JPH08507140A

JPH08507140A - Serum pyridinium cross-linked assay

Info

Publication number: JPH08507140A
Application number: JP6514536A
Authority: JP
Inventors: ティー．クング，バイオラ; ゴメッツ，バルタザール，ジュニア
Original assignee: メトラバイオシステムズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-12-17
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1996-07-30
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: CA2151234A1; AU5851494A; JP3448295B2; WO1994014072A1

Abstract

(57)【要約】骨吸収障害の存在をスクリーニングするのに有用な、ヒト被験体の骨コラーゲン損傷レベルをアッセイする方法。さらに骨吸収率の異常を含む転移状態への進行を包含するかまたはその可能性を有する癌の状態の進行および／または治療反応をモニタリングする方法も開示する。 (57) [Summary] A method for assaying bone collagen damage levels in a human subject, useful for screening for the presence of a bone resorption disorder. Also disclosed are methods of monitoring progression and / or therapeutic response of cancerous states that involve or have the potential to progress to a metastatic state, including abnormal bone resorption rates.

Description

【発明の詳細な説明】血清ピリジニウム架橋物アッセイ１．発明の分野本発明は、ヒトの血液流体サンプル中でペプチド遊離のピリジニウム架橋物（ pyridinium crosslinks）のレベルをアッセイすることにより、ヒト被験体の骨コラーゲン分解を評価する方法に関する。３．発明の背景ヒトには、高レベルの骨吸収、および骨形成と骨吸収との間のバランス異常を特徴とする様々な症状がある。これらのうちより一般的な症状の中には、骨粗鬆症、パジェット病、および、良性と悪性の骨腫瘍の進行および、例えば、前立腺または胸部の初期腫瘍から骨細胞へ移行した転移性癌の進行に関連する症状がある。コラーゲン代謝の変化に関連する他の症状としては、骨軟化症、くる病、子供の成長異常、腎性骨形成異常症、および薬剤誘導性骨減少症が挙げられる。骨代謝の不規則性は、しばしば、甲状腺治療の副作用から生じたり、そして原発性甲状腺機能低下症および甲状腺中毒ならびにクッシング病のような甲状腺状態それ自体から生じたりする。骨吸収障害または骨形成と骨吸収との間のバランス異常を特徴とする他の症状は、尿中のピリジニウム架橋物のレベルの変化により検出され得ることが認識されている（Robins，1982b；Macek；Black）。架橋物は、その中心に3-ヒドロキシピリジニウム環を有する化合物の形を取っている。3-ヒドロキシピリジニウム環中の環内窒素は、リジンまたはヒドロキシリジンのε-アミノ基に由来する（F ujimoto，1978；Robins，1982a；Gunja-Smith；Ogawa；Eyre）。尿中に見出されるピリジニウム架橋化合物は、４つの一般的なクラスに分類される：（1）約400ダルトンの分子量を有す天然型遊離架橋物（Fujimoto）、（2 ）約550ダルトンと1,000ダルトンとの間の分子量を有すグリコシル化架橋物および架橋物ペプチド形（Robins，1983）、（3）1,000ダルトンと3,500ダルトンとの間の分子量を有する架橋物ペプチド形（Robins，1983，1984，1987；Henkel； Eyre）、および（4）3,500ダルトンより大きい分子量を有する架橋物ペプチド形。正常な成人において、これらの形は、尿の全架橋物の約38％（1）、40％（2）、15％（3）、および7％（4）の割合を占める（Daniloff）。正常な成人の尿において、遊離の架橋物の約80％はピリジノリン（またはPyd）であり、その環内窒素はヒドロキシリジン残基に由来している。そして遊離の架橋物の約20％は、デオキシピリジノリン（またはDpd）であり、その環内窒素はリジン残基に由来している。このPyd/Dpdの割合は、尿中の架橋物のうち他の３つのクラスに大体当てはまる。より大きな分子量の架橋物は、酸加水分解により遊離の架橋物に変換され得る（Fujimoto，1978）。尿中のピリジニウム架橋物の測定方法が提案された。これらの方法のうちの１つは、HPLCにより分離される加水分解されたPydのピークを定量することにより、加水分解された全Pyd、すなわち、尿中の架橋物の広範な加水分解により生成されるPydを測定することを含む（Fujimoto，1983）。加水分解された全Pydと年齢との間の関係は、加水分解された全Pyd/クレアチニンの比として、これらの研究者により決定された。そこでは、クレアチンレベルは、尿の濃度および骨格量に対する架橋物のレベルを標準化するのに用いられる。この比率は子供の尿では高く、そして成人期を通して相対的に一定であり、老齢期ではわずかに増加する。このことは、老齢期において観察される骨量の損失に対応すると推測される。慢性関節リウマチの患者の加水分解された尿中の全架橋物のレベルの上昇に関する研究は、この疾患の診断方法として示唆された（Black，1989）。慢性関節リウマチの患者の加水分解された全架橋物のレベル（クレアチニンに対する、HP LCにより測定された全架橋物の比として表される）は、コントロールと比較して、第５因子により上昇した。しかし、加水分解された全Dpdではなく、加水分解された全Pydのみが、測定可能な増加を示した。加水分解された尿を用いたより広範な研究において、Seibelらは、排泄物において、慢性関節リウマチおよび変形性関節症の両方におけるコントロールに対して、骨特異性の加水分解された全Pydおよび全Dpdの架橋物の顕著な増加を示した。加水分解された全Pydの最も顕著な増加は、慢性関節リウマチの患者に見られた（Seibel）。加水分解されたサンプルから架橋物をHPLC定量することを包含するアッセイ法（ここで示したアッセイ法のような）は、実施するのに比較的時間と費用がかかり、そして骨代謝障害の治療の広範囲なスクリーニングまたはモニタリングに対しては実用的ではない。イムノアッセイはまた、尿の架橋物の測定に対して提案される。米国特許第4, 973,666号および同第5,140,103号は、骨コラーゲンに関連する特定のペプチド連結ピリジニウム種を尿中に検出することによって、骨吸収を測定するアッセイを開示している。これらは、パジェット病、すなわち高い割合で骨の形成および破壊が起こることが知られている病気にかかっている患者の尿から得られる。このアッセイは、特異的なペプチド断片または伸長部を含む架橋化合物と、架橋物ペプチドに対して調製された抗体との免疫特異的結合に依存する。アッセイされる架橋物ペプチドの濃度が尿の全架橋物に関係しているのかどうか、そしてどのように関係しているのかは、明らかでない。 Robinsは、加水分解されたPydに特異的な抗体を使用することによって、尿中のピリジノリンを測定する技術を記載した（Robins，1986）。この方法は、抗体が、Pydの加水分解された形に特異的であることが見出されたという限界を有し、試験される尿サンプルが加水分解条件下で最初に処理されることを必要とする。加水分解処理は、アッセイの時間および費用を増加させ、そして他の天然型ピリジニウム架橋物の測定を予め除外する。 PCT国際公開第W0 91/10141号は、加水分解されていない尿サンプル中の天然型でペプチド遊離のピリジノリンまたはデオキシピリジノリンのレベルを測定することによって、ヒト被験体における骨コラーゲン分解を評価する方法を開示している。この方法は、尿サンプルの分析に基づく初期の方法より改良されている。なぜなら、この方法は、以前用いられていた加水分解によるサンプルの前処理を省いているからである。血液流体サンプル中のピリジニウム架橋物種のレベルを測定することによって、ヒト被験体における骨コラーゲン分解のレベルをアッセイすることが望ましい。このようなアッセイは、種々の血清分析物をアッセイするように設計された自動臨床分析システムに統合され得る。この方法はまた、例えば、デオキシピリジノリン/クレアチニンの比を決定することによって、サンプル容量の変化に対して、測定されたレベルを補正する必要がないという利点を有する。４．発明の要旨本発明は、１つの局面において、ヒト被験体における骨吸収障害の存在をスクリーニングする方法を包含する。この方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして抗体と反応させて、抗体とサンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との間で免疫複合体を形成する。この抗体は、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノリン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応可能である。形成された免疫複合体の量を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定した。決定された濃度が、（i）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、または（i i）6nMの天然型遊離のピリジノリンとデオキシピリジノリンとの複合物、より上である場合、被験体は、このような骨吸収障害を有することを示す。血液流体サンプルは、例えば、血清または血漿であり得る。この方法によりスクリーニングされる骨吸収障害は、尿中の加水分解されたピリジノリン架橋物のレベルの上昇を特徴とする障害を包含する。この方法における抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得、そして好ましくは選択されたピリジニウム架橋物に関して少なくとも5×1 0⁷/Mの結合定数を有する。１つの実施態様では、この方法において用いられる抗体は、選択されたピリジニウム架橋物と、分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対して、約5:1より大きい反応比を有する。関連する実施態様では、抗体は、選択されたピリジニウム架橋物と、分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対して、約10:1より大きい、そしてより好ましくは20:1 より大きい反応比を有する。特定の実施態様では、抗体は、天然型遊離ピリジノリンに特異的であり、そして天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約5: 1より大きい反応比を有する。第二の実施態様では、モノクローナル抗体は、天然型遊離デオキシピリジノリンに特異的であり、そして天然型遊離デオキシピリジノリンと天然型遊離ピリジノリンとに対して、約25：1より大きい反応比を有する。別の実施態様では、モノクローナル抗体は、天然型遊離ピリジノリンおよび天然型遊離デオキシピリジノリンの両方に特異的であり、そして天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約2:1と1:2との間の反応比を有する。さらに一般的には、天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対する反応比は、5:1より大きく、1:25より小さく、この間の全ての比率を含んでいる。１つの好ましい実施態様では、サンプルは、抗体の存在下で、選択されたピリジニウム架橋物でコーティングされた固体支持体と接触し、この固体支持体は、抗体に結合するためのサンプル中のこのような選択された架橋物と競合させるのに効果的である。抗体とサンプル中の選択されたピリジニウム架橋物との間で形成された免疫複合体の量は、固体支持体に結合した抗体の量を測定することにより、間接的に測定される。別の好ましい実施態様では、サンプルは、外因性のリポーター標識された、またはリポーター標識可能な選択されたピリジニウム架橋物の存在下で、選択された量のピリジニウム架橋物でコーティングされた固相支持体と接触する。これは、サンプルからの選択されたピリジニウム架橋物が、支持体上に固定された抗体に結合するために、外因性の架橋物と競合する条件下で行われる。この方法は、コラーゲン分解のレベルの上昇に関連する症状の治療をモニタリングするために用いられる。これは、このような治療の間、選択されたピリジニウム架橋物の濃度の変化をモニタリングすることにより行われる。関連する局面では、本発明は、骨吸収速度に異常を有する転移性症状へと進行する可能性を含む、または有するヒト癌の状態をモニタリングする方法を包含する。この方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノリン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応し得る抗体を反応して、抗体とサンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との間で免疫複合体を形成する。形成される免疫複合体の量を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定する。決定されたピリジニウム架橋物の濃度が、（i）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ii）1nMの遊離デオキシピリジノリン、および（ii）6nMのピリジノリンとデキソイピリジノリンの複合物、より上である場合、癌に関連する骨吸収速度の異常性（骨における転移の可能性を示唆している）が示される。この方法は、癌の治療の間、選択されたピリジニウム架橋物の濃度の変化をモニタリングすることによって、コラーゲン分解を起こすことを特徴とする癌の治療をモニタリングするために用いられ得る。別の局面では、本発明は、ヒト被験体における骨コラーゲン分解のレベルをアッセイする方法を包含する。この方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノリン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応し得る抗体と反応させ、そしてここで抗体は、上記の選択された架橋物に対して少なくとも10⁸/Mの結合定数を有し、その結果、抗体とサンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との間で免疫複合体を形成する。形成された免疫複合体の量を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定する。決定された濃度が、（i）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、または（ii）6nMの天然型遊離のピリジノリンとデオキシピリジノリンとの複合物、より上である場合、被験体は、このような骨吸収障害を有することが示される。上記の方法について、低い閾値が、骨分解のレベルの上昇が見られる個体を同定する可能性を増大させるために用いら得ることが認められる--例えば、天然型遊離ピリジノリンを検出するためには、約3nMの値；天然型遊離デオキシピリジノリンを検出するためには、約0.5nMの値、そして天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの複合濃度を検出するためには、約3.5nMの値が用いられ得る。別の実施態様では、本発明は、上記の選択されたピリジウム架橋物に関する少なくとも10⁸/Mの親和定数を有する抗体を包含する。１つの実施態様では、抗体は、選択されたピリジニウム架橋物と、分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対して、約3：1より大きい、そして好ましくは約5:1 より大きい反応比を有する。別の局面では、本発明は、上記の方法に用いられる診断キットを包含する。この方法は、上記のような抗体と、血液流体サンプルからの選択されたピリジニウム架橋物と抗体との反応により形成される免疫複合体の量を検出するための検出手段とを包含する。天然型遊離ピリジノリンを検出するためには、この方法に用いられるキットは、好ましくは、少なくとも約1nM、より好ましくは少なくとも0.5nMの血中ピリジノリン濃度（「閾値濃度」）を検出するために効果的である。天然型遊離デオキシピリジノリンを検出するためには、キットは、好ましくは、少なくとも約0.1nM、より好ましくは少なくとも約0.05nMの血中デオキシピリジノリン濃度を検出するために効果的である。ピリジノリンとデオキシピリジノリンとの複合濃度を検出するためには、閾値濃度は、好ましくは1.1nM、より好ましくは0.6nMである。１つの実施態様では、このキットの検出感度は、選択された範囲で選択されたピリジニウム架橋物の濃度の検出を可能にする。その範囲は、例えば、ピリジノリンに対して1〜10nM、またはデオキシピリジノリンに対して0.1〜10nMである。以下の発明の詳細な説明を添付の図と共に読むと、本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、さらに十分に明らかになる。図面の簡単な説明図1A〜1Cは、本発明の１つの実施態様を実施する工程を示す；図２は、血液流体サンプル中のピリジノリン（N-Pyd）を検出するのに適した抗体の滴定曲線である；図３は、血液流体サンプル中のデオキシピリジノリン（N-Dpd）を検出するのに適した抗体の滴定曲線である；図４は、正常な被験体（コントロール）（第１欄）、原発性上皮小体機能亢進の患者（第２欄）、骨軟化症の患者（第３欄）、カルシウム代謝障害の患者（第４欄）、および骨粗鬆症の患者（第５欄）からの血清サンプル中で測定されたN- Dpdの濃度を示す；図５は、コントロールの健康な患者および癌患者において、本発明に従って測定された血清Pydの濃度を示す。発明の詳細な説明１．定義本明細書中で使用される以下の用語は、次の定義を有する：「Pyd」または「ピリジノリン」または「遊離ピリジノリン」は、以下のＩで示される架橋物化合物を示し、ここで、環内のＮは、ヒドロキシリジル残基のε アミノ基に由来し、そして「Dpd」または「デオキシピリジノリン」または「遊離デオキシピリジノリン」は、以下のIIで示される架橋物化合物を示し、ここで、環内の窒素は、リジル残基のεアミノ基に由来する。「遊離架橋物」は、化合物IまたはIIあるいは両者の混合物のいずれかを示し、すなわち、これらは、ペプチドまたはグリコシル基が全く結合していない。「グリコシル化ピリジノリン」または「glyco-Pyd」は、化合物Iのグリコシル化体を示し、ここで、グリコシル基は、Pydの脂肪族ヒドロキシル基に共有結合する。同定された２つのglyco-Pyd架橋物は、Gal-PydおよびGlc・Gal-Pydであり、これらは、それぞれ、以下のIIIおよびIVで示されるアセタールを含む。「Pyd-ペプチド」または「ピリジノリン−ペプチド」は、化合物Iのペプチド誘導形を示し、ここで、この化合物の３つのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、ペプチド結合を介して、さらなるアミノ酸残基に結合している。同様に、「 Dpd-ペプチド」または「デオキシピリジノリン−ペプチド」は、化合物IIのペプチド誘導形を示し、ここで、この化合物の３つのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上が、ペプチド結合を介して、さらなるアミノ酸残基に結合している。「ピリジニウム−ペプチド」は、Pyd-ペプチドおよびDpd-ペプチドの混合物を示す。「1000ダルトンより大きい分子量を有するPyd-ペプチド」または「Pyd-ペプチド（MW＞1000）」は、1,000の分子量にカットオフされた透析膜により保持されるPyd-ペプチドを示す。「Pyd架橋物」は、遊離形またはペプチド-誘導形のいずれかの化合物Iを含むピリジニウム架橋物を示す。Pyd架橋物は、Pyd、glyco-PydおよびPyd-ペプチドを包含する。同様に、「Dpd架橋物」は、遊離形またはペプチド-誘導形のいずれかの化合物IIを含むピリジニウム架橋物を示す。「Dpd架橋物」には、Dpdおよび Dpd-ペプチドを包含する。「ピリジニウム架橋物」は、遊離形および/またはペプチド結合形の化合物Iおよび/またはIIを含むピリジニウム架橋物を示す。「全Pyd」あるいは「T-Pyd」は、Pydに対するPyd架橋物を加水分解することにより生成される加水分解された全Pydを示す。同様に、「全Dpd」あるいは「T-Dp d」は、Dpdに対するDpd架橋物を加水分解することにより生成される加水分解された全Dpdを示す。「加水分解されたPyd」あるいは「H-Pyd」は、6NのHCl中にて110℃で16時間Py d架橋物を加水分解することにより生成されるPydを示す。同様に、「加水分解されたDpd」あるいは「H-Dpd」は、6NのHCl中にて110℃で16時間Dpd架橋物を加水分解することにより生成されるDpdを示す。「天然型Pyd」あるいは「N-Pyd」は、加水分解の条件を受けていないPydを示す。同様に、「天然型Dpd」あるいは「N-Dpd」は、加水分解の条件を受けていないDpdを示す。「天然型遊離」あるいは「天然型ペプチド遊離」は、上記で示される構造ＩまたはII（あるいは両方）を有し、加水分解の条件を受けていないピリジニウム化合物を示す。「血液流体」は、血液から得られる無細胞の液体およびその画分、例えば、血清あるいは血漿を示す。「検出限界」は、ネガティブのサンプル（すなわち、選択されたピリジニウム架橋物を欠いているサンプル）と判別可能である選択されたピリジニウム架橋物の濃度を示す。さらに詳細には、検出限界は、ネガティブのサンプルで見られるシグナルと、少なくとも２標準偏差だけ異なるシグナルを生じる選択されたピリジニウム架橋物の選択された濃度である。従って、約0.05nMの天然型遊離デオキシピリジノリンの検出限界は、少なくとも0.05nMの天然型遊離デオキシピリジノリンの濃度を検出する能力を意味する。実際の検出限界は、規定の限界より低い。例えば、本実施例において、0.05nMの規定の検出限界のアッセイは、0.02nMの実際の検出限界を有し得る。「検出感度」は、特定のアッセイの手順により確実に測定され得る分析物の濃度の範囲を示す。従って、0.1〜10nMの範囲で天然型遊離ピリジノリンの濃度を検出し得る検出感度は、アッセイの手順が、0.1nMの分析物の濃度を検出し得、そして 0.1〜10nMの範囲で分析物の濃度の差を検出し得ることを意味する。このアッセイの実際の検出範囲は、規定の範囲より広い。例えば、本実施例において、0.1 〜10nMの範囲での検出感度を有すアッセイ法は、0.05〜20nMの範囲で分析物の濃度を検出し、そして判別し得る。 II．抗体試薬の調製このセクションでは、選択された天然型遊離ピリジニウム架橋物（N-Pyd、N-D pdのいずれか、または両方）に特異的であるモノクローナルおよびポリクローナル抗体（「抗体試薬」）の生産を述べる。１つの実施態様では、抗体は、選択された天然型遊離ピリジニウム架橋物と、分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドとに対して、約3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい反応比を有する。この抗体が天然型遊離ピリジノリンを結合するためのものである特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約5:1より大きい、好ましくは約20:1より大きい、そしてより好ましくは約100:1より大きい反応比を有する。この抗体が天然型遊離デオキシピリジノリンを結合するためのものである別の特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天然型遊離デオキシピリジノリンと天然型遊離ピリジノリンとに対して、約5:1より大きい、好ましくは約25:1より大きい、そしてより好ましくは約100:1より大きい反応比を有する。この抗体が天然型遊離ピリジノリンおよび天然型遊離デオキシピリジノリンの両方を結合するためのものである第三の特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約 2:1と1:2との間の反応比を有する。本発明の抗体試薬は、好ましくは、選択されたピリジニウム種（N-PydまたはN -Dpd）に対する約5×10⁷/Mより大きい結合親和定数を有する。Ａ．免疫原抗体試薬の生産に用いられる免疫原は、担体分子、すなわち典型的には、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような担体タンパク質と結合したDpdまたはPydである。 Pydは、天然型Pyd（N-Pyd）または加水分解されたPyd（H-Pyd）であり得る。同様に、Dpdは、天然型Dpd（N-Dpd）または加水分解されたDpd（H-Dpd）であり得る。N-DpdまたはN-Pydを得るためには、尿中の他のピリジニウム化合物からの N-DpdまたはN-Pydの粗分離は、実施例２に記載されるように、尿の分画により行われ得る。簡単に言えば、尿の濃縮物をSephadex G-10カラムにかけ、そして全ピリジニウムを含有する画分を溶出する。次いで、溶出液を、クエン酸ナトリウムで平衡化したホスホセルロースのカラムにかけ、そして塩で溶出させて単一ピークの遊離架橋物を得る。このサンプルは、加水分解の条件を受けていないので、ピークは、N-DpdおよびN-Pydの形態（「遊離架橋物」）だけでなく、上記のGal-PydおよびGlc-Gal-Pydを包含するglyco-Pydも含む。次いで、さらなる精製は、標準的な方法、例えば、スルホン化ポリスチレンビーズ上でのイオン交換またはHPLCを用いることによって都合良く行われる。この分離のための典型的なプロトコルは、例えば、Blackら、1988、Seibelら、1989に見られ、そして実施例２において詳述されている。あるいは、例えば、Blackら、1988に記載のように、加水分解されたPydまたは Dpdは、骨コラーゲンまたは尿中のピリジニウム架橋物の酸加水分解により生成され、精製される。 PydまたはDpdの担体タンパク質へのカップリングは、典型的には、二官能性カップリング剤を用いて、標準的なカップリング法により行われる。この二官能性のカップリング剤は、標準的な方法に従って、一方のカップリング末端にてPyd またはDpdの遊離カルボキシル基の１つとアミド結合を形成し、他方のカップリング末端にて担体タンパク質とアミド結合またはエステル結合またはジスルフィド結合を形成する。あるいは、好ましい実施態様では、PydまたはDpdは、例えば、EDC（1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド）のような水溶性カルボキシル活性化剤の存在下で、さらに公知の方法に従って、タンパク質に直接カップリングされ得る。後者の方法は実施例３において説明され、この実施例３は、EDC 活性化によるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）へのDpdのカップリングを記載している。担体タンパク質をペプチド抗原で誘導するための一般的なカップリング反応は、Harlow（1988）、pp．77-87、およびWong（1991）に示される。Ｂ．モノクローナル抗体試薬モノクローナル抗体試薬を調製するために、上記の免疫原が、マウスのような動物を免疫化するために用いられる。抗原特異的リンパ球が不朽化のためにその動物から得られ得る。適切と認められたある種の動物は、Jackson Laboratory（ Bar Harbor，MN）から入手可能な「自己免疫」MRL/MpJ-lprマウスである。 N-Pydに特異的な抗体が望まれるところに、Pyd免疫原が典型的に用いられる。同様に、N-Dpdに特異的な抗体が望まれるところに、Dpd免疫原が典型的に用いられる。PydおよびDpdの両方を認識する抗体は、Pyd免疫原またはDpd免疫原を用いて得られ得る。Ｂ．１ N-Pydモノクローナル抗体。N-Pydに特異的なモノクローナル抗体試薬を生産するために、実施例４で概説されるように、マウスは、H-Pyd-KLH免疫原の一連の注射を用いて免疫化され得る。初期免疫化して約８週間後、脾臓細胞が採取され、そしてP3X63Ag8.653ミエローマ細胞系と融合される。うまくいった融合産物の選択は、公表された方法（一般的に、 Harlow，pp．196-212を参照のこと）により、調整されたS-DMEM培地中のHATにおいて行われ得る。次いで、うまくいった融合産物は、実施例８に記載のイムノアッセイ形式と同様の競合性イムノアッセイ形式を用いて、N-Pydとの免疫反応性についてスクリーニングされる。N-Pydとの高い結合親和性を示す細胞系は、限界希釈によりサブクローニングされ、そしてN-Pydに対して高い結合親和性を有する抗体の産生に対してさらにスクリーニングされる。上記の手順により得られ、そしてN-Pydに対して高い抗体親和性を有するサブクローニングされたある種の細胞系は、本明細書中では、Mab-XXV-3G6-3B11-1A10と名付けられた。この細胞系のサンプルは、American Type Culture Collection）12301 Parklawn Dr.、 Rockville MD 20852）に寄託され、そしてATCC番号HB11089として受託された。抗体試薬を生産するために、ハイブリドーマ細胞系は、以下の材料および方法のセクションに記載されるように追加されたDulbecco改変Eagle培地（DMEM）のような適切な培地（Harlow，pp．247-270）中で増殖させられる。モノクローナル抗体（「Mabs」）は、公表された方法（Harlow pp．271-318）により、培地から採取され、濃縮され、そして保存され得る。上記のように、本発明の重要な特徴は、尿中のより大きな分子量のピリジニウム架橋物に比較してのN-DpdおよびN-Pydの抗体試薬の特異性である。N-Pyd、N-D pd、および他の尿のピリジニウム架橋物の抗体試薬の相対的特異性が、実施例10 に詳述されるように、N-Pydに対する競合性結合アッセイにより決定され得る。簡単に言えば、種々の精製された架橋物サンプル（N-PydおよびN-Dpd、ならびに等モル（各150μM）の20種の一般アミノ酸を含有するアミノ酸混合物を含む）は、N-Pydを結合している固相支持体上で抗体試薬の限定量と反応する。この反応は、サンプル中のピリジニウム架橋物が、抗体と結合するために、支持体に結合したN-Pydと競合する条件下で行なわれる。固体支持体への抗体の結合程度は、抗体試薬に対するサンプルの架橋物の相対的反応性の評価基準を提供する。実施例10で概説される手順に従って、N-Pyd，N-Dpd、Pydペプチド（MW＞1,000 ）、およびアミノ酸混合物（20種の一般アミノ酸の各150μM）と、細胞系Pyd XX V-3G6-3B11-1A10からのモノクローナル抗体との結合レベルが試験された。各サンプルの見かけのPyd濃度が、精製されたN-Pydを用いて作成した検量線を用いて決定された。各サンプルの反応性％は、全H-PydについてHPLCにより決定されたサンプル中の全Pyd架橋物濃度に対しての（×100）、あるいはN-Dpdサンプルの場合には、全H-DpdについてHPLCにより決定された全Dpd架橋物濃度に対しての（ ×100）、見かけの濃度（上記のN-Pyd検量線を用いて測定される）の比として計算された。結果を表１に示し、ここで、N-Pydとの反応性を100％と定義した。示されるように、モノクローナル抗体試薬は、N-Dpdに比較してN-Pydに対する高い選択性を有し、天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約3:1より大きい、そしてこの場合には5:1より大きい反応比を示す。この試薬はまた、試験されたピリジニウム-ペプチド形（全Pyd含有量を定量する）よりもN-Pydに対して選択的であり、分子量が1,000ダルトンより大きいピリジノリンペプチドに対して、約100:1より大きい反応比を示す。さらに、この試薬は、試験されたアミノ酸混合物と最小の交差反応性（＜1%）を示す。さらに一般的には、N-Pydに対して特異的なMab試薬は、天然型遊離ピリジノリン（N-Pyd）とPyd-ペプチド（MW＞1000）とに対して、上記のアッセイにより測定されるように、5:1より大きい、好ましくは10:1より大きい、より好ましくは2 5:1より大きい、そしてこの場合には、100:1より大きい反応性を有する。Ｂ．２ N-Dpdモノクローナル抗体。N-Dpdに対して特異的なモノクローナル抗体試薬を生産するために、N-Pyd Mabを得る上記の手順が用いられ得（但し、Dpd-KLHを免疫原として用いることを除く）、そして免疫応答スクリーニングがN-Dpdに対するアッセイで行われる。この手順により１つのサブクローニングした細胞系を得、そしてN-Dpdに対して高い抗体親和性を与えるこの細胞系は、本明細書中でMab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11と呼ばれる（実施例５を参照のこと）。抗体試薬は、N-Pyd Mabに関する上記と同様の一般的な手順により、ハイブリドーマ細胞系から調整され、そして保存される。 N-Dpd、N-Pyd、および他の尿のピリジニウム架橋物に対する抗体試薬の相対的な特異性は、上記の方法（セクションＢ．1）により決定され得るが、しかしN-D pdを結合させた固相支持体を用いる。実施例10で概説した手順に従って、N-Dpd、N-Pyd、Dpdペプチド（MW＞1,000）、およびアミノ酸混合物（20種の一般アミノ酸の各150μM）のモノクローナル抗体（細胞系Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11由来）への結合レベルを試験した。各サンプルの見かけのDpd濃度が、精製されN-Dpdを用いて作成した検量線を用いて決定された。各サンプルの反応性％は、全H-DpdについてHPLCにより決定されたサンプル中の全Dpd架橋物濃度に対しての（×100）、あるいはN-Pydサンプルの場合には、全H-PydについてHPLCにより決定された全Pyd架橋物濃度に対しての（×10 0）、見かけのN-Dpd濃度（上記のN-Dpd検量線を用いて測定される）の比として計算された。結果を表２に示し、ここで、N-Dpdの反応性を100 ％と定義した。示されるように、モノクローナル抗体試薬は、N-Pydに比較してN-Dpdに対する高い選択性を有し、天然型遊離デオキシピリジノリンと天然型遊離ピリジノリンとに対して、約100:1より大きい反応比を示す。この試薬はまた、試験されたピリジニウム-ペプチド形（Dpd含有量を定量する）よりもN-Dpdに対して選択的であり、分子量が1,000ダルトンより大きいデオキシピリジノリンペプチドに対して、約3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい反応比を示す。さらに、試薬は、試験されたアミノ酸混合物と最小の交差反応（＜1%）を示す。さらに一般的に、Dpdに対して特異的なMab試薬は、天然ピリジノリン（N-Dpd ）およびDpdペプチド（MW＞1000）に対して、上記のアッセイにより測定されたように、約5:1より大きい、好ましくは10:1より大きい、さらに好ましくは25:1 より大きい、そしてこの場合では、100:1より大きい反応性を有する。Ｂ．３ほぼ同等の親和性を有するN-PydおよびN-Dpdを結合させるモノクローナル抗体。ほぼ同等の親和性を有するN-PydおよびN-Dpdを結合させるモノクローナル抗体試薬を生産するために、N-Pyd MabおよびN-Dpd Mabを得る上記の手順が用いられ得る。免疫原は、Pyd-KLHまたはDpd-KLHであり得、そして免疫応答スクリーニングがN-PydおよびN-Dpdに対する別々のアッセイで行われる。上記手順により、H-Dpd-KLHを免疫原として用いて、１つのサブクローニングされた細胞系を得、そしてN-DpdおよびN-Pydの両方に対して高い抗体親和性を与えるこの細胞系は、本明細書中でMab Pyd/Dpd-V-6H2-2H4-1E4と呼ばれる（実施例６を参照のこと）。抗体試薬は、N-Pyd Mabに関する上記と同様の一般的な手順により、ハイブリドーマ細胞系から調整され、そして保存される。 N-Dpd、N-Pyd、および他の尿のピリジニウム架橋物に対する抗体試薬の相対的な特異性は、上記の手順（セクションＢ．1およびＢ．2）により決定され得る。この場合では、Pyd/Dpd-V-6H2-2H4-1E4細胞系を用いて生産される抗体について、各サンプルの反応性％は、全H-DpdについてHPLCにより決定されたサンプル中の全Dpd架橋物濃度に対しての（×100）、あるいはN-Pydサンプルの場合には、全H-PydについてHPLCにより決定された全Pyd架橋物濃度に対しての（×100）、見かけのN-Dpd濃度（上記のN-Dpd検量線を用いて測定される）の比として計算された。結果を表３に示し、ここで、N-Dpdの反応性を100％と定義した。示されるように、モノクローナル抗体試薬は、1:1に近い交差反応比で、ほぽ同等の親和性を有するN-DpdおよびN-Pydを認識する。この試薬はまた、試験されたピリジニウム-ペプチド形（PydおよびDpdペプチドの両方）よりもN-Dpdに対して選択的であり、分子量が1,000ダルトンより大きいピリジニウムペプチドに対して、約3:1より大きい、そしてこの場合では、9:1より大きい反応比を示す。さらに、試薬は、試験されたアミノ酸混合物と最小の交差反応性（5%）を示す。さらに一般的に、Pyd/Dpd特異性Mab試薬は、天然型遊離ピリジノリン（N-Pyd ）および天然型遊離デオキシピリジノリン（N-Dpd）に対して、約2:1および1:2 の間の反応性を有する。Ｃ．ポリクローナル抗体ポリクローナル抗体の調製は従来技術により行われ、その従来技術は、当該技術分野で公知の免疫学的プロトコル、例えば、Harlow、pp． 93-115に従って、ウサギまたはマウスのような適切な哺乳動物の被験体に免疫原を注射することを包含する。典型的には、ウサギにアジュバントに入れた免疫原を皮下注射し、そしてブースター免疫を２〜３週間毎に皮下または筋内注射により行う；マウスには同様のスケジュールに従って腹腔内注射し得る。血液は、時々、例えば各免疫化注射の１〜２週間後に採取される。抗血清を滴定し、標準免疫沈降法（Harlow，pp．423-470）により、N-PydまたはN-Dpdに関して抗体形成を決定し得る。ウサギにおけるポリクローナル抗体を生産するための１つの方法を、実施例11で詳細に述べる。ポリクローナル抗血清に対する結合親和性定数を公知の方法（例えば、免疫沈降法またはELISAアッセイを用いたスキャッチャード（Scatchard）分析による； Campbell，Segelを参照のこと）により決定し得、そして選択されたピリジニウム種に対して特異的な抗血清中の抗体の結合親和性定数の平均を示す。ウサギVI -8から得たポリクローナル抗体は、スキャッチャード分析により決定したように、約1×10⁸のN-Pydに対する結合定数を有する。選択されたピリジニウム種および他のピリジニウム架橋物に対する抗体試薬の相対的な結合特異性は、上記および実施例14に詳述するように、競合性結合アッセイにより決定され得る。表４は、ウサギVI-8から得た抗Pyd抗血清の相対的な結合特異性を示し、ここで、N-Pydとの反応性を100％と定義する。示されるように、抗体試薬は、N-Pydに対して特異的であり、N-Dpdとは10％未満の交差反応性、Pydペプチド（MW＞1000）とは5％未満の交差反応性、そしてアミノ酸混合物とは中程度（〜12％）の交差反応性であることを示す。本発明の１つの局面に従って、ポリクローナル抗体試薬は、選択した天然型遊離ピリジニウム種（N-Pyd、N-Pyd、または両方）および分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドに対して、上記の抗原-競合アッセイにより測定されるように、3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい反応性を有する。^* III．イムノアッセイキット別の局面では、本発明は、ヒト被験体での骨コラーゲン分解レベルのアッセイで使用するための診断キットを包含する。このキットは、上記のセクションに記載したタイプの抗体試薬を含み、それは、天然型遊離デオキシピリジノリンに対して好ましくは約5×10⁷/Mより大きい、そしてさらに好ましくは8×10⁸/Mより大きい結合定数を有する。このキットはまた、抗体試薬と選択されたピリジニウム架橋物との反応により形成される免疫複合体の量を検出するための検出手段を含み、この検出手段は、血液流体サンプル中の選択された架橋物のレベルの測定に効果的である。説明の目的のために、サンプル中でのN-Pyd測定についてのこのようなキットの特定の実施態様を図1A〜1C中の10で示す。キットの固相支持体12は、結合剤が吸着され得るか、または化学的に結合され得る表面を有する。化学的に誘導可能な基またはタンパク質吸着に効果のある表面を有する、種々のガラスおよびポリマー樹脂の支持体が利用可能である。１つの好ましい実施態様では、キットは、 96アッセイウェルのマイクロタイタープレートを提供し、そこでウェルの表面は、キット中で固相支持体表面を形成する。キット10中の結合剤は、N-Pydであり、図中ではPyd（N）分子により16で示される。この結合剤は、固相（この場合、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル）に、最初にブタ血清アルブミン-ビオチン複合体（図1A中の複合体18）をウェル表面に吸着させ、そして次に、N-Pyd-ストレプトアビジン複合体（複合体20）を吸着されたビオチンに結合させることにより、結合される。このキット中の抗体試薬は、図1Bおよび1C中の22で示され、そして上記セクションに記載のポリクローナルまたはモノクローナル試薬を包含する。図1Bに示されるとおり、サンプル中のピリジニウム架橋物（26で示されるN-Pyd架橋物）は、抗体試薬と結合するための表面結合したN-Pydと競合する。抗体試薬とサンプル架橋物との反応により形成される免疫複合体は、この図の28で示される。このキット中の検出試薬（検出手段）は、リポーター標識二次抗体であり、図 1C中の24で示され、固体支持体に結合したN-Pydにそれ自身結合する抗体試薬との結合が効果的である。リポーター標識した抗体（酵素標識抗体のような）は、市販されているか、またはすでに種々のリポーター部分について容易に構成される（Harlow，pp．319-358）。酵素標識した抗体での１つの好ましい酵素は、アルカリホスファターゼであり、これは、p-ニトロフェニルホスフェート基質と反応し、405nmで強い吸収ピークを有する有色の産物を生産し得る。リポーター標識二次抗体は、典型的には、抗IgG抗体（抗ウサギIgG抗体または抗マウスIgG抗体のような）である。抗ウサギIgG抗体では、キット中のポリクローナル抗体試薬が、免疫したウサギから得られる。抗マウスIgG抗体では、抗体試薬がマウスモノクローナル抗体である。ここで、抗体試薬（上記のようにN-Py dと免疫反応する）は、「リポーター標識可能」である。それは、抗体試薬がリポーター標識二次抗体との反応により標識され得るためである。リポーター標識可能な抗体試薬の他の例は、ビオチンまたはストレプトアビジンで標識した抗体を包含し、それは検出目的のために、リポーター標識したストレプトアビジンまたはビオチン標識した相手と反応し得る。別の実施態様では、検出試薬は、酵素のようなリポーターで標識された抗Pyd 抗体試薬それ自身であり得る。このキット中の検出手段はまた、リポーター標識抗体中のリポーターの検出のために必要とされる必要な基質などを含む。別のキットの実施態様では、支持体に結合される結合剤は、セクションIIに記載したような抗Pyd抗体試薬である。抗体は、種々の公知の方法により固体支持体に結合され得る。これらの公知の方法は、標準的な方法に従って、化学的誘導体化、または支持体結合プロテインＡまたは抗IgG抗体による抗体の高親和性結合を包含する。このキットは、デオキシピリジノリン試薬をさらに含み得、それは、支持体上の抗体試薬への結合について、サンプル中の天然型遊離デオキシピリジノリンとの競合に効果的である。検出目的のために、デオキシピリジノリン試薬は、デオキシピリジノリンに共有結合したリポーター標識を含み得る（すなわち、試薬は、リポーター標識デオキシピリジノリンであり得る）。この形式を有する模範的なキットの調製および使用を実施例７〜９で説明する。あるいは、デオキシピリジノリン試薬は、リポーター標識可能であり、すなわちデオキシピリジノリン試薬は、例えば、対応するリポーター標識ストレプトアビジンまたはビオチン分子による認識のために、ビオチンまたはストレプトアビジンのような薬剤と複合体化したPydを包含する。別の一般的な実施態様では、このキットは、サンプルのデオキシピリジノリンが溶液中で直接的に検出され得るような均一のアッセイのために設計される。本発明のキットが多くの他のアッセイ形式に適応され得ることは認識され得る。他のアッセイは、例えば、放射性トレーサー、結合カップリング酵素、蛍光、化学発光、またはEMIT配置（Gosling）に基づく形式を包含する。従って、別の好ましい実施態様では、このキット中の検出手段は、放射活性リポーター基を含み、これは抗体試薬と天然型遊離Pydとの反応により形成される免疫複合体の量に比例して放射活性シグナルを生産するのに効果的である。このキットは、N-Pydのアッセイに関して上記で説明しているが、このキットが、N-Dpdに特異的な抗体試薬を用いてN-Dpdを測定するのに用いられるか、またはほぼ同等の親和性を有するN-PydおよびN-Dpdを結合させる抗体試薬を用いてN- PydおよびN-Dpdの合計を測定するのに用いられる場合に、同様の形式が用いられ得ることが、認識され得る。 N-Pydの検出について、このキットは、1nMまたはそれ未満、好ましくは0.5nM 、そしてさらに好ましくは0.2nMのN-Pydについての検出限界を有する。図２は、実施例13に記載したイムノアッセイ形式で行ったN-Pydの滴定曲線を示し、これは表４で特徴付けられたウサギVI-8から得たポリクローナル抗血清を用いた。この図からわかるように、このキットは、約0.2nMの感度を提供し、一方で、10nMを越える範囲のN-Pydの信頼性のある測定も提供する。 N-Dpdの検出について、このキットは、好ましくは0.1nMまたはそれ未満、好ましくは0.05nM、そしてさらに好ましくは0.02nMのN-Dpdについての検出限界を有する。図３は、実施例９に記載したイムノアッセイ形式で行ったN-Dpdの滴定曲線を示し、これは上記のハイブリドーマ細胞系13D4から得たモノクローナル抗体を用いた。この図からわかるように、このキットは、約0.02〜0.05nMの検出限界を提供し、一方で、約10nMまでの範囲のN-Dpdの信頼性のある測定も提供する。このキットの検出限界は、このアッセイにおいて、正常を上回ると考えられる範囲でのピリジニウム架橋物レベルだけを検出し、一方で、一般に正常とされるレベルの中に含まれるピリジニウム架橋物レベルが、検出されないように、選択され得ることが認識される。 IV．イムノアッセイ法本発明は、「発明の要旨」と題した上記のセクションで概説したように、ヒト被験体の骨コラーゲンの損傷レベルをアッセイする方法を提供する。血液流体サンプルを、サンプルのアッセイに先立って、好ましくは前処理して干渉する可能性のある物質を除く。このような前処理は、トリクロロ酢酸沈澱により達成され得、ここで、このサンプルは、50％のトリクロロ酢酸と10:1で混合し、次いで遠心分離して沈澱を取り除く。あるいは、このサンプルをプロテインAカラムを通すかまたはStaphylococcus aureusの細胞（例えば、PANSORBIN細胞、Calbiochem，San Diego，CAより入手可能）と接触させて免疫グロブリンなどを除く。好ましい前処理の工程においては、サンプルを濾過して、約30kDaより大きい分子量を有するサンプルの成分を除く。このような濾過は、Centricon-30濾過装置（Amicon，Mass）を用いる遠心分離により達成され得る。上記セクションIIIで示したように、サンプルと抗体試薬との反応は、種々の構成を用いて固相形式で行われ得、あるいは、均一アッセイ形式で行われ得る。実例となる目的のため、イムノアッセイ法を、実施例９に従って、特に血清中の天然型遊離デオキシピリジノリンをアッセイするためのアッセイ形式に関して記載する。ここで、固体支持体は、表面に付着した抗Dpd抗体、および支持体に結合した抗Dpd抗体に結合するためにサンプル由来の天然型遊離デオキシピリジノリンと競合し得る細胞外酵素で標識したデオキシピリジノリンを有する。本方法は他の固相または均一アッセイ形式にどのように適応させられ得るかは認識され得る。本方法の典型的な実施態様では、既知の容量、例えば100μ l、の濾過されたまたは沈澱した血清サンプルを、抗Dpd抗体でコーティングした固体支持体、例えば、実施例８で調製したようにマイクロタイタープレートのウェルに添加する。サンプルの添加に続いて既知の容量、代表的には50〜200μl、のリポーター標識Dpdを既知の希釈濃度に添加する。実施例９では、リポーター標識Dpdは、アルカリホスファターゼ−Dpd複合体、すなわち、酵素標識Dpdである。次いで、固体支持体表面上の混合物を、好ましくは抗Dpd抗体がサンプルのD pdおよび酵素標識されたDpdと結合するための平衡を達成するのに有効な条件で、インキュベートする。実施例９で詳しく述べる方法においては、インキュベーションは４℃で一晩行う。インキュベーションの後、支持体を再度洗浄して非特異的な結合物質を除き、そして支持体に結合した酵素の程度を、酵素基質を添加して変換された基質を分光光度計で測定することにより決定する。詳細は実施例９に記載する。代表的なアッセイでは、濃度を上昇させたN-Dpdを含むN-Dpd標準物を、N-Dpd の検量線を得るためにいくつかのウェルに２組ずつ添加する。次いで最大40サンプルを残ったウェルに２組ずつ添加し、そしてその後それらのウェルを上記の様にアッセイする。検量線は、サンプルに対するピリジニウムの架橋物の値をN-Dp d濃度によって決定するために用いられる。 V．用途上記のイムノアッセイ法、抗体試薬、および本発明のキットは、ヒト被験体のコラーゲン損傷活性のレベルをアッセイするには有効である。一般に、本発明は一般的に骨コラーゲン損傷状態に関連してPydおよびDpdの血液レベルが上昇することを検出するのに有効である。このような状態は、例えば骨粗鬆症、パジェット病、甲状腺機能低下症、変形性関節症、および慢性関節リュウマチを含み得る。天然型遊離ピリジニウム架橋物レベルの増大を含む他の状態は、種々の形態の転移性の癌を含み、それらは骨組織に定着するか、またはそうでなければ骨の代謝を変化させる。血清Dpdレベルの上昇を検出するための本発明の方法の使用を図４に示し、これは健康な（コントロール）患者の血清サンプル中（第１欄）、ならびに原発性上皮小体亢進症（第２欄）、骨軟化症（第３欄）、カルシウム代謝障害（第４欄）、および骨粗鬆症（第５欄）の患者の血清サンプル中で測定したN-Dpdレベルを示す。この研究は、ハイブリドーマ細胞系13D4（上記表２を参照のこと）由来の抗体を用いて実施例９に記載のアッセイプロトコルを用いて行った。図からわかるように、コントロールグループのN-Dpdレベルは約0.2nMと0.5nM との間であり、平均レベル（±標準偏差）は0.33±0.07nMであった。原発性上皮小体亢進症グループは、約0.4nMと1.4nMとの間のレベルを示し、一人は約4.2nM を示した（平均値＝1.4nM）。骨軟化症グループは、約0.5nMと2.6nMとの間のレベル（平均値1.2nM）を示し；カルシウム代謝障害グループは、約0.4nMと1.4nMとの間のレベル（平均値0.9nM）を示し；骨粗鬆症グループは、約0.3nMと1.1nMとの間のレベル（平均値0.6nM）を示した。全体としての罹患グループの図４のデータは、これらの患者のコラーゲン損傷の増加と一致している。結果は、約0.8nMを越える血清N-Dpdレベル、より好ましくは約0.5nMを越える血清N-Dpdレベルが、このような患者のコラーゲン損傷の増加の有用な指標であることを示す。図５は、健康な患者のグループ（グループ１）からの血清サンプルで測定した N-Pydレベルと、骨転移が定着あるいは疑わしい癌患者のグループからのサンプルで測定したレベルとを比較する。この研究は、表４で特徴付けられたウサギVI -8由来の抗体を用いて、実施例13に記載のアッセイプロトコルを用いて行った。図からわかるように、コントロールグループのN-Pydレベルは、約1nMと3nMとの間であり、平均レベル（±標準偏差）は1.7±0.4nMであった。一方、癌のグループは、約2nMと13nMとの間のレベルであり、一人の患者は約23nMというレベルを示したが、これらの患者のコラーゲン損傷の増加と一致した。この結果は、約5n Mを越える血清N-Pydレベル、より好ましくは約3nMを越えるレベルが、このような患者のコラーゲン損傷の増加の有用な指標であることを示す。上述より、本発明の目的がどのようにして適合されるかが認識され得る。血液流体サンプルを用いることによって、本アッセイ法は、天然型遊離ピリジニウム架橋物レベルの測定を血液サンプルを用いた他の臨床試験と統合することを可能にする。この方法はまた、サンプルが尿サンプル（例えば、尿のクレアチニンの測定）の場合、必要とされるサンプル容量のばらつきの補正を省く。このアッセイは、抗体試薬を用いるので、上記のような多くの簡便で速やかなアッセイ形式に適合させ得る。本発明は、患者におけるコラーゲン分解の増加の検出および種々のコラーゲン病状の治療の経過のモニターに用いられ得る。以下の実施例は、抗体試薬の生成法および本発明によるアッセイ法を示す。実施例は、例証することを意図し、発明の範囲をいかなる方法によっても制限しない。実施例材料および方法雌の自己免疫性のMRL/MpJ-1prマウスをJackson Laboratory，Bar Harbor，Mai neより購入した。マウス非分泌性P3X63Ag8.653ミエローマ細胞、およびマウス単球マクロファージ細胞系P388D1（IL-1）およびJ774A.1は、American Type Culture Collection （ATCC），Rockville，Marylandより購入した。アジュバントRibiおよびRibi（CWS）は、RIBI Immunochem Research，Inc.，H amilton，Montanaより購入した。50% PEG 1500（ポリエチレングリコール1500、水中50%（w:v））は、Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indianaより購入した。H ATおよびHTは、Sigma Chemical Company，St．Louis，Missouriより購入した。 Dulbeccoの改変イーグル培地（DMEM）、NCTC-109、およびゲンタマイシンは、 Gibco，GrandIsland，New Yorkより購入した。ウシ胎児クローン血清は、Hyclon e Laboratories，Inc.，Logan，Utahより購入した。オキサロ酢酸およびインスリンは、Sigma Chemical Companyより購入した。S-DMEMを以下のように処方し、ここで％は最終培地における最終容量％を示す：DMEM（80%）、NCTC-109（10%）、ウシ胎児クローン血清（10%）、オキサロ酢酸（1mM）、L-グルタミン（2mM）、ゲンタマイシン（50μg/ml）、およびインスリン（10μg/ml）。調整培地の調製のため、マウス単球細胞系P388D1（IL-1）、または、その代わりとして細胞系J774A.1を、S-DMEM培地で、１週間に２回、1:4で分割しながら、生育させた。３日毎に組織培養上清を0.2ミクロンのフィルターで濾過し、4mMの L-グルタミンを追加した。得られた濃縮調整培地を、S-DMEMの20%増補として用い、ハイブリドーマ細胞を培養した。他に指示のない限り、PBSは、0.01Mリン酸および150mM NaCl，pH7を含む緩衝液として定義する。実施例１架橋物のHPLC測定 PydおよびDpdのHPLC分析を、本質的にはBlack（1988）に記載のように行った。簡単に説明すると、尿サンプルをブタノールおよび氷酢酸と4:1:1（v:ｖ:v）の混合物に調整し、CFlセルロース（Whatman ）のカートリッジにのせ、次いで4:1:1（ブタノール：酢酸：水）の緩衝液で洗浄した。遊離の架橋物のみが保持された。遊離の架橋物を、水でCFlセルロースから溶出した。溶出した物質を、1ml/分で分配される水−アセトニトリル（3-17 %、10分間）の勾配を用い、295nmにおける蛍光物質の励起および395nmにおける放出をモニターして、C18逆相カラム（Rainin，C18-80-200-C3）で分析した。移動相には、0.1% HFBAを含んだ。尿の架橋物の総計は、尿サンプルを110℃のHCl（6N）中で16時間加水分解し、次いで上記のようなCFl前処理とHPLC分析とを行うことにより測定した。HPLCの分離から、加水分解されたPydおよびDpdの画分を得、その画分からT-PydおよびT -Dpdを定量した。実施例２架橋物の精製ヒトの尿を、3000ダルトン分子カットオフフィルター（Filton Co.）で40psi の背圧をかけて濾過した。次いで濾液を凍結乾燥し、0.2M酢酸を用いて当初の容量の1/20に再構成した。次いで、濃縮した尿を0.2M酢酸で平衡化したSephadex G-10 2.6×95cmカラムにかけた。カラム物質からの溶出を、上記のように遊離のPydおよびDpdについて分析した。遊離の架橋物を含む画分を一緒にプールし、pHを2.0に合わせて、1× 18cmの陽イオン交換カラム（Lacarte Co.，UK）にかけ、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH4.2で平衡化した。次いで、イオン交換カラムから0.1Mクエン酸ナトリウム、pH4.2を用いてglyco -Pyd,，Pyd、およびDpdを共溶出した。集めた画分を上記のようにHPLC分析により架橋物の存在について分析した。特異的な架橋物を含む画分（glyco-Pyd、Pyd 、およびDpd）を一緒にプールして、2.5×10cmの逆相C18カラム（Waters）にかけ、続いてそれを0.1％のHFBAを含むアセトニトリルの2-20％の勾配を用いて展開した。分離した画分（glyco-Pyd、Pyd、およびDpd）を、集めて凍結乾燥により濃縮した。乾燥した残渣を0.2M酢酸で再構成し、４℃で保存した。最終物質の純度は、重量分析および元素分析により測定した。尿の架橋物−ペプチドは、ヒトの尿を、1000ダルトン分子量カットオフ透析膜（Spectra-Por）を用いて、十分に透析することにより調製した。ペプチド画分のT-PydおよびT-Dpd架橋物の含有量は、ペプチドサンプルを6NのHClで110℃で16 時間加水分解し、次いでPydおよびDpdについてHPLC分析することにより測定した。調製量のH-PydおよびH-Dpdを、B1ackら（1988）によって記載されたように加水分解して粉末化したウシまたはヒツジの骨から得た。実施例３免疫原の調製以下の手順は、天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノリンまたはその両方に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を入手するためにどのようにして免疫原が調製され得るかを示す。以下のＡおよびＢにおける手順は、Pyd免疫原に関して記載する；Dpd免疫原も同様に調製するが、Pydの代わりにDpdを用いる。Ａ．Pyd-BSA免疫原 0.1M MES、pH5.0中に9mgのウシ血清アルブミン（BSA）および3.8mgのPydを含む3.1mlの溶液に、88mgのEDCを含む0.88mlの水溶液を添加した。混合液を室温で４時間反応させ、その後リン酸緩衝生理食塩水pH7.0（PBS）に対して十分に透析した。UVおよび蛍光測定は、アルブミン１モル当たり5.8モルのピリジノリンが置換されていることを示した。Ｂ．Pyd-KLH免疫原 pHを5±0.5に合わせた乾燥H-Pyd（6mg）の水溶液（200μl）に、PBS中のキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）の10mg/ml溶液を2ml添加した。混合液に3 0mgの固体1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド（EDC、Pie rce）を添加し、10分後、別に30mgのEDCを添加し、室温で４時間反応を続けた。次いで反応混合液を、PBSに対し十分に透析し、その後Pyd-KLH免疫原を回収して保存した。実施例４抗Pydモノクローナル抗体の調製Ａ．免疫化プロトコル雌の５週齢の自己免疫MRL/MpJ-1prマウスを、以下のプロトコルを用いて免疫化した：融合の日に、免疫化したマウスをCO₂ガスで屠殺し、マウスから脾臓を切り出して、予め37℃に暖めた5mlの無血清DMEM培地を含む培養皿に置いた。脾臓に付着した脂肪組織を除去した後、脾臓を5mlの無血清DMEM培地で洗浄した。次いで脾臓を小さな断片に切断し、7mlの無血清DMEM培地を含む細胞ホモジナイザーに入れ、細胞をホモジナイズして細胞懸濁液を作製した。Ｂ．融合プロトコル以下の工程を室温で行った。脾臓細胞懸濁液（無血清DMEM培地中〜２×10⁸細胞）および対数増殖期のP3X63 Ag8.653ミエローマ細胞（無血清DMEM培地中〜７×10⁷細胞）を別々に400×gで10 分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、50mL容量の遠沈管内で無血清DMEM 培地（10ml）で一緒にして懸濁し、次いで400×gで10分間遠心分離した。上清を完全に除き、そして遠沈管を軽くたたいて細胞ペレットをほぐした。細胞融合のため、50% PEG 1500の溶液（4ml）を、ピペットにより穏やかに混合させながら90秒間にわたって管に滴下した。次に、無血清DMEM（4ml）を１分間にわたって滴下した。次いでS-DMEM（40ml）を穏やかに混合させながら２分間にわたって添加し、その後、ピペットにより混合液をさらに2.5分間混合した。得られた混合液は、400×gで10分間遠心分離した。上清を完全に除去した後、細胞を、320mlの20％のP388D1調整S-DMEM培地中のHATに懸濁した。細胞懸濁液を16 枚の96ウェル組織培養プレートに、200μl／ウェルで入れ、次いで、7% CO₂を含む雰囲気中で37℃でインキュベートした。細胞混合液は、第３日および第７日に古い培地を100μl／ウェル除去し、150μl／ウェルのHAT培地（第３日）またはH T培地（第７日）のいずれかを添加して飼養した。ウェルは、融合後7〜10日でスクリーニングの準備ができた。Ｃ．抗N-Pydモノクローナル抗体の産生のためのハイブリドーマのスクリーニングうまくいった融合産物を、実施例12および13に記載したN-Pydイムノアッセイ形式を用いて免疫応答性に関してスクリーニングした。N-Pydへの結合に高い親和性を示した細胞系を、限界希釈によりサブクローニングし、N-Pydに高い結合親和性を有する抗体の産生のためにさらにスクリーニングした。N-Pydに対し高い抗体親和性を与えるサブクローニングされた細胞系の一つを、本明細書中では Mab Pyd-XXV-3G6-3B11-1A10と呼ぶ。この細胞系により産生された抗体の特異性を、上記表１に示す。実施例５抗Dpdモノクローナル抗体の調製抗Dpdモノクローナル抗体を、実施例４に記載の手順で、実施例３において調製されたDpd-KLH免疫原を用いて調製した。マウスの免疫化プロトコルは、実施例４においてと同じであったが、Ribiの代わりにRibi（CWS）をアジュバントとして用いたこと、およびマウス１匹当たり100ｐgの代わりに75μgのDpd免疫原を第４の免疫化工程（融合から１８日後）で用いたことを除く。うまくいった融合産物を、実施例９に記載したN-Dpdイムノアッセイ形式を用いて免疫応答性に関してスクリーニングした。N-Dpdへの結合に高い親和性を示した細胞系を、限界希釈によりサブクローニングし、N-Dpdに高い結合親和性を有する抗体の産生のためにさらにスクリーニングした。N-Dpdに対し高い抗体親和性を与えるサブクローニングされた細胞系の一つを、本明細書中ではMab Dpd- II-7B6-1F4-1H11と呼ぶ。この細胞系により産生された抗体の特異性を、上記表２に示す。実施例６ N-PydおよびN-Dpdの両方に対して特異的なモノクローナル抗体の調製 N-PydおよびN-Dpdの両方に対して特異的なモノクローナル抗体を、実施例５の手順で、免疫原としてH-Dpd-KLH（実施例３）を用いて調製した。うまくいった融合産物を、実施例９に記載したN-Dpdイムノアッセイ形式を用いて免疫応答性に関してスクリーニングした。N-Dpdへの結合に高い親和性を示した細胞系を、限界希釈によりサブクローニングし、N-PydおよびN-Dpdの両方に高い結合親和性を有する抗体の産生のためにさらにスクリーニングした。N-PydおよびN-Dpdの両方に対し高い抗体親和性を与えるサブクローニングされた細胞系の一つを、本明細書中ではMab Pyd/Dpd-V-6H2-2H4-1E4と呼ぶ。この細胞系により産生された抗体の特異性を、上記表３に示す。実施例７アルカリホスファターゼ−Dpd複合体アルカリホスファターゼ-H-Dpd複合体は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸（BSSS）を結合剤として用いて調製した。簡単に言うと、前の晩に４℃ でPBS中で透析した7.1mg/mlのアルカリホスファターゼ（AP，3mg，1 40,000MW， ε=0.963mg/mL^-1cm^-1）（Biozyme Laboratories，San Diego，CA）溶液425μLを、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.5中の11mg/mLのH-Dpd（ε=4933M^-1cm^-1）溶液24μLと混合して、得られた混合液の容量をPBSで500μLに合わせた。次いで混合液に、50μLのDMSO（ジメチルスルホキシド）に0.61mgのBSSS（Pie rce，Rockford，IL）を溶解したものを添加した。反応容器を覆って光を排除し、そして結合反応を室温で２時間続けさせた。次いで500μlの10mMグリシン（0. 1Mリン酸緩衝液、pH7.5中）を添加することにより反応を停止させ、混合液を、光を遮って室温でさらに２時間インキュベートした。次いで、反応を停止した混合液を４℃で暗くして、PBSを４回交換して透析した（各２Ｌずつ、４時間おき）。透析液中でのDpd対APの化学量論は、分光光度計により326nmおよび280nmでの吸光度を測定して決定した。Dpd対APの比は、代表的には1:1から2:1であった。A P-H-Dpd複合体の酵素的活性は、標準APアッセイの天然型APの活性の％として決定した。実施例８抗Dpd抗体でコーティングしたプレートの調製 96ウェルのELISAプレートを以下のようにコーティングした。0.05%のNaN₃を含むPBS中に３μg/mlのウサギ抗マウスIgGを含む200μlの溶液を各ウェルに添加し、次いでプレートを室温で18〜24時間インキュベートした。インキュベーション後、1ウェル当たり300μlずつ３回、洗浄用緩衝液（0.3% Tween20を含むPBS）を用いて洗浄した。最後の洗浄でウェルを吸引した後、100mMリン酸塩、150mM NaC l、0.05% Tween-20、0.05% NaN₃、0.1%ウシ血清アルブミン、および10ng/mlマウス抗Dpdモノクローナル抗体（13D4）、pH７を含む150μlの捕獲溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で18〜24時間インキュベートした。インキュベーションが完結した後、各ウェルを上記のように洗浄用緩衝液で３回洗浄した。ウェルを最後に吸引した後、10%スクロース、100mMリン酸塩、150mM NaCl、および0. 05% NaN₃（pH 7）を含む250μlの保存溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後保存溶液を吸引によって除き、プレートを37℃、10％以下の湿度で18〜24時間置いた。コーティングされたプレートは、乾燥剤のパックと一緒にホイルで密封し、室温で保存した。実施例９血清Dpdのイムノアッセイ N-Dpdの標準溶液および血清サンプルを２組ずつ試験した。標準溶液は代表的には0.05% NaN₃および10mg/mLウシ血清アルブミンを含む10mM PBS中の0、0.05、 0.1、0.2、0.4、1.0、3.0、および9.0nMのN-Dpdからなるものであった。 400μlの各標準溶液または血清サンプルアリコートに40μlの50% v:vトリクロロ酢酸（TCA）水溶液を添加した。そして得られた混合物を短時間ボルテックスにかけ、10,000rpmで５分間遠心分離した。各遠沈管から上清を集めて（300μl ）、３ＮのNaOHでpHを7.0±0.5に合わせた。実施例８からの抗Dpd抗体でコーティングしたプレートの各ウェルに、100μl のTCA沈澱した標準または血清サンプル、および50μlのDpdアルカリホスファターゼ溶液（〜75ng/mL Dpd-AP複合体、100mM PBS、0.7%ウシ血清アルブミン、0.3 %スクロース、7mM Tris、0.15mM MgCl₂、0.05% Tween-20、および0.05%アジドを含む）添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、0.05% NaN₃および0.05% Tween-20を含むPBSでウェルを洗浄した。各ウェルに残ったDpdアルカリホスファターゼ複合体を、各ウェルに150μLの基質溶液（１Mジエタノールアミン中のp-ニトロフェニルホスフェート2mg/mL、p H10、１mM MgCl₂を含む）を添加し、室温で１時間インキュベートし、50μLの3N NaOHを添加することにより酵素反応を停止し、そして405nmでのウェルの光学密度をVmaxリーダー（Molecular Devices Corp.）を用いて読みとることによりアッセイした。各血清サンプルの Dpd架橋物濃度は、N-Dpd標準溶液を用いて作成した検量線との比較により決定した。実施例10 抗体試薬の結合選択性 N-Pyd、N-Dpd、およびピリジニウム−ペプチド（MW＞1000）を、上記のように尿サンプルから単離した。ピリジニウム−ペプチド画分のアリコートを加水分解し、画分中の架橋物をH-PydおよびH-Dpdに変換した。N-PydおよびH-Pyd調製物中のPydの濃度、N-DpdおよびH-Dpd調製物中のDpdの濃度、およびピリジニウム−ペプチド調製物中のDpdの濃度を、実施例１におけるようにHPLCにより決定した。さらに、PBS中に各150μMずつの20個の一般アミノ酸の等モル混合物を含むアミノ酸溶液を調製した。天然型架橋物調製物およびアミノ酸混合物のアリコート（50μl）を、２組ずつ抗Dpd抗体でコーティングしたマイクロタイターウェル（実施例８）に添加し、そして各ウェルをN-Dpdについて実施例９におけるようにアッセイしたが、この際50μLではなく100μLのDpd-AP複合体溶液を用いた。２つのサンプルの光学密度読み取り値（405nm）を平均し、そしてこれらの値から、各サンプルの見かけのN-Dpd濃度を、精製N-Dpdによって作成した検量線を用いて決定した。各サンプルの反応％は、全H-DpdについてHPLCにより決定したサンプル中の全Dpd架橋物濃度に対する見かけのN-Dpd濃度（上記のN-Dpd検量線を用いて測定した）の比として計算した（×100）。精製N-Dpdについて決定した相対的な反応性を、任意に100%とし、そして他の架橋物調製物（およびアミノ酸混合物）の反応性を、100に対するパーセンテージとして表した。本アッセイにより得た結果を、上記表２に示す。実施例11 抗ピリジノリン抗血清の調製免疫化のためにニュージーランド白ウサギ（全部で59羽）を，以下の表６に指示するように免疫化プロトコルに従って８グループに分けた。免疫化の用量は、 200μgのPyd-BSA（実施例3A）、低ハプテンPyd-BSA免疫原（Pyd-BSAに関する実施例3Aのように調製されるが、より低いPyd:BSAの化学量論による）、またはPyd -KLH（実施例3B）であり、これを1.0mlのPBSに入れ、1.0mlのRibiアジュバント（Ribi ImmunoChemical Research，Inc.）と混合した。初回免疫は、多数の部位で皮下注射により行い、そして次のブースター免疫を、３週間の間をおいて筋内注射することにより与えた。抗血清を各免疫化の10日後に採集した。採集の際に、各抗血清を、実施例６に記載したアッセイ形式を用いてPyd結合親和性について試験した。簡単にいうと、血清由来の抗Pyd抗体の固体支持体に固定されたPydへの結合を、アルカリホスファターゼで標識したヤギの抗ウサギI gG抗体試薬を用いて検出した。免疫化した動物は、それらの抗血清が次のパラグラフでさらに定義する以下の基準を満たした場合、飼育し続けた：アミノ酸（AA）＜20%、Pyd-ペプチド＜10% 、力価＞5000、および0から25nMのPydシグナルの分離＞全変化シグナルの10%。最も強い反応性抗血清のプロフィールを以下の表７に示す。これらは、実施例６に記載のアッセイ形式を用いて測定した。第１の欄は、ウサギ抗血清の由来する免疫化プログラムを示す。第２の欄は、分析のためにプールした採血を示す。「力価」と書いてある欄は、イムノアッセイ中で、Pyd-ネガティブ（Pydの存在無し）の光学密度読み取り値が1.2〜1.6を達成するのに必要な各抗血清の希釈度を示す。「アミノ酸（AA）」と書いてある欄は、各抗血清と実施例７に記載のアミノ酸混合物との交差反応性を示す。「Pyd- pep.＞1000MW」と書いてある欄は、各抗血清とPyd-ペプチド（＞1000MW）との交差反応性を示す。最後の欄は、Pydサンプルの0nMと25nMとの間の分離を全変化シグナルの画分として示した。示されるように、ウサギIII-3、V-4、およびVI-8は、0nM〜25nMのN-Pydから著しいシグナルの変化を示した。最も高い活性を持つ血清（VI-8）を選択し、本明細書中に記載するN-Pydアッセイに用いた。実施例12 Pydでコーティングしたマイクロプレートの調製ビオチンで標識したオボアルブミンおよびストレプトアビジン−Pyd複合体をマイクロプレートコーティングに用いた。オボアルブミンのビオチン化は、400 μlのジメチルホルムアミドに10mgのビオチン-X-2,4-ジニトロフェノール-X-L- リジン、スクシンイミジルエステル（Molecular Probes）を入れたものを、150m gのオボアルブミンを含むPBS溶液10mlに添加することにより行った。混合物を室温で２時間反応させ、次にG25カラムクロマトグラフィーにかけた。分光測光分析は、オボアルブミン１モル当たり２個のビオチンが置換されていることを示した。 H-Pydのストレプトアビジンへの複合体化は、チオール化したストレプトアビジンを結合剤SMCCを介してH-Pydに結合させることにより達成した。チオール化したストレプトアビジンは、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP、Pierce）との反応により以下のように調製した。５mgのストレプトアビジンがPBSに入った溶液0.75mlに、260μgのSPDPを含むジメチルホルムアミド21μLを添加した。混合物を室温で１時間反応させ、次いでPBSに対して透析した。SPDP標識ストレプトアビジンは、ジチオスレイトールを最終濃度が10mMになるよう添加することにより還元した。室温で１時間インキュベートした後、チオール化したストレプトアビジンを、G-25カラムにかけて精製した。 H-Pyd-ストレプトアビジンを形成するために、ジメチルホルムアミド（４μl ）中に180μgのスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1- カルボキシレート（SMCC、Pierce）を含む溶液を、100μlのPBS中に0.5mgのチオール化したストレプトアビジンと50μgのH-Pydとを含む溶液に添加した。混合物を室温で３時間反応させ、次いでPBSに対して透析した。得られたPyd-ストレプトアビジンの分光測定分析は、ストレプトアビジン１当量当たり１当量と２当量との間のデオキシピリジノリンが結合していることを示唆した。 96ウェルのELISAプレートの各ウェルを、以下のようにN-Pydでコーティングした。各ウェルに、PBS中3.8μg/mlのビオチン−オボアルブミン溶液150μlを添加し、次に２〜８℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをPBSで洗浄し、1mg/mlのオボアルブミン200μlを添加して室温で一晩インキュベートすることによりブロックした。次いでマイクロプレートをPBSで２回洗浄した。ストレプトアビジン−Pyd複合体は、ビオチンへの結合を媒介するストレプトアビジンを介して固定される。PBS中100μg/mlのストレプトアビジン−Pydを含む150μlの溶液を、ビオチン−オボアルブミンでコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをPBSで２回洗浄した。残った液体は、対流式オーブン内で37 ℃で一晩乾燥させることにより、マイクロプレートから除いた。実施例13 ポリクローナル抗体試薬を用いるPydのイムノアッセイ上記表４および７で特徴づけられたウサギポリクローナル抗体VI-8、および実施例12に記載のN-Pydでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、以下のイムノアッセイを行った。 N-Pydの標準溶液および血液血清サンプルを２組ずつ試験した。標準溶液は、アッセイ緩衝液（150mM NaClを含む100mMリン酸ナトリウムpH7中0.05％NaN₃、0. 05% Tween 20、および0.1% BSA）中の0nM、0.2nM、0.6nM、2.0nM、6.0nM、および24nM N-Pydからなるものであった。血清サンプルを、アッセイの前に、Centri con-30（Amicon，Mass.）濾過装置を通して濾過した。サンプルまたは標準（25μl/ウェル）を添加した後、アッセイ緩衝液で20,000 倍に希釈したVI-8抗血清を125μl/ウェルで添加し、次いでアッセイプレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で300μl/ウェルで３回洗浄した後、150μl/ウェルのヤギ抗ウサギIgG-アルカリホスファターゼ複合体（アッセイ緩衝液で１：1000希釈）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに、150μLの酵素基質溶液（１mM MgCl₂を含む1.0MジエタノールアミンpH9.8に入った2mg/mLのp-ニトロフェニルホスフェート（Sigma））を添加した。室温で１時間インキュベートした後、50μlの3.0ＮのNaOHを各ウェルに添加して酵素反応を停止した。次いで405nmでの光学密度をVmaxリーダー（Molecular D evices Corp.）を用いて測定した。２つのサンプルの光学密度の読み取り値（405nm）を平均し、そしてN-Pyd標準からの平均読み取り値を用いてN-Pyd濃度に対するOD読み取り値の検量線を作成した。この曲線から、各血清サンプル中の遊離N-Pyd架橋物濃度を決定した。実施例14 ポリクローナル抗体試薬の結合選択性 N-Pyd、N-Dpd、およびピリジニウム−ペプチド（MW＞1000）を、上記のように尿サンプルから単離した。ピリジニウム調製物のアリコートを加水分解し、画分中の架橋物をH-PydおよびH-Dpdに変換した。N-PydおよびH-Pyd調製物中のPyd濃度、N-DpdおよびH-Dpd調製物中のDpd濃度、およびピリジニウム−ペプチド調製物中のPyd濃度を、実施例１に記載のようにHPLCにより決定した。さらにPBS中に各150μMずつの20個の一般アミノ酸の等モル混合物を含むアミノ酸溶液を調製した。天然型架橋物調製物およびアミノ酸混合物のアリコート（5 0μl）を、２組ずつPydでコーティングしたマイクロタイターウェルに添加し、そして各ウェルを実施例13におけるようにピリジノリンについてアッセイした。２つのサンプルの光学密度読み取り値（405nm）を平均し、そしてそれらの値から、各サンプルの見かけのN-Pyd濃度を、精製N-Pydによって作成した検量線を用いて決定した。各サンプルの反応％は、全H-PydについてHPLCにより決定したサンプル中の全Pyd架橋物濃度に対する見かけの濃度（上記のN-Pyd検量線を用いて測定した）の比として計算した（×100）。精製N-Pydについて決定した相対的な反応性を、任意に100%とし、そして他の架橋物調製物（およびアミノ酸混合物）の反応性を、100に対するパーセンテージとして表した。本アッセイにより得た結果を、上記表４および７に示す。本発明を特定の実施態様に関して記載するが、種々の変化および改変を、本発明から逸脱することなく行い得ることは認識されるであろう。Detailed Description of the Invention Serum pyridinium cross-linked assay 1.Field of the invention The present invention provides a peptide-free pyridinium crosslinked product ( pyridinium crosslinks) to assay bone levels in human subjects. It relates to a method for assessing collagen degradation. 3.Background of the Invention Humans have high levels of bone resorption and an imbalance between bone formation and bone resorption. There are various symptoms that are characteristic. Among these more common symptoms are osteoporosis Disease, Paget's disease, and progression of benign and malignant bone tumors and, for example, prostate Or, there may be symptoms associated with the progression of metastatic cancer that has migrated from the initial tumor of the breast to bone cells. It Other symptoms associated with altered collagen metabolism include osteomalacia, rickets, and childhood. Dysplasia of the child, renal dysplasia, and drug-induced osteopenia. Bone Metabolic irregularities often result from the side effects of thyroid treatment and are of primary Thyroid conditions such as hypothyroidism and thyroid poisoning and Cushing's disease It can arise from itself. Other disorders characterized by impaired bone resorption or an imbalance between bone formation and resorption Recognized that it can be detected by changes in the level of pyridinium crosslinker in urine. (Robins, 1982b; Macek; Black). The crosslinked product has 3-hydroxy group at its center. It is in the form of a compound having a cypyridinium ring. 3-hydroxypyridinium The endocyclic nitrogen in the ring is derived from the ε-amino group of lysine or hydroxylysine (F ujimoto, 1978; Robins, 1982a; Gunja-Smith; Ogawa; Eyre). The pyridinium cross-linking compounds found in urine are divided into four general classes. (1) Natural free crosslinked product (Fujimoto) having a molecular weight of about 400 daltons, (2 ) Glycosylated cross-linkers with molecular weights between about 550 and 1,000 daltons and And cross-linked peptide form (Robins, 1983), (3) 1,000 Daltons and 3,500 Daltons Cross-linked peptide forms with molecular weights between (Robins, 1983, 1984, 1987; Henkel; Eyre), and (4) crosslinked peptide form with a molecular weight greater than 3,500 daltons . In normal adults, these forms represent approximately 38% (1), 40% (2) of all cross-linked urine. , 15% (3), and 7% (4) (Daniloff). In normal adult urine , About 80% of the free crosslinked product is pyridinoline (or Pyd), The nitrogen is derived from the hydroxylysine residue. And about 20% of the free crosslinker is deoxypyridinoline (or Dpd), The ring nitrogen is derived from the lysine residue. This Pyd / Dpd ratio is due to cross-linking in urine. Generally applies to the other three classes of things. The higher molecular weight crosslinked product is It can be converted to a free crosslinked product by hydrolysis (Fujimoto, 1978). A method for measuring a pyridinium crosslinked product in urine has been proposed. One of these methods One is by quantifying the hydrolyzed Pyd peaks separated by HPLC. , Hydrolyzed whole Pyd, ie produced by extensive hydrolysis of cross-linked products in urine Including measuring Pyd (Fujimoto, 1983). Total Pyd Hydrolyzed and Year The relationship with age was expressed as the ratio of total hydrolyzed Pyd / creatinine in these studies. Determined by the investigator. There, creatine levels are measured by urine concentration and skeletal mass. Used to normalize the level of crosslinks to This ratio is in the urine of children High and relatively constant throughout adulthood, slightly increased in old age . It is speculated that this corresponds to the loss of bone mass observed in old age. Elevated levels of total crosslinks in hydrolyzed urine of patients with rheumatoid arthritis Studies have been suggested as a diagnostic method for this disease (Black, 1989). Chronic joint Levels of total hydrolyzed cross-links in rheumatic patients (for creatinine, HP Expressed as the ratio of total crosslinks measured by LC) compared to controls , Factor 5 increased. However, not the total hydrolyzed Dpd Only all Pyds that have been measured can be measured Showed a significant increase. In a more extensive study with hydrolyzed urine, Seibel et al. For control in both rheumatoid arthritis and osteoarthritis Showed a marked increase in bone-specific hydrolyzed total Pyd and total Dpd crosslinks . The most significant increase in total hydrolyzed Pyd was found in patients with rheumatoid arthritis. (Seibel). Assay method involving HPLC quantification of crosslinks from hydrolyzed samples Are relatively time consuming and expensive to perform (such as the assays shown here) And extensive screening or monitoring of the treatment of bone metabolism disorders. Then it is not practical. Immunoassays are also proposed for the measurement of urinary crosslinks. U.S. Patent No. 4, 973,666 and 5,140,103 show specific peptide sequences related to bone collagen. An assay to measure bone resorption by detecting pyridinium-bound species in urine Disclosure. These are due to Paget's disease, a high proportion of bone formation and fracture. Obtained from the urine of patients with diseases known to cause breakage. this The assay involves cross-linking compounds containing specific peptide fragments or extensions and cross-linking compounds. It relies on immunospecific binding with antibodies prepared against the peptide. Be assayed And whether the concentration of cross-linked peptide is related to total cross-linked urine It's unclear if it's related. Robins used urinary urine by using an antibody specific for hydrolyzed Pyd. Has been described (Robins, 1986). This method uses antibodies Has the limitation that it was found to be specific to the hydrolyzed form of Pyd Requires that the urine sample to be tested be first processed under hydrolysis conditions . The hydrolysis process increases the time and cost of the assay, and other natural type Preliminary exclusion of measurements of lysium cross-links. PCT International Publication No. W0 91/10141 is a natural form in unhydrolyzed urine samples. To measure peptide free pyridinoline or deoxypyridinoline levels Disclosed is a method for assessing bone collagen degradation in a human subject. There is. This method is an improvement over earlier methods based on the analysis of urine samples. Because this method does not allow the previously used pretreatment of the sample by hydrolysis. This is because it is omitted. By measuring the level of pyridinium cross-linked species in blood fluid samples Desirable to assay levels of bone collagen degradation in human subjects . Such assays are self-designed to assay various serum analytes. It can be integrated into a dynamic clinical analysis system. This method can also be used, for example, in deoxypyrididinium. By determining the ratio of Norrin / Creatinine, the change in sample volume Thus, it has the advantage that the measured level does not have to be corrected. 4.Summary of the invention The invention, in one aspect, screens for the presence of impaired bone resorption in a human subject. The method of leaning is included. In this method, a blood fluid sample is Such a pyridinium crosslink in the sample with the antibody is obtained and reacted with the antibody. It forms an immune complex with the object. This antibody is a natural free pyridinoline, natural Free deoxypyridinoline or natural free pyridinoline and deoxy Pyridinium cross-linked products selected from the group consisting of both pyridinolines and immunospecific Can react to. The amount of immune complex formed is measured and selected in the sample. The concentration of the pyridinium crosslinked product was determined. The determined concentration is (i) 5 nM natural Type free pyridinoline, (ii) 1 nM natural free deoxypyridinoline, or (i i) 6 nM natural free pyridinoline-deoxypyridinoline complex, above , The subject is indicative of having such a bone resorption disorder. Blood fluid The sample can be, for example, serum or plasma. Bone resorption disorders screened by this method are those that are hydrolyzed in urine. Includes disorders characterized by elevated levels of lysinoline crosslinks. The antibody in this method is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. And preferably at least 5 × 1 with respect to the selected pyridinium crosslinker. 0⁷Has a coupling constant of / M To do. In one embodiment, the antibody used in this method is selected from the selected pyridiniums. Urinary pyridinium peptides with a molecular weight greater than 1,000 Daltons And have a reaction ratio of greater than about 5: 1. In a related embodiment, the antibody is , Selected pyridinium crosslinkers and urinary pigments with a molecular weight greater than 1,000 daltons. Greater than about 10: 1, and more preferably 20: 1 relative to the lysium peptide It has a larger reaction ratio. In certain embodiments, the antibody is specific to naturally occurring free pyridinoline, and And natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline about 5: It has a reaction ratio of greater than 1. In a second embodiment, the monoclonal antibody is a natural antibody. Specific to native free deoxypyridinoline, and natural free deoxypyridinoline It has a reaction ratio of greater than about 25: 1 for dinoline and natural free pyridinoline. To do. In another embodiment, the monoclonal antibody comprises native free pyridinoline and And native free deoxypyridinoline, and For ridinoline and natural free deoxypyridinoline, between about 2: 1 and 1: 2 Having a reaction ratio. More generally, natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline The reaction ratio with the ratio is greater than 5: 1 and less than 1:25, all ratios in between. Is included. In one preferred embodiment, the sample is selected in the presence of the antibody. Solid coated with dinium crosslinked In contact with the body support, this solid support is used to bind this antibody to the sample in the sample for binding. It is effective in competing with such a selected crosslinked product. Antibody and sample selection The amount of immunocomplex formed with the selected pyridinium cross-linked product depends on the solid support. It is measured indirectly by measuring the amount of antibody bound to. In another preferred embodiment, the sample is exogenously reporter labeled or. Or in the presence of a selected pyridinium crosslinker capable of reporter labeling. Contact with a solid support coated with an amount of a pyridinium crosslinker. this is , An antibody in which a selected pyridinium cross-linked product from a sample is immobilized on a support To bind to exogenous cross-linking products. This method monitors the treatment of conditions associated with elevated levels of collagen degradation. It is used to This is due to the selected pyridini during such treatment. This is done by monitoring the change in the concentration of the um-crosslinked product. In a related aspect, the invention proceeds to metastatic conditions with abnormal bone resorption rates. A method of monitoring the status of a human cancer that includes or has the potential to It In this method, a blood fluid sample is obtained from the subject and the native free pyridin is obtained. Norrin, natural free deoxypyridinoline, or natural free pyridinoline or Crosslinked pyridinium selected from the group consisting of both deoxypyridinoline Reacts immunospecifically with Reaction of the antibody with a possible cross-linking of the antibody with such a pyridinium cross-linked product in the sample. Immune complexes are formed between them. In the sample by measuring the amount of immune complex formed Determine the concentration of the selected pyridinium crosslinker of. The determined pyridinium rack Concentrations of crosslinks are (i) 5 nM natural free pyridinoline, (ii) 1 nM free deoxy Pyridinoline, and (ii) 6 nM pyridinoline and dexoypyridinoline complex Bone resorption rate abnormalities associated with cancer (above metastases in bone Suggesting the ability) is shown. This method monitors changes in the concentration of selected pyridinium crosslinkers during the treatment of cancer. Treatment of cancer characterized by causing collagen degradation by nitering It can be used to monitor therapy. In another aspect, the invention assesses the level of bone collagen degradation in a human subject. Includes essay methods. In this method, a blood fluid sample is obtained from a subject, And natural free pyridinoline, natural free deoxypyridinoline, or natural Selected from the group consisting of both free pyridinoline and deoxypyridinoline React with an antibody capable of immunospecifically reacting with the pyridinium cross-linked product, and And the antibody is at least 10 against the crosslinked product selected above.⁸Has a coupling constant of / M As a result, immunocomplexation between the antibody and such a pyridinium crosslinker in the sample Form a coalesce. The amount of immune complex formed is measured and selected in the sample. Cross-linked pyridinium To determine the concentration of. The determined concentration is (i) 5 nM of natural free pyridinoline, ( ii) 1 nM natural free deoxypyridinoline or (ii) 6 nM free natural free deoxypyridinoline. A complex of lysinoline and deoxypyridinoline, if above, the subject is It is shown to have such a bone resorption disorder. For the above method, a low threshold was used to identify individuals with elevated levels of bone degradation. It is recognized that it can be used to increase the likelihood of A value of about 3 nM for detecting free pyridinoline; natural free deoxypyridin For detection of Norrin, a value of about 0.5 nM, and naturally occurring free pyridinoline and A value of about 3.5 nM was used to detect the combined concentration of and deoxypyridinoline. Can be done. In another embodiment, the present invention relates to selected pyridinium crosslinkers above. At least 10⁸Including antibodies with an affinity constant of / M. In one embodiment, the antibody Is a cross-linked product of selected pyridinium and urine with a molecular weight greater than 1,000 daltons. Greater than about 3: 1 and preferably about 5: 1 relative to the pyridinium peptide It has a larger reaction ratio. In another aspect, the invention includes a diagnostic kit used in the above method. This The method involves the use of an antibody as described above and selected pyridinium from a blood fluid sample. Detection to detect the amount of immune complex formed by the reaction of cross-linked product with antibody And means. This method was used to detect native free pyridinoline. The kit used is preferably at least about 1 nM, more preferably at least Is also effective for detecting a blood pyridinoline concentration of 0.5 nM (“threshold concentration”) It For detecting naturally occurring free deoxypyridinoline, the kit is preferably Is at least about 0.1 nM, more preferably at least about 0.05 nM It is effective for detecting lysinoline concentration. Pyridinoline and deoxypyridy To detect the combined concentration with Norrin, the threshold concentration is preferably 1.1 nM, more It is preferably 0.6 nM. In one embodiment, the detection sensitivity of this kit was selected in a selected range. Allows detection of the concentration of pyridinium cross-links. Its range is, for example, pyridino It is 1 to 10 nM for phosphorus, or 0.1 to 10 nM for deoxypyridinoline. These and other aspects of the invention will be read upon reading the following detailed description of the invention in conjunction with the accompanying figures. The purpose and characteristics will become more fully apparent. Brief description of the drawings 1A-1C show steps for practicing one embodiment of the present invention; Figure 2 is suitable for detecting pyridinoline (N-Pyd) in blood fluid samples It is a titration curve of an antibody; Figure 3 shows the detection of deoxypyridinoline (N-Dpd) in blood fluid samples. Is a titration curve of an antibody suitable for Figure 4 shows normal subjects (control) (column 1), primary hyperparathyroidism. Patients (column 2), patients with osteomalacia (column 3), patients with impaired calcium metabolism (column 3) 4), and N- measured in serum samples from patients with osteoporosis (column 5). Indicates the concentration of Dpd; FIG. 5 shows the results of measurements according to the present invention in control healthy patients and cancer patients. The concentration of the determined serum Pyd is shown. Detailed Description of the Invention 1.Definition As used herein, the following terms have the following definitions: “Pyd” or “pyridinoline” or “free pyridinoline” is Shows the cross-linked compound shown, where N in the ring is the ε of the hydroxylysyl residue Derived from an amino group, and "Dpd" or "deoxypyridinoline" or "free" "Deoxypyridinoline" means a crosslinked compound represented by II below, wherein , The nitrogen in the ring is derived from the ε-amino group of the lysyl residue. "Free crosslinked product" refers to either Compound I or II or a mixture of both. , Ie they have no peptide or glycosyl groups attached. “Glycosylated pyridinoline” or “glyco-Pyd” refers to glycosyl of Compound I Shows a glycosyl group, where the glycosyl group is covalently bonded to the aliphatic hydroxyl group of Pyd To do. The two identified glyco-Pyd crosslinked products are Gal-Pyd and Glc.Gal-Pyd. , These include the acetals shown below in III and IV, respectively. “Pyd-peptide” or “pyridinoline-peptide” is a peptide of compound I Derivatized form, wherein one or more of the three amino acid residues of the compound Are linked to additional amino acid residues via peptide bonds. Similarly, " “Dpd-peptide” or “deoxypyridinoline-peptide” refers to a compound II peptide Shows a tide-derived form in which one or three of the three amino acid residues of the compound are The above is linked to additional amino acid residues via a peptide bond. “Pyridinium-peptide” refers to a mixture of Pyd-peptide and Dpd-peptide. Show. "Pyd-peptide with molecular weight greater than 1000 daltons" or "Pyd-pepti (MW> 1000) ”is retained by a dialysis membrane cut off to a molecular weight of 1,000. Pyd-peptide is shown. "Pyd crosslinks" include Compound I in either free or peptide-derivatized form A pyridinium cross-linked product is shown. Pyd crosslinked products include Pyd, glyco-Pyd and Pyd-peptides. Includes. Similarly, "Dpd cross-linked" means either free or peptide-derivatized form. The pyridinium cross-linked product containing the compound II is shown. “Dpd crosslinked product” includes Dpd and Includes Dpd-peptides. The “pyridinium cross-linked product” is a compound I or a peptide-bonded compound I or free form. And a pyridinium cross-linked product containing II. “Whole Pyd” or “T-Pyd” is for hydrolyzing Pyd cross-links to Pyd. The total hydrolyzed Pyd produced is shown. Similarly, "All Dpd" or "T-Dp d ”is a hydrolyzate produced by hydrolyzing a Dpd cross-linked product against Dpd. All Dpds shown are shown. “Hydrolyzed Pyd” or “H-Pyd” was Py in 6N HCl at 110 ° C for 16 hours. d shows Pyd produced by hydrolyzing a crosslinked product. Similarly, "hydrolyzed Dpd "or" H-Dpd "hydrolyzed the Dpd crosslinked product in 6N HCl at 110 ° C for 16 hours. The Dpd generated by decomposition is shown. “Natural Pyd” or “N-Pyd” indicates Pyd that has not been subjected to hydrolysis conditions. You Similarly, "native Dpd" or "N-Dpd" are not subject to hydrolysis conditions. Indicates the Dpd. “Natural release” or “natural peptide release” refers to structure I or Or II (or both) and not subject to hydrolysis conditions Indicates compound. "Blood fluid" means an acellular liquid obtained from blood and its fraction, such as blood. Indicates clear or plasma. “Detection limit” refers to the negative sample (ie, the selected pyridinium Selected pyridinium crosslinked product that can be distinguished from the sample lacking the crosslinked product) Shows the concentration of. More specifically, the limit of detection is found in negative samples A selected pyramid that produces a signal that differs from the signal by at least two standard deviations. The selected concentration of dinium crosslinker. Therefore, about 0.05 nM of natural free The detection limit for cypyridinoline is at least 0.05 nM of native free deoxypyridinoline. It means the ability to detect the concentration of phosphorus. Actual detection limit is lower than specified limit . For example, in this example, an assay with a defined detection limit of 0.05 nM is 0.02 nM. It may have an actual detection limit. "Detection sensitivity" is the concentration of analyte that can be reliably measured by a particular assay procedure. Indicates the range of degrees. Therefore, the concentration of natural free pyridinoline in the range of 0.1-10 nM The detectable sensitivity is such that the assay procedure can detect an analyte concentration of 0.1 nM, And It means that a difference in the concentration of the analyte can be detected in the range of 0.1 to 10 nM. This asset The actual detection range of b is wider than the specified range. For example, in this embodiment, 0.1 Assays with detection sensitivities in the range ~ The degree can be detected and discriminated. II.Preparation of antibody reagents In this section, selected natural free pyridinium cross-links (N-Pyd, N-D and / or pd specific for monoclonal and polyclonal The production of antibody (“antibody reagent”) is described. In one embodiment, the antibody is selected. Natural free pyridinium cross-linked product and urine with a molecular weight greater than 1,000 daltons. Greater than about 3: 1 and preferably about 5: 1 relative to the pyridinium peptide. It has a larger reaction ratio. Specific embodiments in which this antibody is for binding naturally occurring free pyridinoline In an aspect, the antibody is preferably a naturally occurring free pyridinoline and a naturally occurring free deoxypyridine. Greater than about 5: 1, preferably greater than about 20: 1, relative to lysinoline, And more preferably has a reaction ratio of greater than about 100: 1. This antibody is for binding natural free deoxypyridinoline In a particular embodiment, the antibody preferably comprises native free deoxypyridinoline. Greater than about 5: 1, preferably greater than about 25: 1 relative to native free pyridinoline Have a reaction ratio of greater, and more preferably greater than about 100: 1 It This antibody is a natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline In a third particular embodiment, which is for binding both, the antibody is preferably Is about 10% of natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline. It has a reaction ratio between 2: 1 and 1: 2. The antibody reagent of the present invention is preferably a selected pyridinium species (N-Pyd or N -Dpd) about 5 × 10⁷It has a binding affinity constant greater than / M. A.Immunogen The immunogen used to produce the antibody reagent is a carrier molecule, typically a key molecule. Dpd or conjugated to a carrier protein such as whole limpet hemocyanin (KLH). Or Pyd. Pyd can be native Pyd (N-Pyd) or hydrolyzed Pyd (H-Pyd). Similarly, Dpd is either native Dpd (N-Dpd) or hydrolyzed Dpd (H-Dpd) obtain. To obtain N-Dpd or N-Pyd from other pyridinium compounds in urine Crude separation of N-Dpd or N-Pyd was performed by fractionation of urine as described in Example 2. Can be broken. Briefly, the urine concentrate was applied to a Sephadex G-10 column and the whole The fraction containing pyridinium is eluted. Then, the eluate was added to sodium citrate. A column of phosphocellulose equilibrated with sodium chloride and eluted with salt to form a single pellet. A free cross-linked product of the ark is obtained. This sample is hydrolyzed The peaks are in the form of N-Dpd and N-Pyd (“free crosslinker”) since they have not been subjected to conditions ) As well as glyco-Pyd, including the above Gal-Pyd and Glc-Gal-Pyd. Further purification is then carried out by standard methods, such as sulfonated polystyrene beads. Conveniently by using ion exchange on HPLC or HPLC. This minute Typical protocols for separation are, for example, Black et al., 1988, Seibel et al., 1989. Seen and detailed in Example 2. Alternatively, hydrolyzed Pyd or as described, for example, in Black et al., 1988. Dpd is produced by acid hydrolysis of bone collagen or pyridinium crosslinks in urine And purified. Coupling of Pyd or Dpd to carrier proteins is typically bifunctional. It is carried out by a standard coupling method using a coupling agent. This bifunctionality Coupling agents from Pyd were prepared at one coupling end according to standard methods. Or it forms an amide bond with one of the free carboxyl groups of Dpd, and Amide or ester bond or disulfi with carrier protein Form a bond. Alternatively, in a preferred embodiment, Pyd or Dpd is, for example, EDC (1- (3-di Water-soluble carboxy such as methylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide) In the presence of a protein activator, direct coupling to the protein is performed according to known methods. Can be The latter method is described in Example 3, which uses EDC Keyhole limpet hemocyanin by activation The coupling of Dpd to (KLH) is described. Carrier protein as peptide antigen A general coupling reaction for inducing P. coli is described by Harlow (1988), pp. 77-87, And Wong (1991). B.Monoclonal antibody reagent To prepare a monoclonal antibody reagent, the immunogens described above, such as mouse Used to immunize animals. Due to immortalization of antigen-specific lymphocytes It can be obtained from an animal. Certain animals that have been found suitable include the Jackson Laboratory ( "Autoimmune" MRL / MpJ-lpr mice available from Bar Harbor, MN). Pyd immunogens are typically used where antibodies specific for N-Pyd are desired. Similarly, where an antibody specific for N-Dpd is desired, the Dpd immunogen is typically used. Be done. Antibodies that recognize both Pyd and Dpd use the Pyd or Dpd immunogens. Can be obtained. B. 1N-Pyd monoclonal antibody. Monoclonal antibody reagent specific for N-Pyd To produce H. Pyd-KLH immunogen as outlined in Example 4. Can be immunized with a series of injections of. About 8 weeks after the initial immunization, spleen cells Harvested and fused with P3X63Ag8.653 myeloma cell line. Successful fusion Selection of joint products can be carried out in published methods (generally, Harlow, pp. 196-212), HAT in conditioned S-DMEM medium. Can be done. The successful fusion product was then transformed into the immunoreactor described in Example 8. Immunoreactivity with N-Pyd using a competitive immunoassay format similar to the essay format To be screened for. Cell lines with high binding affinity for N-Pyd are limited. It is subcloned by limiting dilution and has a high binding affinity for N-Pyd. Are further screened for production of antibodies. Obtained by the above procedure , And some subcloned species with high antibody affinity for N-Pyd This cell line was designated herein as Mab-XXV-3G6-3B11-1A10. This thin Cell type sample is American Type Culture Collection) 12301 Parklawn Dr., Rockville MD 20852) and was deposited as ATCC number HB11089. To produce the antibody reagent, the hybridoma cell line was prepared using the following materials and methods. Of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) added as described in the section As described above (Harlow, pp.247-270). Monoclona Antibodies (“Mabs”) were used in culture media according to published methods (Harlow pp.271-318). Can be harvested, concentrated, and stored. As mentioned above, an important feature of the present invention is that the higher molecular weight pyridinium in urine is Specificity of N-Dpd and N-Pyd antibody reagents compared to cross-linked products. N-Pyd, N-D The relative specificity of the antibody reagents for pd, and other urinary pyridinium cross-links, was determined in Example 10. Can be determined by a competitive binding assay for N-Pyd, as detailed in. Briefly, various purified crosslinked samples (N-Pyd and N-Dpd, as well as Amino acid mixture containing 20 common amino acids in equimolar amounts (150 μM each) Reacts with a limited amount of antibody reagent on a solid support that has N-Pyd attached. This anti Correspondingly, the pyridinium cross-linked product in the sample binds to the support in order to bind to the antibody. It is performed under conditions that compete with the combined N-Pyd. The degree of binding of the antibody to the solid support is , Provides a measure of the relative reactivity of sample cross-links to antibody reagents. Following the procedure outlined in Example 10, N-Pyd, N-Dpd, Pyd peptides (MW> 1,000 ), And a mixture of amino acids (150 μM each of 20 common amino acids) and the cell line Pyd XX. The binding level with the monoclonal antibody from V-3G6-3B11-1A10 was tested. Each service The apparent Pyd concentration of the sample was determined using a calibration curve prepared using purified N-Pyd. It has been determined. The% reactivity of each sample was determined by HPLC for total H-Pyd For the total Pyd crosslinker concentration in the sample (× 100) or for the N-Dpd sample In some cases, for the total Dpd crosslinker concentration determined by HPLC for total H-Dpd ( X 100), as a ratio of apparent concentration (measured using the N-Pyd calibration curve above) Was calculated. The results are shown in Table 1, where the reactivity with N-Pyd was defined as 100%. As shown, the monoclonal antibody reagent was directed against N-Pyd compared to N-Dpd. Natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline with high selectivity And a reaction ratio greater than about 3: 1 and in this case greater than 5: 1 . This reagent also quantifies the pyridinium-peptide form tested (total Pyd content. Is more selective to N-Pyd than the It shows a reaction ratio of greater than about 100: 1 for the dinoline peptide. Furthermore, this trial The drug shows minimal cross-reactivity (<1%) with the tested amino acid mixture. More generally, Mab reagents specific for N-Pyd are native free pyridinol (N-Pyd) and Pyd-peptide (MW> 1000) measured by the above assay. As specified, greater than 5: 1, preferably greater than 10: 1, more preferably 2 It has a reactivity of greater than 5: 1 and in this case greater than 100: 1. B. TwoN-Dpd monoclonal antibody. Specific for N-Dpd The above procedure to obtain N-Pyd Mab was used to produce the monoclonal antibody reagent. (But not using Dpd-KLH as the immunogen), and immune response Cleaning is done in an assay for N-Dpd. By this procedure, one sub To obtain a cloned cell line and confer high antibody affinity for N-Dpd. This cell line is referred to herein as Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11 (see Example 5). See). Antibody reagents are hybridized using the same general procedure as described above for N-Pyd Mabs. Prepared and stored from the dorma cell line. Relative antibody reagents to N-Dpd, N-Pyd, and other urinary pyridinium crosslinkers Specificity can be determined by the method described above (Section B.1), but N-D A solid phase support with pd attached is used. N-Dpd, N-Pyd, Dpd peptides (MW> 1,000) according to the procedure outlined in Example 10. , And a mixture of amino acids (150 μM each of 20 common amino acids) The level of binding to the body (from the cell line Mab-Dpd-II-7B6-1F4-1H11) was tested. Each sun Apparent Dpd concentration of pull is determined using a calibration curve prepared with purified N-Dpd Was done. The% reactivity of each sample was determined by HPLC for total H-Dpd. (× 100) for the total Dpd crosslinker concentration in the pull, or for N-Pyd samples For the total Pyd crosslinker concentration determined by HPLC for total H-Pyd (× 10 0), apparent N-Dpd concentration (measured using the N-Dpd calibration curve above) Calculated as the ratio of The results are shown in Table 2, where the reactivity of N-Dpd is 100 It was defined as%. As shown, the monoclonal antibody reagent directed against N-Dpd compared to N-Pyd. Natural free deoxypyridinoline and natural free pyridinoline with high selectivity And a reaction ratio of greater than about 100: 1. This reagent also It is more selective for N-Dpd than the lysium-peptide form (which quantifies Dpd content) Yes, for deoxypyridinoline peptides with a molecular weight greater than 1,000 Daltons Thus exhibiting a reaction ratio of greater than about 3: 1 and preferably greater than about 5: 1. further , The reagents show minimal cross-reactivity (<1%) with the tested amino acid mixture. More generally, Mab reagents specific for Dpd are natural pyridinoline (N-Dpd ) And Dpd peptide (MW> 1000) as determined by the above assay Such as greater than about 5: 1, preferably greater than 10: 1, more preferably 25: 1. It has a reactivity of greater than 100 and in this case greater than 100: 1. B. 3Monochrome binding N-Pyd and N-Dpd with nearly equal affinity Null antibody . Monochrome binding N-Pyd and N-Dpd with nearly equal affinity The above procedure to obtain N-Pyd Mab and N-Dpd Mab to produce the null antibody reagent Can be used. The immunogen can be Pyd-KLH or Dpd-KLH, and the immune response screen The leaning is done in separate assays for N-Pyd and N-Dpd. To the above procedure Shows that one subcloned cell line using H-Dpd-KLH as immunogen And give high antibody affinity to both N-Dpd and N-Pyd The system is referred to herein as Mab Pyd / Dpd-V-6H2-2H4-1E4 (see Example 6). thing). Antibody reagents are hybridized using the same general procedure as described above for N-Pyd Mabs. Prepared and stored from the dorma cell line. Relative antibody reagents to N-Dpd, N-Pyd, and other urinary pyridinium crosslinkers Specificity can be determined by the procedure described above (sections B.1 and B.2). In this case, for antibodies produced using the Pyd / Dpd-V-6H2-2H4-1E4 cell line ,% Reactivity of each sample was determined by HPLC for total H-Dpd in the sample For the total Dpd crosslinker concentration of (× 100), or in the case of N-Pyd sample, (× 100) for total Pyd crosslink concentration determined by HPLC for total H-Pyd, Calculated as the ratio of the apparent N-Dpd concentration (measured using the N-Dpd calibration curve above) It was The results are shown in Table 3, where the reactivity of N-Dpd is 100%. Defined. As shown, the monoclonal antibody reagents have a cross-reactivity ratio close to 1: 1 and Recognizes N-Dpd and N-Pyd with comparable affinities. This reagent has also been tested For N-Dpd rather than pyridinium-peptide forms (both Pyd and Dpd peptides) Is selective and is suitable for pyridinium peptides with a molecular weight greater than 1,000 daltons. And shows a reaction ratio of greater than about 3: 1 and in this case greater than 9: 1. It Moreover, the reagents show minimal cross-reactivity (5%) with the tested amino acid mixture. More generally, Pyd / Dpd-specific Mab reagents are native free pyridinoline (N-Pyd ) And natural free deoxypyridinoline (N-Dpd) about 2: 1 and 1: 2. Has a reactivity between. C.Polyclonal antibody Preparation of polyclonal antibodies is performed by conventional techniques, The prior art includes immunological protocols known in the art, such as Harlow, pp. Immunogen to a suitable mammalian subject, such as a rabbit or mouse, according to 93-115. Injecting. Immunogens typically adjuvanted in rabbits And booster immunization every 2-3 weeks by subcutaneous or intramuscular injection. Mice can be injected intraperitoneally according to a similar schedule. Blood is when , For example, 1-2 weeks after each immunization injection. Antiserum titrated, standard exempt Antibody formation for N-Pyd or N-Dpd by epidemiological precipitation method (Harlow, pp.423-470) Can be determined. One method for producing polyclonal antibodies in rabbits Will be described in detail in Example 11. Binding affinity constants for polyclonal antisera were determined by known methods (eg, immunoprecipitation). By Scatchard analysis using the drop method or an ELISA assay; Campbell, Segel) and selected pyridiniu. Mean binding affinity constants of antibodies in antisera specific for M. spp. Rabbit VI The polyclonal antibody obtained from -8 was as determined by Scatchard analysis. , About 1 × 10⁸Has a binding constant for N-Pyd of. Antibody reagents against selected pyridinium species and other pyridinium crosslinks Relative binding specificity was determined by the competitive binding assay, as described above and detailed in Example 14. May be determined by Say. Table 4 shows the relative anti-Pyd antisera obtained from rabbit VI-8. Conclusion It shows polyspecificity, where the reactivity with N-Pyd is defined as 100%. As shown, the antibody reagent is specific for N-Pyd and is 10% less than N-Dpd. Full cross-reactivity, less than 5% cross-reactivity with Pyd peptide (MW> 1000), and The mino acid mixture is shown to be moderately cross-reactive (~ 12%). 1 of the present invention According to one aspect, the polyclonal antibody reagent is selected from naturally occurring free pyridinium. Species (N-Pyd, N-Pyd, or both) and urine with a molecular weight greater than 1,000 daltons Against the pyridinium peptide of Escherichia coli as determined by the above antigen-competition assay Thus, it has a reactivity greater than 3: 1 and preferably greater than about 5: 1.^* III.Immunoassay kit In another aspect, the invention features bone collagen content in a human subject. Includes diagnostic kits for use in solution level assays. This kit is on Antibody reagents of the type described in the section above, which contain native free deoxyribonucleic acid. Preferably about 5 x 10 for cypyridinoline⁷Greater than / M, and even better Kuha 8 × 10⁸It has a binding constant greater than / M. This kit also selects with antibody reagents The amount of immune complex formed by the reaction with the cross-linked pyridinium For detecting selected cross-links in the blood fluid sample. It is effective for measuring the level of objects. For illustration purposes, such a kit for N-Pyd measurements in samples A particular embodiment of is shown at 10 in Figures 1A-1C. The solid support 12 of the kit is It has a surface that can be adsorbed or chemically bound. Chemically inducible Various glass and poly with a surface that is effective for various groups or protein adsorption Mer resin supports are available. In one preferred embodiment, the kit comprises We provide a microtiter plate of 96 assay wells, where the well surface is Forming a solid support surface in the kit. The binder in Kit 10 is N-Pyd, shown in the figure as 16 by the Pyd (N) molecule. Be done. The binding agent is a solid phase (in this case each of the 96-well microtiter plates). Wells) first with porcine serum albumin-biotin complex (complex 18 in Figure 1A) Are adsorbed onto the well surface, and then the N-Pyd-streptavidin complex (complex By binding body 20) to adsorbed biotin, Be combined. The antibody reagent in this kit is indicated at 22 in Figures 1B and 1C and is And the polyclonal or monoclonal reagents described in Section 1. Shown in Figure 1B As shown in the table, the pyridinium crosslinked product (N-Pyd crosslinked product represented by 26) in the sample is , Compete with surface bound N-Pyd for binding antibody reagents. Antibody reagents and sumps The immune complex formed by the reaction with the cross-linker is shown at 28 in this figure. The detection reagent (detection means) in this kit is a reporter-labeled secondary antibody. An antibody reagent, shown by 24 in 1C, that itself binds to N-Pyd bound to a solid support The combination of is effective. Reporter-labeled antibodies (such as enzyme-labeled antibodies) Commercially available, or already easily configured for various reporter parts (Harlow, pp.319-358). One preferred enzyme for enzyme-labeled antibodies is Lucari phosphatase, which reacts with p-nitrophenyl phosphate substrate Accordingly, a colored product having a strong absorption peak at 405 nm can be produced. The reporter-labeled secondary antibody is typically an anti-IgG antibody (anti-rabbit IgG antibody or Anti-mouse IgG antibody). For anti-rabbit IgG antibody, Internal antibody reagents are obtained from immunized rabbits. Anti-mouse IgG antibody, antibody The reagent is a mouse monoclonal antibody. Where the antibody reagent (as described above for N-Py immunoreactive with d) is "reporter-labelable". It is the antibody reagent For reaction with porter-labeled secondary antibody This is because it can be labeled more. Another example of a reporter-labelable antibody reagent is Biot. Antibodies labeled with tin or streptavidin, which are for detection purposes React with a reporter-labeled streptavidin or biotin-labeled partner You can In another embodiment, the detection reagent is an anti-Pyd labeled with a reporter such as an enzyme. It can be the antibody reagent itself. The detection means in this kit also detect the reporter in the reporter-labeled antibody. Includes necessary substrates etc. needed for. In another kit embodiment, the support-bound binding agent is described in Section II. Anti-Pyd antibody reagent as listed. Antibodies can be solid-supported by various known methods. Can be bound to the body. These known methods are chemically induced according to standard methods. Or high affinity binding of antibody with support-bound Protein A or anti-IgG antibody Inclusive. The kit may further include a deoxypyridinoline reagent, which Is the native free deoxypyridine in the sample for binding to the antibody reagent on the support. Effective against competition with ridinoline. Deoxypyridinoline for detection purposes The reagent may include a reporter label covalently attached to deoxypyridinoline (e.g. That is, the reagent can be a reporter-labeled deoxypyridinoline). This format The preparation and use of an exemplary kit having is described in Examples 7-9. Alternatively, the deoxypyridinoline reagent is a reporter label. Is possible, ie the deoxypyridinoline reagent is, for example, the corresponding reporter -For recognition by labeled streptavidin or biotin molecules, biotin or Or Pyd complexed with a drug such as streptavidin. In another general embodiment, the kit provides a sample of deoxypyridinoline. Is designed for homogeneous assays in which can be detected directly in solution. It can be appreciated that the kit of the invention can be adapted to many other assay formats . Other assays include, for example, radiotracers, binding coupling enzymes, fluorescence, Includes formats based on chemiluminescence or EMIT placement (Gosling). Therefore, in another preferred embodiment, the detection means in this kit are radioactive radioactive Contains a porter group, which is formed by the reaction of an antibody reagent with native free Pyd It is effective in producing a radioactive signal in proportion to the amount of immune complex. This kit is described above for N-Pyd's assay. Is used to measure N-Dpd using antibody reagents specific for N-Dpd, N-Pyd and N-Dpd, which have almost the same affinity, are bound to N- A similar format is used when used to measure the sum of Pyd and N-Dpd. The gain can be appreciated. For detection of N-Pyd, this kit is 1 nM or less, preferably 0.5 nM , And more preferably has a detection limit for N-Pyd of 0.2 nM. Figure 2 Im described in Example 13 Figure 4 shows a titration curve for N-Pyd performed in a No assay format, which is characterized in Table 4. A polyclonal antiserum obtained from rabbit VI-8 was used. As you can see from this figure, This kit provides a sensitivity of approximately 0.2 nM, while the sensitivity of N-Pyd in the range above 10 nM. It also provides reliable measurements. For detection of N-Dpd, this kit is preferably 0.1 nM or less, Preferably, it has a detection limit for N-Dpd of 0.05 nM, and more preferably 0.02 nM. To do. FIG. 3 is a titration curve for N-Dpd performed in the immunoassay format described in Example 9. The line shows the monoclonal antibody obtained from the hybridoma cell line 13D4 above. Was used. As can be seen from this figure, this kit has a detection limit of about 0.02-0.05 nM. While also providing a reliable measurement of N-Dpd in the range up to about 10 nM. The detection limit of this kit is considered to be above normal in this assay Detects only pyridinium crosslink levels in the range, while is generally considered normal Select the level of pyridinium crosslinks contained in the levels so that they are not detected. It is recognized that this can be done. IV.Immunoassay The present invention, as outlined in the section above entitled "Summary of Invention", Provided is a method of assaying a bone collagen damage level in a subject. A blood fluid sample should be used prior to assaying the sample. Preferably, pretreatment is performed to remove substances that may interfere. Such pretreatment is This can be accomplished by lychloroacetic acid precipitation, where the sample is 50% trichloroacetic acid. Mix with acetic acid 10: 1 and then centrifuge to remove precipitate. Or this service Sample through a protein A column or Staphylococcus aureus cells (eg (Available from PANSORBIN cells, Calbiochem, San Diego, CA) Excludes globulin. The preferred pretreatment step is to filter the sample And remove components of the sample having a molecular weight greater than about 30 kDa. Such filtration Can be achieved by centrifugation using a Centricon-30 filtration device (Amicon, Mass) It As shown in Section III above, the reaction of the sample with the antibody reagent can be The configuration can be used to perform in a solid phase format, or in a homogeneous assay format. For illustrative purposes, the immunoassay was performed according to Example 9, especially in serum. Assay format for assaying natural free deoxypyridinoline Enter. Here, the solid support is attached to the surface with the anti-Dpd antibody and the support. Native free deoxypyridyl derived from sample for binding to bound anti-Dpd antibody It has deoxypyridinoline labeled with an extracellular enzyme that can compete with Norrin. This way It is not understood how the method can be adapted to other solid phase or homogeneous assay formats. Can be In an exemplary embodiment of the method, a known volume, for example 100 μ l, filtered or precipitated serum samples coated with anti-Dpd antibody A solid support, for example, a microtiter plate plate as prepared in Example 8. Added to the gel. Known volume, typically 50-200 μl, following sample addition, Add the reporter-labeled Dpd of to a known dilution concentration. In Example 9, the reporter Labeled Dpd is the alkaline phosphatase-Dpd complex, i.e. enzyme labeled Dpd. It The mixture on the solid support surface is then treated, preferably with anti-Dpd antibody, to In conditions effective to achieve equilibrium for binding pd and enzyme-labeled Dpd , Incubate. In the method detailed in Example 9, the incubation Run overnight at 4 ° C. After incubation, the support is washed again to remove non-specifically bound substances, Then, the degree of the enzyme bound to the support is determined by adding an enzyme substrate to analyze the converted substrate. Determined by measuring with a photometer. Details are described in Example 9. In a typical assay, N-Dpd standards containing increasing concentrations of N-Dpd were added to N-Dpd Add to each well in duplicate to obtain a standard curve of Then up to 40 suns Add the pulls in duplicate to the remaining wells and then add those wells as above. Assay. The calibration curve shows the N-Dp value of the pyridinium cross-linked product for the sample. d Used to determine by concentration. V.Use The immunoassay methods, antibody reagents, and kits of the invention described above. Are effective in assaying levels of collagen damaging activity in human subjects . In general, the present invention generally relates to the blood of Pyd and Dpd in relation to bone collagen damage conditions. It is useful in detecting elevated liquid levels. Such a state is, for example, Osteoporosis, Paget's disease, hypothyroidism, osteoarthritis, and chronic joint disease It may include rheumatism. Other conditions involving increased levels of naturally occurring free pyridinium crosslinks Conditions include various forms of metastatic cancer, which settle in or develop in bone tissue. Otherwise, it will change the bone metabolism. The use of the method of the present invention to detect elevated serum Dpd levels is shown in FIG. This is in the serum samples of healthy (control) patients (column 1), as well as in the primary Hyperparathyroidism (column 2), osteomalacia (column 3), calcium metabolism disorder (column 4) ), And N-Dpd levels measured in serum samples of patients with osteoporosis (column 5) Is shown. This study was derived from the hybridoma cell line 13D4 (see Table 2 above) Was performed using the assay protocol described in Example 9. As can be seen from the figure, the N-Dpd level of the control group was about 0.2 nM and 0.5 nM. And the mean level (± standard deviation) was 0.33 ± 0.07 nM. Primary epithelium The hyperthyroid group shows levels between about 0.4 nM and 1.4 nM, with about 4.2 nM per person. Was shown (average value = 1.4 nM). The osteomalacia group has levels between about 0.5 nM and 2.6 nM. Bell (mean value 1.2 nM) is shown; calcium metabolism disorder Harm group shows levels between about 0.4 and 1.4 nM (mean 0.9 nM); osteoporosis The symptom group showed levels between about 0.3 and 1.1 nM (mean 0.6 nM). The data in Figure 4 for the diseased group as a whole shows collagen damage in these patients. Is consistent with the increase. Results show that serum N-Dpd levels above about 0.8 nM, more favorable Serum N-Dpd levels above about 0.5 nM increase the collagen damage in these patients. It shows that it is a useful index. Figure 5: Serum samples from a group of healthy patients (Group 1) were measured N-Pyd levels and samples from groups of cancer patients with established or suspected bone metastases The level measured by This study was characterized in Table 4, Rabbit VI -8 was used and the assay protocol described in Example 13 was used. As can be seen from the figure, the N-Pyd level of the control group was about 1 nM and 3 nM. The mean level (± standard deviation) was 1.7 ± 0.4 nM. Meanwhile, cancer glue The level is between about 2nM and 13nM, and one patient has a level of about 23nM. As shown, it was consistent with increased collagen damage in these patients. This result is about 5n Serum N-Pyd levels above M, more preferably levels above about 3 nM are It is a useful indicator of increased collagen damage in healthy patients. From the above, it can be appreciated how the objects of the invention are met. blood By using a fluid sample, the assay can be performed using native free pyridinium Crosslinked product level measurement Allows integration with other clinical trials using blood samples. This method Also required if the sample is a urine sample (eg, measurement of creatinine in urine) It is possible to omit the correction of the variation of the sample volume. This assay uses antibody reagents Therefore, it can be adapted to many convenient and rapid assay formats as described above. Book The invention provides for the detection of increased collagen degradation in patients and various collagen pathologies. Can be used to monitor the progress of treatment. The following example illustrates a method for producing antibody reagents and an assay method according to the present invention. Real The examples are intended to be illustrative and not limit the scope of the invention in any way. Yes. Example Materials and methods Female autoimmune MRL / MpJ-1pr mice were transferred to the Jackson Laboratory, Bar Harbor, Mai. I bought it from ne. Mouse non-secretory P3X63Ag8.653 myeloma cells, and mouse monocyte macrophages The di-cell lines P388D1 (IL-1) and J774A.1 are the American Type Culture Collection (ATCC), purchased from Rockville, Maryland. Adjuvants Ribi and Ribi (CWS) are commercially available from RIBI Immunochem Research, Inc., H. We purchased from amilton, Montana. 50% PEG 1500 (polyethylene glycol 1500, 50% (w: v) in water purchased from Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana It was H AT and HT are available from Sigma Chemical Company, St. Purchased from Louis, Missouri. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), NCTC-109, and Gentamicin Purchased from Gibco, Grand Island, New York. The fetal bovine clone serum is Hyclon Purchased from e Laboratories, Inc., Logan, Utah. Oxaloacetic acid and insulin Phosphorus was purchased from Sigma Chemical Company. Prescribe S-DMEM as follows, Here% indicates the final volume% in the final medium: DMEM (80%), NCTC-109 (10%) , Fetal bovine clone serum (10%), oxaloacetate (1 mM), L-glutamine (2 mM) , Gentamicin (50 μg / ml), and insulin (10 μg / ml). Mouse monocyte cell line P388D1 (IL-1) or alternative Cell line J774A.1 in S-DMEM medium twice a week with 1: 4 splitting, Let it grow. Tissue culture supernatant was filtered through a 0.2 micron filter every 3 days to give 4 mM Added L-glutamine. Use the obtained concentrated conditioned medium as a 20% supplement of S-DMEM The hybridoma cells were cultured. Unless otherwise specified, PBS is a buffer containing 0.01 M phosphate and 150 mM NaCl, pH 7. It is defined as a liquid. Example 1 HPLC measurement of cross-linked products HPLC analysis of Pyd and Dpd was performed essentially as described by Black (1988). . Briefly, a urine sample And 1: 1 (v: v: v) mixture with glacial acetic acid and CFl cellulose (Whatman ) Cartridge and then wash with 4: 1: 1 (butanol: acetic acid: water) buffer. Clean Only free crosslinks were retained. Freely cross-link the CFl cellulose with water. Eluted from Eluted material was distributed at 1 ml / min in water-acetonitrile (3-17 %, 10 min), and excitation of the fluorophore at 295 nm and at 395 nm Release was monitored and analyzed on a C18 reverse phase column (Rainin, C18-80-200-C3). Transfer The mobile phase contained 0.1% HFBA. The total cross-linked urine was hydrolyzed from a urine sample in HCl (6N) at 110 ° C for 16 hours Then, it was measured by performing the CFl pretreatment and HPLC analysis as described above. HPLC From the separation, a hydrolyzed Pyd and Dpd fraction was obtained, from which T-Pyd and Tpd -Dpd was quantified. Example 2 Purification of crosslinked products Human urine at 40 psi with a 3000 Dalton molecular cutoff filter (Filton Co.) Back pressure was applied and filtered. The filtrate is then freeze-dried and the original volume is adjusted with 0.2M acetic acid. Reconstructed to 1/20 of the volume. The concentrated urine was then equilibrated with 0.2 M acetic acid on a Sephadex G-10 2.6 x 95 cm column. I went to Elute from column material for free Pyd and Dpd as described above. analyzed. Fractions containing free cross-links were pooled together, adjusted to pH 2.0 and 1x Apply to a 18 cm cation exchange column (Lacarte Co., UK) and use 0.1 M sodium citrate. Equilibration at pH 4.2. Then from the ion exchange column, use 0.1 M sodium citrate, pH 4.2, to remove glyco -Pyd, Pyd, and Dpd were coeluted. The collected fractions were analyzed by HPLC as described above. The presence of crosslinked products was analyzed. Fractions containing specific cross-linked products (glyco-Pyd, Pyd , And Dpd) were pooled together and loaded onto a 2.5 x 10 cm reverse phase C18 column (Waters). And then spread it using a 2-20% gradient of acetonitrile containing 0.1% HFBA. Opened. Separated fractions (glyco-Pyd, Pyd, and Dpd) were collected and lyophilized. Concentrated. The dried residue was reconstituted with 0.2M acetic acid and stored at 4 ° C. Of the final substance Purity was measured by gravimetric and elemental analysis. Urine cross-linker-Peptide binds human urine to a 1000 Dalton molecular weight cutoff dialysis membrane. (Spectra-Por) was used for the thorough dialysis. Peptide fraction The content of T-Pyd and T-Dpd cross-linkages in the peptide sample was Determined by time hydrolysis and then HPLC analysis for Pyd and Dpd . Prepared amounts of H-Pyd and H-Dpd were added as described by B1ack et al. (1988). Obtained from hydrolyzed and powdered bovine or ovine bone. Example 3 Preparation of immunogen The following procedure is for natural free pyridinoline, natural free deoxypyridinoline or Or to obtain monoclonal or polyclonal antibodies against both Shows how an immunogen can be prepared. Hands in A and B below The order is described with respect to the Pyd immunogen; the Dpd immunogen is prepared similarly, but in I use Dpd. A.Pyd-BSA immunogen Contains 9 mg bovine serum albumin (BSA) and 3.8 mg Pyd in 0.1 M MES, pH 5.0. To 3.1 ml of the solution, 0.88 ml of an aqueous solution containing 88 mg of EDC was added. The mixture at room temperature Allow to react for 4 hours, then dialyze against phosphate buffered saline pH 7.0 (PBS) did. UV and fluorescence measurements show that 5.8 mol of pyridinoline per mol of albumin It was shown to have been replaced. B.Pyd-KLH immunogen To an aqueous solution (200 μl) of dry H-Pyd (6 mg) adjusted to pH 5 ± 0.5, add the key in PBS. 2 ml of a 10 mg / ml solution of whole limpet hemocyanin (KLH) was added. 3 to mixture 0 mg of solid 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide (EDC, Pie 10 minutes later, another 30 mg of EDC was added, and the reaction was continued at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was then dialyzed thoroughly against PBS, after which the Pyd-KLH immunogen was collected. saved. Example 4 Preparation of anti-Pyd monoclonal antibody A.Immunization protocol Female 5-week-old autoimmune MRL / MpJ-1pr mice were immunized using the following protocol. Turned into: On the day of fusion, immunize mice with CO₂Sacrifice with gas and dissect the spleen from the mouse Then, the plate was placed in a culture dish containing 5 ml of serum-free DMEM medium preheated to 37 ° C. Attached to spleen After removing the adhered adipose tissue, the spleen was washed with 5 ml of serum-free DMEM medium. Then Cut the spleen into small pieces and homogenize the cells with 7 ml of serum-free DMEM medium. The cells were placed in a Nizer and the cells were homogenized to prepare a cell suspension. B.Fusion protocol The following steps were performed at room temperature. Spleen cell suspension (in serum-free DMEM medium ~ 2 x 10⁸Cells) and logarithmic growth phase P3X63 Ag8.653 myeloma cells (in serum-free DMEM medium ~ 7 x 10⁷Cells) separately at 400 xg 10 Centrifuge for minutes. The resulting cell pellet was added to serum-free DMEM in a 50 mL centrifuge tube. The medium was suspended together (10 ml) and then centrifuged at 400 xg for 10 minutes. Supernatant Removed completely and tapped centrifuge tube to loosen cell pellet. For cell fusion, gently mix 50% PEG 1500 solution (4 ml) with a pipette. The tube was added dropwise to the tube for 90 seconds while mixing. Next, serum-free DMEM (4 ml) for 1 minute It was dripped in between. Then mix S-DMEM (40 ml) gently for 2 minutes. And then the mixture was mixed by pipette for an additional 2.5 minutes. The resulting mixture was centrifuged at 400 xg for 10 minutes. After removing the supernatant completely, The cells were suspended in HAT in 320 ml of 20% P388D1 conditioned S-DMEM medium. 16 cell suspensions 200 μl / well in 96 well tissue culture plates, then 7% CO 2₂Including Incubated at 37 ° C in a humid atmosphere. The cell mixture is on days 3 and 7 Remove 100 μl / well of old medium and 150 μl / well HAT medium (day 3) or H Of T medium (7th day) Either was added and it raised. Wells should be screened 7-10 days after fusion. I'm ready. C.Hybridoma screenin for the production of anti-N-Pyd monoclonal antibodies G The successful fusion product was analyzed by the N-Pyd immunoassay described in Examples 12 and 13. The format was used to screen for immunoreactivity. Higher parent for N-Pyd binding A compatible cell line was subcloned by limiting dilution and highly bound to N-Pyd. Further screening for the production of antibodies with affinity. High for N-Pyd One of the subcloned cell lines that confers high antibody affinity is referred to herein as Called Mab Pyd-XXV-3G6-3B11-1A10. Specificity of the antibody produced by this cell line Is shown in Table 1 above. Example 5 Preparation of anti-Dpd monoclonal antibody The anti-Dpd monoclonal antibody was prepared in Example 3 by the procedure described in Example 4. It was prepared using the prepared Dpd-KLH immunogen. Immunization protocol for mice carried out Same as in Example 4, but with Ribi (CWS) as adjuvant instead of Ribi And 75 μg of Dpd immunogen instead of 100 pg / mouse Except used in the fourth immunization step (18 days after fusion). The successful fusion product was prepared using the N-Dpd immunoassay format described in Example 9. And screened for immunoreactivity. Shows high affinity for binding to N-Dpd Subcloning the selected cell line by limiting dilution to give a high binding affinity for N-Dpd. Further screening for the production of harboring antibodies. High antibody parent for N-Dpd One of the subcloned cell lines that confers compatibility is referred to herein as Mab Dpd- Called II-7B6-1F4-1H11. The specificity of the antibody produced by this cell line is shown in the table above. 2 shows. Example 6 Specific for both N-Pyd and N-Dpd Preparation of monoclonal antibody Monoclonal antibodies specific for both N-Pyd and N-Dpd were tested in Example 5. Procedure was prepared using H-Dpd-KLH (Example 3) as the immunogen. I did well The fusion product was immunoreactive using the N-Dpd immunoassay format described in Example 9. Were screened for. Cell lines showing high affinity for binding to N-Dpd Subcloning by limiting dilution, high binding affinity for both N-Pyd and N-Dpd Further screening for production of antibodies with Both N-Pyd and N-Dpd One of the subcloned cell lines that gives high antibody affinity to Called Mab Pyd / Dpd-V-6H2-2H4-1E4 in the detailed text. The anti-body produced by this cell line The body specificity is shown in Table 3 above. Example 7 Alkaline phosphatase-Dpd complex Alkaline phosphatase-H-Dpd complex is bis (sulfosuccinimidyl) Prepared using berylic acid (BSSS) as a binder. Simply put, the night before it was 4 ° C 7.1mg / ml alkaline phosphatase (AP, 3mg, 140,000MW, dialyzed in PBS at room temperature) ε = 0.963 mg / mL^-1cm^-1) (Biozyme Laboratories, San Diego, CA) solution (425 μL) , 11M / mL H-Dpd in 0.1M phosphate buffer, pH 7.5 (ε = 4933M^-1cm^-1) With 24 μL of solution After mixing, the volume of the resulting mixed solution was adjusted to 500 μL with PBS. Then, in the mixed solution, 0.61 mg of BSSS (Pie was added to 50 μL of DMSO (dimethyl sulfoxide). rce, Rockford, IL) was added. Cover the reaction vessel to exclude light , And the binding reaction was allowed to continue for 2 hours at room temperature. Then 500 μl of 10 mM glycine (0. The reaction was stopped by adding 1M phosphate buffer (in pH 7.5), and the mixture was The mixture was shielded from light and incubated at room temperature for another 2 hours. Then, the mixture that stopped the reaction The mixture was darkened at 4 ° C and dialyzed with 4 PBS changes (2 L each, every 4 hours). ). The stoichiometry of Dpd to AP in the dialysate was determined spectrophotometrically at 326 nm and 280 nm. The absorbance was measured and determined. The ratio of Dpd to AP was typically 1: 1 to 2: 1. A The enzymatic activity of the P-H-Dpd complex was determined as the% of native AP activity in the standard AP assay. Decided Example 8 Preparation of anti-Dpd antibody coated plates A 96-well ELISA plate was coated as follows. 0.05% NaN₃Including Add 200 μl of a solution containing 3 μg / ml rabbit anti-mouse IgG in PBS to each well. The plates were then incubated at room temperature for 18-24 hours. incubation After that, wash buffer (PBS containing 0.3% Tween 20) was added 3 times, 300 μl per well. Washed with. After aspirating wells for the last wash, 100 mM phosphate, 150 mM NaC l, 0.05% Tween-20, 0.05% NaN₃, 0.1% bovine serum albumin, and 10 ng / ml mau 150 μl of capture solution containing anti-Dpd monoclonal antibody (13D4), pH 7 in each well Was added to. The plates were incubated at room temperature for 18-24 hours. Incubation After completion of the incubation, each well was washed 3 times with washing buffer as above. We 10% sucrose, 100 mM phosphate, 150 mM NaCl, and 0. 05% NaN₃Add 250 μl stock solution (pH 7) to each well and plate Incubated at temperature for 1 hour. The stock solution is then removed by aspiration and the plate Were placed at 37 ° C and humidity below 10% for 18-24 hours. The coated plate is Foil sealed with desiccant pack and stored at room temperature. Example 9 Serum Dpd immunoassay Standard solutions of N-Dpd and serum samples were tested in duplicate. Standard solution is typical Is 0.05% NaN₃And 0, 0.05 in 10 mM PBS containing 10 mg / mL bovine serum albumin, It consisted of 0.1, 0.2, 0.4, 1.0, 3.0, and 9.0 nM N-Dpd. Add 400 μl of each standard or serum sample aliquot to 40 μl of 50% v: v An aqueous solution of chloroacetic acid (TCA) was added. Then vortex the resulting mixture for a short time. And centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. Collect the supernatant from each centrifuge tube (300 μl ) The pH was adjusted to 7.0 ± 0.5 with 3N NaOH. To each well of the plate coated with anti-Dpd antibody from Example 8 100 μl TCA-precipitated standard or serum sample, and 50 μl Dpd alkaline phosphatase Solution (~ 75ng / mL Dpd-AP complex, 100mM PBS, 0.7% bovine serum albumin, 0.3 % Sucrose, 7mM Tris, 0.15mM MgCl₂, 0.05% Tween-20, and 0.05% azide Added). After incubating the plate at 4 ° C overnight, 0.05% NaN₃And The wells were washed with PBS containing 0.05% Tween-20. The remaining Dpd alkaline phosphatase complex in each well was added to each well in an amount of 150 μL. Substrate solution (p-nitrophenyl phosphate 2 mg / mL in 1 M diethanolamine, p H10, 1 mM MgCl₂) Is added and incubated at room temperature for 1 hour, 50 μL of 3N The enzymatic reaction was stopped by adding NaOH and the optical density of the wells at 405 nm was determined. The degree is read by using a Vmax reader (Molecular Devices Corp.). I made a essay. Of each serum sample The Dpd crosslinked product concentration was determined by comparison with a calibration curve prepared using N-Dpd standard solution. It was Example 10 Binding selectivity of antibody reagents N-Pyd, N-Dpd, and pyridinium-peptides (MW> 1000) were added as above. Isolated from urine sample. Hydrolyzing an aliquot of the pyridinium-peptide fraction Then, the cross-linked product in the fraction was converted into H-Pyd and H-Dpd. In N-Pyd and H-Pyd preparations Concentrations of Pyd, N-Dpd and H-Dpd in the preparation, and pyridinium The concentration of Dpd in the peptide preparation was determined by HPLC as in Example 1. In addition, an ammolytic mixture containing 20 common amino acids, 150 μM each, in PBS. A noic acid solution was prepared. Aliquots (50 μl) of native cross-linked preparation and amino acid mixture in duplicate To anti-Dpd antibody coated microtiter wells (Example 8) , And each well was assayed for N-Dpd as in Example 9, but In this case, 100 μL of Dpd-AP complex solution was used instead of 50 μL. Two sample optics Average the density readings (405 nm), and from these values The concentration of N-Dpd in mosquitoes was determined using a calibration curve generated by purified N-Dpd. Each sun The% reaction of the pull was determined by HPLC for total H-Dpd and total Dpd crosslinks in the sample Apparent N-Dpd concentration relative to concentration (above N-Dpd calibration Calculated as the ratio of (measured using the line) (x100). Determined for purified N-Dpd Relative reactivity to 100%, and other crosslinked preparations (and amino The acid mixture) reactivity was expressed as a percentage of 100. This assay The results obtained by the above are shown in Table 2 above. Example 11 Preparation of anti-pyridinoline antiserum For the immunization, New Zealand white rabbits (59 in total) are designated in Table 6 below. There were 8 groups according to the immunization protocol as indicated. The dose of immunization is 200 μg Pyd-BSA (Example 3A), low hapten Pyd-BSA immunogen Prepared as in Example 3A, but with lower Pyd: BSA stoichiometry), or Pyd -KLH (Example 3B), which was placed in 1.0 ml PBS and 1.0 ml Ribi adjuvant (Ribi ImmunoChemical Research, Inc.). Multiple immunizations Subcutaneous injection in the mouse, and the next booster immunization is given intramuscularly after 3 weeks. Given by injection. Antisera were collected 10 days after each immunization. Upon collection, each antiserum was conjugated with Pyd using the assay format described in Example 6. Tested for affinity. Briefly, it is a solid support for serum-derived anti-Pyd antibodies. Goat anti-rabbit I labeled with alkaline phosphatase for binding to immobilized Pyd Detection was performed using the gG antibody reagent. The immunized animals will have the following antisera defined further in the following paragraphs: If the criteria were met, continued breeding: amino acid (AA) <20%, Pyd-peptide <10%. , Titer> 5000, and separation of Pyd signal from 0 to 25 nM> 10% of total change signal. The profile of the strongest reactive antisera is shown in Table 7 below. These are examples It was measured using the assay format described in 6. The first column shows the immunization program from which the rabbit antiserum was derived. The second column is minutes Shown are pooled blood samples for analysis. The column labeled "titer" is an immunoassay Of Pyd-negative (without Pyd) optical density readings of 1.2-1.6 The dilution of each antiserum required to make is shown. The column that says "amino acid (AA)" Shows the cross-reactivity of each antiserum with the amino acid mixture described in Example 7. "Pyd- The column labeled "pep.> 1000 MW" indicates the crossover between each antiserum and Pyd-peptide (> 1000 MW). Shows differential reactivity. The last column gives the total separation of the separation between 0nM and 25nM for Pyd samples. It is shown as the fraction of Gunnar. As shown, Rabbit III-3, V-4, and VI-8 were labeled from 0 nM to 25 nM N-Pyd. A new signal change was shown. The serum with the highest activity (VI-8) was selected and Used for the N-Pyd assay described in the text. Example 12 Preparation of Pyd coated microplates Biotin-labeled ovalbumin and streptavidin-Pyd complex Used for microplate coating. Biotinylation of ovalbumin is 400 10 μl biotin-X-2,4-dinitrophenol-X-L- in μl dimethylformamide 150m with lysine and succinimidyl ester (Molecular Probes) It was carried out by adding to 10 ml of a PBS solution containing g of ovalbumin. Mix room The reaction was allowed to warm for 2 hours and then subjected to G25 column chromatography. Spectrophotometer Analysis showed that two biotins were replaced per mole of ovalbumin. It was Conjugation of H-Pyd to streptavidin is accomplished by thiolated streptavidin. This was achieved by coupling gin to H-Pyd via the binder SMCC. Thiolation Streptavidin was treated with N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate. Prepared as follows by reaction with onate (SPDP, Pierce). 5 mg of strain 0.75 ml of a solution of ptoavidin in PBS, 260 μg of SPDP in dimethylform 21 μL of amide was added. The mixture The reaction was carried out at room temperature for 1 hour and then dialyzed against PBS. SPDP labeled streptavi Gin was added by adding dithiothreitol to a final concentration of 10 mM. Originally. After incubating for 1 hour at room temperature, thiolated streptavid Was purified by loading on a G-25 column. Dimethylformamide (4 μl) to form H-Pyd-streptavidin ) In 180 μg succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1- A solution containing carboxylate (SMCC, Pierce) was added to 0.5 mg thiol in 100 μl PBS. Solution was added to the solution containing solylated streptavidin and 50 μg of H-Pyd. mixture Was reacted at room temperature for 3 hours and then dialyzed against PBS. Obtained Pyd-strep Spectrophotometric analysis of toavidin is 1 equivalent and 2 equivalents per 1 equivalent of streptavidin. It was suggested that deoxypyridinoline between and was bound. Each well of a 96-well ELISA plate was coated with N-Pyd as follows: It was Add 150 μl of 3.8 μg / ml biotin-ovalbumin solution in PBS to each well And then incubated overnight at 2-8 ° C. Wash the microplate with PBS , 200 μl of 1 mg / ml ovalbumin, and overnight incubation at room temperature Blocked by. The microplate was then washed twice with PBS. Strep The toavidin-Pyd complex binds streptavidin, which mediates binding to biotin. Fixed through. 150 μl containing 100 μg / ml streptavidin-Pyd in PBS Coat the solution with biotin-ovalbumin. Added to each well of the microplate. Incubate at room temperature for 1 hour After that, the plate was washed twice with PBS. The remaining liquid is placed in a convection oven 37 Removed from microplate by drying overnight at 0 ° C. Example 13 Pyd immunoassay with polyclonal antibody reagent Rabbit polyclonal antibody VI-8 characterized in Tables 4 and 7 above, and fruit Using the N-Pyd coated microtiter plate described in Example 12, The following immunoassay was performed. N-Pyd standard solutions and blood serum samples were tested in duplicate. The standard solution is Assay buffer (0.05% NaN in 100 mM sodium phosphate pH7 with 150 mM NaCl)₃, 0. 0%, 0.2 nM, 0.6 nM, 2.0 nM, 6.0 nM in 05% Tween 20, and 0.1% BSA), and And 24 nM N-Pyd. Serum samples should be sent to Centri prior to assay. Filtered through a con-30 (Amicon, Mass.) filtration device. 20,000 with assay buffer after adding sample or standard (25 μl / well) Add 1 × diluted VI-8 antiserum at 125 μl / well, then add assay plate Incubated overnight at 4 ° C. Plate 3 times with wash buffer at 300 μl / well After washing, 150 μl / well goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase complex (Dilution 1: 1000 in assay buffer) and The plate was incubated at room temperature for 1 hour. The wells are then washed 3 times with wash buffer. Clean Add 150 μL of enzyme substrate solution (1 mM MgCl 2) to each well.₂Containing 1.0M diethanolamine 2 mg / mL p-nitrophenyl phosphate (Sigma) in pH 9.8 was added . After incubating at room temperature for 1 hour, 50 μl of 3.0 N NaOH was added to each well. To stop the enzymatic reaction. The optical density at 405 nm was then read on a Vmax reader (Molecular D evices Corp.). Average the optical density readings (405 nm) of the two samples, and then use the N-Pyd standard. Create a calibration curve for OD readings against N-Pyd concentration using average readings from did. From this curve, the concentration of free N-Pyd crosslinked product in each serum sample was determined. Example 14 Binding selectivity of polyclonal antibody reagents N-Pyd, N-Dpd, and pyridinium-peptides (MW> 1000) were added as above. Isolated from urine sample. Hydrolyze an aliquot of the pyridinium preparation into fractions The crosslinked product therein was converted into H-Pyd and H-Dpd. Pyd concentration in N-Pyd and H-Pyd preparations Degree, Dpd concentration in N-Dpd and H-Dpd preparations, and pyridinium-peptide preparation The Pyd concentration in the material was determined by HPLC as described in Example 1. Further in PBS Prepare an amino acid solution containing an equimolar mixture of 20 common amino acids, 150 μM each. It was Aliquots of natural cross-linked preparations and amino acid mixtures (5 0 μl) in duplicate to Pyd coated microtiter wells, Each well was then assayed for pyridinoline as in Example 13. Average the optical density readings (405 nm) of two samples and The apparent N-Pyd concentration of each sample using the calibration curve prepared with purified N-Pyd. I decided. The% reaction for each sample was determined by HPLC for total H-Pyd. Apparent concentration to total Pyd crosslinked product concentration in the sample (using the N-Pyd calibration curve above) It was calculated as the ratio of (measured) (× 100). Relative determined for purified N-Pyd Reactivity arbitrarily 100%, and other crosslinker preparations (and amino acid mixtures) Reactivity was expressed as a percentage of 100. Obtained by this assay The results are shown in Tables 4 and 7 above. Although the present invention is described with respect to particular embodiments, various changes and modifications may be made to the invention. It will be appreciated that things can be done without departing from the clarity.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１２月２２日【補正内容】これらの方法のうちの１つは、HPLCにより分離される加水分解されたPydのピークを定量することにより、加水分解された全Pyd、すなわち、尿中の架橋物の広範な加水分解により生成されるPydを測定することを含む（Fujimoto，1983）。加水分解された全Pydと年齢との間の関係は、加水分解された全Pyd/クレアチニンの比として、これらの研究者により決定された。そこでは、クレアチンレベルは、尿の濃度および骨格量に対する架橋物のレベルを標準化するのに用いられる。この比率は子供の尿では高く、そして成人期を通して相対的に一定であり、老齢期ではわずかに増加する。このことは、老齢期において観察される骨量の損失に対応すると推測される。慢性関節リウマチの患者の加水分解された尿中の全架橋物のレベルの上昇に関する研究は、この疾患の診断方法として示唆された（Black，1989）。慢性関節リウマチの患者の加水分解された全架橋物のレベル（クレアチニンに対する、HP LCにより測定された全架橋物の比として表される）は、コントロールと比較して、第５因子により上昇した。しかし、加水分解された全Dpdではなく、加水分解された全Pydのみが、測定可能な増加を示した。加水分解された尿を用いたより広範な研究において、Seibelらは、排泄物において、慢性関節リウマチおよび変形性関節症の両方におけるコントロールに対して、骨特異性の加水分解された全Pydおよび全Dpdの架橋物の顕著な増加を示した。加水分解された全Pydの最も顕著な増加は、慢性関節リウマチの患者に見られた（Seibel）。 Patersonら（Br．J Cancer（1991）64：884-886）は、加水分解された尿中で測定された加水分解された全PydおよびDpdが、骨に対する転移性癌の広がりを検出するのに有用であり得ることを報告している。加水分解されたサンプルから架橋物をHPLC定量することを包含するアッセイ法（ここで示したアッセイ法のような）は、実施するのに比較的時間と費用がかかり、そして骨代謝障害の治療の広範囲なスクリーニングまたはモニタリングに対しては実用的ではない。イムノアッセイはまた、尿の架橋物の測定に対して提案される。米国特許第4, 973,666号および同第5,140,103号および国際特許出願番号WO 91/08478は、骨コラーゲンに関連する特定のペプチド連結ピリジニウム種を尿中に検出することによって、骨吸収を測定するアッセイを開示している。これらは、パジェット病、すなわち高い割合で骨の形成および破壊が起こることが知られている病気にかかっている患者の尿から得られる。このアッセイは、特異的なペプチド断片または伸長部を含む架橋化合物と、架橋物ペプチドに対して調製された抗体との免疫特異的結合に依存する。アッセイされる架橋物ペプチドの濃度が尿の全架橋物に関係しているのかどうか、そしてどのように関係しているのかは、明らかでない。 Robinsは、加水分解されたPydに特異的な抗体を使用することによって、尿中のピリジノリンを測定する技術を記載した（Robins，1986）。この方法は、抗体が、Pydの加水分解された形に特異的であることが見出されたという限界を有し、試験される尿サンプルが加水分解条件下で最初に処理されることを必要とする。加水分解処理は、アッセイの時間および費用を増加させ、そして他の天然型ピリジニウム架橋物の測定を予め除外する。 PCT国際公開第WO 91/10141号は、加水分解されていない尿サンプル中の天然型でペプチド遊離のピリジノリンまたはデオキシピリジノリンのレベルを測定することによって、ヒト被験体における骨コラーゲン分解を評価する方法を開示している。この方法は、尿サンプルの分析に基づく初期の方法より改良されている。なぜなら、この方法は、以前用いられていた加水分解によるサンプルの前処理を省いているからである。形成される免疫複合体の量を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定する。決定されたピリジニウム架橋物の濃度が、（i）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ii）1nMの遊離デオキシピリジノリン、および（ii）6 nMのピリジノリンとデオキシピリジノリンの複合物、より上である場合、癌に関連する骨吸収速度の異常性（骨における転移の可能性を示唆している）が示される。この方法は、癌の治療の間、選択されたピリジニウム架橋物の濃度の変化をモニタリングすることによって、コラーゲン分解を起こすことを特徴とする癌の治療をモニタリングするために用いられ得る。別の局面では、本発明は、ヒト被験体における骨コラーゲン分解のレベルをアッセイする方法を包含する。この方法では、血液流体サンプルを被験体から得、そして天然型遊離ピリジノリン、天然型遊離デオキシピリジノリン、または天然型遊離のピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの両方からなる群から選択されるピリジニウム架橋物と免疫特異的に反応し得る抗体と反応させ、そしてここで抗体は、上記の選択された架橋物に対して少なくとも10⁸/Mの結合定数を有し、その結果、抗体とサンプル中のこのようなピリジニウム架橋物との間で免疫複合体を形成する。形成された免疫複合体の量を測定して、サンプル中の選択されたピリジニウム架橋物の濃度を決定する。決定された濃度が、（i）5nMの天然型遊離ピリジノリン、（ii）1nMの天然型遊離デオキシピリジノリン、または（ii）6nMの天然型遊離のピリジノリンとデオキシピリジノリンとの複合物、より上である場合、被験体は、このような骨吸収障害を有することが示される。この抗体が天然型遊離デオキシピリジノリンを結合するためのものである別の特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天然型遊離デオキシピリジノリンと天然型遊離ピリジノリンとに対して、約5:1より大きい、好ましくは約25:1より大きい、そしてより好ましくは約100:1より大きい反応比を有する。この抗体が天然型遊離ピリジノリンおよび天然型遊離デオキシピリジノリンの両方を結合するためのものである第三の特定の実施態様では、抗体は、好ましくは、天然型遊離ピリジノリンと天然型遊離デオキシピリジノリンとに対して、約 2:1と1:2との間の反応比を有する。本発明の抗体試薬は、好ましくは、選択されたピリジニウム種（N-PydまたはN -Dpd）に対する約5×10⁷/Mより大きい結合親和定数を有する。Ａ．免疫原抗体試薬の生産に用いられる免疫原は、担体分子、すなわち典型的には、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような担体タンパク質と結合したDpdまたはPydである。 Pydは、天然型Pyd（N-Pyd）または加水分解されたPyd（H-Pyd）であり得る。同様に、Dpdは、天然型Dpd（N-Dpd）または加水分解されたDpd（H-Dpd）であり得る。N-DpdまたはN-Pydを得るためには、尿中の他のピリジニウム化合物からの N-DpdまたはN-Pydの粗分離は、実施例２に記載されるように、尿の分画に 10カラムにかけ、そして全ピリジニウムを含有する画分を溶出する。次いで、溶出液を、クエン酸ナトリウムで平衡化したホスホセルロースのカラムにかけ、そして塩で溶出させて単一ピークの遊離架橋物を得る。示されるように、抗体試薬は、N-Pydに対して特異的であり、N-Dpdとは10％未満の交差反応性、Pydペプチド（MW＞1000）とは5％未満の交差反応性、そしてアミノ酸混合物とは中程度（〜12％）の交差反応性であることを示す。本発明の１つの局面に従って、ポリクローナル抗体試薬は、選択した天然型遊離ピリジニウム種（N-Pyd、N-Pyd、または両方）および分子量が1,000ダルトンより大きい尿のピリジニウムペプチドに対して、上記の抗原-競合アッセイにより測定されるように、3:1より大きい、そして好ましくは約5:1より大きい反応性を有する。 III．イムノアッセイキット別の局面では、本発明は、ヒト被験体での骨コラーゲン分解レベルのアッセイで使用するための診断キットを包含する。このキットは、上記のセクションに記載したタイプの抗体試薬を含み、それは、天然型遊離デオキシピリジノリンに対して好ましくは約5×10⁷/Mより大きい、そしてさらに好ましくは8×10⁸/Mより大きい結合定数を有する。このキットはまた、抗体試薬と選択されたピリジニウム架橋物との反応により形成される免疫複合体の量を検出するための検出手段を含み、この検出手段は、血液流体サンプル中の選択された架橋物のレベルの測定に効果的である。説明の目的のために、サンプル中でのN-Pyd測定についてのこのようなキットの特定の実施態様を図1A〜1C中の10で示す。キットの固相支持体12は、結合剤が吸着され得るか、または化学的に結合され得る表面を有する。酵素標識した抗体での１つの好ましい酵素は、アルカリホスファターゼであり、これは、p-ニトロフェニルホスフェート基質と反応し、405nmで強い吸収ピークを有する有色の産物を生産し得る。リポーター標識二次抗体は、典型的には、抗IgG抗体（抗ウサギIgG抗体または抗マウスIgG抗体のような）である。抗ウサギIgG抗体では、キット中のポリクローナル抗体試薬が、免疫したウサギから得られる。抗マウスIgG抗体では、抗体試薬がマウスモノクローナル抗体である。ここで、抗体試薬（上記のようにN-Py dと免疫反応する）は、「リポーター標識可能」である。それは、抗体試薬がリポーター標識二次抗体との反応により標識され得るためである。リポーター標識可能な抗体試薬の他の例は、ビオチンまたはストレプトアビジンで標識した抗体を包含し、それは検出目的のために、リポーター標識したストレプトアビジンまたはビオチン標識した相手と反応し得る。別の実施態様では、検出試薬は、酵素のようなリポーターで標識された抗Pyd 抗体試薬それ自身であり得る。このキット中の検出手段はまた、リポーター標識抗体中のリポーターの検出のために必要とされる必要な基質などを含む。別のキットの実施態様では、支持体に結合される結合剤は、セクションIIに記載したような抗Pyd抗体試薬である。抗体は、種々の公知の方法により固体支持体に結合され得る。これらの公知の方法は、標準的な方法に従って、化学的誘導体化、または支持体結合プロテインＡまたは抗IgG抗体による抗体の高親和性結合を包含する。このキットは、ピリジノリン試薬をさらに含み得、それは、支持体上の抗体試薬への結合について、サンプル中の天然型遊離ピリジノリンとの競合に効果的である。検出目的のために、ピリジノリン試薬は、ピリジノリンに共有結合したリポーター標識を含み得る（すなわち、試薬は、リポーター標識ピリジノリンであり得る）。この形式を有する模範的なキットの調製および使用を実施例11〜13で説明する。あるいは、ピリジノリン試薬は、リポーター標識可能であり、すなわちピリジノリン試薬は、例えば、対応するリポーター標識ストレプトアビジンまたはビオチン分子による認識のために、ビオチンまたはストレプトアビジンのような薬剤と複合体化したPydを包含する。別の一般的な実施態様では、このキットは、サンプルのピリジノリンが溶液中で直接的に検出され得るような均一のアッセイのために設計される。本発明のキットが多くの他のアッセイ形式に適応され得ることは認識され得る。他のアッセイは、例えば、放射性トレーサー、結合カップリング酵素、蛍光、化学発光、またはEMIT配置（Gosling）に基づく形式を包含する。従って、別の好ましい実施態様では、このキット中の検出手段は、放射活性リポーター基を含み、これは抗体試薬と天然型遊離Pydとの反応により形成される免疫複合体の量に比例して放射活性シグナルを生産するのに効果的である。このキットは、N-Pydのアッセイに関して上記で説明しているが、このキットが、N-Dpdに特異的な抗体試薬を用いてN-Dpdを測定するのに用いられるか、またはほぼ同等の親和性を有するN-PydおよびN-Dpdを結合させる抗体試薬を用いてN- PydおよびN-Dpdの合計を測定するのに用いられる場合に、同様の形式が用いられ得ることが、認識され得る。 N-Pydの検出について、このキットは、１nMまたはそれ未満、好ましくは0.5nM 、そしてさらに好ましくは0.2nMのN-Pydについての検出限界を有する。図２は、実施例13に記載したイムノアッセイ形式で行ったN-Pydの滴定曲線を示し、これは表４で特徴付けられたウサギVI-8から得たポリクローナル抗血清を用いた。この図からわかるように、このキットは、約0.2nMの感度を提供し、一方で、10nM を越える範囲のN-Pydの信頼性のある測定も提供する。 N-Dpdの検出について、このキットは、好ましくは0.1nMまたはそれ未満、好ましくは0.05nM、そしてさらに好ましくは0.02nMのN-Dpdについての検出限界を有する。図３は、実施例９に記載したイムノアッセイ形式で行ったN-Dpdの滴定曲線を示し、これは上記のハイブリドーマ細胞系13D4から得たモノクローナル抗体を用いた。この図からわかるように、このキットは、約0.02〜0.05nMの検出限界を提供し、一方で、約10nMまでの範囲のN-Dpdの信頼性のある測定も提供する。このキットの検出限界は、このアッセイにおいて、正常を上回ると考えられる範囲でのピリジニウム架橋物レベルだけを検出し、一方で、一般に正常とされるレベルの中に含まれるピリジニウム架橋物レベルが、検出されないように、選択され得ることが認識される。 IV．イムノアッセイ法本発明は、「発明の要旨」と題した上記のセクションで概説したように、ヒト被験体の骨コラーゲンの損傷レベルをアッセイする方法を提供する。血液流体サンプルを、サンプルのアッセイに先立って、好ましくは前処理して干渉する可能性のある物質を除く。このような前処理は、トリクロロ酢酸沈澱により達成され得、ここで、このサンプルは、50％のトリクロロ酢酸と10:1で混合し、次いで遠心分離して沈澱を取り除く。実施例２架橋物の精製ヒトの尿を、3000ダルトン分子カットオフフィルター（Filton Co.）で40psi の背圧をかけて濾過した。次いで濾液を凍結乾燥し、0.2M酢酸を用いて当初の容量の1/20に再構成した。 10 2.6×95cmカラムにかけた。カラム物質からの溶出を、上記のように遊離のPy dおよびDpdについて分析した。遊離の架橋物を含む画分を一緒にプールし、pHを 2.0に合わせて、1×18cmの陽イオン交換カラム（Lacarte Co.，UK）にかけ、0.1 Mクエン酸ナトリウム、pH4.2で平衡化した。次いで、イオン交換カラムから0.1Mクエン酸ナトリウム、pH4.2を用いてglyco -Pyd、Pyd、およびDpdを共溶出した。集めた画分を上記のようにHPLC分析により架橋物の存在について分析した。特異的な架橋物を含む画分（glyco-Pyd、Pyd、およびDpd）を一緒にプールして、2.5×10cmの逆相C18カラム（Waters）にかけ、続いてそれを0.1%のHFBAを含むアセトニトリルの2-20%の勾配を用いて展開した。分離した画分（glyco-Pyd、Pyd、およびDpd）を、集めて凍結乾燥により濃縮した。乾燥した残渣を0.2M酢酸で再構成し、４℃で保存した。最終物質の純度は、重量分析および元素分析により測定した。尿の架橋物−ペプチドは、ヒトの尿を、1000ダルトン分子量カットオフ透析膜（Spectra-Por）を用いて、十分に透析することにより調製した。ペプチド画分のT-PydおよびT-Dpd架橋物の含有量は、ペプチドサンプルを6NのHClで110℃で16時間加水分解し、次いで PydおよびDpdについてHPLC分析することにより測定した。次いで500μlの10mMグリシン（0.1Mリン酸緩衝液、pH7.5中）を添加することにより反応を停止させ、混合液を、光を遮って室温でさらに２時間インキュベートした。次いで、反応を停止した混合液を４℃で暗くして、PBSを４回交換して透析した（各２Ｌずつ、４時間おき）。透析液中でのDpd対APの化学量論は、分光光度計により326nmおよび280nmでの吸光度を測定して決定した。Dpd対APの比は、代表的には1:1から2:1であった。A P-H-Dpd複合体の酵素的活性は、標準APアッセイの天然型APの活性の％として決定した。実施例８抗Dpd抗体でコーティングしたプレートの調製 96ウェルのELISAプレートを以下のようにコーティングした。0.05%のNaN₃を含むPBS中に３μg/mlのウサギ抗マウスIgGを含む200μlの溶液を各ウェルに添加し、次いでプレートを室温で18〜24時間インキュベートした。インキュベーション後、 20を含むPBS）を用いて洗浄した。最後の洗浄でウェルを吸引 05% NaN₃、0.1%ウシ血清アルブミン、および10ng/mlマウス抗Dpdモノクローナル抗体（13D4）、pH７を含む150μlの捕獲溶液を各ウェルに添加した。プレートを室温で18〜24時間インキュベートした。インキュベーションが完結した後、各ウェルを上記のように洗浄用緩衝液で３回洗浄した。ウェルを最後に吸引した後、10 %スクロース、100mMリン酸塩、150mM NaCl、および0.05% NaN₃（pH７）を含む25 0μlの保存溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後保存溶液を吸引によって除き、プレートを37℃、10％以下の湿度で 18〜24時間置いた。コーティングされたプレートは、乾燥剤のパックと一緒にホイルで密封し、室温で保存した。実施例９血清Dpdのイムノアッセイ N-Dpdの標準溶液および血清サンプルを２組ずつ試験した。標準溶液は代表的には0.05% NaN₃および10mg/mLウシ血清アルブミンを含む10mM PBS中の0、0.05、 0.1、0.2、0.4、1.0、3.0、および9.0nMのN-Dpdからなるものであった。 400μlの各標準溶液または血清サンプルアリコートに40μlの50% v:vトリクロロ酢酸（TCA）水溶液を添加した。そして得られた混合物を短時間ボルテックスにかけ、10,000rpmで５分間遠心分離した。各遠沈管から上清を集めて（300μl ）、３ＮのNaOHでpHを7.0±0.5に合わせた。実施例８からの抗Dpd抗体でコーティングしたプレートの各ウェルに、100μl のTCA沈澱した標準または血清サンプル、および50μlのDpdアルカリホスファターゼ溶液（〜75ng/mL Dpd-AP複合体、100mM PBS、0.7%ウシ血清アルブミン、0.3 %スク 0.05%アジドを含む）添加した。プレートを４℃で一晩インキ BSでウェルを洗浄した。各ウェルに残ったDpdアルカリホスファターゼ複合体を、各ウェルに150μLの基質溶液（１Mジエタノールアミン中のp-ニトロフェニルホスフェート2mg/mL、p H10、１mM MgCl₂を含む）を添加し、室温で１時間インキュベートし、50μLの3N NaOHを添加することにより酵素反応を停止し、そして405nmでのウェルの光学密度をVmaxリーダー（Molecular Devices Corp.）を用いて読みとることによりアッセイした。採集の際に、各抗血清を、実施例13に記載したアッセイ形式を用いてPyd結合親和性について試験した。簡単にいうと、血清由来の抗Pyd抗体の固体支持体に固定されたPydへの結合を、アルカリホスファターゼで標識したヤギの抗ウサギI gG抗体試薬を用いて検出した。免疫化した動物は、それらの抗血清が次のパラグラフでさらに定義する以下の基準を満たした場合、飼育し続けた：アミノ酸（AA）＜20%、Pyd-ペプチド＜10% 、力価＞5000、および0から25nMのPydシグナルの分離＞全変化シグナルの10%。最も強い反応性抗血清のプロフィールを以下の表７に示す。これらは、実施例 13に記載のアッセイ形式を用いて測定した。第１の欄は、ウサギ抗血清の由来する免疫化プログラムを示す。第２の欄は、分析のためにプールした採血を示す。「力価」と書いてある欄は、イムノアッセイ中で、Pyd-ネガティブ（Pydの存在無し）の光学密度読み取り値が1.2〜1.6を達成するのに必要な各抗血清の希釈度を示す。得られたPyd-ストレプトアビジンの分光測定分析は、ストレプトアビジン１当量当たり１当量と２当量との間のピリジノリンが結合していることを示唆した。 96ウェルのELISAプレートの各ウェルを、以下のようにN-Pydでコーティングした。各ウェルに、PBS中3.8μg/mlのビオチン−オボアルブミン溶液150μlを添加し、次に２〜８℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをPBSで洗浄し、1mg/mlのォボァルブミン200μlを添加して室温で一晩インキュベートすることによりブロックした。次いでマイクロプレートをPBSで２回洗浄した。ストレプトアビジン−Pyd複合体は、ビオチンへの結合を媒介するストレプトアビジンを介して固定される。PBS中100μg/mlのストレプトアビジン−Pydを含む150μlの溶液を、ビオチン−オボアルブミンでコーティングしたマイクロプレートの各ウエルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートをPBSで２回洗浄した。残った液体は、対流式オーブン内で37℃で一晩乾燥させることにより、マイクロプレートから除いた。実施例13 ポリクローナル抗体試薬を用いるPydのイムノアッセイ上記表４および７で特徴づけられたウサギポリクローナル抗体VI-8、および実施例12に記載のN-Pydでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、以下のイムノアッセイを行った。 N-Pydの標準溶液および血液血清サンプルを２組ずつ試験した。標準溶液は、アッセイ緩衝液（150mM NaClを含む100mMリ 0.1% BSA）中の0nM、0.2nM、0.6nM、2.0nM、6.0nM、および24nM N-Pydからなるものであった。血清サンプルを、アッセイの前に、Centricon-30（Amicon，Mass .）濾過装置を通して濾過した。サンプルまたは標準（25μl/ウェル）を添加した後、アッセイ緩衝液で20,000 倍に希釈したVI-8抗血清を125μl/ウェルで添加し、次いでアッセイプレートを４℃で一晩インキュベートした。[Procedure amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission date] December 22, 1994 [Amendment content] One of these methods is to quantify the peak of hydrolyzed Pyd separated by HPLC. By measuring the total hydrolyzed Pyd, that is, the Pyd produced by extensive hydrolysis of the crosslinked product in urine (Fujimoto, 1983). The relationship between total hydrolyzed Pyd and age was determined by these investigators as the ratio of total hydrolyzed Pyd / creatinine. There, creatine levels are used to normalize the level of crosslinks to urine concentration and skeletal mass. This ratio is high in urine of children, and is relatively constant throughout adulthood, and slightly increases in old age. It is speculated that this corresponds to the loss of bone mass observed in old age. Studies on elevated levels of total crosslinks in hydrolyzed urine of patients with rheumatoid arthritis have been suggested as a diagnostic method for this disease (Black, 1989). The level of total hydrolyzed cross-links (expressed as the ratio of total cross-links as measured by HPLC to creatinine) in patients with rheumatoid arthritis was increased by factor 5 compared to controls. However, only total hydrolyzed Pyd, but not total hydrolyzed Dpd, showed measurable increases. In a more extensive study with hydrolyzed urine, Seibel et al. Found in excreta that bone-specific hydrolyzed total Pyd and total Dpd versus controls in both rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Showed a significant increase in the cross-linked product. The most pronounced increase in total hydrolyzed Pyd was found in patients with rheumatoid arthritis (Seibel). Paterson et al. (Br. J Cancer (1991) 64: 884-886) found that total hydrolyzed Pyd and Dpd measured in hydrolyzed urine were used to detect the spread of metastatic cancer to bone. It reports that it may be useful. Assays involving HPLC quantification of crosslinks from hydrolyzed samples (such as the assay shown here) are relatively time consuming and expensive to perform, and for the treatment of bone metabolic disorders. Not practical for extensive screening or monitoring. Immunoassays are also proposed for the measurement of urinary crosslinks. U.S. Pat.Nos. 4,973,666 and 5,140,103 and International Patent Application No. WO 91/08478 disclose an assay that measures bone resorption by detecting in urine certain peptide-linked pyridinium species related to bone collagen. Disclosure. They are obtained from the urine of patients with Paget's disease, a disease known to cause a high proportion of bone formation and destruction. This assay relies on immunospecific binding of a cross-linking compound containing a specific peptide fragment or extension with an antibody prepared against the cross-linker peptide. It is not clear whether and how the concentration of cross-linked peptide assayed is related to total urine cross-linking. Robins described a technique for measuring pyridinoline in urine by using an antibody specific for hydrolyzed Pyd (Robins, 1986). This method has the limitation that the antibody was found to be specific for the hydrolyzed form of Pyd, requiring that the urine sample to be tested be first processed under hydrolyzed conditions. And The hydrolysis treatment increases the time and cost of the assay and precludes the measurement of other naturally occurring pyridinium crosslinks. PCT International Publication No. WO 91/10141 assesses bone collagen degradation in human subjects by measuring the levels of native, peptide-free pyridinoline or deoxypyridinoline in unhydrolyzed urine samples. A method is disclosed. This method is an improvement over earlier methods based on the analysis of urine samples. This is because this method omits the previously used pretreatment of the sample by hydrolysis. The amount of immune complex formed is measured to determine the concentration of the selected pyridinium crosslinker in the sample. The determined concentrations of pyridinium cross-links were higher than (i) 5 nM native free pyridinoline, (ii) 1 nM free deoxypyridinoline, and (ii) 6 nM pyridinoline / deoxypyridinoline complex. , Indicates an abnormal bone resorption rate associated with cancer, suggesting possible metastasis in bone. This method can be used to monitor the treatment of cancer which is characterized by causing collagen degradation by monitoring changes in the concentration of selected pyridinium crosslinkers during the treatment of cancer. In another aspect, the invention includes a method of assaying the level of bone collagen degradation in a human subject. In this method, a blood fluid sample is obtained from a subject, and a pyridinium crosslinker selected from the group consisting of natural free pyridinoline, natural free deoxypyridinoline, or both natural free pyridinoline and deoxypyridinoline. Reacting with an antibody capable of immunospecifically reacting with, and wherein the antibody has a binding constant of at least 10 ⁸ / M for the above selected cross-links, so that the antibody and this in the sample An immune complex is formed with such a pyridinium crosslinked product. The amount of immune complex formed is measured to determine the concentration of selected pyridinium crosslinker in the sample. The determined concentration is (i) 5 nM natural free pyridinoline, (ii) 1 nM natural free deoxypyridinoline, or (ii) 6 nM natural free pyridinoline-deoxypyridinoline complex, If above, the subject is shown to have such a bone resorption disorder. In another particular embodiment, wherein the antibody is for binding naturally occurring free deoxypyridinoline, the antibody preferably comprises about one to about naturally occurring free deoxypyridinoline and naturally occurring free pyridinoline. It has a reaction ratio of greater than 5: 1, preferably greater than about 25: 1, and more preferably greater than about 100: 1. In a third particular embodiment, wherein the antibody is for binding both naturally occurring free pyridinoline and naturally occurring free deoxypyridinoline, the antibody preferably comprises naturally occurring free pyridinoline and naturally occurring free deoxypyridinoline. It has a reaction ratio between dinoline and between about 2: 1 and 1: 2. The antibody reagents of the invention preferably have a binding affinity constant of greater than about 5 × 10 ⁷ / M for the selected pyridinium species (N-Pyd or N -Dpd). A. The immunogen used to produce the immunogen antibody reagent is a Dpd or Pyd conjugated to a carrier molecule, typically a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH). Pyd can be native Pyd (N-Pyd) or hydrolyzed Pyd (H-Pyd). Similarly, Dpd can be native Dpd (N-Dpd) or hydrolyzed Dpd (H-Dpd). To obtain N-Dpd or N-Pyd, crude separation of N-Dpd or N-Pyd from other pyridinium compounds in urine was carried out in the urine fraction as described in Example 2. Apply 10 columns and elute the fractions containing total pyridinium. The eluate is then applied to a column of phosphocellulose equilibrated with sodium citrate and eluted with salt to give a single peak of free crosslinker. As shown, the antibody reagent is specific for N-Pyd and has less than 10% cross-reactivity with N-Dpd, less than 5% cross-reactivity with Pyd peptide (MW> 1000), It is shown to be moderately cross-reactive with the amino acid mixture (~ 12%). In accordance with one aspect of the present invention, a polyclonal antibody reagent is used to detect selected free natural pyridinium species (N-Pyd, N-Pyd, or both) and urinary pyridinium peptides of molecular weight greater than 1,000 Daltons against the above antigens. -Has a reactivity of greater than 3: 1 and preferably greater than about 5: 1, as measured by a competition assay. III. Immunoassay Kits In another aspect, the invention encompasses diagnostic kits for use in assaying bone collagen degradation levels in human subjects. This kit comprises an antibody reagent of the type described in the section above, which is preferably greater than about 5 × 10 ⁷ / M for natural free deoxypyridinoline, and more preferably 8 × 10 ⁸ / M. It has a binding constant greater than M. The kit also includes a detection means for detecting the amount of immune complex formed by the reaction of the antibody reagent with the selected pyridinium crosslinker, the detection means comprising the selected crosslink in the blood fluid sample. It is effective for measuring the level of objects. For illustrative purposes, a particular embodiment of such a kit for N-Pyd determination in a sample is shown at 10 in Figures 1A-1C. The solid support 12 of the kit has a surface to which a binding agent can be adsorbed or chemically bound. One preferred enzyme in enzyme-labeled antibodies is alkaline phosphatase, which can react with p-nitrophenylphosphate substrate to produce a colored product with a strong absorption peak at 405 nm. The reporter-labeled secondary antibody is typically an anti-IgG antibody (such as an anti-rabbit IgG antibody or anti-mouse IgG antibody). For anti-rabbit IgG antibodies, the polyclonal antibody reagent in the kit is obtained from immunized rabbits. In the anti-mouse IgG antibody, the antibody reagent is a mouse monoclonal antibody. Here, the antibody reagent (which immunoreacts with N-Pyd as described above) is "reporter-labelable". That is because the antibody reagent can be labeled by reaction with a reporter-labeled secondary antibody. Other examples of reporter-labelable antibody reagents include antibodies labeled with biotin or streptavidin, which can be reacted with a reporter-labeled streptavidin or biotin-labeled partner for detection purposes. In another embodiment, the detection reagent may be the anti-Pyd antibody reagent itself labeled with a reporter such as an enzyme. The detection means in this kit also include the necessary substrates and the like needed for detection of the reporter in the reporter-labeled antibody. In another kit embodiment, the support-bound binding agent is an anti-Pyd antibody reagent as described in Section II. The antibody can be attached to the solid support by a variety of known methods. These known methods include chemical derivatization, or high affinity binding of antibodies with support-bound Protein A or anti-IgG antibodies, according to standard methods. The kit can further include a pyridinoline reagent, which is effective in competing with native free pyridinoline in the sample for binding to the antibody reagent on the support. For detection purposes, the pyridinoline reagent may include a reporter label covalently attached to pyridinoline (ie, the reagent may be a reporter labeled pyridinoline). The preparation and use of an exemplary kit having this format is described in Examples 11-13. Alternatively, the pyridinoline reagent is reporter-labelable, i.e., the pyridinoline reagent comprises Pyd complexed with an agent such as biotin or streptavidin for recognition by the corresponding reporter-labeled streptavidin or biotin molecule. To do. In another general embodiment, the kit is designed for a homogeneous assay in which the sample pyridinoline can be detected directly in solution. It can be appreciated that the kit of the invention can be adapted to many other assay formats. Other assays include formats based on, for example, radiotracers, binding coupling enzymes, fluorescence, chemiluminescence, or EMIT placement (Gosling). Therefore, in another preferred embodiment, the detection means in the kit comprises a radioactive reporter group, which emits in proportion to the amount of immune complex formed by the reaction of the antibody reagent with native free Pyd. It is effective in producing an activation signal. This kit is described above with respect to the assay for N-Pyd, but this kit is used to measure N-Dpd using antibody reagents specific for N-Dpd, or a near equivalent It will be appreciated that a similar format can be used when used to measure the sum of N-Pyd and N-Dpd using antibody reagents that bind N-Pyd and N-Dpd with affinity. obtain. For detection of N-Pyd, the kit has a detection limit for N-Pyd of 1 nM or less, preferably 0.5 nM, and more preferably 0.2 nM. FIG. 2 shows a titration curve for N-Pyd performed in the immunoassay format described in Example 13, using the polyclonal antisera obtained from rabbit VI-8 characterized in Table 4. As can be seen from this figure, this kit provides a sensitivity of approximately 0.2 nM, while also providing a reliable measurement of N-Pyd in the range above 10 nM. For detection of N-Dpd, the kit preferably has a detection limit for N-Dpd of 0.1 nM or less, preferably 0.05 nM, and more preferably 0.02 nM. FIG. 3 shows a titration curve for N-Dpd performed in the immunoassay format described in Example 9, using the monoclonal antibody obtained from the hybridoma cell line 13D4 described above. As can be seen in this figure, this kit provides a detection limit of about 0.02-0.05 nM, while also providing a reliable measurement of N-Dpd in the range up to about 10 nM. The detection limit of this kit is to detect only levels of pyridinium cross-linker in this assay that are considered above normal, while levels of pyridinium cross-linker included in the generally normal levels are detected. It will be appreciated that it may be selected so that it is not. IV. Immunoassay Methods The present invention provides methods for assaying bone collagen damage levels in a human subject, as outlined in the section above entitled "Summary of the Invention". The blood fluid sample is preferably pretreated to remove potentially interfering substances prior to assaying the sample. Such pretreatment can be accomplished by trichloroacetic acid precipitation, where the sample is mixed with 50% trichloroacetic acid 10: 1 and then centrifuged to remove the precipitate. Example 2 Purification of Crosslinked Products Human urine was filtered through a 3000 Dalton molecular cutoff filter (Filton Co.) with a back pressure of 40 psi. The filtrate was then lyophilized and reconstituted with 0.2M acetic acid to 1/20 of the original volume. Applied to a 10 2.6 x 95 cm column. Elution from column material was analyzed for free Pyd and Dpd as described above. Fractions containing free cross-links were pooled together, adjusted to pH 2.0, applied to a 1 x 18 cm cation exchange column (Lacarte Co., UK) and equilibrated with 0.1 M sodium citrate, pH 4.2. did. Then, glyco-Pyd, Pyd, and Dpd were co-eluted from the ion exchange column with 0.1 M sodium citrate, pH 4.2. The collected fractions were analyzed for the presence of crosslinks by HPLC analysis as described above. Fractions containing specific cross-links (glyco-Pyd, Pyd, and Dpd) were pooled together and loaded onto a 2.5 x 10 cm reverse phase C18 column (Waters), which was subsequently loaded with acetonitrile containing 0.1% HFBA. 2-20% gradient was developed. Separated fractions (glyco-Pyd, Pyd, and Dpd) were pooled and concentrated by freeze-drying. The dried residue was reconstituted with 0.2M acetic acid and stored at 4 ° C. The purity of the final material was determined by gravimetric and elemental analysis. Urine cross-links-peptides were prepared by extensive dialysis of human urine using a 1000 Dalton molecular weight cutoff dialysis membrane (Spectra-Por). The content of T-Pyd and T-Dpd crosslinks in the peptide fraction was determined by hydrolyzing the peptide sample with 6N HCl at 110 ° C. for 16 hours and then HPLC analysis for Pyd and Dpd. The reaction was then stopped by adding 500 μl of 10 mM glycine (in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5) and the mixture was incubated for a further 2 hours at room temperature in the dark. Then, the mixed solution in which the reaction was stopped was darkened at 4 ° C., and PBS was exchanged 4 times and dialyzed (2 L each, every 4 hours). The stoichiometry of Dpd to AP in the dialysate was determined by measuring the absorbance at 326 nm and 280 nm with a spectrophotometer. The ratio of Dpd to AP was typically 1: 1 to 2: 1. The enzymatic activity of the A PH-Dpd complex was determined as the% of activity of native AP in the standard AP assay. Example 8 Preparation of Plates Coated with Anti-Dpd Antibody 96-well ELISA plates were coated as follows. 200 μl of a solution containing 3 μg / ml rabbit anti-mouse IgG in 0.05% NaN ₃ in PBS was added to each well and the plates were then incubated at room temperature for 18-24 hours. After incubation, PBS containing 20). Aspirate wells at last wash 150 μl of capture solution containing 05% NaN ₃ , 0.1% bovine serum albumin, and 10 ng / ml mouse anti-Dpd monoclonal antibody (13D4), pH 7 was added to each well. The plates were incubated at room temperature for 18-24 hours. After the incubation was complete, each well was washed 3 times with wash buffer as above. After the final aspiration of the wells, 250 μl of stock solution containing 10% sucrose, 100 mM phosphate, 150 mM NaCl, and 0.05% NaN ₃ (pH 7) was added to each well and the plate was incubated at room temperature for 1 hour. did. The stock solution was then aspirated off and the plates were left at 37 ° C, humidity below 10% for 18-24 hours. The coated plates were foil sealed with desiccant packs and stored at room temperature. Example 9 Serum Dpd Immunoassay Standard solutions of N-Dpd and serum samples were tested in duplicate. Standard solutions typically consisted of 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0, 3.0, and 9.0 nM N-Dpd in 10 mM PBS containing 0.05% NaN ₃ and 10 mg / mL bovine serum albumin. It was To 400 μl of each standard solution or serum sample aliquot was added 40 μl of 50% v: v trichloroacetic acid (TCA) in water. The resulting mixture was briefly vortexed and centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was collected from each centrifuge tube (300 μl) and the pH was adjusted to 7.0 ± 0.5 with 3N NaOH. In each well of the plate coated with anti-Dpd antibody from Example 8, 100 μl of TCA-precipitated standard or serum sample, and 50 μl of Dpd alkaline phosphatase solution (˜75 ng / mL Dpd-AP complex, 100 mM PBS, 0.7%). Bovine serum albumin, 0.3% 0.05% azide was added). Ink plate at 4 ° C overnight Wells were washed with BS. The Dpd alkaline phosphatase complex remaining in each well was added to each well with 150 μL of a substrate solution (containing ₂ mg / mL of p-nitrophenyl phosphate in 1 M diethanolamine, pH 10, containing ₁ mM MgCl ₂ ) for 1 hour at room temperature. The enzymatic reaction was stopped by incubating, adding 50 μL of 3N NaOH, and the optical density of the wells at 405 nm was assayed by reading with a Vmax reader (Molecular Devices Corp.). At the time of collection, each antiserum was tested for Pyd binding affinity using the assay format described in Example 13. Briefly, binding of serum-derived anti-Pyd antibody to Pyd immobilized on a solid support was detected using a goat anti-rabbit IgG antibody reagent labeled with alkaline phosphatase. Immunized animals continued to be housed if their antisera met the following criteria, further defined in the following paragraphs: amino acid (AA) <20%, Pyd-peptide <10%, titer> 5000. , And separation of Pyd signal from 0 to 25 nM> 10% of total change signal. The profile of the strongest reactive antisera is shown in Table 7 below. These were measured using the assay format described in Example 13. The first column shows the immunization program from which the rabbit antiserum was derived. The second column shows the blood draws pooled for analysis. The column labeled "Titer" indicates the dilution of each antiserum required to achieve a Pyd-negative (absence of Pyd) optical density reading of 1.2-1.6 in the immunoassay. Spectroscopic analysis of the resulting Pyd-streptavidin suggested that between 1 and 2 equivalents of pyridinoline were bound per equivalent of streptavidin. Each well of a 96-well ELISA plate was coated with N-Pyd as follows. To each well was added 150 μl of 3.8 μg / ml biotin-ovalbumin solution in PBS and then incubated overnight at 2-8 ° C. Microplates were washed with PBS and blocked by adding 200 μl of 1 mg / ml ovovarbumin and incubating overnight at room temperature. The microplate was then washed twice with PBS. The streptavidin-Pyd complex is immobilized via streptavidin, which mediates binding to biotin. 150 μl of a solution containing 100 μg / ml streptavidin-Pyd in PBS was added to each well of a biotin-ovalbumin coated microplate. After incubating at room temperature for 1 hour, the plate was washed twice with PBS. The remaining liquid was removed from the microplate by drying in a convection oven at 37 ° C overnight. Example 13 Immunoassay of Pyd with Polyclonal Antibody Reagent Using the rabbit polyclonal antibody VI-8 characterized in Tables 4 and 7 above, and the N-Pyd coated microtiter plate described in Example 12, the following: An immunoassay was performed. N-Pyd standard solutions and blood serum samples were tested in duplicate. The standard solution is assay buffer (100 mM solution containing 150 mM NaCl). It consisted of 0 nM, 0.2 nM, 0.6 nM, 2.0 nM, 6.0 nM, and 24 nM N-Pyd in 0.1% BSA). Serum samples were filtered through a Centricon-30 (Amicon, Mass.) Filtration device prior to assay. After addition of samples or standards (25 μl / well), VI-8 antiserum diluted 20,000-fold in assay buffer was added at 125 μl / well, then assay plates were incubated overnight at 4 ° C.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／０３７，６０２ (32)優先日 1993年３月26日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／１４０，２８４ (32)優先日 1993年10月20日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者ゴメッツ，バルタザール，ジュニアアメリカ合衆国カリフォルニア 94538, フレモント，グリマーブールバード 40390─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (31) Priority claim number 08 / 037,602 (32) Priority date March 26, 1993 (33) Priority claiming countries United States (US) (31) Priority claim number 08 / 140,284 (32) Priority date October 20, 1993 (33) Priority claiming countries United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BR, CA, CZ, FI, JP, KP, KR, NO, NZ, US (72) Inventor Gomets, Baltazar, Jr. United States California 94538, Fremont, Glimmer Boulevard 40390

Claims

[Claims] 1. A method of assaying bone collagen damage levels in a human subject, wherein blood from said subject is screened for the presence of a bone resorption disorder characterized by elevated levels of hydrolyzed pyridinoline crosslinks in urine. Obtaining a fluid sample, immunizing the sample with a pyridinium cross-linker selected from the group consisting of natural free pyridinoline, natural free deoxypyridinoline, or both natural free pyridinoline and natural free deoxypyridinoline. Reacting with an antibody capable of reacting specifically, the reaction forming an immune complex between the antibody and such naturally occurring free pyridinium cross-linked product in the sample, the immune complex formed The amount of body is measured, and the measurement determines such selected natural free pyridin in the sample. The step of determining the concentration of the um cross-linked product, and the determined concentration is (i) 5 nM natural free pyridinoline, (ii) 1 nM natural free deoxypyridinoline, or (ii) 6 nM mixed natural Free pyridinoline and deoxypyridinoline, if higher, identifying the subject as having such a bone resorption disorder. 2. The method of claim 1, wherein the antibody has a binding constant of at least 5 × 10 ⁷ / M for the selected crosslinker. 3. The method of claim 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 4. 4. The method of claim 3, wherein the monoclonal antibody is specific for native free pyridinoline. 5. 4. The method of claim 3, wherein the monoclonal antibody is specific for native free deoxypyridinoline. 6. 4. The method of claim 3, wherein the monoclonal antibody is specific for both native free pyridinoline and deoxypyridinoline. 7. The method of claim 2, wherein the antibody is a polyclonal antibody. 8. 8. The method of claim 7, wherein the polyclonal antibody is specific for native free pyridinoline. 9. 2. The method of claim 1, wherein the antibody has a reaction ratio of greater than about 5: 1 to the selected pyridinium crosslinker and urinary pyridinium peptide having a molecular weight greater than 1,000 Daltons. 10. The method of claim 1, wherein the sample is a serum or plasma sample. 11. 11. The method of claim 10, wherein the obtaining step comprises the step of removing serum or plasma components having a molecular weight of greater than about 30 kDa prior to the reacting step. 12. 11. The method of claim 10, wherein said obtaining step comprises the step of removing trichloroacetic acid-precipitable serum or plasma sample components prior to said reacting step. 13. In the presence of a reporter-labeled pyridinium crosslinker, wherein the antibody is attached to a solid support and the reaction step effectively competes with such selected pyridinium crosslinker in the sample for binding to the antibody. 2. The method of claim 1, wherein the amount of said immunocomplex formed and performed indirectly is determined by measuring the amount of reporter-labeled pyridinium crosslinker bound to said solid support. Method. 14. The antibody is reporter-labeled; a selected amount of the selected crosslinker is immobilized on the solid support; and the reaction step binds the immobilized crosslinker to the antibody In order to be effective in competing with such selected cross-links from said sample, and the amount of said immunocomplex formed is labeled with a reporter bound to said solid support. The method according to claim 1, which is indirectly measured by measuring the amount of the antibody. 15. A method of monitoring the status of a human cancer, which includes or is likely to progress to a metastatic state, including an abnormal bone resorption rate, the method comprising: obtaining a blood fluid sample from a subject; Reacting with an antibody capable of immunospecifically reacting with a pyridinium cross-linked product selected from the group consisting of free pyridinoline free form, naturally occurring free deoxypyridinoline, or both naturally occurring free pyridinoline and naturally occurring free deoxypyridinoline Forming an immune complex between the antibody and the naturally occurring free pyridinium cross-linked product thereof in the sample by the reaction, measuring the amount of the immune complex formed, and the measuring Determining the concentration of such selected natural free pyridinium crosslinker in the sample, and the determined concentration is (i) 5 nM native free pyridinoline, (ii) 1 nM native free deoxypyridinoline, and (ii) 6 nM mixed native free pyridinoline and deoxypyridinoline, if higher, the subject has a bone disorder Identifying as having. 16. 16. For use in monitoring the treatment of such cancers, wherein the identifying step further comprises the step of determining a change in the concentration of the selected crosslinker during the treatment of the cancer. the method of. 17． The method according to claim 15, wherein the antibody is a monoclonal antibody having a binding constant of at least 5 × 10 ⁷ / M for the selected crosslinked product. 18. The method according to claim 15, wherein the antibody is a polyclonal antibody having a binding constant of at least 5 × 10 ⁷ / M for the selected crosslinked product. 19. 16. The method of claim 15, wherein the sample is a serum or plasma sample. 20. 20. The method of claim 19, wherein the obtaining step comprises removing serum or plasma components having a molecular weight greater than about 30 kDa prior to the reacting step. 21. 20. The method of claim 19, wherein said obtaining step comprises removing trichloroacetic acid-precipitable serum or plasma sample components prior to said reacting step. 22. 16. The method of claim 15, wherein the antibody has a reaction ratio of greater than about 5: 1 to the selected pyridinium crosslinker and urinary pyridinium peptide having a molecular weight greater than 1,000 Daltons.