JPH08503194A - Compositions useful for the diagnosis and prevention of Lyme disease - Google Patents

Compositions useful for the diagnosis and prevention of Lyme disease

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JPH08503194A
JPH08503194A JP6500728A JP50072893A JPH08503194A JP H08503194 A JPH08503194 A JP H08503194A JP 6500728 A JP6500728 A JP 6500728A JP 50072893 A JP50072893 A JP 50072893A JP H08503194 A JPH08503194 A JP H08503194A
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ゴールド，ウイリアム・ティー
レーリッヒ，ジョン・ティー
バーコット，トーマス
ピースマン，ジョセフ・エフ
ジョンソン，バーバラ・ジェイ・ビー
メイヤー，レオナルド・ダブリュ
キーン，マーク・ジー
ハント，アン・アール
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US Government
SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、マダニ媒介体中、調節および分化された新規の単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原を提供する。これらの抗原は、ライム病の診断およびその予防用組成物において有用である。   (57) [Summary] The present invention provides novel isolated B. burgdorferi antigens that are regulated and differentiated in tick vectors. These antigens are useful in the diagnosis of Lyme disease and compositions for its prevention.

Description

【発明の詳細な説明】 ライム病の診断および予防に有用な組成物関連出願の相互参照 本願は、１９９２年５月２６日付出願のアメリカ合衆国特許出願第０７／８８ ９，０１５号の一部継続出願である、１９９２年９月１４日付出願の係属中のア メリカ合衆国特許出願第９４４，４６４号の一部継続出願である発明の分野 本発明は、一般に、ライムボレリア症の診断、治療および予防において有用な 医薬および診断用組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ボレリア・バー グドルフェリ（Borrelia burgdoferi）由来であって、マダニ媒介体中で分化さ れた、単離された自然および組換えタンパク質、ポリペプチドおよび高分子抗原 に関する。発明の背景 ライムボレリア病、即ちライム病の原因物質である、細菌ボレリア・バールグ ドルフェリ（Borrelia burgdoferi）はスピロヘータを保有する種々のマダニに 刺されることにより伝播される。感染保有宿主は白足マウス、ペロミスカス・ロ イコパス（Peromyscus leucopus）であることが多く、この病気は、イヌ、ネコ およびヒトを含む多くの哺乳類に伝播され得る［ジェイ・ジイ・ドナヒュー（J ．G．Donahue）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディシン・ アンド・ハイジーン（Am．J．Trop．Med．Hyg.），３６：９２−９６（１９８７ ）；アール・ティー・グリーン（R．T．Green）ら、ジャーナル・オブ・クリニ カル・ミクロバイオロジー（J．Clin．Micro．），２６：６４８−６５３（１９ ８８）］。ビイ・バーグドルフェリＢ３１株はアメリカ合衆国におけるボレロシ ス（Borrelosis）の既知の分離菌の約９０％に関与していると考えられる。ヒト お よび動物におけるライム病の診断は迅速かつ正確な試験に至る明確な血清学がな く、予防接種において免疫応答を誘起できる適当な細菌抗原がないことにより妥 協的なものであった。 ボレリア・バーグドルフェリの培養調製物は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブ ロット分析用の全細胞超音波処理物を調製するために用いられてきたが、境界的 な結果しか得られなかった［エム・カールソン（M．Karlsson）ら、ユーロ・ジ ェイ・クリン・ミクロバイオール・インフェクト・ディス（Eur．J．Clin．Micr obiol．Infect．Dis．），８：８７１−８７７（１９９０）；エス・ダブリュ・ ルガー（S．W．Luger）ら、アーカイブス・オブ・インターナル・メディシン（A rch．Intern．Med．），１５：７６１−７６３（１９９０）、アイ・オルソン（ I．Olsson）ら、アクタ・ダーマトーベネレオロジカ（Acta．Derm．Venereol． ）（ストックホルム），７１：１２７−１３３（１９９１）］。外表面タンパク 質ＡおよびＢ（ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ）、フラジェリン、およびその推定分子 量に従ってＰ２１、Ｐ３９、Ｐ６６およびＰ８３と称される他のタンパク質を含 む血清診断法においてより有用である多くの細菌抗原が同定されている［エイ・ ジイ・バーバー（A．G．Barbour）ら、インフェクション・アンド・イムニティ ー（Infect．Immun．），４５：９４−１００（１９８４）；ダブリュ・ジェイ ・シンプソン（W．J．Simpson）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバ イオロジー（J．Clin．Microbiol．），２８；１３２９−１３３７（１９９０） ；ケイ・ハンセン（K．Hansen）、インフェクト・ジェイ・クリン・ミクロバイ オール（Infect．J．Clin．Microbiol．），２６：３３８−３４６（１９８８） ；ビイ・ウィルスク（B．Wilske）ら、ゼントラル・バクテリオール・パラジテ ンクド・インフェクションシュクル・ヒグ・エイ・ビイ・ティー・１・オリグ・ レイヘ・エイ(Zentral．Basketriol．Parasitenkd．Infectionshkr．Hyg．Abt． 10rig．Reihe．A．），２６３：９２−１０２（１９８６）；ディー．ダブリュ ・ドーワード（D．W．Dorward）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバ イオロジー（J．Clin．Microbiol．），２９：１１６２−１１７０（１９９１） ］。 ボレリア・バーグドルフェリのタンパク質およびポリペプチドに関し、その診 断または薬剤としての使用を示唆する開示が数多くある。これらの文献は，優勢 的に、ビイ・バーグドルフェリタンパク質およびポリペプチドを、in vitro培養 、主に、バーバー・ステンナー・ケリー（Barbour-Stoenner-Kelley（ＢＳＫ） ）修飾培地において産生するものであり、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）技術を用い、その分子量に基づいて ポリペプチドおよびタンパク質を同定するものである。例えば、公開されたＮＴ ＩＳアメリカ合衆国特許出願第４８５，５５１号は、分子量が１１、１３、２２ 、１３、３４および８３ｋＤａのビイ・バーグドルフェリタンパク質に言及して いる。公開されたヨーロッパ特許出願第４６５，２０４号（１９９２年１月８日 公開）は分子量範囲が２５から９３ｋＤａである抗原について言及している。国 際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０１５００（１９９１年９月１９日公開）は分 子量が２８および３９ｋＤａのビイ・バーグドルフェリ抗原に言及している。国 際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９０／０２２８２（１９９１年７月１１日公開）は分 子量が１７、２２、３１、４１および１００ｋＤａのビイ・バーグドルフェリ抗 原に言及している。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８９／００２４８（１９９０年 ５月３日公開）は分子量範囲が２０から８５ｋＤａのビイ・バーグドルフェリ抗 原に言及している。 ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９２／０００５５号（１９９２年１月９日公開）はＯｓ ｐＡおよびＯｓｐＢポリペプチド、融合タンパク質およびビイ・バーグドルフェ リＮ４０および２５０１５株の誘導体を開示している。この開示は、処置された 哺乳類宿主においてボレリア・バーグドフェリ感染により起こるライム病に対抗 して防御するのに有効な免疫応答を誘起するＤＮＡ配列またはポリペプチドにつ いて言及している。実際、ポリペプチドは、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系のマウスを、ボレリ ア・バーグドルフェリ培養物由来のポリペプチドで免疫化し、免疫化した動物に ボレリア・バーグドルフェリを針接種し、接種されたボレリア・バーグドルフェ リに対して免疫化された動物を防御するポリペプチドを選択することにより同定 されるだけである。 先行技術に記載されているビイ・バーグドルフェリ抗原は免疫学的規準、例え ば免疫応答検定によりほとんど特質化されていない。これらの細菌抗原の、血清 学的試験におけるライム病に対する有用性を分析する公開データのほとんどは、 免疫応答性を評価するのに、培養されたスピロヘータまたは精製されたタンパク 質の針接種のシステムを用いている［ユー・イー・シャイブル（U．E．Schaible ）ら、ヨーロピアン・ジャナル・オブ・イムノロジイ（Eur．J．Immunol．）， ２１：２３９７−２４０５（１９９１）；エス・ダブリュ・バートルド（S．W． Barthold）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジイ（Am．J．of Path． ），１３９：２６３−２７３（１９９１）］。今日まで、ビイ・バーグドルフェ リ細菌抗原がマダニに剌されることにより動物に伝播された場合と、針接種によ る実験的感染の場合と比較して、感染経路または免疫応答の特性に差があるかど うかについて何ら観察されていない。ジェイ・エイ・ネルソン（J．A．Nelson） ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ（J．Infect．Dis．）， １６１：１０３４−１０３５（１９９０）；ダブリュ・エフ・シュバック（W．F ．Schubach）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー（J．Cli n．Microbiol.），５９：１９１１−１９１５（１９９１）；エス・ダブリュ・ バートルド（S．W．Barthold）ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディ シーズ，１６２：１３３−１３８（１９９０）；ジェイ・リンデンマイヤー（J ．Lindenmayer）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー，２ ８：９２−９６（１９９０）；およびユー・イー・シャイブルら、プロシーディ ングズ・オブ・ナショナル・アカデミー．オブ・サイエンシズ（Proc．Natl．Ac ad．Sci．），８７：３７６８−３７７２（１９９０）参照］。 ライム病の正確かつ早期の検出、ならびにビイ・バーグドルフェリによる動物 の自然感染の治療および予防のための方法および組成物が必要とされている。発明の要約 一態様において、本発明はマダニ媒介体におけるビイ・バーグドルフェリの増 殖により調節され、分化される、ビイ・バーグドルフェリ抗原単離体を提供する 。本発明の新規抗原を以下の第Ｉ表に列挙する。 これらの抗原のうちいくつかは、ビイ・バーグドルフェリＢ３１株特異的およ び主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非制限的であることを特徴とする。これらの抗 原のうちの別のいくつかは、ＭＨＣ制限的であることを特徴とする。これらの抗 原に対して産生される血清（Ｂ３１ＭＨＣ非制限的およびＢ３１ＭＨＣ制限的） は、さらにビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株との反応性または反応性の欠如を 特徴とし；抗原それ自身（Ｂ３１ＭＨＣ非制限的およびＢ３１ＭＨＣ制限的）は さらにビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株抗原と相同性または異種であることを 特徴とする。本発明の最も好ましい抗原は、種々の動物のハプロタイプにてビイ ・バーグドルフェリに対して株間免疫誘発能を有するために、Ｂ３１ＭＨＣ非制 限的、ＪＤ−１交差反応的およびＪＤ−１非制限的であることを特徴とする。他 の抗原もワクチン組成物および診断に有用である。 もう一つ別の態様において、本発明は、所望により、感染宿主動物に寄生して いてもよい（吸血する）マダニから直接単離された微生物から得られるビイ・バ ーグドルフェリ抗原を提供する。所望により、ビイ・バーグドルフェリは増殖培 地中最小の回数だけ継代し、抗原が単離されるまでその毒性および抗原性を維持 してもよい。in vitroにおける継代の望ましい最少の回数は１および６の間であ る。 さらに別の態様において、本発明は、マダニ媒介体または微生物の低継代培地 から単離されたビイ・バーグドルフェリＤＮＡから調製されるビイ・バーグドル フェリ抗原を提供する。さらに別の態様は、ビイ・バーグドルフェリに感染した マダニまたは低継代培地由来のＰＣＲ遺伝子バンクから調製されるビイ・バーグ ドルフェリ抗原を提供する。 別の態様において、本発明は本発明の新規ビイ・バーグドルフェリに対する抗 体を提供する。このような抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは組み 換え体であってよい。 さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１種の本発明の新規抗原また は抗体からなる診断剤、治療組成物およびワクチン組成物を提供する。 さらに別の態様において、本発明は、本発明の試薬および組成物を用いた診断 用アッセイおよびキット、ライム病の治療法、およびライム病の予防法を提供す る。 本発明の他の態様および利点を、その好ましい具体例である以下の詳細な記載 にて記載する。図面の簡単な記載 第１図は、マダニ感染ハムスターにおける全細胞超音波処理物、精製鞭毛、お よび組み換えＯｓｐＡを示す。抗体応答を全細胞超音波処理物（●）、精製鞭毛 （■）、または組み換えＯｓｐＡ（▲）に関してＥＬＩＳＡにより測定する。 等比中項（ＧＭＴ）log10ＥＬＩＳＡ力価を報告する（ｎ＝６）。全ての点に 関する平均値の標準誤差は≦０．１であった。 第２図は、種々の濃度のビイ・バーグドルフェリを接種したハムスターの抗原 投与量応答分析を示す。ハムスターを感染後（Ｐ．Ｉ．）の２週間（■）および ４週間（●）で採血した。抗体応答を全細胞超音波処理物（実線）または組み換 えＯｓｐＡ（点線）に関してＥＬＩＳＡにより測定した。等比中項（ＧＭＴ）の log10ＥＬＩＳＡ力価を報告する（１４日でｎ＝２、２８日でｎ＝４または５） 。発明の詳細な記載 抗原 本発明は、マダニ媒介体を介するビイ・バーグドルフェリの伝播によって調節 および／または分化される新規の単離されたボレリア・バーグドルフェリを同定 する。本明細書において用いるマダニ媒介体は、ビイ・バーグドルフェリ媒介能 を有する昆虫科の節足動物をいう。マダニ媒介体はマダニ属であるのが最適で、 イクソデス複合体、アイ・ダミニ（I．dammini）、アイ・スカプラリス（I．sca pularus）、アイ・パシフィクス（I．pacificus）またはイヌダニ（I．ricinus ）あるいはライム病を起こす微生物を伝幡することができる関連した種または属 である。 in vitroにおける増殖培地中のビイ・バーグドルフェリの増殖はライム病に関 連する毒性の喪失を生じさせるので、本発明は、遺伝学的に定義されたＭＣＨハ プロタイプマウスにおける応答を用い、マダニ産生のビイ・バーグドルフェリ抗 原およびビイ・バーグドルフェリ培養増殖により産生された抗原の間の差異を血 清学的に同定する。分化および／または調節の最良の指標は、組織または細胞を ヒトまたは動物に接種した場合に産生される抗体特異性により測定される抗原の 出現または損失である。マダニにより産生され、媒介された抗原は、増殖培地中 、in vitroで数回継代した先行技術のビイ・バーグドルフェリ抗原と異なる。 さらには、ヒトおよび動物におけるライム病の病原体であるビイ・バーグドル フェリは、ライム病に関連した臨床的症状を起こす共通の分子群を有すると考え られる。in vitroで継代したビイ・バーグドルフェリは毒性を失うので、毒性因 子に関連するタンパク質または他の分子は、マダニが病気を伝播するための唯一 の方法であるため、マダニにより提供されると考えられる。本発明者らは、抗原 が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）制限的であるかどうか決定することによりワク チンにおいて有用な抗原を同定した。 ＭＨＣは動物またはヒトのあらゆる細胞の表面上の一群のタンパク質（レセプ ター）である。ピー・ジェイ・ビヨルクマン（P．J．Bjorkman）ら、ネイチャー （Nature），３２９：５０６−５１８（１９８７）を参照のこと。典型的には、 動物またはヒトのあらゆる細胞のタンパク質は自然の事象の進行に連れて退化す るかまたは一新する。自己反応性を防止するために、免疫監視機構により細胞よ り除去した全てのペプチドを監視する。典型的には、これは、細胞から放出され るかまたは内部移行し、各アミノ酸に分解して、中間代謝物のプール中に戻るこ とがＭＨＣにより示される。動物はそれ自身のタンパク質と反応するのを嫌うの で、動物の「自己」タンパク質は応答に限定される。タンパク質が自己タンパク 質である場合、その動物の免疫系は反応しない。免疫系が外来のタンパク質また は抗原である場合、ＭＨＣは応答を制限しない。 本発明のある種の抗原は、いずれかのＭＨＣハプロタイプに制限されない。「 ＭＨＣに制限されない」ということは、本発明の抗原がヒトおよび動物において その免疫遺伝学的背景に関係なくライム病に対する免疫応答を誘起できること を意味する（ヒトまたは動物のＭＨＣは免疫応答を制限しない）。本発明の抗原 は、感染したマダニに侵入されたのち早期にマウスにおいて起こる血清学的応答 を示すので、これらはまた毒性ビイ・バーグドルフェリ感染に関連した毒性（共 通）成分を表わす。 本発明のある種の好ましい抗原は、マウスにおいて３種の異なるＭＨＣ背景に わたり免疫応答を誘起することが示されている。好ましくは、抗原はさらにライ ム病のヒトおよび／または動物において臨床的総体症状を誘起できる１以上のビ イ・バーグドルフェリ株と交差反応することを特徴とする。本明細書において抗 原に言及する際の「交差反応的」なる語は、ある種由来の抗原に対して産生した 血清が他種の抗原との反応能を有し、両種の抗原が相同であることを意味する。 他種の抗原との反応能を有しない一の種由来の抗原に対して産生された血清はそ の抗原が異型であることを示す。 ビイ・バーグドルフェリの抗原は、以下のその分子量（キロダルトン）に関し て同定される。例えば、分子量約１７ｋｄのビイ・バーグドルフェリ抗原はＰ１ ７と同定され、分子量約２２ｋｄの抗原はＰ２２と同定される。第Ｉ表において 用いるＰ４１（ｆｌａ）とは、分子量４１ｋｄの鞭毛関連の抗原をいう。第Ｉ表 の他の抗原は、鞭毛、外表面タンパク質（Ｏｓｐ）Ａ、またはＯｓｐＢに関連す るものでない。 本発明のビイ・バーグドルフェリ低継代抗原（即ち、培地中６回未満継代され たボレリア微生物から得られる抗原）の特徴は、以下の表中にて、および以下に 示す実施例に関して同定される。第Ｉ表は、実施例１１〜１３のデータを要約し たものであり、該実施例におけるウェスタンブロット分析は、Ｂ３１およびＪＤ −１株からのタンパク質上のスピロヘータのＢ３１分離菌で感染したイクソデス ・ダミニにさらすことによりビイ・バーグドルフェリＢ３１株で感染したマウス の同系交配種のパネルからの血清を用いて行った。 第Ｉ表は、ある種の抗原は、Ｂ３１ＭＨＣ非制限的であること、即ち、これら の抗原は全てのハプロタイプにおいて免疫応答を誘起できることを特徴とする。 これらのＢ３１ＭＨＣ非制限抗原は、さらに（ａ）ＪＤ−１交差反応性であり、 ＪＤ−１非制限的である；（ｂ）ＪＤ−１交差反応性であり、ＪＤ−１ＭＨＣ制 限的である；または（ｃ）ＪＤ−非反応性であることを特徴とする。（ａ）群の 抗原は、動物において最も広範囲の免疫応答を誘起できる。（ｂ）および（ｃ） の範疇の抗原も、本発明のワクチン組成物において有用である。 第Ｉ表はまた、ビイ・バーグドルフェリＢ３１株由来の多くの新規タンパク質 抗原に対する抗体応答がＭＨＣ制限的であることを示す。例えば、感染の終わり までは、Ｂ１０株マウスのみがＰ８３タンパク質に対して応答する。Ｂ１０．Ｂ Ｒ種およびＢ１０．Ｄ２種のマウスは、ＭＨＣ遺伝子座を除いて完全に遺伝子的 にマッチし、明らかにＭＨＣハプロタイプＨ−２dおよびＨ−２kはＧ−２bと比 較して本発明のタンパク質を提供するのに相対的に有効ではない。特に、以下の 実施例１０および１２参照のこと。 非制限抗原に関して前記したように、これらのＭＨＣ−制限抗原は、またさら に、（ａ）ＪＤ−１交差反応性であり、ＪＤ−１ＭＨＣ非制限的である；（ｂ） ＪＤ−１交差反応性であり、ＪＤ−１ＭＨＣ制限的である；または（ｃ）ＪＤ− 非反応性であることを特徴とする。これらの新規ビイ・バーグドルフェリ抗原に より誘起される免疫応答は、Ｂ３１ＭＨＣ制限的であり、従って全ての動物のハ プロタイプにおいて免疫応答を誘起せず、またヒトおよび他の動物においてライ ム病を防止するためのワクチンおよび診断検定においても有用である。 実施例９〜１３において得られた本発明の新規ビイ・バーグドルフェリ抗原の 特徴の要約を以下の第Ｉ表に示す。 本発明の新規抗原の他の好ましい特徴は、、ビイ・バーグドルフェリ感染期間 の初期、例えば感染後（Ｐ．Ｉ．）の最初の２週間に感染したヒトまたは動物に おいて抗体を産生できる能力にある。本発明の抗原のさらに別の好ましい特徴は 、これに対する抗体が感染期間中安定して産生されることである。「感染期間中 安定して産生される」とは、感染後約２週間から感染後６０日に及ぶ感染後の期 間中に検出可能な抗体の産生を意味する。ほとんどの場合、スピロヘータは宿主 中に長期間存続するので、このような抗体は、感染後１年まであるいはそれ以上 ヒトまたは動物において検出可能なままであると予想される。しかし、生物から 単離され、適当なデリバリー系と組み合わされた抗原は、動物を感染しやすくす る免疫応答を与えると考えられる。 かくして、本発明のこれらの抗原は、好ましくはボレリア・バーグドルフェリ 感染の間の初期のヒトまたは動物において安定な防御抗原応答を誘起することに より、ヒトまたは動物をライム病から予防または防御できる能力を特徴とする。 前記特徴により、これらの新規ビイ・バーグドルフェリ抗原はライム病の診断、 ならびにワクチンおよび治療組成物において有用である。 本発明の抗原は、選択された株、変異株、ボレリアの群またはサブユニットか ら単離される。好ましくは、抗原は、ビイ・バーグドルフェリ、特にライムボレ リア症と最も関連することが多いサブグループＡおよびＢから単離される。しか し、スピロヘータ分離菌もサブグループＣ〜Ｆ［エイ・ジイ・バーバー（A．G． Barbour）ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ（J．Infect． Dis．），１５２：４７８−４８４（１９８５）］ならびに他のサブグループか ら得られる。 本発明の抗原は、マダニ媒介体より直接的に微生物から得られかつ単離される か、またはマダニに剌されることによりビイ・バーグドルフェリに感染したヒト または動物の血清より得られかつ単離される。抗原はまた一連のマダニから宿主 動物感染に対する感染により得られ、次にマダニまたはマダニに侵入したビイ・ バーグドルフェリに感染した動物の血清から得られる。先行技術でビイ・バーグ ドルフェリをマダニから宿主の継代により維持する必要を記載したものはない。 増殖培地中での継代は避けなければならないが、所望により、微生物を少なくと も１回ＢＳＫ培地中で該微生物を単に増幅させるために継代し、抗原性物質を得 ることができる。例えば、ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株を用いた場合、１ 継代で十分な増幅が得られる。Ｂ３１株を用いた場合、６回までの継代を採用で きる。しかし、本発明の抗原を得るためには、in vitro培養における高継代は採 用しない。本発明の目的に関して、「高継代」なる語は、Ｂ３１株に関して６継 代以上、およびＪＤ−１株に関して１継代以上と定義する。一般に、当業者は、 他のビイ・バーグドルフェリ株に関する「高継代」の継代数を以下の実施例５〜 ８に記載したようにしてハムスターにおいて継代した微生物を評価することによ り決定できる。微生物がライム病の症状を起こさない、あるいはハムスターにお いてビイ・バーグドルフェリの増殖特性を示さないことがその株に関する「高継 代」を示すものである。言い換えると、微生物をin vitroで十分に培養し、その 毒性の大部分を失わせ、したがってそれから得られる抗原は本発明の抗原と異な るものである。 本発明の抗原は、好ましくは以下の実施例４に記載するように、その分子量に 応じたイムノブロット法により単離される。このような単離により、実質的に微 生物およびマダニ媒介体の他のタンパク質および非タンパク質物質不含の形態に て抗原が得られる。ビイ・バーグドルフェリポリペプチドおよび本発明の抗原を 含む分子は、マダニから単離され、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを用いた通常または 逆相などの液体クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー（無機 リガンドまたはモノクローナル抗体など）；サイズ排除クロマトグラフィー；固 定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動などを含む種々の常套手段 の変法を用いてさらに精製する。当業者は、最も適当な単離および精製法を本発 明の範囲から逸脱することなく選択できる。 加えて、これらの抗原のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、通常の遺伝 子操作技術、ＰＣＲなどの手段により得られる。［例えば、サンブルック（Samb rook）ら、モレキュラ・クローニング（Molecular Cloning）、第２版、コール ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory） ，ＮＹ（１９８９）参照］。例えば、本発明の抗原は、ＤＮＡプローブおよびＰ ＣＲ技術を用いてマダニ媒介体から単離されたビイ・バーグドルフェリＤＮＡか ら調製または単離される。 また、抗原は、ビイ・バーグドルフェリ感染マダニまたは増殖培地中低継代の 微生物由来のＰＣＲ遺伝子バンクから得られる。 理論により拘束されるつもりはないが、本発明者らはマダニ媒介体がマダニ調 節または遺伝子エレメントを介してビイ・バーグドルフェリ抗原を修飾すると考 えられる。生物として分化するためにまたはある種のタンパク質および抗原を毒 性および感染的状態に処理するために、ビイ・バーグドルフェリはそのベクター 、即ちマダニの環境を必要とすると考えられる。したがって、マダニから得られ る本発明のビイ・バーグドルフェリタンパク質または抗原は、マダニの環境によ り 修飾されるか、または増殖培地中、ビイ・バーグドルフェリを繰り返し培養する ことにより得られるタンパク質と全く異なるものである。 ボレリア・バーグドルフェリは、培地中わずか２回またはそれ以上の継代の後 にその毒性を失う。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、メリーランド州、ロックビルから入手したＢ３１ プロトタイプ株は、少なくとも６０回の非常に高い継代レベルで分布する。した がって、本発明者らは、この株が請求者に届くまで非常に弱い毒性であると考え る。当該分野の報告のほとんどはこの株を取り扱い、これをＡＴＣＣから入手し ていることに留意すべきである。 以下の実施例に示すように、ビイ・バーグドルフェリ株の長期の継代により、 多くの細菌タンパク質の発現において著しい変化が誘起される。特に、実施例１ ２および１３参照のこと。同一種のバクテリアの低継代および高継代分離菌に関 して同一血清を用いたウェスタンブロット分析により、非常に異なるバンドパタ ーンが得られる。特に、高継代分離菌においては多くのタンパク質は検出されず 、バンドの大部分は強度が低い。多くのこれらのタンパク質抗原は複数の継代に よりなくなるかまたは修飾される。実施例において用いた細菌のいずれかの株の 場合、これらのＢ３１およびＪＤ−１高継代誘導体のリゼイトとのマウス血清の 反応性は、同一株の低継代誘導体よりもはるかに低い（実施例１３）。もはや検 出されないタンパク質バンドとしては、Ｐ１４、Ｐ１８、Ｐ２２、Ｐ２４、Ｐ２ ８、３１〜３８ｋＤの範囲内の多くのバンド、Ｐ４３、Ｐ５２および５５〜６５ ｋＤバンドの一部が含まれる。Ｐ３９バンドの検出は、マウス血清の全てに関し て異なるこれらの全ての抗原源のスクリーンにわたり一様である。これらの結果 は、低および高継代細菌分離菌の抗原プロフィルにおいて著しい差異を示す。 本発明の抗原対先行技術のものとの差異は、感染の経路および種類を変更した 場合にハムスターおよびマウスにおいて検出されるビイ・バーグドルフェリ抗原 の発現によりさらに明らかである。実施例により、感染したマダニの吸血により 伝播された自然にボレリア・バーグドルフェリに感染したマウスの同系交配種か らの抗体応答のパターンは、培養したボレリア・バーグドルフェリ・スピロヘー タの針接種により同等に感染したマウスにおける抗体応答パターンと著しく異な ることが示された。特に、実施例７、１０、および１１参照。針接種された培養 ビイ・バーグドルフェリは、侵襲されたマダニ媒介体の針接種されたホモジネー ト、およびマダニ媒介の感染と異なる抗原応答を示す。 本発明の抗原はまた、好ましくはマダニ侵襲の、ビイ・バーグドルフェリに感 染したヒトまたは動物から得られた血清またはＴ細胞により認識されることを特 徴とする。実験において、ボレリア・バーグドルフェリ感染マダニで処理した動 物からの血清は培地中で増殖させたボレリア・バーグドルフェリタンパク質を認 識しない。例えば、以下の実施例７および１０参照のこと。 頻繁に報告されている特性のほとんどは分子量であるので、従来技術は、種々 の報告されているボレリア・バーグドルフェリ抗原を区別することができる規準 に基づいて、ボレリア・バーグドルフェリ抗原を明確に同定することができない 。しかし、同じような分子量にもかかわらず、本発明者らは、以下のものを区別 できる： （ａ）培養増殖されたボレリア・バーグドルフェリからのマダニ媒介体を介す る伝播により限定または調節される本発明のボレリア・バーグドルフェリ抗原（ 実施例１２参照）； （ｂ）ボレリア・バーグドルフェリ感染マダニに侵襲された個体からの抗体に より同定されるが、ボレリア・バーグドルフェリ抽出物の低継代培養増殖に対し て、（先行技術のように）高継代を用いてスクリーンした、ボレリア・バーグド ルフェリ抗原； （ｃ）高継代培養で増殖させたボレリア・バーグドルフェリ抽出物またはサブ ユニットで予防接種し、マダニ由来のまたは低継代ボレリア・バーグドルフェリ 抽出物またはサブユニットでスクリーンされた個体からの抗体により同定される ボレリア・バーグドルフェリ抗原； （ｄ）免疫病理を開始するか、または毒性因子、即ち、マダニまたは宿主中の 組織をキレート化する付着因子を有するボレリア・バーグドルフエリからの抗原 。高継代培養のボレリア・バーグドルフェリは毒性でなく、以下の実施例１２に 記 載するように視覚的に異なる抗原プロフィルを有する；および （ｅ）ＭＨＣハプロタイプに制限されないボレリア・バーグドルフェリ（第Ｉ 表参照）。 本発明の抗原は、タンパク性物質、例えばタンパク質、ポリペプチドまたはそ のフラグメントである。これらの抗原は、一般に抗原が自然に結合しているタン パク性物質および他の物質での汚染がなく単離される。 したがって、本発明の抗原は、遺伝子的に同系交配した動物におけるＭＨＣ− 制限応答を用いたベクターにより産生される病原体に対する免疫学的測定により 特徴付けられる。これらの測定は、ウェスタンブロット、生物物理的測定による 高分子量測定、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ／染色、ＨＰＬＣなど、抗体認識検定、 Ｔ−細胞認識検定、ＭＨＣ結合検定、および細胞、タンパク質または抗体の養子 移入による免疫防御または免疫病理を推定するための検定を包含するが、これら に限定されない。 本発明のビイ・バーグドルフェリ抗原、タンパク質およびポリペプチドは、よ り大きなおよび／またはマルチマータンパク質の一部であってもよいと考えられ る。本発明の抗原は、ビイ・バーグドルフェリの外表面タンパク質、例えばＯｓ ｐＡおよびＯｓｐＢなどと組合わせてもよい。このような組合せにおいては、抗 原は融合タンパク質の形態であってもよい。例えば、本発明の抗原またはポリペ プチドは、Ｎ−末端またはのＣ−末端でＯｓｐＡポリペプチド、またはＯｓｐＢ ポリペプチドと、あるいは非ＯｓｐＡ非ＯｓｐＢポリペプチドまたはその組合せ と融合してもよい。この目的のために有用なＯｓｐＡおよびＯｓｐＢポリペプチ ドは、先行技術により同定されたポリペプチド［例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０ ４０５６参照］およびその変異体を含む。この目的に有用な非ＯｓｐＡ、非Ｏｓ ｐＢポリペプチドは、ビイ・バーグドルフェリ、鞭毛関連タンパク質、他のビイ ・バーグドルフェリタンパク質およびそのフラグメント、および非ビイ・バーグ ドルフェリタンパク質およびそのフラグメントを含む、本発明のポリペプチドお よび先行技術により同定されたものを包含する。 本発明の一態様において、本発明の複数のポリペプチドからなる融合タンパク 質は、本発明の方法および組成物において用いるために構築される。これらの融 合タンパク質またはマルチマータンパク質は、組み換えにより、または化学的に 合成される。脂質および炭水化物を含む、アミノ酸以外の基と融合または結合し た本発明のポリペプチドを含んでもよい。さらに、本発明の抗原は先行技術によ り記載された他のボレリアワクチン剤ならびに他の種のワクチン剤、例えばパル ボウイルス、コロナウイルス、レプトスポリジア、および狂犬病由来の他のワク チン剤と組合せたものを用いてもよい。このようなタンパク質は、広範囲のビイ ・バーグドルフェリ分離菌により起こるライム病の予防、治療および診断に有効 である。 本発明の抗原は、非ＯｓｐＡ、非ＯｓｐＢのビイ・バーグドルフェリ抗原であ って、以下のいずれかの環境が適用された場合に、ボレリア・バーグドルフェリ に感染したマダニの侵襲をうけた予防接種をしたヒトまたは動物において防御応 答を誘起できる： （ａ）好ましい抗原がビイ・バーグドルフェリに感染したマダニに侵襲された ヒトまたは動物から採取した血清またはＴ細胞により認識される場合（実施例１ １〜１３参照）； （ｂ）好ましい抗原が、マウスにおける好ましいＭＨＣハプロタイプに制限さ れない場合（第Ｉ表、実施例１１〜１３参照）； （ｃ）好ましい抗原が１以上の通常の形態の天然のボレリア・バーグドルフェ リ、例えばＢ３１またはＪＤ１と交差反応性である場合（第Ｉ表、実施例１１〜 １３参照）； （ｄ）抗原が、in vitro培養を介在することなく、または増殖培地中、最少数 の継代の宿主またはマダニから採取したボレリア・バーグドルフェリ由来である 場合（第Ｉ表、実施例９参照）； （ｅ）非ＯｓｐＡおよび非ＯｓｐＢ抗原が、予防接種したヒトまたは動物にお いて、抗体または宿主ヒトまたは動物を感染させるのに用いる感染したマダニ由 来の生存能のあるボレリア・バークドルフェリを培養する能力を除去または大幅 に減少できる細胞性免疫（ＣＭＩ）応答を誘起できる場合（実施例１５参照）。 ヒトまたは動物において防御免疫応答を誘起し、ＭＨＣに制限されない本発明 の抗原の例は、以下のものを包含する： 抗原Ｐ１８はイムノブロットにより測定すると分子量が約１８ｋｄであること を特徴とする（実施例４参照）。この抗原は、感染の１ヵ月後までに抗体応答を 惹起し、安定して感染期間中、マダニ媒介体によりビイ・バーグドルフェリに感 染したヒトまたは動物において抗体応答を惹起できる。これはまた、ＭＨＣのＨ −２k、Ｈ−２dおよびＨ−２bハプロタイプのマウスについての応答を惹起する 。即ち、Ｐ１８はＭＨＣ制限的でない。この抗原は、ビイ・バーグドルフェリの 種間、例えばＢ３１およびＪＤ−１間に交差反応応答を惹起する能力も示す。 抗原Ｐ４３は、イムノブロットにより測定すると分子量が約４３ｋＤであるこ とを特徴とする（実施例４参照）。この抗原は、感染後の１２日まで、マダニ媒 介体によりビイ・バーグドルフェリに感染した動物において抗体応答を惹起でき 、この応答は感染期間中安定である。Ｐ４３はＭＨＣのＨ−２k、Ｈ−２bおよび Ｈ−２dハプロタイプのハムスターおよびマウスからの応答を惹起でき、Ｐ４３ は、ＭＨＣ制限的でない。この抗原は、少なくとも２つの異なるビイ・バーグド ルフェリの株、Ｂ３１およびＪＤ−１低継代分離菌により発現されるが、同じ種 の高継代（長期間培養）分離菌によって発現されず、Ｂ３１およびＪＤ−１間で 交差反応応答を惹起する。例えば、ボレリア・バーグドルフェリで感染したこと が立証される（特徴的遊走性紅斑疹の前縁での皮膚生検からのスピロヘータを培 養することによる）ヒト患者の小集団をスクリーンする。これらの患者からの血 漿は抗原としてＪＤ−１低継代を用いた患者の２０人中１０人で、抗原として低 継代Ｂ３１を用いた患者２０人中１１人で反応性であった。 本発明の他の抗原の例はＰ３９であり、これはイムノブロットで測定した分子 量が約３９ｋｄであることを特徴とする。本発明の他の抗原同様、これはマダニ 媒介体によりビイ・バーグドルフェリに感染した人および動物において抗体応答 を惹起し、この応答は感染期間中安定である。これはＭＨＣ−制限的でなく、種 々のビイ・バーグドルフェリ種間で交差反応性応答を惹起できる。 対象となるさらに別の本発明のビイ・バーグドルフェリ抗原はＰ１７である。 単離抗原Ｐ１７はイムノブロットで測定した分子量が約１７ｋＤであることを特 徴とする（実施例４参照）。この抗原はまた感染後１ヵ月までおよび感染期間中 安定して抗体応答を誘起する能力を特徴とする。Ｐ１７は、また相同種Ｂ３１に 関して検定した場合、ＭＨＣ−非制限的応答を惹起できるが、制限的な方法で、 異種ＪＤ−１に応答する（実施例１３参照）。Ｐ１７はＢ３１に関してＭＨＣ制 限的でないが、ＪＤ−１に関して制限的である。この抗原は、ビイ・バーグドル フェリ株間、例えばＢ３１およびＪＤ−１間で交差反応応答を惹起する能力を示 す。他のＢ３１ＭＨＣ非制限抗原は、Ｐ２４、Ｐ２２およびＰ１４で、これはＪ Ｄ−１と反応性でない。 本発明において対象となる他の抗原は、Ｂ３１ＭＨＣ非制限的で、ＪＤ−１非 反応性のもの、即ちＰ２９およびＰ３２である。対象となる他の抗原は、Ｂ３１ ＭＨＣ制限的で、ＪＤ−１交差反応性でＭＨＣ制限的なもの、即ちＰ３０である 。ビイ・バーグドルフェリ抗原、Ｐ８３、Ｐ５２〜Ｐ６５、Ｐ４１（ｆｌａ）、 Ｐ２８およびＰ３４は、Ｂ３１非ＭＨＣ制限的で、ＪＤ−１交差反応性であるが 制限的でない。 本発明の抗原は、その免疫原性を増加するように修飾してもよい。例えば、抗 原は、カップリングが抗原または担体のいずれかの所望の生物学的活性を干渉し ないと仮定すると、化合物または免疫原性担体とカップリングしてもよい。カッ プリングの一般的考察に関しては、アンチボディーズ、ア・ラボラトリー・マニ ュアル（Antibodies，A Laboratory Manual），コールド・スプリング・ハーバ ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory），編集イー・ハーロウお よびディー・レーン（E．HarlowおよびD．Lane）（１９８８））参照。当業界に おいて公知の有用な免疫原性担体としては、アオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）； ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；卵白アルブミン；ＰＰＤ（ツベルクリンの精製 タンパク質誘導体）赤血球；破傷風トキソイド；コレラトキソイド；アガロース ビーズ；活性炭；またはベントナイトが挙げられるが、これに限定されるもので はない。カップリングに関して有用な化合物は、ジニトロフェノール基およびア ルソニリン酸を包含するが、これに限定されるわけではない。抗原は、熱変性お よび／または ＳＤＳなどの他の技術により修飾される。さらに、本発明の抗原は、任意に、選 択されたポリペプチドまたはタンパク質、例えばボレリア抗原ＯｓｐＡおよびＯ ｓｐＢ）他のボレリア抗原、および他の微生物由来のタンパク質またはポリペプ チドと融合してもよい。 本発明の他の抗原は、医薬上許容される塩の形態で用いてもよい。本発明のポ リペプチドと塩を形成できる適当な酸および塩基は当業者には公知であり、無機 および有機酸および塩基を包含する。 抗体 本発明は、また、生物学的液体中に存在する場合、ビイ・バーグドルフェリ病 原体から本発明の自然発生的抗原を認識および結合できる抗体を提供する。本発 明の目的に関して、「生物学的液体」なる語は、血液、血漿、血清、涙、唾液、 尿、膣分泌物、滑液、膀胱壁または耳穿刺を含む。これらの抗体は、ライム病の 診断およびライム病に関して陽性または試験前にライム病の徴侯を示すヒトおよ び／または動物の治療用組成物において有用である。抗体は、単独で、または本 発明の他の抗原に対する抗体ならびに他の公知のビイ・バーグドルフェリ抗原に 対する抗体と組合せて診断において有用である。これらの抗体は、本発明の単離 された抗原を用いて通常の手段により生成できる。例えば、ポリクローナル抗体 は通常選択された動物またはヒトの免疫系を１以上の単離された抗原で刺激し、 免疫系によりそれに対する自然の抗体を産生させ、これらの抗体を動物またはヒ トの血液あるいは他の生物学的液体から回収することにより産生する。 以下の第VI表は、本発明のモノクローナル抗体のリストである。しかし、本発 明の方法の実施に関しては、他のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を入手し、用い るのも望ましい。 したがって、所望のＭＡｂを発現するハイブリドーマ細胞系は、公知の通常の 技術、例えばコラーおよびミルスタイン（KohlerおよびMilstein）およびその変 法として知られている方法により産生される。同様に望ましい高力価の抗体も、 公知の組み換え技術をこれらの抗原に対して発生したモノクローナルまたはポリ クローナル抗体に適用することにより産生される［例えば、ＰＣＴ特許出願第Ｐ ＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号；英国特許出願公開第ＧＢ２１８８６３８Ａ号； アミ（Amit）ら、サイエンス（Science），２３３：７４７−７５３（１９８６ ）；クィーン（Queen）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ ー・オブ・サイエンシス（Proc．Nat’l．Acad．Sci．USA），８６：１００２９ −１００３３（１９８９）；ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＷＯ９００７８６１号； およびライヒマン（Reichmann）ら、ネイチャー（Nature），３３２：３２３− ３２７（１９８８）参照］。あるいは、抗原は、多抗原性複合体として組み立て てもよく［例えば、ヨーロッパ特許出願第０３３９６９５号１９８９年１１月２ 日公開参照］、感染した動物またはヒトの生物学的液体中に出現するように高力 価の選択された抗原を結合できる抗体を惹起するために用いてもよい。 診断検定において用いるために、抗体は、単独または他の組成物または化合物 と組合せて検出可能な信号を提供できる通常の標識と会合してもよい。１以上の 抗体を診断法において用いる場合、標識は相互反応性で検出可能な信号を生成す るのが望ましい。最も望ましくは、標識は視覚的に、例えば比色により検出可能 である。検定において比色信号を出現させるように操作する種々の酵素系が先行 技術において記載されている。一例として、グルコースオキシダーゼ（グルコー スを基質として用いる）は生成物として過酸化物を放出する。過酸化物および水 素ドナー、例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などと反応して酸化ＴＭＢ を産生するペルオキシダーゼは青色である。他の例は、ホースラディッシュペル オキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびグルコー ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと結合したヘキソキナーゼを包含し、こ れはＡＴＰ、グルコースおよびＮＡＤ＋と反応して他の生成物のうち、ＮＡＤＨ を産生し、これは波長３４０ｎｍでの吸光度の増加により検出される。本発明の 方法において用いられる他の標識系は、他の手段により検出できる。例えば、色 素が埋めこまれた着色ラテックス微粒子［バングス・ラボラトリース（Bangs La boratories），インディアナ州］を酵素の代わりに用いて抗体との接合体を形成 させ、適用できる検定において得られた複合体の存在を示す視覚的シ グナル、蛍光化合物、放射性化合物または元素、あるいはイムノエレクトロード を得る。本発明の診断法において有用な抗体との結合に関して検出可能な標識は 、診断法の熟練者には公知で容易に入手可能な種々の組成物から容易に選択でき る。本発明の方法および抗体は用いた特定の検出可能な標識または標識系に限定 されない。 診断法および試験 本発明はまたライム病の診断法を提供する。これらの診断法は、ライム病の症 状を示すかまたはライム病にかかっていると疑いのあるヒトまたは動物の治療に おいて有用である。 一例において、この診断法は、感染したヒトまたは動物の免疫系により、その 生物学的液体中に産生され、本発明の抗原またはその組合せ（所望によりＰ３９ タンパク質を含んでいてもよい）との結合能を有する、天然の抗ビイ・バーグド ルフェリ抗体の存在を検出することからなる。この方法は、本発明の少なくとも １種のビイ・バーグドルフェリ抗原および所望により少なくとも１種のビイ・バ ーグドルフェリ由来の他の抗原を患者の生物学的液体の試料と共に培養する工程 からなる。ビイ・バーグドルフェリ感染の結果として該液体中に存在する抗体は 、抗原と抗体−抗原複合体を形成する。続いて、反応混合物を分析して、これら の抗原−抗体複合体の存在を調べる。反応混合物を分析する工程は、反応混合物 を抗体の標識した特異性結合相手と接触させることを含む。好ましい具体例にお いて、この方法は、ラテックスビーズを本発明の単離された抗原と結合させる。 続いて、生物学的液体をビーズ／タンパク質接合体と共に培養し、これにより反 応混合物を形成する。反応混合物を次に抗体の存在に関して分析する。 他の具体例において、本発明の診断法は、病原体により感染した動物またはヒ トの生物学的液体中、ビイ・ブルグドルフェリ病原体に関連した天然の抗原それ 自身の存在を検出することを含む。この方法は、好ましくは検出のために通常ど おり標識した、本発明の抗体（例えば、適当なヒトおよび／または動物に、少な くとも１種の本発明のボレリア・バーグドルフェリ抗原および所望により少なく とも１種の他のビイ・バーグドルフェリ抗原を投与することにより産生）を、診 断するヒトまたは動物からの生物学的液体の試料と共に培養する工程からなる。 ヒトまたは動物の患者のビイ・バーグドルフェリ感染の存在下で、抗原−抗体複 合体が形成される（特異的結合が起こる）。その後、過剰の標識化抗体を所望に より除去してもよく、反応混合物を分析して、抗原−抗体複合体の存在および抗 体と結合した標識の量を調べる。 本発明のタンパク質抗原を用いた検定はヘテロジニアス（即ち、分離工程を要 する）であってもホモジニアスであってもよい。検定がヘテロジニアスである場 合、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーまたは磁気を含む種々の分離手段を用 いることができる。 血液生成物または他の生理学的または生物学的液体のスクリーニング用の好ま しい検定法は、酵素結合免疫吸着法、即ちＥＬＩＳＡである。好ましくは、多種 のビイ・バーグドルフェリを認識でき、第３のマダニ抽出物を用いて未感染アイ ・ダミニ（幼虫、若虫または成虫）からビイ・バーグドルフェリ感染した者を区 別し、試験用の適当な物質を得ることができるＥＬＩＳＡは抗原捕捉２点ＥＬＩ ＳＡ（antigen-capture two-site ＥＬＩＳＡ）である。 しかし、ＥＬＩＳＡにおいて典型的には、本発明の単離された抗原は、マイク ロタイターウェルに直接または捕捉マトリックス（即ち抗体）を介して吸着され る。残存する表面上のタンパク質結合部位を次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 、熱不活化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）またはブロット（BLOTTO）（さらに、防腐剤 、塩および消泡剤を含有する脱脂粉乳の緩衝溶液）などの適当な試薬で遮断する 。ウェルを次に特定の抗ビイ・バーグドルフェリ抗体を含有する疑いのある生物 学的試料と共に培養する。試料はそのまま用いることもできるが、これを通常少 量（０．１〜５．０％）のＢＳＡ、ＮＧＳまたはＢＬＯＴＴＯなどのタンパク質 を含有する緩衝液中で希釈して用いることが多い。十分な時間培養して特異的結 合を起こした後、ウェルを洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、次に 標識化した抗ヒト免疫グロブリン（αＨｕＩｇ）とともに培養する。標識は、前 記のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、 アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼを含む種々の酵素から選 択で きる。特異的結合が再び起こるよう十分時間が経過した後、ウェルを再び洗浄し て結合していない複合体を除去し、酵素の基質を添加する。発色させ、ウェル中 の内容物の光学密度を視覚的または機器により測定する。 さらに、抗原と結合できる本発明のＭＡｂまたは他の抗体をＥＬＩＳＡプレー トに結合させる。他の診断法において、生物学的液体を抗体結合プレート上で培 養し、洗浄する。抗原−抗体複合体の検出、および標識したＭＡｂの定量を前記 のように通常どおり行う。このような「抗原捕捉」検定は、ＯｓｐＡに関して特 異的なモノクローナル抗体を用いてマダニ中のビイ・バーグドルフェリの検出の ために発達してきたが、現在は、本発明にしたがった生物学的試料中のビイ・バ ーグドルフェリの存在の検出する好ましい方法である。この検定法は、以下の実 施例１４においてさらに詳細に記載する。簡単には、検定は、抗原捕捉用のモノ クローナル抗体およびシグナル生成のための標識したウサギポリクローナル抗ビ イ・バーグドルフェリ抗体を用いる。検定の感度は、ビイ・バーグドルフェリス ピロヘータの約５０〜約２００のビイ・バーグドルフェリスピロヘータ、特に約 １００スピロヘータである。若虫および成虫における感染は、２５％未満のマダ ニを用いて測定でき、これにより、確認試験を行う。 他の有用な検定法は、フィルターカップおよびディップスティックを包含する 。前者の検定法においては、本発明の抗体を小さなキャップの開口部のガラス濾 過器に固定する。生物学的液体または試料（５ｍＬ）をフィルターを通して処理 する。抗原が存在する場合（すなわちビイ・バーグドルフェリ感染）、これはフ ィルターに結合し、次に第二抗体／検出物質により視覚化される。ディップステ ィック検定では、抗原または抗体をフィルターに固定し、これを次に生物学的液 体に浸し、乾燥し、検出分子を用いてスクリーンする。 通常の検定法、特に免疫検定法は、動物およびヒトにおけるビイ・バーグドル フェリ感染の検出に本発明の単離された抗原および抗体を用いる様にできること は、当業者には理解できる。本発明はしたがって、特定の検定法の選択に限定さ れるのではなく、当業者に公知の検定法を包含すると考えられる。 診断キット 都合がために、ＥＬＩＳＡまたは本発明に従った他の検定用の試薬はキットの 形態で得られる。このようなキットは、少なくとも一種の本発明のビイ・バーグ ドルフェリ抗原および／または本発明のビイ・バーグドルフェリ抗原と結合でき る少なくとも一種のビイ・バーグドルフェリ抗体を含有するヒトまたは動物試料 におけるビイ・バーグドルフェリでの感染の診断に有用である。 これらのキットは、本発明のビイ・バーグドルフェリ抗原タンパク質または抗 体をあらかじめ吸着させたマイクロタイタープレート、種々の希釈剤および緩衝 液、特異的に結合した抗原または抗体の検出用の標識化した接合体、および他の シグナル生成試薬、例えば酵素基質、コファクターおよび色素原を含む。これら のキットの他の成分は当業者にとって容易に決定される。このような成分は、例 えばＰ１８、Ｐ１９、Ｐ３９またはＰ４３などのＢ３１非ＭＨＣ制限、ＪＤ−１ 交差反応性および非ＭＨＣ制限の本発明の抗原に対するポリクローナルまたはモ ノクローナル捕捉抗体；Ｐ１７などのＢ３１非ＭＨＣ制限、ＪＤ−１ＭＨＣ制限 抗原に対する抗体；または２以上のこれらの抗体のカクテル、これらの抗原を標 準どおり精製または半精製した抽出物、ＭＡｂ検出抗体、指標分子が結合した抗 マウスまたは抗ヒト抗体、吸着用に調製したＥＬＩＳＡプレート、比色用指標チ ャート、使い捨ての手袋、汚染除去の指示書、アプリケータースティックまたは 容器および試料調製カップを包含する。前記第Ｉ表に列挙したようなＢ３１ＭＨ Ｃ制限抗原もこのキットの一部を形成してもよい。本発明のモノクローナル抗体 の適当な例を第VI表に示す。これらのキットはビイ・バーグドルフェリ感染を診 断する臨床実験室用の簡便で有効な方法を提供する。 治療用組成物 本発明の抗体は、単独または他のビイ・バーグドルフェリ抗原、例えば抗Ｂ３ ９ｋＤ、抗ＯｓｐＡまたは抗ＯｓｐＢ等と組合せて、ビイ・バーグドルフェリで 感染したヒトおよび／または動物の治療用の治療組成物および方法においても用 いられる。このような治療用組成物は、担体または希釈剤および１以上の本発明 の抗体を含むように処方できる（第VI表参照）。適当な医薬上許容される担体は 、タンパク質の投与を容易にするが、生理学的に不活性および／または無害であ る。 担体は当業者により選択される。担体は、例えば、滅菌食塩水、ラクトース、 シュークロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン 、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、および水が挙げられる。さらに、担体または 希釈剤は、遅延物質、例えばグリセロールモノステアラートまたはグリセロール モノステアラートを単独またはワックスと共に含んでもよい。さらに、徐放性ポ リマー処方物も用いることができる。 所望により、この組成物は通常の医薬成分、例えば防腐剤または化学安定剤を 含んでもよい。治療用組成物において抗体と合わせて用いられる適当な成分は、 例えばカザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、 燐酸カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物およびドライミルクを 包含する。 本発明の抗体の代わりに、あるいはそれに加えて、ライム病の治療において有 用なの治療薬、例えば抗生物質または免疫剌激剤、本発明の抗原の受容体媒介活 性の拮抗物質およびサイトカイン調製要素が症状の軽減または除去において有用 であることが期待できる。マダニ媒介体から放出される免疫抑制物質を抑制また は反作用するのに用いることができる薬剤は、感染したヒトまたは動物の自然免 疫を助けるように作用する。従って、このような薬剤は、本発明の治療用組成物 と共同して作用する。これらの薬剤を含む治療用組成物の発展は、本発明の観点 から当業者の技術範囲内である。 本発明の方法にしたがって、有効量のこのような治療用組成物を投与すること によりヒトまたは動物をビイ・バーグドルフェリ感染に関して治療する。好まし くは、このような組成物は、非経口的、好ましくは、筋肉内または皮下的に投与 する。しかし、経口またはトポロジーを含む他の適当な経路により投与するよう に処方できる。 本発明の治療用組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬから約１０００μｇ／ｍＬの 間の本発明の抗体を含有する。このような組成物を１日につき１〜３回、１日か ら１２週間にわたって投与する。しかし、適当な用量は、主治医または獣医によ り、ヒトまたは動物患者の年令、性別、体重および総体的健康状態に応じて決定 される。 ワクチン組成物 他の態様において、本発明は、ビイ・バーグドルフェリに関連したライム病に 対する防御において有用なワクチン組成物および動物またはヒトに有効量のこの ような組成物を投与する予防法を提供する。このワクチン組成物は、本発明の１ またはそれ以上の抗原、または２またはそれ以上のこれらの単離タンパク質、ま たはこれらの抗原と他のビイ・バーグドルフェリの抗原、例えば３９ｋＤタンパ ク質、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢタンパク質の組合せおよび医薬上許容される担体 または希釈剤を含有してもよい。担体の例は前記のとおりである。 所望により、ワクチン組成物はさらにアジュバント、防腐剤、化学安定剤、ま たは他の抗原タンパク質を含んでもよい。典型的には、安定剤、アジュバント、 および防腐剤は、対象となるヒトまたは動物においての有効性に関して最良の処 方を決めるように最適化される。適当な防腐剤は、例えば、クロロブタノール、 ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン 、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含 する。 １またはそれ以上の前記ワクチン成分を混合し、通常のアジュバントで吸着さ せる。アジュバントは、白血球を集めるかまたは免疫応答を向上させるための非 特異的剌激剤として用いる。このようなアジュバントは、とりわけ、鉱物油およ び水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン、アブリジン、Ｌ１２１／スクアレン 、Ｄ−ラクチド−ポリアクチド／グリコシド、プルロニックプライオイス、ムラ ミルジペプチド、死菌ボレリアおよびサポニン、例えばＱｕｉｌＡを包含する。 適当量の活性成分は、望ましい免疫応答のレベルに基づいて当業者が決定でき る。しかし、一般には、ワクチン組成物は１ｍＬあたり１ｎｇから１０００ｍｇ 、好ましくは１ｍＬあたり０．０５μｇから１ｍｇの抗原を含有する。加えて、 本 発明のワクチン組成物は、気管支敗血症菌、イヌパルボウイルス、イヌジステン パー、狂犬病、レプトスポリジア、イヌコロナウイルスおよびイヌアデノウイル スを含む他の非ビイ・バーグドルフェリ抗原を含んでもよい。他の動物種由来の ワクチン剤、例えばネココロナウイルス等もこの組成物中に含まれてもよい。 本発明のワクチン組成物の適当な用量は、当業者であれば容易に決定できる。 一般に、適当な用量は、０．１から５ｍＬのワクチン組成物である。さらに、治 療するヒト患者または動物種に応じて、例えば体重、年令、および総体的健康状 態に応じて、用量は当業者が容易に決定できる。 一般に、ワクチンは、季節に基づいて１度投与する。マダニの季節、通常春に 、ブースター投与を行う。ワクチンは適当な経路により投与する。しかし、非経 口投与、特に筋肉内および皮下が好ましい経路である。経口投与も好ましい。 以下の実施例において、本発明のタンパク抗原を得る好ましい方法、および本 発明の検定および組成物の調製の好ましい方法を示す。明らかに、これらの実施 例から本発明の抗原が現在用いられている抗原よりずっと正確な診断試薬である ことがわかる。これらの実施例においてＰ１７、Ｐ１８、Ｐ３９、およびＰ４３ タンパク質は非ＭＨＣ制限応答（少なくとも、Ｂ３１に関して）を誘起し、少な くとも２種のボレリア・バーグドルフェリ間で交差反応性であった。Ｐ３９タン パク質は既にクローンされ、Ｐ３９に対して特異的なモノクローナル抗体は産生 されている［シンプソンおよびシュワン（SimpsonおよびSchwan）、非公開］。 以下の実施例の結果から、本発明の単離抗原Ｐ１７、Ｐ１８およびＰ４３ならび にＰ３９はライム病について潜在的な診断作用を有し、ライム血清学を向上させ るものであることがわかる。これらの実施例は例示のためのものであって、本発 明の範囲を限定するものではない。実施例１−細菌種およびその増殖 ビイ・バーグドルフェリのＪＤ１株［ジェイ・ピースマン（J．Piesman）ら、 ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー（J．Clin．Microbiol．） ，２５：５５７−５５８（１９８７）およびティー・ジー・シュワン（T．G．Sc hwan） ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー，２７：１７３４−１ ７３８（１９８９）］を、ゴールデンシリアンハムスター（サスコ（SASCO）、 ネブラスカ州、オマハ）にて、４回反復するマダニ継代について、ビイ・バーグ ドルフェリ感染アイ・ダミニマダニをハムスターに交互させることにより維持す る。 ビイ・バーグドルフェリを修飾ＢＳＫ ＩＩ培地中で３４゜Ｃで培養する［ア ール・ジェイ・シンスキー（R．J．Sinsky）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル ・ミクロバイオロジー，２７：１７２３−１７２７（１９８９）］。培養したハ ムスターの耳生検の真菌汚染物質を選択的に阻害するために、１リットル当たり ２０ｍｇのシクロヘキシミドを添加することによりこのＢＳＫ ＩＩブロスをさ らに修飾する。 外部のマダニ表面をまずウェスコダイン（（Wescodyne）、アムスコ・メディ カル・プロダクツ（Amsco Medical Products），ペンシルベニア州、エリー）お よび７０％エタノールに浸漬し、つづいてＢＳＫ ＩＩ培地に浸漬することによ り汚染物質を除去する。ついで、テン・ブレック・ホモジナイザー（Ten Broeck homogenizer）中、１０〜２０匹の若虫を１〜２ｍｌの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）中 で粉砕することにより飽食後２〜３週間の感染イクソデス・ダミニ若虫のホモジ ネートを調製する。ハムスターに０．４ｍｌのホモジネートを腹腔内または皮内 に数箇所接種する。実施例２−ハムスター感染 ハムスターに関する研究のために、動物を接種により培養したビイ・バーグド ルフェリ感染マダニのホモジネートに暴露するか、またはマダニに刺されること によりビイ・バーグドルフェリに暴露する。前記のように、マダニに噛まれるこ とによりハムスターはビイ・バーグドルフェリ感染アイ・ダミニに感染する［ジ ェイ・ピースマン（J．Piesman）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバ イオロジー，２５：５５７−５５８（１９８７）］。針接種に関しては、培養し た微生物をゆっくり撹拌することにより懸濁し、暗視野顕微鏡法により計数し、 適 当にＢＳＫ ＩＩ培地中に希釈する。最初の実験の場合、ハムスターを標準化接 種物を含有する０．７ｍｌのＢＳＫ ＩＩを腹腔内または皮内で数箇所に接種す る。用量応答研究の場合、ハムスターに０．１ｍｌの種々の濃度の微生物（１× １０4〜１×１０8細胞／ｍｌ）を皮内接種する。実施例３−酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ） 以下の検定を実施例５〜８のハムスターに関する研究および実施例９〜１３の マウスの研究の両方に用いた。 ＥＬＩＳＡ検定を、基本的に、ジェイ・ティー・レーリッヒ（J．T．Roehrig ）ら、ウイロロジー（Virology），１１８：２６９〜２７８（１９８２）に記載 されているようにして行う。簡単には、抗原をイムノロン２プレート（ダイナテ ック・インコーポレイテッド（Dynatech，Inc．）、メリーランド州、ケンジン トン）上に一夜４℃で全細胞超音波処理物については２μ／ウェルの濃度で、精 製鞭毛については６０ｎｇ／ウェル、あるいは組み換えＯｓｐＡについては２μ ｇ／ウェルの濃度でコートする。全細胞超音波処理物を、エイチ・ラッセル（H ．Russel）ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディシーズ（J．Infec． Dis．），１４９：４６５〜４７０（１９８４）に従って調製し、細胞周辺鞭毛 を、エイ・ジイ・バーバー（A．G．Barbour）ら、インフェクション・アンド・ イムニティー（Infec．Immun．），５２：５４９〜５５４（１９８６）の方法を 用いて調製する。精製した組み換えＯｓｐＡは、ジョン・ダン博士（Dr．John D unn）、ブロックハブン・ナショナル・ラボラトリー（Brookhaven National Lab oratory）から寄贈された［ジェイ・ジェイ・ダン（J．J．Dunn）ら、プロテイ ン・エクスプレッション．アンド・ピューリフィケイション（Protein Expressi on and Purification），１：１５９〜１６８（１９９１）］。 ＥＬＩＳＡ抗原濃度は、正または負の対照血清に関して抗原の標準的ボックス 力価測定法において測定する。用いた抗原濃度は、抗血清希釈度範囲にわたり正 の対照血清の最大結合を示す最小量である。抗原でコートした後、ウェルを次に １時間３７℃でＰＢＳ中３％ヤギ血清で遮断する。プレートを０．５％ウィーン ２０（Tween 20）を含むＰＢＳ（リンス緩衝液）ですすぐ。結合したハムスター 抗体を１：２００００または１：４００００に希釈したヤギ抗ハムスターＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ（カペル・ラボラトリース（Cappel Laboratories ），ペンシルベニア州、マルバーン）で検出する。結合した接合体を検出するの に用いた基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｈ2 Ｏ2である［ティー・エフ・トサイ（T．F．Tsai）ら、ジャーナル・オブ・クリ ニカル・ミクロバイオロジー，２６：２６２０−２６２５（１９８８）］。５μ ｌ／ウェルの２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を添加することにより反応性を３０分後に停止させ る。吸光度を４５０ｎｍでタイターテック・マルチスキャンＭＣ分光光度計（Ti tertek Multiskan MC spectrophotometer（アイ・シー・エヌ・フロー・ラボラ トリース（ＩＣＮ Flow Laboratories），カリフォルニア州、コスタ・メサ）） で測定する。実施例４−イムノブロット 以下の方法を実施例５〜８のハムスターに関する研究および実施例９〜１３の マウスの研究に関して用いた。 イムノブロットはすでに公開された方法［ジェイ・ティー・レーリッヒ（J．T ．Roehrig）ら、ウイロロジー（Virology），１４２：３４７〜３５６（１９８ ５）およびエイチ・トービン（H．Towbin）ら、プロシーディングズ・オブ・ナ ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス（Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ ），７６：４３５０〜４３５４（１９７９）］を変更したものである。ビイ・バ ーグドルフェリＪＤ１株、タンパク質（１×１０7細胞／ゲル）を１２．５％ポ リアクリルアミド分取用ミニゲル［ユー・ケイ・レムリ（U．K．Laemmli）、ネ イチャー（Nature）（ロンドン），２７７：６８０〜６８５（１９７０）］上で 標品として高分子量バイオラッド・レインボーマーカー（バイオラッド（BioRad ）、バージニア州、リッチモンド）を用いて分離する。２１．４ｋＤａマーカー が分割ゲルの底部に移動したらゲルを停止させる。分子量測定は平均ゲル移動度 に基づく（ｎ＝５）。 タンパク質を、Immobilon−Ｐ膜（ミリポール・コーポレーション （Millipore Corporation），メリーランド州、ベッドホールド）上で、１時間 セミホール・ブロッター（Semiphor blotter）（ホエファー・サイエンティフィ ック・インストラメンツ（Hoeffer Scientific Instruments），カリフォルニア 州、サンフランシスコ）中、１００ｍＡでエレクトロブロットする。膜の端を切 断し、次のゴールド−ブロットタンパク質色素（インテグレイテッド・セパレー ション・システムズ（Integrated Separation Systems），メリーランド州、ハ イドパーク）での染色後、マーカーとして用いる。膜の残りを３７℃で１時間、 または４℃で一夜ＰＢＳ中３％ヤギ血清で遮断し、リンス緩衝液ですすぎ、細片 に切断する。リンス緩衝液中希釈したハムスター血清と共にゆらしながら細片を 、室温で２時間培養する。 ｐ１４、Ｈ９７２４；ＯｓｐＡ、Ｈ５３３２；およびＯｓｐＢ、Ｈ６８３１（ シンビコム（Symbicon），スウェーデン、ウメア）に関して特異的なネズミモノ クローナル抗体（ＭＡｂ）組織培養上清を１：５または１：２０の希釈度で用い る。結合したハムスター抗体をヤギ抗ハムスターＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダ ーゼ標識抗体（カペル・ラボラトリー、ペンシルベニア州、マルバーン）で検出 する。結合したネズミＭＡｂを、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ペルオキシダーゼ 標識抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリース・インコーポレーテッ ド（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc．），ペンシルベニア州、ウエ ストグローブ）で検出する。結合したペルオキシダーゼ接合体を検出するのに用 いた基質は、修飾した組織化学的ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2基質（キルケガード・アンド・ ペリー・ラボラトリース（Kirkegaard and Perry Laboratories），メリーラン ド州、ガイザースバーグ）または化学発光基質（アメルシャム・インターナショ ナル（Amersham International），イリノイ州、アーリントン・ハイツ）である 。染色されたブロットを１〜５分間展開させ、水中ですすぐことにより反応を停 止 ルシャム・インターナショナル、イリノイ州、アーリントン・ハイツ）を用いて 蛍光間接撮影法により記録する。実施例５−種々の抗原源での種々の接種経路でのハムスター免疫応答 接種の経路および抗原源のビイ・バーグドルフェリに対するハムスター抗体応 答に関する影響を比較するために、前記実施例１および２に記載したように針接 種またはマダニの吸血のいずれかで動物を感染させる。感染に用いた抗原の種類 および量の両者を変える。動物を腹腔内または皮内で、培地で増殖させた細菌ま たはビイ・バーグドルフェリ感染アイ・ダミニマダニのホモジネートを接種する 。ハムスターの感染に用いた感染したマダニの数も変えて、自然の用量応答を剌 激する。 動物のうち１匹（以下の第II表におけるＮｏ．３）を、ビイ・バーグドルフェ リ感染若虫に供給する前にバーバーらの方法［インフェクション・アンド・イム ニティー，５２：５４９−５５４（１９８６）］により調製した鞭毛に関して付 加された抗原で免疫化する。この動物に関する免疫化方法は、２箇所に、５０μ ｇのフロインド完全アジュバント中抗原を皮下接種することからなる。２週間後 、動物に５０μｇのフロインド不完全アジュバント中抗原をブースター投与する 。この動物の感染前の力価は、完全細胞超音波処理物ＥＬＩＳＡにおいて測定す ると、１：３２００００である。 ハムスターを攻撃後の種々の時点で採血し、全細胞超音波処理物または精製鞭 毛に対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定する。感染の効率を、以下の実施例６ に記載するように、耳生検からビイ・バーグドルフェリを単離することによりモ ニターする。２７番のハムスターを除いては、ハムスターは全て感染後（Ｐ．Ｉ ．）１ヵ月で陽性である。 以下の第II表において、第３列は、ハムスターがビイ・バーグドルフェリに感 染したアイ・ダミニ若虫または幼虫に吸血されるかまたはマダニホモジネートま たは培養で増殖させたスピロヘータを針接種するかのいずれで感染させたかを示 し、第４列は吸血またはホモジネート産生に用いた感染したマダニの数、または 純粋なスピロヘータの濃度（log10）を表わし、第５列は、血清試料を採取した 感染後の日数を表わし、第６列は、全細胞超音波処理物（Ｓｏｎ）または精製鞭 毛抗原の終点ＥＬＩＳＡ力価の逆数を示す。 全ての動物に関する免疫前の力価は、全細胞超音波処理物に関しては≦４０、 ＯｓｐＡに関しては≦２０、鞭毛抗原に関しては≦１０である。高い全細胞超音 波処理物のＥＬＩＳＡ価（３、８、９、１４、１５、１６および１７）を有する ハムスターの血清試料を１：１００に希釈し、他の血清はすべて１：５０に希釈 して、イムノブロットにおける抗体活性を比較する。これは実施例４に記載した 通りに行う。結合した抗体は、ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2組織化学的基質で検出する。マダ ニで感染したハムスターを１週間間隔で採血する。 １×１０7または１×１０8個の培地で増殖したＪＤ１を接種したハムスターは 全て、接種の経路に関係なくＥＬＩＳＡにおける全細胞超音波処理物および鞭毛 、およびイムノブロットにおけるＯｓｐＡおよびＯｓｐＢの両方に対する抗体を 産生する（第II表）。ＯｓｐＡＥＬＩＳＡに関する正の抗体対照として、ハムス ター１５および１６を、組み換えＯｓｐＡ抗原に対する抗体に関しても試験した 。これらのハムスターの抗ＯｓｐＡ価は１：３２０であった。マダニホモジネー トを接種した数匹の動物において、イムノブロットで低いレベルの抗ＯｓｐＡ（ 抗ＯｓｐＢ抗体はない）が示されることもある。 しかし、マダニの用量に関係なく、マダニ感染の後、抗ＯｓｐＡまたは抗Ｏｓ ｐＢ反応性は同定されないかまたは非常に低い。自然に感染した動物全部、およ びマダニホモジネートを接種した多くの動物は、それぞれＥＬＩＳＡまたはイム ノブロットにより抗鞭毛または抗ｐ４１抗体を示さない（第II表）。４７、４３ （Ｐ４３）、２１、および２０ｋＤａタンパク質に対する抗体応答は、接種の経 路または免疫原の種類に関係なくハムスターにおいて観察される。Ｐ４１および Ｐ４３は抗鞭毛ＭＡｂＨ９２７４の選択的Ｐ４１反応性により区別できる。同様 な区別は、マダニの攻撃前に部分的に精製したフラジェリンで免疫化したハムス ター３において観察される。このハムスターにおいては、この動物のフラジェリ ンに対して既に存在する免疫に応じてより強いＰ４１バンドがイムノブロットに おいて観察される。実施例６−マダニに刺されることによる感染の後のハムスター免疫応答の速度論 マダニに感染したハムスターは、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢに対してあまり応答 しない。自然感染後のハムスター抗体応答の運動をより良く特質化するために、 経時的な抗体産生（第１図）を分析する。自然感染の効率を、耳生検からスピロ ヘータを単離することにより測定する［ジェイ・シンスキー（J．Sinsky）ら、 ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー，２７：１７２３−１７２ ７（１９８９）］。 ハムスターの耳をまず７０％エタノールで消毒し、耳の楔型小片を切断する。 耳生検を、連続してウエスコジン（Wescodyne）および７０％エタノールにそれ ぞれ１５分ずつ続けて浸漬することにより消毒する。楔型小片（２５ｍｍ2）を 小刀で細かく刻み、小片をすべてＢＳＫ ＩＩ培地を入れた４ｍｌ試験管中に接 種し、３４℃で培養する。培養物を陽性になるまで、または２８日間観察する。 すべてのハムスターは、特に記載しないかぎり、接種またはマダニ吸血後１ヵ 月で採取した耳生検からビイ・バーグドルフェリを培養手段で単離することによ り示されるように、感染が持続した。ハムスター抗体応答は迅速である。即ち高 い抗体価が感染の１週間後に起こり、実験中安定に保たれた。１週間後のピーク の後、フラジェリンに対する抗体価は減少し、より低い力価で安定に保たれる（ 第１図）。この結果は、Ｐ４１に関するイムノブロット反応性により確認される 。 この分析は、ハムスター血清試料をプールし（ｎ＝６は１〜５週間、ｎ＝３は ６週間、ｎ＝２は１９週間、ｎ＝１は４２週間）、これをブロッティング前に１ ：４０に希釈する。化学発光基質を用いて抗体結合を同定する。 抗Ｐ４３抗体をイムノブロットにより１週間で検出し、これは感染期間中安定 である。感染後１９週間中、イムノブロットにより抗ＯｓｐＡ抗体はほとんど検 出されず抗ＯｓｐＢ抗体は検出されない。感染４２週間後、生存している１匹の ハムスターはＯｓｐＡまたはＯｓｐＢのいずれかに対する抗体をほとんど示さな い。このハムスターは、しかし依然として培養陽性である。Ｐ３９抗原に対する 抗体は感染後２〜４週まで検出されない。抗３９は感染の後期でも存在する。実施例７−種々の量の接種培養したビイ・バーグドルフェリに対する抗体の用量 応答 マダニ感染または針接種ハムスター間の抗体応答における差異が針接種によっ てより多くの抗原が導入されるためであるかどうかを調べるために、抗原用量応 答分析を、種々の量の培養増殖ビイ・バーグドルフェリ（３．０〜７．０log10 細胞数）の接種を用いて行う。動物を免疫後２および４週間で採血する。免疫前 の全動物に関する力価は、全細胞超音波処理物に関して≦４０、ＯｓｐＡ抗原に 関して≦２０である。 全細胞超音波処理抗原に対する最大の抗体反応性は、１×１０6以上のビイ・ バーグドルフェリを接種した後に検出される（第２図）。１×１０6または１× １０7個の細胞を接種した全動物は、ビイ・バーグドルフェリに関して培養陽性 であり、かつ全細胞超音波処理物ＥＬＩＳＡにおいて血清陽性である。１× １０5個の細胞を接種した５匹の動物のうち１匹は培養陽性であるが、全細胞超 音波処理物ＥＬＩＳＡにおいては５匹全部が血清陽性である。１×１０4個の細 胞を接種した５匹の動物のうち２匹は培養陽性であるが、全細胞超音波処理物Ｅ ＬＩＳＡにおいては３匹が血清陽性である。１×１０3の細菌を接種した動物は 全部培養陰性であるが、全細胞超音波処理物ＥＬＩＳＡにおいて測定すると、検 出可能な抗体は得られない。この実験のＬＤ50は耳生検単離により測定すると１ ．３×１０5細胞／動物である。 ビイ・バーグドルフェリを接種したハムスターの抗原特異性を用量の関数とし て示すために、ハムスターに１×１０5細胞またはそれ以上を接種する。全細胞 超音波処理物に関する各ハムスターのＥＬＩＳＡ価は基本的に同じであるので、 ４週の血清試料をプールし（ｎ＝４または５匹）、イムノブロットにおいて使用 する前に１：４０に希釈する。化学発光基質を用いて抗体結合を同定する。 これらの接種した動物は感染後４週間で高レベルの抗ＯｓｐＡおよび抗Ｏｓｐ Ｂを産生する。イムノブロットの結果と異なり、ＯｓｐＡＥＬＩＳＡにおいて測 定されるＯｓｐＡ抗体は、１×１０6または１×１０7細胞の接種後のみで検出で きる（第２図）。従って、イムノブロットはＥＬＩＳＡよりもＯｓｐＡ抗体の検 出においてより感度がよい。実施例８−定量的密度計測による抗体応答の比較 Ｐ４３、Ｐ４１、Ｐ３９、ＯｓｐＢおよびＯｓｐＡの抗体応答の直接比較は、 定量的密度計測により観察されるイムノブロット反応性を比較することにより行 う。イムノブロットにおいて結合した抗体量を、ギルホールド（Gilford）２６ ００分光光度計を用いたデンシトメータースキャンからのピーク面積の積分によ り求める。検出された抗Ｐ４３の量を１．０に標準化する。抗Ｐ４３抗体と比較 するために、他のタンパク質特異性抗体の量を抗Ｐ４３を１．０に標準化する。 すべての血清は１：４０の希釈度で用いる。 これらの結果を以下の第III表に示す。接種により攻撃した動物に関して、示 した用量はlog10細胞／攻撃である。 密度計測の結果から、視覚的観察が確認される。少なくとも４倍以上の抗Ｏｓ ｐＡおよび少なくとも３０倍以上の抗ＯｓｐＢが針接種による感染後２８日で産 生される。自然感染後７日で抗Ｐ４１応答も観察されるが、この応答は抗Ｐ４３ に関するものほど高くない。同様に、抗Ｐ４３応答は抗Ｐ３９応答よりも高い。実施例９−マウス研究のための感染マダニコロニーおよび抗原調製 Ａ．感染したマダニコロニーの維持 新しく孵化させたイクソデス・ダミニ幼虫を、ビイ・バーグドルフェリＢ３１ 株で感染したＩＣＲ異系マウスに供給し、続いて４℃、高湿度で維持する。若虫 を用いて自然の経路でマダニに接触したマウスを感染させる。すべての感染した マダニを、スピロヘータをマウスに運ぶ感染したマダニのサイクルにより維持し 、これらのマウスを用いて次に孵化させたマダニ幼虫を感染させる。 Ｂ．ボレリア抗原の調製 アイ・ダミニから単離されたＢ３１およびＪＤ−１株［ＣＤＣ（コロラド州、 フォートコリンス）から要請に応じて入手可能］を低継代または高継代の凍結保 存株からの培養物に接種する。これらの実施例において用いる、「低継代」なる 語は、Ｂ３１株に関しては培養中６継代まで、ＪＤ−１株に関しては培養中１継 代を意味する。「高継代」なる語は、両株に関していずれかの株に関する培養に おいて３０継代以上を意味する。 これらは６％ウサギ血清を補足したＢＳＫ ＩＩ培地（ペル−フリーズ・バイ オロジカルズ（Pel-Freez Biologicals），アラスカ州、ロジャース）中で増殖 する。１リットルの増殖培養物を後対数期（５日）に収穫し、１０．２４０ｇで ２０分間２０℃で遠心分離することによりペレット化する。スピロヘータをＰＢ Ｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2で洗浄し、再び遠心分離する。ペレットを１０ｍＭ Tris 、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）中に、３０ｍｌ／ｇ（細胞湿潤重量）で再懸濁する 。スピロヘータをダウンス（Dounce）ホモジナイザー中で分離させ、タンパク濃 度を２ｍｇ／ｍｌに調節する。これらの調製物を次に等容積の２Ｘ ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ試料緩衝液と混合し、分割し、−７０℃で貯蔵する。実施例１０−マダニに剌されることによるマウスの感染 ４〜６週令の成体マウスをジャクソン・ラボラトリース（Jackson Laboratori es）（マサチューセッツ州、バー・ハーバー（ＢＡＬＢ／ｃ，Ｂ１０，Ｂ１０． ＢＲおよびＢ１０．Ｄ２））または特定の病原菌を含まない（ＳＰＦ）ＤＶＢＩ Ｄ、ＮＣＩＤ、ＣＤＣ（コロラド州、フォートコリンス）で維持されたＩＣＲ異 系交配マウスのコロニーから入手する。これらの４の組み換え同系交配種および １異系交配種のマウスをイクソデスマダニによるビイ・バーグドルフェリ感染の 伝播の感染標的として用いる。 この研究において用いるマウスは、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２d）Ｃ５７ＢＬ／１ ０Ｊ（Ｂ１０）（Ｈ−２k）で、Ｂ１０バックグラウンド、Ｂ１０．ＢＲ（Ｈ− ２k）およびＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２d）に関しては組み換え同系交配種である。 ＢＡＬＢ／ｃおよびＢ１０マウスは、その免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子アロタ イプ（ＢＡＬＢ／ｃはＩｇアロタイプ「ａ」を有し、Ｂ１０はＩｇアロタイプ「 ｂ」を有する）が異なり、異系交配マウスはＭＨＣおよびＩｇハプロタイプの混 合物を有する。 各種ならびにＩＣＲ異系交配マウスから４匹のマウスのグループを耳に孔を開 けて番号を付し、免疫前の血清試料を取る。各マウスを前記実施例９に記載した ように１０〜１２匹のビイ・バーグドルフェリＢ３１株に感染したマダニに接触 させる。第IV表は、動物に付着および吸血に成功したマダニの数ならびに感染後 ３０日のボレリアスピロヘータに関する耳生検の培養結果を示す。 １ 吸血せずに回収されたマダニ ２ 感染の３０日目に耳の生検を培養することにより調べた感染実施例１１ 相同細菌種を抗原として用いたマダニに剌された結果のビイ・バー グドルフェリの感染に対する同系交配種のマウスの応答 血清サンプルを各マウスから感染後５、１２、１９、２６および６０日目に採 取し、これらの血清を、ボレリア・バーグドルフェリＢ３１株低継代（８０μｇ ）の全リゼイトを抗原として用いたウェスタンブロット分析において用いる。 サンプルをホーファー・サイエンティフィック・インストラメンツ・モデル・ ＳＥ６００（Hoefer Scientific Instruments model SE600）垂直スラブゲル電 気泳動システムを用いた非連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムにかける。重層および 分解ゲルは、各々、４％および１０％アクリルアミドである。細菌リゼイトを１ 個の分取用ウェル中８０μｇ／ゲルで操作する。分子量標準（１４〜１０６ｋＤ ）をフランキングレーンにかける。これを以下のようにして１０％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにかけ、０．２μｍニトロセルロースフィルターに電気泳動により移す。 ホーファー・セミホールＴＥ７０（Hoefer Semiphor TE70）トランスブロット システムを用いて１００ｍＡで５０分でタンパク質を１５×１５ｃｍニトロセル ロースフィルター（孔径０．２μｍ）（バイオラッド（BioRad)，カリフォルニ ア州、リッチモンド）に移す。ニトロセルロースフィルターを予め遮断した３％ ＢＳＡ−フラクションＶ、０．９％ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ Ｈ７．４および０．１％ナトリウムアジドを含有する溶液４℃で１６時間にいれ る。フィルターを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％ＮａＣｌ、および１０ ｍＭ TrisＨＣｌ ｐＨ７．４（洗浄緩衝液）で２０分間洗浄する。フィルター をイムネティック・ミニブロッター（Immunetics Miniblotter）２５にかけ、再 び洗浄する。ウェルを吸引乾燥し、洗浄緩衝液中適当な希釈度の抗血清またはモ ノクローナル抗体（ＭＡｂ）を加える。一次抗体を室温で３時間培養し、フィル ターを３回、各５分間ずつ洗浄し、１：１０００の希釈度のアルカリホスファタ ーゼ接合ヤギ抗マウス１ｇＧ＋Ｍ（ＨおよびＬ）（ジャクソン・イムノリサーチ （Jackson Immunoresearch），ペンシルベニア州、ヴィンランド）をすべてのウ ェルに添加する。１時間後、フィルターを２回洗浄して装置から外し、もう１度 洗浄する。フィルターを素早く２回脱イオン水で洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質 （キーケガ ールド・アンド・ペリー・ラボラトリース・インコーポレイテッド（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc．），メリーランド州、ガイザースバーグ）を正 確に５分間で添加して、結合アルカリホフファターゼを検出する。 全動物からの免疫前の血清ならびに５日目の血清はビイ・バーグドルフェリＢ ３１株を用いたウェスタンブロットにおいて陰性であった。１２日目に、全マウ スは種々のボレリアタンパク質に対する血清中に見られる抗体を産生しはじめた 。 さらに、同系交配種のマウスは、これらの抗体と分別的に反応する。 例えば、Ｂ１０動物はすべて、８０ｋＤより若干上の分子量で移動するタンパ ク質、特に前記ドーワード（Dorward）らにより報告されるＰ８３に対して強い 応答を示す。この研究における動物のバランスは、感染のこの段階でこのタンパ ク質に対して応答しない。 Ｐ１７抗原に対する応答はいろいろあり［ウィルスク（Wilske）ら、サード・ インターナショナル・シンポジウム・オブ・ライム・ボレリオシス（Third Inte rn’l Symposium of Lyme Borreliosis），スウェーデン（１９９０）記載］、 Ｂ１０コンジェニックマウス系のみが１２日にこのタンパク質に対して応答する 。Ｐ１２抗原もこれらの著者により記載されているが、これはＢＡＬＢ／ｃ以外 のすべての種において弱い応答を誘起する。さらに、２０〜２２ｋＤおよび５５ 〜６０ｋＤの分子量範囲のタンパク質のグループに対して種々の応答が見られる 。抗体応答は感染のこの初期の段階においてこれらの抗原に対しては非常に弱い 。実施例１２−３９ｋＤ分子量範囲のタンパク質により誘起される初期応答 ３９ｋＤ領域中には少なくとも２つのバンドがあるが、フラジェリンに対する ＭＡｂはＰ３９ダブレットの少し上に移動するバンドを検出するので４１ｋＤフ ラジェリンタンパク質に関して反応性であると考えられる。１４および１８ｋＤ 分子量で移動する他の２種のタンパク質も感染のこの初期において種々の応答を 誘起する。最後に、すべてのマウスにより４５ｋＤマーカー付近に移動するタン パク質に対して著しい応答がある。前記実施例５において、このタンパク質はハ ムスターにおける自然の感染において記載され、Ｐ４３抗原と表わされる。 感染のこの段階において、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢまたはフラジェリンに対する応 答は、培養したボレリア・バーグドルフェリの針接種により攻撃した場合これら または他のマウス種から初期応答を誘起するすべてのタンパク質で検出されなか った［ユー・イー・シャイブル（U．E．Schaible）ら、ヨーロピアン・ジャーナ ル・オブ・イムノロジー（Eur．J．Immunol．），２１：２３９７−２４０５（ １９９１）、イー・ファークリッヒ（E．Filrig）ら、インフェクション・アン ド・イミュニティー（Infection and Immunity），５３７１３−７１４（１９８ ６）］。３０ｋＤ（ＯｓｐＡ付近）および３２ｋＤ（ＯｓｐＢ）でバンドと臨界 的反応性があるが、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢが際だったバンドである場合この結 合性はアクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色またはニトロセルロースフィ ルターのポンソーＳ染色に関して化学量論的でない。これはＯｓｐＡおよびＯｓ ｐＢと一致して移動する異なるタンパク質に対する抗体応答と理解される。さら に、これらの血清はイー・コリにおいて発現されたクローン化遺伝子生成物から の精製した全脂肪化ＯｓｐＡを用いてウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによ り分析され、この研究において用いたどのマウスの血清においても抗ＯｓｐＡ活 性は検出されない。 感染後１９日までに、Ｂ３１低継代のウェスタンブロットに関して検出される 様に多くの細菌抗原に対する抗体応答が強化された。１４、１７、１８、２１お よび２２ｋＤで移動する５つのバンドのセットは、１８ｋＤバンドに応答しない Ｂ１０マウスを除いて、５種のマウス全部からの血清により検出される。Ｂ１０ ．ＢＲマウスからの血清は精製したＯｓｐＡ直下に移動する３０ｋＤバンドを検 出せず、ＯｓｐＢと一致して移動するタンパク質のグループに対して種々の応答 がある。Ｐ３９バンドに応答するすべてのマウスおよびＢ１０．ＢＲ＃５のマウ スは、フラジェリン（４１ｋＤ）に対して特異的な抗体を有する。全マウスはＰ ４３に対する応答を維持し、バンドは約５２から５５ｋＤに移動する。Ｂ１０． ＢＲ、およびより程度の低いＢ１０．Ｄ２は、若干高いバンドを５８ｋＤにおい て検出し、１２日目に、Ｂ１０マウスだけが８３ｋＤバンドに応答する。 感染後１９日に採取した同じ血清をＢ３１高継代をブロットするのに用いた場 合、非常に異なるパターンが見られる。低分子量範囲においては、異系交配マウ スだけがＰ２２バンドに応答し、ＢＡＬＢ／ｃを除いたマウスはすべてＰ１７に 応答する。３０ｋＤにおけるバンドに対する同様な反応性は、Ｂ１０．ＢＲを除 いてすべての応答するマウスについて観察される。３１および３９ｋＤ間には反 応性は全く検出されず、すべてのマウスはＰ３９バンドに対して応答する。Ｂ３ １低継代ウェスタンブロットにおいては、Ｐ４１（フラジェリン）、Ｐ４３、ま たはこの分子量範囲の他のバンドに関しては反応性は見られない。５２〜５５ｋ Ｄでのバンドに対する応答は検出可能であるが、このブロットにおいてはｐ８３ に対するＢ１０応答は見られらない。 感染後２６日に採取された血清について行ったイムノブロットを、多くのボレ リア抗原に対する応答の強度の増加を示すように続けた。Ｂ１０動物によるＰ１ ８に対する弱い応答以外は、１４〜２４ｋＤ分子量範囲において５つのバンドに 対して強い応答がすべてのマウスにおいて観察される。約２８ｋＤでのタンパク 質に対して反応性があるが、これはＢ１０．ＢＲ動物からの血清においてのみ検 出され、ＯｓｐＡ（３０ｋＤ）と同じ分子量領域においては不定のおよび最小の 抗原に対する応答がある。 ＯｓｐＢを含む３２〜３４ｋＤの範囲のタンパク質群に対する応答の変異性は 、２６日目で維持されていた。例えば、異系交配およびＢ１０．ＢＲマウスは＃ ６のマウスを除いてＢ１０マウスと同様、この領域において複数のバンドに対す る抗体応答を有する。Ｂ１０．Ｄ２およびＢＡＬＢ／ｃマウス（両方ともＨ−２d ）は、単一のバンドに対して応答するＢＡＬＢ／ｃマウス＃３を除いてはこれ らのタンパク質に応答しない。これらのタンパク質がＨ−２dＭＨＣタンパク質 により有効に提示されないことは明らかである。 すべての動物は、Ｐ３９バンドに関して特異的な抗体を形成し、２６日までに すべてのＢ１０．ＢＲ動物はＰ４１フラジェリンに応答する。初期の時点で観察 されるように、すべての動物はＰ４３に対して応答する。５０および５２ｋＤに おける１対のバンドから、これらの血清を用いて最小のシグナルが得られ、すべ ての動物は、熱ショックタンパク質を含む５５〜６５ｋＤ分子量範囲における一 連のタンパク質に対する抗体を有する。感染のこの時点で、Ｂ１０動物のみがＰ ８３に対して応答する。 この研究に関する最終血清を感染後６０日に採取し、これらの血清およびＢ３ １低継代を抗原として用いたイムノブロットを通常の技術により行う。感染後の この時点で、すべてのこれらの動物の血清は既に記載したように低い分子量範囲 において５個のタンパク質全部に関して特異的な有効な抗体を有する。この感染 の後期において、すべての動物は約２８ｋＤに移動するタンパク質に応答する。 ３０ｋＤでの応答はこの研究において試験した種間で一定しない状態が続く。 ＯｓｐＢの領域に移動するタンパク質に対する応答は初期においてと同様、Ｂ １０マウス＃６、およびＢ１０．Ｄ２マウス＃７および８を除いてより著しく、 種間で一致したものになる。 再び、すべての動物はＰ３９バンドに対して応答し、動物はＰ４１フラジェリ ンに応答するように見える。感染中観察されるように、すべての動物はＰ４３に 対して強い応答を示す。この感染の後期において、すべての動物は約５０および ５２ｋＤでの１対のバンドに応答するように見えるが、Ｂ１０．ＢＲおよびＢ１ ０．Ｄ２応答は非常に弱い。 これらのマウスの５５〜６５ｋＤ分子量領域におけるバンドのトリプレットに 対する応答におけるシグナルの強度は一定でない。感染後６０日までに、Ｂ１０ ．Ｄ２およびＢＡＬＢ／ｃ動物＃２および＃４（すべてＨ−２dハプロタイプ） 以外は、全種はｐ８３に対する抗体を産生する。 これらの血清を抗原としてＢ３１株高継代をブロットするのに用いた場合、ブ ロッティングパターンは非常に異なる。ゲルの低分子量領域で検出される唯一の 抗原はＰ１７である。Ｐ２２およびＰ２４に対する最小応答は異系交配、ＢＡＬ Ｂ／ｃおよびＢ１０．Ｄ２動物においてみられ、Ｂ１０およびＢ１０．ＢＲは基 本的に陰性である。Ｂ３１低継代およびＢ３１高継代ゲルにおいてＰ１７と結合 している抗体は類似しているので、これらの血清を用いた他のタンパク質の検出 における差異は、２種のＢ３１誘導体により発現された細菌タンパク質における 質的差異を示す。恐らくは、培地中多くの継代の後、これらの抗原はスピロヘー タにより発現されなくなり、非常に低いレベルで発現されるかまたはその抗原性 構 造が修飾されて、これらの血清抗体は結合できなくなる。 これらの血清はまたＰ２８抗原を検出できず、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ領域に おいて種々の結合を示す。すべての血清は再びＰ３９バンドを検出するが、Ｐ４ １フラジェリンは検出しない。Ｐ４３領域または５２〜５４ｋＤ領域において反 応性は見られず、同様の結合パターンは５５〜６５ｋＤ領域においてみられる。 これらの血清のＰ８３抗原に結合する能力は、低継代ブロットにおけるのと全く 同一である。一般に、Ｂ３１低継代および高継代に関するイムノブロットを同量 のタンパク抗原を用いて比較した場合、マダニに剌されることによりビイ・バー グドルフェリで感染したマウスから１９および６０日に採取した血清は低継代物 質においてより多くの抗原を検出する。両リゼイト調製物において検出される抗 原の場合、低継代ブロットにおけるシグナルは、前記のとおり、６０日血清に関 するブロットのＰ１７を除いて高継代誘導体に対して検出される同じ反応性より も強い。 これはすべて、ボレリア・バーグドルフェリの長期培養が、ネズミ抗体により 検出できる細菌抗原の大部分の発現において著しい変化を生じさせることを示す 。実施例１３−ボレリア・バーグドルフェリの異種株に対する応答 ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株の低継代分離菌に結合する５種のマウスか らの血清をウェスタンブロット分析に付した。この分析の結果は、これらの血清 が異なるビイ・バーグドルフェリ株から同じ抗原を検出できることを示す。１２ 日に採取された血清は、５値の低分子量バンドに対する応答を示さず、Ｂ３１低 継代物質の場合と類似した３０ｋＤでのバンドに対する応答を示す。すべてのマ ウスはＰ３９バンドに応答し、Ｐ４３の検出は非常に限界的である。またＰ５８ バンドにもよく応答する。これらの血清を用いたＢ３１株の低継代分離菌につい てのブロットと比較して、ＪＤ−１から検出されるバンドは少なく、検出される バンドは弱い。 感染後１９日からの血清は、Ｐ１７およびＰ１８に対する一定しない反応性が 検出される添加でのみ、１２日の血清により検出されるバンドに対して少し強い シグナルを示す。２６日血清を用いると、Ｂ１０以外のすべての動物によるＰ１ ７に対する反応性は明らかである。Ｐ１８に対する応答はこれらのマウス種にわ たり一様であるが、Ｂ１０動物は限界的な応答を有し、Ｂ１０．ＢＲ＃６からの 血清はこの抗原を検出しない。ＯｓｐＡの直下に移動する抗原の検出は一定でな く、すべての血清はＰ３９バンドを検出する。これらの血清はすべてＰ４３に対 して良好なシグナルを与え、５８〜６２分子量抗原に対する反応性はより明らか である。抗原として用いたＢ３１株の場合、Ｂ１０動物からの血清のみがＰ８３ を検出する。 ＪＤ−１株の低継代分離菌に対してブロットした感染後６０日の血清は、Ｐ１ ７およびＰ１８バンドに関して一致した交差反応性を示すが、Ｐ１４、Ｐ２２お よびＰ２４に対するこのような結合は検出できない。２８および３５ｋＤ間に移 動するバンドのすべてについて著しい変異性があり、すべての血清はＰ３９ダブ レットならびにＰ４３抗原を検出する。５８ｋＤでのバンドに対する反応性は、 すべての血清に関して一致しており、その上のバンドは検出が一定でない。特に 、Ｐ８３はすべてのＢ１０およびＢ１０．Ｄ２により検出され、ＢＡＬＢ／ｃお よび異系交配血清によっては一定に検出されず、Ｂ１０．Ｄ２によっては全く検 出されない。抗原として高継代Ｂ３１株を用いた場合、これらのブロットはすべ て、等量のタンパク質抗原に関して同じ血清サンプルに関して行っても、弱いシ グナルを示す。 ＪＤ−１の高継代分離菌に関する感染後６０日に採取した血清に関して検出さ れる著しい反応性は抗Ｐ３９応答だけである。すべての血清により５８ｋＤのバ ンドが限界的に検出され、ＢＡＬＢ／ｃおよび異系交配マウスだけがＰ１８を検 出する。Ｐ８３バンドに関してＢ１０動物からの血清抗体の結合はほとんど検出 できない。この著しい結果は、異なる種ＪＤ−１の高継代分離菌が、この研究に おいて用いた感染性物質、感染マダニにおけるＢ３１株といかに異なるかを示す ものである。実施例１４−抗原捕捉ＥＬＩＳＡ 抗原捕捉ＥＬＩＳＡをプレート、両ポリスチレン（イムロンII（Immulon II） およびポリ塩化ビニルプレート（ダイナテック社（Dynatech），コスター（Cost ar）、カタログ番号２５９７および２７８７）を包含する試験にて異なる多くの パラメータを変えることにより評価する。試験した遮断試薬は、ＢＳＡ（１％、 １．５％、２．５％、５％）、カゼイン（０．５％、１％）、０．５％沸騰カゼ インおよび０．０５％ツィーン２０を含む０．５％沸騰カゼイン；脱脂粉乳（２ ．５％、５％）（０．０５％ツィーン２０を含むかまたは含まない）を包含する 。 抗原捕捉について試験したモノクローナル抗体はＯｓｐＡ（１８４．１および Ｈ５３３２）、ＯｓｐＢ［Ｈ６８３１］、４１ｋｄフラジェリン（Ｈ９７２４） 、ｐ６０分子（１４９．１）に対する抗体を包含する。これらの抗体は、シンビ コム（Symbicom）（スウェーデン、ウメア）から商業上入手可能である。 ウサギにおいて形成されるビイ・バーグドルフェリおよびマウスにおいておこ る超免疫腹水症に対するポリクローナル抗血清を、製造業者の指示（アメルシャ ム（Amersham））にしたがってビオチン標識化し、ホースラディッシュペルオキ シダーゼについての基質としてＡＢＴＳおよびＴＭＢおよびアルカリホスファタ ーゼについての基質としてシグマ（Sigma）１０４−１０５のストレプタビジン −ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体およびストレプタビジン−アルカ リホスファターゼ接合体と共にシグナル認識に関して評価する。 最適の抗原捕捉ＥＬＩＳＡに関する方法は以下のとおりである。ポリ塩化ビニ ルプレート（コスター（Costar））のウェルを５０μｇ／ｍｌのタンパク質Ａ精 製ＭＡｂ Ｈ５３３２で、燐酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍ ｌの濃度でコートする。一夜４℃で培養した後、ウェルを３回０．０５％ツィー ン２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで洗浄し、２００μｌの０．０５％ツィー ン２０を含有するＰＢＳ中２．５％脱脂粉乳を各ウェルに室温で１時間添加する 。 この検定において試験するボレリアの実験室株をＢＳＫ ＩＩ中で成育させ、 計数の前にＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ− ＰＢＳ）の５倍添加の前に試験するボレリアを０．２５％ＰＢＳ中ノニデットＰ −４０（ＮＰ４０−ＰＢＳ）中で１０分間希釈する。試験するイクソデス・ダミ ニ若虫を試験管にあう形状で、電気ドリルにとりつけた乳棒を用いてマイクロチ ューブ（バイオラド（Biorad））中２０μｌのＮＰ４０−ＰＢＳ中で均質化する 。マイクロチューブに滅菌砂を少し添加することにより均質化を促進する。次に １３０μｌのＢＳＡ−ＰＢＳを若虫抽出物に添加する。成熟アイ・ダミニを５０ μｌの前記ＮＰ４０−ＰＢＳ中で均質化し、２５０μｌのＢＳＡ−ＰＢＳ中を添 加する。 遮断工程の後、ウェルを吸引により空にし、５０μｌの試験するボレリアまた はマダニ抽出物を各ウェルに室温（ＲＴ）で２時間添加する。ウェルを次に３回 ＰＢＳＴで洗浄し、２．５μｇ／ｍＬの濃度の５０μｌのビオチン標識ポリクロ ーナルウサギ血清を各ウェルにＲＴで１時間添加する。１時間ＲＴで培養した後 、ＢＳＡ−ＰＢＳ中１：３０００希釈度のストレプタビジン−ホースラディッシ ュペルオキシダーゼ（アメルシャム）を各ウェルに添加する。ＲＴで１時間培養 した後、ウェルを３回前記のように洗浄し、１００μｌのＡＢＴＳ（キーケガー ルド・アンド・ペリー・ラブス（Kirkegaard and Perry Labs）を添加する。１ 時間培養した後，プレートを４０５ｎｍで読み取る。 ＥＬＩＳＡの特異性を２０株のボレリア・バーグドルフェリに対して評価する 。これらの株は、Ｂ３１、ＷＣ−Ｈ１、ＮＹ１４、ＮＹ−９４４、ＪＤ１、ＨＢ １９、ＧＡ−７４７、ＰＡ６０６、ＰＡ６２２、ＰＡ６２４、ＷＩ−２０６、Ｗ Ｉ−２１０、ＣＡ４、ＣＡ５、ＣＡ−８０８、ＣＡ１２３８、ＵＫ８１４、ＩＰ ９０、ＣＨ２２２３、ＣＨ２２４６である。さらに、ビイ・ハームシー、ビイ・ タリカテ、ビイ・コリアセアエ、ビイ・パーケリを評価した。加えて、未感染ア イ・ダミニ、アイ・スカプラリス、アイ・パシフィクス、アイ・クーケイ、アイ ・キンギまたはアンビロマ・アメリカナムをこの検定において試験する。 検定の感度を最大濃度５，０００／ウェルで開始するボレリア・エス・ピイ・ ピイ（Borrelia spp）の標準曲線に対して評価する。 初め、マサチューセッツ［ＣＤＣ，コロラド州、フォート・コリンス］から単 離される実験室コロニー２３２４からのアイ・ダミニをビイ・バーグドルフェリ のＢ３１、ＪＤ１またはＨＦＡ１株で感染したかまたは感染していない若虫およ び成虫で試験した。肥大したおよび平坦な若虫を−２０℃で７０％エタノール中 にて貯蔵した後、均質化し、乾燥するかまたは生かしておく。 抗原捕捉ＥＬＩＳＡは試験したビイ・バーグドルフェリの全ノースアメリカン 株を認識することが見いだされた。唯一の例外はカリフォルニア株（ＣＡ１２３ ８）で、これは実験室における５２代の継代である。クマシーブルー染色からこ の分離菌がもはやＯｓｐＡを産生しないことが判明した。さらに、ＷＩ−２０６ は減少したシグナルを与える。しかし、ＥＬＩＳＡはそれでも感染したアイ・ダ ミニを検出するのに十分感受性である。検定は、イギリス、ロシアおよび中国の 試験した２種の分離菌のうちの１種を検出できなかった。検定は他の試験したボ レリア種を認識しなかった。検定の感度は、約５０〜２００スピロヘータである 。 ＥＬＩＳＡは第３のマダニ抽出物を用いて未感染アイ・ダミニ（幼虫、若虫ま たは成虫）からビイ・バーグドルフェリ感染したものを区別でき、これにより確 認試験用の適当な物質が得られる。この検定は、アイ・ダミニ、アイ・スカプラ リス、アイ・パシフィクス、アイ・キンギまたはアンビロマ・アメリカナムのマ ダニ抗原を認識しない。感染したアイ・ダミニ若虫は、１０００および１０００ ０の間のビイ・バーグドルフェリスピロヘータを有する。生マダニ以外に、この 検定は、凍結し、室温で乾燥し、または７０％エタノール中で貯蔵したマダニに おけるビイ・バーグドルフェリも検出できる。実施例１５−治療および再攻撃実験 ビイ・バーグドルフェリ抗原を用いるワクチン試験の予備試験として、予め一 定種のボレリア・バーグドルフェリで感染することにより、同種のボレリアに２ 回目に暴露された場合に防御されるかどうかを調べた。この「治療および再攻撃 」実験は同じバッチのＢ３１感染イクソデス・ダミニ若虫マダニを感染をを伝播 するために用いて行った。 この予備実験に関して、４種の異系交配マウス、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０、およ びＣ３Ｈを用いた。これらの動物にそれぞれ１０匹までのＢ３１感染マダニを置 くことにより感染させる。マダニ侵襲の３週間後、耳生検を採取し、組織をスピ ロヘータに関してＢＳＫ ＩＩ培地中で培養することによりマウスを感染につい て試験する。１週間後、すべてのマウスは培養によりボレリアに関して陽性であ り、対応するマウスにおいて全身性感染が見られる。感染したマウスを次に飲料 水中テトラサイクリン１ｍｇ／ｍＬで２週間処置する。抗生物質は光感受性であ るので、テトラサイクリン水は１週間につき３回交換する。 抗生物質処置の後、第２の耳生検を採取して、マウスが培養陰性であり、感染 が治癒したことを証明した。これらのマウスを次に１０匹のＢ３１感染マダニを 侵襲させることにより再攻撃する。マダニが吸血して肥大したのち、これを集め 、解剖し、ポリクローナル抗血清を用いて免疫蛍光法によりスピロヘータの存在 について試験する。 マウスを２回目のマダニ攻撃の３週間後に感染について調べる。これは前記と 同様、耳生検を採取し、組織をＢＳＫ ＩＩ培地中で培養することにより行う。 この実験の結果を以下の第Ｖ表に示す。その結果は、たとえマウスが同一種のボ レリアで感染していても、再感染は同様であることを示す。さらには、再感染し なかったマウスは、恐らく免疫動物を吸血した結果、吸血するマダニの４０％以 上で感染が除去されていることを示す。この結論は、同じ年令のナイーブな対照 マウスにて供給されたマダニにおいては有意な除去が観察されず、これらの動物 はすべて感染したという観察に基づくものである。 実施例１６−モノクローナル抗体 ボレリア・バーグドルフェリの抗原に対するモノクローナル抗体のＢ細胞融合 のＢ芽細胞源は、感染したマダニに接触することによりビイ・バーグドルフェリ に感染したマウス由来の脾臓細胞である。これらのマウスは感染し、テトラサイ クリンの投与により治癒し（実施例１５）、もう１度感染マダニに接触させる。 脾臓細胞を２回目の接触の５〜７日後に収穫する（マダニが落ちた後）。 ２回のＢ細胞融合を行い、約１０００個の独立Ｂ細胞ハイブリドーマをスクリ ーンする。最初の融合はＢ細胞リンパ腫と融合したＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｐ３Ｘ ６３Ａｇ８からの免疫Ｂ細胞を用いる。この融合は、ＢＡＬＢ／ｃ抗Ｂ３１に関 してＢＢ３１と命名する。６個のモノクローナル抗体をこの融合から単離する２ 回目の融合は同じ方法によりＣ５７Ｂ１／１０（Ｂ１０）マウスをＢ細胞免疫源 として用いて行う。この融合をＢ１０抗Ｂ３１に関してＢ１０Ｂ３１と表わす。 この融合からさらに５個のモノクローナル抗体が単離される。これらの抗体およ びその特異性の要約を第VI表に示す。 第VI表 モノクローナル抗体 検出バンドの分子量 ＢＢ３１−４２．１ ７５ｋＤ ＢＢ３１−１０９．１ ３０ｋＤ ＢＢ３１−７７．９ ３５ｋＤ ＢＢ３１−２９０．１ ２２ｋＤ ＢＢ３１−２９２．９ １８ｋＤ ＢＢ３１−４２６．１１ ５２および５５ｋＤ Ｂ１０Ｂ３１−６４．４ ３６ｋＤ Ｂ１０Ｂ３１−１０３．１ ５５ｋＤ Ｂ１０Ｂ３１−１５８．６ ７０ｋＤ Ｂ１０Ｂ３１−２２１．１ １７ｋＤ 本発明の種々の修正および変更も前記明細書に含まれ、当業者には自明である と考えられる。本発明の組成物および方法に対するそのような修正および変更も 以下の特許請求の範囲に含まれるものと考えられる。Detailed Description of the Invention                   Compositions useful for the diagnosis and prevention of Lyme diseaseCross-reference of related applications   This application is related to US patent application Ser. No. 07/88 filed May 26, 1992. No. 9,015, a continuation-in-part application, filed on September 14, 1992, pending This is a continuation-in-part application of United States Patent Application No. 944,464.Field of the invention   The present invention is generally useful in the diagnosis, treatment and prevention of Lyme borreliosis. Pharmaceutical and diagnostic compositions. More specifically, the present invention relates to a Borrelia bar. Derived from Bordelia burgdoferi and differentiated in tick vector , Isolated natural and recombinant proteins, polypeptides and macromolecular antigens About.Background of the Invention   The bacterium Borrelia burg, the causative agent of Lyme borrelia disease, or Lyme disease Dorfelia (Borrelia burgdoferi) is found in various ticks carrying spirochete Propagated by being stabbed. Hosts of infection are white-footed mice, Peromiscus ro It is often an ecopath (Peromyscus leucopus), and this disease is caused by dogs and cats. And can be transmitted to many mammals, including humans [J. G. Donahue (J ． G. Donahue) et al., American Journal of Tropical Medicine. And Hygene (Am. J. Trop. Med. Hyg.), 36: 92-96 (1987). ); Journal of Clini, RT Green, et al. Cal Microbiology (J. Clin. Micro.), 26: 648-653 (19) 88)]. B. Bergdorferi B31 strain is Bolerosi in the United States It is considered to be involved in about 90% of the known isolates of Borrelosis. Human Oh Diagnosis of Lyme disease in animals and animals has no clear serology leading to rapid and accurate testing. However, vaccination is compromised by the lack of suitable bacterial antigens that can elicit immune responses. It was cooperative.   Borrelia burgdorferi culture preparations are available in ELISA and Western blot. It has been used to prepare whole cell sonicates for lot analysis but The results were only good [M. Karlsson et al., Euro J. E-J. Clin. Micr obiol. Infect. Dis. ), 8: 871-877 (1990); S W. Archives of Internal Medicine (S.W. Luger) et al. rch. Intern. Med. ), 15: 761-763 (1990), I Olson ( I. Olsson) et al., Acta. Derm. Venereol. ) (Stockholm), 71: 127-133 (1991)]. Outer surface protein Quality A and B (OspA and OspB), flagellin, and their putative molecules It contains other proteins called P21, P39, P66 and P83 according to their amount. Many bacterial antigens have been identified that are more useful in serodiagnosis [A. G. Barbour et al., Infection and Immunity -(Infect.Immun.), 45: 94-100 (1984); W Jay ・ W.J.Simpson et al., Journal of Clinical Microva Iology (J. Clin. Microbiol.), 28; 1329-1337 (1990). K. Hansen, Infect Jay Clin Microbye All (Infect. J. Clin. Microbiol.), 26: 338-346 (1988). B. Wilske et al., Zentral Bacterial Paradite Nukudo Infection Shukuru Hig Aby Tea 1 Olig Reihe A. (Zentral. Basketriol. Parasitenkd. Infectionshkr. Hyg. Abt. 10rig. Reihe. A. ), 263: 92-102 (1986); Dee. W ・ D.W.Dorward et al., Journal of Clinical Microva Iology (J. Clin. Microbiol.), 29: 1162-1170 (1991). ].   The diagnosis of Borrelia burgdorferi proteins and polypeptides There are a number of disclosures suggesting abstinence or use as a drug. These documents are dominant In vitro culture of B. burgdorferi proteins and polypeptides , Mainly Barbour-Stoenner-Kelley (BSK) ) Produced in modified medium, sodium dodecyl sulfate-polyacry Based on its molecular weight, using the lamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique It identifies polypeptides and proteins. For example, published NT IS United States Patent Application No. 485,551 has molecular weights of 11, 13, 22 , 13, 34 and 83 kDa with reference to the B. Burgdorferi protein There is. Published European Patent Application No. 465,204 (January 8, 1992) (Publication) refers to antigens with a molecular weight range of 25 to 93 kDa. Country Minor patent application No. PCT / US91 / 01500 (published September 19, 1991) Mention is made of the B. burgdorferi antigen with litter weights of 28 and 39 kDa. Country Minor patent application No. PCT / EP90 / 02282 (published on July 11, 1991) Bie Bergdorferi anticoagulants with offspring of 17, 22, 31, 41 and 100 kDa It refers to Hara. International Patent Application No. PCT / DK89 / 00248 (1990 Published on May 3) is a Bj Bergdorferi anti-antibody with a molecular weight range of 20 to 85 kDa. It refers to Hara.   PCT Patent Application No. WO92 / 00055 (published January 9, 1992) is Os pA and OspB polypeptides, fusion proteins and B. Burgdorf Disclosed are derivatives of strains N40 and 25015. This disclosure has been treated Countering Lyme disease caused by Borrelia burgdferri infection in a mammalian host To a DNA sequence or polypeptide that elicits an effective immune response to protect against Are mentioned. In fact, the polypeptide can Immunized with a polypeptide derived from A. burgdorferi culture and immunized animals Borrelia burgdorferi needle-inoculated and inoculated with Borrelia burgdorferi Identified by selecting a polypeptide that protects animals immunized against It is only done.   The B. burgdorferi antigens described in the prior art are immunological criteria, eg For example, it has hardly been characterized by an immune response assay. Serum of these bacterial antigens Most published data analyzing the usefulness of Lyme in clinical studies Cultured spirochete or purified protein for assessing immune responsiveness Using a quality needle inoculation system [UE Schaible ) Et al., European Janal of Immunology (Eur.J.Immunol.), 21: 2397-2405 (1991); S. W. Bartled (S.W. Barthold) et al., American Journal of Pathology. ), 139: 263-273 (1991)]. To date, B. Bergdorfe When the bacterial antigen is transmitted to the animal by being treated by ticks and by needle inoculation Whether there is a difference in the route of infection or the characteristics of the immune response compared to the case of an experimental infection No observations have been made as to whether or not. J.A. Nelson , Journal of Infectious Dishes (J. Infect. Dis.), 161: 1034-1035 (1990); W. F. Shuvac (WF) ． Schubach) et al., Journal of Clinical Microbiology (J. Cli n. Microbiol.), 59: 1911-1915 (1991); SW. Barthold et al., Journal of Infectious Day Seeds, 162: 133-138 (1990); Jay Lindenmeier (J ． Lindenmayer) et al., Journal of Clinical Microbiology, 2 8: 92-96 (1990); and You E. Sible et al., Proceedy. Kings of National Academy. Of Sciences (Proc. Natl. Ac ad. Sci. ), 87: 3768-3772 (1990)].   Accurate and early detection of Lyme disease, and animals by B. Bergdorferi There is a need for methods and compositions for the treatment and prevention of natural infections of.Summary of the Invention   In one aspect, the invention provides an increase of B. burgdorferi in a tick vector. Provide a B. burgdorferi antigen isolate that is regulated and differentiated by breeding . The novel antigens of the invention are listed in Table I below.   Some of these antigens were specific to the B. burgdorferi B31 strain. And major histocompatibility complex (MHC) are non-limiting. These anti Another of the sources is characterized by being MHC restricted. These anti Serum produced against Hara (B31MHC non-restricted and B31MHC restricted) May further react with or lack reactivity with B. burgdorferi JD-1 strain. Characterized; the antigen itself (B31MHC unrestricted and B31MHC restricted) Furthermore, it may be homologous or heterologous with the B. burgdorferi JD-1 strain antigen. Features. The most preferred antigens of the present invention are bispecific in various animal haplotypes. ・ Because of the ability to induce interstitial immunity against Bergdorferi, B31MHC is not controlled. It is characterized by being limited, JD-1 cross-reactive and JD-1 unrestricted. other Antigens are also useful in vaccine compositions and diagnostics.   In another aspect, the invention optionally comprises parasitically infecting an infected host animal. Bai ba obtained from microorganisms directly isolated from ticks (blood-sucking) ticks Providing a doldol ferri antigen. If desired, B. Bergdorferi will grow. Keep the toxicity and antigenicity until the antigen is isolated by subculturing it a minimum number of times in the ground May be. The preferred minimum number of passages in vitro is between 1 and 6. It   In yet another aspect, the invention provides a low-passage medium for tick vectors or microorganisms. B. Bergdorf isolated from F. DNA isolated from B. Burgdorf Provides a ferri antigen. Yet another aspect is infection with B. burgdorferi B. berg prepared from PCR gene bank from tick or low passage medium Provides the dolferi antigen.   In another aspect, the present invention provides anti-antibody against the novel B. burgdorferi of the present invention. Provide the body. Such antibodies may be monoclonal, polyclonal or It may be a substitute.   In yet another aspect, the invention provides at least one novel antigen of the invention or Provides a diagnostic, therapeutic and vaccine composition comprising an antibody.   In yet another aspect, the invention provides diagnostics using the reagents and compositions of the invention. Assay and kits, treatments for Lyme disease, and prevention methods for Lyme disease It   Other aspects and advantages of the invention are described in detail below, which are preferred embodiments thereof. Described in.Brief description of the drawings   Fig. 1 shows whole-cell sonicated products, purified flagella, and oocytes in tick-infected hamsters. And recombinant OspA. Antibody response to whole-cell sonicated products (●), purified flagella (■) or recombinant OspA (▲) is measured by ELISA.   Geometric mean (GMT) logTenReport the ELISA titer (n = 6). In every respect The standard error of the mean value for this was ≦ 0.1.   Figure 2 shows hamster antigens inoculated with various concentrations of B. burgdorferi. 3 shows a dose response analysis. 2 weeks after infection (P.I.) of hamsters (■) and Blood was collected at 4 weeks (●). Antibody response to whole-cell sonicated (solid line) or recombinant EspA (dotted line) was measured by ELISA. Of the geometric mean (GMT) logTenReport ELISA titer (n = 2 at 14 days, n = 4 or 5 at 28 days) .Detailed description of the invention   antigen   The present invention is regulated by the transmission of B. burgdorferi through the tick vector And / or identify a novel isolated Borrelia burgdorferi that is differentiated To do. As used herein, the tick vector is capable of mediating B. burgdorferi. It means an arthropod of the insect family having. The tick vector is optimally of the tick genus, Ixodes Complex, I. dammini, I. scapularis pularus), I. pacificus or I. ricinus ) Or a related species or genus capable of transmitting a microorganism that causes Lyme disease Is.   Growth of B. burgdorferi in growth medium in vitro is associated with Lyme disease. The present invention provides a genetically defined MCH group that results in a continuous loss of toxicity. Using responses in protypic mice, tick-producing B. burgdorferi The differences between the antigens produced by original and B. burgdorferi culture growth Identified cleanly. The best indicator of differentiation and / or regulation is tissue or cell Of the antigen as measured by the antibody specificity produced when inoculated into humans or animals Appearance or loss. Antigens produced and mediated by ticks are in growth medium , The B. burgdorferi antigen of the prior art, which was passaged several times in vitro.   In addition, Bj Burgold, the pathogen of Lyme disease in humans and animals Feri thought to have a common molecular group that causes clinical symptoms associated with Lyme disease Can be In vitro passage of B. burgdorferi loses toxicity, so Proteins or other molecules associated with offspring are the only ones for ticks to spread the disease Therefore, it is considered to be provided by ticks. We have the antigen By determining whether is restricted to major histocompatibility complex (MHC) Antigens useful in Chin have been identified.   MHC is a group of proteins (receptors) on the surface of any animal or human cell. It is). PJ Bjorkman et al., Nature (Nature), 329: 506-518 (1987). Typically, Proteins of any animal or human cell degenerate as natural events progress Or renew. In order to prevent self-reactivity, cells from the immune surveillance system Monitor all peptides removed. Typically, it is released from the cell Or internalized, decomposed into amino acids and returned to the pool of intermediate metabolites. Are indicated by MHC. Animals hate reacting with their own proteins Thus, animal "self" proteins are limited to response. Protein is self-protein If so, the animal's immune system does not respond. The immune system is a foreign protein Is an antigen, MHC does not limit the response.   Certain antigens of the invention are not restricted to any MHC haplotype. " Not being limited to MHC "means that the antigen of the present invention can be used in humans and animals. Be able to elicit an immune response against Lyme disease regardless of its immunogenetic background (Human or animal MHC does not limit the immune response). Antigens of the invention Is a serological response that occurs in mice early after invading infected ticks They also show virulence (co-activity) associated with virulent B. burgdorferi infection. Common) component.   Certain preferred antigens of the present invention are found in mice on three different MHC backgrounds. It has been shown to elicit an immune response over time. Preferably, the antigen is One or more toxic agents that can induce clinical symptomatology in humans and / or animals with Mu's disease It is characterized by cross-reacting with Lee Bergdorferi strain. In this specification The term "cross-reactive" when referring to the term was raised against an antigen of some species It means that the serum has the ability to react with the antigens of other species, and the antigens of both species are homologous. Serum produced against an antigen from one species that does not have the ability to react with another species of antigen is Shows that the antigen is atypical.   B. Bergdorferi's antigen is related to its molecular weight (kilodalton) Identified. For example, the B. burgdorferi antigen having a molecular weight of about 17 kd is P1. An antigen having a molecular weight of about 22 kd is identified as P22. In Table I The P41 (fla) used is a flagella-related antigen having a molecular weight of 41 kd. Table I Other antigens of the flagella are associated with flagella, outer surface protein (Osp) A, or OspB. Not something.   B. Bergdorferi low passage antigen of the invention (ie, less than 6 passages in culture Antibodies obtained from Borrelia microorganisms are characterized in the table below and below. Identified with respect to the examples shown. Table I summarizes the data of Examples 11-13. The Western blot analysis in the example shows that B31 and JD -Ixodes infected with B31 isolates of spirochete on protein from -1 strain ・ Mice infected with B. burgdorferi B31 strain by exposure to Damini Was performed using sera from a panel of inbred strains of.   Table I shows that certain antigens are non-restricted to B31MHC, Is characterized by being able to elicit an immune response in all haplotypes. These B31 MHC non-restricted antigens are also (a) JD-1 cross-reactive, JD-1 non-limiting; (b) JD-1 cross-reactive, JD-1 MHC controlled Limited; or (c) characterized by being JD-non-reactive. Of group (a) Antigens can elicit the most widespread immune response in animals. (B) and (c) Antigens of the following categories are also useful in the vaccine compositions of the present invention.   Table I also shows that many novel proteins from the B. burgdorferi B31 strain are It is shown that the antibody response to the antigen is MHC restricted. For example, the end of infection Up to, only B10 strain mice respond to the P83 protein. B10. B R species and B10. The D2 mouse is completely genetic except for the MHC locus. And clearly MHC haplotype H-2dAnd H-2kIs G-2bAnd ratio In comparison, it is relatively ineffective in providing the proteins of the invention. In particular, See Examples 10 and 12.   As mentioned above for non-restricted antigens, these MHC-restricted antigens also And (a) JD-1 cross-reactive and JD-1 MHC unrestricted; (b) JD-1 cross-reactive and JD-1 MHC restricted; or (c) JD- Characterized by being non-reactive. To these new B. Burgdorferi antigens The more elicited immune response is B31 MHC-restricted, and therefore all animal Does not elicit an immune response in the protype and is not It is also useful in vaccines and diagnostic assays to prevent mumps.   Of the novel B. burgdorferi antigens of the invention obtained in Examples 9-13 A summary of the features is shown in Table I below.   Another preferred feature of the novel antigens of the invention is the duration of B. burgdorferi infection. Humans or animals infected during the first 2 weeks of infection, eg, the first 2 weeks after infection (P.I.) It has the ability to produce antibodies. Yet another preferred feature of the antigen of the invention is , The antibody against this is stably produced during the infection period. "During infection "Stable production" means the post-infection period from about 2 weeks after the infection to 60 days after the infection. It means the production of detectable antibodies in the interim. Most often the spirochete is the host Such antibodies may persist for up to a year or more after It is expected to remain detectable in humans or animals. But from the organism Antigens isolated and combined with appropriate delivery systems render animals susceptible to infection. It is thought to give an immune response.   Thus, these antigens of the invention are preferably Borrelia burgdorferi. To elicit a stable protective antigen response in early humans or animals during infection More characterized by the ability to prevent or protect humans or animals from Lyme disease. Due to the above characteristics, these novel B. Burgdorferi antigens are diagnostic for Lyme disease, And in vaccine and therapeutic compositions.   Is the antigen of the present invention a selected strain, mutant strain, group or subunit of Borrelia? Isolated from. Preferably, the antigen is B. burgdorferi, especially lime bolre. It is isolated from subgroups A and B that are most often associated with Rheosis. Only However, spirochete isolates are also subgroups C to F [A.G. Barbour) et al., Journal of Infectious Diseases (J. Infect. Dis. ), 152: 478-484 (1985)] and other subgroups? Can be obtained from   Antigens of the invention are obtained and isolated from microorganisms directly from tick vectors Or a person infected with B. burgdorferi by being treated by a tick Alternatively obtained and isolated from animal serum. The antigen is also a host of ticks from the host Biologically obtained by infection against animal infection and then ticks or ticks that invaded ticks Obtained from the sera of animals infected with Bergdorferi. Bei Berg with prior art There is no mention of the need to maintain dolferi from ticks by host passage. Passage in growth medium should be avoided, but if desired, microorganisms should be minimized. The cells were also passaged once in BSK medium to simply amplify the microorganism to obtain the antigenic substance. Can be For example, when the B. burgdorferi JD-1 strain is used, 1 Sufficient amplification is obtained at passage. When using B31 strain, up to 6 passages can be adopted. Wear. However, in order to obtain the antigen of the present invention, high passages in in vitro culture should be taken. Do not use. For purposes of the present invention, the term "high passage" means 6 passages for the B31 strain. It is defined as more than one generation and more than one passage for the JD-1 strain. Generally, one of skill in the art would The "high passage" passage numbers for other B. burgdorferi strains are shown in Examples 5 to 5 below. By assessing the microorganisms passaged in hamsters as described in 8. Can be decided. Microbes do not cause symptoms of Lyme disease, or hamsters And not showing the growth characteristics of B. burgdorferi on the strain It represents the "age." In other words, cultivate the microorganism well in vitro and Most of the toxicity is lost, and therefore the antigen obtained therefrom is different from the antigens of the invention. Things.   Antigens of the invention preferably have varying molecular weights, as described in Example 4 below. Isolated by appropriate immunoblotting. Such isolation results in a substantial To other protein and non-protein material-free forms of organisms and tick vectors The antigen is obtained. B. Burgdorferi polypeptide and the antigen of the present invention Molecules containing are isolated from ticks and can be isolated using HPLC, FPLC, etc. Reversed-phase liquid chromatography; affinity chromatography (inorganic Ligand or monoclonal antibody); size exclusion chromatography; solid Various conventional means including standardized metal chelate chromatography; gel electrophoresis, etc. Further purification using a modified method of. Those of ordinary skill in the art will find the most suitable isolation and purification You can choose without departing from the range of clarity.   In addition, the polynucleotide and amino acid sequences of these antigens are It can be obtained by means of child operation technology, PCR and the like. [For example, Samb rook) et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cole Cold Spring Harbor Laboratory , NY (1989)]. For example, the antigens of the present invention include DNA probes and P B. burgdorferi DNA isolated from tick vector using CR technology? Prepared or isolated from   In addition, the antigen was a low passage of ticks infected with B. burgdorferi or growth medium. Obtained from PCR gene bank of microbial origin.   While not intending to be bound by theory, we find that tick vectors are tick-like. Considered to modify B. burgdorferi antigens via nodes or genetic elements available. Poisoning for the purpose of differentiating as an organism or for certain proteins and antigens For the treatment of sexual and infectious conditions, B. Bergdorferi is the vector That is, it is considered that the environment of ticks is required. Thus obtained from ticks The B. burgdorferi protein or antigen of the present invention, which depends on the environment of ticks, R Repeated cultures of B. burgdorferi in modified or growth medium It is completely different from the protein thus obtained.   Borrelia burgdorferi, after only two or more passages in medium Lose its toxicity to. American Type Culture Collection (American  Type Culture Collection), B31, obtained from Rockville, MD The prototype strain is distributed at a very high passage level of at least 60 passages. did Therefore, we believe that this strain is very weakly virulent until it reaches the claimant. It Most of the reports in the field deal with this strain, which was obtained from the ATCC. It should be noted that   As shown in the examples below, by long-term passage of the B. burgdorferi strain, Significant changes are induced in the expression of many bacterial proteins. In particular, Example 1 See 2 and 13. For low-passage and high-passage isolates of the same bacteria By using Western blot analysis with the same serum, very different band patterns were detected. You get In particular, many proteins were not detected in high passage isolates. , Most of the bands have low strength. Many of these protein antigens have multiple passages Lost or qualified. Of any strain of the bacteria used in the examples In some cases, mouse sera with these B31 and JD-1 high passage derivative lysates Reactivity is much lower than low passage derivatives of the same strain (Example 13). No longer inspected P14, P18, P22, P24, P2 are protein bands that are not emitted. Many bands in the range of 8, 31-38 kD, P43, P52 and 55-65 Part of the kD band is included. The P39 band was detected for all mouse sera Are uniform across all these different antigen source screens. These results Show significant differences in the antigen profiles of low and high passage bacterial isolates.   The differences between the antigens of the present invention and those of the prior art changed the route and type of infection B. burgdorferi antigen sometimes detected in hamsters and mice Is more apparent by the expression of By example, by sucking blood of infected ticks Is it an inbred of naturally transmitted Borrelia burgdorferi-infected mice? The pattern of the antibody response of Escherichia coli was as follows: Markedly different from the antibody response pattern in mice equally infected by needle inoculation Rukoto has been shown. See in particular Examples 7, 10, and 11. Needle inoculated culture B. Bergdorferi is a needle-inoculated homogenizer of the invasive tick vector. And an antigenic response different from tick-mediated infection.   The antigens of the present invention are also sensitive to B. burgdorferi, preferably tick-infested. It is characterized by being recognized by serum or T cells obtained from stained humans or animals. To collect. In the experiment, animals treated with ticks infected with Borrelia burgdorferi Serum from the product recognized Borrelia burgdorferi protein grown in medium I don't know. See, eg, Examples 7 and 10 below.   Since most of the frequently reported properties are molecular weight, the prior art has Criteria that can distinguish the reported Borrelia burgdorferi antigens To unequivocally identify the Borrelia burgdorferi antigen based on . However, despite similar molecular weights, we distinguish between: it can:   (A) Via a tick vector from Borrelia burgdorferi propagated in culture Borrelia burgdorferi antigen of the present invention (limited or regulated by See Example 12);   (B) Antibodies from individuals infested with ticks infected with Borrelia burgdorferi As identified by the following sub-culture growth of Borrelia burgdorferi extract And screened using high passage (as in the prior art), Borrelia Bergd Ruferi antigen;   (C) Borrelia burgdorferi extract or sub grown in high subculture Vaccinated in units and derived from ticks or low passage Borrelia burgdorferi Identified by antibodies from individuals screened with extracts or subunits Borrelia burgdorferi antigen;   (D) Initiate immunopathology or virulence factors, ie ticks or in the host Antigen from Borrelia burgdorferi having an adhesin chelating tissue . High subculture Borrelia burgdorferi is not toxic and is shown in Example 12 below. Record Have a visually different antigen profile as listed; and   (E) Borrelia burgdorferi (I See table).   Antigens of the invention may be proteinaceous substances such as proteins, polypeptides or Is a fragment of These antigens are generally the proteins to which the antigen naturally binds. Isolated without contamination with pac substances and other substances.   Thus, the antigens of the present invention are associated with MHC- in genetically inbred animals. By immunoassay for the pathogen produced by the vector using the restriction response Characterized These measurements are based on Western blot and biophysical measurements. High molecular weight measurement, for example, SDS-PAGE / staining, HPLC, antibody recognition assay, T-cell recognition assay, MHC binding assay, and adoption of cells, proteins or antibodies Includes assays to estimate immune defense or immunopathology due to transfer Not limited to.   The B. burgdorferi antigens, proteins and polypeptides of the present invention are May be part of a larger and / or multimeric protein It The antigen of the present invention is an outer surface protein of B. burgdorferi, such as Os. It may be combined with pA and OspB. In such a combination, The source may be in the form of a fusion protein. For example, an antigen or polypeptide of the invention The peptide can be an OspA polypeptide at the N-terminus or at the C-terminus, or OspB. Polypeptide, or non-OspA non-OspB polypeptide or combinations thereof May be fused with. OspA and OspB polypeptides useful for this purpose Is a polypeptide identified by the prior art [eg PCT / US91 / 0. 4056] and variants thereof. Non-OspA, non-Os useful for this purpose pB polypeptides are found in B. burgdorferi, flagella-related proteins, and other biology. Bergdorferi protein and its fragments, and non-Byberg Polypeptides of the invention, including dolferi proteins and fragments thereof. And those identified by the prior art.   In one aspect of the invention, a fusion protein comprising a plurality of polypeptides of the invention The quality is constructed for use in the methods and compositions of the present invention. These fusions Synthetic or multimeric proteins can be recombinantly or chemically Is synthesized. Fused or linked to groups other than amino acids, including lipids and carbohydrates The polypeptide of the present invention may be included. Furthermore, the antigens of the present invention are Other Borrelia vaccines described as well as vaccines of other species, such as Boviruses, coronaviruses, leptosporidia, and other vaccines from rabies A combination with a tincture may be used. Such proteins are widely available in ・ Effective for prevention, treatment and diagnosis of Lyme disease caused by Burgdorferi isolates Is.   The antigen of the present invention is a non-OspA, non-OspB B. burgdorferi antigen. Therefore, if one of the following environments is applied, Borelia Bergdorferi Response in vaccinated humans or animals vaccinated with tick-infected ticks Can provoke an answer:   (A) Preferred antigen was invaded by ticks infected with B. burgdorferi When recognized by serum or T cells collected from humans or animals (Example 1 1 to 13);   (B) Preferred antigens are restricted to preferred MHC haplotypes in mice If not (see Table I, Examples 11-13).   (C) one or more preferred forms of the natural form of natural Borrelia burgdorf. If it is cross-reactive with, for example B31 or JD1 (Table I, Examples 11 to 11). 13);   (D) Minimal number of antigens without intervening in vitro culture or in the growth medium Derived from Borrelia burgdorferi collected from the host or tick of the Case (see Table I, Example 9);   (E) The non-OspA and non-OspB antigens are present in vaccinated humans or animals. The antibody or the infected tick used to infect the host human or animal Eliminates or significantly reduces the ability to culture native viable Borrelia barkdorferi When a cell-mediated immune (CMI) response that can be significantly reduced can be induced (see Example 15).   The present invention elicits a protective immune response in humans or animals and is not restricted to MHC Examples of antigens include:   Antigen P18 has a molecular weight of about 18 kd as measured by immunoblot. (See Example 4). This antigen produces an antibody response by 1 month after infection. Induced and stable, during the infection period, the tick vector transmitted to B. burgdorferi An antibody response can be elicited in stained humans or animals. This is also H of MHC -2k, H-2dAnd H-2bEvoking a response for haplotype mice . That is, P18 is not MHC restricted. This antigen is from B. Bergdorferi Also shown is the ability to elicit a cross-reactive response between species, such as B31 and JD-1.   Antigen P43 has a molecular weight of about 43 kD as measured by immunoblot. And (see Example 4). This antigen is a tick tick medium until 12 days after infection. Can induce antibody response in B. burgdorferi-infected animals , This response is stable during the infection period. P43 is H-2 of MHCk, H-2band H-2dCan elicit responses from haplotype hamsters and mice, Is not MHC-restricted. This antigen is associated with at least two different B. Burgd Rufeli strains, expressed by B31 and JD-1 low passage isolates, but of the same species Between B31 and JD-1 not expressed by high passage (long-term culture) isolates of Induce a cross-reactive response. For example, having been infected with Borrelia burgdorferi Was demonstrated (cultivating spirochete from skin biopsy at the leading edge of characteristic erythema migrans) Screen a small population of human patients (by feeding). Blood from these patients Serum is low as an antigen in 10 of 20 patients who used JD-1 low passage as an antigen. Eleven out of 20 patients with passage B31 were reactive.   An example of another antigen of the invention is P39, which is a molecule measured by immunoblot. The quantity is approximately 39 kd. Like the other antigens of the invention, this is a tick Antibody responses in humans and animals infected with B. burgdorferi by a vector This response is stable during the infection period. This is MHC-non-restrictive, species Cross-reactive responses can be elicited between different B. burgdorferi species.   Yet another B. burgdorferi antigen of the invention of interest is P17. The isolated antigen P17 has a molecular weight of about 17 kD measured by immunoblot. (See Example 4). This antigen is also up to 1 month after infection and during the infection It is characterized by the ability to stably elicit an antibody response. P17 is also homologous to B31 When assayed for, an MHC-unrestricted response can be elicited, but in a restricted manner, Responds to heterologous JD-1 (see Example 13). P17 is MHC system regarding B31 Not limiting, but limiting with respect to JD-1. This antigen is B. Bergdorf Shows the ability to elicit a cross-reactive response between ferri strains such as B31 and JD-1 You Other B31 MHC non-restricted antigens are P24, P22 and P14, which are J Not reactive with D-1.   Other antigens of interest in the present invention are B31MHC non-restricted, JD-1 non-restricted. Reactive, namely P29 and P32. Other antigens of interest are B31 MHC-restricted, JD-1 cross-reactive and MHC-restricted, ie P30 . B. Burgdorferi antigen, P83, P52 to P65, P41 (fla), P28 and P34 are B31 non-MHC restricted and JD-1 cross-reactive, Not restrictive.   The antigens of the invention may be modified to increase their immunogenicity. For example, Hara says that the coupling interferes with the desired biological activity of either the antigen or the carrier. If not, it may be coupled with a compound or an immunogenic carrier. Parenthesis For a general discussion of pulling, see Antibodies, A Laboratory Mani (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Herba -Cool Spring Harbor Laboratory, edited by E. Harlow And D. Lane (E. Harlow and D. Lane) (1988)). In the industry Known useful immunogenic carriers are: blue mussel hemocyanin (KLH); Bovine serum albumin (BSA); ovalbumin; PPD (purification of tuberculin Protein derivative) erythrocyte; tetanus toxoid; cholera toxoid; agarose Bead; activated carbon; or bentonite, but not limited to There is no. Compounds useful for coupling include dinitrophenol groups and Includes, but is not limited to, rusonic phosphoric acid. Antigen is heat-denatured And / or It is modified by other techniques such as SDS. Furthermore, the antigen of the present invention is optionally selected. Selected polypeptides or proteins, such as Borrelia antigens OspA and O spB) other Borrelia antigens and proteins or polypeptides from other microorganisms May be fused with Chid.   The other antigens of the present invention may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts. The port of the present invention Suitable acids and bases which are capable of forming salts with polypeptides are known to those skilled in the art and are And organic acids and bases.   antibody   The present invention also relates to B. Burgdorferi disease when present in biological fluids. Antibodies capable of recognizing and binding the naturally occurring antigens of the invention from the drug substance are provided. Departure For the purposes of clarity, the term "biological fluid" means blood, plasma, serum, tears, saliva, Includes urine, vaginal discharge, synovial fluid, bladder wall or ear puncture. These antibodies are Humans who are positive for diagnosis and Lyme disease or who show signs of Lyme disease before testing And / or animal therapeutic compositions. The antibody may be used alone or in book form. Antibodies to other antigens of the invention as well as other known B. burgdorferi antigens It is useful in diagnosis in combination with an antibody against it. These antibodies are isolated according to the invention The generated antigen can be used to generate the antigen by conventional means. For example, polyclonal antibody Normally stimulate the immune system of a selected animal or human with one or more isolated antigens, The immune system produces natural antibodies to it, which can be used by animals or humans. Produced by recovering from blood or other biological fluids.   Table VI below is a list of monoclonal antibodies of the invention. However, For performing the method of the present invention, another monoclonal antibody (MAb) was obtained and used. It is also desirable.   Therefore, a hybridoma cell line expressing the desired MAb is a known conventional Techniques such as Kohler and Milstein and their variants It is produced by a method known as a method. Similarly desirable high titer antibodies Known recombinant techniques have been applied to monoclonal or polys raised against these antigens. Produced by applying to clonal antibodies [eg PCT patent application No. P CT / GB85 / 00392; British Patent Application Publication No. GB2188638A; Amit et al., Science, 233: 747-753 (1986). ); Queen et al., Proceedings of National Academic -Scientific (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA), 86: 10029 -10033 (1989); PCT Patent Application No. PCT / WO9007861; And Reichmann et al., Nature, 332: 323-. 327 (1988)]. Alternatively, the antigen is assembled as a multi-antigenic complex [E.g. European Patent Application No. 0339695, November 2, 1989] See Japanese publication], high potency to appear in biological fluids of infected animals or humans It may be used to raise antibodies capable of binding a selected antigen of valency.   Antibodies, alone or in other compositions or compounds, for use in diagnostic assays May be associated with any conventional label that can be combined with to provide a detectable signal. One or more When the antibody is used in a diagnostic method, the label is cross-reactive and produces a detectable signal. Is desirable. Most preferably, the label is visually detectable, eg colorimetrically Is. Preceded by various enzyme systems manipulated to produce colorimetric signals in assays Described in the technology. As an example, glucose oxidase (glucose Sulphate as a substrate) releases peroxide as a product. Peroxide and water Oxidation TMB by reacting with an elementary donor such as tetramethylbenzidine (TMB) The peroxidase that produces is blue. Another example is Horseradish Pell Oxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP) and glucose Including hexokinase linked to s-6-phosphate dehydrogenase, It reacts with ATP, glucose and NAD +, among other products, NADH Which is detected by an increase in absorbance at a wavelength of 340 nm. Of the present invention Other labeling systems used in the method can be detected by other means. For example, color Colored latex particles with embedded element [Bangs La boratories, Indiana] in place of the enzyme to form conjugates with antibodies And a visual system showing the presence of the complex obtained in the applicable assay. Signal, fluorescent compound, radioactive compound or element, or immunoelectrode Get. Detectable labels for binding to antibodies useful in the diagnostic methods of the invention are , Can be easily selected from various compositions known to those skilled in the diagnostic method and easily available. It The methods and antibodies of the invention are limited to the particular detectable label or labeling system used. Not done.   Diagnostics and tests   The present invention also provides a diagnostic method for Lyme disease. These diagnostics are for Lyme disease For the treatment of humans or animals suspected of having illness or having Lyme disease Useful.   In one example, this diagnostic method is based on the immune system of an infected human or animal, Produced in a biological fluid, the antigen of the invention or a combination thereof (optionally P39 A natural anti-Bybergd, which has the ability to bind to proteins (which may contain proteins) It consists of detecting the presence of a ruferi antibody. This method comprises at least the invention One B. burgdorferi antigen and optionally at least one B. Incubating other antigens from G. dolferi with a sample of the patient's biological fluid Consists of. The antibodies present in the fluid as a result of B. burgdorferi infection are , Forms an antibody-antigen complex with the antigen. Subsequently, the reaction mixture was analyzed to For the presence of the antigen-antibody complex of. The step of analyzing the reaction mixture is Contacting the labeled specific binding partner of the antibody. In a preferred embodiment The method then binds the latex beads with the isolated antigen of the invention. The biological liquid is then incubated with the bead / protein conjugate, which allows A reaction mixture is formed. The reaction mixture is then analyzed for the presence of antibody.   In another embodiment, the diagnostic method of the present invention is directed to an animal or human infected with a pathogen. Natural antigens associated with the B. burgdorferi pathogen in biological fluids of Includes detecting its own presence. This method is typically used for detection The antibody of the present invention (eg, suitable human and / or animal At least one Borrelia burgdorferi antigen of the invention and optionally less (Produced by administering one other B. burgdorferi antigen) Culturing with a sample of biological fluid from the human or animal being cut off. In the presence of B. burgdorferi infection of human or animal patients, antigen-antibody complexes A coalescence is formed (specific binding occurs). Then, excess labeled antibody is desired The reaction mixture can be analyzed for the presence of antigen-antibody complexes and anti-antibody complexes. Determine the amount of label bound to the body.   The assay using the protein antigen of the present invention is heterogeneous (that is, requires a separation step). Yes) or homogeneous. If the test is heterogeneous , Use various separation means including centrifugation, filtration, chromatography or magnetism. Can be   Preferred for screening blood products or other physiological or biological fluids A new assay is the enzyme linked immunosorbent assay, or ELISA. Preferably various Of the B. burgdorferi of E.coli and using a third tick extract ・ Dami (larva, nymph or adult) infected with B. burgdorferi Separately, an ELISA capable of obtaining a suitable substance for testing is an antigen capture two-point ELI. SA (antigen-capture two-site ELISA).   However, typically in an ELISA, the isolated antigen of the invention is Adsorbed directly to the rotiter well or via a capture matrix (ie antibody) It The remaining protein binding sites on the surface are then converted to bovine serum albumin (BSA). , Heat-inactivated normal goat serum (NGS) or blot (BLOTTO) (plus preservative , A buffered solution of skim milk powder containing salt and defoamer)) . Wells then organisms suspected of containing specific anti-B. Burgdorferi antibody With a biological sample. The sample can be used as it is, but this is usually small. Amount (0.1-5.0%) of proteins such as BSA, NGS or BLOTTO Often diluted in a buffer containing Incubate for a sufficient time to achieve specific binding After combining, wash the wells to remove unbound protein, then Incubate with labeled anti-human immunoglobulin (αHuIg). Sign in front Horseradish peroxidase (HRP), β-galactosidase, Choose from a variety of enzymes, including alkaline phosphatase and glucose oxidase. By choice Wear. After sufficient time has elapsed for specific binding to occur again, the wells are washed again. Unbound complex is removed and enzyme substrate is added. Develop color in well The optical density of the contents of is measured visually or by instrument.   In addition, an MAb or other antibody of the invention capable of binding the antigen is added to the ELISA plate. To join. In other diagnostic methods, biological fluids are plated on antibody-coupled plates. Feed and wash. Detection of antigen-antibody complex and quantification of labeled MAb are described above. Do as usual. Such "antigen capture" assays are specific for OspA. Detection of B. burgdorferi in ticks using different monoclonal antibodies However, it has now been developed in the biological samples according to the present invention. A preferred method of detecting the presence of S. dolferi. This test method This will be described in more detail in Example 14. Briefly, the assay is a mono- Clonal antibody and labeled rabbit polyclonal anti-virus for signal generation The Lee Burgdorferi antibody is used. The sensitivity of the test is B. Bergdorferis About 50 to about 200 Pyrochetes of B. Bergdorferis Pyrochetes, especially about 100 spirochetes. Infection in nymphs and adults is less than 25% D can be used for the measurement, and the confirmation test is performed.   Other useful assay methods include filter cups and dipsticks . In the former assay, the antibody of the present invention is added to the glass filter at the opening of a small cap. Fix it to the machine. Process biological fluid or sample (5 mL) through a filter To do. If the antigen is present (ie B. Burgdorferi infection), this is Filter and then visualized by a second antibody / detector. Dip In a quick assay, the antigen or antibody is immobilized on a filter, which is then loaded with biological fluid. Immerse in the body, dry and screen with detection molecule.   Routine assays, especially immunoassays, are based on B. Bergdorf in animals and humans. Being able to use the isolated antigens and antibodies of the invention for the detection of ferri infection Can be understood by those skilled in the art. The present invention is therefore limited to the selection of particular assay methods. Rather, it is believed to encompass assays known to those of skill in the art.   Diagnostic kit   For convenience, the reagents for ELISA or other assays in accordance with the invention are included in the kit. Obtained in form. Such a kit may comprise at least one of the B. Can bind to the Dorferi antigen and / or the B. burgdorferi antigen of the invention Human or animal sample containing at least one B. burgdorferi antibody It is useful in diagnosing infections with B. Bergdorferi.   These kits contain the B. burgdorferi antigen protein or anti-antibody of the present invention. Body pre-adsorbed microtiter plates, various diluents and buffers Fluids, labeled conjugates for the detection of specifically bound antigens or antibodies, and other Includes signal generating reagents such as enzyme substrates, cofactors and chromogens. these The other components of the kit are easily determined by one of ordinary skill in the art. Such ingredients are examples B31 non-MHC restriction such as P18, P19, P39 or P43, JD-1 Cross-reactive and non-MHC-restricted polyclonal or moles to the antigens of the invention. Noclonal capture antibody; B31 non-MHC restriction such as P17, JD-1 MHC restriction Antibodies to antigens; or cocktails of two or more of these antibodies, labeled with these antigens. Purified or semi-purified extract as standard, MAb detection antibody, anti-antibody conjugated with indicator molecule Mouse or anti-human antibody, ELISA plate prepared for adsorption, colorimetric index Chart, disposable gloves, decontamination instructions, applicator stick or Includes container and sample preparation cup. B31MH as listed in Table I above C-restricted antigens may also form part of this kit. Monoclonal antibody of the present invention Suitable examples of are shown in Table VI. These kits diagnose B. Bergdorferi infection A simple and effective method for clinical laboratories is provided.   Therapeutic composition   The antibodies of the invention may be used alone or with other B. burgdorferi antigens such as anti-B3. In combination with 9kD, anti-OspA or anti-OspB, etc., by B. Bergdorferi Also used in therapeutic compositions and methods for the treatment of infected humans and / or animals Can be. Such therapeutic composition comprises a carrier or diluent and one or more of the present invention. Can be formulated to contain the antibodies of (see Table VI). Suitable pharmaceutically acceptable carriers are , Facilitates administration of protein, but is physiologically inactive and / or harmless It   The carrier is chosen by the person skilled in the art. The carrier is, for example, sterile saline, lactose, Sucrose, calcium phosphate, gelatin, dextrin, agar, pectin , Peanut oil, olive oil, sesame oil, and water. Furthermore, the carrier or Diluents may be delayed substances such as glycerol monostearate or glycerol Monostearate may be included alone or with a wax. In addition, sustained release Limmer formulations can also be used.   If desired, the composition may contain conventional pharmaceutical ingredients such as preservatives or chemical stabilizers. May be included. Suitable components for use with the antibody in the therapeutic composition include For example, casamino acid, sucrose, gelatin, phenol red, NZ amine, Add potassium phosphate, lactose, lactalbumin hydrolyzate and dry milk Include.   Instead of, or in addition to, the antibodies of the invention, it has potential in the treatment of Lyme disease. Therapeutic agents such as antibiotics or immunostimulants, receptor-mediated activation of the antigens of the invention. Antagonists and cytokine preparations useful in reducing or eliminating symptoms Can be expected to be. Suppresses immunosuppressive substances released from tick vectors Drugs that can be used to counteract natural reactions in infected humans or animals. Acts to help the plague. Accordingly, such agents are not considered therapeutic compositions of the invention. Work in collaboration with. The development of therapeutic compositions containing these agents is an aspect of the invention. To within the skill of the artisan.   Administering an effective amount of such therapeutic composition according to the methods of the present invention To treat humans or animals for B. burgdorferi infection. Preferred For example, such compositions may be administered parenterally, preferably intramuscularly or subcutaneously. To do. However, it may be administered orally or by any other suitable route including topology. Can be prescribed to.   The therapeutic composition of the present invention comprises about 0.05 μg / mL to about 1000 μg / mL. Between the antibodies of the invention. 1 to 3 times such composition per day For 12 weeks. However, the appropriate dose should be determined by the attending physician or veterinarian. Depending on the age, sex, weight and general health of the human or animal patient Is done.   Vaccine composition   In another aspect, the present invention relates to Lyme disease associated with B. burgdorferi Vaccine compositions useful in protecting against this and animal or human effective amounts of this Prophylactic methods of administering such compositions are provided. This vaccine composition is the Or more antigens, or two or more of these isolated proteins, or Or these and other B. burgdorferi antigens such as the 39 kD tamper Protein, a combination of OspA and OspB proteins and a pharmaceutically acceptable carrier Alternatively, it may contain a diluent. Examples of the carrier are as described above.   If desired, the vaccine composition may further comprise an adjuvant, a preservative, a chemical stabilizer, or Or other antigenic proteins may be included. Typically, stabilizers, adjuvants, And preservatives are best treated for efficacy in the human or animal of interest. Optimized to decide who. Suitable preservatives are, for example, chlorobutanol, Potassium sorbate, sorbic acid, sulfur dioxide, propyl gallate, paraben Includes, ethyl vanillin, glycerin, phenol and parachlorophenol To do.   Mix one or more of the above vaccine components and adsorb with a conventional adjuvant. Let Adjuvants are non-adjuvant for collecting leukocytes or enhancing the immune response. Used as a specific stimulant. Such adjuvants include, among others, mineral oils and Water, aluminum hydroxide, amphigen, abridine, L121 / squalene , D-lactide-polyactide / glycoside, pluronic priois, mura Includes mill dipeptides, killed Borrelia and saponins such as QuilA.   Appropriate amounts of active ingredients can be determined by those skilled in the art based on the level of immune response desired. It However, in general, the vaccine composition is 1 ng to 1000 mg per mL. It preferably contains 0.05 μg to 1 mg of antigen per mL. in addition, Book The vaccine composition of the invention comprises B. bronchiseptica, canine parvovirus, canine disten. Par, rabies, leptosporidia, canine coronavirus and canine adenovirus Other non-B. Burgdorferi antigens, including S. cerevisiae, may be included. From other animal species Vaccine agents such as feline coronavirus may also be included in the composition.   Appropriate doses of vaccine compositions of the present invention can be readily determined by one of ordinary skill in the art. Generally, a suitable dose is 0.1 to 5 mL of vaccine composition. Furthermore, the cure Depending on the human patient or animal species being treated, for example weight, age, and general health Depending on the condition, the dose can be easily determined by those skilled in the art.   Generally, the vaccine is given once on a seasonal basis. In the season of ticks, usually in spring , Booster administration. The vaccine is administered by any suitable route. However, Buccal administration, especially intramuscular and subcutaneous, is the preferred route. Oral administration is also preferred.   In the following examples, a preferred method for obtaining the protein antigen of the present invention, and 1 illustrates a preferred method of assaying and preparing a composition of the invention. Obviously these implementations By way of example, the antigens of the invention are much more accurate diagnostic reagents than currently used antigens. I understand. P17, P18, P39, and P43 in these examples The protein elicits a non-MHC restricted response (at least for B31) and It was cross-reactive between at least two Borrelia burgdorferi. P39 ton The protein has already been cloned and produced a monoclonal antibody specific for P39. [Simpson and Schwan, private]. From the results of the following examples, the isolated antigens P17, P18 and P43 of the present invention, and P39 has potential diagnostic effects on Lyme disease and improves Lyme serology It turns out that it is one. These examples are for illustrative purposes only. It does not limit the range of light.Example 1-Bacterial species and their growth   B. Bergdorferi's JD1 strain [J. Piesman et al. Journal of Clinical Microbiology (J. Clin. Microbiol.) 25: 557-558 (1987) and TG Schwan (TG Sc). hwan) Et al., Journal of Clinical Microbiology, 27: 1734-1 738 (1989)] to the Golden Syrian hamster (SASCO), B. Berg on four-repeat tick passage in Omaha, Nebraska. Maintained by alternating D. ferri-infected A. daminic ticks with hamsters It   B. burgdorferi is cultivated in modified BSK II medium at 34 ° C. RJ Sinsky et al., Journal of Clinical -Microbiology, 27: 1723-1727 (1989)]. Cultivated c Per liter for selective inhibition of fungal contaminants in muscular ear biopsies This BSK II broth was prepared by adding 20 mg of cycloheximide. To be modified.   The external tick surface is first Wescodyne ((Wescodyne), Amsco Medi Cal Products (Amsco Medical Products, Erie, PA) And 70% ethanol, followed by BSK II medium. Remove pollutants. Then, Ten Brock Homogenizer (Ten Broeck  homogenizer) 10-20 nymphs in 1-2 ml phosphate buffer (PBS) Homogenization of infected Ixodes damini nymphs 2-3 weeks after satiation by crushing with Prepare the nate. Inject 0.4 ml of homogenate into hamster intraperitoneally or intradermally Inoculate several places.Example 2-Hamster infection   Bii Burgd cultivated by inoculation of animals for hamster studies Exposure to or homologous to homogenates of Rufeli infected ticks Exposed to B. Bergdorferi. As mentioned above, tick bites Cause hamsters to be infected with B. burgdorferi-infected Ai Damini. J. Piesman et al., Journal of Clinical Microva Biology, 25: 557-558 (1987)]. For needle inoculation, culture Suspended by slowly stirring the microorganisms, counted by dark field microscopy, Suitable Now dilute in BSK II medium. For the first experiment, standardize the hamster. Inoculate several spots intraperitoneally or intradermally with 0.7 ml of BSK II containing seed It For dose-response studies, hamsters were supplemented with 0.1 ml of various concentrations of microorganisms (1 x 10Four~ 1 × 108Cells / ml) are inoculated intradermally.Example 3-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)   The following assays are performed for the hamster studies of Examples 5-8 and for Examples 9-13. It was used for both mouse studies.   The ELISA test is basically based on JT Roehrig. ) Et al., Virology, 118: 269-278 (1982). Do it as it is done. Briefly, use the immunolone 2 plate (Dynate K. Inc. (Dynatech, Inc.), Kenjin, MD Ton) overnight at 4 ° C. at a concentration of 2 μ / well for whole cell sonicate, 60 ng / well for flagella or 2μ for recombinant OspA Coat at a concentration of g / well. Whole cell sonicated product ． Russel) et al., Journal of Infectious Diseases (J. Infec. Dis. ), 149: 465-470 (1984), and pericellular flagella. To A.G.Barbour et al., Infection and Immunity (Infec. Immun.), 52: 549-554 (1986). Prepare using. The purified recombinant OspA was prepared by Dr. John D unn, Brookhaven National Lab oratory) donated by [J.J.Dunn] et al. Expression. And Purification (Protein Expressi on and Purification), 1: 159-168 (1991)].   ELISA antigen concentration is the standard box of antigen for positive or negative control sera It is measured in the titration method. The antigen concentration used should be positive over the antiserum dilution range. Is the minimum amount showing the maximum binding of the control serum of. After coating with antigen, the wells are then Block with 3% goat serum in PBS for 1 hour at 37 ° C. Plate with 0.5% Vienna Rinse with PBS (rinse buffer) containing 20 (Tween 20). Combined hamster Goat anti-hamster IgG with antibody diluted 1: 20,000 or 1: 40,000 (H + L) Peroxidase (Cappel Laboratories ), Malvern, Pennsylvania). To detect bound zygotes The substrate used for 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) / H2 O2[TF Tsai et al., Journal of Cris Nical Microbiology, 26: 2620-2625 (1988)]. 5μ l / well 2N H2SOFourThe reactivity is stopped after 30 minutes by adding It Absorbance at 450 nm Titer Tech Multi-Scan MC Spectrophotometer (Ti tertek Multiskan MC spectrophotometer (ICN Flow Laboratories) Tries (ICN Flow Laboratories, Costa Mesa, CA) To measure.Example 4-immunoblot   The following method is used to study the hamsters of Examples 5-8 and of Examples 9-13. Used for mouse studies.   Immunoblots have already been published [J.T.Rerich (JT ． Roehrig) et al., Virology, 142: 347-356 (198). 5) and H. Towbin et al., Proceedings of Na. Sional Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ), 76: 4350-4354 (1979)]. Bye Ba -Gordoferi JD1 strain, protein (1 x 107Cells / gel) at 12.5% Mini gel for preparative acrylamide [U.K. Laemmli, Ne Nature (London), 277: 680-685 (1970)] High molecular weight bio-rad rainbow markers (BioRad (BioRad ), Richmond, Virginia). 21.4 kDa marker Stop the gel when has moved to the bottom of the split gel. Molecular weight measurement is average gel mobility (N = 5).   Immobilon-P membrane (Millipol Corporation (Millipore Corporation), Bedhold, MD) for 1 hour Semiphor blotter (Hoefer Scientific) Hoeffer Scientific Instruments, California Electroblot at 100 mA, in San Francisco, CA. Cut the edge of the membrane Cut off the next gold-blot protein dye (Integrated Separation Integrated Separation Systems, Ha, MD It is used as a marker after staining with Idpark. The rest of the membrane at 37 ° C for 1 hour, Or block with 3% goat serum in PBS overnight at 4 ° C, rinse with rinse buffer, strip. Cut into pieces. Shake the strips while shaking with hamster serum diluted in rinse buffer. Incubate for 2 hours at room temperature.   p14, H9724; OspA, H5332; and OspB, H6831 ( Mouse specific for Symbicom, Umea, Sweden Using clonal antibody (MAb) tissue culture supernatant at a dilution of 1: 5 or 1:20 It The bound hamster antibody was labeled with goat anti-hamster IgG (H + L) peroxidase. Detected with an enzyme-labeled antibody (Capel Laboratory, Malvern, PA) To do. The bound murine MAb was treated with goat anti-mouse IgG (Fc) peroxidase. Labeled antibody (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. De (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), We, Pennsylvania Strobe). For detecting bound peroxidase conjugate The modified substrate was modified histochemical TMB / H2O2Substrate (Kirkegaard and Kirkegaard and Perry Laboratories, Mary Run Gaithersburg, DO or chemiluminescent substrate (Amersham International) Null (Amersham International, Arlington Heights, Illinois) . Stop the reaction by developing the stained blot for 1-5 minutes and rinsing it in water. Stop With Rusham International, Arlington Heights, Illinois) Record by fluorescence indirect photography.Example 5-Hamster immune response with different inoculation routes with different sources of antigen   Inoculation route and antigenic response of hamster antibodies to B. burgdorferi To compare the effects on the answers, needle contact as described in Examples 1 and 2 above. Infect animals with either species or tick bloodsucking. Type of antigen used for infection Change both and quantity. Bacteria grown on medium, either intraperitoneally or intradermally Or inoculate with a homogenate of A. daminickii infected with B. burgdorferi . The number of infected ticks used to infect hamsters was also altered to create a natural dose response. Intensify.   One of the animals (No. 3 in Table II below) was given to B. Bergdorfe. Before feeding to reinfected nymphs, the method of Barber et al. [Infection and Im Nity, 52: 549-554 (1986)]. Immunize with the added antigen. The immunization method for this animal is 50 μm in two places. g of the antigen in Freund's complete adjuvant. Two weeks later , Booster animals with 50 μg of antigen in Freund's incomplete adjuvant . The pre-infection titer of this animal is measured in a whole cell sonicated ELISA. Then, it is 1: 320,000.   The hamsters were bled at various time points post-challenge and whole-cell sonicated or purified whip. The antibody titer to hair is measured by ELISA. The efficiency of infection was determined in Example 6 below. By isolating B. burgdorferi from ear biopsies, as described in. Niter. With the exception of hamster number 27, all hamsters were infected (P.I. ． ) One month positive.   In Table II below, in the third column, the hamsters feel Bj Bergdorferi. Stained Ai damini nymphs or larvae are either blood-sucked or tick-homogenized. Or inoculated with spirochetes grown in culture or by needle inoculation. The fourth column shows the number of infected ticks used for blood feeding or homogenate production, or Pure spirochete concentration (logTen), And the fifth column collected serum samples. The number of days after infection is shown, and the sixth column shows whole cell sonicated (Son) or purified whip. The reciprocal of the end-point ELISA titer of hair antigen is shown.   Pre-immune titers for all animals were <40 for whole cell sonicates, ≤20 for OspA and ≤10 for flagella antigen. High whole cell super sound Has an ELISA value (3, 8, 9, 14, 15, 16 and 17) of wave treated Hamster serum samples were diluted 1: 100, all other sera were diluted 1:50. And compare antibody activity in immunoblots. This is described in Example 4 Do on the street The bound antibody is TMB / H2O2Detect with histochemical substrate. Mada D. Infected hamsters are bled at weekly intervals.   1 × 107Or 1 × 108Hamsters inoculated with JD1 grown on individual media All whole-cell sonicates and flagella in an ELISA, regardless of route of inoculation , And antibodies against both OspA and OspB in the immunoblot Produce (Table II). Hams as a positive antibody control for OspA ELISA 15 and 16 were also tested for antibodies to recombinant OspA antigen . The anti-OspA titers of these hamsters were 1: 320. Tick tick homogeny Low levels of anti-OspA by immunoblot in several animals inoculated with (There is no anti-OspB antibody).   However, irrespective of tick dose, anti-OspA or anti-Os pB reactivity is unidentified or very low. All naturally infected animals, and Many animals inoculated with ticks and ticks were tested by ELISA or immunization, respectively. No blotches show no anti-flagella or anti-p41 antibodies (Table II). 47, 43 Antibody responses to the (P43), 21 and 20 kDa proteins were determined by inoculation. Observed in hamsters regardless of tract or type of immunogen. P41 and P43 can be distinguished by the selective P41 reactivity of antiflagellar MAb H9274. As well The distinction is that hams immunized with partially purified flagellin before tick attack. Observed at Tar 3. In this hamster, this animal's flagelli The stronger P41 band on the immunoblot depending on the existing immunity to Be observed.Example 6-Kinetics of hamster immune response after infection by tick bites   Hamsters infected with ticks are less responsive to OspA and OspB do not do. To better characterize the movement of the hamster antibody response after natural infection, Analyze antibody production over time (Figure 1). Efficacy of natural infection from spiro ear biopsy It is measured by isolating the heather [J. Sinsky et al. Journal of Clinical Microbiology, 27: 1723-172 7 (1989)].   The hamster's ear is first disinfected with 70% ethanol and the ear wedge is cut. Ear biopsies were serially applied to Wescodyne and 70% ethanol. Disinfect by continuous immersion for 15 minutes each. Wedge-shaped small piece (25 mm2) Cut it into small pieces with a small knife, and put all the pieces into a 4 ml test tube containing BSK II medium. Seed and incubate at 34 ° C. The cultures are observed until they become positive or for 28 days.   All hamsters, unless otherwise stated, should be treated with 1 gestation after vaccination or tick feeding. By isolation of B. burgdorferi from ear biopsies collected on the Moon by culture means As indicated, the infection persisted. The hamster antibody response is rapid. That is, high A high antibody titer occurred one week after infection and remained stable during the experiment. Peak after 1 week After that, the antibody titer to flagellin decreased and remained stable at lower titers ( (Fig. 1). This result is confirmed by the immunoblot reactivity with P41 .   This analysis pooled hamster serum samples (n = 6 for 1-5 weeks, n = 3 for 6 weeks, 19 weeks for n = 2, 42 weeks for n = 1) : Dilute to 40. A chemiluminescent substrate is used to identify antibody binding.   Anti-P43 antibody was detected by immunoblot in 1 week and was stable during infection Is. Anti-OspA antibodies were mostly detected by immunoblot for 19 weeks after infection. No anti-OspB antibody is detected and not detected. 42 weeks after infection one surviving animal Hamsters show little antibody to either OspA or OspB Yes. This hamster, however, is still culture positive. Against P39 antigen Antibodies are not detected until 2-4 weeks after infection. Anti-39 is also present late in infection.Example 7-Dose of antibodies against inoculated B. burgdorferi in various amounts response   Differences in antibody response between tick-acquired or needle-inoculated hamsters are due to needle-inoculation. Antigen dose response to determine if more antigen is being introduced. Answer analysis was performed using various amounts of cultured and grown B. burgdorferi (3.0-7.0 log).Ten Cell number) inoculation. Animals are bled 2 and 4 weeks post immunization. Before immunization Titers for all animals were ≤40 for whole cell sonicated, OspA antigen In this regard, ≦ 20.   Maximum antibody reactivity to whole cell sonicated antigen is 1 x 106More than It is detected after inoculation with Bergdorferi (Fig. 2). 1 × 106Or 1x 107All cells inoculated with single cells are culture positive for B. burgdorferi And is seropositive in whole-cell sonicated ELISA. 1 x 10Five1 out of 5 animals inoculated with 1 cell was culture positive but In the sonicated ELISA all 5 are seropositive. 1 × 10FourIndividual details 2 out of 5 animals inoculated with vesicles were culture positive, but whole cell sonicated E Three animals are seropositive in LISA. 1 × 103Animals inoculated with Although all cultures were negative, when measured in whole cell sonicated ELISA, There is no available antibody. LD of this experiment50Is 1 as measured by ear biopsy isolation ． 3 x 10FiveCell / animal.   Antigen specificity of hamsters inoculated with B. burgdorferi as a function of dose 1 x 10 to the hamster to showFiveInoculate cells or more. Whole cell Since the ELISA value of each hamster for sonicated products is basically the same, Pooled 4 week serum samples (n = 4 or 5) and used in immunoblot Dilute 1: 40 before working. A chemiluminescent substrate is used to identify antibody binding.   These inoculated animals showed high levels of anti-OspA and anti-Osp 4 weeks after infection. Produces B. Unlike the immunoblot results, it was measured by OspA ELISA. The determined OspA antibody is 1 x 106Or 1 × 107Can be detected only after inoculation of cells (Fig. 2). Therefore, immunoblot is more suitable for OspA antibody detection than ELISA. It is more sensitive in output.Example 8-Comparison of antibody responses by quantitative densitometry   A direct comparison of antibody responses of P43, P41, P39, OspB and OspA By comparing the immunoblot reactivity observed by quantitative densitometry, U The amount of bound antibody in the immunoblot was determined by Gilford 26 By integrating the peak area from a densitometer scan using a 00 spectrophotometer Ask. The amount of anti-P43 detected is standardized to 1.0. Compared with anti-P43 antibody To this end, the amount of other protein-specific antibodies is normalized to 1.0 for anti-P43. All sera are used at a dilution of 1:40.   The results are shown in Table III below. For animals challenged by inoculation, Dose is logTenCell / attack.   A visual observation is confirmed from the result of the density measurement. At least 4 times more anti-Os pA and at least 30 times more anti-OspB were produced 28 days after infection by needle inoculation Be born An anti-P41 response is also observed 7 days after natural infection, which is an anti-P43 response. Not as expensive as for Similarly, the anti-P43 response is higher than the anti-P39 response.Example 9-Infected tick colonies and antigen preparation for mouse studies   A. Maintenance of infected tick colonies   The newly hatched Ixodes damini larvae were bred with Bj Bergdorferi B31. Strain-infected ICR allogeneic mice are fed and subsequently maintained at 4 ° C. and high humidity. Nymph To infect mice exposed to ticks by the natural route. All infected Ticks are maintained by a cycle of infected ticks that carry spirochete to mice. These mice are then used to infect the hatched tick larvae.   B. Preparation of Borrelia antigen   B31 and JD-1 strains isolated from Ai damini [CDC (Colorado, CO (Available from Fort Collins) upon request] low-passage or high-passage cryoprotection Inoculate cultures from existing strains. "Low passage" used in these examples The term means up to 6 passages in culture for the B31 strain and 1 passage in culture for the JD-1 strain. Means generation. The term "high passage" refers to both strains in culture for either strain. It means over 30 passages.   These were BSK II medium supplemented with 6% rabbit serum (Per-Freeze-bye. Propagation in Pel-Freez Biologicals, Rogers, Alaska To do. 1 liter of the growth culture was harvested in the late log phase (5 days) at 10.240 g Pellet by centrifuging for 20 minutes at 20 ° C. PB Spirochet S, 5 mM MgCl2Wash with and centrifuge again. Pellet 10 mM Tris Resuspend at 30 ml / g (wet cell weight) in 1 mM EDTA (TE) . The spirochete is separated in a Dounce homogenizer to remove protein Adjust the degree to 2 mg / ml. These preparations were then added to an equal volume of 2X SDS-P. Mix with AGE sample buffer, aliquot and store at -70 ° C.Example 10-Infection of mice by ticking   Adult mice aged 4-6 weeks were tested by Jackson Laboratori. es) (Bar Harbor, Massachusetts (BALB / c, B10, B10. BR and B10. D2)) or certain pathogen-free (SPF) DVBI ICR differences maintained at D, NCID, CDC (Fort Collins, CO) Obtained from a colony of inbred mice. These four recombinant inbreds and 1 Inbred mice were infected with B. burgdorferi by Ixodes ticks Used as an infection target for transmission.   The mice used in this study were BALB / c (H-2d) C57BL / 1 0J (B10) (H-2k), B10 background, B10. BR (H- Twok) And B10. D2 (H-2d) Is a recombinant inbred strain. BALB / c and B10 mice have their immunoglobulin (Ig) gene Ip (BALB / c has Ig allotype “a”, B10 is Ig allotype “a”) b)) and outbred mice are mixed with MHC and Ig haplotypes. Have a compound.   A group of 4 mice from various and ICR outbred mice were perforated in the ear Take a serial number and take a serum sample before immunization. Each mouse was described in Example 9 above. 10 to 12 ticks infected with B. burgdorferi B31 strain Let Table IV shows the number of ticks that successfully adhered to and blood-sucked to animals and after infection. Figure 9 shows the results of an ear biopsy culture for 30 days Borrelia spirochete. 1 Ticks collected without bloodsucking 2 Infections examined by culturing ear biopsies 30 days after infectionExample 11 Bie bar as a result of being ticked by ticks using homologous bacterial species as antigen Responses of inbred mice to infection with Gudolferi   Serum samples were taken from each mouse at 5, 12, 19, 26 and 60 days post infection. These sera were collected and used at low passage (80 μg) for Borrelia burgdorferi B31 strain. Used in a Western blot analysis using all lysates of) as the antigen.   Sample the Hofer Scientific Instruments Model SE600 (Hoefer Scientific Instruments model SE600) Vertical Slab Gel Electron Run on a non-continuous SDS-PAGE system using a electrophoresis system. Layers and The resolved gels are 4% and 10% acrylamide, respectively. 1 bacterial lysate Run at 80 μg / gel in one preparative well. Molecular weight standard (14-106 kD ) In the flanking lane. This is done as follows in 10% SDS-PA GE and electrophoretically transfer to a 0.2 μm nitrocellulose filter.   Hoefer Semiphor TE70 Trans Blot 15 x 15 cm nitrocell for 50 minutes at 100 mA using the system Loin filter (pore size 0.2 μm) (BioRad, California Richmond, A.). 3% with nitrocellulose filter pre-blocked BSA-fraction V, 0.9% NaCl, 10 mM Tris-HCl p A solution containing H7.4 and 0.1% sodium azide at 16 ° C for 16 hours. It Filter with 0.05% Tween 20, 0.9% NaCl, and 10%. Wash with mM TrisHCl pH 7.4 (wash buffer) for 20 minutes. filter Immunetics Miniblotter 25 (Immunetics Miniblotter) And wash. The wells are aspirated and dried, and the appropriate dilution of antiserum or model in wash buffer is used. Noclonal antibody (MAb) is added. Incubate the primary antibody for 3 hours at room temperature and fill The plate was washed 3 times, 5 minutes each, and diluted with alkaline phosphatase at a dilution of 1: 1000. Case-conjugated goat anti-mouse 1g G + M (H and L) (Jackson Immunoresearch (Jackson Immunoresearch), Vinland, PA) Added to the gel. After 1 hour, wash the filter twice and remove it from the device, then try again. Wash. Rinse the filter quickly twice with deionized water and use BCIP / NBT substrate (Key injury Field and Perry Laboratories, Inc. (Kirkegaard  and Perry Laboratories, Inc. ), Gaithersburg, Maryland) Add in exactly 5 minutes to detect bound alkaline phosphatase.   Pre-immune serum and day 5 serum from all animals were B. Bergdorferi B. Western blot using 31 strains was negative. On the 12th day, all mau Started producing antibodies found in serum against various Borrelia proteins .   Furthermore, inbred mice react differentially with these antibodies.   For example, all B10 animals have a tamper that migrates at a molecular weight slightly above 80 kD. Quality, particularly strong against P83 reported by Dorward et al. Shows the response. The animal balance in this study was Do not respond to quality.   There are various responses to the P17 antigen [Wilske et al. International Symposium of Lime Borreriosis (Third Inte rn'l Symposium of Lyme Borreliosis), Sweden (1990)], Only the B10 congenic mouse line responds to this protein on day 12 . The P12 antigen has also been described by these authors, except for BALB / c. Induces a weak response in all species of. Furthermore, 20-22 kD and 55 Different responses to groups of proteins in the ~ 60 kD molecular weight range . Antibody response is very weak against these antigens at this early stage of infection .Examples 12-39 Initial response evoked by proteins in the 39 kD molecular weight range   There are at least two bands in the 39 kD region, but for flagellin The MAb detects a band migrating slightly above the P39 doublet, so It is believed to be reactive with the lagerin protein. 14 and 18 kD Two other proteins migrating in molecular weight also produce different responses at this early stage of infection. Induce. Finally, all mice move to the vicinity of the 45kD marker. There is a marked response to the disease. In Example 5 above, this protein is Described in natural infections in Muster and designated P43 antigen.   At this stage of infection, response to OspA, OspB or flagellin The answer is, if attacked by needle inoculation of cultured Borrelia burgdorferi Or not detected in all proteins that elicit early responses from other mouse species U.E. Schaible et al., European Journal Le of Immunology (Eur. J. Immunol.), 21: 2397-2405 ( 1991), E. Filrig et al., Infection Ann Infection and Immunity, 53713-714 (198) 6)]. Band and critical at 30 kD (near OspA) and 32 kD (OspB) This is the case if OspA and OspB are the prominent bands although they are chemically reactive. Compatibility is by Coomassie blue staining of acrylamide gel or nitrocellulose Not stoichiometric with Luther's Ponceau S stain. This is OspA and Os It is understood as an antibody response to different proteins that move in concert with pB. Further In addition, these sera were derived from the cloned gene product expressed in E. coli. By Western blotting and ELISA using purified, fully fatted OspA of Anti-OspA activity in the serum of any of the mice used in this study. Sex is not detected.   Detected by Western blot at B31 low passage by day 19 post infection Thus, the antibody response to many bacterial antigens was enhanced. 14, 17, 18, 21 And a set of 5 bands migrating at 22 kD do not respond to the 18 kD band Detected by sera from all five mice except B10 mice. B10 ． Serum from BR mice was examined for a 30 kD band migrating just below purified OspA. Various responses to a group of proteins that secretly migrate in concert with OspB There is. All mice responsive to the P39 band and B10. BR # 5 Mau S. has an antibody specific for flagellin (41 kD). All mice are P The response to 43 is maintained and the band moves from approximately 52 to 55 kD. B10. BR, and to a lesser extent B10. D2 has a slightly higher band at 58kD On day 12, only B10 mice respond to the 83 kD band.   The same sera collected 19 days post infection were used to blot the B31 high passages. If so, a very different pattern can be seen. In the low molecular weight range, outbred mice Only responded to the P22 band, and all mice except BALB / c responded to P17. respond. Similar reactivity to the band at 30 kD was obtained with B10. Excluding BR And all responding mice are observed. Between 31 and 39kD No responsiveness was detected and all mice respond to the P39 band. B3 In 1 low passage Western blot, P41 (flagellin), P43, or No reactivity is seen with other bands in this molecular weight range. 52-55k The response to the band at D is detectable, but p83 in this blot. No B10 response is seen for.   Immunoblots performed on sera collected 26 days after infection showed that many Continued to show an increased intensity of response to the rear antigen. P1 by B10 animals 5 bands in the 14-24 kD molecular weight range, except for a weak response to 8 In contrast, a strong response is observed in all mice. Protein at about 28 kD Responsive to quality, but this is B10. Only tested in sera from BR animals Emitted in the same molecular weight region as OspA (30 kD) There is a response to the antigen.   Variability of response to proteins in the 32-34 kD range including OspB , Was maintained on day 26. For example, outcrossing and B10. BR mouse is # Similar to B10 mice with the exception of 6 mice, with multiple bands in this region Antibody response. B10. D2 and BALB / c mice (both H-2d ), Except for BALB / c mouse # 3, which responds to a single band. Do not respond to these proteins. These proteins are H-2dMHC protein It is clear that is not effectively presented by.   All animals develop antibodies specific for the P39 band and by day 26 All B10. BR animals respond to P41 flagellin. Observed at an early point As noted, all animals respond to P43. 50 and 52 kD A minimum of signal was obtained with these sera from a pair of bands in All animals have a range of 55-65 kD molecular weight including heat shock proteins. Have antibodies to a range of proteins. At this point of infection, only B10 animals had P Respond to 83.   The final sera for this study were collected 60 days post-infection, and these sera and B3 Immunoblots using 1 low passage as antigen are performed by conventional techniques. After infection At this point, the sera of all these animals were in the low molecular weight range as previously described. Have effective antibodies specific for all five proteins in. This infection At later stages, all animals respond to proteins migrating at approximately 28 kD. The response at 30 kD remains variable among the species tested in this study.   The response to proteins migrating to the region of OspB is similar to that in the early stage, B 10 mouse # 6, and B10. More notably except D2 mice # 7 and 8, It will be consistent among species.   Again, all animals responded to the P39 band, and the animals showed P41 flagelli. Seem to respond to All animals were exposed to P43 as observed during infection. A strong response is shown. Later in this infection, all animals had about 50 and It appears to respond to a pair of bands at 52 kD, but B10. BR and B1 0. The D2 response is very weak.   A triplet of bands in the 55-65 kD molecular weight region of these mice The intensity of the signal in response to it is not constant. 60 days after infection, B10 ． D2 and BALB / c animals # 2 and # 4 (all H-2dHaplotype) With the exception of all species produce antibodies against p83.   When these sera were used as antigens to blot high passage B31 strains, Rotating patterns are very different. The only one found in the low molecular weight region of the gel The antigen is P17. Minimal response to P22 and P24 is outcross, BAL B / c and B10. Found in D2 animals, B10 and B10. BR is the base It is negative in nature. B31 bound to P17 in low and B31 high passage gels Antibodies are similar, so use these sera to detect other proteins Differences in the bacterial proteins expressed by the two B31 derivatives Show qualitative differences. Presumably, after many passages in culture, these antigens were Is not expressed by the enzyme and is expressed at very low levels or its antigenicity Structure The structure is modified so that these serum antibodies cannot bind.   These sera also failed to detect the P28 antigen, and in the OspA and OspB regions Here, various bonds are shown. All sera again detect the P39 band, but P4 1 Flagellin is not detected. In the P43 region or 52-54 kD region No responsiveness is seen, a similar binding pattern is seen in the 55-65 kD region. The ability of these sera to bind the P83 antigen is quite similar to that in low passage blots. It is the same. Generally, the same amount of immunoblot for B31 low passage and high passage was used. When compared by using the protein antigens of Sera collected 19 and 60 days from mice infected with Gudolferi were low passage Detects more antigen in quality. Antibodies detected in both lysate preparations In the original case, the signal on the low passage blot was related to 60-day serum as described above. The same reactivity detected for high passage derivatives except P17 in the Is also strong.   This is because long-term culture of Borrelia burgdorferi is Shows that it causes marked changes in the expression of most detectable bacterial antigens .Example 13-Response to a heterologous strain of Borrelia burgdorferi   5 mice that bind to low passage isolates of B. burgdorferi JD-1 strain? These sera were subjected to Western blot analysis. The results of this analysis show that these sera Show that the same antigen can be detected from different B. burgdorferi strains. 12 Serum collected on the day showed no response to the low molecular weight band of 5 values, indicating a low B31 Shown is a response to a band at 30 kD similar to that of the passage material. All ma Uss responds to the P39 band with very limited detection of P43. See P58 Responds well to the band. About low passage isolates of B31 strain using these sera The number of bands detected from JD-1 is smaller than that of all the blots and detected. The band is weak.   Sera from day 19 post-infection show variable reactivity to P17 and P18 A little stronger than the band detected by 12-day serum only with the addition detected Indicates a signal. With 26-day serum, P1 by all animals except B10 The reactivity to 7 is clear. Responses to P18 were found in these mouse species. However, B10 animals have a marginal response and B10. From BR # 6 Serum does not detect this antigen. Detection of antigens migrating directly below OspA is variable. However, all sera detect the P39 band. All of these sera were paired with P43 And give a good signal, and the reactivity to the 58-62 molecular weight antigen is more clear Is. In the case of the B31 strain used as an antigen, only the sera from B10 animals had P83. Is detected.   60 days post-infection serum blotted against low passage isolates of JD-1 strain was P1 Consistent cross-reactivity with 7 and P18 bands, but with P14, P22 and And no such binding to P24 can be detected. Moved between 28 and 35kD There was significant variability in all of the moving bands, all sera were P39 dub Ret as well as P43 antigen are detected. The reactivity for the band at 58 kD is The concordance for all sera, the bands above it, is not consistently detected. In particular , P83 are all B10 and B10. Detected by D2, BALB / c And not consistently detected by outbred sera and B10. Depending on D2 Not issued. All of these blots were obtained when the high passage B31 strain was used as an antigen. And the same serum sample for equal amounts of protein antigen, Indicates a gnoll.   Detected in serum collected 60 days after infection of JD-1 high passage isolates. The only significant reactivity seen is the anti-P39 response. 58kD of all serum Were detected marginally and only BALB / c and outbred mice detected P18. Put out. Little detection of serum antibody binding from B10 animals for P83 band Can not. This striking result indicates that high passage isolates of different species JD-1 were included in this study. Of infectious substances used in the above and how they differ from B31 strain in infected ticks Things.Example 14-Antigen capture ELISA   Antigen capture ELISA plate, both polystyrene (Immulon II) And polyvinyl chloride plate (Dynatech), Coster (Cost ar), catalog numbers 2597 and 2787) Evaluate by changing the parameters. The blocking reagents tested were BSA (1%, 1.5%, 2.5%, 5%), casein (0.5%, 1%), 0.5% boiling case 0.5% boiled casein containing 0.05% Tween 20 and 0.05% skim milk; ． 5%, 5%) (with or without 0.05% Tween 20) .   The monoclonal antibodies tested for antigen capture were OspA (184.1 and H5332), OspB [H6831], 41kd flagellin (H9724). , P60 molecule (149.1). These antibodies are Commercially available from Symbicom (Umea, Sweden).   B. burgdorferi formed in rabbits and in mice. Polyclonal antisera against hyperimmune ascites disease according to the manufacturer's instructions (Amerscha Labeled with biotin according to Amersham) and horseradish peroxy ABTS and TMB and alkaline phosphata as substrates for sidases Streptavidin of Sigma 104-105 as substrate for enzyme -Horseradish peroxidase conjugate and streptavidin-alkaline Evaluate for signal recognition with the lipophosphatase conjugate.   The method for optimal antigen capture ELISA is as follows. Polyvinyl chloride Lu well (Costar) wells with 50 μg / ml protein A MAb H5332 manufactured by Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) at 10 μg / m Coat at a concentration of l. After culturing overnight at 4 ° C, the wells were washed 3 times with 0.05% Tweezers. Wash with PBS containing 20% PBS (PBST) and 200 μl of 0.05% Tweed Add 2.5% nonfat dry milk in PBS containing 20 to each well for 1 hour at room temperature .   Borrelia laboratory strains tested in this assay were grown in BSK II, Wash 3 times with PBS before counting. 1% bovine serum albumin in PBS (BSA- Borrelia to be tested prior to the 5 × addition of PBS) to Nonidet P in 0.25% PBS. Dilute in -40 (NP40-PBS) for 10 minutes. Ixodes Dami to test Use a pestle attached to an electric drill to hold the Homogenize in 20 μl NP40-PBS in tube (Biorad). . Homogenization is facilitated by adding a small amount of sterile sand to the microtube. next Add 130 μl BSA-PBS to the nymph extract. 50 Mature Ai Damini Homogenize in μl of the NP40-PBS and add in 250 μl of BSA-PBS. Add   After the blocking step, the wells are emptied by aspiration and 50 μl of borrelia to be tested or Add tick extract to each well for 2 hours at room temperature (RT). Well then 3 times After washing with PBST, 50 μl of biotin-labeled polychlore at a concentration of 2.5 μg / mL was used. 1. Add internal rabbit serum to each well for 1 hour at RT. After culturing at RT for 1 hour , Streptavidin-horseradish at 1: 3000 dilution in BSA-PBS Add peroxidase (Amersham) to each well. Incubate at RT for 1 hour After that, the wells were washed 3 times as above and 100 μl of ABTS (key kegar Add Kirkegaard and Perry Labs. 1 After incubation for hours, the plate is read at 405 nm.   Evaluate the specificity of the ELISA against 20 strains of Borrelia burgdorferi . These strains are B31, WC-H1, NY14, NY-944, JD1, HB. 19, GA-747, PA606, PA622, PA624, WI-206, W I-210, CA4, CA5, CA-808, CA1238, UK814, IP 90, CH2223 and CH2246. In addition, Bee Harmsey, Bee Taricate, B. coriaceae, and B. percheri were evaluated. In addition, Lee Damini, I Scapularis, I Pacific, Ai Kukei, Ai Test Kingy or Ambyloma americanum in this assay.   Borrelia S.P.I., which starts the assay sensitivity at a maximum concentration of 5,000 / well Evaluate against the standard curve of Py (Borrelia spp).   First from Massachusetts [CDC, Fort Collins, CO] Ai Damini from Lab Colony 2324 is released by Bi Bergdorferi Nymphs infected or uninfected with B31, JD1 or HFA1 strains of Tested on adults. Enlarged and flat nymphs at -20 ° C in 70% ethanol After storage in, homogenize and dry or keep alive.   Antigen capture ELISA tested by B. Bergdorferi's All North American It was found to recognize the strain. The only exception is the California stock (CA123 8), this is the 52nd passage in the laboratory. Coomassie blue stained Was found to no longer produce OspA. Furthermore, WI-206 Gives a diminished signal. However, the ELISA is still infected with AIDA. It is sensitive enough to detect mini. Certifications are of British, Russian and Chinese One of the two isolates tested could not be detected. The certification is for other tested Did not recognize Lelia species. Assay sensitivity is approximately 50-200 spirochetes .   The ELISA uses a third tick extract to extract uninfected Ai damini (larvae, nymphs It is possible to distinguish those infected with B. burgdorferi from the Appropriate substances are obtained for approval tests. This test is conducted by Ai Damini and Ai Scapra. Squirrel, I Pacific, Ai Kingi or Ambyloma americanum Does not recognize tick antigens. 1000 and 1000 A. damini nymphs infected It has a Bj Burgdorferi Spirocheta between 0. Besides raw ticks, this Assays are for ticks frozen, dried at room temperature, or stored in 70% ethanol. B. Bergdorferi can also be detected.Example 15-Treatment and rechallenge experiments   As a preliminary test of a vaccine test using the B. burgdorferi antigen, By infecting with a certain species of Borrelia burgdorferi, 2 of the same species of Borrelia It was investigated whether or not it would be protected if it was exposed the second time. This "treatment and re-attack The experiment transmitted the same batch of B31-infected Ixodes damini nymph ticks It was used to do.   For this preliminary experiment, four outbred mice, BALB / c, B10, and And C3H were used. Placed up to 10 B31 infected ticks in each of these animals Infect by infection. Three weeks after the tick infestation, an ear biopsy was taken and tissue was spun. Mice were challenged for infection by culturing in BSK II medium for rocheta. To test. After one week, all mice were positive for Borrelia in culture. Systemic infection is seen in the corresponding mice. Infected mice then drink Treat with tetracycline 1 mg / mL in water for 2 weeks. Antibiotics are light sensitive Therefore, the tetracycline water is changed 3 times a week.   After antibiotic treatment, a second ear biopsy was taken and the mice were culture negative and infected. Proved healed. These mice were then challenged with 10 B31 infected ticks Re-attack by invading. After the ticks sucked blood and enlarged, they were collected Presence of spirochetes by dissection, immunofluorescence with polyclonal antisera To test.   Mice are examined for infection 3 weeks after the second tick challenge. This is Similarly, an ear biopsy is taken and the tissue is cultured in BSK II medium. The results of this experiment are shown in Table V below. The result is that even if the mouse is of the same species, Reinfection is similar if infected with Lelia. Furthermore, reinfection The non-existent mice probably sucked more than 40% of the ticks sucking blood as a result of sucking the immunized animals. The above indicates that the infection has been removed. This conclusion is a naive control of the same age. No significant elimination was observed in ticks fed in mice, Are based on the observation that they were all infected. Example 16-Monoclonal antibody   B cell fusion of a monoclonal antibody against the antigen of Borrelia burgdorferi B blast source of B. burgdorferi by contact with infected ticks It is a spleen cell derived from a mouse infected with. These mice are infected and It is cured by administration of cleanse (Example 15), and it is again contacted with the infected tick. Spleen cells are harvested 5-7 days after the second contact (after the ticks have fallen).   Perform two rounds of B cell fusions and screen approximately 1000 independent B cell hybridomas. To learn. The first fusion was a BALB / c mouse fused with B-cell lymphoma, P3X Immune B cells from 63Ag8 are used. This fusion involves the BALB / c anti-B31 And name it BB31. 6 monoclonal antibodies isolated from this fusion 2 In the second fusion, C57B1 / 10 (B10) mice were immunized with B cells by the same method. Use as. This fusion is designated B10B31 with respect to B10 anti-B31. Five additional monoclonal antibodies are isolated from this fusion. These antibodies and And its specificity is summarized in Table VI.                                   Table VI         Monoclonal antibody                Molecular weight of detection band         BB31-42.1 75kD         BB31-109.1 30kD         BB31-77.9 35kD         BB31-290.1 22kD         BB31-292.9 18kD         BB31-426.1125 and 55 kD         B10B31-64.4 36kD         B10B31-103.1 55kD         B10B31-158.6 70kD         B10B31-221.1 17kD   Various modifications and alterations of the present invention are also included in the above specification and will be apparent to those skilled in the art. it is conceivable that. Such modifications and variations to the compositions and methods of the present invention are also It is considered to be within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/12 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０７／９９２，８９６ (32)優先日 1992年12月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ゴールド，ウイリアム・ティー アメリカ合衆国コロラド州80304、ボール ダー、オーク・アベニュー2076番 (72)発明者 レーリッヒ，ジョン・ティー アメリカ合衆国コロラド州80526、フォー ト・コリンズ、ウォーレンバーグ・ドライ ブ1800番 (72)発明者 バーコット，トーマス アメリカ合衆国コロラド州80526、フォー ト・コリンズ、オーク・アベニュー1400番 (72)発明者 ピースマン，ジョセフ・エフ アメリカ合衆国コロラド州80524、フォー ト・コリンズ、イー・エリザベス・ストリ ート210番 (72)発明者 ジョンソン，バーバラ・ジェイ・ビー アメリカ合衆国コロラド州80525、フォー ト・コリンズ、ブルックウッド・プレイス 2939番 (72)発明者 メイヤー，レオナルド・ダブリュ アメリカ合衆国コロラド州80525、フォー ト・コリンズ、ノアウッド1713番 (72)発明者 キーン，マーク・ジー アメリカ合衆国ニュージャージー州08822、 フレミントン、メドウ・レーン９番 (72)発明者 ハント，アン・アール アメリカ合衆国コロラド州80526、フォー ト・コリンズ、ウォーレンバーグ・ドライ ブ1800番─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI C07K 16/12 8318-4H C12N 15/02 C12P 21/00 A 9282-4B 21/08 9358-4B G01N 33 / 569 A 8310-2J // (C12P 21/00 C12R 1:01) (C12P 21/08 C12R 1:91) (31) Priority claim number 07 / 992,896 (32) Priority date December 18, 1992 (33) Priority claiming country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), AU, CA, JP, US (72) Inventor Gold, William T. Colorado, USA 80304, Boulder, Oak Avenue 2076 (72) Inventor Lerich, John T. -Inventor Burcott, 1800 (72), Warrenberg Drive, Fort Collins, 80526, Colorado, United States Burcott, Thomas 1400 (72), Fort Collins, Oak Avenue, Colorado 80526, USA Inventor Peasman, Joseph F United States Colorado 80524, Fort Collins, E Elizabeth Street No. 210 (72) Inventor Johnson, Barbara Jay Bee United States Colorado 80525, Fort Collins, Brookwood Place 2939 (72) ) Inventor Mayer, Leonardo W. Colorado 80525, Fort Collins, Noorwood 1713 (72) Inventor Keen, Mark Gee, New Jersey 08822, Flemington, Meadow Lane 9 (72) Inventor Hunt, Anne Earl Warrenburg Drive # 1800, Fort Collins, 80526, Colorado, United States of America

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．マダニを介した伝播により調節され、分化することを特徴とする単離され たビイ・バーグドルフェリ抗原。 ２．非主要組織適合複合体制限性であることを特徴とする請求項１記載の抗原 。 ３．ビイ・バーグドルフェリＢ３１株に由来する請求項２記載の抗原。 ４．さらに、ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株と交差反応性であることを特 徴とする請求項３記載の抗原。 ５．ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株と異種であることを特徴とする請求項 ３記載の抗原。 ６．ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株に由来する請求項２記載の抗原。 ７．さらにビイ・バーグドルフェリＢ３１株と交差反応性であることを特徴と する請求項６記載の抗原。 ８．ビイ・バーグドルフェリＢ３１株と異種であることを特徴とする請求項６ 記載の抗原。 ９．主要組織適合複合体制限性であることを特徴とする請求項１記載の抗原。 10．ビイ・バーグドルフェリＢ３１株に由来する請求項９記載の抗原。 11．さらにビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株と交差反応性であることを特徴 とする請求項１０記載の抗原。 12．ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株と異種であることを特徴とする請求項 １０記載の抗原。 13．ビイ・バーグドルフェリＪＤ−１株に由来する請求項９記載の抗原。 14．さらに、ビイ・バーグドルフェリＢ３１株と交差反応性であることを特徴 とする請求項１３記載の抗原。 15．ビイ・バーグドルフェリＢ３１株と異種であることを特徴とする請求項１ ３記載の抗原。 16．マダニに刺されることによりボレリア・バーグドルフェリに感染したヒト または動物において、安定な防御抗体応答を惹起することによるライム病に対す る予防能または防御能を有することを特徴とする請求項１記載の抗原。 17．マダニ媒介体から単離されるかまたは由来する請求項１記載の抗原。 18．単離がビイ・バーグドルフェリに感染した宿主ヒトまたは動物に侵襲した マダニを用いて行われる抗原であって、増殖培地中、in vitro培養を行うことな く、マダニを宿主に対して所望により１回以上継代してもよい請求項１６記載の 抗原。 19．マダニから宿主へのサイクルをわずか６継代で、増殖倍地中にて培養する 請求項１６記載の抗原。 20．継代数が１回である請求項１９記載の抗原。 21．ビイ・バーグドルフェリに感染したマダニ侵襲のヒトまたは動物から得ら れた血清またはＴ細胞により認識される請求項１記載の抗原。 22．１種以上のビイ・バーグドルフェリ株と交差反応性である請求項１記載の 抗原。 23．マダニ媒介体から単離されたビイ・バーグドルフェリｃＤＮＡから調製さ れる請求項１記載の抗原。 24．ビイ・バーグドルフェリ感染マダニに由来するＰＣＲ遺伝子バンクから調 製される請求項１記載の抗原。 25．選択されたポリペプチドまたはタンパク質と所望により融合していてもよ い請求項１記載の抗原。 26．ポリペプチドまたはタンパク質が、ボレリア抗原ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ 、他のボレリア抗原、他の微生物由来のタンパク質またはポリペプチドからなる 群より選択される請求項２５記載の抗原。 27． （ａ）分子量が約１８ｋｄであり； （ｂ）非ＭＨＣ制限的であり； （ｃ）マダニに剌されることにより感染したヒトまたは動物において安定な抗 体応答の誘起能を有し； （ｄ）ボレリア・バーグドルフェリ株間で交差反応性である、マダニに剌され ることにより感染したヒトまたは動物において抗体応答の誘起能を有する ことを特徴とする単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原Ｐ１８。 28．マダニ中のビイ・バーグドルフェリの増殖により調節または分化される請 求項２７記載の抗原。 29． （ａ）分子量が約４３ｋｄであり； （ｂ）非ＭＨＣ制限的であり； （ｃ）マダニに剌されることにより感染したヒトまたは動物において安定な抗 体応答の誘起能を有し； （ｄ）ボレリア・バーグドルフェリ株間で交差反応性である、マダニに刺され ることにより感染したヒトまたは動物において抗体応答の誘起能を有することを 特徴とする単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原Ｐ４３。 30．マダニにおけるビイ・バーグドルフェリの増殖により調節または分化され る請求項２９記載の抗原。 31． （ａ）分子量が約１７ｋｄであり； （ｂ）Ｂ３１に関して非ＭＨＣ制限性であり； （ｃ）ＪＤ−１に関して非ＭＨＣ制限性であり； （ｄ）マダニに剌されることにより感染したヒトまたは動物において安定な抗 体応答の誘起能を有し； （ｅ）ボレリア・バーグドルフェリ株間で交差反応性である、マダニに刺され ることにより感染したヒトまたは動物において抗体応答の誘起能を有する ことを特徴とする単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原Ｐ１７。 32．マダニにおけるビイ・バーグドルフェリの増殖により調節または分化され る請求項３１記載の抗原。 33． （ａ）分子量が約３９ｋｄであり； （ｂ）非ＭＨＣ制限性であり； （ｃ）マダニに剌されることにより感染したヒトまたは動物において安定な抗 体応答の誘起能を有し； （ｄ）ボレリア・バーグドルフェリ株間で交差反応性である、マダニに刺され ることにより感染したヒトまたは動物において抗体応答の誘起能を有する ことを特徴とする単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原Ｐ３９。 34．マダニにおけるビイ・バーグドルフェリの増殖により調節または分化され る請求項３３記載の抗原。 35．適当なヒトまたは動物に、マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増 殖により調節および分化された単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原を投与す ることからなるビイ・バーグドルフェリ抗原に対する抗体の産生法。 36．抗原が、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ４３、Ｐ３９、Ｐ２４、Ｐ２２、Ｐ１４、Ｐ ２９、Ｐ３２、Ｐ８３、Ｐ５２〜６５、Ｐ４１、Ｐ２８、Ｐ３４およびＰ３０か らなる群より選択される請求項３５記載の方法。 37．適当なヒトまたは動物に、マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増 殖により調節および分化された単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原を投与す ることにより産生される抗体。 38．抗原が、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ４３、Ｐ３９、Ｐ２４、Ｐ２２、Ｐ１４、Ｐ ２９、Ｐ３２、Ｐ８３、Ｐ５２〜６５、Ｐ４１、Ｐ２８、Ｐ３４およびＰ３０か らなる群より選択される請求項３７記載の抗体。 39．ボレリア・バーグドルフェリ抗原に対するモノクローナル抗体であって、 第VI表の抗体からなる群より選択される抗体。 40．有効量の少なくとも１種の単離された、マダニ媒介体中、ビイ・バーグド ルフェリの増殖により調節および分化されたビイ・バーグドルフェリ抗原および 医薬上許容される担体からなるワクチン組成物。 41．組成物が少なくとも１種の他のビイ・バーグドルフェリ抗原からなる請求 項４０記載の組成物。 42．抗原がＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、３９ｋｄ抗原、およびそのフラグメントまた は変異種からなる群より選択される請求項４１記載の組成物。 43．抗原が融合タンパク質の形態である請求項４０記載の組成物。 44．ヒトまたは動物に、有効量の少なくとも１種の単離された、マダニ媒介体 中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化されたビイ・バーグド ルフェリ抗原からなる組成物を投与することからなる、ビイ・バーグドルフェリ での感染に対するヒトまたは動物の予防接種法。 45．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた少なくとも１種の単離されたボレリア・バーグドルフェリ抗原および任意の 少なくとも１種の他のビイ・バーグドルフェリ抗原を適当なヒトまたは動物に投 与することにより産生される抗体を、診断されるべきヒトまたは動物からの生物 学的液体の試料と共に培養する工程からなるヒトまたは動物におけるライムボレ リオ症の診断方法であって、ビイ・バーグドルフェリの存在下、抗原−抗体複合 体を形成し、続いて該複合体の存在について該液体試料を分析する診断方法。 46．抗原がＰ３９、Ｐ４３、Ｐ１７およびＰ１８である請求項４５記載の方法 。 47．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた単離されたビイ・バーグドルフェリおよび任意の少なくとも１種の他のビイ ・バーグドルフェリ由来の抗原をヒトまたは動物からの生物学的液体の試料と共 に培養する工程からなるヒトまたは動物におけるライムボレリオ症の診断方法で あって、ビイ・バーグドルフェリ感染の結果として、該液体中に存在する抗体が 該抗原と抗原−抗体複合体を形成し、続いて該複合体の存在を測定するのに該液 体を分析する方法。 48．抗原がＰ３９、Ｐ４３、Ｐ１７およびＰ１８である請求項４７記載の方法 。 49．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた少なくとも１種の単離されたボレリア・バーグドルフェリ抗原および任意の 少なくとも１種の他の抗原を適当なヒトまたは動物に投与することにより産生さ れる少なくとも一種の抗体またはビイ・バーグドルフェリ由来の抗原に対する抗 体と、適当な医薬担体とからなるライム病のヒトまたは動物を治療するのに有用 な治療組成物。 50．少なくとも２種の抗体からなる請求項４９記載の組成物。 51．抗Ｐ１８抗体、抗Ｐ４３抗体、抗Ｐ１７抗体および抗Ｐ３９抗体からなる 請求抗４９記載の組成物。 52．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた少なくとも１種の単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原および担体からな るビイ・バーグドルフェリ感染に対してヒトまたは動物の防御能を有するワクチ ン組成物。 53．さらに別のビイ・バーグドルフェリ抗原からなる請求項５２記載のワクチ ン組成物。 54．Ｐ４３、Ｐ３９、Ｐ１７およびＰ１８からなる請求項５３記載のワクチン 組成物。 55．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた少なくとも１種の単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原からなるヒトまた は動物におけるビイ・バーグドルフェリによる感染を診断するためのキット。 56．マダニ媒介体中、ビイ・バーグドルフェリの増殖により調節および分化さ れた少なくとも１種の単離されたビイ・バーグドルフェリ抗原との結合能を有す る少なくとも１種の抗体からなるヒトまたは動物におけるビイ・バーグドルフェ リによる感染を診断するためのキット。[Claims]   1. Isolated characterized by being regulated by tick-borne transmission and differentiating B. Bergdorferi antigen.   2. Antigen according to claim 1, characterized in that it is non-major histocompatibility complex restricted. .   3. The antigen according to claim 2, which is derived from the B. burgdorferi B31 strain.   4. Furthermore, it is characterized by being cross-reactive with the B. burgdorferi JD-1 strain. The antigen according to claim 3, which is used as a signature.   5. A heterologous strain with the B. burgdorferi JD-1 strain. 3. The antigen according to 3.   6. The antigen according to claim 2, which is derived from the B. burgdorferi JD-1 strain.   7. Furthermore, it is characterized by being cross-reactive with the B. burgdorferi B31 strain. The antigen according to claim 6.   8. 7. Heterologous to the B. burgdorferi B31 strain. The described antigen.   9. Antigen according to claim 1, characterized in that it is major histocompatibility complex restricted.   Ten. The antigen according to claim 9, which is derived from B. burgdorferi B31 strain.   11. Furthermore, it is characterized by being cross-reactive with the B. burgdorferi JD-1 strain. The antigen according to claim 10.   12. A heterologous strain with the B. burgdorferi JD-1 strain. 10. The antigen according to 10.   13. The antigen according to claim 9, which is derived from the B. burgdorferi JD-1 strain.   14. Furthermore, it is characterized by being cross-reactive with the B. burgdorferi B31 strain. The antigen according to claim 13.   15． 2. Heterologous to B. Bergdorferi B31 strain. 3. The antigen according to 3.   16. Human infected with Borrelia burgdorferi by being bitten by a tick Or against Lyme disease by eliciting a stable protective antibody response in animals The antigen according to claim 1, which has a preventive or protective ability.   17． The antigen of claim 1 isolated or derived from a tick vector.   18. Isolation invaded host human or animal infected with B. burgdorferi It is an antigen that is carried out using ticks and should not be cultured in vitro in a growth medium. 17. The tick may be subcultured to the host one or more times if desired. antigen.   19. Cultivate in the medium of multiplication for only 6 passages from tick to host The antigen according to claim 16.   20. The antigen according to claim 19, which has a single passage number.   twenty one. Obtained from tick-infested humans or animals infected with B. burgdorferi The antigen according to claim 1, which is recognized by the collected serum or T cells.   22. The method according to claim 1, which is cross-reactive with one or more B. burgdorferi strains. antigen.   twenty three. Prepared from B. burgdorferi cDNA isolated from tick vector The antigen according to claim 1, which is   twenty four. From PCR gene bank derived from ticks infected with B. burgdorferi The antigen according to claim 1, which is produced.   twenty five. May optionally be fused to a selected polypeptide or protein The antigen according to claim 1.   26. The polypeptide or protein is the Borrelia antigens OspA and OspB , Other Borrelia antigens, proteins or polypeptides from other microorganisms 26. The antigen of claim 25 selected from the group.   27.   (A) has a molecular weight of about 18 kd;   (B) non-MHC restricted;   (C) Stable resistance in humans or animals infected by being treated by ticks Has the ability to induce body response;   (D) Cross-reactive between Borrelia burgdorferi strains, treated by ticks Have the ability to induce antibody responses in infected humans or animals An isolated B. burgdorferi antigen P18, which is characterized in that   28. Contract regulated or differentiated by the growth of B. burgdorferi in ticks The antigen according to claim 27.   29.   (A) has a molecular weight of about 43 kd;   (B) non-MHC restricted;   (C) Stable resistance in humans or animals infected by being treated by ticks Has the ability to induce body response;   (D) A tick bite that is cross-reactive between Borrelia burgdorferi strains To induce an antibody response in infected humans or animals. Characterized isolated B. burgdorferi antigen P43.   30. Regulated or differentiated by growth of B. burgdorferi in ticks The antigen according to claim 29.   31.   (A) has a molecular weight of about 17 kd;   (B) non-MHC restricted with respect to B31;   (C) non-MHC restricted with respect to JD-1;   (D) Stable resistance in humans or animals infected by being treated by ticks Has the ability to induce body response;   (E) A tick bite that is cross-reactive between Borrelia burgdorferi strains Have the ability to induce antibody responses in infected humans or animals An isolated B. burgdorferi antigen P17, which is characterized in that   32. Regulated or differentiated by growth of B. burgdorferi in ticks The antigen according to claim 31.   33.   (A) has a molecular weight of about 39 kd;   (B) is non-MHC restricted;   (C) Stable resistance in humans or animals infected by being treated by ticks Has the ability to induce body response;   (D) A tick bite that is cross-reactive between Borrelia burgdorferi strains Have the ability to induce antibody responses in infected humans or animals An isolated B. burgdorferi antigen P39, which is characterized in that   34. Regulated or differentiated by growth of B. burgdorferi in ticks 34. The antigen according to claim 33.   35. Appropriate humans or animals will be enriched with B. burgdorferi in the tick vector. Administration of isolated B. burgdorferi antigens regulated and differentiated by breeding A method for producing an antibody against B. burgdorferi antigen consisting of   36. Antigen is P17, P18, P43, P39, P24, P22, P14, P 29, P32, P83, P52-65, P41, P28, P34 and P30 36. The method of claim 35 selected from the group consisting of:   37. Appropriate humans or animals will be enriched with B. burgdorferi in the tick vector. Administration of isolated B. burgdorferi antigens regulated and differentiated by breeding An antibody produced by   38. Antigen is P17, P18, P43, P39, P24, P22, P14, P 29, P32, P83, P52-65, P41, P28, P34 and P30 38. The antibody of claim 37 selected from the group consisting of:   39. A monoclonal antibody against the Borrelia burgdorferi antigen, An antibody selected from the group consisting of the antibodies in Table VI.   40. B. burgd in an effective amount of at least one isolated tick vector B. burgdorferi antigens regulated and differentiated by Rufeli growth and A vaccine composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.   41. Claims wherein the composition comprises at least one other B. burgdorferi antigen Item 40. The composition according to Item 40.   42. The antigen is OspA, OspB, 39kd antigen, and fragments thereof, 42. The composition of claim 41, wherein is selected from the group consisting of mutants.   43. 41. The composition of claim 40, wherein the antigen is in the form of a fusion protein.   44. An effective amount of at least one isolated tick tick vector for humans or animals Inside, B. Bergdorf regulated and differentiated by the growth of B. Bergdorferi B. Bergdorferi consisting of administering a composition consisting of a ruferi antigen Vaccination of humans or animals against infections in.   45. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector At least one isolated Borrelia burgdorferi antigen and any At least one other B. burgdorferi antigen is administered to a suitable human or animal. An antibody produced by giving an organism from a human or animal to be diagnosed In humans or animals consisting of culturing with a sample of biological fluid A method for diagnosing liosis, which comprises: A diagnostic method of forming a body and subsequently analyzing the liquid sample for the presence of the complex.   46. 46. The method of claim 45, wherein the antigens are P39, P43, P17 and P18. .   47. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector Isolated B. burgdorferi and any at least one other bii -Coupling of antigens from Burgdorferi with samples of biological fluids from humans or animals. A method for diagnosing Lyme borreliosis in humans or animals, which comprises the step of culturing So, as a result of B. burgdorferi infection, the antibodies present in the liquid The solution is used to form an antigen-antibody complex with the antigen and subsequently to determine the presence of the complex. How to analyze the body.   48. 48. The method of claim 47, wherein the antigens are P39, P43, P17 and P18. .   49. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector At least one isolated Borrelia burgdorferi antigen and any Produced by administering at least one other antigen to a suitable human or animal. Antibodies against at least one antibody or antigen derived from B. burgdorferi Useful for treating humans or animals with Lyme disease consisting of the body and a suitable pharmaceutical carrier Therapeutic composition.   50. 50. The composition of claim 49, comprising at least two antibodies.   51. Consists of anti-P18 antibody, anti-P43 antibody, anti-P17 antibody and anti-P39 antibody A composition according to claim 49.   52. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector Selected from at least one isolated B. burgdorferi antigen and a carrier. Protecting human or animal against B. burgdorferi infection Composition.   53. 53. The vacci according to claim 52, which further comprises another B. burgdorferi antigen. Composition.   54. 54. The vaccine of claim 53, which comprises P43, P39, P17 and P18. Composition.   55. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector A human comprising at least one isolated B. burgdorferi antigen Is a kit for diagnosing B. burgdorferi infection in animals.   56. Regulated and differentiated by the growth of B. burgdorferi in the tick vector Has the ability to bind to at least one isolated B. burgdorferi antigen B. Burgdorf in humans or animals comprising at least one antibody A kit for diagnosing infections caused by li.
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