JPH08503133A - 核酸試料の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分析のため、核酸試料を処理する方法は対応する１つ又は複数のセットの容器(13；15；17)と協同するようにした多数の個々の固相要素(11)を持つ１つ又はそれ以上のマニホルド(10)の使用を含む。試料中の核酸種は各々の固層要素(11)に、１つ又は複数の試料を含む容器又は容器のセット(13；15；17)の中に固相要素を導入することにより結合させる。場合により、結合した核酸種は第二の１つ又は複数のセットの容器中で処理することができ、そしてその中の反応生成物は第二の１つ又は複数のマニホルドの固相要素(11)に結合させることができる。次いで第一又は第二のマニホルドの固相要素(11)を分析器のーつ又は複数の試料容器の中に核酸種又は反応生成物を分析するため導入し、そこで核酸種又は反応生成物は固相要素(11)からはずされる。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸試料の処理方法 本発明は核酸の分析に関し、そしてより詳しくは分析操作のための又はその一 部としての核酸試料の処理方法に関する。 核酸配列に関わる研究室的方法は現在では極めて一般的であり、そしてしばし ば通常の事柄として行われている。そのような方法はとりわけハイブリッド形成 及び酵素反応を含む。 通常の類いのそのような方法は増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応又はＰ ＣＲと略称される反応である。周知のように、このＰＣＲ法は２つの周囲のプラ イマー配列を特徴とする特異なＤＮＡセグメントに高度に特異的な増幅をもたら す。それにより、ＰＣＲは、とりわけヌクレオチド配列決定のためのＤＮＡの十 分な量を得る便利な方法を提供する。ＰＣＲの１つの主要な応用は診断目的のた めである。ＰＣＲの記述については、例えばWhite，T.等、Trendsin Genetics， ５巻、179ページ、1989年が参照される。 分子遺伝学反応に関連して広く使用されている固体支持体はこれまでのところ 、それにより大きな合計面積が得られること及びその簡略化された取扱い及び処 理方法の理由から常磁性ビーズであった。従って、例えばストレプトアビジンが 固定化されたそのような磁性ビーズは商業的に入手することができる。 しかしながら、例えば磁性ビーズを固相として使用する逐次反応工程を通じて 多くの試料を同時に処理することが技術的に求められており、そしてこれは反応 相互間の汚染の実質的な危険を伴うものである。これはもちろん、汚染配列の増 加が起こり得るＰＣＲのような増幅が起こる状況下では特に望ましくないことで ある。 DD-A-279 506は化学分解による固相上のＤＮＡ配列決定（マクサム−ギルバー ト法）のための多数のとがった先端を有する装置の使用を開示している。この装 置は一組のロッドを持ち、その各々には固定化プライマーが付着しており、この ロッドは一組の反応容器の中に差し込まれるように設計されている。配列決定が なされる標識したＤＮＡ断片は、ロッドをＤＮＡ断片を含むそれぞれの容器に浸 すことによりロッドに固定化される。固定化されたＤＮＡ断片のその先の処理は ロッドを対応する試薬及び溶液を含む容器に浸すことにより進められ、そしてそ れぞれの塩基特異試薬により分解されたＤＮＡ断片を含むそれぞれの容器の内容 物は凍結乾燥され、次いでゲル電気泳動にかけられる。 Rosentahl等により上記文献で提唱された多数のとがった先端を有する装置の 使用は、例えば常磁性ビーズ又はマイクロタイターウェルのような別々の固相要 素の使用に関連するいくつかの問題を上手に回避していることが容易に理解され る。しかしながら、この「パトリックス−マトリックス」型処理法の問題点は、 その適用を制限することになる、個々のとがった先端が十分な結合能力を具える ことであった。 これに関連して、固体支持体のセット(パトリックス)が対応する反応ウェルの セット(マトリックス)と協同して動くのを可能にする同様の「パトリックス−マ トリックス」戦略は以前ぺプチド合成に適用されていることを挙げることができ る。もちろん、多数の試料の同時処理が可能な型の多数のとがった先端のある固 体支持体も免疫検定法に適用される物が市販されている。 従って、上述の多数のとがった先端を有する装置を使用する核酸 試料の操作は、著しく操作を簡略化し、そしてかなりな程度まで混同と汚染の危 険を減らすことができるが、それでもなお、反応生成物を固体支持体からはずし 、そしてそれを問題の分析装置に移す比較的厄介な操作が残る。 本発明においては、核酸試料の分析において多数のとがった先端の固体支持体 の使用におけるもう一段の改良が提唱されており、その改良とは分析される反応 生成物の固体支持体からの放出が直接問題の分析器の中に向けてなされ、それに よりとりわけ試料適用のための面倒なピペット取扱い操作をなくすことができる ように多数のとがった先端のある装置を適合させることである。同じように重要 なことであるが、これは核酸試料の固体支持体への吸着から脱着へ、又は支持体 上の反応生成物の分析器例えば電気泳動ゲルに至るすべての処理のため、単一の 又は一連の固相のセットを使用することを可能にする。このようなフォーマット は複雑な試料からの標的分子の分離から最終の分析工程に至る逐次反応工程を経 る多数の試料の平行及び連続移動を相当に簡略化し、その一方試料間の混同及び 汚染の危険を実質的に減らし得ることが容易に認識される。 従って本発明は対応する１つ又は複数のセットの容器と協同するようにした多 数の個々の固相要素を持つ１つ又は複数のマニホルドを準備し、試料からの核酸 種を第一の１つ又は複数のマニホルドの各々の固相要素に、固相要素を前記１つ 又は複数の試料を含む第一の容器又は容器のセットに導入することにより結合さ せ、場合により固相要素を第二の１つ又は複数のセットの容器に導入することに より、各々の核酸種をそれが固相要素に結合している間に処理し、場合により第 二の１つ又は複数のマニホルドの固相要素を前記第に の容器に導入してそこに生成した１つ又は複数の種を固相要素に固定化し、そし て固相要素を分析器の放出に必要な環境を与える１つ又は複数の試料容器に導入 することにより、核酸種又は反応生成物を１つ又は複数のマニホルドの固相要素 から分析装置へ核酸種又は反応生成物を分析するため放出する工程からなる、分 析のための核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）試料の処理方法を提供する。 本明細書で使用する用語「分析器」は広義に解釈すべきである。従って、分析 器は実際の分析装置である必要はなく、例えば着色反応を視覚などにより検出す るマイクロタイターウェルのセットであってよい。 分析される材料のマニホルド固相要素から分析器への放出又は脱着のために必 要な環境及び条件は放出される特定の種及び特定の分析器により変化する。例え ば、ゲル電気泳動からなるＤＮＡ配列分析の場合、マニホルドはその固相要素が 電気泳動ゲル板の試料ウェルに具合よく導入され、そこで合成された核酸鎖のウ ェル脱着が、例えばホルムアミド、熱及び／又はアルカリのような変性pHのよう な変性剤によりなされるように設計される。 固相要素は本発明の範囲内の種々の方法で得ることができる。１つの実施態様 においては、それらはプレート要素の表面から伸びるとがった先端すなわちピン である。そのような系は、例えば慣用のタイプであってよい96ウェルのマイクロ タイタープレートのウェルに差し込まれるようにした幾つかの例えば96のとがっ た先端を持つことができる。他の実施態様においては、マニホルドは例えば４つ 、８つ又はそれより多くのとがった先端を持つ櫛型要素である。適切には、マニ ホルドは２つ又はそれより多くのマニホルドを相互に接 続しそして１つが他の後ろにあるように一緒に組み合わせてとがった先端が数列 をなすマニホルド集成体を作るか、及び／又は横並びの関係で相互に接続するよ うに設計される。さらにもう１つの実施態様においては、固相要素は多数の反応 容積をそれによって決める第二のプレート手段中のそれぞれの部分(例えば凹み) と協同するようにした第一のプレート手段の限定された表面部分である。 前記核酸種の固相要素への結合を可能にするため、それ自身核酸種と相互作用 する能力のある分子又は基、又は核酸種に組み込まれる官能基又は分子を固相表 面に固定化する。 前者の場合、固相表面はオリゴヌクレオチドを支持すること、例えば固相に共 有結合することができ、このオリゴヌクレオチドは核酸種とハイブリッドを形成 すること又はそれに結紮することが可能である。 後者の場合、核酸に組み込まれる官能基は特異的結合対の一員であることがで き、他の一員は固相により支持されている。そのような結合対の例はビオチン− アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、システイン−チオール基、抗原−抗 体、レクチン−糖である。このような関係において特に有用な結合対はビオチン −アビジン(又はストレプトアビジン)である。ＤＮＡを固相に固定化するためそ のような特異的結合対の使用は例えばWO 89／099282に記述されており、これは プラスミド又はファージベクターのＤＮＡ鎖の１つの中に官能基を選択的に組み 込み、次いでこのべクターを固体支持体に官能基を介して直接固定化し、そして その後非結合ＤＮＡ鎖を適当な条件で選択的に溶離することによる配列決定目的 のため一本鎖ＤＮＡ鋳型の不溶性担体への固定化を開示している。 本発明の目的にとって、固相要素は表面を多孔質粒子でコートすることにより 、増加した表面負荷を可能にする実質的に拡げられた表面積を備えることができ るので有利である。接着剤を使用することなく表面に粒子を付着させることを含 む適当なコーティング方法は本出願人の同時に出願した「表面改質の方法」とい う名称の国際特許出願(ＰＣＴ)(スウェーデン特許出願9203319−0に基づく)に記 述されており、その開示は参照により本明細書に組み入れる。そのような固相要 素の粒子コーティングは意図する目的にとって充分な結合能力の達成を容易にも たらすものである。 上述の標的分子を固相要素へ固定化するための「釣り上げ」処理法は簡単で能 率のよい核酸分子の精製及び／又は極めて複雑で粗製の試料からでさえ特定の標 的分子の富化を可能にし、特別な精製工程をなくするものである。 一般の態様においては、本発明の方法は次の工程：（ｉ）試料採取；（ii）所 望の核酸物質の選択及び任意の増幅；（iii）核酸物質の任意の処理；及び（iv ）分析装置（分析器）例えば電気泳動ゲルの適用からなり、その間に適当な洗浄 を挿入することができる。 選択は典型的には問題の核酸物質例えばＤＮＡの一本鎖が、固相に固定化され 得るもう一つの分子に選択的且つ強力に結合するような特異的化学基を持つか又 は供給されるように行う。そのような相互作用する分子又は基、すなわち特異的 結合対の例は既に上で述べたビオチン−ストレプトアビジン及び２つのハイブリ ッドを形成するか又は結紮する一本鎖ＤＮＡ分子である。従って固相及び標的分 子の間の相互作用は非共有結合だけでなく共有結合の型のこともある。 特異的化学基は、例えば問題の核酸物質の鎖の一本に相補的であり、そして５ '−末端に特異的化学基を与えられたオリゴヌクレオチド(プライマー)を作るこ とにより導入することができる。次いでこのプライマーはその相補的な鎖とハイ ブリッドを形成し、その後４つのヌクレオチド(dNTP)及びＤＮＡ依存性ポリメラ ーゼの存在下で伸長させることができる。そのプライマーを第二のプライマーと 組み合わせると、それ自体この技術分野で公知の例えばＰＣＲによる同時の増幅 及び選択を達成することができる。 このように特異的化学基で末端標識した核酸物質は次いでマニホルドの固相要 素に結合させることができ、この固相要素は各々上述のプライマーの特異的化学 基と相互作用することができる分子又は基、すなわち特異的結合対の他の要素を 支持する。この方法により、選択並びに富化及び能率のよい洗浄の可能性が得ら れる。 ある場合にはマニホルドを連続して使用することができる。例えば、第一のマ ニホルド(又はセット)を標的分子を複雑な試料から釣り上げるために使用するこ とができる。次いで固定化された分子を処理して反応溶液中に１つ又は複数の所 望の種を生成させることができる。次いでこの１つ又は複数の種を第二のマニホ ルド（又はセット）に固定化してさらに上述のように処理することができる。場 合により、この操作を異なるマニホルド(又はセット)を使用して１回又は複数回 繰り返し、結局１つ又は複数の所望の種を分析することができる。 マニホルドは上述のように、例えば櫛型手段、とがった先端又は歯であること ができ、この物は前記固相要素を代表しそして適当な表面特性(親水性、利用可 能な表面積など)並びに上述の所望の相互 作用基を有している。 上述のように結合した核酸物質は、次いで所望により、固相要素又はとがった 先端を適当な内容物のあるウェルの中に導入することにより種々な化学的環境に 当てることができる。個々のとがった先端は共通の担体と一体であるから、所望 の数の個々のとがった先端をそれぞれ動かし、そしてそれぞれのウェルの中に導 入することにより個々に処理することができる。典型的には、この処理は各々の 固定化された核酸物質(鋳型)上に相補的分子を合成することからなる。次にこれ らの相補的分子をそれぞれのとがった先端から、それを適当な環境に当てること により脱着し、これに直接つなげてこれらのはずされた相補性分子について引き 続き分析を行う。例えばゲル電気泳動の場合、マニホルド例えば既述の櫛型手段 は、異なる固相要素又はとがった先端が電気泳動ゲル板のウェルの中に差し込ま れて、そこで脱着過程が起こるように設計される。 マニホルド及び容器セットについては、ここで添付の図面を参照しながら説明 する。すなわち 図１は櫛型マニホルドの正面図であり、 図２は２つの長く伸びたウェルを持つウェルストリップの断面略図であり、 図３は図２のウェルストリップの上面略図であり、 図４は８つのウェルを持つウェルストリップ断面略図であり、 図５は図４のウェルストリップの平面略図であり、 図６は分析装置の試料ウェルと共に整列させた図１のマニホルドを示す正面略 図であり、そして 図７は４つのセット及びウェルの３つに異なるセットの透視略図 である。 櫛型マニホルドは図１に略図を以て、表示番号１により概略的に例示され、こ の物は８つのとがった先端又は歯２を持つ。歯２の形及びそれらの間隔は電気泳 動装置の試料ウェルに合わせてあり、これについては以下でより詳しく説明する 。図において、歯２はシェーディング３で示すように誘導体化されており、例え ば本出願人の前述の同時係属中の国際特許出願(ＰＣＴ)及び下記の実施例１に既 述するようにアビジン結合粒子でコートされている。 マニホルド１は対応するウェルセットと協同するように設計されており、ウェ ルセットの２つの異なる態様はそれぞれ図２、３及び４、５に示す。図２及び３ のウェルセットは２つの長く伸びたウェル４を持ち、各々は４つのマニホルドの 歯２を受け容れることができる。例示の場合においては、ウェル４は試薬溶液５ で部分的に満たされている。一方、図４、５に示すウェルセットの態様は８つの 個々のウェル６を持ち、各々のウェル６は単一のマニホルドの歯２を受け容れる ようにしてあり、そしてここでも試薬溶液７で部分的に満たされている。 上述のように、マニホルド１は分析装置の試料ウェルと協同するようにしてあ る。これは図６に略図で例示されており、ここではマニホルド１は表示番号８で 概略的に示す電気泳動装置の上に置かれ、そして歯２が電気泳動装置のそれぞれ の試料ウェル９と共に整列されそして受け容れられるようになっている。 上述のマニホルド及びウェルセットを使用するチェーンターミネーション又は ジデオキシ法によるＤＮＡ配列決定は下記のように行うことができる。 マニホルド１は図１に３で示すようにその歯２にストレプトアビジンが固定化 されている。最初に、所望のＤＮＡ配列の上のＰＣＲをそれ自体慣用的な方式で １つのビオチン標識プライマー及び１つの非標識プライマーを使用して、図２及 び３のウェルストリップの各々の長く伸びたウェル４で行う。次いで、マニホル ド１のストレプトアビジンをコートした歯２をウェル４の反応混合物５の中に導 入してそれぞれのビオチン標識ＰＣＲ反応生成物をそれに結合させる。すなわち 、例示の場合においては、第一のＰＣＲ反応生成物を４つの隣接する歯の一つの セットに、そして第二のＰＣＲ反応生成物を４つの歯の他のセットに結合させる 。次いで各々の二本鎖ＤＮＡ断片の一本の鎖は歯を変性条件、例えば加熱及び／ 又はアルカリ処理にかけることにより溶解して除く。所望により、一本鎖ＤＮＡ の変性は固相への固定化の前、反応完了後に既にＰＣＲ反応混合物において行う ことができる。 ２つのウェル４から歯を除き、そしてもう一つのウェルのセットにおける迅速 洗浄工程において、又は他の手段により非結合ＤＮＡ鎖及び他の反応成分を除い た後、マニホルドの歯２を反応溶液５を含む図２及び３に示すタイプの第二のウ ェルストリップのウェル４に導入して標識したプライマー（例えば着色した又は 蛍光を発する尾部）をマニホルドの歯２に結合した一本鎖ＤＮＡ断片又は鋳型と ハイブリッド形成させる。又は、その後の伸長反応工程で使用するdNTP又はddNT Pをプライマーの代わりに標識することができる。 次いでマニホルド１をウェルストリップから除きそして迅速洗浄後、その歯２ を図４及び５に示すウェルストリップの８つの個々のウェル６に導入し、４つの ウェル６の各々のセットは各々のウェル にそれぞれのジデオキシヌクレオチド(ddNTP)と共に逐次反応混合物７を含み、 それ自体公知の方法で固相−結合鋳型上のヌクレオチド重合を可能にする。 マニホルドの歯２を洗浄後、マニホルド１を図６に示すように電気泳動装置８ に移しそして一緒に整列させ、そしてマニホルドの歯２を電気泳動装置８の試料 ウェル９の中に導入する。試料ウェル８は各々のマニホルドの歯２が担持する鋳 型からのジデオキシ転写終結した伸長生成物の混合物の脱着を果たすための適当 な薬剤溶液、例えばホルムアミドを含む。数分間の脱着後、マニホルド１をウェ ル９から引き上げ、そして電気泳動操作を開始する。 図７は数個の、ここでは４つのマニホルドのセット10を例示し、各々は４つの 歯11を持つ。マニホルド10は適当な手段(図示しない)により、隣接するマニホル ドの歯11が互いに接触することなく、すべての４つのマニホルドが単一ユニット として取り扱えるように一緒に組み合わせることができるように設計されている 。図７においては、マニホルドセットは長く伸びたウェル13の対応するセット12 の上で一緒に整列され、各々のウェル13は１つのマニホルド10のすべての４つの 歯を受け容れるようになっている。そこには各々のマニホルドの歯11のためのそ れぞれのウェル15を持つ第二のウェルセット14も示されている。最後に第三のウ ェルセット16が示され、この物は各々が組み合わされたマニホルドセットのそれ ぞれの歯列(各々のマニホルド10の１つの歯11からなる)を受け容れるウェルセッ ト12のウェル13に対して横方向に配置された４つの長く伸びたウェル17を持つ。 図７に示すマニホルド／ウェルセットを使用して上述の配列決定 操作を行うには、マニホルド10の歯11を、対応するＰＣＲ増幅用混合物を含むそ れぞれのウェル13の中に浸すことにより所望のＤＮＡ断片をその歯に固定化する 。次いで配列決定反応をウェルセット14のウェル15（上述の図４及び５のウェル セットのウェル６におけると同様に）、又はウェルセット16のウェル17のいずれ かで行うことができる。後者の場合、４つの配列決定反応（Ａ，Ｃ，Ｔ及びＧ反 応）の各々の１つをマニホルド集成体の組み合わされた歯11のそれぞれの列で同 時に行うことができる。この態様から反応溶液を異なるウェルヘ分注するために 必要な操作の数を著しく減らすことができることは容易に分かることである。 上述のような単一標識したプライマーを使用するより、むしろそれ自体この技 術分野で公知の４つの異なる標識を付したプライマー又は４つの異なる標識を付 したジデオキシ転写終結剤のいずれかを使用することも可能である。標識したプ ライマーを使用する場合、４つの配列決定反応を４つの別々の歯で進行させ、次 いで反応混合物を合せて、例えば自動蛍光読み取り器で読み取る。この場合、個 々のウェルはもちろん、各々のマニホルドの歯について異なるプライマーをマニ ホルド固定化ＤＮＡ鋳型とハイブリッド形成させるために使用されねばならない 。一方標識した転写終結剤の場合、すべて配列決定反応は単一のマニホルドの歯 で行うことができる。 都合よく、マニホルド及びウェルセットはキット形態で提供することができ、 これは好ましくは必要な試薬成分をウェルの中及び／又は固相要素上で乾燥状態 で存在させる。乾燥状態反応混合物のより詳しい記述については、例えばEP-A 2 98 669，EP-A 383 569及びUS-A-4,891,319を参照することができる（その開示は 参照により本 明細書に組み入れる）。 下記に本発明を実施例により示すが、これらに限定されるものではない。 実施例 １ nology AB，Uppsala，Sweden)を焼結漏斗上で氷冷した１mM HCl(３ いようにした。粒子を1.0Ｍ NaCl及び0.4M NaHCO₃の溶液で迅速に洗浄し、pH8.3 に緩衝化し、そして10mgのアビジンを含む最終液量５mlの上記緩衝液に移した。 懸濁液を１時間エンドオーバーエンド回転（end-over-end rotating）させなが らインキュベートし、濾過し、そして粒子をpH8.3の0.1Ｍエタノールアミン緩衝 液中で15分間 0.1Ｍ酢酸緩衝液で洗浄し、そして直ちに使用するか又は0.02%(ｗ／ｖ)のナトリ ウムアジドを添加したpH7.3の0.05Ｍトリス緩衝液に保存した。 Ｂ．粒子のポリスチレン固体支持体への付着 上のように調製したアビジン結合粒子を濾過し、蒸溜水で洗浄し、メタノール （３×５ml）で乾燥し、次いでトリエチルアミン（Et₃N；３×５ml）を用いて平 衡化した。固体を迅速に適当な容器に移し、そしてEt₃Nを添加して約75％(ｖ／ ｖ)の粒子のスラリーを作った。対応するマイクロタイタープレート（F.A.S.T. システム，Falcon，Oxnard，California，U.S.A.）の個々のマイクロタイターウ ェルの 中に突出するようにした８列の12ピンアンドボールの拡がりを持つマイクロタイ タープレートのふたの形に作ったポリスチレン支持体を超音波浴中でエタノール で20分間洗浄し、次いで粒子をポリスチレン支持体からの突起の上にスラリーに ２回各々２秒間浸漬することによりグラフトさせ、その後直ちに残存Et₃Nを空気 中で蒸発させた。脱イオン水で洗浄後、結合しなかった粒子を集め、再使用した 。ゆるく結合した粒子は水中で振盪しながら10分間インキュベートして除いた。 マニボルドは使用するまで緩衝液（１Ｍ NaCl，100mMトリス−HCl(pH7.5)、及び 0.1％(ｖ／ｖ)Triton X 100、さらに無脂肪乾燥乳0.5％(ｗ／ｖ)及びナトリウム アジド0.02％を添加）中に保存した。 ビオチンで５'−末端を修飾した³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを使用するア ビジンをコートした支持体の結合能力の試験により、支持体の各々のとがった先 端は20pmolの程度のビオチニル化オリゴヌクレオチドを結合し得ることが示され た。 実施例 ２ 図１に示す型の櫛型ポリスチレンマニホルドの歯を上の実施例１で記述したの と同じ方法で、アビジンを結合させたビーズを歯の先端から約５mmまでコートし た。 次いでＤＮＡジデオキシ配列決定反応を実質的にHultman等，NAR，17：4937〜 4946（1989）により記述された標準プロトコルにより、最初に5'−ビオチニル化 鋳型の鎖をマニホルドの歯の上にトラップしそして精製し、次いでマニホルドの 歯を適当な反応媒質を含むウェルに浸すことにより行った。 配列決定反応が完了した後、マニホルドの歯をA.L.F.^TM DNA Sequencer（Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，Sweden）の配列決定用 ゲルのウェル、すなわち濃ホルムアミドを含むウェルの中に導入した。歯はホル ムアミド中に室温で５分間浸漬したままに置いた。次いで電気泳動を開始し、そ してさらに５分後に停止し、その時マニホルドを除いた。その後電気泳動をそれ 自体慣用的な方式で継続し、進行させた。配列読み取りによりジデオキシ転写終 結した反応断片の有効な脱着及びゲル分離が試料ウェル中で起こったことが示さ れた。 本発明はもちろん、上で詳しく説明しそして図面に示した態様に限定されるも のではなく、多くの改変及び変更を添付の特許請求の範囲に明確に示した一般の 発明の概念の範囲から逸脱することなく行うことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．対応する１つ又は複数のセットの容器(４；６；13：15：17)と協同するよう にした多数の個々の固相要素(２；11)を持つ１つ又は複数のマニホルド(１；10) を準備し、 試料からの核酸種を第一の１つ又は複数のマニホルド(１；10)の各々の固相 要素(２；11)に、固相要素を前記１つ又は複数の試料を含む第一の容器又は容器 のセットに導入することにより結合させ、 場合により固相要素(２；11)を第二の１つ又は複数のセットの容器(４；６ ；13；15；17)に導入することにより、各々の核酸種をそれが固相要素に結合し ている間に処理し、 場合により第二の１つ又は複数のマニホルド(１；10)の固相要素(２；11)を 前記第二の容器に導入してそこに生成した１つ又は複数の種を固相要素(２；11) に固定化し、そして 固相要素(２：11)を分析器(８)の放出に必要な環境を与える１つ又は複数の 試料容器(９)に導入することにより、核酸種又は反応生成物を１つ又は複数のマ ニホルドの固相要素(２；11)から分析装置(８)へ核酸種又は反応生成物を分析す るため放出する工程からなることを特徴とする分析のための核酸試料の処理方法 。 ２．反応生成物が固相要素(２；11)に結合したＤＮＡ鋳型上で合成される伸長し たプライマー分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．放出が変性手段を使用する処理により行なわれることを特徴とする請求項１ 又は２記載の方法。 ４．変性手段がホルムアミド、熱及びアルカリのような変性pH、及びそれらの組 合せであることを特徴とする請求項３記載の方法。 ５．固相要素(２；11)に結合した鋳型に対するＰＣＲのような増幅反応を行なう ことを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。 ６．核酸種を固相要素(２；11)に固定化することにより前記核酸種を試料から釣 り上げ、そして前記核酸種を分析器に放出することを特徴とする請求項１〜５の いずれか一項記載の方法。 ７．マニホルドが幾つかの例えば４つ又は８つの固相要素を形成する歯(２；11) を持つ櫛型要素(１；10)であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記 載の方法。 ８．分析器がマニホルドの歯(２；11)を受け容れるようにした試料ウェル(９)を 持つ配列決定用ゲル(８)を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記 載の方法。 ９．核酸配列決定方法の一部であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一 項記載の方法。 10．診断方法の一部であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項記載の 方法。