JPH0921803A - 2 type collagen telopeptide measuring method - Google Patents

2 type collagen telopeptide measuring method

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JPH0921803A
JPH0921803A JP7172196A JP17219695A JPH0921803A JP H0921803 A JPH0921803 A JP H0921803A JP 7172196 A JP7172196 A JP 7172196A JP 17219695 A JP17219695 A JP 17219695A JP H0921803 A JPH0921803 A JP H0921803A
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JP
Japan
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type
collagen telopeptide
antibody
telopeptide
type collagen
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JP7172196A
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Japanese (ja)
Inventor
Tadakatsu Nakamoto
忠克 中本
Hitomi Honda
仁美 本田
Shinji Kobayashi
慎治 小林
Kenji Hosoda
健治 細田
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Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
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Publication date
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To simply and accurately measure the 2 type collagen telopeptide existing in the body liquid of a mammal by using anti-2 type collagen telopeptide antibodies. SOLUTION: In this method, for instance, a sandwich method is used, in which the anti-2 type collagen telopeptide antibodies fixed to an insoluble carrier, and the anti 2 type collagen telopeptide antibodies labeled by a labeling substance are used. Monoclonal antibodies recognizing 2 type collagen telopeptide of a mammal are also used. Such monoclonal antibodies, even as the anti-2 type collagen telopeptide antibodies fixed to an insoluble carrier, can be used as the anti-2 type collagen telopeptide antibodies labeled by a labeling substance. By this method, in the examination subject of a patient having a chronic articular rheumatism in which cartilage destruction is advanced and a proteiform joint disease, the measurement of direct 2 type collagen telopeptide can be enabled. This is effective for the diagnosis and remedy of the diseases attributable to the abnormal metabolism of cartilage.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物の2型コラー
ゲンテロペプチドを特異的に認識する抗体および該抗体
を用いる哺乳動物の体液中に存在する2型コラーゲンテ
ロペプチドの測定方法に関する。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an antibody that specifically recognizes mammalian type 2 collagen telopeptide and a method for measuring type 2 collagen telopeptide present in mammalian body fluids using the antibody.

【0002】[0002]

【従来の技術】2型コラーゲンテロペプチドは、198
9年にクリントン・T・バードウインによってヒトの2
型コラーゲンテロペプチドについての正確なcDNA配
列が決定された蛋白質であって、分子量は2880の分
子であることが知られている(Clinton T.Bardwin et a
l., Biochem. J. 262 521―528(198
9))。また、数々の文献でその存在が取り上げられ、
コラーゲン蛋白の抗原性を示す部分であることが明らか
になっている(藤本大三郎編「細胞外マトリックスのバ
イオサイエンスとバイオテクノロジー」ICP社刊(1
990))。その生理作用については、まだ不明なとこ
ろが多いが、軟骨の代謝に深く関与することが推定され
ている。しかし、2型コラーゲンテロペプチドの病理学
的研究の報告はほとんどない。
2. Description of the Related Art Type 2 collagen telopeptide is 198
2 humans by Clinton T. Birdwin in 9
It is known that the precise cDNA sequence for type I collagen telopeptide is a protein having a molecular weight of 2880 (Clinton T. Bardwin et a.
l., Biochem. J. 262 521-528 (198
9)). In addition, its existence is taken up in numerous documents,
It has been clarified that it is a part showing the antigenicity of collagen protein ("Bioscience and Biotechnology of Extracellular Matrix" edited by Daisaburo Fujimoto, ICP (1
990)). Although its physiological function remains largely unknown, it is estimated to be deeply involved in cartilage metabolism. However, there are few reports of pathological studies on type 2 collagen telopeptides.

【0003】このように、軟骨の代謝に深く関与するこ
とが推定されながら、いまだ未開発の部分が多く、2型
コラーゲンテロペプチドの研究は今後の展開が期待され
る分野の一つである。したがって、その2型コラーゲン
テロペプチドを特異的にかつ簡便に感度よく測定する方
法が望まれており、かかる方法は基礎医学、臨床医学の
領域において非常に重要な意味をもつと考えられる。
As described above, although it is presumed to be deeply involved in cartilage metabolism, there are still many undeveloped parts, and research on type 2 collagen telopeptides is one of the fields for which future development is expected. Therefore, a method for specifically and conveniently measuring the type 2 collagen telopeptide with high sensitivity is desired, and such a method is considered to have a very important meaning in the fields of basic medicine and clinical medicine.

【0004】しかし、2型コラーゲンテロペプチドの測
定法の研究の報告としては、リーナ・アラ・コッコが、
マウスの細胞での2型プロコラーゲンの発現を調べるた
めに、当時、判明していたヒト2型コラーゲンテロペプ
チドの残基に対するポリクローナル抗体を用いた報告
(Leena Ala-Kokko et al., J. Biological Chemistry,
266(22),14175―14178(199
1))があるのみである。この報告では、測定はウエス
タン ブロットを用いて定性的に行われているにすぎな
い。また、動物の体液を測定するには至っておらず、動
物の体液を直接測定できる測定方法は存在しなかった。
つまり、本発明で成し遂げた動物の体液についての測定
が、23残基のペプチドに対する抗体では不可能であっ
た。
However, as a report of research on a method for measuring type 2 collagen telopeptide, Lina Ara Cocco
To investigate the expression of type 2 procollagen in mouse cells, a polyclonal antibody against a human type 2 collagen telopeptide residue that was known at that time was used (Leena Ala-Kokko et al., J. Biological. Chemistry,
266 (22), 14175-14178 (199
There is only 1)). In this report, the measurements were made only qualitatively using Western blots. Moreover, the body fluid of an animal has not been measured yet, and there is no measurement method capable of directly measuring the body fluid of an animal.
That is, the measurement of the body fluid of the animal achieved by the present invention was impossible with the antibody against the peptide of 23 residues.

【0005】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、哺乳動物の体液中に存在する2型コラーゲ
ンテロペプチドを簡便かつ精度よく測定する方法を提供
すること、およびそれに用いる哺乳動物の2型コラーゲ
ンテロペプチドを認識するモノクローナル抗体を得るこ
とである。
The problem to be solved by the present invention is to provide a method for conveniently and accurately measuring type 2 collagen telopeptides present in the body fluid of mammals, and the mammals used therefor. To obtain a monoclonal antibody that recognizes type 2 collagen telopeptide.

【0006】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来技術の課題を鑑みて鋭意研究した結果、本発明に至っ
た。すなわち、本発明は哺乳動物の体液中に存在する2
型コラーゲンテロペプチド量の測定において、抗2型コ
ラーゲンテロペプチド抗体を用いることを特徴とする2
型コラーゲンテロペプチドの測定方法である。この方法
においては、例えば不溶性担体に固定された抗2型コラ
ーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗2
型コラーゲンテロペプチド抗体とを用いるサンドイッチ
法を採用することができる。また、かかる標識物質とし
ては、酵素を用いることが好ましい。
DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have accomplished the present invention as a result of earnest research in view of the problems of the prior art. That is, the present invention exists in the body fluids of mammals.
An anti-type 2 collagen telopeptide antibody is used in the measurement of the amount of type 2 collagen telopeptide 2
It is a method for measuring type I collagen telopeptide. In this method, for example, an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and an anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance are used.
A sandwich method using a collagen type telopeptide antibody can be adopted. Moreover, it is preferable to use an enzyme as the labeling substance.

【0007】さらに、不溶性担体に固定された抗2型コ
ラーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗
2型コラーゲンテロペプチド抗体のうち、少なくとも一
方については、2型コラーゲンテロペプチドを認識する
モノクローナル抗体を採用することが好ましい。
Furthermore, at least one of the anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and the anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance is a monoclonal antibody that recognizes type 2 collagen telopeptide. It is preferable to employ an antibody.

【0008】本発明はまた、上記の2型コラーゲンテロ
ペプチドの測定方法において用いられる、哺乳動物の2
型コラーゲンテロペプチドを認識するモノクローナル抗
体である。かかるモノクローナル抗体は、不溶性担体に
固定された抗2型コラーゲンテロペプチド抗体として
も、標識物質で標識された抗2型コラーゲンテロペプチ
ド抗体としても用いることができる。
[0008] The present invention also relates to a mammalian 2 cell used in the above method for measuring type 2 collagen telopeptide.
It is a monoclonal antibody that recognizes type I collagen telopeptide. Such a monoclonal antibody can be used both as an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and as an anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance.

【0009】このような哺乳動物の2型コラーゲンテロ
ペプチドを認識するモノクローナル抗体としては、例え
ば(N末端)GPGIDMSAFAGLGPREKGP
DPLQMRA(C末端)からなるアミノ酸配列部分と
結合性を有するモノクローナル抗体が挙げられる。
Examples of such monoclonal antibodies that recognize mammalian type 2 collagen telopeptides include (N-terminal) GPGIDMSAFAGLGPREKGP.
A monoclonal antibody having a binding property with the amino acid sequence portion consisting of DPLQMRA (C-terminal) can be mentioned.

【0010】さらに、本発明には不溶性担体に固定され
た抗2型コラーゲンテロペプチド抗体と、標識物質で標
識された抗2型コラーゲンテロペプチド抗体を含む試薬
と、を含んでなる哺乳動物の体液中に存在する2型コラ
ーゲンテロペプチドの測定キットが含まれる。かかるキ
ットには、上記したもののほか、必要により該標識物質
を検出するための試薬を含めることができる。
Further, according to the present invention, a mammalian body fluid containing an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and a reagent containing the anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance. A measurement kit for the type 2 collagen telopeptide present therein is included. In addition to the above-mentioned ones, such a kit can optionally contain reagents for detecting the labeling substance.

【0011】本発明で用いる抗体の作製にあたり、免疫
原として用いる2型コラーゲンテロペプチド(以下CI
I―Tと略す。)は、動物から分離精製された天然型の
CII―T、合成ペプチドCII―T、あるいは遺伝子
工学的手法によって作製された遺伝子組み換えCII―
Tを用いることができる。このなかでも、CII―Tの
ように比較的短いペプチドの場合には、精製純度、再現
性、収率の点から考えて合成ペプチドが好ましい。
In preparing the antibody used in the present invention, type 2 collagen telopeptide (hereinafter referred to as CI
Abbreviated as IT. ) Is a natural CII-T separated and purified from an animal, a synthetic peptide CII-T, or a genetically modified CII- produced by a genetic engineering method.
T can be used. Among them, in the case of a relatively short peptide such as CII-T, a synthetic peptide is preferable in view of purification purity, reproducibility and yield.

【0012】これらのCII―Tは、公知の方法でキー
ホール・リンペット・ヘモシアニン(以下KLHと略
す。)、ウシアルブミン等のキャリアー蛋白と複合体を
作製して免疫原として用いられる。
These CII-T are used as an immunogen by forming a complex with a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (hereinafter abbreviated as KLH) and bovine albumin by a known method.

【0013】本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗
体であってもモノクローナル抗体であってもよい。ポリ
クローナル抗体の場合には、アジュバンドとしてFreund
´sComplete Adjuvant、またはAl(OH)3 などを用
い、CII―T―キャリアー蛋白複合体を公知の方法で
動物に免疫することにより、その抗血清として得ること
ができる。
The antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. For polyclonal antibodies, Freund as an adjuvant
The antiserum can be obtained by immunizing an animal with the CII-T-carrier protein complex by a known method using'sComplete Adjuvant, Al (OH) 3 or the like.

【0014】一方、モノクローナル抗体の場合には、ケ
ラーとミルシュタインによる細胞融合法(G. Koeller a
nd Milstein, Nature,256,495―497(197
5))により作製されたハイブリドーマを培養し、その
培養液からCII―Tと反応する抗体を分離することに
より調製される。細胞融合に用いられる細胞としては、
P3U1などを挙げることができる。
On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, the cell fusion method by Keller and Milstein (G. Koeller a
nd Milstein, Nature, 256 , 495-497 (197).
It is prepared by culturing the hybridoma prepared in 5)) and separating the antibody that reacts with CII-T from the culture. The cells used for cell fusion include
P3U1 etc. can be mentioned.

【0015】こうした抗体を用いて、免疫学的測定法に
より体液中のCII―Tを修飾することなく、特異的か
つ感度よく測定することができる。免疫学的測定法とし
ては、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫定量法(R
IA)、蛍光免疫測定法、免疫凝集法等を挙げることが
でき、EIAとしては、例えば「酵素免疫測定法」(第
二版、石川栄治他著、医学書院1982)などに記載さ
れている方法を用いることができる。EIAとしては、
サンドイッチ法および競合法と称される方法を用いるこ
とができる。
Using such an antibody, it is possible to perform a specific and sensitive assay by an immunoassay without modifying CII-T in the body fluid. Immunological assay methods include enzyme immunoassay (EIA) and radioimmunoassay (R
IA), fluorescence immunoassay, immunoaggregation, etc., and examples of EIA include those described in “Enzyme Immunoassay” (second edition, Eiji Ishikawa et al., Medical Shoin 1982). Can be used. For EIA,
The methods called sandwich method and competitive method can be used.

【0016】サンドイッチ法によるEIAにおいては、
CII―Tに対する抗体を2種類用い、例えば次のよう
な手順に従い測定する。すなわち、2種類の抗体のうち
の一方の抗体(第一抗体)を適当な不溶性担体(例えば
プラスチック容器)に固定化する(以下これを“固定化
抗体”という)。次いで、不溶性担体と測定しようとす
る試薬または検体試料との非特異的結合を避けるため
に、適当な物質(例えばウシ血清アルブミン)で不溶性
担体の表面を被覆する。このようにして得られた第一抗
体が固定化された不溶性担体を、検体試料と一定時間お
よび温度で接触させ反応させる。この間に固定化抗体
(第一抗体)と検体試料中のCII―Tが結合する。次
いで不溶性担体を適当な洗浄液で洗浄した後、適当な標
識物質(例えば酵素)で標識したCII―Tに対する他
方の抗体(第二抗体)の溶液(例えば水溶液)と一定時
間および温度で接触させ、固定化抗体に結合したCII
―Tと第二抗体を反応させる。これを適当な洗浄液で洗
浄し、次いで不溶性担体上の固定化抗体とCII―Tを
介して結合している第二抗体の標識物質の量を測定す
る。なお、上記サンドイッチ法は、固定化抗体、標識抗
体、およびCII―Tを含有する検体試料を同時に混合
し、一定時間および温度でこれら三者を同時に接触させ
て行うこともできる。
In EIA by the sandwich method,
Two types of antibodies against CII-T are used, and measurement is performed according to the following procedure, for example. That is, one of the two kinds of antibodies (first antibody) is immobilized on an appropriate insoluble carrier (for example, a plastic container) (hereinafter this is referred to as "immobilized antibody"). Then, the surface of the insoluble carrier is coated with a suitable substance (for example, bovine serum albumin) in order to avoid nonspecific binding between the insoluble carrier and the reagent to be measured or the analyte sample. The first antibody-immobilized insoluble carrier thus obtained is brought into contact with a sample for a certain period of time and temperature to react. During this period, the immobilized antibody (first antibody) and CII-T in the specimen sample are bound. Then, the insoluble carrier is washed with a suitable washing solution, and then contacted with a solution (eg, an aqueous solution) of the other antibody (second antibody) to CII-T labeled with a suitable labeling substance (eg, enzyme) at a constant time and temperature, CII bound to immobilized antibody
-React T with the second antibody. This is washed with an appropriate washing solution, and then the amount of the labeled substance of the second antibody bound to the immobilized antibody on the insoluble carrier via CII-T is measured. The sandwich method can also be carried out by simultaneously mixing an immobilized antibody, a labeled antibody, and a specimen sample containing CII-T, and contacting these three at the same time for a fixed time and temperature.

【0017】かくして、その値から検体試料中のCII
―Tの量を算出することができる。通常サンドイッチ法
では、第一抗体と第二抗体とが双方ともモノクローナル
抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であっても
よいし、一方をモノクローナル抗体とし、他方をポリク
ローナル抗体として用いることもできる。
Thus, from the value obtained, CII in the specimen sample can be obtained.
-The amount of T can be calculated. Usually, in the sandwich method, both the first antibody and the second antibody may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, or one may be used as a monoclonal antibody and the other as a polyclonal antibody.

【0018】競合法としては、例えば固相に固定した抗
原と測定すべき抗原とに対し、一定量の標識抗体を競争
的に反応させて固相抗原・標識抗体複合体を形成せし
め、洗浄操作の後、固相に結合した標識抗体の標識物質
の量を測定する方法や、固相に抗体を固定し標識抗原と
測定すべき抗原とを競争的に反応させて固相抗体・標識
抗原複合体を形成せしめ、洗浄操作の後、固相に結合し
た標識抗原の標識物質の量を測定する方法を挙げること
ができる。
As a competitive method, for example, a fixed amount of labeled antibody is competitively reacted with an antigen immobilized on a solid phase and an antigen to be measured to form a solid phase antigen / labeled antibody complex, and a washing operation is performed. After that, a method of measuring the amount of the labeled substance of the labeled antibody bound to the solid phase, or a method of immobilizing the antibody on the solid phase and causing the labeled antigen and the antigen to be measured to react competitively An example is a method in which the body is formed, and after the washing operation, the amount of the labeled substance of the labeled antigen bound to the solid phase is measured.

【0019】こうしたサンドイッチ法および競合法のそ
れぞれにおいては、抗体に代えてIgGをペプシンで消
化して得られるF(ab′)2 、F(ab′)2 を還元
して得られるFab′、または抗体をパパインで消化し
て得られるFabなどの抗体フラグメントを、あるいは
これらを標識して使用することができる。
In each of the sandwich method and the competitive method, F (ab ') 2 obtained by digesting IgG with pepsin instead of antibody, Fab' obtained by reducing F (ab ') 2 or An antibody fragment such as Fab obtained by digesting the antibody with papain or labeled with these can be used.

【0020】本発明のCII―Tの測定方法において使
用される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、
フッ素樹脂、架橋デキストラン、アガロース、ポリサッ
カライドなどの高分子の他、紙、ガラス、金属、および
これらの組み合わせなどを挙げることができる。不溶性
担体の形状は、例えばトレイ状、球状、繊維状、粒状、
棒状、盤状、容器状、試験管等の種々の形状であっても
よい。
Examples of the insoluble carrier used in the method for measuring CII-T of the present invention include polystyrene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile,
In addition to polymers such as fluororesins, cross-linked dextran, agarose and polysaccharides, paper, glass, metals, and combinations thereof can be mentioned. The shape of the insoluble carrier is, for example, tray-like, spherical, fibrous, granular,
It may have various shapes such as a rod shape, a disk shape, a container shape, and a test tube.

【0021】また、標識抗体の標識物質としては、酵
素、蛍光物質、蛍光物質または放射性物質等を使用する
ことができる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β―D―ガラクトシダーゼ等
を、蛍光物質としてはフルオレッセインソチオシアネー
ト、フイコピリプロテインなどを、そして放射性物質と
しては 125I、 131I、14C、 3Hなどを使用すること
ができるが、免疫学的測定法に使用し得るものであれば
他のものでもよい。
As the labeling substance of the labeled antibody, an enzyme, a fluorescent substance, a fluorescent substance, a radioactive substance or the like can be used. Enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc., fluorescent substances such as fluorescein sothiocyanate and phycopyriprotein, and radioactive substances such as 125 I, 131 I, 14 C, 3 H. Can be used, but any other can be used as long as it can be used in the immunological assay.

【0022】標識物質が酵素の場合、酵素と抗CII―
T抗体の結合方法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素
酸法、マレイミド法など通常の方法に従うことができ
る。例えばマレイミド化された抗体または抗体のフラグ
メントと、SH化された酵素を溶液中で反応することに
より行うことができる。抗体または抗体のフラグメント
のマレイミド化は、例えばサクシンイミジル―4―(N
―マレイミドメチル)シクロヘキサンカーボネート、ス
ルホサクシンイミジル―4―(N―マレイミドメチル)
シクロヘキサンカーボネート、サクシンイミジル―メタ
マレイミドベンゾエート(以下MBSと略す)、サクシ
ンイミジル―6―マレイミドヘキサノエートなどにより
マレイミド化することができる。酵素へのSH基の導入
は公知の方法(「酵素免疫測定法」第二版、石川栄治他
著、医学書院1982)に従うことができる。例えば酵
素とS―アセチルメルカプト無水コハク酸、またはN―
サクシンイミジル―3―(2―ピリジルチオ)プロピオ
ネートなどと反応することにより行われる。
When the labeling substance is an enzyme, the enzyme and anti-CII-
The T antibody can be bound by a common method such as the glutaraldehyde method, the periodic acid method, and the maleimide method. For example, it can be performed by reacting the maleimidated antibody or antibody fragment with the SH-enzyme in a solution. Maleimidization of antibodies or fragments of antibodies can be performed, for example, by succinimidyl-4- (N
-Maleimidomethyl) cyclohexane carbonate, sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl)
The maleimidation can be performed with cyclohexane carbonate, succinimidyl-metamaleimidobenzoate (hereinafter abbreviated as MBS), succinimidyl-6-maleimidohexanoate, or the like. The SH group can be introduced into the enzyme according to a known method (“enzyme immunoassay” 2nd edition, Eiji Ishikawa et al., Medical School 1982). For example, an enzyme and S-acetylmercaptosuccinic anhydride, or N-
It is carried out by reacting with succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate and the like.

【0023】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために基質および必要により発色剤が用いら
れる。これらの例としては、ペルオキシダーゼを用いる
場合には基質として過酸化水素を用い、発色剤として
2,2′―アジノジ―(3―エチルベンズチアゾリンス
ルホン酸)アンモニウム塩、5―アミノサリチル酸、o
―フェニレンジアミン、4―アミノアンチピリン、また
は3,3′,5,5′―テトラメチルベンジジンなどを
用いる。また、蛍光基質として3―(p―ヒドロキシフ
ェニル)プロピオン酸などを用いることができる。酵素
としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基
質としてo―ニトロフェニルホスフェート、3―(2′
―スピロアダマンタン)―4―メトキシ―4―(3″―
ホスホリルオキシ)フェニル―1,2―ジオキセタンな
どを、酵素としてβ―D―ガラクトシダーゼを用いる場
合には基質としてフルオレセインジ(β―D―ガラクト
ピラノシド)、または4―メチルウンベリフェリシル―
β―D―ガラクトピラノシド等と組み合わせて用いられ
る。
When the labeling substance is an enzyme, a substrate and optionally a color former are used to measure its activity. Examples of these include hydrogen peroxide as a substrate when using peroxidase, 2,2'-azinodi- (3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid) ammonium salt as a color-forming agent, 5-aminosalicylic acid, o
-Phenylenediamine, 4-aminoantipyrine, or 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used. Further, 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid or the like can be used as the fluorescent substrate. When alkaline phosphatase is used as the enzyme, o-nitrophenyl phosphate, 3- (2 '
-Spiro adamantane) -4-methoxy-4- (3 "-
Phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane or the like, and when β-D-galactosidase is used as the enzyme, fluorescein di (β-D-galactopyranoside) or 4-methylumbellifericyl-is used as the substrate.
Used in combination with β-D-galactopyranoside and the like.

【0024】本発明の方法において測定の対象となるC
II―Tを含有する哺乳動物の体液とは、ヒト、ウマ、
ウサギ、ラット、マウス、ウシ等の体液をいい、血清あ
るいは血漿形態の血液、関節液、リンパ液、胸腺水、腹
水、羊水、細胞組織液、骨髄液、尿等の体液のいずれで
あってもよい。かくして、本発明により、体液中のCI
I―Tを簡便かつ精密に測定することができる。
C which is an object of measurement in the method of the present invention
Bodily fluids of mammals containing II-T include humans, horses,
It refers to a body fluid such as rabbit, rat, mouse, bovine, etc., and may be any body fluid such as blood in serum or plasma form, joint fluid, lymph fluid, thymus fluid, ascites fluid, amniotic fluid, cell tissue fluid, bone marrow fluid, urine. Thus, according to the present invention, CI in body fluids
It is possible to measure IT easily and accurately.

【0025】[0025]

【実施例】以下、実施例により本発明を記述するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【0026】[実施例1](1)ヒトCII―Tの合成 27アミノ酸配列(一文字表記による配列は以下であ
る。:(N末端)GPGIDMSAFAGLGPREK
GDPLQYMRA(C末端)を有するヒトCII―T
をペプチド合成機(Applied Biosystems社製)で合成し
た。さらに、合成が終了したペプチド樹脂を、以下の順
でTMSBrクリベッジ法で合成時の保護基の脱保護を
行いCII―Tを得た。すなわち、ペプチド樹脂400
mgをチオアニソール1.2ml、エタンジオール0.
6ml、m―クレゾール0.2ml、TFA7.5m
l、TMSBr1.35mlに溶解し、氷冷下2時間攪
拌した。次に、予め冷やしておいたジエチルエーテルを
加え、析出した沈殿を濾過し、残渣に2規定酢酸を加え
てペプチドを抽出し、pHを6.0に調整後、ゲル濾過
を行いCII―Tを得た。
[Example 1] (1) Synthetic 27 amino acid sequence of human CII-T (The sequence in one-letter code is as follows: (N-terminal) GPGIDMSAFAGLGPREK
Human CII-T with GDPLQYMRA (C-terminal)
Was synthesized with a peptide synthesizer (manufactured by Applied Biosystems). Further, the peptide resin thus synthesized was subjected to the deprotection of the protecting group at the time of synthesis by the TMSBr Cribbage method in the following order to obtain CII-T. That is, the peptide resin 400
1.2 mg of thioanisole, 0.1 mg of ethanediol.
6 ml, m-cresol 0.2 ml, TFA 7.5 m
1, dissolved in 1.35 ml of TMSBr, and stirred under ice cooling for 2 hours. Next, diethyl ether that had been cooled in advance was added, and the deposited precipitate was filtered, 2N acetic acid was added to the residue to extract the peptide, and after adjusting the pH to 6.0, gel filtration was performed to perform CII-T. Obtained.

【0027】(2)CII―T―キャリア蛋白複合体の
調製 CII―T0.5mgを0.1M燐酸緩衝液(以下PB
と略す)(pH6.5)50μlに溶解した。これとは
別にKLH0.5mgを0.1M PB(pH6.5)
50μlに溶解した。この二つの溶液を混和し、ゆっく
りと攪拌した。そこへ、グルタルアルデヒドの0.1M
PB(pH6.0)溶液を2倍当量加え、37℃で2
時間攪拌した。その後、ゲル濾過による精製を行い、目
的物を得た。
(2) of CII-T-carrier protein complex
0.5 mg of the prepared CII-T was added to 0.1 M phosphate buffer (hereinafter referred to as PB
Abbreviated) (pH 6.5). Separately, 0.5 mg of KLH was added to 0.1 M PB (pH 6.5).
Dissolved in 50 μl. The two solutions were mixed and slowly stirred. There, 0.1M of glutaraldehyde
PB (pH 6.0) solution was added in double equivalent, and the mixture was added at 37 ° C for 2
Stirred for hours. Then, the product was purified by gel filtration to obtain the desired product.

【0028】(3)抗原刺激リンパ球の調製 雄Balb/cマウスの腹腔内に、CII―T―KLH
複合体90μgとFreund´s Complete Adjuvantとのエ
マルジョンを投与した。その後1〜2週間間隔で5回C
II―T―KLH複合体40μgとFreund´s Complete
Adjuvantとのエマルジョンを腹腔内投与した。5回目
投与後10日目に、CII―T―KLH複合体50μg
を生理食塩水0.25mlに溶解して静脈内に投与し
た。その4日後に無菌的にマウスから脾臓を摘出し、ス
テンレス製メッシュを通過させることにより、RPMI
―1640培地(GIBCO製)中に浮遊させた脾細胞
懸濁液を調製した。
(3) Preparation of Antigen-Stimulated Lymphocytes Male Balb / c mice were intraperitoneally injected with CII-T-KLH.
An emulsion of 90 μg of the complex and Freund's Complete Adjuvant was administered. 5 times at intervals of 1 to 2 weeks
II-T-KLH complex 40 μg and Freund's Complete
An emulsion with Adjuvant was administered intraperitoneally. 10 days after the 5th administration, CII-T-KLH complex 50 μg
Was dissolved in 0.25 ml of physiological saline and administered intravenously. Four days later, the spleen was aseptically removed from the mouse and passed through a stainless mesh to obtain RPMI.
A splenocyte suspension suspended in -1640 medium (GIBCO) was prepared.

【0029】(4)細胞融合 マウス骨髄腫細胞P3U1は、GIT培地(日本製薬
(株)製)の中で培養した。(3)で調製した該脾細胞
とP3U1とを、細胞数3対1の比率で無血清RPMI
―1640培地中に懸濁し、1500rpm×5分間の
条件で遠心分離した。上記培地を除去した後、沈降細胞
に平均分子量1500の50%ポリエチレングリコール
/無血清RPMI―1640培地溶液(pH7.2)1
mlを静かに加えつつ懸濁液とした。その後、1500
rpm×5分間で遠心分離して上清培地を除去した後、
沈降した細胞にHAT培地40mlを加え懸濁した。
(4) Cell fusion Mouse myeloma cells P3U1 were cultured in GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). The splenocytes prepared in (3) and P3U1 were treated with serum-free RPMI at a cell number ratio of 3: 1.
It was suspended in -1640 medium and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After removing the above medium, the precipitated cells were added to a 50% polyethylene glycol / serum-free RPMI-1640 medium solution (pH 7.2) 1 having an average molecular weight of 1,500.
The suspension was added while gently adding ml. Then 1500
After removing the supernatant medium by centrifugation at rpm x 5 minutes,
40 ml of HAT medium was added to the precipitated cells to suspend them.

【0030】(5)クローン化ハイブリドーマの取得 融合細胞液を96穴マイクロプレート上に分配した(1
穴につき200μl)。このプレートを37℃、5%C
2 雰囲気で培養した。1日後、2日後、およびそれ以
後2日毎に半分量の培地を新たなHAT培地と交換して
培養した。11日後にハイブリドーマの培養上清中のC
II―Tに対する抗体について、酵素免疫測定法により
スクリーニングを行った。スクリーニングに用いられた
抗原はCII―T、第2抗体は西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(以下HRPと略す)標識したヤギ抗マウスIgG
抗体であった。ハイブリドーマを分配した192穴のう
ち102穴中に融合細胞のコロニーを認め、その内2穴
が陽性であった。
(5) Acquisition of cloned hybridoma The fused cell solution was distributed on a 96-well microplate (1
200 μl per hole). This plate is 37 ℃, 5% C
It was cultured in an O 2 atmosphere. After 1 day, 2 days, and every 2 days thereafter, half of the medium was replaced with a fresh HAT medium and cultured. C after 11 days in the culture supernatant of the hybridoma
The antibody against II-T was screened by enzyme immunoassay. The antigen used for the screening was CII-T, and the second antibody was goat anti-mouse IgG labeled with horseradish peroxidase (hereinafter abbreviated as HRP).
It was an antibody. Among the 192 wells into which the hybridomas were distributed, a colony of fused cells was observed in 102 wells, of which 2 wells were positive.

【0031】かくして得られた抗体陽性の各穴中のハイ
ブリドーマを、96穴マイクロプレートの1穴あたり
0.9細胞になるように稀釈し、Balb/cマウスの
腹腔マクロファージ細胞をフィーダー細胞として予め培
養しておいた96穴マイクロプレートで培養した。顕微
鏡下で観察し、確実にシングルコロニーであることを認
めた穴のハイブリドーマの培養上清中のCII―Tに対
する抗体について、酵素免疫測定法によりスクリーニン
グを行った。両穴ともに抗体陽性であり、抗CII―T
モノクローナル抗体を産生していた。
The thus-obtained hybridomas in each antibody-positive well were diluted to 0.9 cells per well of a 96-well microplate, and Balb / c mouse peritoneal macrophage cells were precultured as feeder cells. It culture | cultivated in the 96 well microplate set aside. The antibody against CII-T in the culture supernatant of the hybridoma in the hole, which was confirmed to be a single colony when observed under a microscope, was screened by enzyme immunoassay. Both holes are antibody positive, anti-CII-T
Produced a monoclonal antibody.

【0032】(6)ハイブリドーマの培養 これらのクローン化ハイブリドーマを、1週間前にプリ
スタン(Aldrich 社製)0.1mlを腹腔内投与したB
alb/cマウスに、細胞数106 〜107 個/匹の割
合で腹腔内投与した。その後7〜10日目に、腹水を1
匹あたり2〜3ml採取した。
(6) Culture of hybridoma These cloned hybridomas were intraperitoneally administered with 0.1 ml of pristane (manufactured by Aldrich) one week before, B.
Alb / c mice were intraperitoneally administered at a rate of 10 6 to 10 7 cells / mouse. Ascites on the 7th to 10th days
2-3 ml was collected per animal.

【0033】(7)モノクローナル抗体の精製 採取した腹水を、エイらの方法(P.L. Ey et al., Immu
nochemistry,15,429―436(1978))によ
り精製した。すなわち0.1M PB(pH8.0)で
平衡化したプロテインA―セファロースカラム(ゲル容
量5ml)に、腹水2mlを流し、その後0.1Mクエ
ン酸ナトリウムのpHが6.0、5.0、4.0および
3.0である緩衝液を順次流してカラムからモノクロー
ナル抗体を溶出し、精製モノクローナル抗体、すなわち
CII―T―3B8―A9―A9、CII―T―2A9
―H9―E1およびCII―T―2F9―D1―D2を
得た。
(7) Purification of Monoclonal Antibody The collected ascites was subjected to the method of E. et al. (PL Ey et al., Immu).
Nochemistry, 15 , 429-436 (1978)). That is, 2 ml of ascites was flown through a Protein A-Sepharose column (gel volume: 5 ml) equilibrated with 0.1 M PB (pH 8.0), and then 0.1 M sodium citrate had a pH of 6.0, 5.0, 4, or 4. The monoclonal antibodies are eluted from the column by sequentially passing buffer solutions of 0.0 and 3.0 to obtain purified monoclonal antibodies, namely CII-T-3B8-A9-A9 and CII-T-2A9.
-H9-E1 and CII-T-2F9-D1-D2 were obtained.

【0034】(8)精製したモノクローナル抗体のクラ
精製したモノクローナル抗体のクラスを、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキット(THE BINDING SITE社
製)を用いて決定した。その結果を表1に示す。
(8) Purified monoclonal antibody class
Vinegar class of purified monoclonal antibody, was determined using a mouse monoclonal antibody typing kit (manufactured by THE BINDING SITE Co., Ltd.). Table 1 shows the results.

【0035】[0035]

【表1】 [Table 1]

【0036】[実施例2]ポリクローナル抗体の作製 ウサギの皮下に、実施例1で精製したCII―T―KL
H複合体1mgとFreund´s Complete Adjuvantとのエ
マルジョンを皮内投与した。さらに、10日間隔でCI
I―T―KLH複合体0.5mgとFreund´s Complete
Adjuvantとのエマルジョンを4回皮内投与した。最終
投与後10日目に採血し、血清とした後、酵素免疫測定
法で抗体価を測定した。すなわちCII―Tを抗原と
し、第2抗体にHRP標識したヤギ抗ウサギIgG抗体
で、CII―Tに対する抗体価を測定し、40万倍であ
ることを確認した。その後、全血を採取して血清とし、
プロテインA―セファロースカラムで精製してCII―
Tに対する抗体を得た。
Example 2 Preparation of Polyclonal Antibody CII-T-KL purified in Example 1 was subcutaneously injected into a rabbit.
An emulsion of 1 mg of H complex and Freund's Complete Adjuvant was intradermally administered. Furthermore, CI is set every 10 days
0.5 mg of IT-KLH complex and Freund's Complete
An emulsion with Adjuvant was administered intradermally four times. Blood was collected 10 days after the final administration to obtain serum, and the antibody titer was measured by enzyme immunoassay. That is, using CII-T as an antigen and a goat anti-rabbit IgG antibody labeled with HRP as the second antibody, the antibody titer against CII-T was measured and confirmed to be 400,000 times. After that, whole blood is collected and used as serum,
Protein A-purified with Sepharose column to CII-
An antibody against T was obtained.

【0037】[実施例3](1)抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ(直径6mm)をよく洗浄してか
ら、実施例2で得た20μg/mlの抗CII―Tポリ
クローナル抗体のPBS溶液中に、4℃の温度で一昼夜
放置した。これをPBSで洗浄し、1%ウシ血清アルブ
ミン(以下BSAと略す)のPBS溶液中に、4℃の温
度で一昼夜放置してアフターコーティング処理し、抗C
II―T抗体固定化ビーズを得た。
[Example 3] (1) Preparation of antibody-immobilized beads After washing polystyrene beads (diameter 6 mm) thoroughly, 20 µg / ml anti-CII-T polyclonal antibody in PBS solution obtained in Example 2 was used. It was left to stand overnight at a temperature of 4 ° C. This was washed with PBS, and left in a PBS solution of 1% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) at a temperature of 4 ° C. for one day and after-coating treatment.
II-T antibody-immobilized beads were obtained.

【0038】(2)HRP標識抗体の調製 実施例1で採取した抗CII―Tモノクローナル抗体C
II―T―3B8―A9―A9の1mg/ml 0.0
1M燐酸―0.15M NaCl溶液(pH7.4)
に、10mg/mlのMBSのジメチルホルムアミド
(以下DMFと略す)溶液50μlを添加し、25℃の
温度で30分間反応させた。次いでセファデックスG―
25を充填したカラム、0.1M PB(pH6.0)
を用いてゲル濾過を行い、マレイミド化抗体と未反応M
BSを分離した。
(2) Preparation of HRP-labeled antibody Anti-CII-T monoclonal antibody C collected in Example 1
II-T-3B8-A9-A9 1 mg / ml 0.0
1M phosphoric acid-0.15M NaCl solution (pH 7.4)
To this, 50 μl of a 10 mg / ml MBS dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF) solution was added and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then Sephadex G-
Column packed with 25, 0.1M PB (pH 6.0)
Gel filtration using, and unreacted M with maleimidated antibody
The BS was separated.

【0039】一方、HRPの10mg/ml 0.1M
PB(pH6.5)溶液2mlに、S―アセチルメル
カプト無水コハク酸の60mg/ml DMF溶液12
0μlを加え、25℃で2時間反応させた。次に0.1
Mトリス―塩酸緩衝液(pH7.0)を800μl、
0.1M EDTA160μl、1Mヒドロキシルアミ
ン1.6mlを加え、37℃で4分間反応させた。次
に、反応液をニトロセルロース透析膜に入れ、5mM
EDTA―0.1M PB(pH6.0)溶液に対し、
4℃で3日間透析し、チオール化HRPを得た。
On the other hand, HRP 10 mg / ml 0.1M
To 2 ml of PB (pH 6.5) solution, 60 mg / ml DMF solution of S-acetylmercaptosuccinic anhydride 12
0 μl was added and reacted at 25 ° C. for 2 hours. Then 0.1
800 μl of M Tris-HCl buffer (pH 7.0),
160 μl of 0.1 M EDTA and 1.6 ml of 1 M hydroxylamine were added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 4 minutes. Next, the reaction solution was put into a nitrocellulose dialysis membrane and 5 mM
For EDTA-0.1M PB (pH 6.0) solution,
It dialyzed at 4 degreeC for 3 days, and thiolated HRP was obtained.

【0040】次に、マレイミド化抗体2mgとチオール
化HRP4mgとを混合し、フィルトロン攪拌セル(富
士フィルター工業(株))を用いて氷冷下、蛋白濃度が
4〜10mg/mlになるまで濃縮した後、4℃の温度
で一昼夜放置した。その溶液を、ウルトロゲルAcA4
4(LKB社)を充填したカラムでゲル濾過し、HRP
標識抗CII―T抗体を得た。
Next, 2 mg of the maleimidated antibody and 4 mg of thiolated HRP were mixed and concentrated using a Filtron stirring cell (Fuji Filter Industry Co., Ltd.) under ice cooling until the protein concentration became 4 to 10 mg / ml. After that, it was left to stand overnight at a temperature of 4 ° C. The solution was added to Ultrogel AcA4.
Gel filtration with a column packed with 4 (LKB), HRP
Labeled anti-CII-T antibody was obtained.

【0041】(3)サンドイッチEIA測定系 (1)で調製した抗CII―T固定化ビーズ1個と精製
したCII―T(標準物質)を0〜16ng/mlの範
囲で含有する1%BSA―0.05M TBS(トリス
バッファードセイライン)(pH8.0)200μl
と、(2)で作製したHRP標識CII―T抗体の1%
BSA―0.05M TBS(pH8.0)溶液200
μlとを各試験管に加え、37℃で90分間インキュベ
ートした。次に試験管内の溶液を吸引除去した後、0.
05%Tween20―生理食塩水で洗浄を行った。そ
の後0.02%3,3′,5,5′―テトラメチルベン
ジジン塩酸塩、および2.5mMの濃度で過酸化水素を
含有する0.1M燐酸/クエン酸緩衝液(pH4.3)
を0.4mlずつ各試験管に加え、37℃の温度で30
分間反応させた後、1規定硫酸水溶液を1mlずつ加え
て酵素反応を停止させた。
(3) 1% BSA containing 1 anti-CII-T-immobilized beads prepared in the sandwich EIA measurement system (1) and purified CII-T (standard substance) in the range of 0 to 16 ng / ml 200 μl of 0.05 M TBS (Tris buffered saline) (pH 8.0)
And 1% of the HRP-labeled CII-T antibody prepared in (2)
BSA-0.05M TBS (pH8.0) solution 200
was added to each tube and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. Next, after the solution in the test tube was removed by suction,
Washing was performed with 05% Tween 20-physiological saline. Then 0.02% 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine hydrochloride and 0.1M phosphate / citrate buffer (pH 4.3) containing hydrogen peroxide at a concentration of 2.5 mM.
Add 0.4 ml to each test tube and add 30 ml at 37 ℃.
After reacting for 1 minute, 1 ml of 1N sulfuric acid aqueous solution was added to stop the enzymatic reaction.

【0042】次いで、分光光度計を用いてこの溶液の4
50nmの波長における吸引強度を測定した。この吸引
強度を標準物質濃度0〜16ng/mlに対してプロッ
トし、検量線を得た。この検量線を図1に示す。図1よ
り、本発明の測定方法を用いれば、0.05ng/ml
まで精度よく測定可能であることがわかる。
Then, using a spectrophotometer, 4 parts of this solution were prepared.
The suction strength at a wavelength of 50 nm was measured. The suction strength was plotted against a standard substance concentration of 0 to 16 ng / ml to obtain a calibration curve. This calibration curve is shown in FIG. From FIG. 1, if the measuring method of the present invention is used, 0.05 ng / ml
It turns out that it is possible to measure with high accuracy.

【0043】[実施例4]ヒト関節液中のCII―Tの測定 実施例3の手法および実施例3で得た検量線を用いて、
慢性関節リウマチ患者2名と変形性関節症患者2名の関
節液を測定した。結果を表2に示す。
[Example 4] Measurement of CII-T in human synovial fluid Using the method of Example 3 and the calibration curve obtained in Example 3,
The synovial fluid of two patients with rheumatoid arthritis and two patients with osteoarthritis was measured. Table 2 shows the results.

【0044】[0044]

【表2】 [Table 2]

【0045】[実施例5]ヒト正常小児血漿中のCII―Tの測定 実施例3の手法および実施例3で得た検量線を用いて、
4名分のヒト正常小児血漿を測定した。結果を表3に示
す。
[Example 5] Measurement of CII-T in normal human pediatric plasma Using the method of Example 3 and the calibration curve obtained in Example 3,
Normal human infant plasma for 4 persons was measured. The results are shown in Table 3.

【0046】[0046]

【表3】 [Table 3]

【0047】[0047]

【発明の効果】本発明は、軟骨破壊が進行する慢性関節
リウマチ、変形性関節症患者検体において、初めて直接
2型コラーゲンテロペプチドの測定を可能にした。ま
た、正常小児血漿中に2型コラーゲンテロペプチドが存
在することを明らかにした。本発明は、軟骨の代謝異常
が原因となる疾患の診断、治療、経時の追跡に効果を発
揮すると考えられる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention makes it possible for the first time to directly measure type 2 collagen telopeptide in samples of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis in which cartilage destruction progresses. Moreover, it was revealed that type 2 collagen telopeptide is present in plasma of normal children. The present invention is considered to be effective in the diagnosis, treatment, and follow-up of diseases caused by abnormal cartilage metabolism.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】2型コラーゲンペプチドの検量線FIG. 1 Calibration curve of type 2 collagen peptide

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/535 G01N 33/577 B 33/577 9162−4B C12N 15/00 C //(C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 細田 健治 東京都日野市旭が丘4丁目3番2号 帝人 株式会社東京研究センター内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/535 G01N 33/577 B 33/577 9162-4B C12N 15/00 C // (C12P 21 / 08 C12R 1:91) (72) Inventor Kenji Hosoda 4-3-2 Asahigaoka, Hino City, Tokyo Teijin Limited Tokyo Research Center

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 哺乳動物の体液中に存在する2型コラー
ゲンテロペプチド量の測定において、抗2型コラーゲン
テロペプチド抗体を用いることを特徴とする2型コラー
ゲンテロペプチドの測定方法。
1. A method for measuring type 2 collagen telopeptide, which comprises using an anti-type 2 collagen telopeptide antibody in measuring the amount of type 2 collagen telopeptide present in the body fluid of a mammal.
【請求項2】 不溶性担体に固定された抗2型コラーゲ
ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗2型コ
ラーゲンテロペプチド抗体とを用いるサンドイッチ法で
ある請求項1記載の2型コラーゲンテロペプチドの測定
方法。
2. The type 2 collagen telopeptide according to claim 1, which is a sandwich method using an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and an anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance. Measuring method.
【請求項3】 標識物質が酵素である請求項2記載の2
型コラーゲンテロペプチドの測定方法。
3. The method according to claim 2, wherein the labeling substance is an enzyme.
Method for measuring type I collagen telopeptide.
【請求項4】 不溶性担体に固定された抗2型コラーゲ
ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗2型コ
ラーゲンテロペプチド抗体のうち、少なくとも一方が2
型コラーゲンテロペプチドを認識するモノクローナル抗
体である請求項2または請求項3記載の2型コラーゲン
テロペプチドの測定方法。
4. At least one of an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and an anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance is 2
The method for measuring type 2 collagen telopeptide according to claim 2, which is a monoclonal antibody that recognizes type II collagen telopeptide.
【請求項5】 不溶性担体に固定された抗2型コラーゲ
ンテロペプチド抗体と、標識物質で標識された抗2型コ
ラーゲンテロペプチド抗体を含む試薬と、を含んでなる
哺乳動物の体液中に存在する2型コラーゲンテロペプチ
ドの測定キット。
5. A mammal's body fluid containing an anti-type 2 collagen telopeptide antibody immobilized on an insoluble carrier and a reagent containing the anti-type 2 collagen telopeptide antibody labeled with a labeling substance. Type 2 collagen telopeptide measurement kit.
【請求項6】 哺乳動物の2型コラーゲンテロペプチド
を認識するモノクローナル抗体。
6. A monoclonal antibody that recognizes a mammalian type 2 collagen telopeptide.
【請求項7】 (N末端)GPGIDMSAFAGLG
PREKGPDPLQMRA(C末端)からなるアミノ
酸配列部分と結合性を有する請求項6記載のモノクロー
ナル抗体。
7. (N-terminal) GPGIDMSAFAGLG
The monoclonal antibody according to claim 6, which has a binding property with an amino acid sequence portion consisting of PREKGPDPLQMRA (C-terminal).
JP7172196A 1995-07-07 1995-07-07 2 type collagen telopeptide measuring method Pending JPH0921803A (en)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7195883B2 (en) * 1996-12-09 2007-03-27 Osteometer Biotech A/S Sandwich assays for collagen fragments

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