JPH08506247A - Recombinant CTLA4 polypeptide and method for producing the same - Google Patents

Recombinant CTLA4 polypeptide and method for producing the same

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JPH08506247A JP7504186A JP50418695A JPH08506247A JP H08506247 A JPH08506247 A JP H08506247A JP 7504186 A JP7504186 A JP 7504186A JP 50418695 A JP50418695 A JP 50418695A JP H08506247 A JPH08506247 A JP H08506247A
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ジー． プラット，ディクソン
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アムジェン ボールダー インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、B7結合活性を有する組換え的に生産されたCTLA4ポリペプチドに関し、このポリペプチドは、CTLA4とヒトIg遺伝子との間の融合物による産物ではない。本発明のCTLA4ポリペプチドは、一般にCTLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。本発明は、さらに、ポリエレチングリコールを含む変異タンパク質および結合体を含むCTLA4ポリペプチドの機能的誘導体を提供する。組換えCTLA4ポリペプチドを調製する方法がまた提供され、ならびに組換えポリペプチドのモノマー性およびダイマー性形態を分離する方法、ならびに活性および低活性のダイマー形態を分離する方法が提供される。   (57) [Summary] The present invention relates to recombinantly produced CTLA4 polypeptide having B7 binding activity, which polypeptide is not the product of a fusion between CTLA4 and the human Ig gene. The CTLA4 polypeptides of the invention generally include an amino acid sequence that corresponds to the extracellular domain of the CTLA4 receptor protein. The invention further provides functional derivatives of CTLA4 polypeptides that include muteins and conjugates that include polyeletin glycol. Methods for preparing recombinant CTLA4 polypeptides are also provided, as well as methods for separating monomeric and dimeric forms of recombinant polypeptides, and methods for separating active and less active dimeric forms.

Description

【発明の詳細な説明】 組換えCTLA4ポリペプチドおよびその製造方法 本発明はＴ細胞の活性化を制御するために有用な可溶性タンパク質に関し、そ してより特定すれば、組換えDNA法によって製造される可溶性CTLA4タンパク質に 関する。発明の背景 不適切なＴ細胞の活性化は、自己免疫疾患および移植の拒絶反応を包含するい くつものの有害な状態に関連している。クローン増殖のためのＴ細胞の最適な活 性化は、２つのシグナルを必要とすると考えられている。ひとつは、Ｔ細胞レセ プター（TCR）を通して送達される抗原特異的シグナルであり、第２には、抗原 非特異的または共刺激的（co-stimulatory）シグナルである。Chenら、Cell 71: 1093-1102(1992);Liuら、Eur．J．Immunol．22:2855-2859(1992)。 第２の非特異的シグナルは、Ｔ細胞が増殖のために活性化されているか、ある いはクローンアネルギーとして知られる非反応状態に入っているかを決定する、 共刺激物として知られるＴ細胞調節分子のクラスによって測定される。Ｔ細胞調 節分子であるB7は、活性化マクロファージ、活性化Ｂリンパ球、および樹枝状細 胞のような抗原提示細胞の細胞表面上に発現する共刺激タンパク質であり、Razi -Wolfら、Proc．Nat l Acad．Sci．U.S.A． 89:4210-4214(1992)およびFreemanら、J．Immunol．139:3 26-3267(1992)に報告されている。 B7は、CD28およびCTLA4（細胞溶解性Ｔリンパ球関連抗原第４）として知られ るＴ細胞表面タンパク質の天然のリガンドである。CD28およびCTLA4は、そのア ミノ酸配列中、特にトランスメンブランおよび細胞質ドメイン中で実質的に相同 性があり、そしてそのため、Ｔ細胞共刺激経路において類似の機能を共に担って いると考えられている。B7は、CD28と比較すると、CTLA4に対してより高い親和 性を有していることが知られている。 CD28は、本質的にほとんどのＴリンパ球上で発現する。しかし、CTLA4は、非 活性化細胞溶解性Ｔ細胞よりも、活性化細胞溶解性Ｔ細胞で優先的に発現される ことが、Brunetら、Nature 328:267-270(1987)に記載されているDNAハイブリダ イゼーション実験で測定された。CTLA4は活性化細胞溶解性Ｔリンパ球および活 性化ヘルパーＴリンパ球で発現されることが、現在知られている。 B7とCD28およびCTLA4の相互作用は、免疫応答の間の共刺激経路におけるＴ細 胞の全活性化において重要な役割を果たしている。例えばモノクローナル抗体に よる、B7またはCD28活性の中和によって、外来抗原およびレクチンのようなポリ クローナルアクティベーターに対する応答によるＴ細胞の増殖が妨げられる。B7 活性の中和によって、Ｔ細胞がＢ細胞による抗体合成を誘導するヘルパー細胞と して機能することもま た、妨げられる。 Ｔ細胞増殖および抗体誘導における重要な役割に加えて、B7とCD28との相互作 用はＴリンパ球におけるサイトカイン合成を調節する。B7とCD28との相互作用に よって調節されるサイトカインとして知られているものとしては、インターロイ キン−２、腫瘍壊死因子αおよびβ、γインターフェロンおよび顆粒球マクロフ ァージコロニー刺激因子が包含される（Gimmiら、Proc．Nat'l Acad．Sci．U.S. A． 88:6575-6579(1991);Linsleyら、J．Exp．Med．173:721-730(1991);およびTh ompsonら、Proc．Nat'l Acad．Sci．U.S.A．86:1333-1337(1989)）。 これらのサイトカインの合成は、通常使用される、シクロスポリン（これは、 菌代謝物であり、臓器移植が行われるか、あるいは自己免疫疾患にかかっている 患者の免疫系を抑制するために使用される）などの免疫抑制剤では完全には阻害 されない。従って、B7活性を有効に阻害する薬剤は、シクロスポリン治療の代替 として使用され得、あるいはシクロスポリンと組み合わせて使用され得、Ｔ細胞 増殖を阻害する追加の効果または相乗効果を提供すると考えられる。CD28とCTLA 4は類似しているので、B7とCTLA4との相互作用もまたＴリンパ球におけるサイト カインの合成を調節すると考えられる。 しかし、CTLA4の細胞外ドメインを、可溶性の、非融合タンパク質として発現 させる試みは、成功していなかった。従って、PCT公開公報番号WO93/00431によ れば、活性化CTLA4タン パク質の成功した発現は、このタンパク質をダイマーとして形成させることがで きる発現系を必要とすると考えられる。なぜならこのタンパク質は天然ではダイ マーとして見いだされると考えられるからである。このように、研究者は、適切 な発現系を見いだす努力をしながら、融合タンパク質に焦点を合わせていた。 免疫グロブリン分子のＦc重鎖領域に結合したCTLA4の細胞外ドメインを含む融 合タンパク質は、B7阻害活性を有する、可能性のある薬剤として開発されてきた 。この融合タンパク質（「CTLA4-Ig」と称する）はLinsleyら、J．Exp．Med．17 4:561-569(1991)およびPCT公開特許公報番号WO93/00431に記載されている。これ らの出版物によれば、CTLA4-Ig融合タンパク質は哺乳動物細胞から、溶液中で凝 集するジスルフィド結合したダイマータンパク質として分泌される。しかし、CT LA4の細胞外ドメインを哺動物細胞中の非融合タンパク質として発現させる試み は成功しなかった。融合タンパク質のIg部分はダイマー融合タンパク質の形成を 促進し、これは哺乳動物細胞でプロセスされそして発現されることが可能である 。Ig部分は、さらに、活性融合タンパク質を、馴化培地から、プロテインＡアフ ィニティーカラムを用いて精製することを可能とする。プロテインＡはIg分子の Ｆc領域に対して高い親和性を有する。 主要なCTLA4-Ig種の溶液中での分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーに基 づくと約200kDaであり、これもまた上記 Linsleyらに記載されている。哺乳動物細胞中で発現するCTLA4-Ig融合タンパク 質のモノマー形態の分子量が約50kDaなので、溶液中の上記主要な種は、少なく とも４個のCTLA4-Ig分子の凝集複合体であると考えられる。 CTLA4-Ig融合タンパク質のB7阻害活性は、インビトロおよびインビボの両方の 実験でテストされた。インビトロ実験では、CTLA4-Ig融合タンパク質はB7に結合 し、そしてその活性を中和した。実際、CTLA4-Ig融合タンパク質は、CD28-Ig融 合タンパク質と比較して、B7活性のより優れたインヒビターであった。これらの アッセイの結果は、B7が、CD28に対してよりも、より高い親和性でCTLA4と結合 することを示した、先の実験とも一致する。CTLA4-Ig融合タンパク質は、上記Li nsleyらによって報告された混合リンパ球反応において、Ｔ細胞の増殖を50％最 大阻害量30ng/mlで阻害することが見いだされた。この融合タンパク質はまた、L insleyら、J.Exp.Med．174:561-569(1991)に記載されたインビトロでの研究にお いて、Ｂリンパ球による抗体の産生を刺激するヘルパーＴ細胞の能力を阻害した 。 インビボで行われる実験では、CTLA4-Ig融合タンパク質は免疫抑制的であるこ とが測定され、そしてマウスとラットの膵臓および心臓の同種移植における生存 を延ばすことが可能であった（Lenschowら、Science 257:789-792(1992)およびT urkaら、Proc．Nat'l Acad．Sci．U.S.A．89:11102-11105(1992)）。マウスの研 究において、CTLA4-Igの投与の結果、膵 臓の同種移植が長期間にわたり受容された。この結果は、融合タンパク質が、移 植を受けるマウスを外来組織に対して耐性にすることを示唆している。Linsley ら、Science 257:792-795(1992)に記載されている他の動物の研究もまた、CTLA4 -Igが、羊赤血球のような外来抗原に対しての一次抗体反応を阻害し得ることを 示していた。 CTLA4-Ig融合タンパク質は、ヒトの疾患の治療薬剤としては、いくつかの欠点 を有している。この融合タンパク質は非天然由来分子なので、このタンパク質を 受ける患者は、このタンパク質に対する免疫応答を現し得る。抗原性は、患者が この治療薬剤をやめたとき、従って患者がもはや免疫抑制されておらずこの融合 タンパク質に対して免疫応答できるようになったときに、より大きな問題になり 得る。従って、CTLA4-Ig融合タンパク質を慢性疾患にかかっている患者に断続的 に投与することは、抗原性が妨げ得る。加えて、マウス中でのCTLA4-Ig融合タン パク質の半減期は約４日であり、CTLA4-Igによる治療の中断から５週間後もなお 、顕著なレベルの融合タンパク質がこの動物中から検出される。Linsleyら、Sci ence 257:792-795(1992)。さらに、抗原提示細胞表面のB7に結合すると、融合タ ンパク質のIg部分は補体カスケードを活性化し得、この結果、細胞死および血液 学的問題が起きる。最後に、CTLA4-Ig融合タンパク質は哺乳動物細胞中で発現さ せるが、これはコストのかかる組換えタンパク質生産方法である。 従って、Ｔ細胞活性化の共刺激経路を阻害することができる、さらなる治療用 薬剤に対する要求がある。本発明はこの要求を満たし、そして関連する利点をも 提供する。本発明の要旨 本発明は、ヒトIg分子を含む融合タンパク質ではない、組換え的に生産される CTLA4ポリペプチドに関する。可溶性の、組換えポリペプチドは、塩基性のユニ ットとして、CTLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインから本質的になるモ ノマーを含む。好ましくは、この組換えポリペプチドは、２個またはそれ以上の モノマーが、分子間ジスルフィド結合を介して、またはポリエチレングリコール （PEG）のような架橋剤を介して結合し、生物学的に活性なダイマーおよび他の マルチマーを形成する生成物である。 このポリペプチドはまた、モノマーおよびマルチマーの機能的誘導体、例えば システイン変異タンパク質であり得る。ここでシステインは１個またはそれ以上 のアミノ酸で置換されるか、または野生型CTLA4アミノ酸配列に付加される。こ の置換は、好ましくは、配列番号２に示されるように、CTLA4レセプタータンパ ク質の細胞外ドメインの残基番号79、80、81、109、110または111で行われ、他 方、余分のシステインの追加は、好ましくは、天然由来CTLA4レセプタータンパ ク質のＮ末端から125番目の残基の後で行われる。他の機能的誘導体は、例えば 、２個のシステイン変異タンパク質がPEG分子の各末端 の活性基を介して結合している、PEG化したダンベル型分子を包含する。 本発明はまた、組換えポリペプチドの製造方法を提供する。この方法は以下の 工程を包含する： （a）宿主細胞が、CTLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインに対応するポ リペプチドを発現するように仕向け得るDNA配列を得る工程であって、ここで上 記ポリペプチドはB7結合活性を有している； （b）上記DNA配列を、上記DNAを発現するための作動可能なエレメントを有す るベクター中に挿入する工程； （c）上記ベクターを、上記ポリペプチドを発現し得る宿主細胞中に転移する 工程； （d）上記ポリペプチド発現のための条件下で、上記宿主細胞を培養する工程 ； （e）上記ポリペプチドを回収する工程；および （f）上記ポリペプチドが、活性な三次構造となることを許容する工程。任意 に、このポリペプチドはまた、活性な四次構造もとり得る。 組換えCTLA4ポリペプチドを発現させるのに有用なベクターおよび宿主細胞も また提供される。加えて、本発明はさらに、CTLA4ポリペプチドを活性成分とし て含む薬学的組成物を提供する。 本発明はまた、組換え的に生産されたポリペプチドの種々の形態の分離方法、 特にモノマーおよびダイマーの分離方法 に関する。本発明はまた、種々のダイマー種の分離、および低活性のダイマーか らより活性なダイマーを精製する方法に関する。上記の方法によって、活性な、 組換えポリペプチドを得た後、得られた混合物をイオン交換カラム、特にアニオ ン交換カラムに通して、次いでサイジングカラムを通過させる。これらの分離方 法で、少なくとも約90％がダイマーの第１の混合物のプール、および少なくとも 約85％がモノマーの第２のプールが生成される。これらの方法はまた、低活性な ダイマーからより活性なダイマーを分離する。発明の詳細な説明 本発明は、ヒトIg分子と非融合の可溶性の組換え製造したCTLA4ポリペプチド を提供する。本発明の新規な組換えポリペプチドは、種々の疾患を導き得る不適 なＴ細胞の増幅を阻害するために有用である。 天然に存在する、または野生型のCTLA4タンパク質は、B7のリガンドであり、 これはＴ細胞の活性化を導く共刺激経路に関わる細胞表面タンパク質である。ネ ズミおよびヒトCTLA4のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、Brunetら、Nat ure 328：267-270（1987）、およびDariavachら、Eur．J．Immunol．18：1901-1 905（1988）にそれぞれ報告されている。ヒトCTLA4タンパク質とネズミCTLA4タ ンパク質との間の全てのアミノ酸の相同性は、76％である。全長ヒトCTLA4タン パク質の正確なアミノ酸配列は、1993年１月７日に公開された、PCT公 開公報第WO 93/00431号で提供される。 前述のように、非融合または末端切断されたCTLA4タンパク質を生成する初期 の試みは、まだ成功していなかった。従って、本発明以前の生物学的に活性な組 換えCTLA4タンパク質を得る方法は、融合タンパク質であるCTLA4の発現を包含し た。さらに特定すると、融合タンパク質は、PCT公開公報第WO 93/00431号に、ヒ ト免疫グロブリン分子の重鎖領域（「CTLA4-Ig」タンパク質と呼ばれる）と融合 したCTLA4の細胞外ドメインを含むと記載されている。この公開公報によれば、C TLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインの発現を成功させるには、タンパク 質にダイマーを形成させる発現系が必要である。それと比べて、CTLA4タンパク 質の非融合形態または末端切断形態は、活性形態では発現されない。この公開公 報は、CTLA4-Ig融合タンパク質のIg部分が、ダイマー形成を促進し、そして従来 のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を 補助すると考えられていることをさらに示している。 本発明は、Ig融合タンパク質でない、生物学的に活性な可溶性組換えCTLA4ポ リペプチド（sCTLA4）の製造方法の発見に基づく。本明細書で用いた用語「生物 学的に活性」は、B7結合活性を呈示するポリペプチドのことを意味する。 本発明の組換え製造したCTLA4ポリペプチドは、基本的な単位として、本質的 に野生型CTLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインから成るモノマーを有す る。モノマーは、本質的 に配列番号：２のアミノ酸配列からなる。E．coliなどの原核宿主細胞中で発現 したモノマーは、配列番号：２と類似であるがＮ末端にメチオニンを有するアミ ノ酸配列によりコードされている。モノマーに関して、本明細書で用いられる用 語「本質的に成る」は、野生型CTLA4タンパク質の細胞外ドメインに対応するア ミノ酸配列、またはヒトIg分子をコードするアミノ酸配列以外の付加的なアミノ 酸に結合した細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列によりコードされるモノマ ーを、包含することを意図している。CTLA4モノマー形態の計算上の分子量は、 約12.5〜約13.5kDaである。組換え製造したsCTLA4モノマーは、非還元条件下で のSDS PAGEで、約14〜約16kDaの範囲に２つの主要なバンドを呈していた。 本発明の組換えCTLA4ポリペプチドもまた、ダイマー形態または他のマルチマ ー形態をとり得、それらは１つ以上の基本的モノマー単位を含む。このようなマ ルチマーは、特にダイマーは、分子間のジスルフィド結合により、または架橋剤 （例えば、ポリエチレングリコール（以下「PEG」と呼ぶ）、他のポリエーテル 、EDTAおよび当業者に公知な他のリンカーなど）を介して２つ以上の分子を結合 することにより形成され得る。分子間ジスルフィド結合により結合した２つのモ ノマーにより生成されるダイマー形態は、約25kDaの計算上の分子量を有し、そ して非還元条件下でのSDS PAGEで、約24kDa〜約27kDaの範囲に少なくとも３つの 主要なバンドを呈する。本発明は、種々のダイマー形態を分離する方法および最 も活性なダイマー 形態を精製する方法を提供する。 モノマー形態およびダイマー形態は、以下の実施例に記載のアッセイによると 、生物学的に活性である。しかし、活性ダイマー形態は、これらのインビトロで の生物学的アッセイにおいて、CTLA4のモノマー形態よりもさらに約10倍〜約100 倍活性であることが見いだされた。 本発明は、組換えsCTLA4ポリペプチドの製造方法をさらに提供する。このよう な方法は、以下の工程： （a）宿主細胞に、B7結合活性を有するポリペプチドであるCTLA4レセプタータ ンパク質の細胞外ドメインに対応するポリペプチドを発現させ得るDNA配列を得 る工程； （b）DNA配列を、そのDNA配列を発現するための作動可能なエレメントを有す るベクター中に挿入する工程； （c）ベクターを、ポリペプチドを発現し得る宿主細胞に転移する工程； （d）ポリペプチド発現のための条件下で、宿主細胞を培養する工程； （e）ポリペプチドを回収する工程；および （f）ポリペプチドが、活性な三次構造となることを許容する工程； を包含する。 その後、必要に応じて、このペプチドは、２つ以上のモノマーが結合して、ダ イマー形態または他のマルチマー形態のような単位を形成する四次構造であると 推測することが可能 となり得る。その上、本発明は、さらに必要に応じて、本明細書中では活性ダイ マー形態と呼ばれる、最も阻害活性の高い形態を得るために、ダイマー形態を分 離する工程を包含する。 本発明の方法において有用な核酸配列は、配列番号：１およびその機能的等価 物を含む。本明細書で用いられる用語「機能的等価物」とは、B7結合活性を有す るポリペプチドをコードする配列の能力に実質的に影響しない上記配列に、一つ 以上の付加、欠失、または置換を行った改変配列を意味する。このような改変配 列は、当該分野では公知な方法（例えば、部位特異的突然変異誘発）により生成 され得る。配列は、CTLA4レセプタータンパク質の細胞外ドメインをコードする 天然のDNA配列のような天然源から得られ得る。あるいは、配列は、当該分野に おいて公知な方法に従い、合成により生成され得る。さらに、このようなDNA配 列は、合成および天然源の組み合わせ由来であり得る。天然の配列は、さらにcD NAおよびゲノムDNAセグメントを包含する。合成および天然のDNA配列を得る方法 は、1993年１月７日公開のPCT公開公報第WO 93/00431号に記載されており、これ は本明細書中に参考として援用されている。 これらの方法に用い得たベクターは、上記のように、CTLA4 DNA配列を挿入す るベクターを包含する。本明細書で用いた用語「本質的に成る」とは、CTLA4レ セプタータンパク質の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むベク ターを 意味し、そこにはあらゆる所望の作動可能なエレメントが含まれるが、ヒトIg分 子をコードするヌクレオチド配列は含まれない。CTLA4 DNA配列は、挿入され得 、そしてその発現に影響するあらゆる所望の作動可能なエレメントと連結され得 る。ベクターは、以下の作動可能なエレメントを１つ以上含み得る：（１）プロ モーター；（２）Shine-Dalgarno配列および開始コドン：（３）終止コドン；（ ４）オペレーター：（５）宿主細胞の外への移送を促進するリーダー配列；（６ ）調節タンパク質の遺伝子；（７）ベクターの適切な転写およびそれに続く翻訳 に必要または好ましいあらゆる他のDNA配列。欧州特許出願第90 113 673.9号は 、本明細書中に参考として援用されており、これはいくつかの有用なベクターお よび所望の作動可能なエレメントを開示している。 ベクターは、当該分野において公知な種々の方法（トランスフェクションおよ び形質転換の手法を包含する）により適切な宿主細胞に移され得る。種々の転移 方法が、Sambrookら、Molecular Clonin：A Laborator Manual，Cold Spring Ha rbor，N.Y．(1989)に記載されており、これは本明細書中に参考として援用され ている。このような宿主細胞は、真核細胞または原核細胞のいずれかである。こ のような宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、酵母、E ．coli、およびバキュロウイルス感染昆虫細胞が包含される。欧州特許出願第90 113 673.9号（本明細書中に参考として援用されている）に記載の宿主細胞もま た、本発明の方法に有用である。 本発明の宿主細胞は、組換えCTLA4ポリペプチドの発現に適切な条件下で培養 され得る。これらの条件は、一般的に宿主細胞に特異的であり、そしてこのよう な細胞の成長条件についての出版された文献に照らして当業者により容易に決定 される。例えば、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、第８版、W illiams ＆ Wilkins Co.，Baltimore，Maryland（これは、本明細書中に参考と して援用されている）には、細菌を培養するための適切な条件に関する情報が含 まれている。酵母および哺乳動物細胞の培養に関する類似の情報が、R．Pollack ，Mammalian Cell Culture，Cold Spring Harbor Laboratories（1975）（これ は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。 １つの実施態様では、細胞は、所望のCTLA4ポリペプチドの発現を阻害する適 切な調節条件に直面する高い密度にまで増殖し得る。最適細胞密度に到達したと き、環境条件は、当該分野で公知の手順に従って、または以下の実施例に記載さ れるように、ポリペプチドの発現に適切な条件に改められ得る。従って、発現し たCTLA4ポリペプチドを回収する前には、宿主細胞を発現を誘発する前に、最適 密度の近くまで増殖させておくことが特に有用である。 組換えCTLA4ポリペプチドの発現は、例えばウエスタンブロッティング、また はELISAなどの当該分野において公知のアッセイ手順に従って、抗CTLA4抗体を用 いることにより確認され得る。組換えポリペプチドの発現が一旦確認されると、 次い でポリペプチドは当業者に公知の方法に従って回収される。 組換えポリペプチドは、回収後に精製され得、そして必要であれば、精製前ま たは後に組換えポリペプチドの活性構造を推測し得る。好ましくは、ポリペプチ ドはその活性三次構造または活性四次構造を推測する前に精製される。組換えタ ンパク質の精製方法は、当該分野において公知であり、そして、例えば、欧州特 許出願第90 113 673.9号に記載の方法（これは、本明細書中に参考として援用さ れる）を含む。 生物学的に不活性な形態またはその生物学的活性を増加させる形態で発現する ポリペプチドについて、以下の一般的な再生手順が用いられ得る。これらの手順 は、E．coliなどの原核宿主細胞により発現される生物学的に活性なポリペプチ ドを生成するのに特に有用である。 第１に、CTLA4ポリペプチドの発現中に生じる、分子内あるいは分子間のジス ルフィド結合または他の非共有結合は、ポリペプチドを変性剤および還元剤にさ らすことにより切断される。適切な変性剤は、分子間または分子内結合を切断す ることによりタンパク質のコンフォメーションに変化を生じ、その結果その一次 構造に実質的な影響を与えることなく生物学的な活性を失わせる化合物または化 学物質である。このような変性剤の例には、塩酸グアニジンおよび尿素が包含さ れる。 好ましくは、塩酸グアニジンが変性剤として用いられる。グアニジンの濃度は 、約0.5M〜約6.0Mの範囲、好ましくは、 少なくとも約6.0Mである。 尿素を変性剤として用いる場合、生じる得あらゆる妨害シアン酸塩は、尿素溶 液をDOWEX 1-X8（BioRad、Richmond，California）などのアニオン交換カラムに かけることにより除去され得る。従って、シアン酸塩は、タンパク質中のアミノ 酸を改変し、そして除去され得る（Stark，Methods in Enzymology 11：125（19 67））。 次に、ジスルフィド結合は、次いで還元剤で還元される。適切な還元剤には、 例えば、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（DTT）およびシステイ ンが包含される。好ましくは、DTTが還元剤として用いられる。好ましいDTT濃度 は、６mMである。実施例５および8Aに記載の１つの実施態様では、還元されたタ ンパク質中に存在する遊離のチオールは、酸化剤、好ましくはジスルフィド含有 酸化剤（例えば、酸化グルタチオンまたはシスチン）を過剰に添加することによ り酸化される。最後に、得られた溶液は、ジスルフィド互換を触媒する第２還元 剤を添加する前に希釈される。好ましくは、第２還元剤は、スルフヒドリル（チ オール）基を含有する試薬であり、例えば、DTT、2-メルカプトエタノール、ジ チオエリスリトール、システイン、シスタミンなどが挙げられる。第２還元剤は また、ジスルフィド含有化合物であり得、例えばシスチン、酸化グルタチオンま たはあらゆるシステイン含有ペプチドが加えられた水素化ホウ素ナトリウムまた はあらゆるVIA族水素化物が挙げられる。第２還元剤を添加する目的は、種々の ジ スルフィドまたは他の非共有結合の形成および破砕により、CTLA4組換えポリペ プチドの種々の三次元配置を推測する環境を作ることである。いかなる特定の理 論にもしばられることを望まないが、野生型CTLA4レセプタータンパク質の適切 な三次元構造およびジスルフィド結合パターンは、他の可能なコンフォメーショ ンよりエネルギー的により安定であると考えられる。従って、組換えポリペプチ ドの種々の三次元配置をとり得る条件下で、ポリペプチドの比率が生物学的に活 性なコンフォメーションを形成する。さらに、この環境はまた、分子間ジスルフ ィド結合を介してダイマーの形成を促進する。 ２番目の好ましい方法では、変性および還元タンパク質は希釈され、そして実 施例8Bに記載の酸化または還元剤をさらに添加することなく、モノマーおよびダ イマーへの再生を可能にする。 モノマーおよびダイマー形態は、次いで、以下の実施例５および８に記載の手 順に従って分離され得る。簡単に言えば、混合物を最初に透析し、遠心分離する 。この後得られた上清をイオン交換カラム、好ましくはアニオン交換カラムに通 し、次いでサイジングカラム（例えばSuperdex 75カラム）に通す。イオン交換 カラムの通過により、約70％がダイマーであるダイマープール混合物が得られ、 サイジングカラムの通過により少なくとも90％のダイマー、好ましくは約95％の ダイマーのダイマープール混合物が得られる。同じ手順で、少なくとも約85％の モノマーのモノマープール混合物が得られる。こ の後、さらにダイマーからモノマーを分離するために、この混合物は、フェニル セファロースカラム、または代わりに逆相カラムに通され得る。有用なイオン交 換カラムには、Mono Q、Q-Sepharose、Resource Q、およびSource 15Qカラムが 含まれるがこれらに限定されない。当業者に公知の他の同等の分離手順もまた、 種々の組換えCTLA4形態を分離するのに用いられ得る。 本発明はまた、組換えCTLA4ポリペプチドの機能的誘導体を提供する。本明細 書中で用いられる用語「機能的誘導体」とは、組換えCTLA4ポリペプチドの任意 の生物学的に活性な改変された形態を意味する。このような改変形態は、（1） アミノ酸配列での置換または付加、および／または、（2）架橋剤として用いら れ得るか、または特定の薬物動態学的特性または免疫学的特性を改良する別の官 能基の付加であり得る。しかし、このような改変形態は、親組換えポリペプチド の生物学的活性を、活性の10倍以下に、好ましくは５倍未満に、実質的に低下さ せる。従って、本明細書中に用いられる用語「機能的誘導体」とは、非改変組換 えCTLA4ポリペプチドの生物学的活性を実質的に保持する、上記の組換えCTLA4ポ リペプチドの活性フラグメント、アナログ、または誘導体を意味する。アナログ の場合、好ましいこのような改変ポリペプチドは、配列番号２に比較して約40％ より大きい、より好ましくは50％より大きい、そして最も好ましくは90％より大 きいアミノ酸相同性を有する。約99％のアミノ酸相同性が特に有用である。 例えば、１つの改変は、アミノ酸配列内に「遊離システイン」を提供するシス テインの置換または付加であり得、これは「システイン変異タンパク質」を生成 する。本明細書中で用いられる用語「システイン変異タンパク質」または「CTLA 4変異タンパク質」とは、分子内または分子間ジスルフィド結合に関係しない少 なくとも１つのシステインを有する変異タンパク質をいう。遊離システインは、 B7に結合するその能力を実質的に妨害しない任意のアミノ酸残基に現れ得る。好 ましくは、システインは、Ｎ末端由来の配列番号２の残基番号79、80、81、109 、110、111の残基にある少なくとも１つのアミノ酸と置換されるか、またはその 残基番号125残基の後に付加される。 変異タンパク質または他の誘導体は、当業者に周知の方法により調製され得る 。このような方法には、例えば、システインをコードするヌクレオチドに置換す るかまたはこれを付加する突然変異誘発法が含まれる。一般的な方法は、例えば 米国特許第4,518,584号に記載され、これは本明細書中に参考として援用されて いる。あるいは、変異タンパク質は、当業者に知られる方法によってもまた合成 され得る。 １つの実施態様では、システイン変異タンパク質は、ポリエチレングリコール （PEG）に遊離システインで結合され得、その分子量を増大し、そしてその薬物 動態動態学的特性（例えば血清半減期の増大）を改善する。PEGの長鎖ポリマー 単位は、変異タンパク質上の遊離システイン残基のスルフヒドリル基 への共有結合により、変異タンパク質に結合され得る。異なる分子量を有する種 々のPEGポリマーが用いられ得る。このようなPEGポリマーとしては、例えば、5. 0kDa(PEG5000)、8.5kDa(PEG8500)、10kDa(PEG10.000)、および20kDa(PEG20.000) が用いられる。反応選択性および均質な反応混合物を得るために、スルフヒドリ ル基に特異的に反応する機能化ポリマー単位を用いることが有用である。長鎖PE Gポリマーに結合した官能基または反応基は、変異タンパク質が遊離システイン 部位で結合する活性基である。適切な活性基には、例えば、マレイミド、スルフ ヒドリル、チオール、トリフレート（triflate）、トレシレート（tresylate） 、アジリジン（aziridine）、エキシラン（exirane）、または5-ピリジルが含ま れる。PEG分子はまた、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）-誘導PEG分子を用い てCTLA4に遊離アミン基で結合され得る。 他のCTLA4複合体もまた、例えば、（1）１つのPEG分子をCTLA4モノマー（単PE G化された）またはダイマーに、例えば以下の実施例に記載のように遊離アミン で、結合することにより；（2）２つのPEG分子をCTLA4ダイマーに結合すること により；または（3）２つまたはそれ以上のCTLA4モノマーまたはダイマーをPEG のような架橋部分を介して結合させることにより、図式的に「ダンベル」として 表され得る化合物を生成すると意図され得る。あるいは、２つまたはそれ以上の CTLA4ダイマーがPEGのような架橋部分を介して結合されて、「ダイマーダンベル 」を生成し得る。 ダンベル化合物を作製するために、２つの活性基を含有するPEG分子が用いら れ得る。このような分子としては、例えば、PEGビスマレイミド（分子の各末端 にマレイミド活性基を含有するPEG分子）またはビス-NHS-PEG（分子の各末端にN HS基を含有するPEG分子）が挙げられる。当業者は、適切なpH、ポリペプチド濃 度、および単PEG化されたポリペプチドまたはダンベルポリペプチドの有用な収 量を得るのに必要なポリペプチド：PEG比を容易に決定し得る。 本発明は、さらに、薬学的に受容可能なキャリア中に組換えCTLA4ポリペプチ ドまたはその機能的誘導体を含有する薬学的組成物を提供する。本明細書中で用 いられる用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、活性成分に対し非毒性の、 一般的に不活性のベヒクルを意味し、その成分またはこの組成物が投与される被 験体に悪影響を及ぼすことがない。適切なベヒクルまたはキャリアは、標準的な 薬学テキスト、例えばRemington's Phamaceutical Sciences，第16版、Mack Pub lishing Co.，Easton，PA（1980）に記載されており、これは本明細書中に参考 として援用されている。このようなキャリアには、例えば、炭酸水素バッファー 、リン酸バッファー、リンガー液、および生理食塩水のような水溶液が含まれる 。さらに、このキャリアは、処方物のpH、浸透圧重量モル濃度、粘度、透明度、 色、無菌性、安定性、溶解速度、またはにおいを改良するかまたは維持するため に、他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。 この薬学的組成物は、当該分野で公知の方法により調製され得る。この方法に は、実施例の方法、単に試薬を混合する方法が含まれる。当業者は、目的とする 使用および投与形態に依存する、薬学的キャリアの選択および組成物の適切な調 製を理解している。 薬学的組成物はいったん処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、 固形物、または脱水したまたは凍結乾燥した粉末として、減菌バイアル中に保存 され得る。このような処方物は、そのまま使用可能な形態であるか、または投与 前に再構成が必要な形態であるかのいずれかであり得る。一般的に、処方物の保 存は、このような薬剤に従来用いられる温度で行われる。このような温度には、 室温または好ましくは４℃またはそれ以下、例えば−70℃が含まれる。処方物は 、約５から約８のpH範囲の間、好ましくはおよそ生理的pHで、保存および投与さ れ得る。 組換えCTLA4ポリペプチドおよびそれらの機能的誘導体は、種々の目的に対し て用いられ得る。１つの実施態様では、組換えポリペプチドは、当該分野で公知 の方法に従って、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するための免 疫原として用いられ得る。この方法には、例えば、HarlowおよびLane，Antibodi es：A Laboratory Manual (1988)に記載の方法があり、これは本明細書中に参考 として援用されている。CTLA4は免疫抑制性であるので、好ましくは、組換えCTL A4ポリペプチドは、最初に変性し、そして所望であれば免疫原と して使用する前に還元して抗CTLA4抗体を生成する。このような抗体は、順に、 当該分野で周知の手順に従って、Ｔ細胞の細胞表面上のCTLA4レセプタータンパ ク質の検出、またはイメージングのようなインビボ使用、またはB7のこのような レセプタータンパク質への結合の阻害のために用いられ得る。 本発明の組換えポリペプチドはまた、当該分野で公知の手順に従って、B7また は精製B7の存在を検出するための検出試薬として用いられ得る。診断目的では、 組換えポリペプチドは、検出されるべきリガンドを含むと考えられる試料にさら す前にマーカーで標識され得る。このポリペプチドはまた、B7の精製のために、 固体支持体に結合され得る。 さらに、組換えポリペプチドおよびそれらの機能的誘導体は、不適切なＴ細胞 活性化および増殖に関連した疾患を予防、抑止、または治療するのに用いられ得 る。従って、本発明は、有害なＴ細胞活性化および増殖に関連した疾患の治療方 法を提供する。このような疾患には、例えば、移植拒絶、種々の自己免疫疾患、 および他のＴ細胞介在疾患が含まれる。PCT公開番号WO 93/00431（本明細書中に 参考として援用されている）は、種々のＴ細胞介在疾患を記載している。CTLA4 ポリペプチドおよびその機能的誘導体の投与が有用であり得る自己免疫疾患には 、E．RubensteinおよびD．Federman，Scientific American Medicine，第２巻， IV章（1993）（これは、本明細書中に参考として援用されている）に記載される 、関節リウマチ、喘息、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、対宿主性移植片病、 Ｉ型糖尿病、および他の自己免疫疾患が含まれる。 本発明の治療方法は、有害なＴ細胞活性化を阻害するのに有効な量の本発明の 組換えCTLA4ポリペプチドまたはそれらの機能的誘導体を被験体に投与すること により達成される。活性成分は、好ましくは、前記のようにして薬学的組成物中 に処方される。 本明細書で用いられる用語「被験体」とは、B7により共刺激され得るＴ細胞を 有するいずれもの動物をいい、これにはヒトも含まれる。さらに、組換えCTLA4 ポリペプチドおよびそれらの機能的誘導体もまた「活性成分」とも呼ばれる。 有効投与量は当業者に公知の種々の要因に依存し、これらの要因には、被験体 の種類、年齢、体重、および医学的状態、ならびに予防、抑止、または治療され るべき疾患のタイプ、症状の重篤さ、投与経路、および用いられる活性成分が含 まれる。熟練した医師または獣医は、活性成分の有効量を容易に決定し指示し得 る。一般的には、治療は、活性成分の最適用量より実質的に少ないような少量で 開始され得る。この後、投与量は、顕著な弊害または有害な副効果を引き起こす ことなく最適または所望の効果が得られるまで、少量ずつ増加させる。好ましく は、１日当たりの投与量は、ヒト被験体あたり約10〜約2000mgの範囲内である。 本発明の化合物および薬学的組成物は、経口投与または当該分野で公知の任意 の手段による非経口投与により投与され得る。このような投与には、例えば、静 脈内、皮下、関節内、 または筋肉内の注射または注入が含まれる。所望の有効用量を達成し維持するた めに、繰り返し投与が望ましいと。投与の頻度は、いくつかの要因に依存する。 このような要因としては、例えば、用いられる処方物、疾患のタイプ、被験体の 個体特性などが挙げられる。当業者は、このような要因に基づいて適切な頻度を 容易に決定し得る。 以下の実施例は、本発明の説明するものであって、制限するものでないことが 意図される。 実施例１ CTLA4のクローニング CTLA4タンパク質の細胞外ドメインをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反 応（PCR）技法を用いて、ヒトＴ細胞白血病細胞株「Hut 78」から、クローンし た。Hut 78細胞株（カタログ＃TIB 161）は、メリーランド州、ロックビルのア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。このHut 78細胞を 、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、５X10-5M2-メルカプトエタノール、I00U/m lペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI1640培地中、４X1 05細胞／mlで培養した。この細胞に、５ng/mlホルボール12-ミリステート13-ア セテート（カタログ＃P-8139，Sigma Chemical Company，St．Louis，MO）、１ μg/ml PHA-L（カタログ＃L-4144，Sigma Chemical Company，St．Louis，MO） 、５ng/ml IL-2（R&D Systems，Minneapolis，MN）を添加して活性化し、さらに49時間培養 した。回収に際し、９X106個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で洗浄し 、ペレットにして液体窒素中で速やかに凍結し、そして一晩-70℃で保存した。 次の日、この凍結細胞を３mlのPBS中に再懸濁し、その１ml（３X106細胞）を簡 単に微量遠心にてペレットにした。Invitrogen Corporation（San Diego，CA） から購入した「Micro FastTrack mRNA Isolation Kit」を製造者の提供した取扱 説明書に従って使用して、メッセンジャーRNAを上記細胞から調製した。得られ たmRNAペレットを10μlの水に再懸濁し、その１μlを、「cDNA Cycle Kit」（In vitrogen Corporation）および該キットで供給されたランダムプライマーを用い る、第１鎖のcDNA合成に使用した。この第１鎖のcDNA合成手法は、製造者の取扱 説明書に従って、実施した。 成熟CTLA-4（Dariavachら、Eur．J．Immunol.、vol.18、1901-1905頁（1988） ）のcDNA細胞外部分（アラニン１からアスパラギン酸125まで）を、100μlの容 量中、10mM Tris（pH8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001%（w/v）ゼラチン、 各々200μMのdATP、dCTP、dGTPおよびTTP、ならびに各々20ピコモルのオリゴヌ クレオチドプライマー、5'CCCCATATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCT3'（配列番号:3 ）および5'CCCAAGCTTGGTACCTTATCAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG3'（配列番号:4） （CTLA-4のDNA配列と重複する領域には、下線を付している。）を含有する混合 物中における、上記第１鎖のcDNAから成る全cDNA容量の５ 分の１（20μlのうちの４μl）を用いたPCR法により、増幅した。95℃、１分間 でのRNA/cDNAハイブリッドの変性後、温度を600℃に下げ、そして0.5μl（2.5単 位）の「AmpliTaq DNA Polymerase」（Perkin-Elmer Corporation，Norwalk，CT ）を加え、そして温度を72℃に上げた（１分間）。PCR法は、Ericomp製「Twinbl ock」サーマルサイクラー（San Diego，CA）において、95℃１分間、600℃１分 間、および72℃１分間を包含する29回の付加工程により実施した。このPCR増幅 は、72℃での10分間のインキュベーションにより終了とした。 0.4kbのPCRフラグメントが生成されていることを（1.5%アガロースゲル上での 少量の反応混合物の泳動により）確認後、反応混合物をフェノールで１回抽出し 、次いでエタノールで沈澱し、続いて制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびHindII Iにより切断した。切断されたDNAをスピンカラムにかけて小さいDNAフラグメン トを除去した。そして、その少量（元のPCR反応物の約20分の１）をNdeIおよびH ind IIIで切断されたpT88IQ（Tacプロモーター発現プラスミド）に連結し、E.col iの宿主株「DH5-α」（GIBCO BRL，Gaithersberg，MDから入手可能）に挿入した 。 発現ベクターpT88IQは、発現ベクターpT3XI-2からの派生物である。このベク ターpT3XI-2は、以下の方法で構築された。この構築のための開始プラスミドは 、Pharmaciaから購入したプラスミドpKK223-3である。プラスミドpKK223-3は、 テトラサイクリン耐性遺伝子の一部を保有している。機能を有さな いこの遺伝子を、プラスミドpBR322中に保有される完全なテトラサイクリン耐性 遺伝子で置換した。プラスミドpKK223-3をSphIで完全に切断し、そしてBamHIで 不完全に切断した。4.4キロベースペアのフラグメントをゲルで精製し、以下の 合成アダプター（配列番号:5）： および上記pBR322（PL Biochemicals，27-4891-01）のテトラサイクリン耐性遺 伝子のClaI、SphI切断から得たDNAの539ベースペアのフラグメントを結合した。 得られたプラスミドをpCJ1と命名した。 次に、New England Biolabs（Beverly，Massachusetts）から購入したXhoIリ ンカーをプラスミドpCJ1のPvuII部位に挿入し、pCJX-1を形成した。この挿入は 、プラスミドコピー数を制御するrop遺伝子を破壊する。次に、lacI遺伝子を含 有するEcoRIフラグメントをプラスミドpMC9（Calosら、（1983））から精製し、 そして、XhoI〜EcoRIのアダプターとともに、XhoI部位へ挿入した。次に、pKK22 3-3のポリリンカー領域をEcoRIおよびPstIでの切断により、付加部位を含むポリ リンカー（配列番号:6）： で置換した。こうして得られたプラスミドベクターをpCJXI-1と命名した。 最後に、上記テトラサイクリン耐性遺伝子を、制限酵素HindIII、BamHI、およ びSalIの認識部位が亜硫酸水素塩突然変異誘発により破壊された同等の遺伝子で 置換した。以下の手法を、pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子を変異させるの に用いた。プラスミドpBR322をHindIIIで切断し、次いで、亜硫酸水素ナトリウ ムで変異誘発した（Shortle and Botstein、1983）。変異したDNAを連結し、環 状DNAを形成した。次いで、HindIIIで切断し、変異を免れたプラスミドを全て直 線化した。この切断反応混合物を用いてE.coli JM109（Yanisch-Perronら、1985 ）を形質転換した。テトラサイクリン耐性コロニーを単離し、そして上記プラス ミドのテトラサイクリン耐性遺伝子中のHindIII部位の欠失を調べた。うまく変 異したプラスミドをpT1と命名した。同様の手法により、pT1のBamHI部位の変異 についても行い、プラスミドpT2を得た。次に、プラスミドpT2を変異誘発してSa lI部位を除去し、プラスミドpT3を形成した。変異したテトラサイクリン耐性遺 伝子を保有する、pT3のClaI-StyIフラグメントを単離し、これを用いて、pCJXI- 1の相同フラグメントを置換し、pT3XI-2を形成した。この変異したテトラサイク リン耐性遺伝子は、依然、機能性タンパク質をコードする。tacプロモーター領 域の下流に、ポリリンカーを導入した。これは、以下に示すように、E.coliでの 発現のための遺伝子クローニングの際に有用な、BamHIおよび KpnI認識部位を他の部位の間に含有している。 pT3XI-2と同様、pT88IQが含有するクローンされた遺伝子の発現は、tacプロモ ーターにより制御される。翻訳は、唯一つのNdeI認識配列CATATG中のATGから開 始される（下流のNdeI部位は除去され、その結果、この開始部位のNdeI配列が唯 一となる）。このNdeI部位の下流にポリリンカーがあり、所望の遺伝子の挿入を 助長する。さらに、IacＩ領域を含有する上記XhoIフラグメントを、1acZプロモ ーターおよびそのオペレーター（lacリプレッサーの結合部位である）が除かれ た欠損フラグメントで置換した。上記置換したlacI領域はまた、lacIq変異（一 つの塩基の置換によりlacリプレッサーの生産が増大したもの：Muller-Hillら、Proc．Nat'l Acad．Sci．（U.S.A.） 59:1259-1264（1968））を保有する。 pT3XI-2とpT88IQとの特有の差異は以下の通りである。 １．クローニング部位の領域 上記ポリリンカーの上流のEcoRI部位と、上記ポリリンカーの下流のHindIII部 位との間の、以下の135マーの配列が置換されている（配列番号:7）： この配列は、発現のための開始コドンのNdeI部位（下線部）、 ならびにBamHI、XmaI、KpnI、SaII、SacI、BstBI、SpeI、およびSacIIを含むポ リリンカーを含有する。 ２．NdeI部位の下流 pT3XI-2のクローニング領域の下流約2.4Kb付近にNdeI部位が存在する。pT88IQ においては、この部位が除去され、その結果、上述したように、開始コドンでの NdeI部位が唯一である。この部位は、5'〉CATATG〉3'から5'〉CATATATG〉3'に変 えられていて、NdeI認識配列が除去されている。 ３．lacIq領域 pT3XI-2の二つのXhoI部位間にある、lacI領域を含有するこの領域は、以下に 示す1230塩基配列により置換されている： pT88IQのlacIq配列（1230bp）（配列番号：８） この置換された領域は、lacZプロモーターおよびオペレーター領域（lacリプ レッサーの結合領域である）が除外されている。この領域ははまた、lacリプレ ッサーを合成を増大させるlacIq変異を含有する（Muller-Hillら、同上）。 プラスミドDNAを種々の得られた上記コロニーから調製し、挿入DNAを配列解析 した。予期される配列の種々のクローンが見いだされ、発現試験により、それら が予期されるサイズのsCTLA-4（約14kDa）組換えタンパク質を産生することが認 められた。 発現レベルを高めるために、NdeIおよびKpnIにより、クローン59-8-7のsCTLA- 4領域を切り出し、アガロースゲルから溶出して、pT88IQプラスミドから単離精 製した。次いで、PCT特許公開公報第WO 91/08285号（本明細書中に参考として援 用されている）に記載される様に、同様に切断したT7プロモーター発現ベクター pT5Tに連結した。このpT5T::sCTLA4構築物をE.coliの宿主株HMS174/DE3（Brookh aven National Laboratory，Upton，NYのF．William Studier博士から入手した ）に挿入した。このプラスミドDNAは、３コロニーから調製した。このプラスミ ドDNAを配列解析して、正しいsCTLA4 DNA配列が、正しく挿入されていることを 確認した。一つのクローン、59-8-14が、発現および再生（refolding）の研究の ために選択され、以下これをpT5T::sCTLA-4という。本研究において得られた全 てのCTLA4 cDNAは、そのタンパク質の配列（配列番号：２）の第111位のアミノ 酸としてスレオニン残基を含有するが、ア ラニン残基は含まなかった。この結果は、Linsleyら、J．ExP．Med．174:561-56 9（1991）により報告された、ヒトCTLA4の正確なヌクレオチド配列を裏づける。 上記sCTLA4タンパク質の予備的発現は、pT5T::sCTLA-4を含むHMS174/DE3を12 μg/mlテトラサイクリンを含有するＬブロス中で、OD600が1.0になるまで培養す ることにより、実施した。このとき、sCTLA-4の発現は、イソプロピルβ-Dチオ ガラクトピラノシド（IPTG、カタログ＃I-5502、Sigma Chemical Company，St． Louis，MO）を１mMの濃度まで添加することにより誘導した。細胞は、誘導後２ 時間で回収した。全細胞のうちの少量を５％の2-メルカプトエタノールを含有す るSDS試料バッファー中で２分間ボイルし、そして14%ポリアクリルアミドSDSゲ ルで泳動した。クマシーブルーで染色して可視化したゲルの最も主要なバンドが およそ14kDaのsCTLA-4であった。異なる遺伝子（インターロイキン-6）を有する pT5Tを含有するHMS174/DE3から調製したコントロール培養物の溶解物においては 、上記バンドは存在しなかった。 実施例２ sCTLA4の大容量生産 10リットルの発酵を、生化学分析に十分な量の組換えsCTLA4を提供するために 行った。プラスミドpT5T::sCTLA4を含むE.coliのHMS174/DE3株を、A660での光学 密度が10になるまで、10Ｌの複合培地（40g/L NZ-アミンHD、４g/L KH2PO4、１ ｇ /L MgSO4-7H2O、１g/L Na2SO4、0.3g/L Na3クェン酸-2H2O、50g/Lグリセロール 、10mg/LチアミンHCl、２ml/L微量鉱物、0.05ml/L Mazu DF-204、および15mg/L テトラサイクリン）中で37℃で培養した。このとき、培養物に0.24グラムのIPTG （0.1mMの最終濃度）を加えることにより、細胞を誘導した。この細胞をさらに6 .5時間培養し、次いで遠心分離により回収した。この細胞ペレットを使用するま で-20℃で凍結保存した。 実施例３ 洗浄した封入体（WIBS）の調製 実施例２に従って調製した403グラム湿重量のE.coliの細胞ペレットを、２リ ットルの破砕バッファー（25mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.5、1mMジチオスレイ トール）で希釈した。得られたスラリーを10,000PSIの圧力で３回Rannieミニ-ミ ル（APV Gaulin，Inc.，Everett，MA）に通して、細胞を破砕した。破砕した細 胞を、Beckman J2-20遠心機のJA-10ローターを用いて5,000rpmで15分間回転させ た。上清をデカントし、捨てた。ゆるい（loose）ペレットを破砕バッファー中 に再懸濁し、そして10,000rpmで60分間再度回転させ、上清をデカントした。２ 相のペレットが観察された：下方のペレットは白色であり、ゆるい上方のペレッ トはベージュ色であった。このペレットを-20℃で凍結した。２つのペレットか らの試料のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 （SDS-PAGE）分析により、sCTLA-4の大部分は下方の白色のペレット中に存在し 、そして上方のベージュ色のペレットは主としてE.coliの膜タンパク質から構成 されることが示された。 E.coli膜タンパク質を除去するために、実施例２の凍結ペレットを融解し、Po lytron PT 3000ミキサー（Kinematica AG，Littau，Switzerland）を用いて8000 rpmでホモジナイズすることにより、1.5リットルの破砕バッファー中に再懸濁し た。次いで、この混合物をJA-10ローター中で8000rpm（11,000×g）で30分間回 転させた。このペレットを-20℃で凍結した。翌日、このペレットを融解し、（P olytronミキサーを用いて5000rpmでホモジナイズすることにより）2.1リットル の破砕バッファー中に再懸濁し、前回と同様に8000rpmで遠心分離した。容器を デカントして、残っているベージュ色の膜の層の大部分を取り除き、これを捨て た。残りのペレットを、洗浄した封入体（WIBS）と称する。洗浄した封入体の湿 重量は92.5グラムであった。これは、元のE.coli細胞ペレットの重量の約23％で ある。WIBSを使用するまで-20℃で凍結した。 実施例４ WIBS由来のsCTLA4の再折り畳みおよびインビトロ活性 １グラムのWIBSを、60mlの新しく作成した６MグアニジンHCl、0.1M Tris pH 8 .0、6mMジチオスレイトール中で、Polytronミキサーを用いて2000〜3000rpmで手 早くホモジナイズして室温で15分間放置することにより変性させた。JA-20ロー ターで18,000rpmにて15分間回転させることにより、不溶性デブリをペレットに した。3.3mlの0.5Mグルタチオンを上清に加えて、室温で15分間放置した。以下 の溶液を、引き続いて室温で撹拌しながら加えた： １）40mlの、50mM Tris-HCl，pH 9.7中の６Mグアニジン ２）500mlの50mM Tris-HCl，pH 9.7 ３）６mlの0.5Mシステイン ４）６mlの100mMフェニルメタンスルホニルフルオリド （100％エタノール中） 再折り畳み混合物中のグアニジン-HClの好ましい濃度は、0.6Mと４Mとの間で あることが測定された。 sCTLA4の再折り畳み混合物を含む容器を４℃で２日間放置し、sCTLA4を適切な コンフォメーションに再折り畳みさせた。このとき、50mlの再折り畳み混合物を 取り出し、生物学的活性をテストした。テストする前、再折り畳み混合物を、J2 -21遠心機（Beckman Instruments，Palo Alto，CA）のJA-20ローターで8,000rpm にて15分間遠心分離して、再折り畳み手順の間に形成された全ての沈澱物を取り 除いた。次いで、25mlの上清を４リットルの50mM NaCl、20mM Tris-HCl、pH 8に 対して透析した。50mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 8中の300ug/mlの濃度の10mlの ヒト血清アルブミン（HSA）を同じフラスコ中で透析した。HSAはICN Pharmaceut icals，Inc.（Costa Mesa，CA，カタログ番号823011）から得た。透析後、再折 り畳み混合物およびHSA溶液をJA-20ローターで8,000rpmにて15分間遠 心分離して、沈澱した物質を除去した。透析したsCTLA4再折り畳み混合物および HSAのタンパク質濃度は、それぞれ、750ug/mlおよび220ug/mlであることが測定 された。 透析したsCTLA4再折り畳み混合物を、インビトロ混合リンパ球反応における生 物学的活性についてテストした（Methods in Immunology，487-497頁，J．S．Ga rvey、N．E．Cremer、およびD．H.Sussdorf編、The Benjamin/Cummings Publish ing Company，Reading，MA，1977を参照）。このアッセイにおいては、２つの異 なる個体からのリンパ球を混合する。それらの抗原性の差のために、これらの細 胞は互いを異物として認識する。これによりリンパ球増殖を生じる免疫応答が開 始される。細胞の増殖応答は、本明細書に記載の標準混合リンパ球反応手順に従 って、細胞を3H-チミジンでパルスすることにより測定する。 リンパ球を、Sigma Diagnostics，St．Louis，MOから購入したAccuspin-Syste m Histopaque 1077培地を用いてヒト被験体ＡおよびＢから得た、抗凝血処理し た血液（エンドトキシンを含まない0.9％生理食塩水溶液中で作成された1/10容 量の3.8％クエン酸ナトリウムで処理した）から単離した。以下の細胞単離手順 は、このキットに付随する製造者の指示書に記載されているものであった。個体 Ｂ由来のリンパ球を25ug/mlの濃度のマイトマイシンＣ（Sigma Chemical Compan y，St．Louis，MOから得た）で、30分間37℃で処理した。この細胞を10mlの培地 で４回洗浄して、マイトマイシンＣを除去した。 各個体からのリンパ球を完全培地（25mM HEPESバッファー、10%ヒトAB血清、２m Mグルタミン、100U/mlペニシリン、および100ug/mlストレプトマイシンを含むRP MI 1640培地）中に１×106/mlで再懸濁した。２つのリンパ球集団を混合した場 合、96ウェル組織培養プレート（Corning Glass Works，Corning，NY）のウェル あたり100μlの各細胞懸濁液を加えた。非刺激リンパ球の増殖を測定するために 用いたコントロールウェルは、200μlの単一の個体由来の細胞を含んでいた。透 析した分画していないsCTLA4再折り畳み混合物またはHSAのアリコートを、完全 培地中に0.05〜50μg/mlの濃度で懸濁した。懸濁液の50μlアリコートを、混合 した細胞集団の適切なウェルに加えた。試料を３回テストした。37℃で５日間イ ンキュベーションした後、各ウェルに、50μlの完全培地中の２μCiの3H-チミジ ン（Dupont、カタログ番号NET-0272）を入れた。約18〜20時間後、細胞をPHDセ ルハーベスターを用いてガラス繊維フィルターストリップ上に（両方ともCambri dge Technology，Inc.，Watertown，MAから購入した）回収した。細胞をPBSで３ 回洗浄し、７％トリクロロ酢酸を用いてDNAを沈澱させた。フィルターを無水メ タノールで洗浄して風乾した。DNA中に取り込まれた3H-チミジンを、シンチレー ションカウントにより測定した。３連のウェルの平均を各テスト試料について計 算した。 この実験の結果を表１に示す。データは、DNAへの3H-チミジンの取り込みの減 少により測定されるように、sCTLA4の再 折り畳み混合物がリンパ球増殖の用量依存性阻害を引き起こすことを示す。観察 された最大阻害は、10ug/mlのタンパク質濃度で85％であった。50％阻害を与え た再折り畳み混合物のタンパク質濃度は、約100ng/mlであった。HSAは同様のリ ンパ球増殖の阻害を引き起こさず、このことにより、sCTLA4再折り畳み混合物で 観察された阻害は特異的であることが示された。 実施例５ sCTLA4モノマーおよびダイマーの精製および生物学的活性 Ａ．精製 実施例４に記載のように調製した300mlの再折り畳み混合物を、SPECTRO/POR 3 チューブ（Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA）で5700mlの20mM T ris-HCl pH 8.0に対して４℃で一晩透析した。透析後、大量の沈澱物が観察され た。SDS-PAGE分析により、沈澱物が主にE.coli膜タンパク質および不適切に再折 り畳みされたsCTLA-4から構成されることが示された。透析した再折り畳み混合 物を、JA-10ローター中で8000rpmにて15分間遠心分離した。上清を0.45ミクロン フィルター（Nalge Company，Rochester，NY）に通して残りの沈澱物を除去し、 そして20mlのQ-セファロースカラム（Pharmacia LKB，Picataway，NJ）にかけ、 50mMグアニジン、20mM Tris-HCl pH 8.0で洗浄した。結合したタンパク質を、60 0mlの０から60％までの１M NaCl、20mM Tris pH 8.0の直線塩グラジエントで、 流速５ml/分にて溶出した。sCTLA4のモノマー形態は約250mM NaClで溶出したが （ピークＡ）、sCTLA4のダイマー形態は約350mM NaClで溶出した（ピークＢ）。 約450〜600mM NaClで溶出する広いタンパク質のピーク（ピークＣ）もsCTLA4を 含んでいた。このピークは、主としてsCTLA4のモノマーと、ジスルフィド架橋さ れていると思われるsCTLA4のいくつかの高分子量形態から構成されていた。この 物質は凝集し たsCTLA4形態を示し得る。sCTLA4のモノマーおよびダイマー形態を、非還元条件 下で14％ポリアクリルアミドSDSゲル上でカラム画分の試料を電気泳動すること により確認した。sCTLA4のダイマー形態は24〜27kDaの分子量範囲で２つ〜３つ のバンドとして移動した。sCTLA4のモノマー形態は、14〜16kDaの分子量範囲で ２つ〜３つのバンドとして移動した。ジスルフィド還元剤（2-メルカプトエタノ ール）の存在下で、ダイマーおよびモノマーの両sCTLA4は、約15kDaの相対分子 量の単一バンドとして移動した。これらのゲル分析により、sCTLA4ダイマーは、 ジスルフィド結合により互いに共有結合した２つのsCTLA4タンパク質を含むこと が示された。 sCTLA-4のピークＡ、Ｂ、およびＣを含むカラム画分を別々にプールし、撹拌 細胞濃縮器およびYM3メンブレン（いずれもAmicon，Inc.，Beverly，MAから得た ）を用いて濃縮した。プールＡおよびＢを約1.9mlにまで濃縮し、プールＣを約2 .3mlにまで濃縮した。濃縮したプール中のタンパク質濃度は、プールＡおよびＢ については約900ug/mlであり、プールＣについては1820ug/mlであった。1.5mlの 各濃縮プールを、マルチウェル透析マニフォールド（manifold）（BRL，Gaither sburg，MD）で、２リットルの100mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4に対して１分 あたり2.2mlで４℃で透析した。濃縮し、透析したプールのアリコートを非還元S DSゲルで試験した。プールＡが大部分のsCTLA4モノマーおよび少量のsCTLA4ダイ マーを含み；プールＢが大部分のsCTLA4ダイマーおよび少量のsCTLA4モノ マーを含み；そしてプールＣが大部分のsCTLA4モノマーを含むがいくらか（約10 ％）のsCTLA4ダイマーおよび少量の高分子量形態のsCTLA-4（おそらく、トリマ ー、テトラマーなどである）も含むことが観察された。各プールの５つの200μl アリコートを凍結し、アッセイに使用するまで-70℃で保存した。 Q-セファロースカラムからのモノマーおよびダイマーのプール（それぞれプー ルＡおよびＢ）のアリコート（50μl）を別々に、250mM NaCl、20mM酢酸ナトリ ウムpH 5.5で平衡化したスーパーデックス-75サイズ分離カラム（3.2×300mm；P harmacia LKB，Picataway，NJから商業的に入手可能）にかけた。カラムを50μl /分の流速で溶出した。モノマープールは15〜17kDaの分子量を有する主要ピーク （総タンパク質の70％）として、および30〜35kDaの分子量を有するマイナーピ ーク（総タンパク質の30％）として溶出した。ダイマープールは、30〜35kDaの 分子量を有する主要ピーク（総タンパク質の70％）として、および15〜17kDaの 分子量を有するマイナーピーク（総タンパク質の30％）として溶出した。 Ｂ．CTLA4ダイマーの疎水性相互作用クロマトグラフィー Q-セファロースカラムから得た60μlのCTLA4ダイマープール（約1.2mg/ml）を 、20mM Tris-HCl、２M NaCl、pH 7.4で500μlにまで希釈し、予め20mM Tris-HCl 、２M NaCl、pH 7.4で平衡化したフェニルセファロース（Hi Sub）（Pharmacia/ LKB，Pictaway NJ）を充填した１mlのカラムにかけた。タン パク質を０〜50％CH3CN（および２M〜０M NaCl）の直線グラジエントで1.0ml/分 の流速にて30分で溶出した。sCTLA4ダイマーは、約27％CH3CN、0.9M NaClで対称 的なピークとして溶出した。sCTLA4モノマーは、約30〜35％CH3CN、0.8M NaClで わずかに遅れて溶出した。 Ｃ．CTLA4の逆相精製 Q-セファロースモノマー（プールＡ）およびダイマー（プールＢ）の20μlア リコートを（H2O中の0.05％TFAで）200μlにまで希釈し、予めH2O中の0.05％TFA で平衡化したRP-1逆相カラム（SynChrom Inc.）に別々にかけた。タンパク質を ０〜100％CH3CN（0.05％TFA）の直線グラジエントで100μl/分にて30分で溶出し た。sCTLA4のモノマー形態は、約85％CH3CNで単一ピーク（約95％の純度）とし て溶出した。sCTLA4のダイマー形態は、約85〜90％CH3CNで５つ〜６つの異種の ピークとして溶出した。 HPLCカラムから得られたCTLA4モノマーおよびダイマーを当業者に公知のEdman 分解方法により配列決定した。モノマーおよびダイマーについて得られたアミノ 末端配列は同一であった：AlaMetHisValAla（配列番号９）。この配列はＮ-末端 のメチオニン残基がないことを除いて、sCTLA4について予想されたアミノ末端配 列に適合した。Ｎ-末端のメチオニン残基がないことは、この残基がE.coliプロ セス酵素によりsCTLA4タンパク質から効率的に開裂されることを示す。 実施例６ 組換えsCTLA4モノマーおよびダイマーのインビトロの活性 混合リンパ球反応での生物学的活性について、実施例５に記載のQ-セファロー スカラムから得たプールＡ、Ｂ、およびＣのアリコートをテストした（実施例４ に記載の方法）。この実験に用いたリンパ球をヒト被験体ＣおよびＤから単離し た。被験体Ｄに由来するリンパ球をマイトマイシンＣで処理し、実施例４に記載 のように洗浄した。混合リンパ球培養物を、実施例４に記載のように作製した。 ヒト血清アルブミン（HSA）をコントロールタンパク質として用いた。この実験 のためのHSAを、4mgのHSAを60mlの20mMTris-HCl（pH8）、250mM NaCl、37.5mMグ アニジン塩酸中で混合し、撹拌細胞濃縮器およびYM3メンブラン（いずれもAmico n,Inc.，Beverly，MAから入手）を用いて試料を1.97mlまで濃縮することにより 調製した。この混合物1.2mlを、マルチウェル透析マニフォールド（BRL，Gaithe rsburg，MD）を用いて２リットルの100mM NaCl、20mM Tris-HCl（pH 7.4）に対 して透析を行った。HSAプールの最終タンパク質濃度は、1100ug/mlであった。組 換えsCTLA4（プールＡ（モノマー）、Ｂ（ダイマー）、およびＣ（遅いモノマー ）のアリコート）またはHSAを、0.05〜50ug/mlの濃度で完全培地に懸濁した。50 μlのアリコートを適切な混合細胞集団のウェルに加えた。試料を３度繰り返し テストした。3℃で５日間インキュベーションした後、各ウェルに２uCiの3H-チ ミジンを含む50μlの完全培地を入れた。約20時間後、実施例４に記載したよう に、細胞を回収し、シンチレーションカウントによりDNA中に組み込まれた放射 能を測定した。この実験の結果を表２に示す。 データにより、DNA中に取り込まれた放射能が減少することにより証明された ように、組換えCTLA4（プールＡ、Ｂ、およびＣ）を含む各々のQ-セファロース プールは、混合リンパ球反応において、用量依存性リンパ球増殖阻害を起こすこ とがわかる。HSAでは顕著な阻害は見られなかった。このことにより、阻害はsCT LA4に特異的であることが示された。プールＢは、CTLA4ダイマーを主に含有して おり、プールＡ（ほとんどがCTLA4モノマー）またはプールＣ（ほとんどが凝集 したCTLA4モノマー、ダイマー、およびより大きい分子量形態）よりも有効な増 殖応答インヒビターであった。リンパ球増殖を50％阻害したプールＢの用量は、 10ng/mlよりわずかに少ない値となった。この数値は、プールＢの有効性を過大 評価している可能性がある。なぜなら、阻害パーセントを計算するために用いた 非混合リンパ球細胞集団のカウント数／分（cpm）は、プールＢ試料での方が他 のプールでよりも大きかったからである（表２の脚注を参照）。このことを説明 するために、他のタンパク質プールの非混合細胞集団の平均cpmを用いて、プ ールＢのデータをまた計算した。これらの修正阻害パーセントを表２の括弧内に 示す。修正値を用いると、リンパ球増殖を50％阻害したプールＢの用量は約10ng /mlとなった。プールＢタンパク質濃度が１〜10ug/mlのときに、リンパ球増殖は 本質的に完全に阻害された。リンパ球増殖を50％阻害したプールＡおよびＣの用 量は、プールＡについては100ng/mlと1,000ng/mlとの間であり、プールＣについ ては1000ng/mlと10,000ng/mlとの間であった。このように、ほとんどCTLA4ダイ マーを含有するプール（プールＢ）は、ほとんどCTLA4モノマーまたはモノマー 凝集物を含有するプール（プールＡおよびＣ）に比べて10倍から100倍の特異的 阻害活性を有していた。 プールＡ、Ｂ、およびＣを、ヒト被験体ＥおよびＦから得たリンパ球を用いる 第２の混合リンパ球反応実験でテストした。個体Ｆ由来のリンパ球を、実施例４ に記載したようにマイトマイシンＣで処理した。この実験の他の手順は、実施例 ４および先の実験に記載した通りであった。この実験の結果を表３に示す。 先の実験でわかったように、プールＢは、リンパ球増殖阻害においてプールＡ およびＣよりも有効であった。この実験におけるプールＢでの阻害は、最高73％ であった。リンパ球 増殖を50％阻害したプールＢの用量は、約１ug/mlであった。これに対して、リ ンパ球増殖を50％阻害したプールＡおよびＣの用量は、約10ug/mlであった。HSA では顕著なリンパ球増殖阻害は見られなかった。 この実験では、組換えsCTLA4プールのいずれもリンパ球増殖を完全には阻害し なかった。このことについては、幾つかの可能な説明が考えられる。１つの説明 として、プールＡ、Ｂ、およびＣのsCTLA4タンパク質が試料を混合する間に不活 性化されたということが考えられ得る。別の説明として、CTLA4リガンド以外の 共刺激性分子B7が被験体の抗原存在細胞の表面で発現されたということが考えら れ得る。B7とは異なる共刺激性分子が存在することは公知である（Razi-Wolfら 、Proc．Nat'l Acad．Sci，（U.S.A.）89:4210-4214（1992）；Liuら、Eur．J． Immunol.， 22:2855-2859（1992）。１人の被験体は、通常の約４倍の白血球数を 有しており、このことにより、この被験体が最近感染症を患ったことが示唆され た。この被験体の白血球には、その結果として活性化されていたものがあった可 能性がある。これが事実であり得ることは、この実験で見られたリンパ球増殖の 刺激が、先の２種の実験（非混合細胞で見られたレベルに対して３〜４倍）より も大きかった（非混合細胞で見られたレベルに対して１１〜１４倍）ことにより 示唆される。プールＢで観測された73％の阻害が、この実験においてsCTLA4で達 成され得た最高程度の阻害であると仮定すると、この最高程度の阻害の50％を行 うプールＢの用 量は、10ng/mlと100ng/mlの間であった。これは、先の２種の実験で決定された5 0％阻害用量と同程度である。 実施例７ 安定なB7発現性細胞株の開発 混合リンパ球反応の代わりとして、PHAレクチン存在下でのヒトＴ細胞株およ び安定に形質転換してヒトB7レセプタータンパク質を発現するチャイニーズハム スター卵巣（CHO）細胞株によるIL-2産生を測定する、新規なバイオアッセイを 開発した。このIL-2バイオアッセイは、混合リンパ球反応に対して幾つかの利点 を有する。これらの利点には、IL-2バイオアッセイは１日半しかかからないのに 対し、混合リンパ球反応は６〜７日かかり、IL-2バイオアッセイは、細菌性エン ドトキシン（細菌から調製されたsCTLA4調製物を汚染し得る）に感応性がないの に対し、混合リンパ球反応は、エンドトキシンが存在すると疑似データを生じ、 そしてIL-2アッセイは初代細胞よりむしろ細胞株を使用し、それにより感染の危 険が減少し、アッセイ用の大量の細胞を得るのがより容易であるという事実が含 まれる。このバイオアッセイの開発には、ヒトB7 cDNAをクローニングし、真核 細胞での発現のための適切なベクター内にそれをクローニングし、形質転換し、 そしてB7レセプタータンパク質を発現するCHO細胞を選択することが必要であっ た。 A. ヒトB7 cDNAのクローニング B7遺伝子をヒトRaji B細胞株（ATCC番号CCL 86）からクローニングした。製造 業者の指示に従って、Micro-FastTrack mRNA Isolation Kit（Invitrogen，San Diego，CA）を用い、mRNAを3×106個のRaji細胞から単離した。cDNA Cycle Kit （Invitrogen，San Diego）を用い、mRNAの1/10のcDNAのコピーを作製した。B7 配列の５’および３’末端と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、Pfuポリ メラーゼ（Stratagene，San Diego）、およびGene Amp System 9600 Thermal Cy cler（Perkin Elmer Cetus，CA）を用いたPCRによって、Raji cDNAの1/5のB7遺 伝子を増幅した。 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した： B7（5'P）32：５’CCC AAG CTT TCA CTT TTG ACC CTA AGC ATCTG ３’（配列番 号：10） B7（3'P）36：５’CCC TCT AGA TTA TAC AGG GCG TAC ACT TTC CCT TCT-３’（ 配列番号：11） （B7配列との重複部分にアンダーラインを付す） PCR反応混合物は、20mM Tris-HCl pH 8.2、10mM KCl、6mM（NH4）2SO4、1.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100、各200μMのdATP、dCTP、dGTP、およびTTP、各20pm olのプライマーオリゴ、４μlのRaji cDNA、および0.5μl（1.25u）のPfuポリメ ラーゼ（全量＝50μl）を含有していた。PCR条件は（95℃で1分、60℃で１分、 および72℃で１分）を30サイクルであり、次に72℃で10分のインキュベーション を行った。PCRが完結した後、4 5μlの反応混合物をスピンカラム（spin column）（ChromaSpin-100，ClonTech ，Palo Alto，CA）に通過し、次いで20μlをXbaIおよびHindIIIで消化し、そし て0.8％のアガロースゲル上で電気泳動した。約0.9kbのバンドを溶出し、そして 同じ制限酵素で切断しそして同じ方法でゲル精製したプラスミドpRc/CMV（Invit rogen，San Diego，CA）と連結した。連結混合物を、E．coli株TOP10F'（Invitr ogen，San Diego，CA）を形質転換するために用いた。50μg/mlのアンピシリン を含有するLuria Broth寒天平板上で選択したコロニーを、正しいサイズの挿入 物を含むプラスミドについてスクリーニングし、そしてこのような１つの構造物 に由来の挿入遺伝子を、それが期待した配列を有することを確認するために、両 方の鎖全体について十分配列決定した。このプラスミドクローンをB7-5と名付け た。 B. 安定なB7発現細胞株の調製 チャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO-K1，ATCC番号：CCL 61）を、DMEMお よびペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、プロリン（20μg/ml）、お よび10％ウシ胎児血清中で増殖した。滴定実験によって、400μg/mlの抗生物質G 418（硫酸ゲンタマイシン，GIBCO BRL，Gaithersburg，MD）がCHO細胞を殺傷す るのに充分であることを決定した。B7遺伝子を発現するために用いるpRc/CMVベ クターは、G418に耐性を与えるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝 子を含む。 CHO細胞をトランスフェクトするために用いるB7-5プラスミドを、Qiagenミニ− プレップ手順（Qiagen，Chatsworth，CA）を用いて調製し、ここで、50μg/mlの アンピシリンを有するLuria Broth中で一晩増殖した19.2mlの培養物は、約1256 μg/mlのプラスミドDNAを120μl生成した。製造業者の指示に従い、Invitrogen （San Diego，CA）製のキットを用いたリン酸カルシウム沈澱法により、CHO細胞 をトランスフェクトした。トランスフェクションして４日目に、培地を、G418を 400μg/mlで含有する新しい培地と交換した。トランスフェクションして19日目 に、個々の耐性細胞を選択するため、G418耐性細胞を限界希釈した。６個の個別 のコロニーを単離し、そして２回目の限界希釈を行った。それぞれの１個のウェ ルを増殖のために選択した。細胞株をF9、C11、G10、E12、C12、およびH9と名付 けた。 C．形質転換B7-CHO細胞株のFACSスクリーニング ６種のG418耐性細胞株を、それらが細胞表面上にB7を発現するかどうかを決定 するために、抗−ヒトB7モノクローナル抗体でスクリーニングした。各細胞株の コンフルエントになったT-75フラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを含ま ないPBS10mlで２回洗浄し、そして10mM EDTAを含有しカルシウムおよびマグネシ ウムを含まないPBS10mlに室温で10分間曝した。細胞をほぐすため上下に数回ピ ペッティングした後、はがれた細胞を15mlの円錐形遠心管に移し、そしてGS-6R テー ブルトップ遠心分離機（Beckman instruments，Houston，TX）を用いて１000rpm で遠心分離した。120マイクロリットルの氷冷したFACS培地（２％(v/v)のウシ胎 児血清および0.1％のアジ化ナトリウムを含有するRPMI 1640培地(Biowhittaker ，Walkersville，MD，カタログ番号12-115B)）中に細胞を再懸濁した。細胞の濃 度は、１mlあたり約２×107個であった。50マイクロリットルの各細胞株を、氷 上の1.5mlのマイクロヒュージチューブ（microfuge tube）中で、1:1000に希釈 した抗ヒトB7モノクローナル抗体（Becton Dickinson，San Jose，CA，カタログ 番号550024）またはコントロールマウスのIgGlモノクローナル抗体（Becton Dic kinson，San Jose，CA，カタログ番号550029）を含むFACS培地50マイクロリット ルと混合した。細胞を抗体と共に氷上で55分間インキュベートし、マイクロヒュ ージチューブをFACS培地で満たし、次いでマイクロヒュージチューブ中で300× ｇにて５分間遠心分離した。上清を吸入により除去し、そして１:25に希釈したF ITC-標識ポリクローナルヤギ抗-マウス抗血清（Becton Dickinson，San Jose，C A，カタログ番号349031）を含有する氷冷したFACS培地100マイクロリットル中に 細胞を再懸濁した。混合物を氷上で55分間インキュベートし、チューブを氷冷し たFACS培地で満たし、そしてマイクロヒュージチューブ中で300×ｇにて５分間 遠心分離した。上清を吸引し、そして細胞を、氷冷したFACS培地500マイクロリ ットル中に再懸濁した。標識細胞をフローサイトメーターを用いて陽性の蛍光に ついて分析した。このアッ セイを用いると、細胞株F9、C12およびH9は、B7の発現について陽性であった。 D. IL-2産生バイオアッセイ PHA-Lレクチン（Sigma Chemical Company，St．Louis，MO，カタログ番号L-41 44）の存在下で、F9、C12およびH9細胞株をCD28-陽性ヒトJurkat T細胞株（ATCC 番号CRL 1863）と混合し、それらがJurkat細胞によりIL-2の産生を誘発するかど うかを決定した。96ウェルの組織培養プレートの各ウェルに、１×105個のJurka t細胞および５×104個のF9、C12、H9または親CHO細胞を加えた。コントロールの ウェルはJurkat細胞のみを含んでいた。PHAを各ウェルに加え、最終濃度を10μg /mlとした。１ウェルあたりの最終容量は250μlであった。細胞および化学物質 をIL-2アッセイ培地（25mM HEPESバッファー、ペニシリン、ストレプトマイシン 、グルタミン、および10％ウシ胎児血清を含有するRPMI 1640培地(Biowhittaker ，Walkersville，MD，カタログ番号12-115B)）に再懸濁した。F9、C12、H9およ び親CHO細胞を、10mM EDTAを含有し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない ダルベッコPBS中でインキュベートすることによりそれらの培養皿から剥離した 。剥離した細胞を、カウントおよびプレートに入れる前にIL-2アッセイ培地中で 数回洗浄した。アッセイは３重測定で行った。よく混合した後、プレートを、標 準的な組織培養インキュベーター中にて37℃で約20〜24時間インキュベートした 。次いで、 各ウェル中の液体をピペッティングにより混合し、そして100μlをIL-2 ELISAア ッセイプレート（R＆D Systems Inc.，Minneapolis，MN）の新しいウェルに移し た。 ELISAアッセイに用いる手順は、IL-2アッセイ培地をブランクとして用いること 以外は、製造業者により提供されるものであった。ウェルの光学密度をマイクロ プレートのプレートリーダー（Molecular Devices，Menlo Park，CA）で450nm〜 570nmにおいて測定した。光学密度は試料中のIL-2の量を反映する。３重測定の ウェルの光学密度の平均値を計算し、そしてIL-2標準曲線を用いてIL-2のpg/ml に換算した。結果は、B7-CHO細胞株、F9、C12およびH9細胞が、それぞれ、360pg /ml、300pg/mlおよび150pg/mlのIL-2の産生を誘発することを示した。親細胞の トランスフェクトしていないCHO細胞は、20pg/mlのIL-2を誘発した。Jurkat細胞 単独では20pg/mlのIL-2を産生した。これらの結果は、F9、C12およびH9細胞株は Jurkat Ｔ細胞によりIL-2の産生を誘発し得ることを示した。さらなるアッセイ の開発のために、C12細胞株を選択した。コントロール実験は、バックグラウン ドレベルを超えてIL-2の産生を誘発するためには、PHAが必要とされることを示 した。滴定実験は、バイオアッセイにおいて１ウェルあたりのC12細胞の数が増 加すると、IL-2の産生は用量依存的に増大することを示した。応答は直線的では なく、より対数的であった。sCTLA4調製物の生物活性を測定するのに用いられる 標準的なIL-2産生アッセイでは、上記のバイオアッセイにおいて、１ウェルあた り2. 5×104個のC12細胞、1×105個のJurkat細胞、および10μl/mlのPHAが用いられる 。CTLA4はC12細胞上のB7と結合しそしてB7を中和するので、CTLA4をテスト用ウ ェルに添加するとIL-2の産生が減少し、これは、テスト用ウェルの光学密度の減 少により測定される。 実施例８ 適切に再折り畳みされたsCTLA4ダイマーの同定および精製 実施例５に記載されるように、ほとんどのsCTLA4の再折り畳み体は、24-27kDa の分子量範囲の複数の（典型的には少なくとも３つの）ダイマー型を含む。この ダイマー種は、SDS-PAGE（14％非還元SDSゲル）により、および実施例８Ｂに記 載されるようにRP-4カラムを用いる逆相クロマトグラフィーにより分割され得る 。異なるダイマー型は、IL-2産生アッセイにおけるこれらの生物活性が異なる。 ダイマー型のうち１つだけが、このアッセイにおいてIL-2産生を顕著に阻害し得 る。この顕著な比活性を有するダイマー型は、おそらく適切に折り畳まれている が、低活性ダイマー型はおそらく不適切に折り畳まれている（misfolded）。こ の異なるダイマー型を、サイジングカラムを用いて互いに分離し得る。この最も 活性なダイマー種は、実施例８Ｄおよび下記の表６に記載されるようにカラムか ら最後に溶出する（より小さい見掛けの分子量である）。「活性」および「低活 性」ダイマー種を、以下の実施例に記載されるように互いに分離した。再折り畳 み手順２（以下に記載）を用いて得られる活性および低活性ダイマー型は、Mono Q、Source 15Qイオン交換カラムを用いて、またはフェニル−セファロース疎水 性相互作用カラムを用いることにより互いに分離され得た。 Ａ．再折り畳み手順１ 30gのWIBSを2000mlの新たに作製した６MグアニジンHCl、0.1M Tris pH8.0、６ mM DTTに、polytron PT 3000（BrinkmanInstruments，Lucerne，Switzerland） を用いて溶解し、室温で15分間放置した。次いで、この溶液をJA-10ローター中1 0,000rpmで30分間遠心分離し、そしてペレットを捨てた。この上清に110mlの0.5 Mグルタチオン（酸化型）を加えた。この溶液を室温で15分から30分間放置して 、次いで緩やかに撹拌しながら18リットルの50mM Tris pH9.7中0.44Mグアニジン HClにゆっくりと加えた。次いで、200mlの0.5Mシステインおよび200mlの100mMフ ェニルメチルスルホニルフルオライド（エタノール中）を加えた。この再折り畳 み混合物を４℃で６日間撹拌せずに放置した。この時点で、この混合物をS10Y3 スパイラルウルトラフィルトレーションカートリッジ（Amicon，Beverly，MA） で約１リットルに濃縮し、そしてSpectra/Por ３チューブ（Spectrum Medical I ndustries，Houston，TX）中で19容量の20mM Tris pH8.0に対して２日から３日 間透析した。多量の沈殿をJA-10ローター中10,000rpmで15分間遠心することによ り除去した。残りの沈殿を、上清を0.45μmフィルターに通すことによりを除去 した。この上清を、300mlのQ-セファロース（Fast Flow；Pharmacia，Piscatawa y，N.J.）カラム上に10ml/分でかけた。タンパク質を、10ml/分で20mM Tris pH8 .0中１M NaClの０％から60％の勾配を用いてカラムから溶出した。 30%から40％の領域（約300mMから400mM NaCl）の各画分のアリコート（25μl） を非還元の14％SDSゲル上で電気泳動した。クマシーブル−R250で染色した場合 、活性ダイマー種は非常にくっきりしたバンドとして識別され得るが、不活性ま たは低活性のダイマー種（「低活性ダイマー」）はより広がっている。この区別 は容易に明らかである。この低活性ダイマー種は、典型的には、14％非還元SDS ゲル上で活性ダイマーより若干高い見掛けの分子量を有する。１つの低活性ダイ マー種は、しばしば、活性ダイマー種とSDSゲル上を共移動する。この低活性ダ イマー種は、下記のサイジングカラムを用いて活性ダイマー種と区別し得る。活 性ダイマー種を含むQ-セファロースカラム画分をプールし、そしてAmicon撹拌セ ル中のYM-10膜（Amicon，Beverly，MA）を用いて約40mlに濃縮した。この濃縮活 性ダイマープールを、250mM NaCl、20mM Tris pH7.5のバッファー中で26ml/分で ７リットル、85cmセファクリルS-100（Pharmacia）カラム中に通した。主タンパ ク質ピーク（タンパク質は画分のＡ280nmでの吸光度を測定することにより検出 された）にわたる各画分のアリコート（25μl）を上記のように14％非還元SDSゲ ル上で電気泳動した。活性ダイマー種は、不活性ダイマー種より遅れて溶出する 。このサイジングカラムの工程は、ほとんどの他の混入タンパク質およびほとん どの低活性ダイマー種を除去する。理論的に純粋な活性ダイマーを含む画分をプ ールし、そしてAmicon撹拌セル中のYM-10膜（Amicon Inc.，Beverly，MA）を用 いて約10mlに濃縮した。タンパ ク質濃度を、タンパク質標準物質（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）とし てのIgGを用いて、Lowryタンパク質アッセイキット（「DCタンパク質アッセイ」 ，Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA））を用いて測定した。 Ｂ．再折り畳み手順２ 実質的により多い活性CTLA4ダイマーが、再折り畳み手順を改変することによ り、再折り畳み混合物から回収し得ることが見出された。再折り畳み手順２は、 開始WIBSのグラム当たり実質的により多い活性CTLA4ダイマーを生じる改良され た再折り畳み手順である。酸化グルタチオンおよびシステインは、典型的には、 細菌由来の組換えタンパク質を再折り畳みするために用いられる混合物中に含ま れ、これを再折り畳み混合物から除去することによりかなりのコスト削減となる 。酸化グルタチオンおよびシステインは、活性CTLA4ダイマーの正しい再折り畳 みを妨害するようである。酸化グルタチオンおよび/またはシステインはCTLA4の システイン残基に結合し、そしてタンパク質再折り畳みおよび/または正しいジ スルフィド結合形成を妨害すると考えられている。再折り畳み手順２では、WIBS を最初に還元するために用いられたDTTの他に、追加の酸化剤または還元剤を再 折り畳み混合物に加えない。以下に、30gのWIBSで開始する典型的な再折り畳み を示す。 30gのWIBsを600mlの新たに作製した６MグアニジンHCl、50mM Tris pH8.5に、p olytron PT 3000（Brinkman Instruments） を用いて溶解し、次いで室温で30分間ゆっくりと撹拌した。7.2mlの0.5M DTT（ 最終DTT濃度=６mM）を加え、そしてこの溶液を室温で１時間ゆっくりと撹拌した 。次いで、この溶液をJA-10ローター中で10,000rpmで30分間遠心分離し、そして ペレットを捨てた。この上清を、343.9gのグアニジンHCl、10.9gのTris-HCl、お よび60.6gのTris塩基を11.4リットルの水に溶解して含む11.4リットルのグアニ ジン/Tris溶液にゆっくりと加えた。この再折り畳み混合物を４℃で３日間放置 した。次いで、この溶液をSA-1連続フロー遠心分離（flow centrifuge）（Westf alia，Oeldo，Germany）により２00ml/分、14psiで通し、続いて２リットルの0. 6MグアニジンHCl、50mM Tris pH9.5で４℃で追跡した。この上清をスパイラルウ ルトラフィルトレーションカートリッジ（S10Y3，Amicon Inc.，Beverly，MA） を用いて約１リットル〜２リットルまで濃縮し、そしてSpectra/Por３チューブ （Spectrum Medical Industries，Houston，TX）中で19リットルの２0mM Tris p H7.5に対して４℃で１日透析した。透析バッファーを交換し（同じ溶液および同 じ容量で）、そして４℃でさらに１日透析を継続した。生じた多量の沈殿をJA-1 0ローター中で10,000rpmで15分間遠心分離することにより除去した。残りの沈殿 を、上清を0.45μmフィルターに通すことによりを除去した。この溶液を、50ml のSource 15Q（Pharmacia）カラムに10ml/分でかけた。タンパク質を、10ml/分 て20mM Tris pH8.0中１M NaClの０％から60％の勾配を用いてカラムから溶出し た。約300mM NaClで溶出した主タンパク質 ピーク由来の各画分のアリコート（10μl）を非還元14％SDSゲル上で電気泳動し た。クマシーブルーR250で染色した場合、「活性」ダイマーは非常にくっきりし たバンドとして識別され得るが、「低活性」ダイマーのバンドはより広がってい る。この区別は容易に明らかである。再折り畳み手順１とは対照的に、再折り畳 み手順２を用いて形成する低活性ダイマーは、14％非還元SDSゲル上で活性ダイ マー種より典型的には低い見掛けの分子量を有する。活性ダイマーを含む画分を プールし、そして撹拌セル中のYM-10膜（Amicon）を用いて約40mlの容量に濃縮 した。この濃縮活性ダイマープールを250mM NaCl、20mM酢酸ナトリウムpH5.5中 で26ml/分で７リットル、85cmセファクリルS-100（Pharmacia）カラムに通した 。主タンパク質ピーク（Ａ280nmでの吸光度により検出された）にわたる各画分 のアリコート（10μl）を上記のように14％非還元SDSゲル上で電気泳動した。活 性ダイマーは低活性ダイマーより遅れて溶出する。このサイジングカラムの工程 は、ほとんどの他の混入タンパク質およびほとんどの活性ダイマーを除去する。 主として活性ダイマーを含む画分をプールし、そして撹拌セル中のYM-10膜（Ami con Inc.，Beverly，MA）を用いて約10mlに濃縮した。タンパク質濃度を、タン パク質標準物質としてのIgG（Bio-Rad Laboratories）を用いて、Lowryタンパク 質アッセイキット（「DCタンパク質アッセイ」，Bio-Rad Laboratories，Richmo nd，CA）を用いて測定した。 逆相HPLCにより、上記の手順により得られたこの活性ダイ マー種の特徴をさらに調べた。精製した活性CTLA4ダイマーのアリコート（50μl -100μl）をバッファーＡ（0.05％トリフルオロ酢酸「TFA」）で500μlに希釈し 、そして逆相カラム（RP-4、１×250mm、Synchrom，Lafayette，IN）に注入し、 そして100％のアセトニトリル、0.042％TFA（バッファーＢ）で直線勾配（2.6％ バッファーＢ/分の増加）を用いて、0.25ml/分の流速で溶出した。正しく再折り 畳みした活性CTLA4ダイマーが27.8分のところで対称のピークとして溶出した。 表４は、手順１および手順２を用いるいくつかの再折り畳み実験から得られた 良好なダイマー（good dimer）の収量を比較する。手順１を用いて得られたもの の４〜５倍も多い活性ダイマーが手順２から得られたことが表から明らかである 。 Ｃ．再折り畳み手順３ 再折り畳み手順３では、0.4gのWIBSを８mlの６Mグアニジン、50mM Tris-HCl p H8.5に溶解した。４mlのこの溶液をDTTを６mMの最終濃度に加えることにより還 元した。２mlのこの溶液を50mM Tris-HCl pH9.5で20mlに10倍希釈した。このグ アニジン濃度は１Mに維持した。最終DTT濃度は0.6mMであった。タンパク質を３ 日間４℃で再折り畳みした。20mM Tris-HCl，pH8に対して透析後、このタンパク 質を20mM Tris-HCl，pH8のバッファー中でMono-Qカラム（Pharmacia HR5/5カラ ム）にかけた。 タンパク質を20mM Tris-HCl pH8中の０〜600mMのNaClの直線勾配で１ml/分（10m M NaCl/分の増加）で溶出した。このカラムプロフィールは、画分32および33に 溶出される主タンパク質ピーク、続いて画分34から37に溶出されるより小さい広 いタンパク質ピークを示した。SDS-PAGE分析は、画分32および33の主タンパク質 種が再折り畳み手順１を用いて得られた活性ダイマー種と共移動したことを示す 。画分34から37は少なくとも３つのダイマー種を含んでいた。そのうちの１つは 、（少ない成分）活性ダイマー種とSDSゲル上を共移動した。他の２つのダイマ ー種は、活性ダイマー種より少し速く移動した（すなわちより低い見掛けの分子 量）。画分35および36はこれらのより速く移動するダイマー種に富んでいた。ど のダイマー種が最大の活性を有するのかを決定するために、画分32および33を合 わせ、そして画分35および36を合わせた。２つのプールをIL-2産生バイオアッセ イでテストした。タンパク質濃度をウシ血清アルブミンを標準物質として用いて 、Bradfordアッセイにより測定した。ウシ血清アルブミンの標準物質としての使 用で、IgGを標準物質として用いる場合に得られた濃度の約半分であるタンパク 濃度を回収した。この結果（表５）は、画分32および33のプールが約100ng/mlの IC50で最大の阻害活性を有したことを示す。これは、再折り畳み手順１を用いて 精製した活性CTLA4ダイマー種のIC50と同等である。画分35および36のプールは ほとんど滴定し得ない阻害活性を示し、そして３ug/mlより大きいIC50を有した 。 画分32および33の主タンパク質は、再折り畳み手順２を用いて得られた主タン パク質ピークの主タンパク質に、分子量（SDS-PAGEによる）および物理学的特徴 （イオン交換カラムの溶出時間）で類似している。画分35および36の低活性ダイ マー種は、再折り畳み手順２を用いて得られた不適切に折り畳まれたダイマー種 と同一でない場合には、似ている。 Ｄ．活性および低活性ダイマー種のサイジングカラム上での分離 RF-KCの実験では、CTLA4は再折り畳み手順１に概略したように再折り畳まれ、 ダイマーは本質的にQ-セファロースカラムから精製された。少なくとも３つのダ イマー種は非還元SDS-PAGEにより識別され得た。正しいまたは最も活性なダイマ ー種が、この実験の少量の総ダイマー種を構成していた。主なダイマー種を含む 画分（画分89-109）をプールし、222mlに濃縮し、そして再折り畳み手順１に記 載されたようにS-100サイジングカラムにかけた。CTLA4ダイマーは、主タンパク 質ピーク（画分33-41を含む）、続く小さなショルダーピーク（画分42-54を含む ）として溶出された。非還元SDS-PAGE分析は、かなりの量の低活性ダイマー種（ ショルダーピーク中の総タンパク質の少なくとも50％）を含むが、このショルダ ーピークが活性ダイマー種に富んでいることを示した。主タンパク質ピークは、 主に低活性ダイマー種である複数のダイマー種を含んでいた。主タンパク質ピー クはほとんど活性ダイマー種を含まなかった。主タンパク質ピーク（画分33-41 ）をプールし（プールＡと呼ぶ）、そしてIL-2産生バイオアッセイで活性をテス トした。同様に、ショルダーピーク（画分42-54）をプールし（プールＢと呼ぶ ）、バイオアッセイで活性をテストした。この結果（表６）は、プールＢのみが 顕著な阻害活性を有することを示した。プールＡのIC50は10ug/mlより大きかっ たが、プール ＢのIC50は、120-370ng/mlであった。活性ダイマー種をさらに精製するために、 プールＢ（画分42-54）をプールし、４0mlに濃縮し、そしてS-100カラムに再び かけた。1750mlのバッファーがカラムを通過するまでは、画分は集めなかった。 次いで、25mlの画分の回収を始めた。CTLA4ダイマーは、２つの重複したタンパ ク質ピークとして溶出された：複数のダイマー種を含む初期に溶出するピーク（ 画分28から35）、および単一のダイマー種に富む後期に溶出するピーク（画分36 から44）。２つのタンパク質ピーク由来のプール、画分28-35（プールＢ−１） および画分36-41（プールＢ−２）を調製し、そしてIL-2産生バイオアッセイで テストした。この結果（表６）は、後期に溶出されるピーク（プールＢ−２）は 、120および370ng/mlの間のIC50を有し、最も活性であること；初期に溶出され るピーク（プールＢ−１）は約10μg/mlのIC50を有し、非常に低活性であること を示した。 Ｅ．再折り畳みCTLA4の追加の精製 精製をイオン交換カラムのみを用いて達成した以外は、再折り畳み手順８Ｂカ ラムに従って実質的に調製されたCTLA4ダ イマープールを、20mM Tris，pH7.4、250mM NaClで予め緩衝化した疎水相互作用 カラム（HIC）（フェニル−セファロース、5mm×５cm、Pharmacia、Piscataway ，NJ）に直接かけた。この結合タンパク質を30カラム容量で20mM Tris，pH7.4、 50％アセトニトリル（CH3CN）の直線勾配を用いて１ml/分の流速で溶出した。CT LA4は２つのピークとして溶出された：15％CH3CNで溶出される主ピーク、および 25％CH3CNで溶出される小さなピーク。SDS-PAGE分析は、主ピークが正しく再折 り畳みされた活性CTLA4ダイマーに対応し、小さなピークがより低い相対分子量 で移動する不適切に折り畳まれた低活性CTLA4ダイマー種に対応することを示し た。 実施例９ 異なるCTLA4精製調製物のバイオアッセイ 再折り畳み手順１を用いて精製したCTLA4活性ダイマーを、上記のIL-2産生ア ッセイを用いて、活性についてアッセイした。CTLA4タンパク質をIL-2アッセイ 培地を用いて、所望の濃度まて希釈し、10μg/mlのPHAの存在下でB7+-CHO細胞（ C12細胞）2.5×104およびJurkat細胞１×105と混合し、そして組織培養インキュ ベーター中、37℃で約24時間インキュベートした。各タンパク質希釈物を、96ウ ェルの組織培養プレート（Corning，Corning，NY）を用いて、３回ずつアッセイ した。ジャーカットセル半PHAをコントロールとして使用した。ウェルのIL-2濃 度は、上記のようにIL-2 ELISAキットを用いて測 定した。ウェルの光学密度は、ウェル中のIL-2の量に比例する。すなわち、光学 密度が高い程、IL-2レベルが高いことを示す。異なるCTLA4ダイマー調製物のIC5 0 （IL-2産生の最大阻害の半分を観察する濃度）は、このアッセイを用いると約1 00〜300ng/mlの範囲であった（表７）。 再折り畳み手順２を用いて調製された活性CTLA4ダイマーは、IL-2生産バイオ アッセイにおいて類似のIC50を示した。 実施例10 組換えsCTLA4は、動物中の細胞損傷を阻害する Tiegsら（Journal of Clinical Investigation 90巻、196、1992）は、コンカ ナバリンＡ（Con A）により誘導され得る、マウスにおけるＴ細胞依存性肝臓損 傷モデルを記載する。Con-A誘導肝臓損傷は、８時間以内に検出可能でCon Aの存 在下マクロファージによるＴ細胞のポリクローナル活性化から生じる。肝臓損傷 は、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（SGPT）を含む、特異的肝 臓酵素の血流中への放出により測定される。sCTLA4のインビボ活性をこのモデル を用いて評価した。CTLA4タンパク質は、再折り畳み手順１を用いて調製された 再折り畳みRF-16、RF-17、RF-19およびRF-KCのプール中に含まれていた（表７） 。18-20gの雌のBalb/Cマウスを、Charles Riverから購入した。マウスに、Con-A （タイプV、カタログ番号C-7275；Sigma Chemical Company、St．Louis、Missou ri）を０時間で静脈注射（15mg/kg）し、−２、０、２、４、および６時間に生 理食塩水または0.3、３または30mg/kgのCTLA4を皮下注射した。８時間目にマウ スを殺しそしてSGPTの血清レベルを、Ektachem 700アナライザー（Kodak、Roche ster、N.Y.）を用いて測定した。個々のマウスのSGPT血清レベルを表８中に示す 。 注射あたり、３または30mg/kgのCTLA4を投与されたマウスは、SGPTレベルが統 計的に顕著に低下し、Con-Aのみで処理されたコントロールに比べて肝臓損傷が より少ないことを示す（p<0.05）。Dunnettの多重比較を用いた分散分析を、生 理食塩水および異なる用量のCTLA4を投与されたグループ間の差異を試験するた めに実施した。 実施例１１ 野生型CTLA4のPEG化 Ａ．NHS-PEG試薬を用いたPEG化 CTLA4はモノマーあたり２つのリシン残基を有する。可溶性CTLA4は、NHS-5K-P EG試薬を用いて効果的にPEG化され得、この試薬は、リシン残基に存在する遊離 のアミンのような遊離のアミンと優先的に反応する。実施例８Ｅにより調製され た活性CTLA4ダイマーを、3000 Da分子量カットオフ（MWCO）膜（YM3、Amicon） を含む撹拌圧力セル（Amicon、50ml）を用いて1.5-4.0mg/mlまで濃縮した。再折 り畳みされた可溶性CTLA4を、5,000 kDaのNHS-エステルポリエチレングリコール （5K-NHS-PEG）と反応させた。最終反応混合物は、675mg/ml、（28mM）CTLA4、9 mM TRIS、55mMリン酸ナトリウム、pH 7.0、396mg/ml、（84mM）5K-NHS-PEG、112 mM NaClを含んでいた。PEG:CTLA4のモル比は3:1であった。反応は、室温で5-6時 間行なった。反応混合物は４℃で保存した。SDS-PAGE分析（非還元条件）は、 PEG化生成物が、相対分子量がそれぞれ46,000 Da、および65,000 Daの位置に移 動する主生成物および副生成物からなることを示した。CTLA4出発物質の全体の 変換率（パーセント）は、約50-60%であった。 Ｂ．リシン−PEG化生成物の単離 PEG化生成物を含む反応混合物を、等容量の20mM TRIS、pH8.0（バッファーＣ ）で希釈し、予めバッファーＣで平衡化したアニオン交換カラム（Resource Q、 5mm×50mm、容量=1.0ml、Pharmacia、Piscataway、NJ）にロードした。結合した タンパク質（および未反応PEG）を1.0 ml/分の流速で0.5M NaClまでの直線勾配 （20カラム容量）で溶出した。0.5mlずつの画分を集めた。PEG化副生成物（SDS- PAGE上65000 Daの位置に移動する）は、約0.3M NaClで画分９および10中に溶出 した。PEG化主生成物（SDS-PAGE上46000 Daの位置に移動する）は、約0.35M NaC lで画分11および12中に溶出した。未反応PEGおよび未反応CTLA4ダイマーは、約0 .4M NaClで画分14および15中に溶出した。 Ｃ．PEG化生成物の分析 PEG化主生成物およびPEG化副生成物の両者のアリコート、および未反応CTLA4 ダイマーを、非還元および還元条件の両方の条件下で、SDS-PAGEにより分析した 。未反応CTLA4ダイマーの還元は、相対分子量12000 Daの位置に移動するモノマ ーを 生じた。PEG化主生成物（非還元SDS-PAGEにより約46,000 Daの相対分子量の位置 に移動）の還元は、分子量約12000 Daおよび18000 Daの分子量の位置にそれぞれ 移動する非PEG化モノマーおよびPEG化生成物の両者を、1:1のモル比で生じた。 このことは、PEG化主生成物（46,000Da）が、モノPEG化ダイマーである、即ち、 モノマーサブユニットの１つだけがPEG化されそして単一のPEG分子を含むことを 示す。還元後、18000 Daの位置に移動する種は、モノPEG化モノマーである。PEG 化副生成物（非還元SDS-PAGEにより65,000Daの相対分子量の位置に移動する）の 還元は、１つの主生成物、つまり18000 Daの位置に移動するPEG化生成物を生じ た。この18,000 Da PEG化生成物は、モノPEG化モノマーであり、65000 Da PEG化 生成物は、二重にPEG化されたCTLA4ダイマーであることを示す。この二重にPEG 化された種の還元は、著量の非PEG化モノマーを生じなかったので、各CTLA4モノ マーは単一のPEG化リシン残基を含んでいる。少量の、46000 Daの位置に移動す るPEG化生成物および非PEG化モノマーの両者がまた、65,000 Da副PEG化生成物の 還元後検出された。これらは、少量の、65,000 Da生成物に混じった高MW（67000 Daを超える）のPEG化種からの生成物であるようである。 Ｄ．PEG化生成物の生物活性 実施例１１Ｂからの画分９および10（二重PEG化ダイマー）、画分11および12 （モノPEG化ダイマー）および画分14および15 （未反応ダイマー）を別々にプールし、濃縮しそして実施例７に記載したIL-2産 生バイオアッセイ中の活性についてアッセイした。表９に示された結果は、モノ PEG化されたCTLA4は、非PEG化CTLA4のIC50の約3-4倍より大きいIC50を有したこ と（400ng/ml対100ng/ml）を示す。ジPEG化CTLA4に対するIC50は、非PEG化CTLA4 のそれに比べ約６倍より大きかった。 本発明の先行する記述は、例証および説明の目的のための例示である。本発明 の思想および範囲を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される べきである。従って、以下の請求項は、そのような改変のすべてを包含するよう 解釈されることが意図される。 配列表 (1)一般的情報： (i)出願人：コックス，ジョージ他 (ii)発明の名称：組換えCTLA4ポリペプチドおよびその製造方法 (iii)配列数：９ (iv)連絡住所： (A)住所人：シナジェン，インコーポレイテッド (B)番地：1885 33アールディー ストリート (C)市：ボールダー (D)州：コロラド (E)国：アメリカ合衆国 (F)郵便番号：80301 (v)コンピューター読み出し形態： (A)媒体型：フロッピーディスク、3.5インチ、360Kb (B)コンピューター：IBM互換用 (C)操作システム：MS-DOS (D)ソフトウェア：ASCII (vi)現在の出願データ：無し (vii)優先権主張の出願データ：無し (A)出願番号： (B)出願日： (viii)代理人／事務所情報： (A)氏名：テレサ，ブラウン エイ． (B)登録番号：32,547 (C)照会／記録番号：SYNE-275PCT (ix)電話回線情報： (A)電話：（303）541-1372 (B)テレファックス：（303）541-1370 (2)SEQ ID NO:1の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：384塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:1： (3)SEQ ID NO:2の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：125アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:2： (4)SEQ ID NO:3の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：32塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:3： (5)SEQ ID NO:4の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：45塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:4： (6)SEQ ID NO:5の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：33塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:5： (7)SEQ ID NO:6の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：37塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トボロジー：直鎖状 (10)SEQ ID NO:9の情報： (i)配列の特色： (A)長さ：5アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (xi)配列：SEQ ID NO:9： Detailed Description of the Invention             Recombinant CTLA4 polypeptide and method for producing the same   The present invention relates to soluble proteins useful for controlling T cell activation, More specifically, the soluble CTLA4 protein produced by recombinant DNA method Related.Background of the Invention   Inappropriate T cell activation may include autoimmune disease and transplant rejection. Related to the harmful condition of shoes. Optimal T cell activity for clonal expansion It is believed that sexualization requires two signals. One is the T cell receptor Antigen-specific signal that is delivered through the putter (TCR), and secondly, the antigen. It is a non-specific or co-stimulatory signal. Chen et al.Cell 71: 1093-1102 (1992); Liu et al.Eur. J. Immunol.22: 2855-2859 (1992).   The second non-specific signal is whether the T cell is activated for proliferation Or determine if you are in a non-reactive state known as clone anergy, It is measured by a class of T cell regulatory molecules known as costimulators. T cell tone The nodal molecule, B7, activates macrophages, activated B lymphocytes, and dendritic cells. Razi is a costimulatory protein expressed on the cell surface of antigen-presenting cells such as vesicles. -Wolf et al.Proc. Nat l Acad. Sci. USA. 89: 4210-4214 (1992) and Freeman et al.,J. Immunol.139: 3 26-3267 (1992).   B7 is known as CD28 and CTLA4 (cytolytic T lymphocyte associated antigen No. 4) Is a natural ligand for T cell surface proteins. CD28 and CTLA4 are Substantial homology in the mino acid sequence, especially in the transmembrane and cytoplasmic domains And therefore share similar functions in the T cell costimulatory pathway Are believed to be present. B7 has a higher affinity for CTLA4 when compared to CD28 It is known to have sex.   CD28 is essentially expressed on most T lymphocytes. However, CTLA4 is Expressed preferentially on activated cytolytic T cells over activated cytolytic T cells Brunet et al.Nature 328: 267-270 (1987). Measured in an easing experiment. CTLA4 activates activated cytolytic T lymphocytes and activates It is now known to be expressed on sexually helper T lymphocytes.   The interaction of B7 with CD28 and CTLA4 is a T-cell in the costimulatory pathway during the immune response. Plays an important role in total cell activation. For example, for monoclonal antibodies Thus, by neutralizing B7 or CD28 activity, foreign antigens and lectin-like poly The response to clonal activators prevents T cell proliferation. B7 By neutralizing the activity, T cells and helper cells that induce antibody synthesis by B cells And functioning Hindered.   In addition to its important role in T cell proliferation and antibody induction, the interaction between B7 and CD28 Use regulates cytokine synthesis in T lymphocytes. For the interaction between B7 and CD28 Thus, interleukins are known as cytokines that are regulated. Kin-2, tumor necrosis factors alpha and beta, gamma interferon and granulocyte macrophage AGE colony stimulating factor is included (Gimmi et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. US A. 88: 6575-6579 (1991); Linsley et al.,J. Exp. Med.173: 721-730 (1991); and Th ompson et al.Proc. Nat'l Acad. Sci. USA.86: 1333-1337 (1989)).   The synthesis of these cytokines is commonly used in cyclosporine (which It is a bacterial metabolite that has undergone organ transplantation or has an autoimmune disease Completely inhibited by immunosuppressants such as (used to suppress the patient's immune system) Not done. Therefore, agents that effectively inhibit B7 activity are alternatives to cyclosporine therapy. T cells that can be used as, or can be used in combination with cyclosporine, It is believed to provide the additional or synergistic effect of inhibiting proliferation. CD28 and CTLA Since B4 is similar, the interaction between B7 and CTLA4 also shows a site in T lymphocytes. It is thought to regulate the synthesis of kine.   However, the extracellular domain of CTLA4 is expressed as a soluble, non-fusion protein Attempts to make it were unsuccessful. Therefore, according to PCT Publication No. WO 93/00431 Activated CTLA4 ton Successful expression of the protein allows the protein to form as a dimer. It is thought that an expression system is required. Because this protein is naturally It is believed that they will be found as a mar. Thus, the researchers They focused on the fusion protein while trying to find a different expression system.   F of immunoglobulin moleculecA fusion containing the extracellular domain of CTLA4 bound to the heavy chain region. Synthetic proteins have been developed as potential drugs with B7 inhibitory activity . This fusion protein (designated "CTLA4-Ig") was prepared by Linsley et al.J. Exp. Med.17 4: 561-569 (1991) and PCT Published Patent Publication No. WO93 / 00431. this CTLA4-Ig fusion protein is coagulated in solution from mammalian cells. It is secreted as a disulfide-bonded dimeric protein that assembles. But CT An attempt to express the extracellular domain of LA4 as a non-fusion protein in mammalian cells Did not succeed. The Ig portion of the fusion protein causes the formation of a dimeric fusion protein. Promote, which can be processed and expressed in mammalian cells . The Ig portion also added active fusion protein from the conditioned medium to protein A Allows purification using an infinity column. Protein A is an Ig molecule FcIt has a high affinity for the region.   The molecular weights in solution of the major CTLA4-Ig species are based on size exclusion chromatography. The total is about 200 kDa, which is also the above. Linsley et al. CTLA4-Ig fusion protein expressed in mammalian cells Since the quality monomeric form has a molecular weight of about 50 kDa, less of the above major species in solution Both are considered to be an aggregation complex of four CTLA4-Ig molecules.   The B7 inhibitory activity of the CTLA4-Ig fusion protein has been demonstrated both in vitro and in vivo. Tested in the experiment. CTLA4-Ig fusion protein binds to B7 in in vitro experiments And neutralized its activity. In fact, the CTLA4-Ig fusion protein is a CD28-Ig fusion protein. It was a better inhibitor of B7 activity compared to the combined protein. these The results of the assay show that B7 binds CTLA4 with a higher affinity than does CD28. This is consistent with the previous experiment, which showed that CTLA4-Ig fusion protein is The mixed lymphocyte reaction reported by nsley et al. It was found to inhibit with a large inhibition amount of 30 ng / ml. This fusion protein is also L insley et al.J.Exp.Med.174: 561-569 (1991). And inhibited the ability of helper T cells to stimulate antibody production by B lymphocytes. .   CTLA4-Ig fusion proteins are immunosuppressive in in vivo experiments. , And survival in mouse and rat pancreatic and cardiac allografts Could be extended (Lenschow et al.Science 257: 789-792 (1992) and T urka et al.Proc. Nat'l Acad. Sci. USA.89: 11102-11105 (1992)). Mouse lab Study showed that administration of CTLA4-Ig resulted in pancreas Allogeneic transplant of the viscera was accepted for a long time. This result indicates that the fusion protein It has been suggested to make transplanted mice resistant to foreign tissues. Linsley ,Science Other animal studies described in 257: 792-795 (1992) also show CTLA4. -Ig could block the primary antibody response to foreign antigens such as sheep red blood cells Was showing.   CTLA4-Ig fusion protein has some drawbacks as a therapeutic agent for human diseases have. Since this fusion protein is a non-naturally occurring molecule, The receiving patient may develop an immune response to this protein. Antigenic This fusion, when the drug was stopped, and thus the patient was no longer immunosuppressed It becomes a bigger problem when you get an immune response to the protein obtain. Therefore, the CTLA4-Ig fusion protein was intermittently applied to patients with chronic disease. Can be interfered with by antigenicity. In addition, CTLA4-Ig fusion protein in mice The half-life of the protein is about 4 days, and still 5 weeks after the interruption of CTLA4-Ig treatment. , A significant level of fusion protein is detected in this animal. Linsley et al.Sci ence  257: 792-795 (1992). Furthermore, when bound to B7 on the surface of antigen-presenting cells, the fusion tag The Ig part of the protein can activate the complement cascade, resulting in cell death and blood Problems occur. Finally, the CTLA4-Ig fusion protein is expressed in mammalian cells. However, this is a costly recombinant protein production method.   Therefore, for further therapeutic use, which may inhibit the costimulatory pathway of T cell activation There is a demand for drugs. The present invention fulfills this need and has the associated advantages. provide.Summary of the invention   The present invention is recombinantly produced, not a fusion protein containing a human Ig molecule. It relates to CTLA4 polypeptides. Soluble, recombinant polypeptide is The model consists essentially of the extracellular domain of the CTLA4 receptor protein. Including Nomer. Preferably, this recombinant polypeptide comprises two or more Monomers are linked via intermolecular disulfide bonds or polyethylene glycol Bound through cross-linking agents such as (PEG), biologically active dimers and other It is a product that forms a multimer.   The polypeptide may also be functional derivatives of monomers and multimers such as It can be a cysteine mutein. Where one or more cysteines Of the amino acid sequence or added to the wild-type CTLA4 amino acid sequence. This Is preferably a CTLA4 receptor tamper, as shown in SEQ ID NO: 2. Cytoplasmic extracellular domain at residue numbers 79, 80, 81, 109, 110 or 111, and others On the other hand, the addition of extra cysteine is preferably performed by using the naturally-occurring CTLA4 receptor tamper protein. It is performed after the 125th residue from the N-terminus of the protein. Other functional derivatives are eg Two cysteine muteins at each end of the PEG molecule PEGylated dumbbell-shaped molecules linked through the active groups of   The present invention also provides a method for producing a recombinant polypeptide. This method is as follows Including steps:   (A) The host cell corresponds to the extracellular domain of the CTLA4 receptor protein. A step of obtaining a DNA sequence that can be directed to express a polypeptide, The polypeptide has B7 binding activity;   (B) the above DNA sequence has an operable element for expressing the above DNA Inserting into a vector   (C) transfer of the vector into a host cell capable of expressing the polypeptide Process;   (D) a step of culturing the host cell under the conditions for expressing the polypeptide ;   (E) recovering the above polypeptide; and   (F) A step of allowing the above-mentioned polypeptide to have an active tertiary structure. Any In addition, the polypeptide may also adopt an active quaternary structure.   Vectors and host cells useful for expressing recombinant CTLA4 polypeptides are also provided. Also provided. In addition, the present invention further comprises a CTLA4 polypeptide as an active ingredient. A pharmaceutical composition comprising the same is provided.   The invention also provides a method of separating various forms of recombinantly produced polypeptides, Especially a method for separating monomers and dimers About. The present invention also separates various dimer species and To a method for purifying a more active dimer. By the above method, active, After obtaining the recombinant polypeptide, the resulting mixture is subjected to an ion exchange column, especially an anion. A column exchange column and then a sizing column. How to separate these A pool of the first mixture of at least about 90% dimer, and at least A second pool of about 85% monomer is produced. These methods are also less active Separate the more active dimers from the dimers.Detailed Description of the Invention   The present invention provides soluble recombinantly produced CTLA4 polypeptides that are not fused to human Ig molecules. I will provide a. The novel recombinant polypeptide of the present invention is unsuitable for leading to various diseases. It is useful for inhibiting the expansion of various T cells.   The naturally occurring or wild type CTLA4 protein is a ligand for B7, It is a cell surface protein involved in the costimulatory pathway leading to T cell activation. Ne The nucleotide and amino acid sequences of mouse and human CTLA4 are described in Brunet et al.,Nat ure  328: 267-270 (1987), and Dariavach et al.,Eur. J. Immunol.18: 1901-1 905 (1988). Human CTLA4 protein and murine CTLA4 The homology of all amino acids with proteins is 76%. Full length human CTLA4 tongue The exact amino acid sequence of the protein is published in PCT published on January 7, 1993. An open publication is provided in WO 93/00431.   Early as described above to produce unfused or truncated CTLA4 protein 'S attempt was not yet successful. Therefore, the biologically active group prior to the present invention Methods for obtaining a modified CTLA4 protein include expression of the fusion protein, CTLA4. It was More specifically, the fusion protein is described in PCT Publication WO 93/00431 in Fused to the heavy chain region of the immunoglobulin molecule (called the "CTLA4-Ig" protein) It is described as containing the extracellular domain of CTLA4. According to this publication, C To successfully express the extracellular domain of the TLA4 receptor protein, the protein There is a need for an expression system that allows the quality to form dimers. In comparison, CTLA4 protein The unfused or truncated forms of quality are not expressed in the active form. This public release Reportedly, the Ig portion of the CTLA4-Ig fusion protein promotes dimer formation and Purification of the fusion protein by Protein A affinity chromatography It further shows what is believed to aid.   The present invention provides a biologically active soluble recombinant CTLA4 polypeptide that is not an Ig fusion protein. It is based on the discovery of a method for producing a polypeptide (sCTLA4). As used herein, the term "organism "Morologically active" means a polypeptide that exhibits B7 binding activity.   The recombinantly produced CTLA4 polypeptide of the present invention is essentially Has a monomer consisting of the extracellular domain of wild-type CTLA4 receptor protein It Monomer is essential In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. E. Expression in prokaryotic host cells such as coli The prepared monomer is similar to SEQ ID NO: 2 but has an methionine at the N-terminus. Encoded by the no acid sequence. As used herein with respect to monomer The term "consisting essentially of" refers to the a Amino acid sequences or additional amino acids other than the amino acid sequence encoding the human Ig molecule. A monomer encoded by an amino acid sequence corresponding to the extracellular domain bound to acid. -Is intended to be included. The calculated molecular weight of the CTLA4 monomer form is: It is about 12.5 to about 13.5 kDa. Recombinantly produced sCTLA4 monomer is The SDS PAGE of the product showed two major bands in the range of about 14 to about 16 kDa.   The recombinant CTLA4 polypeptides of the invention may also be in dimeric form or other multimeric forms. -May take the form of containing one or more basic monomer units. Like this Rutimers, especially dimers, are formed by intermolecular disulfide bonds or by cross-linking agents. (For example, polyethylene glycol (hereinafter referred to as "PEG"), other polyethers , EDTA and other linkers known to those of skill in the art) to attach two or more molecules Can be formed by Two models linked by an intermolecular disulfide bond The dimeric form produced by the nomer has a calculated molecular weight of approximately 25 kDa and SDS PAGE under non-reducing conditions showed that at least 3 Presents a major band. The present invention provides methods and methods for separating various dimeric forms. Active dimer A method of purifying a form is provided.   The monomeric and dimeric forms are according to the assay described in the examples below. , Biologically active. However, the active dimeric form is in vitro in these In a biological assay of about 10 to about 100 times more than the monomeric form of CTLA4. It was found to be twice as active.   The invention further provides methods for producing recombinant sCTLA4 polypeptides. like this The method involves the following steps:   (A) CTLA4 receptor tag which is a polypeptide having B7 binding activity in host cells To obtain a DNA sequence capable of expressing a polypeptide corresponding to the extracellular domain of the protein. Process;   (B) having a DNA sequence that has operable elements for expressing the DNA sequence Inserting into a vector   (C) transferring the vector into a host cell capable of expressing the polypeptide;   (D) culturing a host cell under conditions for polypeptide expression;   (E) recovering the polypeptide; and   (F) allowing the polypeptide to be in an active tertiary structure; Includes.   Then, if desired, the peptide may have two or more monomers attached to it, Be a quaternary structure that forms a unit such as an imer form or other multimeric form Can be guessed Can be. Moreover, the present invention further provides, where appropriate, active dyes herein. To obtain the most inhibitory form, called the dimer form, the dimer form was separated. The step of separating is included.   Nucleic acid sequences useful in the methods of the invention include SEQ ID NO: 1 and its functional equivalents. Including things. As used herein, the term "functional equivalent" has B7 binding activity. One of the above sequences that does not substantially affect the ability of the sequence encoding the polypeptide to It means a modified sequence having the above addition, deletion, or substitution. Such modified distribution Sequences are generated by methods known in the art (eg, site-directed mutagenesis) Can be done. The sequence encodes the extracellular domain of the CTLA4 receptor protein It can be obtained from natural sources such as natural DNA sequences. Alternatively, the sequence is in the art Can be produced synthetically according to methods known in the art. In addition, such DNA distribution The rows can be from a combination of synthetic and natural sources. The natural sequence is Includes NA and genomic DNA segments. Methods for obtaining synthetic and natural DNA sequences Is described in PCT Publication No. WO 93/00431 published January 7, 1993, which Are incorporated herein by reference.   The vector that can be used in these methods will insert the CTLA4 DNA sequence as described above. Include the vector. As used herein, the term "consisting essentially of" refers to CTLA4 Vector containing a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of a sceptor protein Tar Is meant to include any desired activatable element, but not human Ig Nucleotide sequences encoding offspring are not included. CTLA4 DNA sequence can be inserted , And can be linked to any desired operable element that affects its expression It The vector may include one or more of the following operable elements: (1) pro Motor; (2) Shine-Dalgarno sequence and start codon: (3) stop codon; ( 4) Operator: (5) Leader sequence that promotes export of the host cell; (6) ) Genes for regulatory proteins; (7) Proper transcription of the vector and subsequent translation Any other DNA sequence required or preferred for. European Patent Application No. 90 113 673.9 , Which are hereby incorporated by reference, which include some useful vectors. And the desired actuatable elements are disclosed.   Vectors can be prepared by various methods known in the art (transfection and And transformation techniques) into suitable host cells. Various transitions The method is Sambrook et al.Molecular Clonin: A Laborator Manual， Cold Spring Ha rbor, N.Y. (1989), which is incorporated herein by reference. ing. Such host cells are either eukaryotic or prokaryotic cells. This Examples of host cells such as, Chinese hamster ovary (CHO) cells, yeast, E ． E. coli, and baculovirus-infected insect cells are included. European Patent Application No. 90  113 673.9 (also incorporated herein by reference). It is also useful in the method of the present invention.   The host cells of the invention are cultured under conditions suitable for expression of recombinant CTLA4 polypeptide. Can be done. These conditions are generally host cell specific, and Easily determined by one of skill in the art in light of published literature on growth conditions for various cells To be done. For example,Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, W illiams & Wilkins Co., Baltimore, Maryland, which is hereby incorporated by reference. Information on suitable conditions for culturing bacteria. It is rare. Similar information on culturing yeast and mammalian cells is found in R.M. Pollack ,Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) (This Are incorporated herein by reference).   In one embodiment, the cells are adapted to inhibit expression of the desired CTLA4 polypeptide. It can grow to high densities that face severe regulatory conditions. When the optimal cell density is reached Environmental conditions are described in accordance with procedures known in the art or in the examples below. As described above, the conditions can be changed to those suitable for the expression of the polypeptide. Therefore, the expression Prior to inducing expression of host cells, recovery of the It is particularly useful to grow close to density.   Expression of recombinant CTLA4 polypeptide can be determined, for example, by Western blotting, Use anti-CTLA4 antibody according to assay procedures known in the art such as ELISA. Can be confirmed. Once expression of the recombinant polypeptide is confirmed, Next And the polypeptide is recovered according to methods known to those skilled in the art.   The recombinant polypeptide can be purified after recovery and, if necessary, prior to purification. Alternatively, the active structure of the recombinant polypeptide can be inferred later. Preferably, polypepti The peptide is purified before inferring its active tertiary or quaternary structure. Recombination Methods for purifying proteins are known in the art and are described, for example, in European patents. The method described in Permit Application No. 90 113 673.9, which is incorporated herein by reference. Included).   Express in a biologically inactive form or in a form that increases its biological activity For polypeptides, the following general refolding procedure can be used. These steps Is E. Biologically active polypeptides expressed by prokaryotic host cells such as E. coli It is especially useful for generating code.   First, intra- or intermolecular dislocations that occur during expression of CTLA4 polypeptides. Rufido bonds or other non-covalent bonds link the polypeptide to denaturing and reducing agents. It is cut by slicing. A suitable denaturant breaks the intermolecular or intramolecular bonds. Changes the conformation of the protein, resulting in A compound or compound that loses biological activity without substantially affecting its structure It is an academic substance. Examples of such modifiers include guanidine hydrochloride and urea. Be done.   Guanidine hydrochloride is preferably used as denaturant. The concentration of guanidine is , About 0.5M to about 6.0M, preferably, At least about 6.0M.   When urea is used as a denaturant, any resulting interfering cyanate is Apply the solution to an anion exchange column such as DOWEX 1-X8 (BioRad, Richmond, California) It can be removed by pouring. Therefore, cyanate is an amino acid in proteins. Acids can be modified and removed (Stark,Methods in Enzymology 11: 125 (19 67)).   The disulfide bond is then reduced with a reducing agent. Suitable reducing agents include For example, β-mercaptoethanol, dithiothreitol (DTT) and cystein Are included. Preferably DTT is used as the reducing agent. Preferred DTT concentration Is 6 mM. In one embodiment described in Examples 5 and 8A, the reduced tag Free thiols present in proteins contain oxidants, preferably disulfides By adding an oxidizing agent (eg, oxidized glutathione or cystine) in excess Be oxidized. Finally, the resulting solution is subjected to a second reduction that catalyzes disulfide compatibility. Dilute before adding agent. Preferably, the second reducing agent is a sulfhydryl (ti All) group containing reagents such as DTT, 2-mercaptoethanol, di- Examples include thioerythritol, cysteine, cystamine and the like. The second reducing agent is It can also be a disulfide-containing compound such as cystine, oxidized glutathione. Or sodium borohydride with any cysteine-containing peptide added Is any VIA group hydride. The purpose of adding the second reducing agent is various. The The formation and disruption of sulfides or other non-covalent bonds allows the CTLA4 recombinant polypeptide to The goal is to create an environment that infers various three-dimensional arrangements of the peptide. Any particular reason I don't want to be controversial, but the suitability of the wild-type CTLA4 receptor protein The unique three-dimensional structure and disulfide bond pattern make it a possible alternative conformation. It is considered to be more energetically more stable than Therefore, the recombinant polypeptide The ratio of polypeptides is biologically active under conditions that allow for various three-dimensional configurations of peptides. Form a sexual conformation. In addition, this environment is also an intermolecular disulfate. Promotes the formation of dimers via tide bonds.   In the second preferred method, denatured and reduced proteins are diluted and Without further addition of the oxidizing or reducing agent described in Example 8B, the monomer and dust were added. Enables replay to Immersion.   The monomeric and dimeric forms were then prepared as described in Examples 5 and 8 below. They can be separated according to order. Briefly, the mixture is first dialyzed and centrifuged . The supernatant obtained after this is passed through an ion exchange column, preferably an anion exchange column. And then pass through a sizing column (eg Superdex 75 column). Ion exchange Passing through the column gives a dimer pool mixture of about 70% dimer, At least 90% dimer, preferably about 95% by passage through the sizing column A dimer pool mixture of dimers is obtained. The same procedure, at least about 85% A monomer pool mixture of monomers is obtained. This After this, to further separate the monomer from the dimer, the mixture was It can be passed through a Sepharose column, or alternatively a reverse phase column. Useful ion exchange Replacement columns include Mono Q, Q-Sepharose, Resource Q, and Source 15Q columns. Including but not limited to. Other equivalent separation procedures known to those of skill in the art also It can be used to isolate various recombinant CTLA4 forms.   The invention also provides functional derivatives of recombinant CTLA4 polypeptides. This specification As used herein, the term "functional derivative" refers to any recombinant CTLA4 polypeptide. A modified biologically active form of Such a modified form is (1) Substitution or addition with amino acid sequence and / or (2) use as a cross-linking agent Another agent that can be or improves certain pharmacokinetic or immunological properties It may be the addition of functional groups. However, such modified forms are The biological activity of is substantially reduced to less than 10 times, preferably less than 5 times, the activity. Let Accordingly, the term "functional derivative" as used herein refers to non-modified recombinant The recombinant CTLA4 polypeptide described above, which substantially retains the biological activity of the CTLA4 polypeptide. An active fragment, analog, or derivative of a polypeptide is meant. analog In such cases, a preferred such modified polypeptide is about 40% compared to SEQ ID NO: 2. Greater than, more preferably greater than 50%, and most preferably greater than 90% It has a homology with a threshold amino acid. Amino acid homology of about 99% is particularly useful.   For example, one modification is a cis that provides a "free cysteine" within the amino acid sequence. Can be a substitution or addition of thein, which produces a "cysteine mutein" To do. As used herein, the term "cysteine mutein" or "CTLA "4 muteins" are small proteins that do not involve intramolecular or intermolecular disulfide bonds. It refers to a mutant protein having at least one cysteine. Free cysteine It can appear at any amino acid residue that does not substantially interfere with its ability to bind B7. Good Preferably, cysteine is the N-terminal derived residue number 79, 80, 81, 109 of SEQ ID NO: 2. At least one amino acid in residues 110, 111, or It is added after residue number 125.   Muteins or other derivatives can be prepared by methods well known to those of skill in the art. . Such methods include, for example, substituting a nucleotide encoding cysteine. Mutagenesis methods that include or add to it. Common methods include No. 4,518,584, which is hereby incorporated by reference. There is. Alternatively, the mutein may also be synthesized by methods known to those of skill in the art. Can be done.   In one embodiment, the cysteine mutein is polyethylene glycol. (PEG) with free cysteine to increase its molecular weight and its drug Improved kinetic properties (eg increased serum half-life). PEG long chain polymer The unit is the sulfhydryl group of the free cysteine residue on the mutant protein. Can be attached to the mutein by covalent attachment to. Species with different molecular weights Various PEG polymers can be used. Examples of such a PEG polymer include 5. 0kDa (PEG5000), 8.5kDa (PEG8500), 10kDa (PEG10.000), And 20kDa (PEG20.000) Is used. To obtain reaction selectivity and homogeneous reaction mixture, sulfhydryl It is useful to use a functionalized polymer unit that reacts specifically with a diol group. Long chain PE The functional group or reactive group attached to the G polymer is It is an active group that binds at a site. Suitable active groups include, for example, maleimide, sulfone. Hydryl, thiol, triflate, tresylate Contains aziridine, exirane, or 5-pyridyl Be done. PEG molecule also used NHS (N-hydroxysuccinimide) -derivatized PEG molecule Can be attached to CTLA4 with a free amine group.   Other CTLA4 complexes also include, for example, (1) one PEG molecule with CTLA4 monomer (single PE). G-modified) or dimers, free amines, eg as described in the Examples below. And (2) conjugating two PEG molecules to CTLA4 dimer Or; (3) PEG two or more CTLA4 monomers or dimers As a "dumbbell" by connecting it via a cross-linking part such as It may be intended to produce a compound that may be represented. Or two or more CTLA4 dimers are linked via a PEG-like cross-linking moiety, the “dimer dumbbell Can be generated.   PEG molecules containing two active groups were used to make dumbbell compounds. Can be Examples of such molecules include PEG bismaleimide (each terminal of the molecule). A PEG molecule containing a maleimide active group) or bis-NHS-PEG (N at each end of the molecule) PEG molecules containing HS groups). Those of ordinary skill in the art will appreciate that the And the useful yield of the mono-PEGylated or dumbbell polypeptide. The polypeptide: PEG ratio needed to obtain the amount can be readily determined.   The invention further provides recombinant CTLA4 polypeptides in a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention provides a pharmaceutical composition containing a peptide or a functional derivative thereof. For use in this specification The term “pharmaceutically acceptable carrier” as used refers to a nontoxic to active ingredient, Generally, refers to an inert vehicle, the component or composition to which this composition is administered. It does not adversely affect the test subject. A suitable vehicle or carrier is a standard Pharmacy text, for exampleRemington's Phamaceutical Sciences, 16th Edition, Mack Pub lishing Co., Easton, PA (1980), which is incorporated herein by reference. Is used as. Such carriers include, for example, bicarbonate buffer. , Phosphate buffer, Ringer's solution, and saline solutions . In addition, the carrier can include the formulation pH, osmolality, viscosity, clarity, To improve or maintain color, sterility, stability, dissolution rate, or odor May also include other pharmaceutically acceptable excipients.   The pharmaceutical composition can be prepared by methods known in the art. This way Includes the methods of the examples, simply mixing the reagents. The person skilled in the art aims The choice of pharmaceutical carrier and appropriate formulation of the composition will depend on the use and mode of administration. I understand the manufacturing.   Once formulated, the pharmaceutical composition may be a solution, suspension, gel, emulsion, Stored in sterile vials as a solid or dehydrated or lyophilized powder Can be done. Such formulations may be in ready-to-use form or for administration It may be either in a form that requires prior reconstruction. Generally, the preservation of the formulation Retention is carried out at temperatures conventionally used for such agents. At such temperatures, Room temperature or preferably 4 ° C or lower, eg -70 ° C is included. The formulation is , Stored and administered at a pH range of about 5 to about 8, preferably at about physiological pH. Can be   Recombinant CTLA4 polypeptides and their functional derivatives are useful for a variety of purposes. Can be used. In one embodiment, the recombinant polypeptide is known in the art. For producing polyclonal or monoclonal antibodies according to the method of It can be used as a quarantine source. This method includes, for example, Harlow and Lane,Antibodi es: A Laboratory Manual (1988), which is referred to in the present specification. Is used as. Since CTLA4 is immunosuppressive, preferably recombinant CTL The A4 polypeptide is first denatured and, if desired, the immunogen. It is reduced to produce anti-CTLA4 antibody before use. Such antibodies, in turn, CTLA4 receptor tamper on the cell surface of T cells according to procedures well known in the art. In vivo use, such as the detection of cytoplasm, or imaging, or such of B7 It can be used for inhibition of binding to receptor proteins.   Recombinant polypeptides of the invention may also be labeled with B7 or B7 according to procedures known in the art. Can be used as a detection reagent to detect the presence of purified B7. For diagnostic purposes, The recombinant polypeptide is exposed to a sample suspected of containing the ligand to be detected. Can be labeled with a marker prior to application. This polypeptide is also for purification of B7, It can be attached to a solid support.   Furthermore, recombinant polypeptides and their functional derivatives are Can be used to prevent, deter or treat diseases associated with activation and proliferation It Accordingly, the present invention provides a method of treating diseases associated with deleterious T cell activation and proliferation. Provide the law. Such diseases include, for example, transplant rejection, various autoimmune diseases, And other T cell mediated diseases. PCT Publication No. WO 93/00431 (herein , Which is incorporated by reference), describes various T-cell mediated diseases. CTLA4 For autoimmune diseases in which administration of the polypeptide and its functional derivatives may be useful , E. Rubenstein and D.D. Federman,Scientific American Medicine, Volume 2, Described in Section IV (1993), which is incorporated herein by reference. , Rheumatoid arthritis, asthma, lupus, multiple sclerosis, psoriasis, graft versus host disease, Includes Type I diabetes, and other autoimmune diseases.   The method of treatment of the present invention comprises the treatment of an amount of the present invention effective to inhibit deleterious T cell activation. Administering a recombinant CTLA4 polypeptide or a functional derivative thereof to a subject Achieved by The active ingredient is preferably present in the pharmaceutical composition as described above. Be prescribed to.   As used herein, the term “subject” refers to a T cell that can be costimulated by B7. Any animal that has one, including humans. Furthermore, recombinant CTLA4 Polypeptides and their functional derivatives are also referred to as "active ingredients."   Effective doses depend on a variety of factors known to those of skill in the art, and these factors include the subject. Type, age, weight, and medical condition, as well as prevention, deterrence, or treatment It includes the type of disease to be treated, the severity of the symptoms, the route of administration and the active ingredient used. Get caught A skilled physician or veterinarian can readily determine and prescribe the effective amount of the active ingredient. It Generally, treatment is with small amounts, which are substantially less than the optimum dose of the active ingredient. Can be started. After this, the dose causes significant adverse or harmful side effects In small increments until the optimum or desired effect is achieved without any. Preferably The daily dose is in the range of about 10 to about 2000 mg per human subject.   The compounds and pharmaceutical compositions of the invention may be administered orally or by any means known in the art. Can be administered by parenteral administration. Such administration includes, for example, Intravascular, subcutaneous, intraarticular, Or includes intramuscular injection or infusion. To achieve and maintain the desired effective dose Therefore, repeated administration is desirable. The frequency of dosing will depend on several factors. Such factors may include, for example, the formulation used, the type of disease, the Individual characteristics are included. Those of ordinary skill in the art will determine an appropriate frequency based on such factors. It can be easily determined.   The following examples illustrate the invention and are not limiting. Intended.                             Example 1                         CTLA4 cloning   The DNA sequence encoding the extracellular domain of the CTLA4 protein is labeled with polymerase chain reaction. Cloned from the human T-cell leukemia cell line "Hut 78" using the PCR technique. It was The Hut 78 cell line (catalog #TIB 161) is a product of Rockville, Maryland. Obtained from the Merikan Type Culture Collection. This Hut 78 cell , 10% fetal bovine serum, 2mM glutamine, 5X10-FiveM2-Mercaptoethanol, I00U / m 4X1 in RPMI1640 medium containing l penicillin and 100 μg / ml streptomycin 0FiveCultured at cells / ml. Add 5 ng / ml phorbol 12-myristate 13-a to these cells. Cate (Catalog # P-8139, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 1 μg / ml PHA-L (Catalog # L-4144, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) 5ng / ml IL-2 (R & D Systems, Minneapolis, MN) was added for activation, and cultured for an additional 49 hours did. 9X10 upon collection6Cells were washed in phosphate buffered saline (PBS) , Pelleted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored overnight at -70 ° C. The next day, the frozen cells were resuspended in 3 ml of PBS and 1 ml (3X106Cell) Pelletized simply by microcentrifugation. Invitrogen Corporation (San Diego, CA) Handling of the "Micro FastTrack mRNA Isolation Kit" purchased from Messenger RNA was prepared from the cells using according to the instructions. Obtained The mRNA pellet was resuspended in 10 μl of water and 1 μl of it was added to the “cDNA Cycle Kit” (In vitrogen Corporation) and the random primers supplied with the kit. Used for first strand cDNA synthesis. This first strand cDNA synthesis method is handled by the manufacturer. It was carried out according to the instructions.   Mature CTLA-4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol., Vol. 18, 1901-1905 (1988) ) CDNA extracellular portion (from alanine 1 to aspartic acid 125) in a volume of 100 μl 10 mM Tris (pH8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% (w / v) gelatin, 200 μM each of dATP, dCTP, dGTP and TTP, and 20 pmol each of oligonu Cleotide primer, 5'CCCCATATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCT3 '(SEQ ID NO: 3 ) And 5'CCCAAGCTTGGTACCTTATCAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG3'(SEQ ID NO: 4) (A region overlapping with the DNA sequence of CTLA-4 is underlined.) 5 of the total cDNA capacity consisting of the above-mentioned first-strand cDNA in the product. Amplification was carried out by the PCR method using one part (4 μl of 20 μl). 95 ° C for 1 minute After denaturing the RNA / cDNA hybrids at 50 ° C, lower the temperature to 600 ° C and add 0.5 μl (2.5 AmpliTaq DNA Polymerase "(Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT) ) Was added and the temperature was raised to 72 ° C. (1 min). The PCR method is Ericomp's "Twinbl ock ”thermal cycler (San Diego, CA) 95 ° C for 1 minute, 600 ° C for 1 minute , And 29 additional steps including 1 minute at 72 ° C. This PCR amplification Was terminated by incubation at 72 ° C for 10 minutes.   Confirm that a 0.4 kb PCR fragment was generated (on a 1.5% agarose gel) After confirmation (by running a small amount of the reaction mixture), the reaction mixture is extracted once with phenol. , Followed by ethanol precipitation, followed by restriction endonucleaseNdeI andHindII Cut with I. The cleaved DNA is spun on a small DNA fragment. Removed. And a small amount (about 1/20 of the original PCR reaction)NdeI andH ind Ligated to pT88IQ (Tac promoter expression plasmid) cut with III, E.col i host strain "DH5-α" (available from GIBCO BRL, Gaithersberg, MD) .   Expression vector pT88IQ is a derivative of expression vector pT3XI-2. This Tar pT3XI-2 was constructed in the following manner. The starting plasmid for this construction is Plasmid pKK223-3 purchased from Pharmacia. The plasmid pKK223-3 is It carries a part of the tetracycline resistance gene. Has no function The gene for this bacterium is a complete tetracycline resistance gene contained in the plasmid pBR322. It was replaced with the gene. Plasmid pKK223-3 was digested to completion with SphI and digested with BamHI. Cut incompletely. The 4.4 kilobase pair fragment was gel purified and Synthetic adapter (SEQ ID NO: 5): And the tetracycline resistance of pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01) above A 539 base pair fragment of DNA obtained from ClaI, SphI digestion of the gene was ligated. The resulting plasmid was named pCJ1.   Next, the XhoI library purchased from New England Biolabs (Beverly, Massachusetts). Marker was inserted into the PvuII site of plasmid pCJ1 to form pCJX-1. This insert Control plasmid copy numberropDestroy the gene. Next, include the lacI gene. Purifying the EcoRI fragment with plasmid pMC9 (Calos et al., (1983)), Then, it was inserted into the XhoI site together with the XhoI to EcoRI adapters. Then pKK22 By cutting the polylinker region of 3-3 with EcoRI and PstI, the polylinker region containing the addition site was added. Linker (SEQ ID NO: 6): Replaced with. The plasmid vector thus obtained was named pCJXI-1.   Finally, the above tetracycline resistance gene was replaced with restriction enzymes HindIII, BamHI, and And a SalI recognition site in an equivalent gene disrupted by bisulfite mutagenesis. Replaced. The following method was used to mutate the tetracycline resistance gene of pBR322. Used for. The plasmid pBR322 was cut with HindIII and then digested with sodium bisulfite. Mutagenesis (Shortle and Botstein, 1983). The mutated DNA is ligated and the DNA was formed. Then, it was digested with HindIII and all the plasmids that escaped mutation were repaired Linearized. This cleavage reaction mixture was used to transform E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985 ) Was transformed. Isolate tetracycline resistant colonies and The deletion of the HindIII site in the tetracycline resistance gene of Mid was examined. Well changed The different plasmid was named pT1. By the same method, mutation of BamHI site of pT1 Was carried out to obtain the plasmid pT2. Next, the plasmid pT2 was mutated to generate Sa The 11 site was removed to form plasmid pT3. Mutated tetracycline resistance The ClaI-StyI fragment of pT3, which carries the gene, was isolated and used to transform pCJXI- One homologous fragment was replaced to form pT3XI-2. This mutated tetracycline Phosphorus resistance genes still encode functional proteins. tac promoter territory A polylinker was introduced downstream of the region. This is done in E.coli, as shown below. BamHI and BamHI useful for gene cloning for expression It contains a KpnI recognition site between other sites.   Similar to pT3XI-2, the expression of the cloned gene contained in pT88IQ was Controlled by the motor. Translation is from the ATG in the unique NdeI recognition sequence CATATG. Is initiated (the downstream NdeI site is removed, so that the NdeI sequence at this initiation site is unique. Become one). There is a polylinker downstream of this NdeI site to insert the desired gene. Promote. In addition, the above XhoI fragment containing the IacI region was added to the 1acZ promoter. And its operator, which is the binding site for the lac repressor, are excluded Was replaced with the missing fragment. The replaced lacI region also contains the lacIq mutation (single Increased production of the lac repressor by substitution of three bases: Muller-Hill et al.Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 59: 1259-1264 (1968)).   The unique differences between pT3XI-2 and pT88IQ are as follows. 1. Area of cloning site   EcoRI site upstream of the polylinker and HindIII site downstream of the polylinker The following 135-mer sequence between the positions is replaced (SEQ ID NO: 7):   This sequence contains the NdeI site (underlined) of the start codon for expression, And BamHI, XmaI, KpnI, SaII, SacI, BstBI, SpeI, and SacII. Contains a relinker. 2. Downstream of NdeI site   There is an NdeI site at approximately 2.4 Kb downstream of the cloning region of pT3XI-2. pT88IQ In, this site was removed, resulting in a start codon The NdeI site is unique. This site changes from 5 '> CATATG> 3' to 5 '> CATATATG> 3'. Yes, the NdeI recognition sequence has been removed. 3. lacIq region   This region, containing the lacI region, between the two XhoI sites of pT3XI-2 is It has been replaced by the 1230 base sequence shown:             lacIq sequence of pT88IQ (1230bp) (SEQ ID NO: 8)   This replaced region contains the lacZ promoter and operator regions (lac The binding region of the lesser) is excluded. This region is also It contains a lacIq mutation that increases ssss synthesis (Muller-Hill et al., Ibid.).   Plasmid DNA was prepared from the various colonies obtained above and the insert DNA was sequenced. did. Various clones of the expected sequence were found, and expression tests revealed that Is expected to produce sCTLA-4 (approx. 14 kDa) recombinant protein of the expected size. Was called.   To increase the expression level,NdeI andKpnBy I, sCTLA- of clone 59-8-7 The 4 regions were excised, eluted from the agarose gel and isolated from the pT88IQ plasmid. Made. PCT Patent Publication No. WO 91/08285 (incorporated herein by reference) T7 promoter expression vector cleaved in the same manner as described in It was ligated into pT5T. This pT5T :: sCTLA4 construct was transformed into E. coli host strain HMS174 / DE3 (Brookh F. aven National Laboratory, Upton, NY. Obtained from Dr. William Studier ) Was inserted. This plasmid DNA was prepared from 3 colonies. This plasm Sequenced DNA to confirm that the correct sCTLA4 DNA sequence was inserted correctly. confirmed. One clone, 59-8-14, was used for expression and refolding studies. Was selected for the following, hereinafter referred to as pT5T :: sCTLA-4. All obtained in this study All CTLA4 cDNAs contain amino acid at position 111 of the protein sequence (SEQ ID NO: 2). It contains a threonine residue as an acid, but The lanine residue was not included. The result is that Linsley et al.J. ExP. Med.174: 561-56 9 (1991) corroborates the correct nucleotide sequence of human CTLA4.   Preliminary expression of the above sCTLA4 protein was obtained using HMS174 / DE3 containing pT5T :: sCTLA-4. OD in L broth containing μg / ml tetracycline600Incubate until 1.0 It was carried out by At this time, sCTLA-4 was expressed by isopropyl β-D thiol. Galactopyranoside (IPTG, Catalog # I-5502, Sigma Chemical Company, St. (Louis, MO) was added to a concentration of 1 mM for induction. 2 cells after induction Recovered in time. Small amount of whole cells contains 5% 2-mercaptoethanol Boil in SDS sample buffer for 2 minutes and mix with 14% polyacrylamide SDS gel. Run. The most major band of the gel visualized by staining with Coomassie blue is It was approximately 14 kDa sCTLA-4. Have different genes (interleukin-6) In control culture lysates prepared from HMS174 / DE3 containing pT5T , The above band did not exist.                               Example 2                         Large capacity production of sCTLA4   10 liter fermentation to provide sufficient amount of recombinant sCTLA4 for biochemical analysis went. E. coli strain HMS174 / DE3 containing plasmid pT5T :: sCTLA4 10L complex medium (40g / L NZ-Amine HD, 4g / L KH2POFour1 g / L MgSOFour-7H2O, 1g / L Na2SOFour, 0.3g / L Na3Quenoic acid-2H2O, 50g / L glycerol , 10 mg / L thiamine HCl, 2 ml / L trace mineral, 0.05 ml / L Mazu DF-204, and 15 mg / L Incubated at 37 ° C. in tetracycline). At this time, 0.24 g of IPTG was added to the culture. Cells were induced by adding (0.1 mM final concentration). 6 more cells Incubated for 5 hours and then harvested by centrifugation. Use this cell pellet until It was stored frozen at -20 ° C.                             Example 3                     Preparation of washed inclusion bodies (WIBS)   A 403 gram wet weight of E. coli cell pellet prepared according to Example 2 was Crushing buffer (25 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM dithiothrey) Diluted). The resulting slurry is Rannie mini-mi three times at a pressure of 10,000 PSI. Cells (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) to disrupt the cells. Crushed fine The cells were spun for 15 minutes at 5,000 rpm using a JA-10 rotor on a Beckman J2-20 centrifuge. It was The supernatant was decanted and discarded. Break loose pellets in disruption buffer The supernatant was decanted and resuspended in 10 minutes and spun again at 10,000 rpm for 60 minutes. Two Phase pellets were observed: the lower pellet was white and the loose upper pellet was The beige color was beige. The pellet was frozen at -20 ° C. Two pellets Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis of these samples By (SDS-PAGE) analysis, the majority of sCTLA-4 was present in the lower white pellet. , And the upper beige pellet is composed primarily of E. coli membrane proteins Was shown to be done.   To remove E. coli membrane proteins, thaw the frozen pellet of Example 2 and add Po 8000 using a lytron PT 3000 mixer (Kinematica AG, Littau, Switzerland) Resuspend in 1.5 liter of disruption buffer by homogenizing at rpm. It was This mixture was then spun in a JA-10 rotor at 8000 rpm (11,000 xg) for 30 minutes. I rolled it. The pellet was frozen at -20 ° C. The next day, thaw this pellet and 2.1 liters (by homogenizing at 5000 rpm using an olytron mixer) Was resuspended in the disruption buffer, and centrifuged at 8000 rpm as before. Container Decant to remove most of the remaining beige film layer and discard it It was The remaining pellet is referred to as washed inclusion bodies (WIBS). Wet inclusions after washing The weight was 92.5 grams. This is about 23% of the weight of the original E. coli cell pellet is there. Frozen at -20 ° C until using WIBS.                               Example 4           Refolding and in vitro activity of WIBS-derived sCTLA4   1 gram of WIBS was added to 60 ml of freshly made 6M guanidine HCl, 0.1M Tris pH 8 Using a Polytron mixer in a 0,6 mM dithiothreitol at 2000-3000 rpm. It was quickly homogenized and denatured by leaving it at room temperature for 15 minutes. JA-20 Law Insoluble debris into pellets by spinning for 15 minutes at 18,000 rpm did. 3.3 ml of 0.5 M glutathione was added to the supernatant and left at room temperature for 15 minutes. Less than Solution was subsequently added at room temperature with stirring:   1) 40 ml of 6M guanidine in 50 mM Tris-HCl, pH 9.7   2) 500 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 9.7   3) 6 ml of 0.5M cysteine   4) 6 ml of 100 mM phenylmethanesulfonyl fluoride       (In 100% ethanol)   The preferred concentration of guanidine-HCl in the refolding mixture is between 0.6M and 4M. It was measured to be.   The container containing the refolding mixture of sCTLA4 was left at 4 ° C for 2 days to allow sCTLA4 to Refolded into a conformation. At this time, add 50 ml of the refolding mixture. Removed and tested for biological activity. Before testing, refold mixture J2 -8,000 rpm in JA-20 rotor of 21-centrifuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) Centrifuge for 15 minutes at room temperature to remove any precipitate formed during the refolding procedure. I removed it. Then 25 ml of the supernatant was added to 4 liters of 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8. It was dialyzed against. 10 ml of a concentration of 300 ug / ml in 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8 Human serum albumin (HSA) was dialyzed in the same flask. HSA is ICN Pharmaceut icals, Inc. (Costa Mesa, CA, Catalog No. 823011). Refold after dialysis The refolding mixture and HSA solution were spun for 15 minutes at 8,000 rpm in a JA-20 rotor. The core was separated and the precipitated material was removed. Dialyzed sCTLA4 refolding mixture and HSA protein concentration measured to be 750ug / ml and 220ug / ml, respectively Was done.   The dialyzed sCTLA4 refolding mixture was used in live in vitro mixed lymphocyte reactions. Tested for physical activity (Methods in Immunology, pages 487-497, JS Ga rvey, N.N. E. Cremer, and D. H. Sussdorf, The Benjamin / Cummings Publish ing Company, Reading, MA, 1977). In this assay, two differences Mix the lymphocytes from the individual. Due to their antigenic differences, these parameters are The cells recognize each other as foreign substances. This opens the immune response that causes lymphocyte proliferation. Be started. The proliferative response of cells was determined according to the standard mixed lymphocyte reaction procedure described herein. Thus, the cells are pulsed with 3H-thymidine and measured.   Lymphocytes were analyzed using Sigma Diagnostics, St. Accuspin-Syste purchased from Louis, MO m Histopaque 1077 medium obtained from human subjects A and B, anticoagulated Blood (1/10 volume made in 0.9% saline solution without endotoxin) Treated with an amount of 3.8% sodium citrate). The following cell isolation procedure Was as described in the manufacturer's instructions accompanying this kit. individual Lymphocytes from B were treated with mitomycin C (Sigma Chemical Compan y, St. (Obtained from Louis, MO) for 30 minutes at 37 ° C. Add these cells to 10 ml of medium Mitomycin C was removed by washing 4 times with. Lymphocytes from each individual were cultured in complete medium (25mM HEPES buffer, 10% human AB serum, 2mM). RP containing M glutamine, 100 U / ml penicillin, and 100 ug / ml streptomycin 1 x 10 in MI 1640 medium)6Resuspended in / ml. When two lymphocyte populations are mixed Wells in 96-well tissue culture plate (Corning Glass Works, Corning, NY) 100 μl of each cell suspension was added per well. To measure proliferation of unstimulated lymphocytes The control wells used contained 200 μl of cells from a single individual. Transparent Complete aliquots of unfractionated sCTLA4 refolding mixture or HSA It was suspended in the medium at a concentration of 0.05 to 50 μg / ml. Mix a 50 μl aliquot of the suspension, The cell population was added to the appropriate wells. The sample was tested three times. 5 days at 37 ℃ After incubation, add 2 μCi in 50 μl complete medium to each well.3H-Chimeji (Dupont, catalog number NET-0272). After about 18 to 20 hours, the cells are Using a lu harvester onto a glass fiber filter strip (both Cambri (purchased from dge Technology, Inc., Watertown, MA). Cells with PBS 3 It was washed twice and the DNA was precipitated with 7% trichloroacetic acid. Remove the filter It was washed with tanol and air dried. Incorporated into DNA3H-thymidine, scintillation It was measured by the ion count. Average of triplicate wells for each test sample I calculated.   The results of this experiment are shown in Table 1. Data to DNA3Reduced uptake of H-thymidine SCTLA4 reactivation as measured by It is shown that the folding mixture causes a dose-dependent inhibition of lymphocyte proliferation. Observation The maximum inhibition achieved was 85% at a protein concentration of 10 ug / ml. Give 50% inhibition The protein concentration of the refolding mixture was about 100 ng / ml. HSA is similar Do not cause inhibition of cell proliferation, which allows the sCTLA4 refolding mixture to The inhibition observed was shown to be specific.                             Example 5         Purification and biological activity of sCTLA4 monomers and dimers A. Refining   300 ml of the refolding mixture prepared as described in Example 4 was treated with SPECTRO / POR 3 5700 ml of 20 mM T in a tube (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) It was dialyzed against ris-HCl pH 8.0 overnight at 4 ° C. A large amount of precipitate was observed after dialysis It was SDS-PAGE analysis revealed that the precipitate was predominantly E. coli membrane protein and was improperly refolded. It was shown to be composed of folded sCTLA-4. Dialysis refolding mix Articles were centrifuged in a JA-10 rotor at 8000 rpm for 15 minutes. 0.45 micron of supernatant Pass the filter (Nalge Company, Rochester, NY) to remove the remaining precipitate, Then, apply it to a 20 ml Q-Sepharose column (Pharmacia LKB, Picataway, NJ), It was washed with 50 mM guanidine, 20 mM Tris-HCl pH 8.0. Bound protein, 60 0 ml of 0-60% 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 8.0 linear salt gradient, Elution was performed at a flow rate of 5 ml / min. Although the monomeric form of sCTLA4 eluted at about 250 mM NaCl, (Peak A), the dimeric form of sCTLA4 eluted at about 350 mM NaCl (Peak B). A broad protein peak (peak C) eluting at about 450-600 mM NaCl also showed sCTLA4. Included. This peak is mainly disulfide bridged with sCTLA4 monomer. It was composed of several high molecular weight forms of sCTLA4 that appear to be present. this The substance aggregates May exhibit different sCTLA4 forms. Monomer and dimer forms of sCTLA4 were tested under non-reducing conditions Electrophores a sample of column fractions on a 14% polyacrylamide SDS gel under Confirmed by. Two to three dimeric forms of sCTLA4 in the 24-27 kDa molecular weight range Moved as a band. The monomeric form of sCTLA4 is in the 14-16 kDa molecular weight range. Migrated as 2-3 bands. Disulfide reducing agent (2-mercaptoethano SCTLA4, both dimeric and monomeric, in the presence of The amount migrated as a single band. These gel analyzes show that sCTLA4 dimer Including two sCTLA4 proteins covalently linked to each other by disulfide bonds It has been shown.   Column fractions containing sCTLA-4 peaks A, B, and C are pooled separately and agitated Cell concentrator and YM3 membrane (both from Amicon, Inc., Beverly, MA) ) Was used for concentration. Concentrate pools A and B to approximately 1.9 ml and pool C to approximately 2 Concentrated to 0.3 ml. The protein concentration in the concentrated pool was pool A and B. Was about 900 ug / ml and for Pool C was 1820 ug / ml. 1.5 ml Each enriched pool was added to a multiwell dialysis manifold (BRL, Gaither). 1 min for 2 liters of 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4. It was dialyzed at 4 ° C with 2.2 ml per volume. Aliquots of the concentrated and dialyzed pool are non-reduced S Tested on DS gel. Pool A contains most sCTLA4 monomer and a small amount of sCTLA4 dye Pool B contains most sCTLA4 dimer and a small amount of sCTLA4 mono Pool C; and pool C contains most of the sCTLA4 monomer but some (about 10 %) SCTLA4 dimer and a small amount of high molecular weight form of sCTLA-4 (probably trimmer , Tetramer, etc.) was also included. Five 200 μl of each pool Aliquots were frozen and stored at -70 ° C until used in the assay.   Pools of monomers and dimers from the Q-Sepharose column (respectively pooled) Aliquots (50 μl) of 250 mM NaCl, 20 mM sodium acetate Superdex-75 size separation column (3.2 × 300 mm; P harmacia LKB, Picataway, NJ). 50 μl column Elution was performed at a flow rate of / min. Monomer pool is the major peak with a molecular weight of 15-17 kDa (70% of total protein) and with minor molecular weights of 30-35 kDa. Eluate (30% of total protein). The dimer pool is 30-35kDa As the major peak with a molecular weight (70% of total protein) and between 15 and 17 kDa Eluted as a minor peak with molecular weight (30% of total protein). B. Hydrophobic interaction chromatography of CTLA4 dimers   60 μl of CTLA4 dimer pool (about 1.2 mg / ml) obtained from Q-Sepharose column , 20mM Tris-HCl, 2M NaCl, dilute to 500μl with pH 7.4, and add 20mM Tris-HCl in advance. Phenyl Sepharose (Hi Sub) equilibrated with 2M NaCl, pH 7.4 (Pharmacia / It was applied to a 1 ml column packed with LKB, Pictaway NJ). Tan 0-50% CH quality31.0 ml / min with a linear gradient of CN (and 2M-0M NaCl) Elution was carried out at a flow rate of 30 minutes. sCTLA4 dimer is about 27% CH3Symmetric with CN, 0.9M NaCl It was eluted as a specific peak. sCTLA4 monomer is about 30-35% CH3CN, 0.8M NaCl It eluted with a slight delay. C. Reverse phase purification of CTLA4   20 μl of Q-Sepharose monomer (Pool A) and dimer (Pool B) Recoat (H2Dilute to 200 μl with 0.05% TFA in O and pre-H20.05% TFA in O RP-1 reverse-phase column (SynChrom Inc.) equilibrated with C. Protein 0-100% CH3Elute in 100 μl / min for 30 min with a linear gradient of CN (0.05% TFA) It was The monomeric form of sCTLA4 is about 85% CH3Single peak at CN (about 95% purity) Was eluted. The dimer form of sCTLA4 is about 85-90% CH35 to 6 different types in CN Eluted as a peak.   The CTLA4 monomer and dimer obtained from the HPLC column were analyzed by Edman known to those skilled in the art. The sequence was determined by the digestion method. Amino obtained for monomers and dimers The terminal sequences were identical: AlaMetHisValAla (SEQ ID NO: 9). This sequence is N-terminal The amino-terminal sequence predicted for sCTLA4, except that there is no methionine residue in Fit the column. The absence of the N-terminal methionine residue means that this residue It is shown that it is efficiently cleaved from the sCTLA4 protein by a cess enzyme.                             Example 6         In vitro activity of recombinant sCTLA4 monomer and dimer   Q-Sepharo as described in Example 5 for biological activity in mixed lymphocyte reaction. Aliquots of pools A, B, and C obtained from Squam were tested (Example 4 Method described in. The lymphocytes used in this experiment were isolated from human subjects C and D It was Lymphocytes from subject D were treated with mitomycin C and described in Example 4. Washed like. Mixed lymphocyte cultures were prepared as described in Example 4. Human serum albumin (HSA) was used as a control protein. This experiment For HSA, 4 mg HSA in 60 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8), 250 mM NaCl, 37.5 mM Mix in anidine hydrochloric acid and mix with a stirred cell concentrator and YM3 membrane (both Amico n, Inc., Beverly, MA) by concentrating the sample to 1.97 ml. Prepared. 1.2 ml of this mixture was added to a multi-well dialysis manifold (BRL, Gaithe rsburg, MD) to 2 liters of 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4). Then, dialysis was performed. The final protein concentration of the HSA pool was 1100 ug / ml. set SCTLA4 (pool A (monomer), B (dimer), and C (slow monomer) Aliquot) or HSA was suspended in complete medium at a concentration of 0.05-50 ug / ml. 50 Aliquots of μl were added to wells of the appropriate mixed cell population. Repeat the sample 3 times Tested After incubating at 3 ° C for 5 days, add 2 uCi to each well.3H-chi 50 μl complete medium containing midine was added. After about 20 hours, as described in Example 4. In addition, cells were harvested and radiation incorporated into DNA by scintillation counting. Noh was measured. The results of this experiment are shown in Table 2.   Data proved by reduced radioactivity incorporated into DNA As such, each Q-sepharose containing recombinant CTLA4 (pools A, B, and C) The pool causes a dose-dependent inhibition of lymphocyte proliferation in the mixed lymphocyte reaction. I understand. No significant inhibition was seen with HSA. This results in inhibition of sCT It was shown to be specific to LA4. Pool B mainly contains CTLA4 dimer And pool A (mostly CTLA4 monomer) or pool C (mostly aggregated) CTLA4 monomer, dimer, and higher molecular weight forms) It was a reproduction response inhibitor. The dose of pool B that inhibited lymphocyte proliferation by 50% was The value was slightly lower than 10 ng / ml. This number makes Pool B too effective You may be evaluating. Used to calculate percent inhibition The counts per minute (cpm) of the non-mixed lymphocyte cell population are higher in the pool B sample Because it was larger than in the pool (see footnote in Table 2). Explain this In order to obtain the mean cpm of the unmixed cell population of the other protein pools, The data for Rule B was also calculated. These modified percent inhibitions are shown in brackets in Table 2. Show. Using the corrected value, the dose of pool B that inhibited lymphocyte proliferation by 50% was approximately 10 ng. / ml became. When pool B protein concentration is 1-10 ug / ml, lymphocyte proliferation is Essentially completely inhibited. Use of pools A and C that inhibited lymphocyte proliferation by 50% The amount was between 100 ng / ml and 1,000 ng / ml for Pool A and for Pool C Between 1000 ng / ml and 10,000 ng / ml. Like this, almost CTLA4 die The pool containing mer (Pool B) was mostly CTLA4 monomer or monomer. 10- to 100-fold more specific than pools containing aggregates (pools A and C) It had inhibitory activity.   Pools A, B, and C with lymphocytes obtained from human subjects E and F It was tested in a second mixed lymphocyte reaction experiment. The lymphocytes from individual F were used in Example 4 Treated with mitomycin C as described in. Other procedures for this experiment are described in Example 4 and as described in previous experiments. The results of this experiment are shown in Table 3.   As seen in previous experiments, pool B was pool A in inhibiting lymphocyte proliferation. And was more effective than C. Up to 73% inhibition in pool B in this experiment Met. lymphocytes The dose of pool B that inhibited growth by 50% was approximately 1 ug / ml. On the other hand, The dose of pools A and C that inhibited pamperocyte proliferation by 50% was approximately 10 ug / ml. HSA No significant inhibition of lymphocyte proliferation was observed in.   In this experiment, none of the recombinant sCTLA4 pools completely inhibited lymphocyte proliferation. There wasn't. There are several possible explanations for this. One explanation As a result, pool A, B, and C sCTLA4 proteins were inactivated during sample mixing. It can be considered to have been sexualized. Another explanation is that other than CTLA4 ligand It is considered that the costimulatory molecule B7 was expressed on the surface of the antigen-presenting cells of the subject. Can be It is known that there are costimulatory molecules different from B7 (Razi-Wolf et al. ,Proc. Nat'l Acad. Sci, (USA)89: 4210-4214 (1992); Liu et al.,Eur. J. Immunol., 22: 2855-2859 (1992). One subject has about four times the normal white blood cell count Have, which suggests that this subject has recently had an infection. It was Some of the white blood cells of this subject were consequently activated. There is a potential. The fact that this may be the case is that of the lymphocyte proliferation seen in this experiment. Stimulation is from two previous experiments (3-4 fold over levels seen in unmixed cells) Was also large (11-14 fold over levels seen in unmixed cells) It is suggested. The 73% inhibition observed in pool B was reached with sCTLA4 in this experiment. Assuming the highest degree of inhibition that could be made, 50% of this highest degree of inhibition was performed. For Pool B The amount was between 10 and 100 ng / ml. This was determined in the previous two experiments5 It is similar to the 0% inhibitory dose.                             Example 7                     Development of stable B7 expressing cell line   As an alternative to the mixed lymphocyte reaction, human T cell lines in the presence of PHA lectin and And stable transformation to express human B7 receptor protein in Chinese ham A novel bioassay to measure IL-2 production by the star ovary (CHO) cell line developed. This IL-2 bioassay has several advantages over mixed lymphocyte reactions Having. These advantages, while the IL-2 bioassay takes only a day and a half In contrast, the mixed lymphocyte reaction took 6-7 days and the IL-2 bioassay showed that Not sensitive to dotoxin, which can contaminate sCTLA4 preparations prepared from bacteria In contrast, the mixed lymphocyte reaction produces pseudo data in the presence of endotoxin, And the IL-2 assay uses cell lines rather than primary cells, which can compromise infection. This includes the fact that steepness is reduced and it is easier to obtain large numbers of cells for assay. Get caught To develop this bioassay, the human B7 cDNA was cloned and Clone it into a suitable vector for expression in cells, transform, And it is necessary to select CHO cells that express the B7 receptor protein. It was A. Cloning of human B7 cDNA   The B7 gene was cloned from the human Raji B cell line (ATCC No. CCL 86). Manufacture Micro-FastTrack mRNA Isolation Kit (Invitrogen, San (Diego, CA) using 3 × 10 5 mRNA6Isolated from Raji cells. cDNA Cycle Kit (Invitrogen, San Diego) was used to make 1/10 cDNA copies of the mRNA. B7 Oligonucleotide primers complementary to the 5'and 3'ends of the sequence, Pfu poly Melase (Stratagene, San Diego), and Gene Amp System 9600 Thermal Cy By PCR using cler (Perkin Elmer Cetus, CA), 1/5 of Raji cDNA was isolated from B7 clone. Amplified the gene.   The following oligonucleotide primers were used: B7 (5'P) 32: 5'CCC AAG CTT TCA CTT TTG ACC CTA AGC ATCTG  3 '(sequence number Issue: 10) B7 (3'P) 36: 5'CCC TCT AGATTA TAC AGG GCG TAC ACT TTC CCT TCT-3 '( (SEQ ID NO: 11) (Underline is added to the overlapping part with B7 array)   The PCR reaction mixture was 20 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM KCl, 6 mM (NHFour)2SOFour, 1.5 mM  MgCl2, 0.1% Triton X-100, 200 μM each dATP, dCTP, dGTP, and TTP, 20 pm each ol primer oligo, 4 μl Raji cDNA, and 0.5 μl (1.25 u) Pfu polymer It contained the enzyme (total volume = 50 μl). PCR conditions (95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, And 72 ° C for 1 min) for 30 cycles, then 72 ° C for 10 min incubation Was done. 4 after the PCR is complete Add 5 μl of the reaction mixture to a spin column (ChromaSpin-100, ClonTech). , Palo Alto, CA), then digested 20 μl with XbaI and HindIII, and Electrophoresed on a 0.8% agarose gel. Elute the band at approximately 0.9 kb, and Plasmid pRc / CMV (Invit, digested with the same restriction enzymes and gel purified in the same way rogen, San Diego, CA). The ligation mixture,E. coliStock TOP10F '(Invitr ogen, San Diego, CA). 50 μg / ml ampicillin Insert the selected colonies on Luria Broth agar plates containing And a single construct such as The inserted gene from Escherichia coli was used to confirm that it has the expected sequence. The entire strand was fully sequenced. This plasmid clone was named B7-5 It was B. Preparation of stable B7 expressing cell line   Use Chinese hamster ovary cells (CHO-K1, ATCC No .: CCL 61) for DMEM and And penicillin, streptomycin, glutamine, proline (20 μg / ml), And grown in 10% fetal bovine serum. 400 μg / ml antibiotic G by titration experiment 418 (gentamicin sulfate, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) kills CHO cells Decided to be enough. The pRc / CMV vector used to express the B7 gene. Is an aminoglycoside phosphotransferase gene conferring resistance to G418. Including children. The B7-5 plasmid used to transfect CHO cells was transformed with Qiagen mini- Prepared using the prep procedure (Qiagen, Chatsworth, CA), where 50 μg / ml A 19.2 ml culture grown overnight in Luria Broth with ampicillin had approximately 1256 120 μl of μg / ml plasmid DNA was produced. Invitrogen according to the manufacturer's instructions CHO cells by the calcium phosphate precipitation method using a kit manufactured by (San Diego, CA) Were transfected. On the 4th day after transfection, the medium and G418 were added. The medium was replaced with a new medium containing 400 μg / ml. 19 days after transfection In addition, G418 resistant cells were subjected to limiting dilution in order to select individual resistant cells. 6 individual Colonies were isolated and a second limiting dilution was performed. One for each Were selected for growth. Cell lines named F9, C11, G10, E12, C12, and H9 I did. C. FACS screening of transformed B7-CHO cell line   Determining whether 6 G418 resistant cell lines express B7 on the cell surface To screen for anti-human B7 monoclonal antibody. For each cell line Confluent T-75 flask containing calcium and magnesium Wash twice with 10 ml PBS, and add 10 mM EDTA for calcium and magnesi It was exposed to 10 ml of PBS without um for 10 minutes at room temperature. Pinch up and down several times to loosen the cells. After petting, transfer the detached cells to a 15 ml conical centrifuge tube and use GS-6R. Te 1000 rpm using a Bulltop centrifuge (Beckman instruments, Houston, TX) It was centrifuged at. 120 microliters of ice-cold FACS medium (2% (v / v) fetal bovine RPMI 1640 medium containing baby serum and 0.1% sodium azide (Biowhittaker , Walkersville, MD, Catalog No. 12-115B)). Cell density About 2 x 10 per 1 ml7It was an individual. Fifty microliters of each cell line on ice Dilute 1: 1000 in the above 1.5 ml microfuge tube Anti-human B7 monoclonal antibody (Becton Dickinson, San Jose, CA, Catalog No. 550024) or control mouse IgGl monoclonal antibody (Becton Dic 50 microliters of FACS medium containing kinson, San Jose, CA, Catalog No. 550029) Mixed with le. Incubate cells with antibody for 55 min on ice, -Fill the tube with FACS medium, then 300x in a microfuge tube. Centrifuge at 5 g for 5 minutes. Supernatant was removed by inhalation and F diluted 1:25 ITC-labeled polyclonal goat anti-mouse antiserum (Becton Dickinson, San Jose, C A, Catalog No. 349031) in 100 microliters of ice-cold FACS medium The cells were resuspended. Incubate the mixture on ice for 55 minutes and chill the tube on ice. Filled with FACS medium, and in a microfuge tube at 300 xg for 5 minutes It was centrifuged. The supernatant was aspirated and the cells were resuspended in 500 microliters of ice-cold FACS medium. Resuspend in a bottle. Make labeled cells positive for fluorescence using a flow cytometer I analyzed it. This Cell lines F9, C12 and H9 were positive for the expression of B7 using sei. D. IL-2 production bioassay   PHA-L Lectin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Catalog No. L-41 F9, C12 and H9 cell lines in the presence of CD28-positive human Jurkat T cell line (ATCC No. CRL 1863) and whether they induce IL-2 production by Jurkat cells Decided. 1 x 10 in each well of a 96-well tissue culture plateFiveJurka pieces t cells and 5 x 10FourF9, C12, H9 or parental CHO cells were added. Of control Wells contained only Jurkat cells. Add PHA to each well to give a final concentration of 10 μg / ml. The final volume per well was 250 μl. Cells and chemicals IL-2 assay medium (25 mM HEPES buffer, penicillin, streptomycin 1640 medium (Biowhittaker containing 10% fetal bovine serum, glutamine, and 10% fetal bovine serum) , Walkersville, MD, Catalog No. 12-115B)). F9, C12, H9 and And parental CHO cells containing 10 mM EDTA and no calcium and magnesium Detached from their culture dishes by incubating in Dulbecco's PBS . Detached cells in IL-2 assay medium before counting and plating. Washed several times. Assays were performed in triplicate. After mixing well, plate Incubated at 37 ° C for approximately 20-24 hours in a quasi-tissue culture incubator . Then The liquid in each well was mixed by pipetting, and 100 μl was added to the IL-2 ELISA assay. Transfer to new well of essay plate (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) It was Use the IL-2 assay medium as a blank for the procedure used in the ELISA assay. Others were provided by the manufacturer. Optical density of wells in micro Plate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA) 450nm ~ It was measured at 570 nm. Optical density reflects the amount of IL-2 in the sample. Triplicate Calculate the mean optical density of the wells and use the IL-2 standard curve to calculate Converted to. The results show that B7-CHO cell line, F9, C12 and H9 cells each had 360pg It was shown to induce the production of IL-2 at / ml, 300 pg / ml and 150 pg / ml. Parental cell Untransfected CHO cells induced 20 pg / ml IL-2. Jurkat cells Alone produced 20 pg / ml of IL-2. These results show that the F9, C12 and H9 cell lines It was shown that Jurkat T cells can induce the production of IL-2. Further assays The C12 cell line was selected for the development of Control experiment background It is shown that PHA is required to induce IL-2 production above normal levels. did. Titration experiments were performed to increase the number of C12 cells per well in the bioassay. In addition, it was shown that the production of IL-2 increased in a dose-dependent manner. The response is not linear But more logarithmic. Used to measure the biological activity of sCTLA4 preparations The standard IL-2 production assay was 1 well per well in the above bioassay. 2. 5 x 10FourC12 cells, 1x10FiveJurkat cells and 10 μl / ml PHA are used . CTLA4 binds to and neutralizes B7 on C12 cells, so CTLA4 was tested as a test sample. IL-2 produced less IL-2, which reduced the optical density of the test wells. Measured by the minority.                               Example 8         Identification and purification of the properly refolded sCTLA4 dimer   As described in Example 5, most sCTLA4 refolders have 24-27 kDa. Including multiple (typically at least 3) dimeric forms in the molecular weight range of this The dimer species are described by SDS-PAGE (14% non-reducing SDS gel) and in Example 8B. Can be resolved by reverse phase chromatography using RP-4 column as listed . Different dimeric forms differ in their biological activity in the IL-2 production assay. Only one of the dimeric forms can significantly inhibit IL-2 production in this assay It The dimeric form with this remarkable specific activity is probably properly folded However, the low activity dimeric form is probably misfolded. This Different dimer types of can be separated from each other using a sizing column. This most The active dimer species was either a column or column as described in Example 8D and Table 6 below. Elutes last (smaller apparent molecular weight). "Active" and "low activity" The "sex" dimer species were separated from each other as described in the Examples below. Refold The active and low activity dimeric forms obtained using only procedure 2 (described below) are Mono Q, using a Source 15Q ion exchange column or phenyl-Sepharose hydrophobic They could be separated from each other by using a sexual interaction column. A. Refolding procedure 1   2000 g of newly prepared 6 M guanidine HCl, 0.1 M Tris pH 8.0, 30 g of WIBS mMtron DTT, polytron PT 3000 (Brinkman Instruments, Lucerne, Switzerland) It was dissolved with and left at room temperature for 15 minutes. This solution is then placed in a JA-10 rotor 1 Centrifuge at 0,000 rpm for 30 minutes and discard the pellet. 0.5 ml of 110 ml in this supernatant M glutathione (oxidized) was added. Leave this solution at room temperature for 15 to 30 minutes , Then 0.44 M guanidine in 18 liters 50 mM Tris pH 9.7 with gentle agitation Slowly added to HCl. Then 200 ml of 0.5 M cysteine and 200 ml of 100 mM cysteine were added. Phenylmethylsulfonyl fluoride (in ethanol) was added. This refold The mixture was left at 4 ° C. for 6 days without stirring. At this point, add this mixture to S10Y3 Spiral Ultrafiltration Cartridge (Amicon, Beverly, MA) Concentrate to approximately 1 liter with a Spectra / Por 3 tube (Spectrum Medical I ndustries, Houston, TX) 2 to 3 days for 19 volumes of 20 mM Tris pH 8.0 I dialyzed for a while. A large amount of precipitate was centrifuged in a JA-10 rotor at 10,000 rpm for 15 minutes. Removed. Remove the remaining precipitate by passing the supernatant through a 0.45 μm filter did. 300 ml of Q-Sepharose (Fast Flow; Pharmacia, Piscatawa) was added to the supernatant. y, N.J.) column at 10 ml / min. Protein at 20 ml Tris pH8 at 10 ml / min The column was eluted with a 0% to 60% gradient of 1M NaCl in 0.0. Aliquots (25 μl) of each fraction in the 30% to 40% area (approximately 300 mM to 400 mM NaCl) Was electrophoresed on a non-reducing 14% SDS gel. Coomassie Bull-when stained with R250 , The active dimer species can be identified as a very sharp band, but it remains inactive. Or less active dimer species (“less active dimers”) are more prevalent. This distinction Is readily apparent. This low activity dimer species typically contains 14% non-reducing SDS. It has an apparent molecular weight slightly higher than the active dimer on the gel. 1 low activity die The mer species often co-migrate with the active dimer species on the SDS gel. This low activity da Immer species can be distinguished from active dimer species using the sizing column described below. Live The Q-Sepharose column fractions containing the sex-dimer species are pooled, and the Amicon stirred sepa It was concentrated to about 40 ml using a YM-10 membrane (Amicon, Beverly, MA) in solution. This concentrated activity Sex dimer pool at 26 ml / min in a buffer of 250 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5. Passed through a 7 liter, 85 cm Sephacryl S-100 (Pharmacia) column. Main tamper Quality peak (protein is fraction A)280Detected by measuring the absorbance at nm Aliquots (25 μl) of each fraction over 14% non-reduced SDS gel as described above. Electrophoresed on a gel. Active dimer species elute later than inactive dimer species . This sizing column process is done with most other contaminating proteins and most Remove any low activity dimer species. Fractions containing theoretically pure active dimer And use YM-10 membrane (Amicon Inc., Beverly, MA) in an Amicon stirred cell. And concentrated to about 10 ml. Tampa The protein concentration was used as the protein standard (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Lowry protein assay kit (“DC protein assay”) , Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)). B. Refolding procedure 2   Substantially more active CTLA4 dimers are possible by modifying the refolding procedure. It has been found that it can be recovered from the refolding mixture. The refolding procedure 2 is Improved yielding substantially more active CTLA4 dimer per gram of starting WIBS Refolding procedure. Oxidized glutathione and cysteine are typically Included in the mixture used to refold recombinant proteins of bacterial origin And removing it from the refolding mixture results in significant cost savings . Oxidized glutathione and cysteine are correct refolds of the active CTLA4 dimer It seems to disturb you. Oxidized glutathione and / or cysteine are associated with CTLA4 Binds to cysteine residues and refolds proteins and / or It is believed to interfere with sulfide bond formation. In refolding procedure 2, WIBS In addition to the DTT used to initially reduce the Do not add to the folding mixture. Below is a typical refolding starting with 30g WIBS Is shown.   30 g of WIBs was added to 600 ml of newly prepared 6M guanidine HCl, 50 mM Tris pH8.5, p olytron PT 3000 (Brinkman Instruments) Was used to dissolve and then slowly stirred at room temperature for 30 minutes. 7.2 ml of 0.5M DTT ( Final DTT concentration = 6 mM) was added and the solution was slowly stirred at room temperature for 1 hour. . This solution was then centrifuged in a JA-10 rotor at 10,000 rpm for 30 minutes, and The pellet was discarded. This supernatant was mixed with 343.9 g of guanidine HCl, 10.9 g of Tris-HCl, and And 10.6 liters of guani containing 60.6 g of Tris base dissolved in 11.4 liters of water. Slowly added to the gin / Tris solution. Leave this refolding mixture at 4 ° C for 3 days did. This solution was then subjected to SA-1 flow centrifuge (Westf alia, Oeldo, Germany) at 200 ml / min, 14 psi, followed by 2 liters of 0. Followed with 6M guanidine HCl, 50 mM Tris pH 9.5 at 4 ° C. Spiral supernatant Lutra filtration cartridge (S10Y3, Amicon Inc., Beverly, MA) Concentrate to approximately 1 to 2 liters using a Spectra / Por3 tube (Spectrum Medical Industries, Houston, TX) 19 liters of 20 mM Tris p It was dialyzed against H7.5 at 4 ° C. for 1 day. Change dialysis buffer (same solution and same Dialysis) and continued for another day at 4 ° C. JA-1 It was removed by centrifugation for 15 minutes at 10,000 rpm in a 0 rotor. Remaining sediment Was removed by passing the supernatant through a 0.45 μm filter. 50 ml of this solution Source 15Q (Pharmacia) column at 10 ml / min. 10 ml / min of protein Elute from the column using a 0% to 60% gradient of 1M NaCl in 20 mM Tris pH 8.0. It was Main protein eluted at about 300 mM NaCl An aliquot (10 μl) of each fraction from the peak was electrophoresed on a non-reducing 14% SDS gel. It was "Active" dimers are very crisp when stained with Coomassie Blue R250 Band of the “low activity” dimer is more widespread. It This distinction is readily apparent. Refolding, as opposed to refolding procedure 1 The low-activity dimer formed using the procedure 2 is the active dimer on a 14% non-reducing SDS gel. It typically has a lower apparent molecular weight than the mer species. Fraction containing active dimer Pool and concentrate using a YM-10 membrane (Amicon) in a stirred cell to a volume of approximately 40 ml. did. This concentrated active dimer pool was added to 250 mM NaCl, 20 mM sodium acetate pH 5.5. 7 liters at 26 ml / min at 85 cm Sephacryl S-100 (Pharmacia) column . Main protein peak (A280Fractions over (detected by absorbance at nm) Aliquots (10 μl) were electrophoresed on 14% non-reducing SDS gels as described above. Live The sex dimer elutes later than the less active dimer. This sizing column process Removes most other contaminating proteins and most active dimers. Fractions containing predominantly active dimer were pooled, and the YM-10 membrane (Ami con Inc., Beverly, MA). Protein concentration Lowry protein using IgG (Bio-Rad Laboratories) as a protein standard Quality Assay Kit ("DC Protein Assay", Bio-Rad Laboratories, Richmo nd, CA).   This active dye obtained by the above procedure was analyzed by reverse phase HPLC. The characteristics of the Ma species were further investigated. Aliquot of purified active CTLA4 dimer (50 μl -100 μl) to 500 μl with buffer A (0.05% trifluoroacetic acid “TFA”) , And reverse phase column (RP-4, 1 × 250 mm, Synchrom, Lafayette, IN), Then, with 100% acetonitrile, 0.042% TFA (buffer B), a linear gradient (2.6% Buffer B / min increase) was used to elute at a flow rate of 0.25 ml / min. Refold correctly Folded active CTLA4 dimer eluted as a symmetrical peak at 27.8 minutes.   Table 4 was obtained from several refolding experiments using Procedure 1 and Procedure 2. Compare the yields of good dimers. Obtained using step 1 It is clear from the table that 4-5 times more active dimer was obtained from procedure 2. . C. Refolding procedure 3   In refolding procedure 3, 0.4 g of WIBS was added to 8 ml of 6M guanidine, 50 mM Tris-HCl p. Dissolved in H8.5. Reconstitute 4 ml of this solution by adding DTT to a final concentration of 6 mM. Originally. 2 ml of this solution was diluted 10 times to 20 ml with 50 mM Tris-HCl pH 9.5. This The anidine concentration was maintained at 1M. The final DTT concentration was 0.6 mM. Protein 3 Refolded at 4 ° C for days. After dialysis against 20 mM Tris-HCl, pH8, this protein The quality of the Mono-Q column (Pharmacia HR5 / 5 column) in a buffer of 20 mM Tris-HCl, pH8. ) The protein was loaded onto a linear gradient of 0-600 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl pH8 at 1 ml / min (10 mM (M NaCl / min increase). This column profile is in fractions 32 and 33. The major protein peak eluting, followed by the smaller broad band eluting in fractions 34-37. A protein peak. SDS-PAGE analysis shows major proteins in fractions 32 and 33 Shows that the species co-migrated with the active dimer species obtained using the refolding procedure 1. . Fractions 34 to 37 contained at least 3 dimeric species. One of them , (Less component) co-migrated with the active dimer species on the SDS gel. The other two dimers -The species migrated slightly faster than the active dimer species (ie the lower apparent molecule amount). Fractions 35 and 36 were rich in these faster migrating dimer species. Th Fractions 32 and 33 were combined to determine which of the dimeric species had maximum activity. And fractions 35 and 36 were combined. 2 pools of IL-2 producing bioasset Tested in Lee. Protein concentration using bovine serum albumin as standard , Bradford assay. Use of bovine serum albumin as a standard For use in protein, which is about half the concentration obtained when IgG is used as a standard substance. The concentration was recovered. The results (Table 5) show that pools of fractions 32 and 33 contained approximately 100 ng / ml. I c50Shows that it had the maximum inhibitory activity. This uses the refolding procedure 1 IC of purified active CTLA4 dimer species50Is equivalent to Pools for fractions 35 and 36 Shows almost non-titratable inhibitory activity and IC greater than 3 ug / ml50Had .   The major proteins of fractions 32 and 33 are the major proteins obtained using refolding procedure 2. Molecular weight (by SDS-PAGE) and physical characteristics of major protein in protein peak (Ion exchange column elution time) is similar. Low activity dye in fractions 35 and 36 Mer species are improperly folded dimer species obtained using the refolding procedure 2. If not identical, then they are similar. D. Separation of active and low activity dimer species on a sizing column   In the RF-KC experiment, CTLA4 was refolded as outlined in Refolding Procedure 1, The dimer was essentially purified from the Q-Sepharose column. At least 3 da Immer species could be identified by non-reducing SDS-PAGE. The correct or most active dimer The species constituted the minority total dimer species in this experiment. Including major dimer species Fractions (fractions 89-109) were pooled, concentrated to 222 ml and refolded as described in step 1. Loaded on S-100 sizing column as listed. CTLA4 dimer is the main protein Quality peak (including fractions 33-41) followed by a small shoulder peak (including fractions 42-54) ). Non-reducing SDS-PAGE analysis showed significant amounts of low activity dimer species ( This shoulder contains at least 50% of the total protein in the shoulder peak. -The peak was shown to be rich in active dimer species. The main protein peak is It contained multiple dimer species, which were primarily low activity dimer species. Main protein pea Ku contained almost no active dimer species. Main protein peak (fractions 33-41 ) Was pooled (referred to as pool A) and tested for activity in the IL-2 production bioassay. I got it. Similarly, the shoulder peaks (fractions 42-54) are pooled (called pool B). ), Tested for activity in a bioassay. This result (Table 6) shows that only Pool B It was shown to have significant inhibitory activity. Pool A IC50Is larger than 10ug / ml Taga pool IC of B50Was 120-370 ng / ml. To further purify the active dimer species, Pool B (fractions 42-54) was pooled, concentrated to 40 ml and re-applied to the S-100 column. I hung it Fractions were not collected until 1750 ml of buffer had passed through the column. Collection of 25 ml fractions was then started. CTLA4 dimer has two overlapping tampers Eluted as a protein peak: a peak that elutes early containing multiple dimer species ( Fractions 28 to 35) and a late eluting peak enriched in a single dimer species (fraction 36 To 44). Pool from two protein peaks, fractions 28-35 (Pool B-1) And fractions 36-41 (Pool B-2) were prepared and in an IL-2 production bioassay Tested This result (Table 6) shows that the peak (Pool B-2) eluted late , IC between 120 and 370 ng / ml50Is most active; Peak (Pool B-1) is about 10 μg / ml IC50Have very low activity showed that. E. FIG. Additional purification of refolded CTLA4   Refolding procedure 8B C except that purification was achieved using only an ion exchange column. CTLA4 Da substantially prepared according to Rum Immersion pool pre-buffered with 20 mM Tris, pH 7.4, 250 mM NaCl for hydrophobic interactions Column (HIC) (Phenyl-Sepharose, 5mm x 5cm, Pharmacia, Piscataway , NJ). This binding protein was loaded in 30 column volumes with 20 mM Tris, pH7.4, 50% acetonitrile (CH3(CN) with a linear gradient at a flow rate of 1 ml / min. CT LA4 eluted as two peaks: 15% CH3Main peak eluted at CN, and 25% CH3A small peak eluted at CN. SDS-PAGE analysis shows that the main peak refolds correctly Corresponds to the active, folded CTLA4 dimer with smaller peaks and lower relative molecular weight Shows Correspondence to an Improperly Folded Low-Activity CTLA4 Dimer Species that Moves in It was                             Example 9               Bioassay of different purified CTLA4 preparations   The CTLA4 active dimer purified using refolding procedure 1 was transformed into the IL-2 producing Assays were used to assay for activity. IL-2 assay for CTLA4 protein Dilute to desired concentration with medium and add B7 in the presence of 10 μg / ml PHA.+-CHO cells ( C12 cells) 2.5 x 10FourAnd Jurkat cells 1 x 10FiveMixed with tissue culture incubator Incubated at 37 ° C in beta for about 24 hours. Add each protein dilution to 96 Assay using 3 wells of tissue culture plate (Corning, Corning, NY) did. Jurkat cell half PHA was used as a control. Well IL-2 concentrate The degree is measured using the IL-2 ELISA kit as described above. Decided The optical density of the wells is proportional to the amount of IL-2 in the wells. Ie optical Higher density indicates higher IL-2 levels. ICs of different CTLA4 dimer preparationsFive 0 (Concentration at which half maximal inhibition of IL-2 production is observed) is approximately 1 using this assay. It was in the range of 00 to 300 ng / ml (Table 7).   The active CTLA4 dimer prepared using refolding procedure 2 was used for IL-2 production biotechnology. Similar IC in assay50showed that.                             Example 10             Recombinant sCTLA4 inhibits cell damage in animals   Tiegs et al. (Journal of Clinical Investigation90Vol. 196, 1992) T cell-dependent liver loss in mice that can be induced by Navarin A (Con A) Describe the wound model. Con-A induced liver damage can be detected within 8 hours and the presence of Con A It results from polyclonal activation of T cells by resident macrophages. Liver damage Is a specific liver containing serum glutamate pyruvate transaminase (SGPT) It is measured by the release of visceral enzymes into the bloodstream. In vivo activity of sCTLA4 in this model Was evaluated. CTLA4 protein was prepared using refolding procedure 1 It was included in the refolded RF-16, RF-17, RF-19 and RF-KC pools (Table 7). . 18-20 g female Balb / C mice were purchased from Charles River. To the mouse, Con-A (Type V, Catalog No. C-7275; Sigma Chemical Company, St. Louis, Missou ri) was injected intravenously (15 mg / kg) at 0 hours and lived at -2, 0, 2, 4, and 6 hours. Physiological saline or 0.3, 3 or 30 mg / kg CTLA4 was injected subcutaneously. Mau at 8th hour The serum levels of SGPT and Ektachem 700 analyzer (Kodak, Roche ster, N.Y.). SGPT serum levels of individual mice are shown in Table 8. .   Mice that received 3 or 30 mg / kg CTLA4 per injection showed that SGPT levels were consistent. Is significantly reduced, and liver damage is lower than that of the control treated with Con-A alone. It shows less (p <0.05). Perform an analysis of variance using Dunnett's multiple comparisons Test differences between groups receiving saline and different doses of CTLA4 It was carried out for the purpose.                             Example 11                         PEGylation of wild-type CTLA4 A. PEGylation using NHS-PEG reagent   CTLA4 has two lysine residues per monomer. Soluble CTLA4 is NHS-5K-P It can be effectively PEGylated using EG reagent, which is free at the lysine residue. Reacts preferentially with free amines such as Prepared according to Example 8E Activated CTLA4 dimer with 3000 Da molecular weight cutoff (MWCO) membrane (YM3, Amicon) Concentrated to 1.5-4.0 mg / ml using a stirred pressure cell (Amicon, 50 ml) containing. Refold The refolded soluble CTLA4 was treated with 5,000 kDa NHS-ester polyethylene glycol. (5K-NHS-PEG). The final reaction mixture was 675 mg / ml, (28 mM) CTLA4, 9 mM TRIS, 55 mM sodium phosphate, pH 7.0, 396 mg / ml, (84 mM) 5K-NHS-PEG, 112 It contained mM NaCl. The PEG: CTLA4 molar ratio was 3: 1. Reaction is 5-6 hours at room temperature I did it for a while. The reaction mixture was stored at 4 ° C. SDS-PAGE analysis (non-reducing conditions) The PEGylated product was transferred to positions with relative molecular weights of 46,000 Da and 65,000 Da, respectively. It was shown to consist of a moving main product and by-products. CTLA4 starting material whole The conversion rate (percent) was about 50-60%. B. Isolation of lysine-PEGylated product   The reaction mixture containing the PEGylated product was added to an equal volume of 20 mM TRIS, pH 8.0 (buffer C ), Anion exchange column (Resource Q, 5 mm x 50 mm, capacity = 1.0 ml, Pharmacia, Piscataway, NJ). Combined Linear gradient of protein (and unreacted PEG) to 0.5M NaCl at a flow rate of 1.0 ml / min (20 column volumes) was eluted. Fractions of 0.5 ml were collected. PEGylated by-product (SDS- Migrating to the 65000 Da position on the PAGE) elutes in fractions 9 and 10 at approximately 0.3M NaCl. did. The PEGylated main product (moved to the position of 46000 Da on SDS-PAGE) was about 0.35M NaC. It eluted in fractions 11 and 12 at l. Unreacted PEG and unreacted CTLA4 dimer are approximately 0 Eluted into fractions 14 and 15 with .4M NaCl. C. Analysis of PEGylated products   Aliquots of both PEGylated major product and PEGylated byproduct, and unreacted CTLA4 Dimers were analyzed by SDS-PAGE under both non-reducing and reducing conditions . Reduction of unreacted CTLA4 dimer is a monomer that moves to the position of relative molecular weight 12000 Da. - occured. PEGylated main product (relative molecular weight position of about 46,000 Da by non-reducing SDS-PAGE To the molecular weight positions of about 12000 Da and 18000 Da, respectively. Both the migrating non-PEGylated monomer and the PEGylated product were produced in a 1: 1 molar ratio. This means that the PEGylated main product (46,000 Da) is a monoPEGylated dimer, ie Only one of the monomer subunits is PEGylated and contains a single PEG molecule. Show. The species that migrates to the 18000 Da position after reduction is the monoPEGylated monomer. PEG Of by-products (moved to the position of relative molecular weight of 65,000 Da by non-reducing SDS-PAGE) The reduction yields one major product, the PEGylated product, which migrates to the 18000 Da position. It was This 18,000 Da PEGylated product is a mono PEGylated monomer The product is shown to be a doubly PEGylated CTLA4 dimer. PEG in this double Reduction of PEGylated species did not yield significant amounts of non-PEGylated monomer, so each CTLA4 mono The mer contains a single PEGylated lysine residue. A small amount, move to the 46000 Da position Both the PEGylated product and the non-PEGylated monomer of 65,000 Da Detected after reduction. These are high MW (67000 Da) mixed with a small amount of 65,000 Da product.  Product (above Da)). D. Biological activity of PEGylated products   Fractions 9 and 10 from Example 11B (double PEGylated dimer), fractions 11 and 12 (MonoPEGylated dimer) and fractions 14 and 15 The (unreacted dimer) was pooled separately, concentrated and the IL-2 product described in Example 7 was produced. Assayed for activity in the live bioassay. The results shown in Table 9 are PEGylated CTLA4 is an IC of non-PEGylated CTLA450IC about 3-4 times larger than50Had And (400 ng / ml vs. 100 ng / ml). IC for diPEGylated CTLA450Non-PEGylated CTLA4 It was about 6 times larger than that.   The foregoing description of the invention is exemplary for purposes of illustration and description. The present invention It is understood that various modifications can be made without departing from the idea and scope of Should be. Accordingly, the following claims are intended to cover all such modifications. Is intended to be interpreted.                             Sequence listing (1) General information:   (i) Applicant: Cox, George, etc.   (ii) Title of the invention: Recombinant CTLA4 polypeptide and method for producing the same   (iii) Number of sequences: 9   (iv) Contact address:     (A) Addressee: Synagen, Inc.     (B) Address: 1885 33 Rd Street     (C) City: Boulder     (D) State: Colorado     (E) Country: United States     (F) Zip code: 80301   (v) Computer readout form:     (A) Medium type: Floppy disk, 3.5 inch, 360Kb     (B) Computer: For IBM compatibility     (C) Operating system: MS-DOS     (D) Software: ASCII   (vi) Current application data: None   (vii) Priority claim application data: None     (A) Application number:     (B) Application date:   (viii) Agent / Office Information:     (A) Name: Teresa, Brown A.     (B) Registration number: 32,547     (C) Inquiry / record number: SYNE-275PCT   (ix) Telephone line information:     (A) Telephone: (303) 541-1372     (B) Telefax: (303) 541-1370 (2) SEQ ID NO: 1 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 384 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 1: (3) SEQ ID NO: 2 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 125 amino acids     (B) type: amino acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 2: (4) SEQ ID NO: 3 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 32 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 3: (5) SEQ ID NO: 4 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 45 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 4: (6) SEQ ID NO: 5 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 33 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 5: (7) SEQ ID NO: 6 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 37 base pairs     (B) type: nucleic acid     (C) Number of chains: double-stranded     (D) Tobology: linear (10) SEQ ID NO: 9 information:   (i) Features of the array:     (A) Length: 5 amino acids     (B) type: amino acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (xi) Sequence: SEQ ID NO: 9:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C12N 1/21 8828-4B C12P 21/02 C 9282-4B (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, LK, LU, LV, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（a）配列番号：２のアミノ酸配列、またはＮ末端にメチオニンを有する 配列番号：２のアミノ酸配列から本質的になる少なくとも１種の組換え的に生産 されたモノマー、または（b）該モノマーの機能的誘導体、 を含有するCTLA4ポリペプチドであって、B7に結合し得る、CTLA4ポリペプチド 。 ２．前記モノマーが、配列番号：２のアミノ酸配列から本質的になる、請求項 １に記載のCTLA4ポリペプチド。 ３．前記モノマーが、Ｎ末端メチオニンを有する配列番号：２のアミノ酸配列 から本質的になる、請求項１に記載のCTLA4ポリペプチド。 ４．前記機能的誘導体が、少なくとも１つの遊離のシステインを有するCTLA4 突然変異タンパク質を包含する、請求項１に記載のCTLA4ポリペプチド。 ５．ポリエチレングルコール（PEG）分子が、前記CTLA4ポリペプチドに結合し た、請求項１に記載のCTLA4ポリペプチド。 ６．前記ポリペプチドがモノマーである、請求項１に記載のCTLA4ポリペプチ ド。 ７．前記ポリペプチドがマルチマーである、請求項１に記載のCTLA4ポリペプ チド。 ８．前記ポリペプチドがダイマーである、請求項１に記載のCTLA4ポリペプチ ド。 ９．前記ダイマーが、PEG分子により架橋された２つのCTL A4ポリペプチドモノマーを含有する、請求項８に記載のCTLA4ポリペプチド。 １０．前記ダイマーが、ジスルフィド結合により結合した２つのCTLA4ポリペ プチドモノマーを含有する、請求項８に記載のCTLA4ポリペプチド。 １１．前記ポリペプチドが、原核生物宿主細胞中で組換え的に生産される、請 求項１に記載のCTLA4ポリペプチド。 １２．請求項１に記載のCTLA4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列か ら本質的になるベクター。 １３．前記ヌクレオチド配列が、CTLA4ポリペプチドを発現するための作動可 能なエレメントを含有する、請求項１２に記載のベクター。 １４．前記ヌクレオチド配列が配列番号：１の配列である、請求項１２に記載 のベクター。 １５．請求項１２のベクターを含有する宿主細胞。 １６．前記宿主細胞がE.coliである、請求項１５に記載の宿主細胞。 １７．薬学的に受容可能なキャリア中に請求項１に記載のCTLA4ポリペプチド を含有する薬学的組成物。 １８．請求項１に記載の組換えCTLA-4ポリペプチドを製造するための方法であ って、以下の工程を包含する方法： （a）宿主細胞が組換えCTLA4ポリペプチドを発現するように仕向け得るDNA配列 を得る工程； （b）該DNA配列を、該DNA配列を発現するための作動可能なエレ メントを有するベクター中に挿入する工程； （c）該ベクターを、該ポリペプチドを発現し得る宿主細胞中に転移する工程； （d）該ポリペプチド発現のための条件下で、該宿主細胞を培養する工程； （e）該ポリペプチドを回収する工程；および （f）該ポリペプチドが、活性な三次構造となることを許容する工程。 １９．前記工程（f）で変性剤としてグアニジンが使用される、請求項１８に 記載の方法。 ２０．グアニジンが0.5Mから4.0Mの濃度で使用される、請求項１９に記載の方 法。 ２１．さらに、工程（f）の後に、前記ポリペプチドがマルチマーを形成する 活性な四次構造となることを許容する工程を包含する、請求項１８に記載の方法 。 ２２．前記マルチマーがダイマーである、請求項２１の方法。 ２３．請求項１８に記載の組換え的に生産されたCTLA4ポリペプチドのモノマ ー性形態およびダイマー性形態を実質的に分離するための方法であって、以下の 工程を包含する方法： （a）該CTLA4ポリペプチド形態の混合物をイオン交換カラムに通す工程；および （b）工程（a）で得られる混合物をサイジングカラムに通し、CTLA4モノマー性 およびダイマー性形態を実質的に分離する工程。 ２４．請求項１８に記載の組換え的に生産されたCTLA4ポリペプチドのより低 活性なダイマーから活性なダイマーを実質的に分離する方法であって、以下の工 程を包含する方法： （a）該CTLA4ポリペプチドの活性およびより低活性のダイマーの混合物をイオン 交換カラムに通す工程；および （b）該工程（a）で得られる混合物を、サイジングカラムまたは疎水性相互作用 カラムに通しより低活性のダイマーから活性ダイマーを実質的に分離する工程。 ２５．前記工程（a）で得られる混合物を、前記サイジングカラムおよび前記 疎水性相互作用カラムに通す、請求項２４に記載の方法。[Claims] 1. (A) at least one recombinantly produced monomer consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having a methionine at the N-terminus, or (b) A CTLA4 polypeptide containing a functional derivative, which is capable of binding to B7. 2. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the monomer consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 3. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the monomer consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with an N-terminal methionine. 4. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the functional derivative comprises a CTLA4 mutein having at least one free cysteine. 5. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein a polyethylene glycol (PEG) molecule is attached to the CTLA4 polypeptide. 6. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is a monomer. 7. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is a multimer. 8. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is a dimer. 9. 9. The CTLA4 polypeptide of claim 8, wherein the dimer contains two CTLA4 polypeptide monomers cross-linked by PEG molecules. 10. 9. The CTLA4 polypeptide of claim 8, wherein the dimer contains two CTLA4 polypeptide monomers linked by disulfide bonds. 11. The CTLA4 polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is recombinantly produced in a prokaryotic host cell. 12. A vector consisting essentially of a nucleotide sequence encoding the CTLA4 polypeptide of claim 1. 13. 13. The vector of claim 12, wherein the nucleotide sequence contains operable elements for expressing CTLA4 polypeptides. 14. 13. The vector of claim 12, wherein the nucleotide sequence is the sequence of SEQ ID NO: 1. 15. A host cell containing the vector of claim 12. 16. 16. The host cell according to claim 15, wherein the host cell is E. coli . 17． A pharmaceutical composition comprising the CTLA4 polypeptide of claim 1 in a pharmaceutically acceptable carrier. 18. A method for producing the recombinant CTLA-4 polypeptide according to claim 1, comprising the following steps: (a) DNA that can direct the host cell to express the recombinant CTLA4 polypeptide. Obtaining a sequence; (b) inserting the DNA sequence into a vector having an operable element for expressing the DNA sequence; (c) a host cell capable of expressing the polypeptide (D) culturing the host cell under conditions for expression of the polypeptide; (e) recovering the polypeptide; and (f) the polypeptide is active. A process that allows a tertiary structure. 19. 19. The method of claim 18, wherein guanidine is used as a denaturant in step (f). 20. 20. The method of claim 19, wherein guanidine is used at a concentration of 0.5M to 4.0M. 21. 19. The method of claim 18, further comprising the step of allowing after step (f) the polypeptide to form an active quaternary structure that forms a multimer. 22. 22. The method of claim 21, wherein the multimer is a dimer. 23. 20. A method for substantially separating monomeric and dimeric forms of the recombinantly produced CTLA4 polypeptide of claim 18, comprising the steps of: (a) the CTLA4. Passing the mixture of polypeptide forms through an ion exchange column; and (b) passing the mixture obtained in step (a) through a sizing column to substantially separate CTLA4 monomeric and dimeric forms. 24. 19. A method of substantially separating active dimers from less active dimers of the recombinantly produced CTLA4 polypeptide of claim 18, comprising the steps of: (a) the CTLA4. Passing a mixture of the active and less active dimers of the polypeptide through an ion exchange column; and (b) passing the mixture obtained in step (a) through a sizing column or a hydrophobic interaction column Substantially separating the active dimer from. 25. 25. The method of claim 24, wherein the mixture obtained in step (a) is passed through the sizing column and the hydrophobic interaction column.
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