JPH08507288A

JPH08507288A - Ｉｌ−２による未成熟なトリの処置法

Info

Publication number: JPH08507288A
Application number: JP6513544A
Authority: JP
Inventors: リックス，キャサリン・エイ; フェルプス，パトリシア・ヴイ
Original assignee: エンブレクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-10
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 1996-08-06
Also published as: EP0688168A1; EP0688168A4; IL108593A0; ZA941374B; AU6100594A; WO1994019944A1; CA2156090A1; AU677040B2; BR9405994A

Abstract

(57)【要約】未成熟なトリにおいて細菌感染症を抑制する有効量のインターロイキン-2（IL-2）から成るT-細胞増殖因子を未成熟なトリに投与することによって、未成熟なトリにおいて大腸菌およびサルモネラ菌感染症を含む細菌感染症を抑制する方法が明らかにされている。本法は、インキュベーション約18日目のニワトリにおいて実施するのが望ましい。

Description

【発明の詳細な説明】ＩＬ−２による未成熟なトリの処置法発明の範囲本発明は、細菌感染症を抑制するためにインターロイキン-2を投与することによるトリの処置法に関する。発明の背景卵から孵化するトリは、割れた卵殻と殻膜から遊離する病原菌に晒される。吸入あるいは経口的にトリの体内に摂取された細菌は、呼吸器または胃腸管の粘膜にコロニー形成し、上皮バリアーを通過することができる。孵化したトリは最初は母体由来の抗体によって病原菌から防御されている。しかし、母体由来の抗体は、トリ自身の免疫システムがまだ未熟な孵化前後の期間に、一時的な防御機能を提供するに過ぎない。天然の抗体合成により未成熟なトリを病原菌から十分に防御できるようになる前に、母体由来の抗体レベルが弱まることがしばしばあり、これが抗体レベル低下の原因となる。この抗体レベルの低下は、孵化後２週目から３週目に起こり、病原菌による死亡率のピーク、特に孵化後３週目から４週目の大腸菌性敗血症を伴うことがしばしばある。 BerkhoffおよびVinalの米国特許第4,775,621号は、孵卵器内に侵入性大腸菌が存在するか否かを決定することによりトリにおける大腸菌性敗血症の診断法について論じているが、大腸菌性敗血症の治療法については論じていない。前記の理由から、トリにおける細菌感染症を抑制する新しい手段が今なお必要である。発明の要約未成熟なトリの処置方法がここに明らかにされている。この方法は、未成熟なトリにおいて細菌感染症を抑制する有効量のインターロイキン-2（IL-2）を、未成熟なトリに投与することから成る。未成熟なトリにおいて大腸菌感染症を抑制する有効量のインターロイキン-2（ IL-2）を未成熟なトリに投与することから成る未成熟なトリにおける大腸菌感染症を抑制するための未成熟なトリの処置方法も明らかにされている。上記方法の特定の実施例は、一群のトリにおいて大腸菌性敗血症性感染症を抑制する方法を示している。この方法は、未成熟なトリに大腸菌感染症を抑制する有効量のIL-2を卵内（in ovo）投与し、トリを共通の孵卵器内で一緒に孵化させるためにインキュベートし、続いて少なくとも２週令までトリを飼育することから成る。未成熟なトリにおいてサルモネラ菌感染症を抑制する有効量のインターロイキン-2（IL-2）を、トリに投与することから成る未成熟なトリにおけるサルモネラ菌感染症を抑制するための未成熟なトリの処置方法も明らかにされている。本発明の別の面は、ここに既述されている処置法を実行するための薬剤を調製するためのIL-2の使用である。米国特許第5,028,421号は、トリにIL-2を卵内投与し、孵化後の体重増加を促進する方法と、ワクチンと併用するIL-2の卵内投与を明らかにしている。米国特許第5,106,617号は、孵化後の未成熟なトリにIL-2を投与することにより、未成熟なトリの体重増加を誘発する方法を明らかにしている。今、予想外ではあったが、トリに卵内投与されたIL-2は、細菌感染症、特に大腸菌およびサルモネラ菌感染症を抑制することが明らかにされた。IL-2がこのような効果を引き起こす能力を有することは、今まで報告されていない。発明の詳細な説明ここに使用される“トリ”という言葉は、全ての鳥類の雄または雌を含めることを意図しているが、卵や肉を得るために商業的に飼育される家禽を含めることを主として意図している。従って、“トリ”という言葉は、特にオンドリ、メンドリ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジを含むことを意図している。一般にトリと呼ぶこととする。ここに使用される“未成熟”という言葉は、成年に達していないトリ全てを含むことを意図しており、卵内（in ovo）のトリを含む。ここに使用される“インターロイキン-2（IL-2）”という言葉は、ウシ、ヒツジ、ネズミ、ヒトまたはトリのIL-2を含む全ての種のIL-2を指す。米国特許第5, 106,617号および第5,028,421号（ここで引用した米国特許の全ての開示内容を引用することにより本明細書の一部とすることを、出願人は特に意図している。）に記載されているように、多くの種類のIL-2が公知である。ここに使用される“トリのIL-2”という言葉は、あらゆる鳥類によって生産されるIL-2に相当するIL-2を意味する。“トリの（avian）”という言葉は、全てのトリ種を含むことを意図しており、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジを含むが、これらに限定されない。様々なトリのIL-2が公知である。例えば、米国特許第5,028,421号および第5,106,617号を参照すること。簡単に述べれば、トリのIL-2は、トリのドナー（トリのドナーの脾臓から最も得やすい）からリンパ球を収集することによって得られ、コンカナバリンＡ（Conc anavalinA）のようなＴ細胞分裂促進剤を含む培地（血清を含まない培地が望ましい）内でリンパ球を増殖させ、任意に、培地からIL-2を回収する。従って、IL -2条件培地そのものをIL-2投与に使用できる。本発明の実施にトリのIL-2を使用する際、少なくとも血清と分裂促進因子を実質的に含まないことが望ましいが、トリのIL-2の純度は重要ではない。粗IL-2製剤は、種々の公知の分離法のいずれによっても精製でき、これらの分離法から得られた種々の分画は、本技術において公知のIL-2分析法によりIL-2活性をスクリーニングすることができる。IL-2は、適切な薬剤学的に許容可能な担体のいずれかに含めて供給できるが、燐酸緩衝食塩水のような水性担体に含めて供給するのが望ましい。種々のトリ種のIL-2の交差反応性は、IL-2応答細胞を用いる公知のバイオアッセイ法によりルーチンで決定することができる。例えば、Schnetzler et al.，上記、561を参照。あるいは、１標本群のトリにIL-2を卵内投与し、その種におけるIL-2活性を決定することによって簡単にスクリーニングできる。一般に、いずれの場合でも、投与されるIL-2が由来する種と、処置されるトリの種が近い程、投与されるトリにおけるIL-2の生物活性は高いものと予想される。従って、ここに明らかにされた方法において投与されるIL-2が由来する種は、処置される被験動物の種と一致していることが望ましいが、必須ではない。本技術に精通する者は、公知のIL-2の交差反応性と、本技術に精通する者にとって公知の簡単なスクリーニングテストに基づき、処置されるトリに適切なIL-2組成を選択することができる。トリ１羽あたりのIL-2投与量は、処置される種によって、IL-2が由来する種によって、被験動物の年齢によって、トリの注入部位によって、IL-2の純度によって異なる。上記に述べたように、ニワトリのIL-2は、14K種と30K種として存在する。Fred ericksenおよびSharma、上記；Schnetzler、上記、565を参照。30K種は、天然型と考えられている。米国特許第5,028,421号の実施例３（ここで引用する全ての引用特許の開示内容は、引用することにより本明細書の一部とする）に従って調製され、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）によって97％の純度であることが明らかにされた30KトリIL-2製剤から、タンパク質１ミリグラム当たり約100〜30 0活性単位の30KトリIL-2が得られる。本発明を実施するには、卵あたり約0.0035 活性単位以上の量のトリIL-2を投与する。より望ましくは、卵あたり約0.035活性単位以上の量のIL-2を投与する。本発明を実施するには、卵あたり約35活性単位までの量のトリIL-2を投与する。より望ましくは、卵あたり約3.5活性単位までの量のIL-2を投与する。本発明を実施する際、IL-2はIL-2条件培地の形態で投与することができる。例えば、インキュベーション約18日目にIL-2条件培地を投与されたニワトリにおいて、本発明の方法によって陽性の結果が予想される。この場合、投与されたIL-2 条件培地は、卵あたり約0.0035活性単位以上の量のトリIL-2を含む。より望ましくは、投与されたIL-2条件培地は、卵あたり約0.035活性単位以上の量のトリIL- 2を含む。本発明を実施する際、投与されるIL-2条件培地は、卵あたり約35活性単位までの量のトリIL-2を含む。より望ましくは、投与されるIL-2条件培地は、卵あたり約3.5活性単位までの量のトリIL-2を含む。本出願人が知るかぎり、トリIL-2の類似体はまだ合成されていない。しかし、トリ種以外における種々のIL-2の交差反応性を考えると、入手可能ならば、トリ IL-2の合成類似体を、本発明における活性に関して一般的な方法でスクリーニングすることができ、天然に存在するIL-2と実質的に同じ方法で本発明において機能する筈である。ここに使用される“卵内（in ovo）”という言葉は、孵化前の卵の中にはいっているトリを指す。従って、本発明は、卵を処置する方法と、トリを処置する方法の両者と考えることができる。本発明は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジを含むどのような種類のトリの卵を用いても実施できる。ニワトリとシチメンチョウの卵が望ましく、ニワトリの卵が最も望ましい。本発明の方法によって処置される卵はインキュベーションの第４四半期にある受精卵が望ましい。ニワトリの卵は、インキュベーション約15日目から19日目の間に処置され、インキュベーション約18日目（胚発生の１８日目）に処置されるのが最も望ましい。シチメンチョウの卵はインキュベーション約21日目から26日目に処置されるのが望ましく、インキュベーション約25日目が最も望ましい。本発明は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両者の感染症を抑制するのに使用できる。このようなグラム陽性菌には、パスツレラ（Pasteurella）属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性菌には、大腸菌、シュードモナス属、サルモネラ属が含まれるが、これらに限定されない。腸炎菌（Salmonella enteriditis）は、商業用産卵業界において重要な病原菌である。産卵鶏の卵巣にコロニー形成すると、食用卵にサルモネラ菌が母体感染することがあるからである。ここに使用される“大腸菌性敗血症（colisepticemia）”という言葉は、侵入性大腸菌によって引き起こされる大腸菌感染症による敗血症を指す。大腸菌の株の中には非侵入性のものもあるが、宿主組織に侵入することができ、重篤な疾病を引き起こす侵入性株が存在する。大腸菌性敗血症が家禽に伝染する経路はまだ十分判明していない。本発明において、IL-2条件培地を使用する投与を含むIL-2の未成熟なトリへの投与は、卵内投与、静脈内注入、腹腔内注入、皮下注入等の適切などの方法によっても実施できる。殻を通して化合物を送達するどのような手段によっても卵に IL-2を投与できる。しかし、望ましい投与方法は注入法である。注入部位は、羊水と胚そのものを含む羊膜によって囲まれた領域内、卵黄包内、あるいは気室内が望ましい。インキュベーションの第４四半期が始まるまでに、羊膜は十分大きくなっているので、卵の大きい方の端の中央から長軸に沿って注入すれば、殆どいつでも確実に羊膜から透過させることができる。ワクチンは、IL-2と同じ方法で、同じ部位に投与できる。注入のメカニズムは重要ではないが、胚の組織および器官あるいは胚を取り囲んでいる胚外膜を不当に障害せず、従って処置により斬化率を低下させない方法が望ましい。約18ないし22ゲージ注射針が付いた皮下シリンジがこの目的に適っている。気室内に注入するには、卵の中に針を約２ミリメートル挿入するだけでよい。１インチ針を卵の大きい方の端の中央から完全に挿入すると、殻、気室を取り囲む外殻および内殻膜、および羊膜を貫通する。胚の発生段階と位置が正確ならば、この長さの針の末端は、ヒナの上方の羊水かヒナ自体の中に入る。針が破損したり、鈍くなるのを防止するために、針を挿入する前に殻に試験的に穴を開けたり、ドリルで穴を開けることができる。希望する場合には、望ましくない細菌が続いて侵入するのを予防するために、ワックス等の実質的に細菌不透過性の密封材料で卵を密封することができる。本発明を実施するにあたり、トリ胚用高速自動注入システムが特に適切と考えられる。多くのこの種の機器が入手可能であり、多くの例が以下の米国特許に明らかにされている。Hebrankの米国特許第4,903,635号および第4,681,063号、Lew isの米国特許第5,056,464号、Millerの米国特許第4,040,388号、第4,469,047号および第4,593,646号（ここで引用する全ての特許の開示内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。本発明の実施用に改変されたこのような機器は全て、ここに報告されているように、トリIL-2を含む注入器を有し、この注入器は、この装置により保持された卵にトリIL-2を注入できるように配置される。この装置のその他の特徴は、上記に論じられている。更に、必要な場合には、注入後卵の穴を封ずるために、注入装置と関連して作動する密封装置も供給できる。本発明を実施するために望ましい装置がHebrankの米国特許第4,903,635号、Le wisの米国特許第5,056,464号に明らかにされており、引用することにより、これらの開示内容は本明細書の一部をなすものとする。これらの装置は、液体物質を複数の卵に注入するための注入装置と注入装置に対してそれらの卵を一列に並べる装置から成る。本発明を実施するために、これらの装置の特徴を、上記に記載された装置の特徴と組み合わせることができる。本発明を実施する場合には、注入された卵をインキュベートして孵化させ、トリは少なくとも２週令まで飼育する。以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明するために提示されたもので、それらを限定するものと見なすべきではない。以下の実施例において、℃はセ氏温度を意味し、μはミクロンを、mmはミリメートルを、cmはセンチメートルを、ccは立法センチメートルを、mlはミリリットルを、μｌはマイクロリットルを、gはグラムを、mgはミリグラムを、μｇはマイクログラムを、nは数を、ozはオンスを、Mはモルを、mMはミリモルを、TSBはトリプチケース大豆肉汁（trypticase s oy broth）を、PBSは燐酸緩衝食塩水（pH=7.4）を、IL-2はトリインターロイキン-2を、IL2CMはトリインターロイキン-2条件培地を、Con-Aはコンカナバリン-A （Concanavalin A）を、RBCは赤血球を、rpmは１分間当たりの回転数を、CO₂は二酸化炭素を、CFUはコロニー形成単位を、IMは筋肉内を、MTTは3-［4,5-ジメチルチアゾリル-2］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを、RPMIはロズウェルパーク記念研究所を、ODは光学密度を意味する。実施例１脾臓細胞の調製脾臓は、４週令から10週令のハイライン、SCニワトリから入手し、被膜を剥離した脾臓から１つの細胞から成る懸濁液を調製した。具体的に述べると、脾臓を燐酸緩衝食塩水（PBS）（pH＝7.4）に入れ、５mlのシリンジに通し、続いて18ゲージの注射針に通した。懸濁液を室温で５分間放置し、間質を沈殿させ、上清を収集した。沈殿した間質に更に５mlのPBSを加え、混合し、５分間放置し、上清を収集し、最初の上清と共にプールした。次に、これらの細胞からペレットを得、下記の実施例２に記載されているRPMI-G培地を加える前に、PBSで２回洗浄した。トリパンブルー色素除外法により測定した細胞の生存可能性は95％以上であった。実施例２ IL-2条件培地の調製 RPMI-G培地は、L-グルタミン（２mM）を補足したRPMI-1640培地と硫酸ゲンタマイシン（50マイクログラム／ミリリットル）（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）から構成された。脾臓から調製した１つの細胞から成る懸濁液を、RPMI-G培地50ミリリットルを含む75立法センチメートルのフラスコの中に、６×10⁶細胞／ミリリットルの細胞濃度となるように入れ、コンカナバリンＡ（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ州）の濃度を４マイクログラム／ミリリットルにした。40℃の５％CO₂を含む加湿された大気中で64〜96時間インキュベート後、これらの培養からIL-2条件培地（IL2CM）が得られた。生成ピークは96時間後であった。実施例３ＩＬ−２分析トリIL-2の活性は、分裂促進剤に予め接触させておいたT-細胞のin vitroの増殖反応によって規定される。増殖反応は、特定の色素（MTT、すなわち3-［4,5- ジメチルチアゾリル-2］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）のミトコンドリアの取り込み量によって示される。１活性単位は、以下の細胞増殖分析において測定される最大増殖反応の50％すなわち1／2を引き起こす物質の量として定義される。１．リンパ球懸濁液の調製ニワトリを屠殺し、摘出した脾臓をゲンタマイシン（gentamicin）を含む冷たいPBS（PBS1000mlあたり25mg／mlのゲンタマイシンを2ml加えたもの）に入れる。脾臓の被膜を除去し、滅菌シリンジを通して押し出し、組織を細かくする。３つの脾臓から得られた細かく刻まれた組織のスラリーを18ゲージの注射針を通して、50mlの試験管内に移し、冷たいPBSを加え、容量を50mlにする。細胞間質と余分な組織を除去するために、組織スラリーを７分間沈殿させ、各試験管の上部から細胞懸濁液35mlを除去する。各試験管の残りの間質にPBSを加え、総容量を約47mlにする。15mlの目盛りより上の細胞懸濁液を除去し、最初に収集した懸濁液と合わせてプールする。細胞懸濁液を200rpmで5分間遠心分離し、余分なRBCを除去する。次に、上清を1500rpmで15分間遠心分離する。上清をデカントし（ペレットは取っておく）、1500rpmで15分間再度遠心分離する。各ペレットを50mlの冷たいPBSに再懸濁し、上清と共に遠心分離する（1500rpm で15分間）。次に、上清を廃棄し、細胞ペレットを50mlまたはそれ以下の冷たい PBSの中にプールする。細胞懸濁液を均等に2つに分け、各容量をPBSで37mlにする。頂部にPBSに溶解した60％パーコル（Percoll）12mlを、底部にPBSに溶解した2 0％パーコル15mlを用いて、パーコル密度勾配を調製する。各密度勾配の上に細胞懸濁液6mlを載せ、15℃で2000rpmで25分間遠心分離する。各密度勾配から白色細胞を除去し、別の50ml試験管の中に入れる。冷たいPBSを加え各試験管の総容量を50mlにし、1600rpmで10分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットをプールし、総容量35から40mlの冷たいPBS中に再懸濁し、1200rpmで10分間遠心分離する。上記の実施例１から得られた細胞ペレットを総容量35から45mlのRPMI培養培地に再懸濁する。総容量500mlのRPMI培養培地のそれぞれに関して、RPMI（シグマ社カタログ番号R-7509 RPMI 1640、フェノールレッドを含まない）に、100×L- グルタミン５mlとゲンタマイシン（25mg／ml）１mlを混合する。細胞は、４％トリパンブルー（Trypan Blue）中の１：100の希釈係数で計数される（すなわち、450μｌのトリパンブルー＋50μｌの細胞＝１：10；50μｌの１：10＋450μｌのトリパンブルー＝１：100）。細胞を、RPMI培養培地に15×10⁶ 個／cm²で接種する。遊離Con-Aを加え、リンパ芽球の変換を促進する。組織培養グレードのコンカナバリンＡ（シグマ社、カタログ番号C-5275）、２μg／ml 培地が必要である。フラスコ内に100mlの細胞懸濁液を入れて、リンパ芽球を変換するために、細胞懸濁液をインキュベートする。各フラスコに５％CO₂を含む空気を30秒間供給し、37℃で５％CO₂中に横倒しにする。ガス交換ができるように、フラスコのキャップを緩め、フラスコを44時間から48時間インキュベートする。２．分析用細胞収集細胞と培地を50ml／試験管で、1200rpm 10分間遠心分離する。細胞ペレットを総容量25mlのRPMI培地内にプールし、40℃で15分間インキュベートする。細胞懸濁液を混合し、遠心分離器の中に入れ、400rpmにして、遠心分離器のスイッチを切る。上清を保存し（ペレットは廃棄する）、100rpmで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを15ml試験管中のRPMI培地10mlの中に再懸濁する。細胞懸濁液を氷上に30分間おき、凝集沈殿させる。約９mlの細胞懸濁液を試験管からピペットで取り出し、残りの凝集物を廃棄する。細胞懸濁液を400rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞ペレットを５〜７mlのRPMI培地に、３×10⁶細胞／mlの濃度で再懸濁する。３．細胞増殖分析 96ウェルミクロタイタープレートを使用する。各プレートの上、下、横の外側の１つのウェルにウェル当たり200μｌのPBSを入れる。残りのウェルに次の添加剤を含むRPMI培地（シグマ社カタログ番号R-7509 RPMI 1640、フェノールレッドを含まないもの）を100μｌ入れる。ゲンタマイシン１ml（硫酸ゲンタマイシン、カタログ番号16051、米国バイオケミカル社）；L-グルタミン（100×／500ml を５ml；ジブコ社（Gibco），カタログ番号321-5030A6）；２％H.I．ニワトリ血清（シグマ社、カタログ番号C5405）；0.1Mマノピラノシド（Mannopyranoside）（3.884g／200ml）（シグマ社、カタログ番号M-6882）。テスト試料をそれぞれ２検体ずつ３列目に入れる（プレート当たり３種類の試料を分析できる）。ウェル当たり100μｌの試料を加え、試料当たり２つのウェルを使用する。まず、３列目で試料と培地を混合することによって、連続希釈液を調製する。３列目から10列目まで連続希釈液が入る。10列目を混合後、100μ ｌを廃棄すると、各ウェルの中に100μｌ残る。各ウェルに100μｌの細胞懸濁液を加える。２列目と11列目は対照ウェルである（試料を含まず細胞のみ）。マイクロタイタープレートを46時間以上50時間以下、５％CO₂、37℃のインキュベータ内に入れる。 MTT色素取り込みに関しては、５mgのMTT（米国バイオケミカル社、カタログ番号19265）をPBS １mlに溶解する。溶解したMTTを0.45μ滅菌フィルター装置で濾過し、25μｌを各プレートの各ウェルに加え、プレートを５％CO₂、37℃のインキュベータ内で60分間インキュベートする。60分間のインキュベーション終了時に、150μｌを各ウェルから除去し、100μｌの酸性イソプロパノール（イソプロパノール1000mlに12M HCl 3.3mlを溶解）を加える。各プレートをミクロタイタープレートシェーカーで高速で２分間混合する。570ナノメーターの波長でミクロタイタープレートアナライザーによりプレートを測定する。バックグランドウェル（PBSのみを含むウェル）の平均光学密度（OD）を、ミクロタイタープレート毎に計算する。平均バックグランドODを、各対照および試料ウェルのOD測定値から減ずる。平均ODは、各希釈度における各対照および各試料ウェルについて２例ずつ調製したウェル（マイナスバックグランド）から計算する。平均対照（試料を含まない細胞）ODを各プレート毎に計算し、平均対照値を分析に使用した全てのプレートに関して計算する。連続希釈度毎の試料のパーセント変化量を、平均対照値に対して計算する。ｘ＝％変化量に関する未知の値（ｘ試料OD）−（ｘ対照OD）＝ΔOD値各希釈度の対数に関してパーセント変化量をプロットする。対照値以上の基準物質に関する最大反応の50％インターセプト基準ラインを計算する。インターセプトにおける対数値を決定し、逆対数を計算し、各試料に関する希釈力価を決定する。１単位は、最大増殖反応の50％すなわち２分の１を引き起こす試料物質の量と定義される。実施例４材料および方法卵の注入と飼育管理。受精したハバードＸ（Hubbard X）ハバードブロイラー養鶏用卵を商業目的の孵化場から入手し、16℃で保存した。インキュベーション 0日目に、卵を一段階ジェームスウエイ252強制換気孵卵器に無作為にセットした。温度と湿度の条件は、製造者のガイドラインに忠実に従った。インキュベーション10日目に、卵を孵卵器から取り出し、蝋燭で照らして生存可能性を検査した。無精卵、位置異常の卵、生存不可能な卵は全て試験から除外した。孵化卵を無作為に処置群に分け、表示し、注入し斬化バスケットに移し、孵卵器に戻した。卵の注入は、18ゲージ注射針を使用して、卵の上端または下端から殻に５mm通すことから成る。次に、１ccツベルクリンシリンジに取り付けた23ゲージ注射針を穿孔した穴から22mm挿入し、テスト物質を注入した。注入部位は、密封も消毒もしなかった。孵化しない卵は全て破壊し、後期死亡、生存ヒナ、死亡ヒナ、死亡ヒヨコ、または失格のいずれかに分類した。位置異常および奇形の胚は孵化率分析から除外した。生存可能なヒナを数え、体重測定し、標識バンドを付けた。トリは処置群によりカラーコードで識別した。細菌投与用材料。大腸菌培養（セログループ01）またはネズミチフス菌（Salm onella typhimurium）のナリディキシックノボビオシン（nalidixic novobiocin ）耐性菌株をトリプチケース大豆肉汁（TSB）中で37℃で生育させた。密集成長培養菌を必要に応じて0.9％食塩水で希釈した。経口投与用の大腸菌接種材料の用量を調製するには、遠心分離により10倍の濃度にする必要があった。投与まで、砕いた氷の上で細菌懸濁液を保存した。投与製剤を連続希釈し、実際の投与量を決定するためにトリプチケース大豆寒天平板上に３例ずつ平板培養した。実施例５孵化時の大腸菌経口投与 18日目孵化ブロイラー卵にPBSまたは0.35活性単位のIL2CMを注入した。孵化した日に、各処置群から40羽のヒナに8.8×10⁸CFUの大腸菌を含むPBS 100μｌを経口胃管投与した。卵の中でPBSを投与された更に40羽のヒナにPBS 100μｌを胃管投与した。ヒナは１つの檻の中に混合し、食餌と水は自由摂取させた。１日当たりの死亡率を連続５日間記録し、その時全てのヒナの体重を測定し、研究を終了した。結果。卵内投与したIL2CMは、大腸菌を経口投与したブロイラーのヒナの５日間死亡率を10％から2.5％に有意に減少させた（表１）。更に、IL2CMを卵内投与されたトリの体重は、大腸菌を投与された対照群と大腸菌を投与されなかった対照のいずれよりも数字の上で高かったことは、残りのトリが罹患していないことを示している。孵化率に対するIL2CM卵内投与の効果は明らかでなかった。孵化率は、注入時（インキュベーション１８日目）に生存していた卵から孵化したヒナの数に基づいた。これらの結果は、18日目孵化卵にIL2CMを単回卵内投与することにより、新たに孵化したヒナを経口摂取された大腸菌から保護できることを示している。保護効果は、孵化と同時に発揮された。実施例６ネズミチフス菌の孵卵器内伝染と孵化後の伝染 150個の18日目の孵化ブロイラー卵に、PBSまたは0.35活性単位のIL2CMを注入した。各処置群の75個の卵を対照孵卵器に戻した。各処置群の別の75個の卵を、隔離室内の孵卵器の中に入れた。更に、170CFUのネズミチフス菌（Salmonella t yphimurium）を25個の卵の気室の中に注入した。これらの卵は、孵卵器最上部の孵卵トレイの中に入れられ、孵卵器内の水平感染用としてのみ利用された。この孵卵器は現在まで汚染用に指定されている。孵化20日目の汚染された孵卵器内から得られた15分間エーロゾルプレートの細菌数の平均値は、169CFUであった。ノボビオシンとナリジキシン酸（nalidixic acid）を含む選択的寒天培地が使用された。各孵化用バスケット内に配置されたプレートから得られた細菌数は同じであった。対照孵卵器からテスト菌株は分離されなかった。孵化時、対照孵卵器と汚染された孵卵器の両者から各処置群あたり25羽のヒナが、２つの檻にそれぞれ入れられた。対照孵卵器からのトリと、汚染された孵卵器からのトリを１：１の比率で混合すると、孵卵器で細菌に接触したヒナから接触しなかったヒナへの孵化後の水平感染が生じた。ヒナの食餌と水は自由摂取とした。死亡率は毎日計測した。孵化後12日目に、トリの体重を測定し、試験を終了した。結果。孵化率は、卵内処置と孵卵器処置では同等であった。サルモネラ菌を注入された卵の孵化率は、72％であった。これらのヒナは檻には入れなかった。卵内IL2CM投与は、孵卵器内水平サルモネラ感染と孵化後水平サルモネラ感染の両者を防御した。孵卵器内でサルモネラ菌に接触したヒナの12日目死亡率は、36％から28％に有意に減少した（表２）。孵卵器内で汚染されたトリと混合されたヒナの死亡率は、20％から12％に減少した（表２）。IL2CMで処置されたトリの体重が数字の上で低いことから、胃腸管におけるサルモネラ菌のコロニー形成には影響しないが、血液伝染性病原菌は減少することを示唆している。これらの結果は、18日目孵化卵にIL2CMを単回卵内投与することによって、孵化前と孵化後のサルモネラ菌感染症からヒナを守ることができることを示している。実施例７孵化後18日目の大腸菌筋肉内投与 18日目孵化ブロイラー卵にPBSまたは0.35活性単位のIL2CMを注入した。孵化時、処置毎にヒナの羽にバンド標識し、檻の中で混合した。孵化後18日目に、処置群あたり均一サイズの30羽のトリの体重を測定し、10⁴または10⁶CFUの大腸菌を含むPBS 100μｌを胸筋内に注入した。更に、PBSを卵内投与された30羽のネガティブコントロールのトリにPBS 100μｌを筋注した。トリを檻に戻し、７日間毎日死亡数を監視し、７日目にトリの体重を再度測定し、試験を終了した。結果。細菌は、孵化後18日目に投与した。この時期は、母体の抗体レベルが低下し、天然の抗体合成が不十分であるため、細菌感染し易い時期である。10,000 CFUの大腸菌を投与されたトリの死亡率は僅かで、卵内投与とは無関係に細菌投与後２羽しか死亡しなかった（表３）。卵内投与間で死亡率に差はなかったが、 IL2 CMを投与されたトリの体重の数字が増加したことは、トリの有病率は低い値を維持したことを示唆している。これに反して、1,000,000CFUの大腸菌を投与されたトリは、予めIL2CMを卵内投与されていた場合には、死亡率が低下した（表３）。残りのトリの体重は数字の上で減少していた。これらの結果は、18日目孵化卵へのIL2CMの単回卵内投与により、ヒナを長時間保護することができ、孵化後18日目のヒナを大腸菌筋肉内投与から守れることを示唆している。前記の実施例は、本発明を説明するものであり、本発明を制限するものと見なすべきではない。本発明は、ここに含められる請求項と同等物と共に、以下の請求項によって規定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月２３日【補正内容】請求の範囲（補正）１．大腸菌感染症とサルモネラ菌感染症から成るグループから選択された細菌感染症を抑制する有効量のトリIL-2を未成熟なトリに投与することにより、当該トリにおける細菌感染症を抑制する薬物を調製するためのトリのインターロイキン-2（IL-2）の使用。２． IL-2がニワトリIL-2である請求項１記載の使用。３．トリIL-2が30KニワトトリIL-2である請求項１記載の使用。４．トリがトリIL-2を卵内投与される請求項１記載の使用。５．トリIL-2が卵内インキュベーションの第４四半期頃にトリに卵内投与される請求項１記載の使用。６．大腸菌感染症を抑制する有効量のトリIL-2を未成熟なトリに投与することにより、当該トリにおける大腸菌感染症を抑制する薬物を調製するためのトリインターロイキン-2（IL-2）の使用。７．トリIL-2がニワトリのIL-2である請求項６記載の使用。８．トリIL-2が30KニワトリIL-2である請求項６記載の使用。９．トリがIL-2を卵内投与される請求項１記載の使用。 10．トリIL-2が卵内インキュベーションの第４四半期頃にトリに卵内投与される請求項６記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フェルプス，パトリシア・ヴイアメリカ合衆国、27608 ノース・キャロライナ、ローリー、アンダーソン・ドライヴ 2514

Claims

【特許請求の範囲】１．細菌感染症を抑制する有効量のIL-2を未成熟なトリに投与することにより、当該トリにおける細菌感染症を抑制する薬物を調製するためのインターロイキン-2（IL-2）の使用。２． IL-2はトリIL-2である請求項１記載の使用。３． IL-2はニワトリIL-2である請求項１記載の使用。４． IL-2は30KニワトリIL-2である請求項１記載の使用。５．トリは、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジから成るグループから選択される請求項１記載の使用。６．トリはIL-2を卵内投与される請求項１記載の使用。７． IL-2は卵内インキュベーションの第４四半期頃にトリに卵内投与される請求項１記載の使用。８．細菌感染症は大腸菌感染症とサルモネラ菌感染症から成るグループから選択される請求項１記載の使用。９．細菌感染症はサルモネラ菌感染症である請求項１記載の使用。 10．大腸菌感染症を抑制する有効量のIL-2を未成熟なトリに投与することにより、当該トリにおける大腸菌感染症を抑制する薬物を調製するためのインターロイキン-2（IL-2）の使用。 11． IL-2はトリIL-2である請求項10記載の使用。 12． IL-2はニワトリIL-2である請求項10記載の使用。 13． IL-2は30KニワトリIL-2である請求項10記載の使用。 14．トリは、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジから成るグループから選択される請求項10記載の使用。 15．トリはIL-2を卵内投与される請求項10記載の使用。 16． IL-2は卵内インキュベーションの第４四半期頃にトリに卵内投与される請求項10記載の使用。 17．細菌感染症は大腸菌感染症とサルモネラ菌感染症から成るグループから選択される請求項10記載の使用。 18．細菌感染症はサルモネラ菌感染症である請求項10記載の使用。