙げられる。このアミノ酸配列を有するペ
プチドは常法により化学合成することができる。例え
ば、市販されているペプチドシンセサイザーを用いて、
上記配列を入力すれば上記ペプチドを得ることができ
る。また、ペプチドの受託合成サービスを行っている会
社に依託して入手してもよい。<1> Antigen As an antigen used for immunizing a mammal, a peptide having an amino acid sequence specific for human tyrosinase is preferable. As such an amino acid sequence, SEQ ID NO: 1
The sequences shown in are listed. The peptide having this amino acid sequence can be chemically synthesized by a conventional method. For example, using a commercially available peptide synthesizer,
By inputting the above sequence, the above peptide can be obtained. Alternatively, the peptide may be obtained by entrusting it to a company that provides a peptide synthesis service.
【0017】かくして得られるペプチド(以下、「合成
ペプチド」ともいう)は、そのまま抗原としても用いる
ことができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
(KLH:Keyhole Limpet Hemocyanin)、ウシ血清アル
ブミン(BSA:Bovine SerumAlbumin)、卵白アルブ
ミン(OVA:Ovalbumin)等の担体と結合させて用い
ることもできる。このような担体を用いると、ペプチド
のみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合
でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体
に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマを選
択する段階で取り除くことができる。The peptide thus obtained (hereinafter, also referred to as "synthetic peptide") can be used as it is as an antigen, or may be used as a keyhole limpet hemocyanin (KLH) or bovine serum albumin (BSA). ), Ovalbumin (OVA), or the like. When such a carrier is used, the antigenicity can be enhanced even if the peptide alone has low or no antigenicity. In this case, antibodies against the carrier can be prepared, but they can be removed at the stage of selecting the hybridoma.
【0018】<2>哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、0.5
mg/kg〜50mg/kgの用量で、フロイントの完
全アジュバントまたは不完全アジュバントとともに1〜
2週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の2週間以上
後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法
が挙げられる。<2> Immunization of mammals The mammals to be immunized with the above-mentioned antigens are not particularly limited as long as they are mammals usually used in immunization experiments, and examples thereof include mice, rats and rabbits. In addition, the method of immunization is
It may be carried out according to a usual immunization method, and for example, a synthetic peptide or a synthetic peptide bound to a carrier is
mg / kg to 50 mg / kg with Freund's complete or incomplete adjuvant
Examples include a method in which administration is repeated several times every two weeks, and two or more weeks after the final administration, only the synthetic peptide is administered for final immunization.
【0019】このときの合成ペプチドあるいは担体に結
合させた合成ペプチドの投与量は、1回当たり0.5m
g/kg〜50mg/kg程度が適当である。投与量が
0.5mg/kg未満では抗体を十分に生成しないこと
がある。また、50mg/kgを越えても更なる免疫効
果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目
的とする抗体が得られない恐れがある。The dose of the synthetic peptide or the synthetic peptide bound to the carrier at this time is 0.5 m per dose.
About g / kg to 50 mg / kg is suitable. If the dose is less than 0.5 mg / kg, the antibody may not be sufficiently produced. Further, even if it exceeds 50 mg / kg, no further immune effect can be expected, and further, immunosuppression occurs in vivo, and the desired antibody may not be obtained.
【0020】<3>ハイブリドーマの作製 上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後3〜4日
後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細
胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下
で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細
胞−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。<3> Preparation of hybridoma The animal immunized as described above is sacrificed 3 to 4 days after the final immunization, the spleen is excised, and splenocytes are taken out. A splenocyte-cultured cell hybridoma can be obtained by fusing this cell with a cultured cell that is a fusion partner in the presence of a fusion promoter and selecting the resulting fused cell.
【0021】融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞(骨髄腫細胞)が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。The cultured cells to be fused are not particularly limited as long as they can be fused with splenocytes, but myeloma cells (myeloma cells) are generally suitable. Further, in order to be able to distinguish unfused cells and fused cells after cell fusion, those having a specific drug marker for selection are preferable.
【0022】例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地(HAT培地)中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はHAT
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別で
きる。具体的には、P3X63Ag8.653株、P3/NSI/1-AG4-1
株、FO株、SP2/0-Ag14株等のミエローマ細胞の市販株が
挙げられるが、これらには限定されない。Examples include hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase-deficient ones. Such cells cannot grow in a medium (HAT medium) supplemented with hypoxanthine aminopterin and thymidine, but fused cells of these cells and normal cells are HAT.
It can grow in the medium and can be distinguished from unfused cells. Specifically, P3X63Ag8.653 strain, P3 / NSI / 1-AG4-1
Commercially available strains of myeloma cells such as strains, FO strains, SP2 / 0-Ag14 strains, etc. are mentioned, but not limited thereto.
【0023】細胞融合は通常RPMI1640、MEM
等の培地中で、抗体産生細胞(脾細胞)とミエローマ細
胞とを10:1〜2:1の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量500〜7000のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。Cell fusion is usually RPMI1640, MEM
The antibody-producing cells (spleen cells) and myeloma cells are mixed with a fusion promoter in a medium such as the above at a mixing ratio of 10: 1 to 2: 1. As a fusion accelerator,
There is no particular limitation as long as it is a fusion agent that is commonly used in cell fusion experiments, and specific examples thereof include Sendai virus and polyethylene glycol having an average molecular weight of 500 to 7,000. Alternatively, they may be fused by electric pulses.
【0024】細胞融合を終えた細胞は、例えばRPMI
1640あるいはMEM培地などで希釈し、遠心分離に
より洗浄した細胞をHAT培地等の選択培地に浮遊さ
せ、マルチプレート等に分注して培養を行い、ハイブリ
ドーマのみを生育させるThe cells that have completed cell fusion are, for example, RPMI.
Cells that have been diluted with 1640 or MEM medium and washed by centrifugation are suspended in a selective medium such as HAT medium, dispensed on a multiplate or the like and cultured to grow only hybridomas.
【0025】<4>ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すまわちチロシ
ナーゼに特異的なペプチドに特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する。<4> Selection of hybridoma The hybridoma obtained as described above is a mixture of strains of hybridomas that produce monoclonal antibodies against different antigenic determinant sites among peptides used as antigens or monoclonal antibodies against proteins used as carriers. Since it is the body, a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the synthetic peptide, that is, the peptide specific for tyrosinase is selected from these.
【0026】この選別の方法としては、抗原に用いた合
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法(ELISA法)
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておきこれにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質で標識した第2
抗体を加え、結合した標識量から合成ペプチドに結合す
る抗体量を知ることができる。或は、ハイブリドーマが
産生する抗体を固相化し、これに合成ペプチド、標識第
2抗体を順次加えてインキュベートしてもよい。As a method for this selection, an enzyme immunoassay method (ELISA method) using a synthetic peptide used as an antigen
Is preferred. For example, the synthetic peptide is immobilized on a plastic plate or the like, and the hybridoma culture supernatant is further labeled with an enzyme, a fluorescent substance or a luminescent substance.
The amount of the antibody that binds to the synthetic peptide can be known from the amount of the label that is bound by adding the antibody. Alternatively, the antibody produced by the hybridoma may be solid-phased, and the synthetic peptide and the labeled second antibody may be sequentially added thereto and incubated.
【0027】このようにして得られたハイブリドーマの
1株は、平成6年5月27日より工業技術院生命工学工
業技術研究所(郵便番号305 日本国茨城県つくば市
東一丁目1番3号)に、FEPM P−14340とし
て寄託されており、平成6年9月14日に、この原寄託
からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託
番号FERM BP−4801として寄託されている。One strain of the hybridoma obtained in this way is from the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (Postal Code 305, 1-3-1 Higashi Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan) since May 27, 1994. No. FEPM P-14340, and on September 14, 1994, the original deposit was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty, and the deposit number is FERM BP-4801.
【0028】<5>チロシナーゼに特異的に結合する抗
チロシナーゼ抗体F(ab’)2フラグメントの調製及
びその利用法 上記のようにして得られたハイブリドーマからチロシナ
ーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得るに
は、例えば、抗体産生ハイブリドーマを常法に従って硫
安分画、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー
等で精製すれば、チロシナーゼに特異的なモノクローナ
ル抗体が得られる。これをさらに蛋白分解酵素にて部分
消化し、プロテインAカラムにてFcフラグメントを除
けばF(ab’)2フラグメントが得られる。かかる蛋
白分解酵素としてはpH等の環境を適切に設定すること
により制限的にF(ab’)2を切断し得るものであれ
ば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等
が例示できる。<5> Preparation of anti-tyrosinase antibody F (ab ') 2 fragment that specifically binds to tyrosinase and its utilization method A monoclonal antibody that specifically binds to tyrosinase is obtained from the hybridoma obtained as described above. For example, a monoclonal antibody specific to tyrosinase can be obtained by, for example, purifying an antibody-producing hybridoma by an ammonium sulfate fractionation, gel filtration, affinity chromatography and the like according to a conventional method. This is further digested with a proteolytic enzyme and the Fc fragment is removed on a protein A column to give an F (ab ') 2 fragment. The proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it can cleave F (ab ′) 2 in a restricted manner by appropriately setting the environment such as pH, and examples thereof include pepsin and ficin. .
【0029】また、前記と同様にして合成ペプチドで哺
乳動物を免疫し、その血液から通常の抗体の精製と同様
にしてイムノグロブリン画分を調製すれば、抗チロシナ
ーゼポリクローナル抗体が得られる。こうして得られた
抗チロシナーゼポリクローナル抗体もチロシナーゼに特
異的に結合するものであり、この抗チロシナーゼポリク
ローナル抗体前記蛋白分解酵素で消化しても、本発明の
F(ab’)2フラグメントが得られる。Further, an anti-tyrosinase polyclonal antibody can be obtained by immunizing a mammal with a synthetic peptide in the same manner as described above and preparing an immunoglobulin fraction from the blood in the same manner as in the purification of ordinary antibodies. The anti-tyrosinase polyclonal antibody thus obtained also specifically binds to tyrosinase, and the F (ab ′) 2 fragment of the present invention can be obtained even by digesting with this proteolytic enzyme.
【0030】本発明のチロシナーゼに特異的に結合する
抗チロシナーゼ抗体F(ab’)2フラグメントは、チ
ロシナーゼと特異的に反応するので、ヒト由来の培養細
胞、皮膚組織等の免疫染色における染色体用抗体、さら
にはウェスタンブロットあるいはミクロオートラジオグ
ラフィーにおける染色用抗体として使用可能であり、ヒ
トチロシナーゼの定性あるいは定量のための検知用試薬
として利用することができる。この時、通常のモノクロ
ナール抗体を用いた抗原の免疫学的検知法と同様に、F
(ab’)2フラグメントの検出のための標識を導入し
た標識化F(ab’)2フラグメントを用いることがで
きる。Since the anti-tyrosinase antibody F (ab ') 2 fragment of the present invention which specifically binds to tyrosinase specifically reacts with tyrosinase, it is a chromosomal antibody for immunostaining of human-derived cultured cells, skin tissues, etc. Further, it can be used as an antibody for staining in Western blot or microautoradiography, and can be used as a detection reagent for qualitative or quantitative determination of human tyrosinase. At this time, as in the conventional immunological detection method for antigens using a monoclonal antibody, F
(Ab ') 2 labeled introduced a label for the detection of fragments F (ab') can be used 2 fragments.
【0031】更に、遺伝子組換え技術を利用して、この
F(ab’)2フラグメントとヒトのIgGのFc部分
を組み合わせてキメラモノクロナール抗体として用いる
ことも可能である。Furthermore, it is also possible to use this F (ab ') 2 fragment in combination with the Fc portion of human IgG as a chimeric monoclonal antibody by utilizing gene recombination technology.
【0032】[0032]
【実施例】以下に、本発明について、実施例を挙げて更
に詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に何等限定
を受けないことは云うまでもない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to these examples.
【0033】<1>ハイブリドーマの作製 ペプチドの合成および担体(KLH)への結合は、株式
会社ペプチド研究所に依頼した。<1> Preparation of hybridoma The peptide synthesis and the binding to the carrier (KLH) were requested to Peptide Institute Inc.
【0034】上記の担体結合合成ペプチド100μgを
生理食塩水100μlに溶かし、完全フロイントアジュ
バント(SIGMA製)100μlと混合乳化したもの
を、8週令のBALB/cマウス(日本クレア)の腹腔内に投
与した。その後1週間目と2週間目に、上記担体結合合
成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混合乳
化液200μlを腹腔内投与した。更に、3回目の投与
から2週間後に、50μgの合成ペプチドを溶解した生
理食塩水100μlを静脈注射した。100 μg of the above-mentioned carrier-bound synthetic peptide was dissolved in 100 μl of physiological saline, mixed with 100 μl of complete Freund's adjuvant (manufactured by SIGMA) and emulsified, and intraperitoneally administered to BALB / c mice (CLEA Japan, 8 weeks old). did. Then, 1 week and 2 weeks thereafter, 200 μl of the carrier-bonded synthetic peptide-incomplete Freund's adjuvant equivalent mixed emulsion was intraperitoneally administered. Two weeks after the third administration, 100 μl of physiological saline containing 50 μg of the synthetic peptide was intravenously injected.
【0035】3日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾
細胞をRPMI1640培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.653(大日本製
薬より購入)を、細胞融合に合わせて対数増殖期になる
ように培養し、遠心分離により集めた。After 3 days, the spleen was removed from the mouse, and the splenocytes were suspended in RPMI1640 medium and washed.
On the other hand, mouse myeloma cell line P3X63Ag8.653 (purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was cultured at the logarithmic growth phase in accordance with cell fusion and collected by centrifugation.
【0036】108個の脾細胞に対し、2×107個のミ
エローマを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞を
ペレットにした。上清を除いた後、37℃に保温した5
0%PEG4000(SIGMA製)を含むRPMI1
640培地1mlを1分間で徐々に滴下し、1分間穏や
かに撹拌した。更に、37℃のRPMI1640培地2
mlを2分間で、更に8mlを3分間で撹拌しながら滴
下した。To 10 8 splenocytes, 2 × 10 7 myeloma were mixed in the above medium, and the cells were pelleted by centrifugation. After removing the supernatant, the temperature was kept at 37 ° C.
RPMI1 containing 0% PEG4000 (manufactured by SIGMA)
1 ml of 640 medium was gradually added dropwise over 1 minute and gently stirred for 1 minute. Furthermore, RPMI1640 medium 2 at 37 ° C
ml was added dropwise over 2 minutes and 8 ml over 3 minutes with stirring.
【0037】滴下終了後、遠心分離により上清を除いた
後、細胞ペレットをGIT培地(和光純薬製)40ml
に懸濁し、これを4枚の96ウェルプレート(住友ベー
クライト製)に、1ウェルにつき100μlずつ分注し
た。翌日25μlのHAT培地を添加し、更に4日後2
5μlのHAT培地を添加した。1週間培養した後、培
養上清を半分除き、100μlのGIT培地を添加し
た。After completion of the dropping, the supernatant was removed by centrifugation and the cell pellet was added to 40 ml of GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
100 μl per well was dispensed into four 96-well plates (Sumitomo Bakelite). The next day, 25 μl of HAT medium was added, and 4 days later, 2
5 μl HAT medium was added. After culturing for 1 week, half of the culture supernatant was removed, and 100 μl of GIT medium was added.
【0038】細胞融合から約2週間後、ミエローマと脾
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約1mmになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体(西洋ワサビペル
オキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIg’s(γ
+L)抗体:TAGO社製)を用いたサンドウィッチE
LISA法により検定した。このうち、抗体価の高かっ
たウェル中のハイブリドーマを限界希釈法によるクロー
ニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
株を得た。この株は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に、BP−4801として寄託されている。Approximately 2 weeks after cell fusion, only hybridomas in which myeloma and spleen cells were fused formed colonies, and the culture was continued until the diameter of the colonies became approximately 1 mm. At this point, the antibody secreted in the culture supernatant was
The above synthetic peptide and a commercially available secondary antibody (horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ
+ L) antibody: Sandwich E using TAGO)
It was assayed by the LISA method. Of these, the hybridoma in the well with the highest antibody titer was cloned by the limiting dilution method to obtain a monoclonal antibody-producing hybridoma strain. This strain has been deposited as BP-4801 at the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute.
【0039】<2>チロシナーゼに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体F(ab’)2フラグメントの調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、チロシ
ナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を
行った。<2> Preparation of monoclonal antibody F (ab ') 2 fragment that specifically binds to tyrosinase The hybridoma cell line obtained above was cultured and a monoclonal antibody that specifically binds to tyrosinase was collected. .
【0040】上記ハイブリドーマをGIT培地で培養
し、細胞濃度が約5×106個/mlになったところで
培養上清を遠心分離により回収し、これをポアーサイズ
0.22μmのフィルターでろ過し、ろ液をプロテイン
Aカラムキット(アマシャム・ジャパン製)により精製
し抗チロシナーゼモノクローナル抗体を得た。The above hybridoma was cultured in GIT medium, and when the cell concentration reached about 5 × 10 6 cells / ml, the culture supernatant was recovered by centrifugation, filtered with a filter having a pore size of 0.22 μm, and filtered. The solution was purified with a protein A column kit (manufactured by Amersham Japan) to obtain an anti-tyrosinase monoclonal antibody.
【0041】得られたモノクローナル抗体のクラス及び
サブクラスをアイソタイピングキット(アマシャム・ジ
ャパン製)により調べたところ、クラスはIgGであ
り、サブクラスはIgG1であることが判明した。When the class and subclass of the obtained monoclonal antibody were examined by an isotyping kit (manufactured by Amersham Japan), it was found that the class was IgG and the subclass was IgG 1 .
【0042】得られた抗体をIgG1F(ab’)2調
製キット(ピアス社製)を用いて部分消化し、消化物か
らFcフラグメントをプロテインAカラムに吸着させて
除去し、F(ab’)2フラグメントを得た。このもの
の分子量は、電気泳動により測定したところ10500
0であった。この数値より、得られたフラグメントはF
abフラグメントではなく、F(ab’)2フラグメン
トであることが判った。The obtained antibody was partially digested with an IgG1F (ab ') 2 preparation kit (Pierce), and the Fc fragment was removed from the digest by adsorption on a protein A column to give F (ab') 2. A fragment was obtained. The molecular weight of this product was 10500 when measured by electrophoresis.
It was 0. From this value, the obtained fragment is F
It was found to be an F (ab ') 2 fragment, not the ab fragment.
【0043】<3>抗チロシナーゼモノクローナル抗体
F(ab’)2フラグメントの評価 (1)抗チロシナーゼモノクローナル抗体F(ab’)
2フラグメントのチロシナーゼに対する特異性 上記で得られたモノクローナル抗体について、MeWo
細胞(ヒト悪性黒色腫由来培養細胞)およびHeLa細
胞(ヒト子宮頚ガン由来培養細胞)の抽出物を用いて、
特異性の評価をウエスタンブロット法(エンザイムイム
ノブロット法)により行った。<3> Evaluation of anti-tyrosinase monoclonal antibody F (ab ') 2 fragment (1) Anti-tyrosinase monoclonal antibody F (ab') 2
Specificity of 2 fragments for tyrosinase For the monoclonal antibody obtained above, MeWo
Using an extract of cells (human malignant melanoma-derived cultured cells) and HeLa cells (human cervical cancer-derived cultured cells),
The specificity was evaluated by Western blotting (enzyme immunoblotting).
【0044】培養フラスコで培養したMeWoおよびH
eLa細胞の培養上清を除き、ダルベッコPBSバッフ
ァー(PBS)で数回洗浄した後、細胞をラバーポリス
マンを使用して回収した。回収した細胞を、再びPBS
で数回洗浄し、細胞溶解緩衝液(Triton X−1
00を0.5%含んだ0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液,pH6.9)に懸濁した。MeWo and H cultured in culture flask
After removing the culture supernatant of eLa cells and washing several times with Dulbecco's PBS buffer (PBS), the cells were collected using a rubber policeman. Collected cells are again in PBS
The cells were washed several times with a cell lysis buffer (Triton X-1
00 was suspended in 0.1 M sodium phosphate buffer containing 0.5%, pH 6.9).
【0045】この細胞を、超音波細胞破砕装置(東湘電
機製)で30秒処理して破砕し、16,000×Gで1
0分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、試料蛋白とした。これを、5〜20
%の密度勾配ポリアクリルアミドゲル(パジェル:AT
TO製)を用いた電気泳動に供した。アプライ量は、1
レーン当りタンパク量として10μg/レーンである。
なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終了
後、ゲルを取り出し1レーンを切り取り、チロシナーゼ
の活性染色(DOPA染色)を行いゲル上のチロシナー
ゼの位置を検出した。The cells were crushed by treating with an ultrasonic cell crusher (manufactured by Tosho Denki Co., Ltd.) for 30 seconds and crushed at 16,000 × G.
Centrifugation was performed for 0 minutes. The protein concentration contained in the obtained supernatant was measured and used as a sample protein. 5 to 20
% Density gradient polyacrylamide gel (PAJEL: AT
It was subjected to electrophoresis using TO). Apply amount is 1
The amount of protein per lane is 10 μg / lane.
The electrophoresis was performed according to a conventional method. After completion of the electrophoresis, the gel was taken out, one lane was cut out, and the activity staining of tyrosinase (DOPA staining) was performed to detect the position of tyrosinase on the gel.
【0046】一方、ゲルの残りのレーンをトランスファ
ーバッファー(100mM,Tris;192mM,g
lycin)に浸漬した後、ブロッティング装置(セミ
ドライブロッティング装置:ATTO製)を用い、泳動
物をゲルから、予めトランスファーバッファーに浸漬し
たメンブレン(Immobilon;ミリポア社製)へ
転写した。On the other hand, the remaining lanes of the gel were transferred to transfer buffer (100 mM, Tris; 192 mM, g
After immersing in lycin), the electrophoretic material was transferred from the gel to a membrane (Immobilon; manufactured by Millipore) previously immersed in transfer buffer using a blotting device (semi-dry blotting device: manufactured by ATTO).
【0047】泳動物を転写したメンブレンを、PBSバ
ッファーに15分間浸漬した後、ブロッキングバッファ
ー(5%スキムミルクあるいは1%BSA及び0.1%
Tween20を含むPBSバッファー)に浸し、25
℃で1時間緩やかに振とうした。The membrane on which the electrophoretic material was transferred was immersed in PBS buffer for 15 minutes, and then the blocking buffer (5% skim milk or 1% BSA and 0.1% was added).
Soak in PBS buffer containing Tween 20 for 25
Shake gently for 1 hour at ℃.
【0048】その後、メンブレンを0.1%Tween
20を含むPBSバッファー(TPBSバッファー)を
用いて洗浄(15分1回,5分2回)し、前記<2>で
得られたF(ab’)2フラグメント溶液(5μg/m
l溶液を約2ml)に浸漬し、約1時間25℃で緩やか
に振盪した。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二
次抗体溶液(西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標
識ヤギ抗マウスIg’s(γ+L)抗体:TAGO社
製、10,000倍希釈液を約2ml)に浸漬し、25
℃で約1時間緩やかに振盪した。Thereafter, the membrane was washed with 0.1% Tween.
It was washed with a PBS buffer containing 20 (TPBS buffer) (15 minutes once, 5 minutes twice), and the F (ab ′) 2 fragment solution (5 μg / m) obtained in <2> above.
1 solution was immersed in about 2 ml) and gently shaken at 25 ° C. for about 1 hour. After the membrane was washed, it was further dipped in a commercially available secondary antibody solution (horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ + L) antibody: 10,000 times diluted with TAGO, about 2 ml), 25
It was shaken gently for about 1 hour at ° C.
【0049】メンブレンをTPBSバッファーにより洗
浄(15分1回,5分4回)した後、市販のHRP検出
キット(アマシャム製ECLキット)を使用して、抗チ
ロシナーゼモノクローナル抗体が結合した泳動物のバン
ドを検出した。尚、HRPが結合したバンドは、4−ク
ロロ−1−ナフトールを基質として使用しても検出する
事ができる。After washing the membrane with TPBS buffer (15 minutes once, 5 minutes 4 times), a band of the electrophoresed product to which the anti-tyrosinase monoclonal antibody was bound using a commercially available HRP detection kit (Amersham ECL kit). Was detected. The band to which HRP is bound can also be detected by using 4-chloro-1-naphthol as a substrate.
【0050】上記のようにして行ったイムノブロッティ
ングの結果、前記活性染色の結果からチロシナーゼと考
えられるDOPA染色バンドと同じ位置にバンドが認め
られ、上記で得られたモノクローナル抗体F(ab’)
2フラグメントは、ヒトチロシナーゼ活性を有する蛋白
のバンド、すなわちヒトチロシナーゼに結合することが
判明した。さらにこのモノクローナル抗体は、HeLa
細胞の抽出物には結合しなかった。他の動物種として、
マウス由来のメアラノーマB−16細胞について同様の
処理をしたところ、弱いながらもチロシナーゼ活性を有
する蛋白のバンドに結合した。As a result of the immunoblotting carried out as described above, a band was recognized at the same position as the DOPA-stained band considered to be tyrosinase from the result of the above-mentioned activity staining, and the monoclonal antibody F (ab ') obtained above was obtained.
It was found that the two fragments bind to a protein band having human tyrosinase activity, that is, human tyrosinase. Furthermore, this monoclonal antibody is HeLa
It did not bind to cell extracts. As another animal species,
When the same treatment was performed on the mouse-derived Melanoma B-16 cells, it was bound to a protein band having a weak tyrosinase activity.
【0051】(2)抗チロシナーゼモノクローナル抗体
F(ab’)2の反応性 上記で得られたモノクローナル抗体F(ab’)2フラ
グメントについて、酵素標識抗体測定法(ELISA)
により非特異的染色性を蛋白分解酵素処理してない酵素
未処理のIgGと比較した。(2) Reactivity of anti-tyrosinase monoclonal antibody F (ab ') 2 The monoclonal antibody F (ab') 2 fragment obtained above was subjected to enzyme-labeled antibody assay (ELISA).
The non-specific staining property was compared with that of the enzyme-untreated IgG which was not treated with a protease.
【0052】培養フラスコで培養したMeWo細胞の培
養上清を除き、ダルベッコPBSバッファー(PBS)
で数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを使用して
回収した。回収した細胞を、再びPBSで数回洗浄し、
細胞溶解緩衝液(Triton X−100を0.5%
含んだ0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.9)
に懸濁した。The culture supernatant of MeWo cells cultured in a culture flask was removed, and Dulbecco's PBS buffer (PBS) was added.
After several washes with cells, cells were harvested using a rubber policeman. The collected cells are washed again with PBS several times,
Cell lysis buffer (Triton X-100 0.5%
0.1M sodium phosphate buffer containing, pH 6.9)
Suspended in water.
【0053】この細胞を、超音波細胞破砕装置(東湘電
機製)で30秒処理して破砕し、16,000×Gで1
0分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれるタン
パク濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを、抗原蛋
白とした。The cells were crushed by treating with an ultrasonic cell crusher (manufactured by Tosho Denki Co., Ltd.) for 30 seconds and crushed at 16,000 × G.
Centrifugation was performed for 0 minutes. The protein concentration contained in the obtained supernatant was measured and used as a cell extract. This was designated as an antigen protein.
【0054】次にこの抗原蛋白をELISA用マイクロ
プレート(スミロンtypeH(住友ベークライト
(株)))の各ウェルに抗原蛋白(10μg/ml)を
50μlずつを入れ37℃で1時間放置後1%ウシ血清
由来アルブミンを含むPBS100μlを加え25℃で
1時間ブロッキングを行った。PBSにて2回洗浄しチ
ロシナーゼを含む抗原固相ウェルを作製した。このプレ
ートに精製チロシナーゼモノクローナル抗体IgG(5
00ng/ml)およびF(ab’)2フラグメント
(500ng/ml)を各々50μlを加え、37℃で
1時間インキュベートした。上記と同様に洗浄後、二次
抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識
ヤギ抗マウスIg’s(γ+L)抗体(TAGO社製)
50μlを加え37℃で1時間インキュベートした。同
様に洗浄後、o−フェニレンジアミンハイドロクロライ
ドを含む発色液を75μl加え37℃で30分インキュ
ベートした。25μlの1M硫酸で反応を停止し、42
0nmの吸光度を測定した。Next, 50 μl of the antigenic protein (10 μg / ml) was placed in each well of an ELISA microplate (Sumilon typeH (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)) and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. 100 μl of PBS containing serum-derived albumin was added and blocking was performed at 25 ° C. for 1 hour. It was washed twice with PBS to prepare an antigen solid phase well containing tyrosinase. The purified tyrosinase monoclonal antibody IgG (5
00 ng / ml) and F (ab ′) 2 fragment (500 ng / ml) were added in an amount of 50 μl each, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing in the same manner as described above, horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse Ig's (γ + L) antibody (manufactured by TAGO) as a secondary antibody
50 μl was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing in the same manner, 75 μl of a coloring solution containing o-phenylenediamine hydrochloride was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Stop the reaction with 25 μl of 1M sulfuric acid and
The absorbance at 0 nm was measured.
【0055】表1に示すようにチロシナーゼに対する反
応性はIgGに比較してF(ab’)2のほうが高く実
使用においてはさらに低い濃度で使用する事ができ、非
特異的反応を防止することができる。更にこのことよ
り、Fcフラグメントはチロシナーゼの認識・結合に不
要であることが判る。従って、Fcフラグメントを取り
除いた、本発明のF(ab’)2フラグメントは抗チロ
シナーゼモノクロナール抗体そのものよりも、Fc部分
が少ないだけ異物認識されにくいことが期待できる。As shown in Table 1, the reactivity to tyrosinase is higher in F (ab ') 2 than in IgG, so that it can be used at a lower concentration in actual use and non-specific reaction can be prevented. You can Furthermore, this indicates that the Fc fragment is not required for tyrosinase recognition and binding. Therefore, the F (ab ′) 2 fragment of the present invention from which the Fc fragment has been removed can be expected to be less likely to be recognized as a foreign substance than the anti-tyrosinase monoclonal antibody itself, because the Fc portion is small.
【0056】[0056]
【表1】 [Table 1]
【0057】[0057]
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体のF(a
b')2フラグメントは、ヒトチロシナーゼに対する反応
性が高く非特異的結合を防止することが可能である。こ
のモノクローナル抗体は、本発明の方法により得られ
る。EFFECT OF THE INVENTION F (a of the monoclonal antibody of the present invention
The b ′) 2 fragment is highly reactive with human tyrosinase and can prevent nonspecific binding. This monoclonal antibody is obtained by the method of the present invention.
【0058】[0058]
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:14 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu 1 5 10[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 14 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu 1 5 10
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/563 G01N 33/577 B 33/573 A61K 39/395 P 33/577 9281−4B C12N 5/00 B // A61K 39/395 9162−4B 15/00 ZNAC (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 柴田 孝史 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560ポーラ化 成工業株式会社戸塚研究所内 (72)発明者 加藤 朋美 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560ポーラ化 成工業株式会社戸塚研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/563 G01N 33/577 B 33/573 A61K 39/395 P 33/577 9281-4B C12N 5 / 00 B // A61K 39/395 9162-4B 15/00 ZNAC (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Takashi Shibata 560 Kashio-cho, Totsuka-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Pola Chemical Industry Co., Ltd. Totsuka Kenkyu Co., Ltd. (72) Inventor Tomomi Kato 560 Kashio-cho, Totsuka-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Pola Chemical Industry Co., Ltd. Totsuka Laboratory
Claims (8)
して認識する抗チロシナーゼ抗体のF(ab’)2フラ
グメント。1. An F (ab ′) 2 fragment of an anti-tyrosinase antibody that recognizes at least part of tyrosinase as an antigen.
位が配列番号1に示すアミノ配列の少なくとも一部であ
る請求項1記載のF(ab’)2フラグメント。2. The F (ab ′) 2 fragment according to claim 1, wherein the recognition site for tyrosinase of the antibody is at least a part of the amino sequence shown in SEQ ID NO: 1.
求項1又は2記載のF(ab’)2フラグメント。3. The F (ab ′) 2 fragment according to claim 1 or 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
り、サブクラスがIgG1である請求項3のF(a
b’)2フラグメント。4. The F (a) of claim 3, wherein the monoclonal antibody is IgG and the subclass is IgG 1.
b ') 2 fragments.
来である請求項3又は4記載のF(ab’)2フラグメ
ント。5. The F (ab ′) 2 fragment according to claim 3, wherein the monoclonal antibody is derived from mouse cells.
る、請求項1〜5の何れか一項に記載のF(ab’)2
フラグメント。6. The F (ab ′) 2 according to any one of claims 1 to 5, wherein the tyrosinase is human tyrosinase.
Fragment.
b’)2フラグメントの製造法、 (a)チロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナー
ゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結
合物を用いて哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞
を取り出し、培養細胞と融合してハイブリドーマを作製
し、 (b)チロシナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連
蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択し、 (c)前記ハイブリドーマを適当な培地で培養した培養
上清、あるいは前記ハイブリドーマをマウス腹腔内で培
養して得られる腹水から抗体蛋白を採取し、 (d)前記抗体蛋白を蛋白分解酵素により部分消化して
F(ab’)2フラグメントとFcフラグメントとに切
断し、F(ab’)2フラグメントを分離する。7. The F (a) according to claim 3, including the following steps.
b ′) Method for producing 2 fragment, (a) Using a conjugate of a peptide having at least a part of an amino acid sequence of a region having low homology with the amino acid sequence of a tyrosinase-related protein in the amino acid sequence of tyrosinase, and a carrier After immunizing a mammal, splenocytes of the animal are taken out, fused with cultured cells to prepare a hybridoma, and (b) a hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to tyrosinase and does not bind to a tyrosinase-related protein is selected. And (c) an antibody protein is collected from a culture supernatant obtained by culturing the hybridoma in an appropriate medium, or ascites obtained by culturing the hybridoma in the abdominal cavity of a mouse, and (d) the antibody protein is treated with a protease. Partially digested and cleaved into F (ab ') 2 and Fc fragments to obtain F (ab') 2 fragment Separate the components.
(ab’)2フラグメント又はその検出のための標識を
導入した標識化F(ab’)2フラグメントを用いるこ
とを特徴とする、チロシナーゼの免疫学的検知法。8. The F according to any one of claims 1 to 7.
An immunological detection method for tyrosinase, which comprises using a (ab ′) 2 fragment or a labeled F (ab ′) 2 fragment into which a label for detecting the fragment has been introduced.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04209295A JP3522877B2 (en) | 1995-03-01 | 1995-03-01 | Anti-tyrosinase monoclonal antibody F (ab ') 2 fragment |
Applications Claiming Priority (1)
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1995
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