【発明の詳細な説明】発明の名称
肝モデル発明の分野
本発明は、機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、肝毒性もしく
は胆汁分泌停止能、肝性抽出能、胆汁中への肝性放出、代謝物質の産生、または
肝細胞代謝を変性する能力に関し、化合物をスクリーニングするための有用且つ
新規な方法に関する。本発明の新規な方法の使用により、動物自体で毒性検査及
び医薬開発などを研究する必要が軽減し、また化学実験に必要な動物総数も減少
する。更に、このスクリーニング手順から得られた情報は、完全動物を用いて行
う試験において生じるような他の器官及び組織との間の反応に由来する干渉を含
むことがない。発明の背景
肝毒性もしくは胆汁分泌停止能、肝性抽出能、肝性放出、代謝物質の産生、及
び肝細胞代謝を変性する化合物の能力に関し、新薬候補をスクリーニングするた
めに完全動物を使用することに対しては科学的、経済的及び倫理的な面で制約が
あり、これらに対する配慮から化合物のin vivo動態を正確に反映するようなin
vitro/ex vivo系の研究が進
められている。
細胞外マトリックスの幾何学的形態が肝細胞機能に与える影響は、Dunnらによ
ってサンドイッチ構造を用いて報告されている（J.C.Y.Dunnら、The FASEB Jour
nal，Vol 3，174-177(1992)；The Journal of Cell Biology，Vol 116，1043-10
53(1992)；及びBiotechnol．Prog.，Vol 7，237-245(1991)）。これらの論文に
よれば、コラーゲンサンドイッチ系で培養された成熟ラット肝細胞は、正常形態
、並びに、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、胆汁酸及び尿素
などの生理的分泌速度を少なくとも42日間維持していた。この期間中はこれらの
細胞が、正常肝臓中で検出されるレベルと同様のアルブミンmRNAを維持している
ことも判明した。
本発明は、肝細胞に対する化合物の作用及び化合物に対する肝細胞の作用を測
定するために肝細胞培養物が有用であることを実証した。ラット及びブタの肝細
胞培養物を硬質または軟質の基質、即ち非ゲル化またはゲル化コラーゲンの上で
増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆した。これらの細胞は培養物全体に行き
渡る均一な毛細胆管網の形成を開始した。典型的には、コラーゲンゲルで被覆し
た24
時間後に、形成された肝細胞培養物の特徴はほぼ完全な連続的毛細胆管網を示す
ことであった。これらの「サンドイッチされた」細胞培養物を電子顕微鏡観察に
よって形態分析すると、大部分の隣接細胞間にチャンネルが形成され、これらの
チャンネルは、結合複合体、微絨毛及び頂膜直下の末端アクチン網のような生体
の毛細胆管の特性を多く有していることが確認された。これらの細管はまた、肝
細胞培養物に加えられた生体異物を濃縮する機能を有している。従って本発明に
おいては、このようにして培養された肝細胞が多様な化合物をスクリーニングす
るために使用でき、これに伴って実験動物の犠牲を極めて少なくできることが証
明された。発明の概要
機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、肝毒性もしくは胆汁分泌
停止能、肝性抽出能、肝性放出、代謝物質の産生、または肝細胞代謝を変性する
化合物の能力に関し、化合物をin vitroスクリーニングする方法がここに提供さ
れる。該方法は、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細
胞培養培地と約90％の等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁
させ、約350×重力で約５分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調整し、コラーゲ
ンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中でイン
キュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約２時間後に肝細胞培養培地を交換及び
補充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に肝細胞を収容した皿を約１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に添加し、
(h)光学顕微鏡によって細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュ
ベートし、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１fMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約１分間か
ら約２週間インキュベートし、
(j)細管網、細胞極性または細胞骨格構造の総体的な形態変化または構造変化を
評価するか、肝細胞内部に含まれているかもしくは培養溶液中に残留している化
合物の量を測定するか、細管網内部に取りこまれている胆汁中に分泌された化合
物を定量するか、または、肝細胞代謝の変性の程度を測定する段階を含む。発明の詳細な説明
本発明者らは、機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、肝毒性も
しくは胆汁分泌停止能、肝性抽出能、肝性放出、代謝物質の産生、または肝細胞
代謝を変性する化合物の能力をin vitro評価するための新規な化合物スクリーニ
ング手順を見出した。本発明の方法は、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
５分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調整し、コラーゲ
ンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％
CO2の雰囲気中でインキュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約2時間後に肝細胞培養培地を交換及び補
充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に肝細胞を収容した皿を約１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に添加し、
(h)光学顕微鏡によって細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュ
ベートし、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１fMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約１分間か
ら約２週間インキュベートし、
(j)細管網、細胞極性または細胞骨格構造の総体的な形態変化または構造変化を
評価するか、肝細胞内部に含まれているかもしくは培養溶液中に残留している化
合物の量を測定するか、細管網内部に取りこまれている胆汁内に分泌された化合
物を定量するか、または、肝細胞代謝の変性の程度を測定する段階を含む。
本発明の実施によれば、硬質または軟質のコラーゲン基質上で増殖させ次いで
コラーゲンゲルで被覆した一次肝細胞は、培養物全体に行き渡る均一な毛細胆管
の形成を開始し、この培養物を化合物のスクリーニングに使用し得る。典型的に
は、被覆の24時間後に肝細胞培養物は複数の細胞を相互接続する吻合性毛細胆管
網を形成していた。これらの「サンドイッチされた」肝細胞培養物の形態分析に
よれば、大部分の隣接細胞間にチャンネルが形成されており、これらのチャンネ
ルは接合複合体、微絨毛及び頂膜直下の末端アクチン網のような生体の毛細胆管
の特徴を多く有していることが確認された。
「サンドイッチされた」肝細胞培養物を頂膜マーカーに対する抗体（アミノペ
プチダーゼN、ジペプチジルペプチダーゼIV）によって免疫染色すると、チャン
ネル構造と結合した原形質膜領域が強力な蛍光染色を示した。更に、チャンネル
の形成以前及び以後にアクチンミクロフィラメント及び微小管に対する肝細胞培
養物の二重蛍光標識を行うと、チャンネルの形成中に細胞性アクチン及びチュー
ブリンの顕著な編成替えが生じることが判明した。アクチン染色のパターンは、
張力繊維の散在性分布からチャンネル膜直下
の強力な周辺性染色に変化した。アクチン染色のこのような転位は、新しく形成
されたチャンネルを包囲して細管周囲アクチン網が形成されることを示す電子顕
微鏡写真の観察と一致した。チューブリン染色は、新しく形成された細管の前縁
に付着しこの前縁から放射状に伸びる微細管束列の存在を示していた。
ゲル化または非ゲル化のコラーゲンから成る基底マトリックスをコートした組
織培養皿上で一次肝細胞を平板培養し、細胞を拡散させて細胞間接触を生じさせ
、次いで培養物の上部を細胞外マトリックスで被覆しゲル化することによって肝
細胞培養物を調製する。肝細胞調製の少なくとも１日前に組織培養皿にコラーゲ
ンをコートする。硬質の非ゲル化増殖基質を得るために、３mg/mlのVitrogen（
登録商標）を含む200〜250μlの溶液（またはその他のコラーゲン溶液）を各100
mMの組織培養皿に添加し、テフロンポリスマンによって均等に拡散させる。コー
トされた皿を37℃で１夜維持し、次にコラーゲンを中和するために５mlの新しい
組織培養培地を添加する。ゲル化した基底マトリックスを得るためには、中和Vi
trogen（8:1:1のVitrogen（登録商標）:10×ダルベッコの改質イーグル培地:0.1
NのNa0H）を調製し、上記と
同様にペトリ皿に拡散させる。プレートを37℃に30〜40分間維持してコラーゲン
ゲルを形成させ、次に新しい培地を皿に添加して37℃で保存する。使用直前に、
プレコートした培養皿から培地を吸引する。
標準コラゲナーゼ潅流法（Selgen，P.O．METHODSBIOL.，1976 13，29-83）を
用いて肝細胞を単離する。肝臓をカルシウム非含有緩衝液で８〜９分間潅流し、
次いでカルシウム及びコラゲナーゼ(0.3mg/ml)を含有する緩衝液で約10〜12分間
潅流する。次に肝臓を切開し、滅菌ナイロン網によって遊離肝細胞を未消化組織
から引き離す。次に、遊離細胞を２つの50ml遠心管に分割し、ホルモン非追加の
５％ウシ胎仔血清含有のダルベッコの改質イーグル培地で１回洗浄する。細胞ペ
レットを90％等張パーコールと培地との1:1混合物に再懸濁させ、350×gで5分間
遠心する。生存肝細胞を含有しているペレットを新しい培地に再懸濁させ、１回
洗浄し、プレコートした皿に肝細胞を9×106細胞/皿の密度で添加し、５%CO2の
インキュベーター内で37℃でインキュベートする。２〜３時間後、培地を、0.4
μg/mlのデキサメタゾン、４μg/mlのインシュリン及び20ng/mlのEGFを含む新し
い温培地に交換する。引き続いて培地を、ホルモン添加し
た新しい温培地に１日１回の割合で交換する。平板培養の24〜48時間後に、培養
培地を吸引除去し１mlの中和コラーゲン（8:1:1のVitrogen:10×ダルベッコの改
質イーグル培地:0.1NのNaOH）を添加することによって培養物をコラーゲンゲル
で被覆する。次に培養物を37℃で30〜40分間インキュベートしてマトリックスを
ゲル化させ、その後に新しい培地を皿に添加する。次に倒立顕微鏡を用いた位相
差顕微鏡観察によって毛細胆管の形成をモニターする。
本発明の１つの実施態様においては、肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１fM
から約１mMの化合物を含有する溶液を約１μlから約５mlの量で添加し、細胞を
収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中で約５分間から
約96時間インキュベートすることによって、化合物の肝毒性または胆汁分泌停止
能を評価し得る。次いで肝細胞培養物を試験し、化合物によって肝細胞培養物に
何らかの毒作用が生じていればその程度を測定する。
このような肝細胞毒性に関する化合物のスクリーニング方法は、明瞭な輪郭の
細管が形成され従って細管の形態変化を直接観察し得るので特に好都合である。
第２の実施態様においては、「サンドイッチされた」肝
細胞培養物を用い、肝細胞抽出能力に関して、スクリーニングすべき化合物を約
１pMから約50mMの量で含有する溶液を約１μlから約５mlの量で培養物に添加し
、肝細胞を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中で約1分間から約４
時間インキュベートすることによって、化合物をスクリーニングする。薬剤含有
緩衝液を除去し、等張塩溶液（即ち、リン酸塩緩衝塩溶液またはハンクの平衡塩
溶液）で細胞を洗浄し、界面活性剤溶液（即ち、ドデシル硫酸ナトリウム）で細
胞を溶解し、シンチレーションカウンティング、HPLC、吸光度または蛍光定量法
のような分析手順を用いて溶解液及び出発インキュベーション溶液中の薬剤の量
を測定することによって、肝細胞内部に含まれた化合物の量を決定する。または
、蛍光化合物の場合には、細胞に結合した蛍光の直接測定によって化合物の直接
量を評価し得る。
このような肝細胞毒性に関して化合物をスクリーニングする方法は、化合物が
、Ｉ型カチオン性、II型カチオン性、アニオン性、胆汁塩及びアシアログリコプ
ロテイン受容体のような活性キャリアー系を用いて肝細胞に運搬される場合、ま
たは化合物が肝細胞に受動的に吸収される場合には、肝臓による化合物の抽出に
関する標準を示すので特に好都
合である。
本発明の第３の実施態様においては、肝細胞培養物と化合物との相互作用によ
る代謝物質産生のスクリーニングが行われる。このスクリーニング手順では、肝
細胞培養物に適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液を約１
μlから約５mlの量で培養プレートに添加する。次に培養物を、約37℃、約95％
相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中で約30分間から約2週間インキュベートする。
時々インキュベーション培地サンプルを採取し、インキュベーションが完了した
時点で親化合物の減量と新しい代謝物質の産生量とを、HPLC、TLC、質量分析法
のような化学的分析技術を用いて測定し得る。同様の方法で、細胞に結合した親
化合物と代謝物質とを界面活性剤細胞溶解物から測定し得る。
本発明の第４の実施態様において、以下のスクリーニング方法で測定される肝
細胞代謝を変性する化合物の能力も本発明の範囲に包含される。この方法では、
適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液を約１μlから約５m
lの量で肝細胞培養物に添加する。代謝経路用基質を添加し、培養物を約37℃、
約95％相対湿度及び約5％CO2の
雰囲気中で約30分間から約２週間インキュベートする。化合物の存在下または非
存在下に基質から形成された産物を同定及び定量することによって肝細胞の代謝
を測定する。
本発明の第５の実施態様は、このコラーゲンサンドイッチ構造中で増殖した肝
細胞が細管内への生体異物の排泄に適応するという知見に依存する。化合物を胆
汁中に放出する肝性放出能はこのスクリーニング方法を用いて測定され得る。肝
細胞培養物に適合性の溶媒中にスクリーニングすべき化合物を約１pMから約50mM
の量で含有する溶液を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加する。次に
培養物を、約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中で約１分間から約
４時間インキュベートする。この時点でリン酸塩緩衝生理食塩水を用いて細胞を
洗浄し、次に細管をEDTAで破壊する。即ち、EDTAは細胞膜を破壊することなく細
管を封鎖している融合膜を破壊する。この方法では、細胞内に取込まれた物質に
妨害されることなく、細管網内に分泌された物質を測定し得る。１mg/mlのカル
ボキシフルオレセンジアセテートを含む５μlの溶液または１mg/mlのローダミン
Bを含む５μlの溶液を培地に導入したとき、これらの化合物は、「サンドイッチ
された」肝細胞の細管網内に選択的に
分泌されて濃縮することが蛍光顕微鏡によって観察された。カルボキシフルオレ
セン蛍光はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で処理すると遊離し、これは融合膜に
よって結合されたマクロドメインの形成と一致する。
この方法はまた、多数の化合物の同時的スクリーニングに応用できる。適合性
溶媒によって可溶化され得る任意数の化合物を肝細胞培養物に同時に提供し得る
。肝細胞毒性が観察された場合には、どの化合物またはどの化合物群が効果を発
揮したかを決定するために、引き続いてこれらの化合物の各々を個別にスクリー
ニングするとよい。
「スクリーニング」なる用語は、一連の化合物またはその混合物の潜在的特定
活性に関する判定を意味する。
「化合物」なる用語は、毒性または治療特性を潜在的に有する任意の化学物質
またはその混合物を意味する。
「連続的な」という用語は、細管が細胞培養物全体に行き渡る多細胞チャンネ
ル網を形成し、この網が培養物内部の複数の細胞を統合し単離細胞の結合体では
なく多数細胞に連続していることを意味する。
「肝毒性」なる用語は、正常肝機能に有害な影響を与えるかまたは肝細胞の生
存率を低下させる活性を意味する。
「胆汁分泌停止能」なる用語は、正常な胆汁分泌量を減少させる傾向を意味す
る。
「一次肝細胞培養物」なる用語は、in vitroに維持された正常肝細胞を意味す
る。
「機能性毛細胆管網」なる用語は、化合物の長手方向への分泌能力を維持する
肝細胞間の吻合性相互接続管状路を意味する。
「コラゲナーゼ潅流」なる用語は、肝細胞を分離及び単離するために、コラゲ
ナーゼ溶液で肝臓をin situ潅流し細胞間接触及び細胞／基底膜接触の酵素的破
壊を生じさせることを意味する。
「肝細胞培養培地」なる用語は、肝細胞の生存を支持するために必要な栄養素
及び成長因子を含有する維持溶液を意味し、例えば、0.4μg/mlのデキサメタゾ
ン、４μg/mlのインシュリン及び２ng/mlの上皮増殖因子を補充した５％ウシ胎
仔血清、非必須アミノ酸、グルタミン、抗生物質、抗菌物質を含むダルベッコの
改質培地を意味する。
「パーコール溶液」なる用語は、細胞及び細胞性成分を密度差に基づいて遠心
分離するために使用されるポリビニルピロリドン皮膜をもつコロイド状シリカの
混合物を意味
する。
「コラーゲンをプレコートした培養皿」という表現は、コラーゲンゲルを表面
に吸着しているかまたは非ゲル化コラーゲンを表面で乾燥させたプラスチックの
ウエルまたはプレートを意味する。
「約１mlの低温中和コラーゲンで被覆する」という表現は、培養皿またはウエ
ルに予め付着させた細胞の上面にコラーゲン溶液を載せる処理を意味する。
「細胞間接触」なる用語は、隣接細胞間の付着を意味する。
「細管網が発達する」という表現は、多数細胞を相互接続する連続的細管の網
目構造が形成されることを意味する。
「肝細胞培養物に適合性の溶媒」という表現または「適合性溶媒」なる用語は
、実験手順及び肝細胞維持の正常な進行中を通じて、培養された肝細胞内に好ま
しくない生化学的または形態的変化を誘起しない溶液を意味する。
「細管網の総体的な形態変化または構造変化」という表現は、細管の物理的外
観の変化及び／または膜成分もしくは細胞骨格成分即ちアクチンもしくはチュー
ブリンの再分布を意味する。
「細胞極性」なる用語は、細胞に単側性(sideness)、即ち、細管に面する側及
び類洞間隙に面する側を与える、細胞性成分または膜成分の不均等な分布を意味
する。
「肝性抽出能」なる用語は、化合物が肝臓内部に吸収される傾向を意味する。
「胆汁中への化合物の肝性放出能」なる表現は、化合物が毛細胆管内に分泌さ
れる傾向を意味する。
「化合物からの代謝物質の産生をスクリーニングする」という表現は、肝臓内
の酵素的経路によって化学的に修飾され得る化合物の能力を判定することを意味
する。
「肝細胞代謝を変性させる化合物の能力」という表現は、肝臓内の生化学的経
路と相互作用して代謝産物の定量的または定性的変化を生じさせる化合物の能力
を意味する。
「肝細胞代謝の変性度を測定する」という表現は、放射性標識基質もしくは蛍
光基質または化学分析のような分析技術を用い、生化学的経路による産物形成の
定量的または定性的変化を測定することを意味する。
このスクリーンに使用される化合物は、任意の標準分析技術を用いて定量でき
る。使用できる標準分析技術の非限定例としては、高性能液体クロマトグラフィ
ー(HPLC)、ガ
スクロマトグラフィー(GC)、質量分析法(MS)、電気泳動、光学吸収、蛍光定量、
放射性同位体の定量などがある。
細管網、細胞極性または細胞骨格構造の総体的な形態変化もしくは構造変化は
、光学顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、タンパク質の化学的修飾
、抗体標識などを用いて評価し得る。実施例 実施例１ ラット肝細胞に対するコラーゲン被覆の効果
乾燥した非ゲル化コラーゲンまたはゲル化したコラーゲンをコートした組織培
養プレート上で増殖させた一次ラット肝細胞の上面で、中和ウシ皮膚コラーゲン
（Vitrogen(登録商標)）をゲル化させる実験を実施した。被覆コラーゲンマトリ
ックスのゲル化後、組織培養培地を皿に添加し、95％空気５％CO2の湿潤インキ
ュベータ内で37℃で細胞をインキュベートした。１日後の細胞を位相差顕微鏡で
観察すると、複数の細胞にわたって伸長しており細胞を包囲する屈折チャンネル
のように見える精密な細管チャンネル網が発達していた。電子顕微鏡及び蛍光顕
微鏡によって観察するとこれらのチャンネルが毛細胆管であることが確認された
。
被覆された肝細胞を電子顕微鏡で観察すると、両側に融合膜が結合し細管膜の直
下に緻密なアクチン網を有している隣接細胞間の微絨毛内包チャンネルが存在し
ていた。蛍光標識抗体を使用して蛍光顕微鏡で観察すると、天然の肝臓で観察さ
れるのと同様に細管チャンネル内に頂膜マーカーであるアミノペプチダーゼN及
びジペプチジルペプチダーゼが存在することが確認された。また、ファロイジン
の蛍光性接合体を用いると、天然の肝臓と同様に肝細胞中のアクチンが細管周縁
領域に高度に局在していることが判明した。電子顕微鏡観察によれば、コラーゲ
ンで被覆した細胞の形態は、ゲル化コラーゲンから成る基底膜上で増殖させたと
きのほうが乾燥コラーゲン上で増殖させたときよりも良好であることが判明した
。位相差顕微鏡観察によれば、ラット尾コラーゲン、ウシ鍵コラーゲン及びウシ
皮膚コラーゲンはいずれも基底膜及び被覆マトリックスの双方に有効なマトリッ
クスであることが判明し、Engelbreth-Holm-Swarmマウス腫瘍(MatrigelTM)由来
の細胞外マトリックスも被覆マトリックスとして有効であることが判明した。実施例２ ブタ肝細胞に対するコラーゲン被覆の効果
乾燥した非ゲル化コラーゲンまたはゲル化したコラーゲンをコートした組織培
養プレート上で増殖させた一次ブタ肝細胞の上面で、中和コラーゲン（Vitrogen
(登録商標)）をゲル化させる実験を実施した。被覆コラーゲンマトリックスのゲ
ル化後、組織培養培地を皿に添加し、95％空気５％CO2の湿潤インキュベータ内
で細胞を37℃でインキュベートした。１日後の細胞を位相差顕微鏡で観察すると
、ラット肝細胞で観察されたものと同様に複数の細胞にわたって伸長した精密細
管チャンネル網が発達していることが判明した。実施例３ コラーゲンで被覆された肝細胞は生体異物を毛細胆管に濃縮する
コラーゲンでサンドイッチされた肝細胞が、ジカルボキシフルオレセンを細胞
内部から細管に運搬し化合物を細管に濃縮する能力を有していることを実証する
実験を実施した。コラーゲン被覆の５日後に、培養物を１〜10μg/mlのジカルボ
キシフルオレセンジアセテートを含有するハンクの平衡塩溶液中で37℃でインキ
ュベートしてジカルボキシフルオレセンジアセテートを取込ませ、プローブをジ
カルボ
キシフルオレセンに変換した。５〜15分後に残留ジカルボキシフルオレセンジア
セテートを除去し、細胞をハンクの平衡塩溶液で３〜４回洗浄した。ジカルボキ
シフルオレセンの取込みを蛍光顕微鏡で観察し、これが細胞内部に局在しまた毛
細胆管にある程度蓄積されていることを確認した。37℃で更に15〜30分間インキ
ュベーション後、位相差顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察を比較すると、ジカルボ
キシフルオレセンがほぼ毛細胆管だけに局在していることが判明した。２mMのED
TAを用いると細管を封鎖していた融合膜が破壊され細管内に濃縮していたジカル
ボキシフルオレセンが放出される。実施例４ コラーゲンでサンドイッチされた肝細胞による受動吸収及び毛細胆管内への分泌
肝臓によって受動的に吸収され胆汁中に分泌されるローダミンBが、コラーゲ
ンでサンドイッチされた肝細胞によって取込まれ毛細胆管内に分泌されることを
実証する実験を実施した。コラーゲン被覆の５日後に、１μg/mlのローダミンB
を含有するハンクの平衡塩溶液中で培養物を37℃でインキュベートした。５分後
に残留ローダミンBを除去し、細
胞をハンクの平衡塩溶液で３〜４回洗浄した。37℃で更に５〜20分間インキュベ
ーション後、位相差顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡観察を比較すると、ローダミンB
が細管に高度に濃縮され細胞内部では濃縮されずに拡散分布していることが判明
した。実施例５ コラーゲンでサンドイッチされた肝細胞による胆汁塩の活性取込み
コラーゲンでサンドイッチされた肝細胞による胆汁酸の活性取込みを実証する
ための実験を実施した。コラーゲン被覆の24時間後、肝細胞をハンクの平衡塩溶
液で洗浄し、0.1μCiの14C-タウロコール酸塩を含む１mMのタウロコール酸塩と
共に37℃または４℃でインキュベートした。規定時点毎にタウロコール酸塩含有
緩衝液を除去し、培養プレートをハンクの平衡塩溶液で洗浄した。次に肝細胞を
界面活性剤で溶解し、溶解液中の放射性タウロコール酸塩の存在量に基づいて肝
細胞に取込まれたタウロコール酸塩の量を決定した。37℃及び４℃における取込
み量の差に基づいてタウロコール酸塩の活性取込み量を受動取込み量及び吸着量
から識別した。また、サンドイッチされない肝細胞を同
様の細胞密度で用いて取込み実験を実施すると、タウロコール酸塩の取込みに関
してはコラーゲンで被覆された肝細胞のほうが優れていた（表１参照）。
Detailed Description of the InventionInvention title
Liver modelField of the invention
The present invention uses a primary hepatocyte culture having a functional bile canaliculi network and exhibits no liver toxicity.
Is the ability to stop bile secretion, hepatic extraction, hepatic release into bile, production of metabolites, or
Useful for screening compounds for their ability to modify hepatocyte metabolism and
Regarding a new method. By using the novel method of the present invention, toxicity testing and
And the need for research on drug development are reduced, and the total number of animals required for chemical experiments is also reduced.
To do. In addition, the information obtained from this screening procedure should be performed using whole animals.
Including interferences resulting from reactions with other organs and tissues, such as those that occur in clinical trials.
There is no waste.Background of the Invention
Hepatotoxicity or cholestasis, hepatic extraction, hepatic release, production of metabolites, and
To screen new drug candidates for their ability to modify hepatic cell metabolism
There are scientific, economic and ethical restrictions on the use of whole animals for
In consideration of these factors, in
Advance research on in vitro / ex vivo systems
It is
The effect of extracellular matrix geometry on hepatocyte function was described by Dunn et al.
Has been reported using a sandwich structure (J.C.Y.Dunn et al., The FASEB Jour.
nal, Vol 3, 174-177 (1992); The Journal of Cell Biology, Vol 116, 1043-10
53 (1992); and Biotechnol. Prog., Vol 7, 237-245 (1991)). In these papers
Therefore, mature rat hepatocytes cultured in collagen sandwich system showed normal morphology.
, As well as albumin, transferrin, fibrinogen, bile acid and urea
The physiological secretion rate was maintained for at least 42 days. During this period these
Cells maintain albumin mRNA levels similar to those found in normal liver
I also found out.
The present invention measures the action of compounds on hepatocytes and the action of hepatocytes on compounds.
It was demonstrated that hepatocyte cultures were useful to determine. Rat and pig liver
Cell cultures on a hard or soft substrate, ie non-gelled or gelled collagen
Proliferated and then coated with collagen gel. These cells go through the entire culture
The formation of a uniform network of bile canaliculi started. Typically coated with collagen gel
Was 24
After hours, the characteristics of the hepatocyte cultures formed show an almost complete continuous bile canalicular network
Was that. These "sandwiched" cell cultures can be examined by electron microscopy.
Therefore, morphological analysis shows that channels are formed between most adjacent cells,
A channel is a biological complex such as a binding complex, microvilli and terminal actin network just below the apical membrane.
It was confirmed that they have many characteristics of the bile canaliculi. These tubules also
It has the function of concentrating xenobiotics added to the cell culture. Therefore, in the present invention
In this way, hepatocytes cultured in this way screen for diverse compounds.
It can be used to reduce the sacrifice of experimental animals.
RevealedSummary of the invention
Hepatotoxicity or biliary secretion using primary hepatocyte cultures with functional bile canaliculi network
Alters arrest, hepatic extraction, hepatic release, metabolite production, or hepatocyte metabolism
Methods for in vitro screening compounds for their potency are provided here.
Be done. The method is
(a) isolation of hepatocytes by collagenase perfusion,
(b) The isolated cells were washed with hepatocyte culture medium and
Suspend cells in about 50:50 mixture of cell culture medium and about 90% isotonic Percoll solution.
And centrifuge at about 350 x gravity for about 5 minutes,
(c) About 1-2 x 10 per ml of hepatocyte culture medium6Adjust the cell concentration of the cells and
Introduce about 6 ml of cell suspension into the culture dish pre-coated with
(d) Place the dish containing the cells at about 37 ° C, about 95% relative humidity and about 5% CO2In the atmosphere of
Cubes,
(e) Replace the hepatocyte culture medium after about 2 hours to completely remove unattached cells and
Replenish,
(f) After the cells have diffused and cell-cell contact has been established, place the dish containing hepatocytes at a low temperature of about 1 ml.
Step of coating with neutralized collagen solution and gelling the added neutralized collagen
Incubate again under the condition of (d),
(g) Add about 5 ml of hepatocyte culture medium to hepatocytes,
(h) Incubate under the conditions of step (d) until the development of the capillary network is observed by an optical microscope.
Bet
(i) A solution containing about 1 fM to about 50 mM of a compound in a solvent compatible with hepatocyte cultures
Was added to the hepatocyte cultures in an amount of about 1 μl to about 5 ml and the conditions of step (d) for about 1 min.
For about 2 weeks,
(j) Changes in tubule network, cell polarity or cytoskeletal structure
To be evaluated, or contained in hepatocytes or remaining in the culture solution
The amount of the compound is measured, or the compound secreted in the bile that is incorporated inside the tubular network is used.
Quantifying the substance or measuring the degree of alteration in hepatocyte metabolism.Detailed Description of the Invention
The present inventors have used a primary hepatocyte culture having a functional bile canalicular network and also have hepatotoxicity.
Biliary arrest, hepatic extraction, hepatic release, metabolite production, or hepatocytes
A novel compound screeni for in vitro evaluation of the ability of compounds to modify metabolism
Found the procedure. The method of the present invention is
(a) isolation of hepatocytes by collagenase perfusion,
(b) The isolated cells were washed with hepatocyte culture medium and washed with hepatocyte culture medium to about 90%.
Suspend the cells in a mixture of about 50:50 with isotonic Percoll solution and about 350 x gravity.
Centrifuge for 5 minutes,
(c) About 1-2 x 10 per ml of hepatocyte culture medium6Adjust the cell concentration of the cells and
Introduce about 6 ml of cell suspension into the culture dish pre-coated with
(d) Place the dish containing cells at about 37 ° C, about 95% relative humidity and about 5%
CO2Incubate in an atmosphere of
(e) Replace and supplement the hepatocyte culture medium after about 2 hours to completely remove unattached cells.
Charge
(f) After the cells have diffused and cell-cell contact has been established, place the dish containing hepatocytes at a low temperature of about 1 ml.
Step of coating with neutralized collagen solution and gelling the added neutralized collagen
Incubate again under the condition of (d),
(g) Add about 5 ml of hepatocyte culture medium to hepatocytes,
(h) Incubate under the conditions of step (d) until the development of the capillary network is observed by an optical microscope.
Bet
(i) A solution containing about 1 fM to about 50 mM of a compound in a solvent compatible with hepatocyte cultures
Was added to the hepatocyte cultures in an amount of about 1 μl to about 5 ml and the conditions of step (d) for about 1 min.
For about 2 weeks,
(j) Changes in tubule network, cell polarity or cytoskeletal structure
To be evaluated, or contained in hepatocytes or remaining in the culture solution
The amount of the compound is measured or the compound secreted in the bile that is incorporated inside the tubule network.
Quantifying the substance or measuring the degree of alteration in hepatocyte metabolism.
In accordance with the practice of the invention, growth on a hard or soft collagen matrix and then
Primary hepatocytes coated with collagen gel are uniform bile canaliculi throughout the culture.
Formation can be initiated and this culture can be used for compound screening. Typically
24 hours after coating, hepatocyte cultures connect anastomotic capillary ducts that interconnect multiple cells.
Had formed a net. For morphological analysis of these "sandwiched" hepatocyte cultures
According to this, channels are formed between most adjacent cells, and these channels
Are bile ducts in the body, such as the junctional complex, microvilli and terminal actin network just below the apical membrane.
It has been confirmed that it has many characteristics.
The "sandwiched" hepatocyte cultures were treated with an antibody (aminop
Immunostaining with peptidase N, dipeptidyl peptidase IV)
The plasma membrane region associated with the flannel structure showed strong fluorescent staining. Furthermore, the channel
Cell culture for actin microfilaments and microtubules before and after the formation of
Dual fluorescence labeling of the nutrients provided cellular actin and chewing during channel formation.
It was found that a significant rearrangement of Bling occurs. The pattern of actin staining is
Directly below the channel membrane from the dispersive distribution of tension fibers
Was changed to strong peripheral staining. Such dislocations of actin staining are newly formed
Electron microscopy showing that a peritubular actin network is formed surrounding the affected channel
Consistent with the microscopic observation. Tubulin staining is the leading edge of newly formed tubules
It showed the existence of a bundle of fine tube bundles that adhered to the ridge and extended radially from this leading edge.
Base-matrix coated set consisting of gelled or non-gelled collagen
Plate the primary hepatocytes on a woven culture dish to allow the cells to diffuse and create cell-cell contact.
, Then the liver by coating the top of the culture with extracellular matrix and gelling
Prepare cell culture. Collage in tissue culture dishes at least 1 day before hepatocyte preparation.
Coat. To obtain a rigid, non-gelling growth substrate, 3 mg / ml Vitrogen (
200-250 μl (or other collagen solution) containing 100
Add mM to tissue culture dish and spread evenly with Teflon policeman. Co
The cooked dishes were kept at 37 ° C overnight and then 5 ml of fresh to neutralize collagen.
Add tissue culture medium. To obtain a gelled basal matrix, neutralizing Vi
trogen (8: 1: 1 Vitrogen®): 10 × Dulbecco's Modified Eagle Medium: 0.1
N Na0H) and prepared as above
Similarly spread in a Petri dish. Keep the plate at 37 ° C for 30-40 minutes to allow collagen
Allow the gel to form, then add fresh medium to the dish and store at 37 ° C. Just before use,
Aspirate the medium from the precoated culture dish.
Standard collagenase perfusion method (Selgen, P.O.METHODS BIOL., 1976 13, 29-83)
Hepatocytes are isolated using. Perfuse the liver with calcium-free buffer for 8-9 minutes,
Then for about 10-12 minutes with a buffer containing calcium and collagenase (0.3 mg / ml)
Perfuse. Next, the liver is incised and free hepatocytes are undigested with sterile nylon mesh.
Pull away from. The free cells are then split into two 50 ml centrifuge tubes and hormone free.
Wash once with Dulbecco's modified Eagle's medium containing 5% fetal bovine serum. Cell
Resuspend the lett in a 1: 1 mixture of 90% isotonic Percoll and medium, 350 xg for 5 minutes
Centrifuge. Resuspend pellet containing viable hepatocytes in fresh medium and
9x10 hepatocytes in washed and precoated dishes6Add at cell / dish density, 5% CO2of
Incubate at 37 ° C in an incubator. After 2-3 hours, add 0.4
New with μg / ml dexamethasone, 4 μg / ml insulin and 20 ng / ml EGF
Replace with warm medium. Subsequent addition of hormone to the medium
Replace with fresh warm medium once a day. 24-48 hours after plating, culture
Aspirate the medium and remove 1 ml of neutralized collagen (8: 1: 1 Vitrogen: 10 × Dulbecco's
Quality culture medium: collagen gel by adding 0.1 N NaOH)
Cover with. The culture is then incubated at 37 ° C for 30-40 minutes to remove the matrix.
Allow to gel and then add fresh medium to the dish. Next, the phase using an inverted microscope
Biliary bile duct formation is monitored by differential microscopy.
In one embodiment of the invention, about 1 fM in a solvent compatible with hepatocyte cultures.
Solution containing about 1 mM of the compound is added in an amount of about 1 μl to about 5 ml, and the cells are added.
Stored dishes at about 37 ° C, about 95% relative humidity and about 5% CO2From about 5 minutes in the atmosphere
Hepatotoxicity or cholestasis of compounds by incubation for about 96 hours
Can evaluate Noh. The hepatocyte cultures are then tested and the compounds give rise to hepatocyte cultures.
If any toxic effects have occurred, measure their extent.
The method of screening compounds for such hepatotoxicity should have a clear outline.
It is particularly advantageous because the capillaries are formed and thus the morphological changes of the capillaries can be observed directly.
In a second embodiment, the "sandwiched" liver
Approximate compounds to be screened for their ability to extract hepatocytes using cell culture.
A solution containing 1 pM to about 50 mM was added to the culture in an amount of about 1 μl to about 5 ml.
, Hepatocytes at about 37 ° C, about 95% relative humidity and about 5% CO2In an atmosphere of about 1 minute to about 4
Compounds are screened by incubation for a period of time. Drug-containing
The buffer is removed and the isotonic salt solution (ie phosphate buffered salt solution or Hank's balanced salt solution)
Cells) and wash with detergent solution (ie sodium dodecyl sulfate).
Cell lysis and scintillation counting, HPLC, absorbance or fluorimetry
Amount of drug in lysate and starting incubation solution using analytical procedures such as
To determine the amount of compound contained inside the hepatocytes. Or
In the case of fluorescent compounds, direct measurement of the compound by direct measurement of cell-bound fluorescence
The amount can be evaluated.
Methods of screening compounds for such hepatotoxicity include:
, Type I cationic, type II cationic, anionic, bile salts and asialoglycop
When delivered to hepatocytes using an active carrier system such as the Rotein receptor,
Or when the compound is passively absorbed by hepatocytes, the
Especially good cities
It is the case.
In a third embodiment of the invention, the interaction between the hepatocyte culture and the compound is used.
Screening for metabolite production is performed. In this screening procedure, the liver
A solution containing about 1 pM to about 50 mM of the compound in a solvent compatible with the cell culture is about 1
Add from μl to about 5 ml to the culture plate. Then culture the mixture at approximately 37 ° C and approximately 95%
Relative humidity and about 5% CO2Incubate in an atmosphere of about 30 minutes to about 2 weeks.
Sometimes incubation medium samples were taken to complete the incubation
At that time, the weight loss of the parent compound and the production amount of the new metabolite were analyzed by HPLC, TLC, and mass spectrometry.
It may be measured using a chemical analysis technique such as. In a similar manner, the parent bound to the cell
Compounds and metabolites can be measured from detergent cell lysates.
In the fourth embodiment of the present invention, the liver measured by the following screening method:
The ability of compounds to alter cellular metabolism is also within the scope of this invention. in this way,
A solution containing about 1 pM to about 50 mM compound in a compatible solvent is about 1 μl to about 5 m
l volume is added to hepatocyte cultures. Substrates for metabolic pathways were added and the culture was incubated at approximately 37 ° C,
About 95% relative humidity and about 5% CO2of
Incubate in an atmosphere for about 30 minutes to about 2 weeks. In the presence or absence of compounds
Metabolism of hepatocytes by identifying and quantifying the product formed from the substrate in the presence
To measure.
The fifth embodiment of the present invention is the liver grown in this collagen sandwich structure.
It relies on the finding that cells adapt to excretion of xenobiotics into the tubules. Compound bile
The hepatic release capacity released in the juice can be measured using this screening method. liver
Compounds to be screened in a solvent compatible with cell culture from about 1 pM to about 50 mM
Is added to the hepatocyte culture in an amount of about 1 μl to about 5 ml. next
Culture at 37 ° C, 95% relative humidity and 5% CO2In the atmosphere of about 1 minute to about
Incubate for 4 hours. At this point the cells were depleted using phosphate buffered saline.
Wash and then break tubules with EDTA. That is, EDTA does not break down the cell membrane and
Destroy the fusion membrane blocking the tube. In this method,
The substances secreted into the tubule network can be measured without interruption. 1 mg / ml cal
5 μl solution containing boxyfluorescein diacetate or 1 mg / ml rhodamine
When 5 μl of solution containing B was introduced into the medium, these compounds
Selectively "within the tubular network of hepatocytes
Secretion and concentration were observed by fluorescence microscopy. Carboxyfluore
Sen fluorescence was released by treatment with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), which was released to the fusion membrane.
It is thus consistent with the formation of bound macrodomains.
This method can also be applied to the simultaneous screening of multiple compounds. compatibility
Any number of compounds that can be solubilized by a solvent can be simultaneously provided to hepatocyte cultures
. If hepatotoxicity is observed, which compound or compound group is effective.
Each of these compounds is then individually screened to determine if it has evolved.
Good to learn.
The term "screening" refers to the potential identification of a series of compounds or mixtures thereof.
It means a judgment regarding activity.
The term "compound" refers to any chemical substance that potentially has toxic or therapeutic properties.
Or a mixture thereof.
The term "continuous" refers to a multicellular channel in which tubules are spread throughout the cell culture.
Form a network of cells that integrates multiple cells inside the culture and
It means that it is continuous to a large number of cells.
The term "hepatotoxicity" refers to the detrimental effect on normal liver function or the production of hepatocytes.
It means the activity of decreasing the survival rate.
The term "ability to stop bile secretion" refers to the tendency to decrease normal bile output.
It
The term "primary hepatocyte culture" refers to normal hepatocytes maintained in vitro.
It
The term "functional bile canalicular network" maintains the longitudinal secretory capacity of a compound
By anastomotic interconnected tubular tract between hepatocytes.
The term "collagenase perfusion" refers to the use of collagenase to separate and isolate hepatocytes.
In situ perfusion of the liver with a Nase solution to enzymatically disrupt cell-cell and cell / basement membrane contacts.
It means to cause destruction.
The term "hepatocyte culture medium" refers to the nutrients needed to support the survival of hepatocytes.
And a maintenance solution containing growth factors, such as 0.4 μg / ml dexamethasone.
5% fetal bovine supplemented with 4 μg / ml insulin and 2 ng / ml epidermal growth factor
Dulbecco's containing serum, non-essential amino acids, glutamine, antibiotics and antibacterial substances
Means modified medium.
The term "Percoll solution" refers to centrifugation of cells and cellular components based on density differences.
Of colloidal silica with polyvinylpyrrolidone coating used for separation
Means mixture
To do.
The expression "culture dish pre-coated with collagen" means that the collagen gel surface
Of plastic that has been adsorbed to
Means a well or plate.
The expression "coating with about 1 ml of cold-neutralized collagen" means a culture dish or a wafer.
Means a treatment of placing a collagen solution on the upper surface of cells previously attached to the capsule.
The term "cell-cell contact" means the attachment between adjacent cells.
The expression "developing the tubule network" refers to a network of continuous tubules that interconnect many cells.
Means that an eye structure is formed.
The expression "solvent compatible with hepatocyte cultures" or the term "compatible solvent" is
, In the cultured hepatocytes throughout the experimental procedure and normal progression of hepatocyte maintenance.
A solution that does not induce unfavorable biochemical or morphological changes.
The expression "overall morphological or structural change of the tubule network" refers to the physical external
Changes in appearance and / or membrane or cytoskeletal components, actin or chew
It means the redistribution of Brin.
The term "cell polarity" refers to the sideness of a cell, that is, the side that faces the tubules.
Means an uneven distribution of cellular or membrane components, giving the side facing the sinusoidal space
To do.
The term "hepatic extractability" refers to the tendency of a compound to be absorbed inside the liver.
The expression "hepatic release ability of a compound into bile" means that the compound is secreted into the bile canaliculi.
It means the tendency to be.
The expression "screening for the production of metabolites from a compound" refers to
Means determining the ability of a compound to be chemically modified by the enzymatic pathway of
To do.
The expression "the ability of a compound to modify hepatocyte metabolism" refers to the biochemical process in the liver.
The ability of a compound to interact with the pathway to produce a quantitative or qualitative change in a metabolite
Means
The expression “measuring the degree of denaturation of hepatocyte metabolism” refers to a radiolabeled substrate or a firefly.
Of the product formation by biochemical pathways using analytical techniques such as photo-substrate or chemical analysis
It means measuring quantitative or qualitative changes.
The compounds used in this screen can be quantified using any standard analytical technique.
It Non-limiting examples of standard analytical techniques that can be used include high performance liquid chromatography.
-(HPLC), gas
Chromatography (GC), mass spectrometry (MS), electrophoresis, optical absorption, fluorescence quantification,
For example, quantification of radioisotopes.
The overall morphological or structural changes in the tubular network, cell polarity or cytoskeletal structure
, Light microscopy, fluorescence microscopy, electron microscopy, chemical modification of proteins
, Antibody labels, etc. can be used for evaluation.Example Example 1 Effect of collagen coating on rat hepatocytes
Tissue culture coated with dry non-gelling collagen or gelling collagen
On the upper surface of primary rat hepatocytes grown on a nutrient plate, neutralized bovine skin collagen
Experiments were performed to gel (Vitrogen®). Coated collagen matri
After gelling the cells, add tissue culture medium to the dish and add 95% air 5% CO 2.2Wet ink
Cells were incubated at 37 ° C in a tub. One day later, the cells were examined with a phase contrast microscope.
Observed, a refractive channel that extends across multiple cells and surrounds the cells
A precise network of capillary channels that looked like was developed. Electron microscope and fluorescence microscope
Microscopic observation confirmed that these channels were bile canaliculi
.
When the coated hepatocytes are observed with an electron microscope, fusion membranes are bound to both sides and
There is a microvilli-encapsulating channel between adjacent cells with a dense actin network below
I was When observed under a fluorescence microscope using a fluorescently labeled antibody, it is observed in the natural liver.
In the same way as in the tubule channel, apical membrane marker aminopeptidase N and
And dipeptidyl peptidase were confirmed to be present. Also, phalloidin
When using the fluorescent conjugate of actin, actin in hepatocytes is surrounded by the tubule periphery like in the natural liver.
It was found to be highly localized in the area. According to the electron microscope observation,
The morphology of cells coated with collagen was that they were grown on a basement membrane composed of gelled collagen.
Mushrooms proved to be better than when grown on dry collagen
. According to phase contrast microscopy, rat tail collagen, bovine key collagen and bovine
Both skin collagens are effective matrices for both the basement membrane and the coating matrix.
And was found to be encrusted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse tumors (MatrigelTM) Origin
The extracellular matrix of E. coli was also found to be effective as a coating matrix.Example 2 Effect of collagen coating on porcine hepatocytes
Tissue culture coated with dry non-gelling collagen or gelling collagen
Neutralized collagen (Vitrogen) was applied to the upper surface of primary pig hepatocytes grown on the culture plate.
An experiment was conducted to gel the (registered trademark)). Coating collagen matrix
After ligation, add tissue culture medium to the dish and add 95% air 5% CO2In the wet incubator
The cells were incubated at 37 ° C. When the cells after 1 day are observed with a phase contrast microscope
, A fine cell that extended over multiple cells similar to that observed in rat hepatocytes.
It was found that the tube channel network was well developed.Example 3 Hepatocytes coated with collagen concentrate xenobiotics in the bile canaliculi
Hepatocytes sandwiched with collagen are cells containing dicarboxyfluorescein
Demonstrate the ability to transport compounds from inside to tubules and concentrate compounds into tubules
Experiments were conducted. Five days after the collagen coating, the culture was treated with 1-10 μg / ml dicarbohydrate.
Inks at 37 ° C in Hank's balanced salt solution containing xylfluorescein diacetate.
And allow the dicarboxyfluorescein diacetate to be incorporated and dilute the probe.
Carbo
Converted to xylfluorescein. Residual dicarboxyfluoresceindia after 5-15 minutes
The settate was removed and the cells were washed 3-4 times with Hank's balanced salt solution. Dicarbox
Cyfluorescein uptake was observed by fluorescence microscopy, which was localized inside the cells and
It was confirmed that some amount was accumulated in the bile duct. Ink for another 15-30 minutes at 37 ℃
After the incubation, comparing the phase-contrast microscope observation and the fluorescence microscope observation, dicarb
It was found that xylfluorescein was localized only in the bile canaliculi. 2 mM ED
When TA was used, the fusion membrane that had blocked the tubules was destroyed and concentrated in the tubules.
Boxyfluorescein is released.Example 4 Passive absorption and secretion into the bile canaliculi by hepatocytes sandwiched by collagen.
Rhodamine B, which is passively absorbed by the liver and secreted in bile, is a collagenase.
It is taken up by hepatocytes sandwiched by
A demonstrative experiment was performed. Five days after collagen coating, 1 μg / ml rhodamine B
Cultures were incubated at 37 ° C. in Hank's balanced salt solution containing After 5 minutes
To remove residual Rhodamine B and
The cells were washed 3-4 times with Hank's balanced salt solution. Incubate for another 5-20 minutes at 37 ° C
After the reaction, comparison of phase-contrast and fluorescence microscopy revealed that rhodamine B
Are highly concentrated in the tubules and found to be diffused and distributed inside the cells without being concentrated.
did.Example 5 Active uptake of bile salts by collagen sandwiched hepatocytes
Demonstrate active uptake of bile acids by collagen sandwiched hepatocytes
Experiments were carried out. 24 hours after collagen coating, hepatocytes were dissolved in Hank's balanced salt solution.
Wash with 0.1 μCi141 mM taurocholate containing C-taurocholate
Both were incubated at 37 ° C or 4 ° C. Contains taurocholate at specified time points
The buffer was removed and the culture plates were washed with Hank's balanced salt solution. Then hepatocytes
Dissolved with a detergent and based on the amount of radioactive taurocholate present in the lysate, the liver
The amount of taurocholate taken up by the cells was determined. Uptake at 37 ℃ and 4 ℃
The active uptake of taurocholate based on the difference
Identified from. In addition, hepatocytes that are not sandwiched are
When uptake experiments were performed at similar cell densities, taurocholate uptake
However, hepatocytes coated with collagen were superior (see Table 1).
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９４年１１月４日
【補正内容】
請求の範囲
１．機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、前記細胞培養物を非ゲ
ル化またはゲル化コラーゲン上で増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆して、
肝毒性もしくは胆汁分泌停止能に関して化合物をスクリーニングする方法であっ
て、方法が、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
5分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調整し、コラーゲ
ンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中でイン
キュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約２時間後に肝細胞培養培地を交換及び
補充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に、肝細胞を収容した皿を１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で
再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に追加し、
(h)光学顕微鏡で細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュベート
し、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１fMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約５分間か
ら約96時間インキュベートし、
(j)細管網、細胞極性または細胞骨格構造の総体的な形態変化または構造変化を
評価する段階から成ることを特徴とする方法。
２．機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、前記細胞培養物を非ゲ
ル化またはゲル化コラーゲン上で増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆して、
肝性抽出能に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
５分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度
に調整し、コラーゲンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中でイン
キュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約２時間後に肝細胞培養培地を交換及び
補充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に、肝細胞を収容した皿を１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に追加し、
(h)光学顕微鏡で細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュベート
し、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約１分間か
ら約４時間インキュベートし、
(j)肝細胞に含まれているかまたは段階(i)の溶液中に残留している化合物の量を
測定する段階から成ることを特徴とする方法。
３．機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、前記細胞培養物を非ゲ
ル化またはゲル化コラーゲン上で増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆して、
胆汁中への化合物の肝性放出能をスクリーニングする方法であって、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
５分間遠心し、(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調
整し、コラーゲンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中でイン
キュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約2時間後に肝細胞培養培地を交換及び補
充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に、肝細胞を収容した皿を１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に追加し、
(h)光学顕微鏡で細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュベート
し、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約１分間か
ら約４時間インキュベートし、
(j)細管網内部に取りこまれた胆汁中に分泌された化合物を定量する段階から成
ることを特徴とする方法。
４．機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、前記細胞培養物を非ゲ
ル化またはゲル化コラーゲン上で増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆して、
化合物からの代謝物質の産生をスクリーニングする方法であって、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
５分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調整し、コラーゲ
ンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％
CO2の雰囲気中でインキュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約２時間後に肝細胞培養培地を交換及び
補充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に、肝細胞を収容した皿を１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に追加し、
(h)光学顕微鏡で細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュベート
し、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物に添加し、段階(d)の条件で約30分間か
ら約２週間インキュベートし、
(j)化合物の減量または代謝物質の産生を定量する段階から成ることを特徴とす
る方法。
５．機能性毛細胆管網を有する一次肝細胞培養物を用い、前記細胞培養物を非ゲ
ル化またはゲル化コラーゲン上で増殖させ、次いでコラーゲンゲルで被覆して、
肝細胞代謝を変性する化合物の能力をスクリーニングする方法であって、
(a)コラゲナーゼ潅流によって肝細胞を単離し、
(b)単離した細胞を肝細胞培養培地によって洗浄し、肝細胞培養培地と約90％の
等張パーコール溶液との約50:50の混合物中に細胞を懸濁させ、約350×重力で約
５分間遠心し、
(c)肝細胞培養培地１mlあたり約１〜２×106細胞の細胞濃度に調整し、コラーゲ
ンをプレコートした培養皿に約６mlの細胞懸濁液を導入し、
(d)細胞を収容した皿を約37℃、約95％相対湿度及び約５％CO2の雰囲気中でイン
キュベートし、
(e)未付着細胞を完全に除去するために約2時間後に肝細胞培養培地を交換及び補
充し、
(f)細胞が拡散し細胞間接触が成立した後に、肝細胞を収容した皿を１mlの低温
中和コラーゲン溶液で被覆し、添加した中和コラーゲンをゲル化させるべく段階
(d)の条件で再度インキュベートし、
(g)更に約５mlの肝細胞培養培地を肝細胞に追加し、
(h)光学顕微鏡で細管網の発達が観察されるまで段階(d)の条件でインキュベート
し、
(i)肝細胞培養物に適合性の溶媒中に約１pMから約50mMの化合物を含有する溶液
を約１μlから約５mlの量で肝細胞培養物
に添加し、段階(d)の条件で約30分間から約２週間インキュベートし、
(j)肝細胞代謝の変性の程度を測定する段階から成ることを特徴とする方法。
６．化合物が、Ｉ型カチオン性、II型カチオン性、アニオン性、胆汁塩及びアシ
アログリコプロテイン受容体から成るグループから選択された活性キャリアー系
を用いて肝細胞に運搬されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に
記載の化合物スクリーニング方法。
７．化合物が肝細胞中に受動的に取りこまれることを特徴とする請求項1から5の
いずれか一項に記載の化合物スクリーニング方法。
８．肝細胞培養物が底部及び頂部のゲル化した細胞外マトリックスの間に維持さ
れていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物スクリ
ーニング方法。
９．機能性毛細胆管が複数の細胞を相互接続する吻合性網構造を形成しているこ
とを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物スクリーニング方
法。[Procedure Amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission Date] November 4, 1994 [Amendment Content] Claims 1. Using a primary hepatocyte culture with a functional bile canaliculi network, the cell culture was grown on non-gelled or gelled collagen and then coated with a collagen gel to protect the compounds for hepatotoxicity or choleresis. A method of screening, comprising: (a) isolating hepatocytes by collagenase perfusion, (b) washing the isolated cells with hepatocyte culture medium, and then adding hepatocyte culture medium to about 90% isotonic percoll. Suspend the cells in a mixture of about 50:50 with the solution, centrifuge at about 350 x gravity for about 5 minutes, and (c) adjust the cell concentration to about 1-2 x 10 6 cells per ml of hepatocyte culture medium. Then, about 6 ml of the cell suspension was introduced into a culture dish precoated with collagen, and (d) the dish containing the cells was incubated at about 37 ° C. in an atmosphere of about 95% relative humidity and about 5% CO 2. , (E) About 2 o'clock to completely remove unattached cells After a period of time, the hepatocyte culture medium was exchanged and replenished, and (f) after the cells were diffused and cell-cell contact was established, the dish containing the hepatocytes was coated with 1 ml of the cold neutralized collagen solution, and the added neutralized collagen was added. Re-incubate under the conditions of step (d) to gelate, (g) add about 5 ml of hepatocyte culture medium to the hepatocytes, and (h) step until the development of the tubule network is observed by an optical microscope. Incubating under conditions (d), (i) adding about 1 μl to about 5 ml of a solution containing the compound of about 1 fM to about 50 mM in a solvent compatible with the hepatocyte culture to the hepatocyte culture. Incubating for about 5 minutes to about 96 hours under the condition of step (d), and (j) evaluating the overall morphological change or structural change of the tubular network, cell polarity or cytoskeletal structure. Method. 2. Method for screening compounds for hepatic extractability using a primary hepatocyte culture with a functional bile canalicular network, growing the cell culture on non-gelled or gelled collagen and then coating with collagen gel Wherein (a) hepatocytes were isolated by collagenase perfusion, (b) the isolated cells were washed with hepatocyte culture medium, and about 50% of hepatocyte culture medium and about 90% isotonic Percoll solution: The cells were suspended in a mixture of 50, centrifuged at about 350 × gravity for about 5 minutes, (c) adjusted to a cell concentration of about 1-2 × 10 6 cells per ml of hepatocyte culture medium, and precoated with collagen. About 6 ml of cell suspension was introduced into the culture dish, and (d) the dish containing the cells was incubated at about 37 ° C. in an atmosphere of about 95% relative humidity and about 5% CO 2 , (e) unattached The hepatocyte culture medium was replaced after about 2 hours to completely remove the cells. And (f) after the cells have diffused and cell-cell contact has been established, the dish containing the hepatocytes is coated with 1 ml of the cold neutralized collagen solution, and the added neutralized collagen is gelated (step d). )), (G) add about 5 ml of hepatocyte culture medium to hepatocytes, and (h) incubate in step (d) until reticular network development is observed by light microscopy. (I) A solution containing a compound of about 1 pM to about 50 mM in a solvent compatible with hepatocyte culture is added to the hepatocyte culture in an amount of about 1 μl to about 5 ml, and under the condition of step (d), Incubating for about 1 minute to about 4 hours, and (j) measuring the amount of compound contained in hepatocytes or remaining in the solution of step (i). 3. Using a primary hepatocyte culture with a functional bile canaliculi network, the cell culture was grown on non-gelled or gelled collagen and then coated with collagen gel to determine the hepatic release ability of the compound into bile. (A) Hepatocytes are isolated by collagenase perfusion, (b) the isolated cells are washed with hepatocyte culture medium, and hepatocyte culture medium and about 90% isotonic Percoll solution are added. The cells are suspended in a mixture of about 50:50 of the above, centrifuged at about 350 × gravity for about 5 minutes, and adjusted to a cell concentration of about 1-2 × 10 6 cells per ml of (c) hepatocyte culture medium, About 6 ml of the cell suspension was introduced into a collagen-precoated culture dish, and (d) the cell-containing dish was incubated in an atmosphere of about 37 ° C., about 95% relative humidity and about 5% CO 2 , e) After about 2 hours to completely remove the unattached cells, the hepatocyte culture medium was After replacement and replenishment, (f) after the cells have diffused and cell-cell contact has been established, the dish containing the hepatocytes is coated with 1 ml of a cold neutralized collagen solution to gelate the added neutralized collagen ( Incubate again under the conditions of d), (g) add about 5 ml of hepatocyte culture medium to the hepatocytes, and (h) incubate under the conditions of step (d) until the development of the capillary network is observed by an optical microscope. And (i) adding a solution containing a compound of about 1 pM to about 50 mM in a solvent compatible with the hepatocyte culture to the hepatocyte culture in an amount of about 1 μl to about 5 ml, and the condition of step (d) And (j) quantifying the amount of the compound secreted in the bile that has been incorporated into the tubular reticulum. 4. Screening the production of metabolites from compounds using primary hepatocyte cultures with a functional bile canalicular network, growing the cell cultures on non-gelled or gelled collagen and then coating with collagen gel A method comprising: (a) isolating hepatocytes by collagenase perfusion, (b) washing the isolated cells with hepatocyte culture medium, and adding about 50% of the hepatocyte culture medium and about 90% isotonic Percoll solution. Suspend the cells in a mixture of 50:50 and centrifuge at about 350 x gravity for about 5 minutes to adjust the cell concentration to about 1-2 x 10 6 cells per ml of hepatocyte culture medium and pre-coat with collagen. About 6 ml of the cell suspension was introduced into the prepared culture dish, and (d) the dish containing the cells was incubated in an atmosphere of about 37 ° C., about 95% relative humidity and about 5% CO 2 , Hepatocyte culture medium was removed after about 2 hours to completely remove adherent cells. After replacement and replenishment, (f) after the cells diffuse and the intercellular contact is established, the dish containing the hepatocytes is coated with 1 ml of the cold neutralized collagen solution to gelate the added neutralized collagen ( Incubate again under the conditions of d), (g) add about 5 ml of hepatocyte culture medium to the hepatocytes, and (h) incubate under the conditions of step (d) until the development of the capillary network is observed by an optical microscope. And (i) adding a solution containing a compound of about 1 pM to about 50 mM in a solvent compatible with the hepatocyte culture to the hepatocyte culture in an amount of about 1 μl to about 5 ml, and the condition of step (d) At about 30 minutes to about 2 weeks, and then quantifying (j) compound weight loss or metabolite production. 5. Using a primary hepatocyte culture with a functional bile canalicular network, the cell culture was grown on non-gelled or gelled collagen and then coated with a collagen gel to improve the ability of the compound to modify hepatocyte metabolism. A method of screening, comprising the steps of: (a) isolating hepatocytes by collagenase perfusion, (b) washing the isolated cells with hepatocyte culture medium, and combining the hepatocyte culture medium with about 90% isotonic Percoll solution. Suspend the cells in a mixture of about 50:50, centrifuge at about 350 x gravity for about 5 minutes, and (c) adjust the cell concentration to about 1-2 x 10 6 cells per ml of hepatocyte culture medium, About 6 ml of the cell suspension was introduced into the culture dish precoated with (d) the dish containing the cells was incubated in an atmosphere of about 37 ° C., about 95% relative humidity and about 5% CO 2 , ) After about 2 hours to completely remove unattached cells, hepatocyte culture medium was After replacing and replenishing the ground, (f) after the cells have diffused and the cell-cell contact has been established, the dish containing the hepatocytes is coated with 1 ml of the cold neutralized collagen solution to gelate the added neutralized collagen. Incubate again in step (d), (g) add about 5 ml of hepatocyte culture medium to hepatocytes, and (h) step (d) until reticular network development is observed by light microscopy. And (i) adding a solution containing about 1 pM to about 50 mM of the compound in a solvent compatible with hepatocyte cultures to the hepatocyte cultures in an amount of about 1 μl to about 5 ml, step (d) Incubating for about 30 minutes to about 2 weeks under the condition of (j), and (j) measuring the degree of alteration of hepatocyte metabolism. 6. A compound is delivered to hepatocytes using an active carrier system selected from the group consisting of type I cationic, type II cationic, anionic, bile salts and asialoglycoprotein receptors. 6. The compound screening method according to any one of 1 to 5. 7. The compound screening method according to any one of claims 1 to 5, wherein the compound is passively incorporated into hepatocytes. 8. The method for screening a compound according to any one of claims 1 to 5, wherein the hepatocyte culture is maintained between the gelled extracellular matrix at the bottom and the top. 9. The compound screening method according to any one of claims 1 to 5, wherein the functional bile canaliculi form an anastomosis network structure that interconnects a plurality of cells.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，Ｍ
Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ
(72)発明者 レクリユイス，エドワード
アメリカ合衆国、カンサス・66049、ロー
レンス、ウエスト・ナインス・ストリー
ト・3217─────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AU, BB, BG, BR, BY, CA,
CZ, FI, HU, JP, KR, KZ, LK, LV, M
G, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD
, SK, UA, US, UZ
(72) Inventor Recriuis, Edward
Rho, United States, Kansas 66049
Lens, West 9th Story
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