JPH08505387A - ヒト免疫不全ウイルスデコイ - Google Patents

ヒト免疫不全ウイルスデコイ

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JPH08505387A
JPH08505387A JP6515970A JP51597094A JPH08505387A JP H08505387 A JPH08505387 A JP H08505387A JP 6515970 A JP6515970 A JP 6515970A JP 51597094 A JP51597094 A JP 51597094A JP H08505387 A JPH08505387 A JP H08505387A
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ebv
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アンドリュー イー． ゲルマン
エドワード イー． スポンスラー
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Abstract

(57)【要約】 直径が約１０００ナノメートル未満のコア粒子でできていて、その超微細粒子に、生物活性を有するタンパク質、ペプチドまたは薬理学的作用物質が結合できるように設計されている層でコートされている、生物活性組成物。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のウイルスタンパク質が上記コア粒子に結合されると、その結果、大きさ、構造および表面特性が未変性のＨＩＶに正確に似ているが、微細粒子のコアのため悪性の活性を全く欠くウイルスデコイが得られる。このＨＩＶデコイは、免疫応答を誘発させるために哺乳動物を処置するのに用いるワクチンとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全ウイルスデコイ 発明の背景 本願は、１９９０年６月２２日に出願された同時係続中の米国特許願第０７／ ５４２，２５５号の一部継続出願である１９９１年４月２４日に出願された同時 係続中の米国特許願０７／６９０，６０１号の一部継続出願である。 １．発明の分野 本発明は、一般に、微細粒子コアを有する合成の生物活性組成物に関する。さ らに詳しくは、本発明は、後天性免疫不全症候群（エイズ）に対するワクチンと して用途がある合成のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）デコイ（decoy）に関す る。 ２．関連技術の説明 生物活性を有するタンパク質類、ペプチド類または薬理学的作用物質を各種の 担体粒子に結合させることは、強力に研究が行われている分野である。これら接 合生物系は、生物活性作用物質の毒性の減少、効力の増大および費用の低減を行 うのに有望である。その結果、多種類の担体モデルが現在入手できる（Varga，J ．M．とAsato，N．の論文、Goldberg，E．P．編集：「Polimers in Biology and Medicine」、ニューヨーク、Wiley社刊、２巻、７３〜８８頁（１９８３年）。 Ranney，D．F．とHuffaker，H．H．の論文、Juliano，R．L．編集：「Biologica l Approaches to the Delivery of Drugs」、Ann．N．Y．Acad．Sci．刊、５０ ７巻、１０４〜１１９頁（１９８７年）。） 。ナノ結晶（nanocrystalline）およびミクロンサイズの無機基質は、最も普通 の担体であり、そしてタンパク質は、最も普通の接合作用物質である。例えば、 金／タンパク質（主として免疫グロブリン）接合体は、５ｎｍ程度の小さな寸法 のものであるが、（光学顕微鏡、透過電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡、なら びに免疫ブロッテイング法の免疫標識付けの用途に使用されてきている（Faulk ，W．とTaylor，G．の論文、Immunochemistry８巻、１０８１〜１０８３頁（１ ９７１年）。Hainield，J．Fの論文、Nature３３３巻、２８１〜２８２頁（１９ ８８年）。）。 シラン化酸化鉄タンパク質接合体（やはり主として抗体）は、一般に５００〜 １５００ｎｍの寸法であるが、（常磁性を有利に利用できる各種の生体外での用 途に有用であることが証明されている（Research Products Catalog、Advanced Magnetics，Inc．社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、１９８８年〜１９ ８９年。）。Ugelstadらは、薄いポリスチレンのシェルでコートしたガンマ酸化 鉄のコアを製造している（Nustad，K.、Johansen，L.、Schmid，R.、Ugelstad， J.、Ellengsen，T.、Berge，A．論文：「Covalent coupling of proteins to mo nodisperse particles．Preparation of solid phase second antibody．」、Ag ents Actions １９８２年；９：２０７〜２１２（ｉｄ．ｎｏ．６０）。）。得 られた４５００ｎｍのビーズは、ポリスチレンラテックスのビーズを吸着する性 能および常磁性の比較的新規な利点の両方を示した。 生体内での用途向けに設計された担体系が無機および有機のコアの両者から作 製されている。例えば、DavisとIllumは、ポリスチレンコアを含んでなり、ブロ ックコポリマーのポロキサマー（poloxamer）、ポリオキシエチレンおよびポリ オキシプロピレンの外側コー ト（ラットの肝臓と脾臓のマクロファージをバイパスする注目すべき性能を示す ）を有する６０ｎｍの系を開発した（Davis，S．S．、Illum，L．論文、Biomate rials ９巻、１１１〜１１５頁（１９８８年））。これらの粒子を有する薬物送 達系は、まだ実物提示されていない。RanneyとHaffakerは、３５０〜１６００ｎ ｍの常磁性薬物担体を生成する酸化鉄／アルブミン／薬物の系を論述した（Rann ey，D．F．とHuffaker，H．H．の論文、Juliano，R．L．編集：「Biological ap proaches to the delivery of drugs」、Ann．N．Y．Acad．Sci.、５０７巻、１ ０４〜１１９頁（１９８７年）。）。Poznaskyは、未変性酵素の顕性抗原性をマ スクしながら、生成物の生物分解に対する感受性を低下させると思われる酵素− アルブミン接合体系を開発した（Poznasky，M．J．の論文：「Targeting enzyme albumin conjugates．Examining the magic bullet．」、Juliano，R．L．編集 ：「Biological approaches to the delivery of drugs」、Annals New York Ac ademy Sciences １９８７年、５０７巻２１１〜２１９頁。）。 Shawらは、リポタンパク質／薬物の複合体を製造し、その特性を決定した（Sh aw，J．M.、Shaw，K．V.、Yanovich，S.、Iwanik，M.、Futch，W．S.、Rosowsky ，A.、Schook，L．B．の論文：「Delivery of lipophilic drugs using lipopro teins．」、Juliano，R．L．編集：「Biological approaches to the delivery of drugs」、Annals New York Academy Sciences１９８７年、５０７巻、２５２ 〜２７１頁。）。脂肪親和性薬物は、これらの担体中では比較的安定であり、詳 細はほとんど分かっていないが、細胞の相互作用が起こる。 接合生物組成物においては、その吸着されたタンパク質などの生物作用物質の 配座の完全性および生物活性が、厄介な免疫応答を誘 起することなく維持されることが大切である。空間配向と構造配置は、多くのペ プチド、タンパク質および薬理学的作用物質の生物活性を測定する際に役割を果 たすことが知られている。これらの化合物の構造配置が変化すると、生物活性が 一部分または全部が失われることがある。配置の変化は、その生物活性を有する 化合物または作用物質の周囲の環境を変えると起こることがある。例えば、生体 外で活性を示す薬理学的作用物質が生体内で活性を示さなくなることがあるが、 これはさきに測定された分子配置が生体外の環境で一部が失われたためである。 さらに、食作用トラッピング（phagocytic trapping）を最小にする担体粒子の 大きさと関連性能は、その組成物が生体外で使用される場合、重要な関心事であ る。これらの要因はすべて、担体粒子を製造する場合、配慮しなければならない 。 非常に多種類の担体粒子が開発されているが、生物活性を有するペプチド、タ ンパク質または薬理学的作用物質のその活性配置での安定化を促進するように、 この生物活性化合物を担体粒子に結合させることができる、生体内と生体外の両 方に用いる担体粒子に対する要望が続いている。生体内の用途については、エイ ズのような恐ろしい疾患に対して個体を免疫化するワクチンとして使用できる合 成のデコイウイルスを開発することが望ましい。 発明の要約 本発明によれば、生物活性を有するペプチド、タンパク質または薬理学的作用 物質がコア粒子に結合されて多種類の生物活性組成物が得られる。本発明は、超 微細粒子（ナノ結晶粒子）の表面を表面コーティングで改変して、生物活性部分 を結合させて、生物活性が維持されるために該部分の天然に生じる構造環境が充 分に模倣され ているような組成物を製造できるという発見に基づいている。本発明に従って生 物活性部分をナノ結晶粒子に結合させるコーティングは、基本的なまたは改変さ れた糖もしくはオリゴヌクレオチドで構成することができる。基本的な糖または オリゴヌクレオチドでナノ結晶粒子をコーティングすることにより、表面エネル ギーや他の表面特性が変化して、この粒子は、生物活性部分を結合させるのに好 適な粒子になる。 本発明の一実施態様では、ナノ結晶粒子が、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡの コアが微細粒子で置換されているデコイウイルスを製造するのに使用される。こ の微細粒子は、大きさがウイルスのコアとほぼ同じでその結果周囲のタンパク質 コートの配座が未変性のウイルスを正確に模倣しているように選択される。得ら れたウイルスデコイは、感染挙動は行えないが、同時に免疫応答を充分に行うこ とができ、その他に抗原として生体反応性である。 この実施態様では、ＤＮＡまたはＲＮＡのコアを模倣するため、直径が約１０ ００ｎｍ（ナノメートル）未満の超微細粒子が選択される。コアの周囲のコーテ ィングに結合させるウイルスペプチドは、未変性ウイルスの少なくとも一部分を 模倣した構造をもっている。また、微細粒子のコアのこの大きさは、活性を維持 するためにナノ結晶粒子の足場またはコアを必要とする足場依存性の薬理学的作 用物質などの生物化成化合物を保持するのに好適の大きさである。 本発明の格別の特徴として、ＨＩＶ由来のウイルス粒子をタンパク質コートの 少なくとも一部分として含有するデコイウイルスが提供される。このデコイウイ ルスが動物モデルで細胞応答および体液応答を誘発するのに有効であることが発 見されたのである。 本発明の生物活性微細粒子には、その微細粒子コアに結合される 生物活性化合物のタイプに応じた広範囲な用途がある。ＨＩＶ由来のウイルスタ ンパク質が微細粒子コアに結合されると、エイズのワクチン、診断手段または抗 体を生じさせる抗原剤として使用できるデコイウイルスが得られる。特異的な抗 体を生成させるためまたは診断手段として用いるため、非ウイルスのタンパク質 または抗原のコーティングを選択して構築できる。さらに、この微細粒子は、薬 理学的活性を有する化合物をそのコア粒子に結合させると、薬理学的作用物質と して機能することができる。 本発明によれば、ＨＩＶウイルスのタンパク質が周囲に結合されているコア微 細粒子を利用して、ウイルスの遺伝物質が存在していることに伴ういかなる問題 も危険もすべて排除しながら、未変性ＨＩＶの抗原反応性を正確に模倣する有効 な方法を提供する。さらに、他のタンパク質、ペプチドまたは薬理学的作用物質 をコア粒子に結合させて、その化合物の活性を保持および／または増大させるこ とができる。 本発明の前述および多くの他の特徴並びにそれに付随の利点は、下記の詳細な 説明を参照することによって一層よく理解されるであろう。 発明の詳細な説明 本発明には、抗原物質または他の生物活性部分を利用する免疫処置または免疫 方法に広い用途がある。これらの利用分野としては、予防接種剤、再診断用に抗 体を生成させるのに用いる抗原剤および診断手段として用いられる抗原化合物が ある。また、本発明の組成物は、生物反応性を保持および／または強化するため コア粒子にタンパク質、ペプチドまたは薬理学的作用物質を固定する必要がある 他の広範囲の用途にも使用できる。 本発明の組成物は、タンパク質、ペプチドまたは薬理学的作用物質の粒子への 結合を促進する表面エネルギー改変層でコートされるナノ結晶コア粒子（直径は １０００ｎｍ未満）を含有している。そのコーティングによってナノ結晶のコア 粒子の表面エネルギーが改変されて、多種類の、免疫原性を有するタンパク質、 ペプチドおよび薬理学的作用物質を、抗原活性を著しく失わせずにまたは変性さ せずにコア粒子に結合させることができる。その結果、生物学的に不活性なコア を含有する生物活性組成物が得られる。本発明の組成物の最終用途は、そのコー トされたコア粒子に結合される特定のタンパク質、ペプチドまた薬理学的作用物 質によって決まる。例えば、抗原活性を有するタンパク質またはペプチドを結合 させて免疫診断ツールとして有用な組成物を提供することができる。免疫原活性 を有するウイルスのフラグメントまたはタンパク質のコーティングを結合させて 、ワクチンを提供することができる。また薬理学的作用物質を結合させて、疾患 を治療するのに有用な組成物を提供することができる。 ワクチンとして用いるデコイウイルスを製造する場合、直径が約１０〜２００ ｎｍの粒子が好ましい。というのは、この範囲の大きさの粒子が、ウイルス中に 一般に見られるＤＮＡおよびＲＮＡのコアの直径にきわめてよく似ているからで ある。 これらのコア粒子は、金属またはセラミックを含む広範囲の無機材料で製造す ることができる。好ましい金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレ ン、ニッケル、金、銀、白金がある。好ましいセラミック材料としては、二酸化 ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズが挙 げられる。こ れらのコア粒子は、炭素（ダイヤモンド）を含む有機材料で製造することができ る。好ましいポリマーとしてはポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロース がある。酸化スズ、二酸化チタンまたは炭素（ダイヤモンド）製の粒子は特に好 ましい。 １０００ｎｍ未満の直径を有する上記材料で製造された粒子は、市販のもので も間に合うし、または溶液中での漸増核形成法（progressive nucleation）（コ ロイド反応）もしくはスパッタデポジション法のような各種の物理的化学的蒸着 法で製造することができる（Hayashi，C.、J．Vac．Sci．Technol．Ａ５（４） 巻、１９８７年７月／８月号、１３７５〜１３８４頁；Hayashi，C.、「Physics Today」、１９８７年１２月号、４４〜６０頁；MRS Bulletin、１９９０年１月 号、１６〜４７頁）。水中に分散された凝集粒子の直径が約１４０ｎｍの酸化ス ズがVacuum Metallurgical Co．社（日本）から市販されている。所望の組成と 寸法範囲を有する他の市販されている粒子は、Advanced Refractory Technologi es，Inc．社（米国、ニューヨーク州、バッファロー所在）から入手できる。 プラズマアシステッドケミカルベーパーデポジション法（plasma-assisted ch emical vapor deposition）（ＰＡＣＶＤ）は、適切な微細粒子を製造するのに 使用できる多くの方法のうちの一つである。ＰＡＣＶＤ法は、比較的高い大気圧 下（１トール以上のオーダの）で行われ、直径が１０００ｎｍまでの粒子を生成 させるのに有用である。例えば、直径１０００ｎｍ未満の窒化アルミニウムは、 Ａｌ（ＣＨ3）3とＮＨ3を反応物として用い、ＰＡＣＶＤ法によって合成するこ とができる。ＰＡＣＶＤの装置は、一般に、水平に設置された石英管および連係 したポンプ系とガス供給系を具備している。サセプター（susceptor）が該石英 管の中心に配置され、６０ｋＨｚの 高周波源を用いて加熱される。合成された窒化アルミニウムの粒子は、該石英管 の壁上に集められる。Ａｌ（ＣＨ3）3の担体として窒素ガスを用いる。反応室内 のＡｌ（ＣＨ3）3，：ＮＨ3の比率は、Ｎ2／Ａｌ（ＣＨ3）3とＮＨ3のガスを反 応室内への流量を変えることによって制御する。反応室内の圧力は、一般に１０ トールの一定圧に維持して、超微細でナノ結晶の窒化アルミニウムの粒子を析出 ・生成させる。ＰＡＣＶＤ法は、他の各種の適切なナノ結晶粒子を製造するのに 利用できる。 これらのコア粒子は、生物学的関連部位を変性させるほど強固でない結合を起 こさせるのに充分なしきい表面エネルギーをコア粒子に与える物質でコートされ る。コーティングは、分散された表面改変剤を含有する溶液中に粒子を懸濁させ ることによって実施することが好ましい。このコーティングは、粒子の表面をタ ンパク質またはペプチドが一層結合し易いようにすることが必要である。本発明 の適切なコーティング物質としては、セロビオース、トレハロース、イソマルト ース、マルトース、ナイストース（nystose）、マルトトリオース、類縁基本糖 類、およびニトロセルロースなどの変性糖が挙げられる。ガラス転移温度が比較 的高い二糖類おおよび糖類が好ましい。ガラス転移温度は、約７７℃のオーダが 好ましい。セロビオースは、好ましいコーティング材料である。 コア粒子を懸濁させるコーティング溶液は、例えば１〜３０重量／容量％のコ ーティング材料を含有している。溶質としては、再蒸留水（ｄｄＨ2Ｏ）が好ま しい。コーティング溶液内に懸濁されるコア粒子の量は、粒子の種類とその大き さによって変わる。一般に０．１〜１０重量／容量％を含有する懸濁液が適切で ある。約１重量／容量％の粒子を含有している懸濁液が好ましい。 コア粒子は、粒子の均一なコーティングを得るのに充分な時間、コーティング 溶液中に分散状態で保持する。この分散状態を維持するには、音波処理法が好ま しい方法である。室温で３０分間〜数時間の範囲の分散時間をとれば、通常、粒 子に適切なコーティングを付与するのに充分である。コーティングの厚さは、５ ｎｍ未満が好ましい。コーティングの厚さは、変えることができるが、最終のコ ア粒子は粒子表面の実質的に全てに亘って均一なコーティングを備えていなけれ ばならない。 粒子は、コーティングを行った後、懸濁液から分離し、将来使用するために貯 蔵しておいてもよいし、または粒子に結合させるタンパク質またはペプチドを含 有する溶液に再懸濁させてもよい。あるいは、そのコートされた粒子は、所望の タンパク質またはペプチドの結合を含むその後の処理のために前記懸濁液中に残 しておいてもよい。 コートされた粒子につけられるタンパク質またはペプチドは、広範囲のタンパ ク質またはペプチドから選択できる。ワクチンが必要な場合は、抗原性を有する ものが好ましい。そのタンパク質は、選択されたウイルス由来のウイルスタンパ ク質外被またはその免疫原性部分でもよい。このウイルスタンパク質外被は、ウ イルスタンパク質を単離および分離する公知の分離法によって単離される。この ウイルス外被は、ウイルスの抗原活性が位置していることが分かっている場所に 存在するから、好ましいタンパク質である。典型的には、ウイルスは、消化また は可溶化されて、ウイルスタンパク質の混合物を形成する。これらのウイルスタ ンパク質は、次に、液体クロマトグラフィまたは他の通常のプロセスにより各種 のタンパク質粒子の画分に分離され、次いで透析して不純物を除かれる。 ウイルスタンパク質の粒子を分離し単離できる適切なウイルスとしては、エプ スタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイル ス、単純ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスがある。また、広範囲の抗原 性タンパク質材料の製剤がMicrogene Systems，Inc.社（米国、コネティカット 州０６５１６、ウェスト・ヘーブン、フロンテージ・ロード、４００所在）、Am gen Corporation社（米国、カリフォルニア州９１３２０−１７８９、サウザン ド・オークス、オーク・テラス・レーン１９００所在）、およびCetus Corporat ion社（米国、カリフォルニア州９４６０８、エメリービル、５３番通り、１４ ００所在）、およびAdvanced Biotechnology，Inc．社（米国、メリーランド州 、コロンビア所在）などの供給会社から購入できる。天然産のウイルス粒子に対 応する合成のペプチドおよび／またはタンパク質も利用することができる。 ＨＩＶについては、免疫応答をもたらすことが知られているウイルスフラグメ ントのいずれをも用いることができる。適切なウイルスフラグメントとしては、 ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４１およびコアタンパク質（ｐ２４）がある。組 換え法を含めて、ＨＩＶフラグメントを用意する公知の技術のいずれでも利用で きる。 結合させることができる他の生物活性を有するタンパク質およびペプチドとし ては、酵素、ホルモン、輸送タンパク質および防御タンパク質がある。薬理学的 作用物質のアムホテリシンとインシュリンに加えて、ヒト血清トランスフェリン 、プラスミノーゲン活性化因子および凝固因子が具体例である。 コア粒子上のコーティングに抗原または他のタンパク質を結合させる方法には 、抗原を含有する水溶液中に、コートされたコア粒子を懸濁させることが含まれ る。粒子の表面に優先的に結合する材料 が該溶液中に存在すると、不利なことが多い。例えば、溶液中に存在している分 散剤は、タンパク質を結合させる前に、懸濁された粒子上に望ましくないコーテ ィングを生成することがある。メタノールまたはエタノールのような水混和性の 溶媒を用いることができる。コートされた微細粒子の水溶液を充分に攪拌してそ の粒子の均一な懸濁液を得ることができる。典型的には、溶液中の粒子の量は、 溶液１ｍｌ当り約０．５ｍｇ〜５ｍｇである。音波処理は、溶液中にコートされ た粒子の均一な懸濁を得るのに好ましい方法である。 コートされた粒子と抗原の懸濁液は、タンパク質の結合と自己集合が起こる特 定のパラメータの範囲内でなければならない。粒子溶液の温度は、１℃〜４５℃ でなければならない。特定のタンパク質と薬理学的作用物質は、蒸留水中で、コ ートされた粒子に結合できる。コートされた粒子と、蒸留水中では不安定である かまたは容易には分散しないタンパク質および他の薬理学的作用物質との反応の ために、溶液中に塩を加えてもよい。一般に、この塩の溶液は、イオンバランス （ionic balance）がｍＭ（ミリモル）値において次の範囲：Ｋ＝３００〜５０ ０、Ｎａ＝３０〜７０、Ｃｌ＝４０〜１５０、Ｃａ＝０．０００３〜０．００１ 、およびＭｇ＝０．０００３〜０．００１を超えないように調合しなければなら ない。該溶液の酸素テンション（oxygen tension）は、最初ヘリウムで散布し、 次にヘリウム、窒素および二酸化炭素を吹き込んで溶液中１０％未満にすること が有利である。その溶液のｐＨは、わずかに酸性（血液に比べて）で、６．８〜 ７．２の値にあるのが好ましい。コートされた微小粒子を分散させてタンパク質 を結合させるのに用いる代表的な溶液は、１ｌ当り０．０３６０ｍｇのＭｇＳＯ4 、０．０６０９ｍｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．４４１ｍｇのＣａＣｌ2・２ Ｈ2Ｏ、２２．８２３ｇのＫ2ＨＰＯ4、１３．６０９ｇのＫＨ2ＰＯ4、７．４５ ５ｇのＫＣｌおよび４．１０１ｇの酢酸ナトリウムを含有する水溶液である。こ の溶液のｐＨは、６．８に調整される。 結合されたタンパク質を有するコートされた粒子コアは、イオン成長媒体（io nic growth medium）から分離して、その後に使用するため貯蔵することができ る。このコートされた粒子は、抗原性化合物または抗体を貯蔵するのに一般に用 いられる通常の方法のいずれかによって貯蔵しておくことができる。例えば、こ のコートされた粒子は、凍結乾燥されるかまたは相溶性溶液中の懸濁液として貯 蔵される。ワクチンとして使用される場合は、ウイルスのタンパク質外皮でコー トされた粒子は、通常の方法にしたがって個体に注射されるか他の方法で投与さ れる。医薬として許容される担体の溶液または他の化合物は、コートされた粒子 を個体に投与する際に使用することができる。生体外で診断を目的として使用す る場合、タンパク質でコートされた粒子は、溶液に懸濁させられ、他の抗原性化 合物と同じ要領で用いられる。タンパク質でコートされた粒子を抗体生成のため に使用する場合も、同じことが当てはまる。抗原を使用して抗体を産生させるの によく知られているのと同じプロトコルおよび手順が、通常使用されている抗原 性化合物の代わりに本発明のタンパク質でコートされた粒子を用いて、利用され てもよい。 下記の実施例は、本発明の特定の態様をより詳細に記述するが、本発明を限定 するものではない。 実施例１．ナノ結晶酸化スズ微細粒子の製造：１．５〜２．０ｍｇの超微細（ ナノ結晶）金属粉末を、１．５ｍｌの再蒸留水（ｄｄＨ2Ｏ）が入っているねじ 蓋付きの１．７ｍｌ微小遠心分離機に入れ た。このｄｄＨ2Ｏは、水洗した０．４５ミクロンフィルター滅菌装置またはア クロディスク（acrodisc）（Gelman Scientific社）によって濾過した。金属粉 は、平均直径（光子相関分光分析法による）が１４０ｎｍの酸化スズであった。 その混合物を３０秒間かき混ぜ、次に水音波処理浴中に一夜置いた。音波処理浴 の温度は、６０℃の恒温とした。２４時間音波処理を行った後、試料をもう一度 ３０秒間かき混ぜ、得られた分散液を約１６，０００ｒｐｍで１５秒間微小遠心 分離機にかけて透明にした。粉子寸法の分析は、Coulter Ｎ４ＭＤサブミクロン 粒子分析器で行った。 コーティングは、酸化スズ粒子をセロビオースの原液中に懸濁させることによ って、粒子に付着させた。セロビオースの原液は、セロビオース１．０００ｇを ９．００ｍｌのｄｄＨ2Ｏの中に溶解して作製した２９２ｍＭ（ミリモル）の溶 液であった。迅速に溶解させるため、上記溶解は、約７０℃で行った。得られた セロビオース溶液は、水洗した０．４５ミクロンフィルターを通して濾過滅菌を 行い、最終容量を１０．００ｍｌに調節した。 充分な量のセロビオース原液を１５０μｌ（マイクロリットル）の超微細酸化 スズ分散液に加えて、酸化スズの最終濃度を１．００％（ｗ／ｖ＝重量／容量） すなわち２９．２ｍＭにした。製造を行う場合の典型的な容量は、２．０ｍｌで あり、これをマイクロピペッタの作動により４〜５回混合した。混合後、その分 散液を２時間平衡化させた。粒子のコーティングが成功していることは、粒子（ コート済みおよび未コートの粒子）の移動度をCoulter DELSA 440ドップラーエ ネルギー光散乱分析器（doppler energy light scatter analyzer）で測定する ことによって、証明された。コートされた酸化スズ粒子は、コートされていない 酸化スズ粒子に比べて低い移 動度を示した。移動度の測定結果が人為的なものではないことを保証するため、 各種の希釈塩濃度で測定を行った。その試験結果は、粒子がセロビオースでコー トされたことを示している。 次いで、そのコートされた粒子を用いて、抗原性のタンパク質、ペプチドまた は薬理学的作用物質を結合させて、生物活性粒子を得る。 実施例２．ナノ結晶の酸化ルテニウム粒子の製造：酸化ルテニウムの微細粒子 を酸化スズの粒子の代わりに用いたことを除いて、実施例１にしたがって同じ手 順を実施した。酸化ルテニウムの粒子は、Vacuum Metallurgical Company（日本 ）から入手した。 実施例３． ナノ結晶の二酸化ケイ素と酸化スズの粒子の製造：ナノ結晶の二 酸化ケイ素は、Advanced Refractory Technologies，Inc．社（米国、ニューヨ ーク州、バッファロー所在）から購入し、酸化スズは、Vacuum Metallurgical C o．社（日本）から購入した。また、酸化スズ粒子は、アルゴン酸素混合気中で スズを反応性蒸発（reactive evaporation）させて製造もし、冷却した基板上に 集めた。また、ナノ結晶の酸化スズは、Ｄ．Ｃ．反応性マグネトロンスパッタリ ング法（D．C．reactive Magnetron Sputtering）（反転カソード）でも合成し た。３″直径の高純度スズのターゲットをアルゴンと酸素の高圧混合ガス中でス パッタリングさせた。ガス相に生成した超微細粒子を、流動液体窒素で７７Ｋ（ ケルビン）まで冷却した銅チューブ上に集めた。全材料を、Ｘ線回折結晶分析法 、透過電子顕微鏡法、光子相関分光分析法およびドップラー電気泳動光分散分析 法によって特性を決定した。Ｘ線回折の試料は、倍寸のスコ ッチテープを用いてガラススライド上に粉末を載せて作成した。Norelco回析計 にＣｕＫα放射線を使用した。得られたスペクトルを酸化スズのＡＳＴＭ標準デ ータ（Powder Diffraction File、Card #21-1250、Joint Commitee on Powder D iffraction Standards，American Society for Testing and Materials，Philad elphia 1976年）と比較した。ＴＥＭ用試料は、２−プロパノール中ＵＦＰの分 散液の中に浸漬することによって標準の３ｍｍ直径の炭素コートした銅メッシュ 上に集めた。これらの試料を、６０〜８０ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ−ＳＴＥＭ １００ ＣＸを用いて試験した。 これら金属酸化物の使用分散液を製造するため、無塵のねじ蓋付き微小遠心分 離管（Sarsted社）中の１．５ｍｌの再蒸留水中に１．５〜３．０ｍｇの金属酸 化物の粉末を添加し、３０秒間かき回した。混合液を１６，０００×ｇで１５秒 間、微小遠心分離にかけて微細粒子をペレット化することによってサブミクロン の画分を単離した。約１．３ｍｌの上澄み液を取り出し、別の無塵のねじ蓋付き 微小遠心分離管に入れた。分散液５０〜１００μｌを取り出し、ポリスチレン製 キュベットに入れｄｄＨ2Ｏで希釈して最終容積１．００ｍｌにすることによっ て、光子相関分光分析（Coulter N4MD）用およびドップラー電気泳動光散乱分析 （Coulter delsa 440）用の試料を調製した。分散液の安定性は、２４時間にわ たって逐次測定することによって求めたが、安定であることが分かった。溶媒の 漸増塩分濃度（progressive salinity）（増大する導電率）に対する分散液の安 定性も同様に測定した。安定性は、溶媒の塩分濃度が増大するにつれて増大した 。 予め水洗した５×１０5分子量カットオフタイプＦ膜（Spectra社）を取り付け た１５．０ｍｌ容量の限外濾過用攪拌セル（Stir Cell） （Spectra社）中で、１．００ｍｌの分散液を、８．００ｍｌのｄｄＨ2Ｏおよび １．００ｍｌの２９．２ｍＭセロビオース原液と混合して攪拌した。その試料は 、その後１５分間攪拌されるにまかせた。攪拌後、ぜん動ポンプの作動によって 、２５０ｍｌのｄｄＨ2Ｏを１０．０ｍｌ／ｍｉｎを超えない流量でセルチャン バを通じてフラッシュさせることによって、過剰のセロビオースを除いた。洗浄 後、加圧Ｎ2ガスを用いて、濾液を約１．０ｍｌまで濃縮した。処理された分散 液５００μｌを取り出し、Ｎ４ＭＤ分析によって特性決定を行った。この段階で 平均分散直径を再測定した。コートされた分散液の安定性は、２４時間に亘って 逐次測定することによって求めた。溶媒の漸増塩分濃度（増大する導電率）に対 するコートされた分散液の安定性を同様に測定した。 得られたコートされたナノ結晶粒子は、各種のタンパク質、ペプチドおよび医 薬作用物質を結合させるのに適切なものである。 実施例４． ヒト血清トランスフェリンタンパク質の製造、単離および表面吸 着 ：ナノ結晶酸化スズをＤ．Ｃ．反応性マグネトロンスパッタリング法（反転カ ソード）で合成した。３″直径の高純度スズのターゲットをアルゴンと酸素の高 圧ガス混合ガス中でスパッタリングさせた。ガス相中に生成した超微細粒子を、 流動液体窒素で７７Ｋ（ケルビン）まで冷却した銅管上に集めた。全材料を、Ｘ 線回折結晶分析法、選択領域電子回折法、透過電子顕微鏡法、光子相関分光分析 法およびエネルギ分散式Ｘ線分光分析法によって特性を決定した。Ｘ線回折用の 試料は、倍寸のスコッチテープを用いてガラススライド上に粉末を載せて作製し た。ＣｕＫ（α）放射線をNorelco回折計に用いた。得られたスペクトルを酸化 スズのＡＳＴＭ 標準データと比較した。透過電子顕微鏡法と選択領域回折法用の試料は、２−プ ロパノール中ナノ結晶材料の分散液の中に浸漬することによって標準の３ｍｍ直 径の炭素コートした銅メッシュ上に集めた。これらの試料を、６０〜８０ｋｅＶ の加速電圧でＪＥＯＬ−ＳＴＥＭ １００ ＣＸを用いて試験した。また、粒子 の２−プロパノール懸濁液は、Coulter Ｎ４ＭＤを用い、２２．５℃、６００秒 の実験時間で、光子相関分光分析法で特性を決定した。エネルギ分散式Ｘ線分光 分析は、Kevex quantex Ｖソフトウェアを利用してＪＥＯＬ ＪＳＭ−Ｔ３３０ Ａ走査型電子顕微鏡で実施した。 本発明により組成物を合成するためのこれら金属酸化物の使用分散液を作製す るために、無塵のねじ蓋付ガラスバイアルびん中の２９．２ｍＭセロビオース− リン酸緩衝食塩水１．０ｍｌに金属酸化物粉末０．５ｍｇを添加し、次いで２２ ．５〜３５℃で２０分間音波処理を行った。次に、１６，０００×ｇで３０秒間 、微小遠心分離にかけて微小粒子をペレット化することによってサブミクロンの 画分を単離した。次いで、約９００μｌの上澄み液を取り出し、無塵のねじ蓋付 き微小遠心分離管の中に入れた。その上澄み液の一部分を取り出して、光子相関 分光分析（Coulter Ｎ４ＭＤ）とドップラ電気泳動光散乱分析（Coulter ＤＥＬ ＳＡ ４００）による分析にかけた。また、該上澄み液の一部を取り出し、時間 の経過および溶媒の漸増塩分濃度（増大する導電率）に対するコートされた粒子 の分散液の安定性を測定した。 セロビオースでコートされた金属酸化物のナノ結晶コアにタンパク質を吸着さ せるため、Ｃａ++とＭｇ++を含有しないリン酸緩衝食塩水（Gibco社）で１０． ０ｍｌまで希釈した。４０．０μｇの精製ヒト血清トランスフェリン（４μｇ／ μｌ）（Gibco社）を、その 抗原性はＥＬＩＳＡ法で確認したが、１０ｍｌの攪拌セル（Spectra社）に入れ た。次に、この試料を、発泡させないように充分注意しながら、３０分間のゆっ くり攪拌に委ねた。その追加期間の後、１５ｍｌのＣａ++とＭｇ++を含有しない リン酸緩衝食塩水（Gibco社）を、２ｐｓｉの窒素ガス圧ヘッド下で、セルを通 過させて洗浄した。洗浄後、試料をＮ2下で１．００ｍｌまで再度濃縮し、５０ ０μｌの試料を取り出し、以下に詳細に述べるように、光子相関分光分析法、ド ップラ電気泳動光散乱法および透過電子顕微鏡法で分析した。 結合されたタンパク質に保持された抗原性を測定することによって配座の完全 性を評価した。試料のセルに、ウサギポリクローナル抗ヒトトランスフェリン抗 体（Dako社）５０．０μｌを、その抗原性はＥＬＩＳＡ法で確認したが、濃縮さ れた１．０ｍｌの反応生成物に３７．５℃でゆるやかに攪拌しながら加えた。３ ０分間インキュベートした後、Ｃａ++とＭｇ++有していないリン酸緩衝食塩水（ Gibco社）１５ｍｌを、２ｐｓｉの窒素ガス圧ヘッド下で該セルを通過させて洗 浄し、次いで再び反応容積を１．０ｍｌまで減少させた。 二価イオンを含有しない食塩水中１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミンを含有する ブロッキング剤２００μｌを添加し、１０分間平衡化した。次に、二次抗体であ る、３０ｎｍの金接合ヤギ抗ウサギポリクローナルＩｇＧ（Zymed社）を添加し 、反応混合物を３０分間インキュペートした。試料を取り出し、透過電子顕微鏡 法のグリッド上でチョップし減圧乾燥を行った。その混合物を、窒素の圧力ヘッ ド下で、二価イオンを含有しない食塩水１５ｍｌを用いて再び洗浄し、次いでグ ルタルアルデヒドで固定した。その混合物に、３％固体ウシコラーゲン（Collag en Corp.社）１ｍｌを添加し、その複合体を １０6×ｇで３０分間、超遠心分離にかけ、得られたペレットは透過電子顕微鏡 法用の生物試料として通常どおりに処理した。１０ｎｍの厚さの切片を、Zeiss の透過電子顕微鏡で視見した。対照試料を、セロビオースの中間結合層なしで上 記のようにして製造した。 透過電子顕微鏡写真は、Ｄ．Ｃ．マグネトロンでスパッタリングされた酸化ス ズが、直径２０〜２５ｎｍの個々の粒子で構成され、これらの粒子が凝集して直 径８０〜１２０ｎｍのクラスターになっていることを示した。光子相関分光分析 により、これらの同じ粒子は、蒸留水中に分散させたところ、１５４±５５ｎｍ の寸法の凝集体を生成したことが分かった。これらの酸化スズ粒子は、電子およ びＸ線回折で特性を決定した結果、充分に結晶性であった。エネルギ分散式Ｘ線 分光分析法によって、不純物として他の元素は全く存在しないことが分かった。 ドップラ電気泳動光散乱分析法によって、酸化スズは、１０．８〜２０．３μ Ｍの範囲のＮａＣｌを含有する水溶液中で２．１７７±０．２１５μｍ−ｃｍ／ Ｖ−ｓの平均移動度を示した。１％溶液中でセロビオース表面コーティングを行 うと、酸化スズは、０．０〜２１．０μＭのＮａＣｌ水溶液中で１．５４４±０ ．２４１μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓの平均移動度を示した。この酸化物は、４０．０μ Ｍを超える塩濃度中および濃度が増大するセロビオースの溶液中で凝集した。 伝達結合（transferring binding）によって、粗製酸化スズ／セロビオース／ タンパク質接合体は、光子相関分光分析法および透過電子顕微鏡法で測定した結 果、３５０±８４ｎｍの大きさであった。低濃度の金抗体によって降下し、減圧 乾燥された試料は、３５〜５０ｎｍの大きさであった。セロビオースの結合層が ないと、減圧乾 燥された切片は、４００〜１０００超ｎｍの大きさであった。時々、抗体の結合 が認められた。高濃度の免疫金の標識付けと濾過を行った後、セロビオースで処 理された薄い切片の試料は、５０〜１００ｎｍの大きさであった。正の金の結合 （positive goldbinding）は、適正にコートされた試料の約２０％に確認された が、一方、負の対照（一次ラビット抗体を欠いていることを除き先に述べたのと 同様に製造）は、約１％の非特異的結合を示した。 上記実施例から分かるように、炭水化物で処理されたナノ結晶の金属酸化物粒 子の表面に吸収されたタンパク質の生物活性は、保持されている。 実施例５． エプスタイン・バールウイルスのデコイの製造と特性決定：前に 実施例１で説明したようにして、Ｄ．Ｃ．反応性マグネトロンスパッタリング法 でナノ結晶の酸化スズ粒子を合成した。 傾瀉スクロース勾配法（elutriated sucrose gradient）で精製されたＢ９５ −８細胞系由来のエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）をAdvanced Biotech nologies，Inc．社（米国、メリーランド州、コロンビヤ）から購入した。ウイ ルスの各分取物は、１０ｍＭトリス（ＴＲＩＳ）−１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐｈ ７．５緩衝液中に懸濁され、１ｍｌ当り約５．００×１０10個のウイルス粒子を 含有していた（約０．９４ｍｇ／ｍｌのタンパク質）。Wellsが報告した方法（W ells A.、Koide N.、Klein G.：「Two large virion envelope glycoproteins m ediate EBV binding to receptor-positive cells」、J．Virology１９８２年、 ４１巻、２８６〜２９７頁）の変形を用いて、上記ビリオンを０．７５％（ｖ／ ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で可溶化し、次に１５０，０００×ｇで６０分間、 超遠心分 離を行い、ＤＮＡコアをペレット化した。透析に続いて、ＥＢＶの上澄み抽出液 を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（変性）（Biorad Mini Gel II、４〜２０％勾配ゲル、２ ００Ｖ×４５分間、次いで銀で染色）およびサイズ排除ＤＰＬＣ（非変性）（Ｗ ＩＳＰ自動インジェクターと７２０ホトダイオードアレイ検出器を備えたWaters ６２０システム、１００ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリスｐＨ９．４勾配液の移 動相を用いるWaters ＳＷ３００ ＧＦＣカラムに亘って流量０．５ｍｌ／分〕 。 対照（非ＥＢＶ）タンパク質を、上述の方法と同じ方法を用いて、λファージ ウイルス（Pharmacia社、米国、ウイスコンシン州、ミルウォーキ）の分取物か ら抽出した。 重量が約１．５ｍｇの酸化スズ粉末の分取物を、最初に無塵のガラスバイアル びんに入れた２９．２ｍＭのセロビオース溶液３．０ ｍｌの中に、自由にかき 混ぜて懸濁させた（Vortex Genie、Scientific Industries社、米国、ニューヨ ーク州、ボヘミア）。得られた褐色を帯びて濁った懸濁液を、２５℃で１０．０ 分間、約２０ｋＨｚの周波数で１７５Ｗで音波処理を行った（Branson２″Cup H orn、Branson Ultrasonics Corp．社、米国、コネティカット州、ダンブリー〕 。分散液を、１６，０００×ｇで１５秒間、微小遠心分離にかけて透明化した。 残留ペレットを排棄し、上澄み液を得た。未吸着のセロビオースを、２５ｍＭリ ン酸反応緩衝液（ｐＨ７．４０）２５ｍＭ ＨＰＯ4 2-／Ｈ2ＰＯ4 1-）２０ｍｌ に対して、３７．５℃で７．５ｐｓｉのＮ2ガス圧ヘッド下で、１０ｋＤ呼称分 子量濾過攪拌セル（Pharmacia社）で、除去した。中間生成物の一部について、 光子相関分光分析法で特性を決定し、次いで先に述べたのと同様に透析に続いて 、ドップラ電気泳動光散乱分析法で特性を決定した。 ウイルスタンパク質吸着の工程は、ＥＢＶ抽出液２５０μｌから緩和なトリト ン界面活性剤を、１０ｋＤ呼称分子量の攪拌セルで、４℃のリン酸反応緩衝液２ ５ｍｌに対して限外濾過を行って除去することで開始し、次に１．０μｇ／μｌ の濃度すなわち約１．０ｍｌの最終容量まで調節した。次に上記のトリトンを含 有しないＥＢＶ抽出液５００μｌを、３７．５℃に予め加温した表面処理済酸化 スズ分散液２．０ｍｌとともに、ＭＤ呼称分子量攪拌セルにすばやく添加した。 その混合物をゆっくり攪拌し、３７．５℃で２．０時間インキュベートした。イ ンキュベートを行った後、未吸収のＥＢＶ抽出物を、リン酸反応緩衝液２５ｍｌ に対し限外濾過を行って除去した。 λファージウイルスタンパク質抽出物で作製した対照（非ＥＢＶ）のデコイを 、上記の方法と同じ方法を用いて合成した。 中間成分、最終的に組み立てられたデコイおよび全エプスタイン・バールのビ リオンの特性決定をドップラ電気泳動光散乱分析法（ＤＥＬＳＡ４４０、Coulte r Electronics Inc．社、米国、フロリダ州、ハイアリーア）によって行い、こ れらのものの流動相中での電気泳動移動度（表面電荷）を測定した。２５℃でｐ Ｈが４．５９〜９．０６の範囲内にあり、かつ対応して導電度が２．２９０〜４ ．７２０ｍＳ／ｃｍの範囲内にある９個のリン酸緩衝溶液を調製した。原料の酸 化スズ、セロビオースで被覆して表面を改変した酸化スズ、合成されたＥＢＶデ コイ、および全ＥＢＶそれぞれの分取物を、上記９個の各溶液に対して透析し、 次いで分散液中の粒子の移動度をそれぞれ、４．０、５．５、５．５および８． ０ｍＡの電界強度下で測定した。測定装置の４アングル検出器によって同時に得 た移動度の値を平均し、１分散液当り３個の測定値の平均値を記録した。 合成されたＥＢＶデコイと対照デコイの特性を、免疫凝集光子相関光分析法で 決定して、これらの表面の抗体反応性を測定した。１５％ラクトース、０，９％ ＮａＣｌ、１０ｍｌのＤＥＰＥＳ緩衝液および０，２％ＮａＮ３中の抗ＥＢＶマ ウスモノクローナル抗体の混合液（抗ＥＢＶ−ＶＣＡ、抗ＥＢＶ ＥＡ−Ｒ、抗 ＥＢＶ ＭＡ、および抗ＥＢＶ ＥＡ−Ｄを各々１μｇずつ含有）（DuPont社、 米国、デラウエア州、ウイルミントン〕とともに、ＥＢＶデコイを３７，５℃で ６０分間インキュベートすることによって、陽性反応性を評価した。ＥＢＶデコ イを関連のないマウスＩｇＧ1とともにインキュベートすることによって、バッ クグランド反応性を評価した。λファージデコイをモノクローナル抗ＥＢＶマウ ス抗体と反応させることによって、特異性を評価した。凝集反応は、９０゜の角 度で光子相関分光分析法によって測定した（Ｎ４ＭＤ、Coulter社）。 上記の粒子と抗体を用い次いで二次抗マウス３０ｎｍ金標識付け抗体を添加し て、免疫金透過電子顕微鏡法によって抗体アフィニティの強度を評価した（Faul k W、Taylor G.、「Immunocolloid method for electron microscopy」、Immuno chemistry、８巻、１０８１〜１０８３頁、１９７１年）。 マウスモノクローナルの混合物２０μｌ（１５％ラクトース、０．９％ＮａＣ ｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液およびＮａＮ３中の１μｇの抗ＥＢＶ−ＶＣＡ および１μｇの抗ＥＢＶ ＥＡ−Ｒ（DuPont社））を、ＥＢＶデコイの新しい０ ．５ｍｌの試料とともに、３００ｋＤ呼称分子量の撹拌セルで、３７．５℃で３ ０分間インキュベートすることによって、ＥＢＶデコイの標識付け（陽性反応） を行った。次に、未結合の抗体を、５．０ｐｓｉのＮ2圧力ヘッド下で、２０ｍ ｌのリン酸反応緩衝液に対して限外濾過を行なうことによっ て、除去した。洗浄後、３０ｎｍの金球体に共有結合で融合したヤギ抗マウス抗 体５０μｌ（１０6個の粒子／ｍｌ（Zymed Laboratories社、米国、カリフォル ニア州、サンフランシスコ））を、上記の標識を付けた粒子２００μｌとともに 、３７，５℃で３０分間、１Ｍ呼称分子量の攪拌セル内でインキュベートした。 未結合の二次抗体を、リン酸反応緩衝液１０ｍｌに対して限外濾過を行なうこと によって、除去した。 ２．５μｌのマウスポリクローナル非特異的ＩｇＧ１（１５ｍＭのＮａＣｌ中 １μｇ／μｌ、ｐＨ７．４（Sigma Chemica1 Corp．社、米国、ミズーリ州、セ ントルイス）を、ＥＢＶデコイの新しい０．５ｍｌの試料とともに上記のように インキュベートし、続いて同じ洗浄と金の標識付けステップを実施することによ って、ＥＢＶデコイの標識付け（陰性反応）を実施した。マウスモノクローナル 抗ＥＢＶ抗体とλファージウイルスでコートされたデコイとの混合物２０μｌを 、上記詳述したのと同じ方法を用いてインキュベートすることによって、λファ ージの対照デコイの標識付け（陰性反応）を行った。 電子顕微鏡によって調べるために、免疫標識付け粒子を二通り調製した。カー ボンでコートされた銅の視検グリッド（Ted Pe11a Inc．社、米国、カリフォル ニア州、レディング）を試料中に約５秒間浸漬し次に５％グルタルアルデヒド中 で１分間固定する直接浸漬法を、迅速選別法として全反応に対して用いた。もう 一つの方法は、グルタルアルデヒドを反応溶液に直接添加し、次いで生成物を１ ６，０００×ｇで５分間かけて軟寒天製剤（水中０．７％のアガロース（Sea Ke m社、米国、カリフォルニア州、タメクラ））０．５ｍｌの中にペレット化した 。次いで、視検するために、得られた寒天プラ グをプラスチック中に埋包し、０．１μｍ厚のシートに切断した。 標識を付けた反応生成物のペレット化された試料を、透過電子顕微鏡法で試験 することによって、陰性と陽性の対照の両者の分析を実施した。抗体結合の相対 強度は、金の球体を捕捉したと観察された酸化スズベースの粒子の数を計数し（ ％陽性）、次いで所定の一つの粒子に捕捉された金球体の数を記録する（強度、 数／事象）ことによって、求めた。 透過電子顕微鏡法によって、それらの超微細酸化スズ粒子は、直径が２０〜２ ５ｎｍであり、そして直径が８０〜１２０ｎｍの凝集体を形成していることが分 かった。光子相関分光分析方法によると、これらの同じ粒子は、それらを蒸留水 中に分散させたとき、１５４±５５ｎｍの大きさの集塊を生成した。酸化スズの 粒子は、電子およびＸ線回折で特性決定したところ、充分結晶的であった。エネ ルギー分散式Ｘ線分光分析法によって、不純物として他の元素は全く存在しない ことが分かった。 ＥＢＶタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特性決定を行ったところ、二つ の別のタンパク質バンドを示した。第一のバンドは、可変のグリコシル化を示唆 する二量体として存在し、ＥＢＶの主要なエンベロープ糖タンパク質と一致する 約３５０ｋｄの分子量を示した。第二のバンドは、ウイルスの表面に見かけ上強 く吸着する血清アルブミンと一致する約６７ｋｄの分子量を示した。ＨＰＬＣに よって、二つの区別しうるバンドが存在することが確認さ札 それらのバンドは 、分光測光法で、タンパク質類に一致する２８０ｎｍにおける吸収極大を示した 。主ピークは、クロマトグラフィの保持時間が１０．３０分であり、モノクロー ナル抗ＶＣＡによって９０％抑制できた。第二の比較的小さいピークは、ウシ血 清アルブミン の標品に類似したクロマトグラフィの保持時間１５．７５分を示した。 先に述べたドップラ電気泳動移動度の試験をｐＨ範囲４．５〜９．０で行った ところ、三つの相異なるパターンが実証された。第一のパターンでは、デコイと 未変性のＥＢウイルスの両者力（上記のｐＨ範囲全体にわたって事実上同一の移 動度すなわち約−１．４μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓを保持していた。第二のパターンで は、未処理の酸化スズがｐＨ４．５で約−１．０μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓの移動度を 示し、そして５．０以上のｐＨ値で−０．３μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓの移動度まで急 速に上昇した。第三のパターンでは、セロビオースで処理された表面改変酸化ス ズが、約−１．５μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓを保持していたが、７．５のｐＨにおいて −２．５μｍ−ｃｍ／Ｖ−ｓまで急速に増大した。 先に述べた光子相関分光分析法によって、未変性のＥＢＶは約１０２±３２ｎ ｍの大きさを示し、合成のＥＢＶデコイは約１５４±５２ｎｍの大きさを示した 。合成したＥＢＶデコイは、モノクローナル抗ＥＢＶ混合物と反応させると、凝 集して１５３４±３９４ｎｍの凝集塊を生成した。合成したＥＢＶデコイは、非 特異的マウスＩｇＧと反応させたところ、凝集塊の直径は２３０±７６ｎｍで大 きさがごく僅か大きくなっただけであった。λファージのデコイは、モノクロー ナル抗ＥＢＶ混合物と反応させとところ、凝集塊の直径は１７０±３５ｎｍで大 きさがごく僅か大きくなっただけであった。 抗ＥＢＶ抗体で標識を付けたＥＢＶデコイ粒子を先に述べた透過電子顕微鏡法 で試験したところ、陽性金染色頻度（positive gold stainig frequency）が２ ３．５１±５．５３％で、平均染色強度（average staining intensity）が７． ４１金標識／事象であった。 非特異的マウスＩｇＧ抗体で標識を付けたＥＢＶデコイ粒子を試験した結果、陽 性金染色頻度は５．５３±２．０４％で、平均染色強度は１．００金標識／事象 であった。抗ＥＢＶ抗体で標識を付けたλファージデコイ粒子を試験したところ 、陽性金染色頻度は７．２１±１．２６％で、平均染色強度は１．０６金標識／ 事象であった。 実施例６：エプスタイン・バールウイルスのデコイによる抗体の生体内での誘 発 ：４個の感作溶液を調製し、約８週齢のニュージランドウサギに、隔週毎に１ 度、２５０ｍｌずつの部分標本を３回筋肉内注射で投与した。第一群の４頭の動 物には、１回の注射当たり、リン酸緩衝液に分散させた約１０9の全ＥＢＶビリ オン（２５μｇのウシ血清アルブミン標品に対し、２８０ｎｍでの分光測光法に よる吸収曲線を積分することによって推定した約３２μｇのｇｐ３５０）を投与 した。第二群の４頭の動物には、同じ注射のプロトルコを用い、単離・精製され たｇｐ３５０を１注射当り３２μｇ投与した。第三群の動物には、１注射当たり 、３２μｇのｇｐ３５０の出発部分標本から合成したＥＢＶウイルスデコイ（実 施例５）を投与した。最後の群の動物には、セロビオースでコートされた酸化ス ズをリン酸反応緩衝液に分散させたものを投与した。注射液は、アジュバントを 含有ないものであった。上記３回の注射のそれぞれの２週間後に、心臓突刺によ って無菌的方法を利用して全血を採取し、動物は心臓突刺を終り、６週間目に鎮 静致死させた。全血を１６，０００×ｇで１分間、微小遠心分離にかけることに よって、血清を抽出し、分析を行うまで−７０℃で凍結保管した。 全ＥＢＶビリオン（ＡＢＩ）に対する免疫特異的抗体をＥＬＩＳＡ法で検定し た。リン酸反応緩衝液中の約１０9個／ｍｌのビリオンを、コーティング緩衝液 で１：１０に希釈し、次いでポリカーボ ネートの検定プレート（Falcon社）に４℃で一夜吸着させた。結合されたＥＢＶ ビリオンに対するウサギ血清のアフィニティを、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフ ォスファターゼ（Sigma社）の比色反応（リン酸パラニトロフェニルで展開する ）によって測定した。免疫特異的ＩｇＧの濃度は、吸着される抗原として非特異 的ウサギＩｇＧを用いて較正曲線と比較しかつ酸化スズだけで刺激されたウサギ 由来の血清が入っているウエルから記録されるベースライン値を差し引いて、測 定した。 酸化スズで感作された４頭のウサギから収集した血清は、２週間の間隔をおい て３回資料を採取したいずれの時点でも、免疫前血清を越える抗ＥＢＶ活性の増 大を、全く示さなかった。残りの３群は、６週間にわたって、抗ＥＢＶ特異的Ｉ ｇＧの濃度が次第に上昇するのを示した。精製ＥＢＶタンパクだけで感作された 動物は、６週間後の時点で、約０．０５μｇ／μｌの抗ＥＢＶ ＩｇＧの最大値 を示した。これに対して、全ｅＢＶまたはデコイＥＢＶで感作された動物は、６ 週間時点で、抗ＥＢＶ ＩｇＧが約０．２０ｐｇ／μｌという統計的に有意な４ 倍も大きい応答を示した。デコイＥＢＶおよび全ＥＢＶに対する免疫特異的応答 は、ほとんど同一であった。 実施例５と６から明らかなように、本発明によって合成せれたＥＢＶデコイは 、未変性のウイルスと同じ表面電荷を有し、モノクローナル抗体によって特異的 にかつ強く認識され、そして全ウイルスと同じ有効度で免疫特異性抗体を誘発す る。光子相関分光分析法を用いて、上記３反応条件で凝縮した粒子の数を、凝縮 体の直径の測定値から計算した。これらの計算によると、モノクローナル抗ＥＢ Ｖ抗体が、平均９８８．０個のデコイＥＢＶ粒子からなる凝集塊を生成すること を示している。非特異的マウスＩｇＧ抗体は、平均３． ３３個のデコイＥＢＶ粒子からなる凝集塊を生成し、一方モノクローナル抗ＥＢ Ｖ抗体は、平均１．３５個のデコイ対照λファージ粒子からなる凝集塊を生成す る。これらの測定結果は、本発明のＥＢＶデコイの測定された凝集性能が対照と 比べてほとんど３桁大きいことを示している。免疫金の透過電子顕微鏡法による 試験は、抗ＥＢＶ標識付けＥＢＶデコイの金標識付け抗体染色が対照より２５〜 ３０倍大きいことを示している。ＥＢＶデコイによってウサギに誘発された抗Ｅ ＢＶ ＩｇＧの免疫特異性をＥＬＩＳＡ法で分析した結果は、未変性ウイルスで 誘発された応答と同様であり、単離・精製されたタンパク質によって誘発された 応答より４倍大きい。実施例５と６は、Kossovsky，N．他の「Nanocrystalline Epstein-Barr Virus Decoys」、Journal of Applied Biomaterial、２巻、２５ １〜２５９頁、（１９９１年）に要約されている。 実施例７． ＨＩＶデコイの製造： 下記の手順を用いて、ＨＩＶ膜抗体をダイヤモンドのナノ結晶粒子に吸着させ 、ＨＩＶデコイを提供した。 ＨＩＶ精密検査 １．０ｍｌのＨＩＶ（ＴＣＩＤ ５０の力価は、メーカーの Advanced Biotechnology，Inc．社の測定結果では１０5.75〜１０7.17の間を変 動していた。）を、１００ＫＤ限外濾過によってＰＢＳ中に透析し、必要になる まで−７０℃に凍結した。注射日には、上記ウイルスの貯蔵物を氷上で解凍し、 ＰＢＳで１：２５に希釈した。この製剤１００μｌを注射に使用した。１．０ｍ ｌのＨＩＶ（１ｍｌ当り１０5.75形質転換単位（transforming unit））（ＡＢ Ｉ）を、０．５ｍｌのエンベロープ抽出緩衝液（１．０％のTriton X １００／ ０．２５ｍＭのＤＴＴ／１０ｍＭのトリスｐＨ７． ４／１．０ｍＭのＭｇＣｌ）に添加し、室温で１．０時間インキュベートさせた 。抽出液を、４．０℃で、１００，０００×ｇで２．０時間超遠心分離にかけて （３５，０００ｒｐｍ、ＳＷ５０．１ Beckmanロータ）、ヌクレオキャプシドを 除いた。Triton Xの除去とエンベロープタンパク質の濃縮を、ポリスチレン微小 ビーズのスラリー（Spectra Ge1 D2）３００μｌとともにインキュベートし、次 いでＰＢＳへ１００ｋＤの限外濾過を行うことによって、実施した。１００μｌ の注射のために、抽出液の容量を１．０ｍｌの容量に補正し、次にＰＢＳ内で１ ：２５に希釈するか、または約２．５μｇ／１００μｌ／注射容量のタンパク質 濃度に希釈した。タンパク質の量子化は、ＨＰＬＣで実施した。ＨＰＬＣの条件 は、次のとおりであった。すなわち、Waters ＧＦＣ ＳＷ３００／移動相：３ ００ｍＭ ＮａCｌ、２０ｍＭリン酸ｐＨ７．４／０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量に おいて保持時間が約８．９分の一つの大きなピーク／インテグレーションは、Ｂ ＳＡ標品に対して行った。 ＨＩＶデコイの製造。 ＨＩＶｅｘを、ｐＨ７．４０の２０ｍＭリン酸緩衝液 に対して限外濾過を行った後１．０ｍｌの容量に調節し、５００ｍＭのセロビオ ースで予めコートされたダイヤモンド粒子１．０ｍｌとともに４．０℃で２４時 間インキュベートした。そのダイヤモンドの粒子は、平均粒子寸法が５０ｎｍの オーダーであった。吸着の後、そのデコイ分散液を、ＰＢＳに対して３００ｋＤ の限外濾過を行って未吸着のタンパク質を除くことによって注射用に調製し、Ｐ ＢＳで１．０ｍｌに調節し、次いで１００μｌずつ１０個の注射液に区分けした 。 ＨＩＶデコイの免疫活性 ウサギ、モルモットおよびマウスに、生ウイルス、タンパク質抽 出液、フロイントアジュバントと混合したタンパク質抽出液またはＨＩＶデコイ ウイルスのいずれかを注射した。全ウイルスに対する抗体力価をＥＬＩＳＡ法で 測定し、ウェスタンブロット法で特性を決定した。細胞媒介反応性を、モルモッ トで、生ウイルスによる真皮攻撃を行い次いで生検を行うことによって、評価し た。 生理的ｐＨにおいて、これらの合成担体の平均電気泳動移動度および平均分散 直径（５０ｎｍ）は、それらの伝染性対応物のものと極めてよく似ていた。マウ ス、モルモットおよびウサギにＨＩＶデコイで予防接種を行ったところ、ＥＬＩ ＳＡ法によって測定した結果、全ＨＩＶ製剤に対し特異的な結合性を示す抗血清 の産生を誘発した。デコイウイルスおよび全ウイルスで感作された動物のイヤー プリック（earprick）部位を組織学的に分析した結果、１、２、７および２４週 間後の時点で、フロイントで感作された動物および精製タンパク質で感作された 動物の両者とは有意に異なる類似（定性的および定量的に）の反応を示した。結 合特異性は、ウェスタンブロット法で確認した。 上記の実施例で分かるように、本発明のＨＩＶデコイは、未変性の全ＨＩＶウ イルスと共有する多くの特性をもっている。これらの特性には、大きさ、表面電 荷、免疫認識性、同等の抗体力価を誘発する性能、および細胞応答の大きさと特 性が含まれる。これらの属性は、本発明のデコイウイルスが予防接種剤（ワクチ ン）として有効に機能できることを示している。 本願で引用したすべての文献の全内容をここに本願に参照として援用するもの である。 以上のように本発明の代表的実施態様を説明してきたが、当該技術分野の当業 者は、開示されたのは代表的なものだけでありかつ各 種の他の変形を本発明の範囲内で実施することができると解すべきである。した がって、本発明は、本願で示した特定の実施態様に限定されるものではなく、以 下の請求項によってのみ限定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 ゲルマン アンドリュー イー. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 90036 ロサンジェルス ノーススタンレ ーアベニュー 418 (72)発明者 スポンスラー エドワード イー. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91505 バーバンク マニングストリート 1921

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト免疫不全ウイルスに対し免疫応答を誘発させるために動物を処置する のに用いるワクチンであって、 デコイウイルスを含有し、そのデコイウイルスは、 直径が約１０〜２００ナノメートルのコア粒子と、 ヒト免疫不全ウイルスの免疫学的に活性のフラグメントを変性させることな く、該フラクグメントを捕捉するのに充分なしきい表面エネルギを前記コア粒子 に与え、かつ前記コア粒子の表面の少なくとも一部を被覆する物質を含有するコ ーティングと、 前記のコートされたコア粒子に結合されて前記デコイウイルスを形成する、 ヒト免疫不全ウイルスの少なくとも一つの免疫学的に反応性のフラグメントを含 有するものであり、および 前記デコイウイルス用の、医薬として許容される担体を含有してなるワクチン 。 ２．請求項１に記載のワクチンであって、 前記物質が二糖類であるもの。 ３．請求項２に記載のワクチンであって、 前記コーティングがセロビオースであるもの。 ４．請求項１に記載のワクチンであって、 前記コア粒子が金属、セラミックまたはポリマーを含有しているもの。 ５．請求項４に記載のワクチンであって、 前記金属が、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀および 白金からなる群から選択されるもの。 ６．請求項４に記載のワクチンであって、 前記セラミックが、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化ルテニウム、炭素お よびスズ酸化物からなる群から選択されるもの。 ７．請求項１に記載のワクチンであって、 前記コア粒子が本質的にダイヤモンドで構成されているもの。 ８．請求項１に記載のワクチンであって、 ヒト免疫不全ウイルスの前記フラグメントが、ｇｐ １２０、ｇｐ １６０およ びｇｐ ４１からなるフラグメントの群から選択されるもの。 ９．ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体を生成させるために動物にワクチン接 種をする方法であって、 前記ヒト免疫不全ウイルスに対する前記抗体を生成させる免疫応答を誘発する のに充分な量の請求項１に記載のデコイウイルスを前記動物に投与するステップ を含んでなる方法。 １０．請求項９に記載の動物にワクチン接種をする方法であって、前記コア粒 子が、金属、セラミックまたはポリマーを含有しているもの。 １１．請求項９に記載の動物にワクチン接種をする方法であって、前記コア粒 子が本質的に酸化スズで構成されているもの。 １２．請求項９に記載の動物にワクチン接種をする方法であって、前記コア粒 子が本質的にダイヤモンドで構成されているもの。 １３．請求項１２に記載の動物にワクチン接種をする方法であって、 前記コーティングが本質的にセロビオースで構成されているもの。
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