JPH08502489A - Immunological purging of tumor cells from bone marrow using microspheres and monoclonal antibodies - Google Patents

Immunological purging of tumor cells from bone marrow using microspheres and monoclonal antibodies

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JPH08502489A JP6510304A JP51030494A JPH08502489A JP H08502489 A JPH08502489 A JP H08502489A JP 6510304 A JP6510304 A JP 6510304A JP 51030494 A JP51030494 A JP 51030494A JP H08502489 A JPH08502489 A JP H08502489A
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Abstract

(57)【要約】 Ｂ細胞リンパ腫患者骨髄由来の腫瘍細胞を免疫学的にパージングするための方法を記載する。パージングした骨髄は治療上の自己骨髄移植に用いることができる。ミクロスフィアおよび複数の抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を用いて骨髄から、非腫瘍細胞の除去または溶解を起こすことなく、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより検出されないレベルにまで、腫瘍細胞を除去する。   (57) [Summary] A method for immunologically purging tumor cells from B cell lymphoma patient bone marrow is described. Purged bone marrow can be used for therapeutic autologous bone marrow transplantation. Microspheres and multiple anti-B cell monoclonal antibodies are used to remove tumor cells from bone marrow to levels not detected by the polymerase chain reaction assay without removal or lysis of non-tumor cells.

Description

【発明の詳細な説明】 ミクロスフィアおよびモノクローナル抗体を用いた 骨髄からの腫瘍細胞の免疫学的パージング政府援助 本発明は米国政府の援助により行われ米国政府は本発明に対し米国立衛生研究 所グラントCA40216およびCA34183の下に所定の権利を有する。技術分野 本発明はモノクローナル抗体とミクロスフィアとの特有の組み合わせを用いた 骨髄からの腫瘍細胞の免疫学的パージングに関し、さらに前記特有の組み合わせ を用いて腫瘍細胞をパージングした骨髄の自己処理および移植によりＢ細胞リン パ腫の患者を処置する方法に関する。背景技術 高投与量放射線／化学療法後の自己骨髄移植（ABM）による治療は増加しつつ ある血液学的および充実性腫瘍患者の主要な処置のオプションとなっている［1 〜10］。自己骨髄の注入は付随の激しい骨髄抑制（myelosuppresion）を防ぐの に十分な造血幹細胞を提供するが、自己骨髄内に潜む潜在的クローン原性腫瘍細 胞はこの骨髄を患者に移植して戻した後の増加による再発に関与することがある という関連がある。非ホジキンス（non-Hodgkin's）リンパ腫（NH）)では、この 疾病による骨髄浸潤は診断および再発の時に共通である［11〜12］。 免疫学的および薬理学的薬剤を用いて骨髄のリンパ腫細胞をパージングする試 みは詳細に説明されている［２、４、13〜14］。これらの研究は患者の骨髄を、in vitro で、血液学的植え付けを有意に減ずることなく、パージングすることが できることを示している。しかし、10年近くの科学的研究の後も、収集した骨髄 から少数の残留物または組織学的に明らかな腫瘍細胞でさえも除去する必要があ るかどうかに関して論争が続いている。さらに、かかる研究は骨髄パージングが 疾病のない生存（disease-free survival）（DFS）の患者の機会（patient's ch ance）を改善するのに寄与するかどうかの問題に十分答えていない。 腫瘍細胞のパージングが疾病のない生存の患者の機会を増加させるかどうかを 決定する際の重大な障害はin vitroのパージング前後に骨髄中の潜在または潜伏 リンパ腫細胞を正確に確認することができないことである。通常の形態学的方法 を用いて、組織学的に正常な判定を受けた骨髄試料は５％までのリンパ腫細胞と 一緒にさらに浸潤することができる。この５％の数値は形態学的腫瘍細胞検出の 下限である。しかし、近年、骨髄浸潤を腫瘍細胞によりアッセイする一層感度の 高い技術が開発された。この新しい技術は通常の形態学的方法を用いてアッセイ した所定の”組織学的に正常”な骨髄試料が十分な数のリンパ腫細胞［15〜17］ を実際に含む場合があることが確認された。 骨髄中の潜在性細胞をアッセイする際に特に有用な技術はポリメラーゼ鎖成長 反応（PCR）である。種々の出版物［18〜28］には、PCR増幅を用いて第18染色体 上のbcl-2プロトオンコジーンおよび第14染色体上の免疫グロブリン重鎖座を含 む内部染色体転座（interchromosomal translocation）を検出することができる ことを示している。この転座は濾胞状のNHLの約85％の患者に発生しさらにび漫 性NHLの30％の患者に発生する［21〜26］。最高の感度のPCR技術は106個の正常 細胞中の１個のリンパ腫細胞を検出することができる［18、20］。ここに示すよ うに、骨髄がPCR陽性かまたはPCR陰性かを決定することにより、骨髄をパージン グするのに用いる物質の効能を一層正確に評価することができる。次に、この精 度により、患者の疾病のない生存の見込みを一層正確に評価することができる。 補体の存在下に、モノクローナル抗体を用いて骨髄をパージングすることは多 数の研究者により過去10年にわたって報告されている。L.M.Nadler et al．、「 Lancet」、ii：427〜431（1984）は再発したＢ細胞NHLの患者への自己骨髄移植 のために抗B5（抗CD20）モノクローナル抗体および補体を用いることが報告され ている。Baumgartner et al.、「Proceedings of the 1st International Sympo sium on Autologous Bone Marrow Transplantation」、K.Dicke、G.Spitzerおよ びA.R.Zander改訂、（1985）、377〜381頁には、処置および補体とモノクローナ ル抗体である抗Y-29/55とで処理した骨髄の移植が報告されており、抗体は、 他の細胞の中で、ヒト血漿細胞前駆体から誘導した悪性リンパ性細胞を認識する が、急性リンパ球性白血病細胞のヌル、普通の、プレＢ、およびＴ型と、または 顆粒球マクロファージ前駆体を含む正常造血要素と反応しない。Feeney et al． の、「CaI1cer Res．」41：3331〜3335（1981）には、補体および抗体を用いて ラット骨髄から白血病細胞を除去することが報告されている。 さらに最近、Armitage et al．は"Bone marrow transplantation in the tre atment of patients with lymphoma."に報告している［１］；Freedman et al． は"Autologous bone marrow transplantation in B-cell non-Hodgkin's lympho m a..."で研究している［２］；Hurd et al．は"Autologous bone marrow trans pl antation in non-Hodgkin lymphoma ：monoclonal antibodies plus comptem entfor ex vivo marrow treatment."で議論している［４］；Ball et al．は"Au tolo gous bone marrow transplantation for acute myeloid leukemia using m onocl onal-purged bone marrow."に報告している［６］；さらにFrei et al． は"Bone marrow transplantation for solid tumors..."の見込みを研究した［ ９］。しかし、これらの出版物にはいずれも、薬剤もしくは抗体またはそれらの 組み合わせおよび／またはin vitroで自己骨髄処理した後に、骨髄を処理して長 期間患者を生存させることができるようにする方法が示されていない。 本発明は従来技術のもつ問題点を解決しミクロスフィアおよび複数のモノクロ ーナル抗体（以下MmAbという）の組み合わせを用いることにより骨髄から腫瘍細 胞をパージングする際に重要な利点を達成する。請求の範囲に記載した本発明の ミクロスフィアおよび選択した抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を用いて集めてここ で開示したデータは、補体媒介溶解および複数のモノクローナル抗体（以下CmAb という）を用いる既知の方法に比較して腫瘍細胞を消耗させた、有意に高い割合 の試料を生じる予測されない相乗的相互作用が存在することを明白に示している 。この相乗的相互作用は、ここで処理した腫瘍細胞含有骨髄試料の、すべての試 料を複数の選択的モノクローナル抗体およびミクロスフィアで３回処理した後、 腫瘍細胞においてPCR陰性になるようパージングすることができるという事実に より明らかである。対照的に、補体媒介溶解および同一の複数のモノクローナル 抗体を用いると、約50％のCmAbをパージングした試料は３回のCmAb処理後に示さ れ るべきPCR陰性の欠落により示されるように腫瘍細胞を含んでいた。ミクロスフ ィアおよび選択したＴ細胞モノクローナル抗体を用いた試験は、ミクロスフィア の使用が、それ自体により、骨髄からの腫瘍細胞の除去を促進しないことを示す 。結果として、MmAbを用いて骨髄から腫瘍細胞をパージングすることにより観察 される相乗的相互作用はミクロスフィアおよび抗体の別々の効果に沿って加算さ れた単なる付加的効果ではない。結論として、ここに記載したCmAbのデータはbc l-2転座のためにPCR陰性にまで骨髄をパージングする能力とABMT後の患者の疾病 のない生存との間に高度に有意な相互関係があることを示す。しかし、骨髄試料 の約50％だけがCmAbを用いてPCR陰性にまでパージングすることができることが 見出された。ここに示したデータはMmAbの使用がPCR陰性にまで（90〜100％まで ）パージングすることができる試料の割合を有意に増加させることを示し、MmAb の使用が疾病のない生存の統計を有意に改善することができると信じられる。発明の開示 本発明では治療としての自己骨髄移植を目的として、Ｂ細胞リンパ腫の患者の 骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパージングするための特有の方法を開示する。こ の方法は次の段階を含む： （a）骨髄を収集し； （b）複数の選択的モノクローナル抗体およびミクロスフィアを特定の配列で 用いて、非腫瘍細胞を消耗させることなく、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイに より骨髄中で腫瘍細胞が検出されないレベルにまで、骨髄を処理し；さらに （c）処理した骨髄をそれを得た患者に投与する。 この方法には腫瘍細胞に結合する抗体と抗体とミクロスフィア、好ましくは約 0.3〜約5.0ミクロンの範囲のサイズの磁性ミクロスフィアで、抗体に結合する際 にヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ig）で被覆したミクロスフィアの使用が含まれ る。ヤギ抗ラビットおよびラビット抗マウスIgも本発明に用いることができる。 ヤギ抗マウスIgが好ましい。抗体を用いて腫瘍細胞を結合したミクロスフィアを 、その後骨髄試料から分離した。複数のモノクローナル抗体およびミクロスフィ アを用いるこの特有の方法は、補体を用いることなく、腫瘍細胞を骨髄からPCR 陰性になるまで除去することが見出された。さらに、複数の選択的モノクローナ ル抗体と補体の使用が骨髄試料に含まれる約50％の腫瘍をパージングしてPCR陰 性にすることが見出されたが、複数のモノクローナル抗体とミクロスフィアを用 いると、腫瘍含有試料の約90〜100％をPCR陰性にまでパージングした。ミクロス フィアを用いる他の例では、抗体とミクロスフィア処理を配列する代わりに、腫 瘍細胞含有骨髄に接触させる前に、モノクローナル抗体をミクロスフィアに結合 するか、または免疫グロブリンもしくは他の物質を結合したかあるいは被覆した ミクロスフィアに結合させることができる。これらの例では、当業者に知られて いる立体化学および他の物理的研究について配慮される必要がある。例えば、抗 体を腫瘍細胞含有試料に接触させる前に、ミクロスフィアに結合させる場合、ミ クロスフィアの表面と抗体との間に約１〜20個の原子長さの架橋基を導入する必 要がある場合がある。次にこの方法はパージングサイクル後のミクロスフィアの 洗浄および非腫瘍細胞の損失を最小にするために洗浄とバルク試料とを組み合わ せることを必要とする場合がある。図面の簡単な説明 図１はクローン原性細胞増殖により評価した種々の補体および／または抗体を 用いた、ラージ細胞（Raji cell）の免疫学的パージングの効力を示すグラフで ある； 図2Aおよび2Bは本発明の処理前後の、ポリメラーゼ鎖成長反応（PCR）により 増幅されたbcl-2転座配列のサザンブロット分析結果を示す； 図３はＢ細胞NHLの114名におけるABMT後の疾病のない生存の保険統計上の確率 （actuarial probability）のグラフである； 図4A〜4CはABMTの疾病状態により下位に分類したABMT後の疾病のない生存の保 険統計上の確率のグラフである； 図5A〜5DはABMTの骨髄連累により下位に分類したABMT後の疾病のない生存の保 険統計上の確率のグラフである； 図６はポリメラーゼ鎖成長反応により増幅したbcl-2転座配列のために、２名 の患者から採取した骨髄（A）および多数の末梢血液試料（B〜G）のサザンブロ ット 分析結果である。 図7A〜7Cはポリメラーゼ鎖成長反応により増幅したbcl-2転座配列をサザンブ ロット分析により検出した結果を示す。 図８はPCR分析が106個の正常単核細胞中の１個のリンパ腫細胞をMmAb-4処理後 に検出することができることを示す。発明を実施するための最良の形態 参考文献 １．J.O.Armitage et al．、Blood、73：1749〜1758(1989)。 ２．A.S.Freedman et al．、J．Clin．Oncol．、8：1〜8(1990)。 ３．J.G.Gribben et al.、J．Clin．Oncol．、7：1621〜1629(1989)。 ４．D.D.Hurd et al．、Am．J．Med．、85：829〜834(1988)。 ５．I.Phllip et al．、N．Eng．J．Med．、316：1593〜1498(1987)。 ６．E.D.Ball et al．、Blood、75：1199〜1206(1990)。 ７．J.G.Gribben et al.、Blood、73：304〜34(1989)。 ８．R.Wallerstein et al.、J．Clin．Oncol．、8：1782〜1788(1990)。 ９．E.Frei et al．、J．Clin．Oncol．、7：515〜526(1989)。 10．W.P.Peters et al．、J．Clin．Oncol．、6：1501〜1515(1988)。 11．F.Dlck et al．、Cancer、33：1382〜1398(1874)。 12．R.S.Stein et 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Ｂ細胞非ホジキンスリンパ腫の114名の患者について研究した。すべての患者 はABMTの時に、放射線／化学的敏感性の疾病であった。このことは攻撃的誘導ま たは救済（salvage）放射線／化学療法後のプロトコール適格の最小疾病状態（p rotocol eligible minimal disease state）の達成として評価された。プロトコ ール適格の疾病基準には（１）完全な緩解（CR）または腫瘍塊を２cm以下にする 部分的な緩解（PR）が認められるかどうかおよび（２）最初のプロトコールで腫 瘍細胞による５％以下の骨髄浸潤が認められるが、次のプロトコールで20％未満 の内部柱空間（intertrabecular spase）であるかどうかが含まれる。免疫タイ ピング（immunotyping）によりすべての場合にB1（CD20）を発現することを証明 した。 補体を用いて免疫学的にパージングし腫瘍を十分な量の複数の抗Ｂ細胞および 抗CALLA（抗−通常急性リンパ芽球性白血病抗原）モノクローナル抗体で除去し た後骨髄を再注輸した。十分な量のモノクローナル抗体の存在は骨髄中に存在す る腫瘍細胞のおよその量を測定する予備処理試験により決定する。ラビットの補 体が好ましかった。 PCRの陰性は代表的に３回の処理または腫瘍パージングサイクル後に達成され た。結果として、すべての場合、パージングされた骨髄は３回の骨髄処理または パージングサイクル後に移植されたにすぎない。すべての患者からの骨髄のバイ アルをパージングの前後に低温保存した。パージング前後に低温保存していない 38名の患者の試料から、DNAを抽出した。これらの患者の10名については、それ ぞれの３回の補体／抗体パージング後に得た骨髄のアリコートへからもDNAを抽 出した。診断上のリンパ腺から単離した細胞を多数の患者について低温保存した 。正常骨髄を健康なボランティアドナーから得た。ゲノムDNAをすべての場合に ついて非イオン性界面活性剤およびプロテイナーゼＫ（シグマ社、米国ミズーリ 州セントルイス所在）を用いた細胞溶解処理により単離した。他の50種のDNA抽 出も既知の確立された方法を用いて行った。 骨髄を腸骨稜から一般的な麻酔下に収集し防腐剤を含まないヘパリンを含むRP MI培地〔ホワイタッカー（Whitakker）、米国ニュージャージー州ピスカッタウ ェイ所在〕に蓄えた。収集した骨髄を濃縮して軟膜を得、Cobe 2991細胞洗浄機 で洗浄した。単核細胞画分をフィコールハイパック（ファルマシア社、米国ニュ ージャージ州ピスカタウェイ所在）上での遠心分離により単離し、これらの細胞 を0.5％のウシ胎児血清〔FBS、ハイコン ラボ（Hycone Lab）、米国ユタ州ロー ガ ン所在〕を含むRPMI 1640中に２×107個細胞／mlの濃度で再懸濁した。これらの 細胞は、腫瘍を除去するのに十分な、好ましくは飽和濃度の、モノクローナル抗 体と一緒に、15分〜約１時間の範囲の時間、好ましくは約15分、４℃でインキュ ベーションした。各抗体の飽和濃度を存在する腫瘍細胞の数および細胞上の抗原 密度から決定する。ラビットの補体〔３〜４週齢のラビット血清、ペル フリー ズ インコーポレーション（Pel Freeze Inc.）、米国ウィスコンシン州、ブラ ウン ディアー所在〕を各ロットにっいて予め決められた希釈で添加し30分間37 ℃にて、細胞凝集を防止するために2.5mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ（シグ マ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）の存在下に標的細胞とインキュベーシ ョンした。添加した補体の量は試料の容量に依存するが1/1〜1/10 v/vの範囲に ある。これらの細胞を遠心分離によりペレット化しこの方法をin vitroでモノク ローナル抗体およびラビット補体を用いる合計３回の処理について２回繰り返し た。これらの細胞を３回洗浄し、自己の血清および10％のジメチルスルホキシド （シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）中に再懸濁し、さらにTakovari an et al．、N．Engl．J．Med.、316:1499〜1505（1987）の方法に従って低温保 存した。再注輸する前に、低温保存した細胞を迅速に解凍し、Takovarian et al ．、NEMJ、316:1499〜1505（1987）に記載のDNAaseを含む培地中で希釈した。生 存力をトリパン色素排除により測定した。一般的に、骨髄は得てから４週間内に 再注輸した。 本発明の評価にリンパ腫細胞系ラージおよびDHL-6を用いた。ラージはCD20、C D10およびB5抗原を発現するヒトバーキットリンパ腫Ｂ細胞系である。ラージ細 胞は10％熱不活性化FBS、２％L-グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウムならび に１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中で増殖させ た。DHL-6はbcl-2転座を含むヒトＢ細胞系でありDr.A.Epstein（Univ．So．Cali f.、米国ロサンゼルス所在）から入手した。 本発明で用いるモノクローナル抗体は抗CD（抗B1）モノクローナル抗体、活性 化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体（抗B5）、抗 CD10（抗J5）モノクローナル抗体および抗CD19（抗B4）モノクローナル抗体であ る。本発明で用いる抗体は補体の存在下に骨髄中の腫瘍細胞の溶解を誘導する必 要がある。ここで用いる抗体はすべてラビット補体の存在下に溶解を誘導する。 抗B1は正常および悪性細胞上に見出せる35,000ダルトンの細胞表面糖タンパク 質に特異的なIgG2aネズミモノクローナル抗体である。旧抗原は、末梢血、リン パ腺、脾臓、扁桃および骨髄から単離したすべてのＢ細胞に見出せる。またこの 抗体はCALLA陽性の急性リンパ芽球性白血病（ALL）の50％に見出せるが；正常Ｔ 細胞、単球、顆粒球またはこれらの系統の腫瘍には見出せない。B1抗原はＢ細胞 膜の絶対必要な成分であり、さらに若干のヌル細胞リンパ腫および非Ｔ細胞ALL 上で見出せる。抗B1モノクローナル抗体をP.Stashenko et al.、"Characterizat ion of a human B lymphocyte-specific antigen"、J．Immunol．、125:1678以 下参照（1980）およびL.M.Nadler et al．、"A unique cell surface antigen i dentifying lymphoid malignancies of B cell origin"、J．Clin．Invest.、67 :134以下参照（1981）により調製した。抗B1と同一の方法で旧抗原と反応する任 意のモノクローナル抗体は本発明の実施に際し用いることができる。補体媒介溶 解はモノクローナル抗体の補体媒介細胞溶解活性に依存する。 抗B5は米国特許第4,692,405号明細書に記載されたネズミIgMモノクローナル抗 体である。B5抗原は75,000ダルトンの分子量を有しさらに非刺激リンパ腺、脾臓 および扁桃中の少数の活性化Ｂ細胞に発現する。末梢血、リンパ腺、脾臓または 扁桃から単離して得られたＢ細胞上には発現しない。in vitroでプロテインＡ、 抗Ig、エプスタイン−バーウイルスまたはヤマゴボウマイト−ジェンを用いて活 性化されて得られた脾臓のＢ細胞はB5抗原の存在を示す。B5は広範な種類のＢ細 胞新生物および多数のＢ-Cll、バーキットリンパ腫、小結節性の不十分にしか分 化していないリンパ球性リンパ腫、び漫性の不十分にしか分化していないリンパ 球性リンパ腫、び漫性大細胞リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびび漫性のよ く分化したリンパ球性リンパ腫上に見出せる。B5は非Ｔ細胞All、Ｔ細胞または 脊髄白血病細胞、正常Ｔ細胞、単球、顆粒球、赤血球または血小板上には発現し ない。しかし、若干の非造血悪性腫瘍、特に小細胞肺ガン腫に現れる。抗B5と同 一の方法でB5抗原と反応する任意のモノクローナル抗体は本発明を実施する際に 用いることができる。 抗J5はヒト通常急性リンパ芽球性白血病抗原（CALLA）に対して向けられた約1 0 0,000ダルトンの分子量を有するIgG2aネズミモノクローナル抗体である。この抗 原は、非Ｔ細胞ALLの患者の80％および急性転化の慢性骨髄性白血病の40〜50％ からの腫瘍細胞上に見出せる。この抗原は正常な骨髄および胎児肝臓中の少数の 細胞上に存在する。またJ5抗原は若干のＢ細胞およびＴ細胞リンパ腫からの、不 十分にしか分化していない小結節性リンパ球性リンパ腫、バーキットリンパ腫お よびＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ならびに正常腎臓の管状上皮および糸球体上 皮ならびに胸平滑筋上皮細胞を含む腫瘍細胞上に見出せる。抗J5モノクローナル 抗体はCALLA陽性非Ｔ細胞ALLの患者からの腫瘍細胞を用いてJ.Ritz et al．、"A monoclonal antibody to human acute lymphoblastic leukemias antigen."、N ature、283:583以下参照(1980)により、免疫したBALB/cJマウスからの脾臓細胞 とマウスNS/1-AG細胞とのハイブリダイゼーションから誘導した。抗Ｊと同様にJ 5抗原と反応する任意のモノクローナル抗体を本発明の実施に際して用いること ができる。 抗B4（抗CD19）はCD19についてのネズミIgG2aモノクローナル抗体である。こ の抗体はリンパ系器官から単離したすべてのＢ細胞上および正常成人骨髄細胞の 約５％上に存在するB4抗原を認識する。さらに、B4抗原は95％より多くの非Ｔ細 胞急性リンパ芽球性白血病に、Ｂ細胞リンパ腫およびＢ細胞慢性リンパ球白血病 の90％に発現する。 抗B1、抗B5、抗旧および抗J5モノクローナル抗体は米国フロリダ州ハイアレア 所在のクールターコーポレーションの、クールターイムノロジーディビジョンか ら商業上入手することができる。 クローン原性アッセイ 骨髄を健康なボランティアドナーから得、防腐剤を含まないヘパリンを用いて 血液凝固を阻止した。単核細胞画分をフィコールハイパック密度勾配遠心分離に より単離してパージング実験で細胞をリンパ腫細胞と混合する前に細胞を11.1Gy ／分で40Gyの放射線に照射する（137Cs、Gamma cell、Atomic Energy of Canada 、カナダ国オタワ所在）。リンパ腫細胞系ラージを放射線照射した正常骨髄単核 細胞に1:20の割合で添加して２×107個細胞／mlで培地中に懸濁した。この細 胞懸濁物を骨髄収集試料に用いた同一のプロトコルを用いてモノクローナル抗体 と補体の組み合わせで合計３回処理した。次にこの細胞を３回洗浄し限界希釈ア ッセイにおいて平板培養した［33］。各試料を連続して５×105〜0.5個細胞／10 ％FBSを追加した100mlのRPMI培地まで希釈した。各希釈物の48〜96アリコートを 平坦底のマイクロカルチャーウエル（Nunclo、デンマーク国ヌンク所在）上で平 板培養した。新鮮培地を４日毎に加え37℃、５％CO2雰囲気中、14〜18日インキ ュベーションした。連続した希釈物の増殖は”全か無”を、倒立相顕微鏡（inve rted phase microscope）下の陽性または陰性の様式（fashion）で評価した。こ のような条件下に、増殖する腫瘍細胞だけが高いクローニング効率を有する。各 希釈において、各点についてのすべての細胞数に対する陰性ウエルのプロット数 はポアソン確率分布に従う。試験集団内のクローン原性細胞の頻度をカイ二最小 化（Chi-square minimization）を用いて評価した。 ポリメラーゼ鎖成長反応 DNAを96℃、10分加熱して増幅前にプロテイナーゼＫを不活性化した。一群に なったオリゴヌクレオチドの増幅は、各試料についてbcl-2/IgHハイブリッド遺 伝子の多数のブレークポイント（MBR）および少数のクラスタ（mcr）領域で行っ た。MBRのPCR増幅のための条件は正常骨髄単核細胞中の連続した希釈の細胞系DH L-６を用いて最適化して106個の正常細胞中の１個の腫瘍細胞の希釈を容易に検 出することができた。いずれの細胞系もmcrのためのプライマを用いることによ るPCRの感度の正確な決定には有用でなかった。しかし、患者腫瘍細胞を用いる 希釈研究は106個の正常骨髄細胞中の少なくとも１個の腫瘍細胞の感度を示唆す る。増幅した物質の交差汚染（cross contamination）に対する標準的予防措置 を行って、DNA抽出を行った領域に増幅させた物質を含ませなかった。 PCR増幅をPerkin Elmer Cetus thermal cycler〔セタス（Cetus）、米国カリ フォルニア州エメリービル所在〕で50mM KCl、10mM Tris-Cl、2.25mM MgCl2、0 .01％ゼラチン、1.5mgのDNA、20nMのオリゴヌクレオチドプライマ、それぞれ200 mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、1.5UのTaqポリメラーゼ（セタス、米国カリ フォルニア州エメリービル所在）を含む50mlの緩衝液中で25回行った。最初の 増幅はMBRのためのオリゴヌクレチド５′CAGCCTTAAACATTGATGG （配列番号１） 、mcrのための５′CGTGTGGTACCACTCCTG３′（配列番号２）および JH コンセン サス領域のため５′ACCTGAGGAGACGGTGACC３′（配列番号２）を用いて行っ た。各回とも94℃で１分間の変性、55℃（MBR）または58℃（mcr）で１分間のア ニーリングおよび72℃で１分間の伸長を用いて行った。最後の伸長期間は10分に 延ばした。 増幅した混合物の5mlアリコートを50mlに合わせ最初のプライマにオリゴヌク レオチドインターナル、 MBRのための５′TATGGTGGTTTGACCTTTAG５′ （配列番号４） mcrのための５′GGACCTTCCTTGGTGTGTTG３′（配列番号５）および JH コンセンサス領域のため５′ACAGGGTCCTTGGCCCA３′（配列番号６）を用い て、94℃で１分間の変性、58℃で１分間のアニーリングおよび72℃で１分間の伸 長を行い、30回再増幅させた。最後の伸長期間を再度10分間延ばした。最終反応 生成物のアリコートを臭化エチジウムを含む４％アガロースゲル（NuSieve、FMC 、米国メイン州ロックランド所在）で電気泳動することにより分析し、UV光下に 可視化した。DNAをゼータプローブブロッティングメンブラン（Bio Rad）米国カ リフォルニア州リッチモンド所在）上にブロッティングし、bcl-2特異DNA を32P 標識オリゴヌクレチドプローブ、MBRのための５′CCCTCCTGCCCTCCTTCCG３′（配 列番号７）、およびmcrのための５′GGACCTTCCTTGGTGTTG３′（配列番号５）と 一昼夜ハイブリダイゼーションして検出した。オリゴヌクレオチドを、製造者の 指示に従って、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs、米国マサ チューセッツ州ベヴァリー所在）を用いて（32Ｐ）ATPで放射線標識した。 対照試験を正常骨髄細胞中の細胞系DHL-6の10-5希釈物からのDNAからなるわず かに陽性の対照および熱不活性化プロテイナーゼＫを含むPCR緩衝液からなる陰 性対照を用いて各増幅と一緒に行った。各試料を少なくとも３回それぞれのブレ ークポイント部位で分析した。さらに、PCR生成物を検出できないすべての試料 について、最初のオリゴヌクレオチドおよびヒトB7遺伝子に特異的なプライマを 用いて、PCR反応を繰り返してDNAをすべての試料で増幅することができるこ とを確実にした。次に各DNA試料の連続した希釈物をPCR試料緩衝液中で作製した 。PCRを行い、出発物質中の転座を伴うDNAの量を評価するために、PCRが陰性と なる力価を決定した。 評価および統計学的方法 処理前に、患者を全血化学（complate blood chemistry）、骨髄穿刺および生 検、物理試験、骨髄単核細胞および末梢血の細胞表面表現型により評価した。他 の評価には疾病の広がりを決定するのに必要なコンピュータＸ線断層撮影法、Ｘ 線およびガリウムスキャンニングが含まれる。再注輸後に、再試験を６月毎また は臨床上必要な場合に行った。 患者の特性、PCRポスト溶解の結果および再発までの時間の間の関係をログラ ンク試験［38］を用いて評価した。患者の特性とPCRとの関係はフィッシャー抽 出試験（Fisher exact test）［39］で評価した。オーダーした偶発性変数（ord ered contingency variable）のためのウイルコキソン試験（Wilcoxon test）を オーダーした分類別データのために用いた。また分類されたログランク試験は、 再発までの一層長い時間の予後であると考えられる患者の変数を用いて考慮され た。コックス比例ハザード退行（Cox proportional hazards regression）［41 ］を用いて再発の危険における共変量の効果を評価するモデルを構築するよう試 みた。疾病のない生存曲線はカプラン（Kaplan）およびメイヤー（Meier）の方 法［42］を用いて評価し、ログランク試験により比較した。生存率を骨髄移植の 日から計算した。表１には本発明を試験する間に起こる患者の関連した特性をま とめる。 腫瘍細胞をモノクローナル抗体により正常骨髄からパージングする能力はin v itro モデルを用いて証明された。ハイブリドーマ細胞系ラージを正常ドナー髄単 核細胞に1:20の割合で添加した。次にこの懸濁液を抗Ｂ細胞モノクローナル抗体 抗B1および抗B5と、抗J5とを、単独または組み合わせて、補体の存在下に用いて 処理した。この細胞懸濁液をラージクローン原性細胞を消耗させるために合計３ 回処理した。 図１には補体単独または補体を含まない抗（B5+B1+J5）の組み合わせを用いる ラージ含有懸濁液の処理が、懸濁液試料中のクローン原性細胞の画分を有意に減 少させないことを示す。しかし、補体および１種の抗Ｂ）抗B1、または抗J5を用 いた場合、in vitroパージング後に抗体または補体単独を用いるパージングと比 較してクローン原性細胞の増殖の有意な（p=0.014）減少が起こった。 これらの評価では、抗体と補体の溶解は約３の対数（103）の細胞死滅を誘導 することができた。２または３種の抗体と補体との組み合わせは補体および抗体 単独の場合に比べさらにクローン原性腫瘍細胞の増殖に（p=0.0066）一層大きな 減少を起こした。図１によると、組み合わせ抗B1＋抗J5＋補体および抗B1＋抗B5 ＋抗J5＋補体はいずれも約10-6までクローン原性細胞の画分を減少した。後者の 組み合わせが好ましい。 免疫原性パージングがABMTの時に患者の骨髄からリンパ腫細胞を根絶すること ができるかどうかを決定するために、収集した骨髄にbcl-2ガン遺伝子の転座を 有する細胞が含まれる10名の患者からの試料を分析して免疫原性パージングによ りPCR陰性にまでこれらの細胞を減少させることができるかどうかを決定した。 これらの骨髄のそれぞれを抗B1＋抗B5＋抗J5＋補体を含む混合物で処理した。こ れらの試料をbcl-2転座について３回のモノクローナル抗体＋補体処理のそれぞ れの前後にPCRで分析した。10名の患者の骨髄の６つを陰性にまでパージングし た。それぞれの場合で、３サイクルのモノクローナル抗体＋補体処理がPCR陰性 を達成するのに必要であった。この群からの３名の代表患者で得た結果を図2aに 示す。患者１および２は第３回の処理後にPCR陰性に達するが患者３はbcl-2転座 についてPCR陽性のままであった。Negrin et al．、Blood、77:654〜660（1991 ）［43］はリンパ腫細胞系の免疫学的パージングによりPCR陰性になることに注 目するが、またこれらの著者はリンパ腫細胞系中にパージングに対する感受性に 関し違いが存在することに注目した。全体的に、処置した患者の50％の骨髄が３ 回の補体／抗体処理サイクル後に、bcl-2についてPCR陰性になった。 ここに記載した結果はbcl-2転座についてならびにプレおよびポスト溶解試料 をいずれも分析のために入手することができる患者についての詳細に記録された PCR増幅性ブレークポイントを有する患者の処置の分析から得た。bcl-2転座をPC Rにより125名の患者の診断上の組織において確認し必要な試料がこれらの場 合の114例について入手できた。さらに、プレおよびポスト溶解試料もbcl転座を 含むPCR増幅しない転座を有するＢ細胞NHLの47名の患者から入手できた。これら の47種の試料は対照として用いた。 DNAをプレおよびポスト溶解試料から抽出し、PCRをMBRおよびbcl-2のmcrで行 いbcl-2転座を有する残留細胞が収集およびその後の補体／抗体パージングの際 に存在ずるかどうかを評価した。それぞれのプレおよびポスト溶解試料を３回分 析し、臨床上の結果に関してまたはbcl転座がその患者に以前確認されたかどう かに関して隠した。骨髄収集と同時に、PCRはbcl-2転座が臨床上の組織中で検出 されるすべての114の患者のプレ溶解骨髄において骨髄浸潤を検出した。 免疫学的パージングによりここに記載された114名の患者の57名のポスト溶解 試料中に検出可能なPCR生成物の損失を招いた。他の57例のポスト溶解試料では 、パージング後bcl-2転座のPCRが陽性であった。９種の代表的プレおよびポスト 溶解試料からの結果を図2bに示す。レーン１〜４はbcl-2転座を有するリンパ腫 細胞がポスト溶解試料においてPCRにより検出することができない場合を示す。 レーン５〜９は溶解後にPCR陽性のままである代表的患者を示す。等量のDNAを各 PCR反応に添加するが、PCR陰性にまでパージングする能力はプレ溶解試料中のPC R信号の強度と相関すると考えられない。実際に、レーン８に示す試料では、パ ージング後に検出されたPCR生成物の強度にわずかな増加が見られた。このこと はまさに技術上の正常な変動であるかもしれないしまたはこの患者で正常細胞の 損失が新生物細胞の損失よりも比較的多かったのかもしれない。PCRは定量アッ セイではないので、連続した希釈のプレおよびポスト溶解試料を用いてPCRを実 施してPCR生成物を検出することができない力価を決定する。このことはbcl-２ 転座を有するそれぞれの試料中のDNAの量の半定量的評価を提供する。プレ溶解 試料中のDNAの量とPCR陰性にまでパージングする能力との間の相関関係はない〔 p=0.138、オーダーした偶発性変数についてのウィルコキソン試験〕。プレ溶解 試料中のDNAの量とPCR陰性にまでパージングする能力との間の相関関係の欠如は 種々の患者からのリンパ腫細胞のパージング管理に対する感受性に本質的な相違 があることを示唆している。 試験分析の一部として、患者の臨床上の特徴とPCR陰性にまでパージングする 能力を相関させることを試みた。表１に示すように、PCR陰性およびPCR陽性のサ ブグループを性、組織学および以前のエクストラノーダル(EN)疾病に関して等し く検査した。多数の異なる相関が試みられたが、最良の結果は組織学的骨髄連累 （involvement）の病歴を用いて達成された。骨髄連累の病歴をもたない29名の 患者では、69%がPCR陰性になった。骨髄連累の病歴をもつ85名の患者では、パー ジング後44％がPCR陰性であった（p=0.0169）。他の有用な研究中の変数はこの モデルを改善しなかった。 骨髄からすべての残留するリンパ腫をパージングための補体／抗体の組み合わ せの能力の効果はABMT後の疾病を含まない生存（DFS）と相関した。図３ではABM T後のDFSで患者が溶解後にPCR陰性または陽性にパージングされたかどうかに強 い相関が見られたことが示されている（p,0.00001）。PCR陰性にパージングされ た患者の群では、８年間の間には57名の患者の４名だけが再発した。この群の２ 名の付加的患者は関連のない理由から死亡した後にABMT後24および28カ月の分析 から除去した。これらの２名の患者はいずれも解剖中の肉眼的および顕微鏡試験 後にリンパ腫を有することが見出せなかった。対照的に、bcl-2転座についてPCR 陽性のままの57名の患者の、26名の患者は再発しこの群の中位のDFSは19.7カ月 で達した。 図4A〜4Cは完全に回復した患者および部分的に回復した患者を比較してあり、 完全な緩解患者はDFSを増加した（p=0.0021）ことを示す。しかし、図４もABMT で完全に緩解した49名の患者で、bcl-2についてPCR陰性にパージングされた29名 の患者が、パージング後にPCR陽性のままの20名の患者に比べABMT後にDFSを増加 したことを示す（p=0.0012）。同様に、ABMTで部分的に緩解した65名の患者で、 PCR陰性にパージングされた28名の患者が、パージング後にポスト溶解試料がPCR 陽性ままの37名の患者に比べDFSを増加した（p=0.0011）。 図5A〜5DはABMTでの組織学的骨髄連累もABMT後のDFSと相関することを示す（p =0.0054）。骨髄収集の際に骨髄浸潤の形態学的証拠を有しない65名の患者で、 溶解後にPCR陰性にパージングされた35名の患者はパージング後にPCR陽性のまま の30名の患者に比べDFSを増加したことを示す（p=0.0001）。同様に、ABMTで形 態により最小骨髄連累を有すると評価された（≦５％の内部柱空間）38名の患 者で、PCR陰性にパージングされた20名の患者がPCR陽性ままの18名の患者に比べ DFSを増加した（p=0.005）。11名の患者は骨髄収集の時に明白な組織学的骨髄連 累（10〜20％の内部柱空間）を有した。これらの患者の２名だけがパージング後 にPCR陰性になった。NHLの組織学的サブタイプはABMT後にDFSと相関しなかった （p=0.249）。しかし、各サブタイプ内で、溶解後陰性にパージングされた患者 はDFSを増加した。図４に示すデータを試験した後、結論としてPCR陰性にまでの パージングがDFSを増加させ、さらに補体および抗体の組み合わせが腫瘍細胞を 、すべての異なる骨髄試料についてではないが、骨髄細胞からPCR陰性の点まで 除去する。 パージング後のPCR状態と再発までの時間の関係をログランク試験を用いて評 価した。また分類したログランク試験を分類因子として患者の再発までの一層長 い時間の潜在的な予後の変数を用いて行った。データの単一変数ログランク分析 はABMT後再発までの時間の示唆に富む相違と関連した種々の変数を確認した。こ の分析結果は完全な緩解（p=0.0021）、ABMTでの骨髄浸潤（p=0.0054）およびPC Rに加えて潜在的な説明のための変数として骨髄浸潤の病歴（p=0.05）を確認し た。すべての場合、分類のために他の変数を用いる際にPCRの効果が持続した。P CRの効果はそれぞれの層内で重要なままであった。これらの結果は補体／抗体の 組み合わせが、隠れた腫瘍細胞を骨髄からパージングするための、容易に評価さ れた手段を提供するという有用性を示した。この組み合わせは少なくとも若干の 患者の骨髄中の腫瘍細胞をPCR陰性にまで減少することができる。PCR陰性は増加 したDFSと相関する。なぜすべての患者の骨髄がPCR陰性にまでパージングするこ とができないかに関して明らかでない。他の抗B1および抗J5モノクローナル抗体 、ならびに活性化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的な他のモノクローナ ル抗体が骨髄の腫瘍細胞をパージングすることができる患者の割合を増加させる ことは本発明の請求項に記載した範囲内である。 ABMT法を行った後の、bcl-2転座を有する末梢血細胞の検出結果は骨髄の腫瘍 細胞をパージングする能力と相関することが見出された。本発明を実施する過程 で、分析を行い検出することができるリンパ腫細胞がABMTの時に患者の末梢血中 に存在するかどうかを決定した。25名の患者がこの研究に含められた。また血液 試料をABMT後６カ月試験した。多数の血液試料をそれぞれの患者から得てPCRに より分析した。骨髄および２名の代表的患者、図2bからの患者１および８、から の多数の血液試料を図６に示す。ABMTの前後に患者がbcl-2転座について陽性の 末梢血液細胞をもつことに関し相関関係はなかった（データは示していない）。 しかし、bcl-2転座を含む細胞はパージング後PCR陽性のままのこの群内の14名の 患者の13名の末梢血中の検出された。対照的に、bcl-2転座を有す細胞はCmAb骨 髄パージング後PCR陰性になった11名の患者の末梢血中の検出されなかった。 補体に関連して３および４種のモノクローナル抗体の使用を比較した。19名の 患者からの骨髄試料に含まれる腫瘍細胞を補体ならびにそれぞれの抗B1、B5およ びJ5または抗B1、B4、B5およびJ5を用いる上述した３サイクルにより処理した。 結果を以下の表２に示す。３種のモノクローナル抗体を用いると、10/19の試料 がPCR陽性のままであった。４種のモノクローナル抗体を用いると、5/19の試料 がPCR陽性のままであった。 ＩＩ．ミクロスフィアを用いた腫瘍細胞の消耗実施例１ ．骨髄試料からの腫瘍細胞の補体誘導溶解と磁性スフィア消耗の比較 健康ボランティアからの正常骨髄試料を連続した希釈のリンパ腫細胞系、とも にbcl-2転座を含む、DHLおよびRLで汚染した。これらの細胞系は同一の標的抗原 を等しく発現するが、細胞系の補体媒介溶解に対する感受性における著しい相違 があった。これらの違いは抗B4（抗CD19）モノクローナル抗体を抗B1、B5および J5抗体の組み合わせに添加したか否かで維持された。しかし、抗B1、B5およびJ5 を磁性ミクロスフィアと共に用いた場合、骨髄をDHLまたはRL細胞系で汚染した かどうかに関わらず有意に一層効果的な方法で骨髄試料をPCR陰性にパージング した。 リンパ腫細胞で故意に汚染した正常骨髄を用いて得た陽性の結果はさらに腫瘍 細胞を含む骨髄のアリコートを用いた実験室試験を促進した。腫瘍細胞を含む骨 髄を５名の非ホジキンスリンパ腫の患者から収集した。すべての患者からのアリ コートを最初に補体およびモノクローナル抗体、抗B1、B5およびJ5で処理した。 上述した３ラウンド処理の後、５名の患者の２名からのアリコートがPCR陰性に 達した。その後追加のアリコートを同一の方法であるが、この組み合わせに抗B4 モノクローナル抗体で処理した。５種のアリコートの２種がPCR陰性に達する、 同一の結果を得た。PCR陰性に達するアリコートを両試験とも同一の供給源から 得た。 補体およびそれぞれ３または４種のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた この連続した試験の後、さらに腫瘍細胞を含む５名の患者からの骨髄アリコート をさらに３種（抗B1、B5およびJ5）ならびに４種のモノクローナル抗体（抗B1、 B5、J5およびB4）の組み合わせとともに用いて実験室試験を行った。補体誘導溶 解を用いて上述のように得た結果に対比して、すべての患者からの骨髄試料を処 理の３ラウンド後にPCR陰性にまでパージングした。PCR陰性を３および４種のモ ノクローナル抗体を用いて達成した。これらの結果はリンパ腫細胞の補体媒介溶 解に対する感受性に相違がありさらにこれらの相違がモノクローナル抗体の組み 合わせに補体を加える代わりに、モノクローナル抗体と磁性ミクロスフィアとの 組み合わせを使用することにより克服するかまたは安定化することができること を示唆している。実施例２ ．リンパ腫患者の骨髄試料からの腫瘍細胞の補体誘導溶解と磁性スフィ ア消耗のさらなる比較 ３種（抗B1，B5およびJ5）ならびに４種の（抗B1、B4、B5およびJ5）モノクロ ーナル抗体の組み合わせを調製した。リンパ腫患者からの収集した骨髄を得さら に分割した。骨髄の一部分で腫瘍細胞を前述した補体と３種のモノクローナル抗 体との組み合わせを用いてパージングした。収集した骨髄の残余からの単核細胞 画分をフィコールハイパック密度遠心分離により単離し４種の画分に分割した。 これらの４種の画分を別々に処理した。遠心分離した骨髄の２種の画分を、飽和 濃度の３種のモノクローナル抗体を用いて、約４℃で約30分間インキュベーショ ンし２種を４種のモノクローナル抗体とインキュベーションした。抗体インキュ ベーション時間は約15分〜約１時間の範囲でよい。 モノクローナル抗体とインキュベーションした後、３種の抗体および４種の抗 体インキュベーションは３〜４週齢のラビットの血清からの十分な濃度のラビッ ト補体（Pel-freeze、米国ウイスコンシン州ブラウンディア所在）を用いる補体 溶解により腫瘍細胞を消耗させた。これらの細胞を約37℃で約15分〜約１時間の 範囲の時間、好ましくは約30分間、インキュベーションした。補体処理後、細胞 はデオキシリボヌクレアーゼ（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）の 終濃度2.5mg/mlを含む培地中で洗浄した。このことにより細胞の凝集が予防され 溶解した細胞からのDNAがDNA抽出中に同時に精製されないことが保証された。 残留する３および４種の抗体インキュベーションはヤギ抗マウスIg結合磁性ビ ーズを用いた磁気による分離により消耗された。ヤギ抗マウスIgとIgＭ結合磁性 ビーズ（Advanced Magnetics、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）とを 混合し、指示に従って２回洗浄し106抗体被覆細胞当たり100μLの終濃度で添加 した。これらの細胞を４℃で約15分〜約１時間の範囲、好ましくは約30分間の時 間磁性ビーズとインキュベーションした。インキュベーション後、磁性ビーズを 磁性粒子濃縮機（Dynal）米国ニューヨーク州グレートネック所在）を用いて約1 5分間の２回の連続した手法において集めた。 補体媒介溶解または磁性ビーズ消耗の後、これらの細胞を遠心分離によりペレ ット化し合計３回の処理サイクルについてこの手法を２回繰り返した。それぞれ の３回の処理サイクル前後に、細胞のアリコートを各画分から集めゲノムDNAを 非イオン性界面活性剤およびプロテイナーゼＫ（シグマ社、米国ミズーリ州セン トルイス所在）を用いる細胞溶解により単離した。一群になったオリゴヌクレオ チド増幅を上述の方法で用いるbcl-2/IgHハイブリッド遺伝子のMBRまたはmcl領 域で行った。19種の試料についてのPCR結果を表２に示す。 表２に示す結果は磁性ミクロスフィアを用いて抗体被覆腫瘍細胞を消耗させる ことにより骨髄試料からの腫瘍細胞のパージングが高められ一層多くの試料がPC R陰性にまでパージングされることを示す。PCRアッセイは補体に３種のモノクロ ーナル抗体を加えて処理した試料の50％を３回の処理後にPCR陰性にまでパージ ングすることができることを示す。これらの結果は補体媒介溶解に抵抗する腫瘍 細胞のサブ集団が存在するに違いないことおよび他の方法が腫瘍細胞を除去する 場合一層効果的である場合があることを示唆する。抗B4モノクローナル抗体を補 体と３種のモノクローナル抗体に添加することはパージングしてPCR陰性にする ことができる試料の数を増加させたが；補体媒介溶解法のいずれも磁性ミクロ スフィアを用いて達成されるものに等しい結果を達成しなかった。腫瘍含有骨髄 試料を３または４種のモノクローナル抗体とインキュベーションし磁性ミクロス フィアを用いて消耗させることによりすべての試料が陰性にパージングされた。 本発明で用いられる磁性ミクロスフィアは磁性ポリスチレンラテックススフィ ア、磁性デキストランまたはゼラチンミクロスフィアおよび同様のミクロスフィ アのような任意の磁性ミクロスフィアを用いることができる。ここで用いたよう な、ミクロスフィアとは、すなわち適切な寸法で任意の形；例えば、球形、立方 形、矩形または他の形の磁性もしくは非磁性粒子を含む免疫学的に受け入れるこ とができる基材をいう。磁性粒子はポリスチレン、もしくはゼラチンのような被 覆物質により囲むかまたはその粒子をコーティング中に埋め込むことができる。 本発明で用いた磁性ミクロスフィアの寸法は約0.3ミクロン〜５ミクロンの範囲 でよい。ここに記載した磁性種と同等の非磁性物を本発明に用いることができる 。適切な分離法はかかる非磁性粒子を用いる場合に選択することができる。 免疫グロブリン被覆磁性ミクロスフィアを実施例２に記載のようなモノクロー ナル抗体で飽和させた腫瘍細胞を消耗させるのに用いることに加え、本発明で用 いるモノクローナル抗体を、ミクロスフィアを骨髄試料と混合する前に従来既知 の技術によりミクロスフィアに付着することができる。例えば、モノクローナル 抗体をミクロスフィアと骨髄に含まれる腫瘍細胞と混合する前に免疫グロブリン 被覆ミクロスフィアに付着させることができる。他の例は抗体とミクロスフィア の間の架橋のためのカルボン酸−ジアミンカップルの使用である。ミクロスフィ アがアミン、カルボキシル基またはチオール基のようなペンダント基を有する場 合、抗体をいずれの種類もさらに機能的にすることなくミクロスフィアに付着す ることができる。 次の実施例は本発明のさらなる例であり、限定するものではない。磁性ミクロ スフィアの組成中の変動およびモノクローナル抗体の組み合わせをミクロスフィ アに付着させる方法は本発明の範囲内である。これらには教示を参考としてここ に記載した米国特許に記載された方法が含まれる：米国特許第4,152,563；第4,2 53,844；第3,639,558；第4,452,773；第3,639,558；第4,419,444；第4,738,932; 4,360,358および4,414,324号。参考として記載した他の教示はPCT国 際公開第WO 90/04178号に見出すことができる。実施例３ ．選択的モノクローナル抗体の組み合わせを有する免疫グロブリン被覆 磁性ミクロスフィアの調製。 一般に単分散したかまたは約0.3〜約5.0ミクロンの範囲の均質寸法の非多孔性 磁性ミクロスフィア（時にはビーズと称する）を次のようなラビットまたはヤギ 抗マウス免疫グロブリン（GAMまたはRAM）でミクロスフィアを予め被覆すること によりモノクローナル抗体の組み合わせがその上に結合するように改良する。 まず、250mgのビーズを3mlの蒸留水に分散させ２〜３分間超音波処理する。次 に水中のビーズ混合物を４℃で数時間冷却する。次いでこれらのビーズを磁力で 分離し水を廃棄する。これらのビーズを5mgのRAMまたはGAM中に再懸濁させ500μ lのリン酸緩衝溶液（PBS）で希釈する。この混合物を室温でインキュベーション し４〜５時間混合する。その後ビーズを６回、１％のウシ血清アルブミン（BSA ）を含むPBSの4ml部分で洗浄する。次にこれらのビーズを4mlのPBS-1％BSA中に 再懸濁して混合する。 ５×108個の量の再懸濁ビーズをシリコン処理した試験管にピペットで分注す る。これらのビーズを廃棄する液体から磁力で分離する。次いでビーズをPBS中 に再懸濁し上述した３または４種の選択的モノクローナル抗体の組み合わせを抗 体の組み合わせ濃度が合計で約0.5mg/mlの溶液になるようにこの懸濁液に加える 。次いでビーズおよび抗体を含む溶液を10〜30℃の範囲の温度で、約１時間イン キュベーションする。次にビーズを複数回PBS-1％BSAで洗浄し同一溶液中に再懸 濁させる。実施例４ ．免疫グロブリン被覆磁性ミクロスフィア上の選択的モノクローナル抗 体の組み合わせを用いる骨髄からの腫瘍細胞の除去。 腫瘍細胞含有骨髄を上述の補体媒介溶解のために収集し、濃縮し、洗浄し、分 画してRPMI培地中に懸濁する。次に実施例３により調製した抗体含有磁性ビーズ を骨髄試料に添加し得られた混合物を約10分〜約１時間の範囲の時間、好ましく は約15分間、約４℃の温度でインキュベーションする。その後磁性スフィアを除 去し、さらに細胞を洗浄してペレット化する。この方法を合計３回の処理につい て２回繰り返す。骨髄細胞をその後洗浄してPCRにより腫瘍細胞について試験す る。 ミクロスフィアを用いる腫瘍細胞の消耗 bcl-2転座の検出にポリメラーゼ鎖成長反応の極めて感度の高い技術を用いる ことにより、補体媒介溶解および３種のモノクローナル抗体（CmAb-3）の使用が PCR検出可能なリンパ腫細胞を含む種々の骨髄試料の50％だけをパージングする ことを見出した。この観察結果は残留リンパ腫細胞を有する骨髄を再注輸した患 者が再発頻度を有意に高めるため、臨床上重要である。約50％だけの患者の骨髄 を、PCR陰性にまでCmAbを用いてパージングすることができるという点を鑑みて 腫瘍細胞のミクロスフィア消耗をさらに研究した。ミクロスフィアの使用は腫瘍 細胞の消耗に予期できない程度の有意な改良結果を生じる。ミクロスフィアおよ び３または４種のモノクローナル抗体（MmAb-3またはMmAb-4）を用いることによ り、すべてのPCR検出可能な腫瘍細胞を、25種の異なる腫瘍細胞含有骨髄試料の アリコートからパージングした。これらの同一な25種の試料の種々のアリコート を補体および３種のモノクローナル抗体（CmAb-3）で処理した場合、25種中11種 （44％）だけがPCR陰性にまでパージングされた。第４のモノクローナル抗体を 添加し補体媒介溶解（CmAb-4）して付加的な５名の患者の骨髄をパージングし、 25種中16種とした。またMmAbの使用は掛かり合った骨髄原種細胞の損失を起こさ ないので特異的であることが見出せた。ミクロスフィアの使用結果はミクロスフ ィアの使用が補体媒介溶解より優れていることを示唆し、さらに骨髄原種細胞に 対する非特異的毒性を示さないことによりミクロスフィアの使用が植え付けを害 さないことが予想される。次にミクロスフィアおよびモノクローナル抗体を用い て骨髄試料から腫瘍細胞を除去する他の試験を説明する。 材料および方法 Human Protection Committeeの確認およびインフォームドコンセントの後、Ｂ 細胞NHLの25名の患者から骨髄を得た。イムノタイピングはすべてのリンパ腫が CD20を発現していることを示した。すべての患者は骨髄収集の際の誘導または回 収化学療法（induction or salvage chemotherapy）に次いで病歴の適格最小疾 病レベル（protocol eligidle minimal disease level）に達した。最小疾病の 基準には完全な緩解（CR）または2cm以下の腫瘍塊までの部分的な緩解（PR）お よび内部柱空間の20％未満の骨髄浸油が含まれる。骨髄穿刺液および生検は骨髄 収集の前１ヵ月に得てリンパ腫の浸油を評価しさらにbcl-2転座をＰＣＲ増幅に より検出することができることを確認した。すべての試料はPCR検出可能なbcl-2 転座を含んでいた。 患者特性を次に要約する。20名の患者は濾胞状小分割細胞（follicular small cleaved cell）を有し、１名の患者は濾胞状の混合小および大細胞（follicular mixed small and large cell）を有し４名の患者はび漫性小細胞組織構造を有し ていた。９名の患者は誘導または回収化学療法後にCRに達し残る患者はここで規 定する病歴適格PRに達した。15名の患者は局所浸潤から90％の内部柱空間まで変 化する形態学的骨髄浸潤の前病歴を有した。11名の患者は骨髄収集の時に骨髄浸 潤の形態学的証拠を有した。25名の患者のすべてはPCRにより評価した場合、収 集した骨髄中に残留する検出可能なリンパ腫細胞を有した。19名の患者はbcl-2 の転座含有主要ブレークポイント領域（MBR）を有し６名の患者は少数集団領域 （minor cluster region）（cmr）に転座を有した。 ミクロスフイア ミクロスフィア、すなわちここで用いるビーズとは多数の寸法が0.1〜５ミク ロンの粒子と説明され、球形、立方形、および矩形の粒子ならびに他の形の粒子 が含まれる。好ましい粒子は約0.3〜5.0ミクロンである。これらの粒子はポリス チレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエステル、スチレン−ジ ビニルベンゼン共重合体のような重合体物質で作製することができる。ポリフェ ニレンオキシドおよび他の重合体、共重合体またはゼラチン、デキストランもし くはアミノデキストランのような物質はこれらの重合体、共重合体または物質で 被覆した物質で作製することができる。 ミクロスフィアは磁性または非磁性でよい。磁性ミクロスフィアは重合体マト リックス中に埋め込んだ磁性物質を有する重合体粒子でよく、あるいは磁性核も しくは重合体被膜を有するコアを含んでいる場合がある。ゼラチン被覆粒子の例 は米国特許第5,062,991号に見出せる。 25名の患者の骨髄を処理するために用いる磁性ビーズは、米国マサチューセッ ツ州、ケンブリッジ所在のAdvanced Magneticsから購入しヤギ抗マウス（GAM）I gGおよびIgM結合磁性ビーズによりなる。ここで用いるものは本発明を制限する ものではない。上述した任意の種類を上述した種類の任意のビーズに用いること ができる。非被覆ビーズのIgGおよびIgM被覆は従来技術として良く知られている 。 モノクローナル抗体 抗Ｂ細胞モノクローナル抗体はここで以前説明した。３種の抗体組み合わせ（ mAb-3）はネズミ抗B1、抗B5および抗J5モノクローナル抗体の混合物であった。 ４種の抗体組み合わせ（mAb-4）は抗B4モノクローナル抗体を３種の抗体の組み 合わせに添加することにより形成した。過剰な飽和濃度のモノクローナル抗体を 用いた。 対照として用いた抗Ｔ細胞モノクローナル抗体はCD2、CD3、CD4およびCD28に 特異的で、さらに米国マサチューセッツ州、ボストン所在のDana-Farber Cancer Institute、Dr.C.Morimotoから得た。指摘されたCD特異性を有する他の抗Ｔ細 胞モノクローナル抗体をそれらの代わりに用いることができる。抗Ｔ細胞モノク ローナル抗体は抗Ｂ細胞モノクローナル抗体に匹敵するアイソタイプであった。 過剰の飽和濃度の抗体を用いた。 骨髄パージング 収集した骨髄のアリコートをここに記載したように３種のモノクローナル抗体 および補体媒介溶解（CmAb-3）を用いてパージングした。これらのCmAb-3パージ ング試料をミクロスフィア法の有用性を決定するための対照試料として用いた。 別な方法で特定しないかぎり、すべての試験では骨髄試料の少量のアリコートを 用いた。骨髄試料のバルクを臨床上の試料と称しここで指示したように使用する ために保存した。 骨髄の他のアリコートを特定の配列にしたMmAB技術を用いてパージングした。 単一のパージングサイクルで、これらのアリコートを最初に過剰の飽和濃度の３ 種の抗体と、４℃で30分間インキュベーションした。次にモノクローナル抗体で 被覆されたこれらの細胞をGAM IgGおよびIgMを結合し抗体も結合させた磁性ビー ズの２回洗浄混合物を用いて消耗させた。これらのビーズを106細胞当たり100μ Lの割合で細胞に添加した。これにより約50のビーズ対細胞比が得られた。ここ で用いたモノクローナル抗体が正常Ｂ細胞ならびにリンパ腫細胞を標的とずるの で、評価されたビーズ対腫瘍細胞比は約250〜500の範囲であった。試料をこれら のビーズと４℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、磁性 ビーズを磁性粒子濃縮機（Dynal、米国ニューヨーク州、グレートネック所在） または他の磁性分離手段を用いて15分間集めた。消耗した骨髄細胞試料を清浄な 容器に移しその中に含まれる残留磁性ビーズを第２の15分間の磁性分離中に集め た。 最初のCmAbまたはMmAb消耗後に、処理した骨髄細胞を遠心分離によりペレット 化し、３回洗浄しそして腫瘍細胞の消耗またはパージングを合計３サイクル繰り 返した。最初の消耗サイクルの前および各消耗サイクルの後に、試料細胞を集め ゲノムDNAを非イオン性界面活性剤その後プロテイナーゼＫ（シグマ社、米国ミ ズーリ州、セントルイス所在）で処理することにより単離した。 PCR増幅 試料中に存在する腫瘍細胞のPCR増幅をここに記載したように実施した。この 分析では、50μLの試料を用いて細胞系RLをDHL-6の代わりに用いた。細胞系RLは Dr.W.Urba、National Cancer Institute、Biologic Response Modifiers Branch 、米国メリーランド州、フレデリック所在から譲り受けた。RLは主要なブレーク ポイントでPCR増幅転座を有する。同様の転座を有する他の細胞系をRLの代わり に用いることができる。主要なブレークポイントに転座を用いて細胞系を入手で きなかった。またヒトＢ細胞活性化抗原B7のためのオリゴヌクレオチドを用いて 、PCR増幅を行い、抽出したDNAをすべての試料中でPCRにより増幅することがで きることを確認した。 コロニーアッセイ 25名の患者のうち８名からの骨髄試料をパージング前およびCmAb-4およびMmAB -4を用いた第３パージング後の造血性原種細胞増殖についてアッセイした。試料 をコロニーアッセイを行っている被験者から隠した。顆粒球マクロファージコロ ニー形成単位（CFUGM）を、２層アガーアッセイ［48］を用いる標準法によりア ッセイした。嚢ガン腫細胞系5637（ATCC、米国メリーランド州、ロックビル所在 ）馴化培地をコロニー刺激因子の供給源に対し終濃度10％で用いた。それぞれの 骨髄画分からの合計５×104骨髄単核細胞を２重層アガーシステムの上層の各ウ エル中で平板培養した。４倍のCFUGM培養物を７日および14日、ならびに0.3％ア ガー上層で収集しガラススライド上で乾燥しさらにギルズ（Gill's）ヘマトキシ リン（シグマ社、米国ミズーり州、セントルイス所在）で染色した。CFUGMを７ および14日に計数し、さらに平板培養した５×104細胞当たりの総コロニーおよ び５×１０4個の最初の”プレ消耗骨髄単核細胞当たりの総コロニー数としてあ らわした。 評価 本発明の研究では、PCR検出可能な腫瘍細胞を有する骨髄を25名の患者から得 て、MmAB法を用いて処理し、CmAB法に比べてPCR腫瘍細胞検出レベル未満に消耗 することができる多数の試料において改善を行えるかどうかを決定した。２名の 代表的患者からの試料のPCR分析結果を図7A、7Bに示す。図7Aに示すように、患 者６は３サイクルのCmAb-3処理後に残留PCR検出可能腫瘍細胞を有していた。し かし、すべてのPCR検出可能腫瘍細胞を３回のCmAb-4処理後に除去した。MmAB-3 およびMmAb-4を用いた消耗により２回の処理後すべてのPCR検出可能腫瘍細胞を 除去することができた。図7Cはこの患者のB7遺伝子のためのオリゴヌクレオチド を用いるPCR増幅により得た結果を示す。これらの結果はPCR増幅可能DNAがそれ ぞれの試料から抽出されたことを示す。 図7Bに示すように、患者７はCmAB-3またはCmAb-4を用いる第３回の処理後PCR 検出可能なリンパ腫細胞を有しなかった。類似したMaAb処理を用いる場合、第２ 処理サイクル後にはPCR検出可能な腫瘍細胞を見出せなかった。 ミクロスフィアを用いた骨髄試料のパージングは特異的であると考えられ抗体 を含まない細胞がミクロスフィアに結合することにより失われない。反復実験で は、骨髄細胞を抗Ｔ細胞モノクローナル抗体およびGAM被覆ミクロスフィアを用 いる３サイクルにより処理した場合、ミクロスフィアへの腫瘍細胞の非特異的結 合によりPCR検出可能な腫瘍細胞の消失が起こらなかった。さらに、ミクロスフ ィアの使用はPCR増幅の感度に影響を及ぼさなかった。図８に示す結果が示して いるように、PCR分析は106個の正常骨髄細胞中の１個のリンパ腫細胞を検出する ことができる。 表３には25名のすべての患者からの骨髄試料について３種のCmAb-3、CmAb-4、 MmAb-3およびMmAb-4処理サイクルを行った後のbcl-2転座の多数のおよび少数の ブレークポイント領域でのPCR増幅の結果を示す。CmAb-3処理の第３サイクルの 後、25種の試料のうち11種だけ（44％）がPCR検出可能なリンパ腫細胞を有しな かった。これらの11種では、３種のサイクルがこの状態に到達するのに必要であ った。同一の結果をバルク（臨床的）骨髄試料および25名の患者の24名について のアリコートを用いて得た。患者11について、臨床上の試料は残留する検出可能 リンパ腫細胞を含むが、すべてのPCR検出可能細胞のアリコート画分をパージン グした。このことは少量の骨髄アリコートを用いて得た結果が全収集骨髄試料で 典型であることを示唆している。 骨髄試料のCmAb-4処理は３サイクル後の25名の患者のうち16名（64％）にまで PCR検出可能腫瘍細胞を有しない試料の数を増加させた。試料の残留リンパ腫細 胞を４種の、３種ではない、モノクローナル抗体によりパージングすることがで きる他の５名の患者を患者番号の後にアスタリスクにより示した。しかし、３種 または４種のモノクローナル抗体を用いるかどうかに関わらず、任意の試料のPC R検出可能腫瘍細胞をパージングする前に、３種のCmAb処理サイクルが必要であ った。研究した患者の数に鑑み、第４のモノクローナル抗体をCmAb処理法に加え ることに統計学上有意な利点があるとは思えない（p=0.256、フィッシャー抽出 試験）。 患者特性とパージングの成功を関連付ける試みを行った。患者の臨床的特性（ 組織学、ABMT［Cr対PR］の状態、以前の骨髄連累または収集時の骨髄連累）とCm Ab-3またはCmAb-4を用いる骨髄のすべてのPCR検出可能な細胞のパージング能力 との間に関連は見出せなかった。 ミクロスフィアを用いて得た結果は有意に異なっており補体媒介溶解を用いて 得たよりも良好であった。ミクロスフィアを用いる３種の処理サイクルの後、３ または４種のモノクローナル抗体を用いてすべての25名の患者試料のPCR検出可 能なリンパ腫細胞を消耗させることができた。統計学的に、進歩は３種のモノク ローナル抗体を用いてp=0.0001であり、４種の抗体を用いてp=0.0016であった。 ２種だけのMmAb-3処理サイクル後、11名の患者試料（44％）のPCR検出可能細胞 がパージングされた。MmAb-4を用いた２種だけの処理サイクル後、20名の患者試 料（80％）が腫瘍細胞についてPCR陰性となった。４種のモノクローナル抗体の 使用は、CmAb中の同一点で３種のモノクローナル抗体を使用する第２の処理サイ クル後（p=0.0186）、残留リンパ腫細胞を除去する際に有意に一層効果的であっ た。２種のMmAb-4サイクル後ではなく、２種のMmAb-3処理サイクル後に、骨髄に 残留PCR検出可能リンパ腫細胞を含むこれらの患者は表３に記号＾＾で示す。表 ３に示した結果中、意味のあるものは４名の患者、番号５、14、19および21の骨 髄が単一のMmAb-4処理後に、PCR検出可能な腫瘍細胞を示さなかったことである 。患者21の試料はCmAB-3またはCmAb-4のいずれを用いてもPCR検出可能な細胞を 消耗させることができないため、特に有意である。 試験中の関心はミクロスフィアパージング方法が骨髄単核細胞の受け入れがた い損失を招くかもしれないことであった。処理した患者からの単核細胞の数は（ 6.44±1.23）×109の範囲であった。CmAb-3処理後、臨床上の試料は（4.4±1.2 ）×109細胞、68％の回収率であった。CmAb-3を用いる評価（evaluation）アリ コートからの細胞回収率は72％であった。２つの値は極めて一致している。ミク ロスフィアの使用は補体の使用に関係のある非特異的細胞損失を減少させるよう に思われる。細胞回収率はMmAb-3の後、78％で、MmAb-4後に82％であった。す べての場合、CmAbまたはMmAbにおいて、総細胞の約５％を分析のために、全部の パージングサイクル中に除去した。従って、最大回収率は95％である。フローサ イトメトリー分析はCmAbまたはMmAbのいずれの後もＢ直系細胞（lineage cell） の損失はなかったことを示す（データは示していない）。 他の関心事はミクロスフィアまたは補体媒介溶解の使用により骨髄から造血性 原種の損失が起こることであった。３種の処理サイクルによるCmAb-4またはMmAb -4を用いる平行実験では、コロニーアッセイを患者18〜25のために説明したよう に確立した。３名の患者の試料についての結果を、細胞損失について修正し、表 ４に示す。これらの結果はミクロスフィア消耗後７または14日では消耗しない骨 髄試料（プレ）またはCmAbに比較して５×104個の細胞当たりのCFUGMの、有意な 損失が起こらないことを示す。コロニーの数を修正し５×104個の”プレ消耗” 骨髄単核細胞当たりで示す場合、”プレ”試料に比較してMmAb消耗試料について ７または14日にCFUGMの有意な損失（NS）が起こらなかった。しかし、修正したC mAb試料は研究した８名の患者の７名で７または14日にCFUGMの有意な損失を示し た。しかし、８名の患者の７名にCmAb後７および14日でCFUGMの有意な損失が起 こったが、これらの患者のすべては高い投与量の治療後にその骨髄の再注輸の後 直ちに植え付けた。 ここに示した結果は複数のモノクローナル抗体およびミクロスフィアを用いる 腫瘍細胞の消耗が複数のモノクローナル抗体と補体媒介溶解を用いる方法より有 意に一層効果的であることを示す。また、これらの結果は３回のMmAb消耗が必要 であり、MmAb消耗骨髄の再注輸がCmAb消耗骨髄に比べ優れた結果を生じることが ありミクロスフィアの使用が植え付けを害しない適用において脊髄原種細胞に対 し非特異的毒性を欠如することが示される。 CmAbパージングのすべての腫瘍細胞の除去の不履行を説明することができ、こ れは３種の起こりうる機構が原因である場合がある。第１に、クローン原性腫瘍 細胞が多数の腫瘍細胞により発現される表面抗原を発現しない場合である。第２ に、モノクローナル抗体のリガンドへの付着後の１種以上の表面抗原の調節が補 体媒介溶解を制限する場合である。第３に、患者のサブグループが補体媒介溶解 に対し本質的に一層抵抗性のあるリンパ腫を病んでいる場合である。モノクロー ナル抗体の同数を両方法に用いる場合、補体媒介溶解方法は腫瘍細胞を完全には 除去できないがミクロスフィア方法はすべての場合に残留リンパ腫細胞を消耗さ せることができるので、第３の機構が最も有望と考えられる。補体の溶解作用に 抵抗する細胞の起こり得る多数の機構は技術文献に説明されている。細胞中の生 化学的現象と補体媒介溶解に対する感度との間の関係が示されている［49、50］ 。ヒト骨髄中に抗補体因子が存在することが示されている［51］。最後に、さら に若干のリンパ腫細胞はミクロスフィアにより除去が可能である、かかる低密度 の標的抗原を発現することが可能であるが、補体媒介溶解では可能でない［52、 53］。 自己骨髄中のリンパ腫細胞の再注輸がABMT後に次の再発の一因となるかどうか に関し議論があるが、ここに示したCmAbの結果はパージング後、自己骨髄にPCR 検出可能リンパ腫細胞を含む患者で再発の発生率が高まることを示す。しかし、 この観察結果は再注輸したリンパ腫細胞が再発の原因であることを証明しない。 内因性疾病は、同系の骨髄の再注輸後でさえも、若干の患者の再発に関係すると 考えられる。無作為化した試験または遺伝子マーカー研究がいずれも内因性疾病 対再注輸腫瘍細胞により起こった再発に関連する寄与を詳細に説明するのに必要 であることがいくつかの場合に立証されたが、本発明の請求の範囲に記載された 手法は腫瘍を含まない骨髄を再注輸する際に再発率が有意に減少する場合、この ことは骨髄誘導細胞が再発に関連することの強力な指標である。図３に示す長期 間CmAbの結果はABMT後の疾病を含まない生存が患者の骨髄をPCR陰性または陽性 にパージングしたかどうかと強力に相関することを示す。陰性にパージングした 群では、８年後までに57名の患者のうちの４名だけが再発した。対照的に、骨髄 がCmAb後にPCR陽性の57名の患者のうち26名は、再発し疾病を含まない生存時間 の中央値は19.7カ月であった。CmAb結果の重要性として、腫瘍細胞を除去する場 合の任意の改善、例えばここに記載したようなミクロスフィアの使用は疾病を含 まない生存を経験する患者の数および／または生存時間の長さを増加させること ができると信じられる。実施例５ ．ゼラチン被覆磁性ミクロスフィア上の選択的モノクローナル抗体の組 み合わせを用いた骨髄からの腫瘍細胞の除去 磁性ミクロスフィアを米国特許第5,062,991号の記載に従って調製しそれに１ 〜20原子長の架橋基を用いてモノクローナル抗体を結合する。腫瘍細胞を含む骨 髄を収集し、濃縮し、洗浄し、分画して補体媒介溶解用の上述したようなRPMI培 地中に懸濁する。次に抗体含有磁性ビーズを骨髄懸濁液に添加し得られた混合物 を実験的に求めた時間、可能なら10分〜約２時間、約４℃の温度でインキュベー ションする。次に磁性スフィアを除去し、さらにこれらの細胞を洗浄してペレッ ト化する。この方法を合計３種の処理について２回繰り返す。次いで骨髄細胞を 洗浄しPCRにより腫瘍細胞について試験する。あるいはまた、米国特許第5,062,9 91号の記載に従って調製した磁性ミクロスフィアをGAMで被覆し実施例２に記載 したように使用する。Detailed Description of the Invention             Using microspheres and monoclonal antibodies             Immunological purging of tumor cells from bone marrowGovernment assistance   This invention was made with US Government support and is subject to U.S. Government Health Research Has certain rights under Grants CA40216 and CA34183.Technical field   The present invention uses a unique combination of monoclonal antibody and microspheres. The immunological purging of tumor cells from bone marrow, further comprising the unique combination Tumor cells were purged with bone marrow by self-treatment and transplantation of B cell phosphorus A method of treating a patient with papilloma.Background technology   Treatment with autologous bone marrow transplant (ABM) after high-dose radiation / chemotherapy is increasing Has become a major treatment option for patients with certain hematological and solid tumors [1 ~Ten]. Injection of autologous bone marrow prevents consequent severe myelosuppresion Cells that provide sufficient hematopoietic stem cells for Vesicles may be involved in increased recurrence after transplanting this bone marrow back into the patient There is a relationship. In non-Hodgkin's lymphoma (NH) Disease-induced bone marrow infiltration is common at diagnosis and recurrence [11-12].   A trial of purging bone marrow lymphoma cells with immunological and pharmacological agents. Are described in detail [2, 4, 13-14]. These studies have examined the bone marrow of patientsin vitro , Purging without significantly reducing hematological implants It shows that you can do it. However, even after nearly a decade of scientific research, the bone marrow collected To remove a small number of residues or even histologically apparent tumor cells There is ongoing debate over whether or not to do so. Moreover, such studies have shown that bone marrow purging Opportunities (patient's ch) for disease-free survival (DFS) The question of whether to contribute to improving the ance) is not fully answered.   Whether tumor cell purging increases the chances of a patient free of disease The major obstacles to making a decision arein vitroOr latency in bone marrow before and after purging The inability to accurately identify lymphoma cells. Normal morphological method Using bone marrow, bone marrow samples that were judged to be histologically normal contained up to 5% of lymphoma cells. Can be further infiltrated together. This 5% figure is for morphological tumor cell detection It is the lower limit. However, in recent years, a more sensitive assay for bone marrow invasion with tumor cells has become more sensitive. High technology has been developed. This new technique uses conventional morphological methods to assay Sufficient number of selected “histologically normal” bone marrow samples [15–17] It was confirmed that it may actually be included.   A particularly useful technique for assaying latent cells in bone marrow is polymerase chain growth. It is a reaction (PCR). Various publications [18-28] include PCR amplification using chromosome 18 Contains the upper bcl-2 proto-oncogene and the immunoglobulin heavy chain locus on chromosome 14. Can detect interchromosomal translocation It is shown that. This translocation occurs in approximately 85% of patients with follicular NHL and is more diffuse. It occurs in 30% of patients with sex NHL [21–26]. 10 PCR techniques with the highest sensitivity6Normal One lymphoma cell in the cell can be detected [18,20]. I'll show you here Thus, by determining whether the bone marrow is PCR positive or PCR negative, The efficacy of the substance used to monitor can be assessed more accurately. Then this spirit The degree allows a more accurate assessment of a patient's likelihood of disease-free survival.   Purging bone marrow with monoclonal antibodies in the presence of complement is often Reported by a number of researchers over the last decade. L.M.Nadler et al. , Lancet, ii: 427-431 (1984) is autologous bone marrow transplantation for patients with recurrent B cell NHL. Reported to use anti-B5 (anti-CD20) monoclonal antibody and complement for ing. Baumgartner et al., `` Proceedings of the 1st International Sympo sium on Autologous Bone Marrow Transplantation ", K. Dicke, G. Spitzer and And A.R.Zander Rev., (1985), pp. 377-381, Treatment and Complement and Monoclonal. Bone marrow treated with anti-Y-29 / 55 antibody is reported. Recognizes malignant lymphoid cells derived from human plasma cell precursors among other cells With acute, lymphocytic leukemia cell null, normal, pre-B, and T types, or It does not react with normal hematopoietic factors, including granulocyte-macrophage precursors. Feeney et al. , "CaI1cer Res." 41: 3331-3335 (1981), using complement and antibodies. It has been reported to remove leukemic cells from rat bone marrow.   More recently, Armitage et al. Is "Bone marrow transplantation in the tre Atd of patients with lymphoma. "[1]; Freedman et al. Is "Autologous bone marrow transplantation in B-cell non-Hodgkin's lympho [2]; Hurd et al. are studying "Autologous bone marrow trans pl antation in non-Hodgkin lymphoma: monoclonal antibodies plus comptem entfor ex vivo marrow treatment. ”[4]; Ball et al. tolo gous bone marrow transplantation for acute myeloid leukemia using m onocl onal-purged bone marrow. "[6]; and Frei et al. Studied the prospect of "Bone marrow transplantation for solid tumors ..." 9]. However, none of these publications include drugs or antibodies or their Combination and / orin vitroAfter autologous bone marrow treatment with No method has been shown to allow the patient to survive for a period of time.   The present invention solves the problems of the prior art by eliminating microspheres and multiple monochrome Tumor cells from the bone marrow by using a combination of internal antibodies (hereinafter referred to as MmAbs). It achieves important advantages in purging cells. The invention according to the claims Collected here using microspheres and selected anti-B cell monoclonal antibodies The data disclosed in (1) describes complement-mediated lysis and multiple monoclonal antibodies (hereinafter CmAb A significantly higher rate of depleting tumor cells compared to known methods using Clearly shows that there is an unexpected synergistic interaction resulting in . This synergistic interaction was observed in all samples of tumor cell-containing bone marrow samples treated here. After treatment with multiple selective monoclonal antibodies and microspheres three times, To the fact that it can be purged to be PCR negative in tumor cells More obvious. In contrast, complement-mediated lysis and multiple monoclonals identical With the antibody, a sample with approximately 50% CmAb purged is shown after three CmAb treatments. Re It contained tumor cells as indicated by the lack of PCR negative to be. Microsoff And selected T cell monoclonal antibodies were tested using microspheres. Shows that use of does not promote removal of tumor cells from bone marrow by itself . As a result, observed by purging tumor cells from bone marrow with MmAb Synergistic interactions are added along with the separate effects of microspheres and antibodies. It is not just an added effect. In conclusion, the CmAb data presented here is bc Ability to purge bone marrow to PCR negative due to l-2 translocation and disease of patients after ABMT We show that there is a highly significant correlation with survival without. However, bone marrow samples Only about 50% of the population can purify PCR negative with CmAb Was found. The data presented here show that the use of MmAb was PCR negative (up to 90-100%). ) Shows a significant increase in the percentage of samples that can be purged, It is believed that the use of can significantly improve the statistics of disease-free survival.Disclosure of the invention   In the present invention, for the purpose of autologous bone marrow transplantation as a treatment, patients with B cell lymphoma Disclosed is a unique method for immunologically purging tumor cells from bone marrow. This The method involves the following steps:   (A) collect bone marrow;   (B) Multiple selective monoclonal antibodies and microspheres with specific sequences For use in polymerase chain growth reaction assays without depleting non-tumor cells Treat the bone marrow to a level where more tumor cells are not detected in the bone marrow;   (C) Administer the treated bone marrow to the patient who obtained it.   This method involves the binding of antibodies to tumor cells and antibodies and microspheres, preferably about Magnetic microspheres in the size range of 0.3 to about 5.0 microns for binding antibodies Includes the use of microspheres coated with goat anti-mouse immunoglobulin (Ig) It Goat anti-rabbit and rabbit anti-mouse Ig can also be used in the present invention. Goat anti-mouse Ig is preferred. The microspheres that bound the tumor cells with the antibody , Then separated from bone marrow samples. Multiple monoclonal antibodies and microspheres This unique method using a It was found to be removed until negative. In addition, multiple selective monochrome The use of antibody and complement purifies approximately 50% of the tumors contained in bone marrow samples and PCR However, using multiple monoclonal antibodies and microspheres , About 90-100% of the tumor-containing samples were purged to PCR negative. Micros In another example of using spheres, instead of sequencing antibody and microsphere treatment, tumor Monoclonal antibody bound to microspheres prior to contact with bone marrow containing tumor cells Or bound or coated with immunoglobulins or other substances Can be attached to microspheres. These examples are known to those skilled in the art Consideration should be given to existing stereochemistry and other physical studies. For example, If the body is allowed to bind to the microspheres before contacting the sample with tumor cells, the It is necessary to introduce a bridging group having a length of about 1 to 20 atoms between the surface of the cross sphere and the antibody. There may be a point. This method then applies to the microspheres after the purging cycle. Combined washes and bulk samples to minimize washes and loss of non-tumor cells May need to be done.Brief description of the drawings   FIG. 1 shows various complement and / or antibodies assessed by clonogenic cell proliferation. A graph showing the efficacy of Raji cell immunological purging used is there;   2A and 2B show the polymerase chain reaction (PCR) before and after the treatment of the present invention. 5 shows the results of Southern blot analysis of the amplified bcl-2 translocation sequence;   Figure 3 Insurance statistical probability of disease-free survival after ABMT in 114 B-cell NHLs. (Actuarial probability) graph;   Figures 4A-4C show the maintenance of disease-free survival after ABMT, subdivided by ABMT disease status. It is a graph of the probability in the statistical statistics;   Figures 5A-5D show disease-free survival following ABMT, subclassified by the bone marrow ensemble of ABMT. It is a graph of the probability in the statistical statistics;   Figure 6 shows two people due to the bcl-2 translocation sequence amplified by polymerase chain reaction. Of bone marrow (A) and numerous peripheral blood samples (BG) from patients with To It is an analysis result.   Figures 7A-7C show the Southern bcl-2 translocation sequence amplified by the polymerase chain reaction. The result detected by lot analysis is shown.   Figure 8 shows 10 PCR analysis6Treatment of 1 lymphoma cell in 4 normal mononuclear cells with MmAb-4 It can be detected in.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION References   1. J.O. Armitage et al. , Blood, 73: 1749-1758 (1989).   2. A.S. 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Complement-mediated lysis shown here The solution data is compared with the claimed invention.   A major concern when using ABMT is that clonogenic tumor cells are associated with autologous bone marrow. It may be reinjected and associated with patient recurrence. Micros according to the invention Effective immunology using a unique combination of spheres and selective monoclonal antibodies Parsing is possible. This combination yields 10 in the clonogenic assay.3 ~Ten6It is possible to induce the disappearance of individual tumor cells. Tumor cells after treatment according to the invention As a result of this decrease in Bcl-2, a PCR-amplifying resting point containing the bcl-2 translocation Bone marrow was PCR negative in 57 of 114 patients with. More importantly Depleted residual lymphoma cells, ie re-injected with PCR-negative autologous bone marrow These patients who were looped could not purge the bone marrow to a PCR negative value. , As a result, was highly reduced, but with autologous bone marrow containing residual lymphoma cells Highly statistically significant increase in disease-free survival compared to reinfusion patients It was   114 patients with B-cell non-Hodgkin's lymphoma were studied. All patients Was a radiation / chemically sensitive disease at the time of ABMT. This is an aggressive inducement Or salvage radiation / chemotherapy protocol-eligible minimal disease state (p It was evaluated as achievement of rotocol eligible minimal disease state). Protocol The criteria for disease qualification are (1) complete remission (CR) or tumor mass of 2 cm or less Whether there is partial remission (PR) and (2) tumors in the first protocol Bone marrow infiltration of less than 5% due to tumor cells, but less than 20% by the following protocol It is included whether it is the internal pillar space (intertrabecular spase). Immune thailand Demonstrated expression of B1 (CD20) in all cases by immunotyping did.   Immunologically purging with complement to tumors with sufficient numbers of multiple anti-B cells and Removed with anti-CALLA (anti-normal acute lymphoblastic leukemia antigen) monoclonal antibody Then the bone marrow was reinfused. Presence of sufficient amount of monoclonal antibody is present in bone marrow. It is determined by a pretreatment test that measures the approximate amount of tumor cells that are present. Rabbit complement I liked my body.   Negative PCR is typically achieved after 3 treatments or tumor purging cycles It was As a result, in all cases, the purged bone marrow was treated with three bone marrow treatments or It was only transplanted after the purging cycle. Bone marrow from all patients The al was cryopreserved before and after purging. Not stored at low temperature before and after purging DNA was extracted from samples of 38 patients. For 10 of these patients, it DNA was also extracted from aliquots of bone marrow obtained after each of three complement / antibody purgings. I put it out. Cells isolated from diagnostic lymph nodes were cryopreserved in many patients . Normal bone marrow was obtained from healthy volunteer donors. Genomic DNA in all cases About non-ionic surfactant and proteinase K (Sigma, Missouri, USA) Isolation by cell lysis treatment using St. Louis (State). 50 other DNA extracts Output was also performed using known established methods.   Bone marrow is collected from the iliac crest under general anesthesia and heparin-free RP containing no preservatives MI medium [Whitakker, Piscattaw, NJ, USA The location]. The collected bone marrow is concentrated to obtain buffy coats, and the Cobe 2991 cell washing machine is used. Washed with. The mononuclear cell fraction was collected from Ficoll Hi-Pack (Pharmacia, USA). -These cells isolated by centrifugation on Piscataway, Jersey) 0.5% fetal bovine serum [FBS, Hycone Lab, Roh, Utah, USA Moth 2) in RPMI 1640 including7Resuspended at a concentration of individual cells / ml. these The cells are treated with monoclonal antibodies, preferably in saturating concentrations, sufficient to remove the tumor. Incubate with the body for a time ranging from 15 minutes to about 1 hour, preferably about 15 minutes at 4 ° C. I masturbated. Number of tumor cells present at saturating concentrations of each antibody and antigen on cells Determine from density. Rabbit complement [3-4 week old rabbit serum, perfrey Pel Freeze Inc., Bra, Wisconsin, USA Add location) to each lot at a predetermined dilution for 30 minutes 37 2.5 mg / ml of deoxyribonuclease (signature to prevent cell aggregation at MA, Inc. (St. Louis, MO) I did. The amount of complement added depends on the sample volume, but is in the range of 1/1 to 1/10 v / v. is there. Pellet these cells by centrifugation andin vitroAt Monoku Repeated twice for a total of 3 treatments with Ronal antibody and rabbit complement It was These cells were washed 3 times and autologous serum and 10% dimethyl sulfoxide were added. (Sigma, St. Louis, Mo., USA) and resuspended, followed by Takovari an et al. , N. Engl. J. Med., 316: 1499-1505 (1987) Existed. Prior to re-infusion, cryopreserved cells are thawed rapidly and Takovarian et al. ． , NEMJ, 316: 1499-1505 (1987) in a medium containing DNAase. Living Viability was measured by trypan dye exclusion. Generally, bone marrow is obtained within 4 weeks I re-transfused.   The lymphoma cell line large and DHL-6 were used in the evaluation of the present invention. Large is CD20, C Human Burkitt lymphoma B cell line expressing the D10 and B5 antigens. Large thin Cells are 10% heat inactivated FBS, 2% L-glutamine, 1% sodium pyruvate and Were grown in RPMI 1640 medium containing 1% penicillin and streptomycin. It was DHL-6 is a human B cell line containing the bcl-2 translocation and is a Dr. A. Epstein (Univ. So. Cali. f., Los Angeles, USA).   The monoclonal antibody used in the present invention is an anti-CD (anti-B1) monoclonal antibody, active B cell and B cell lymphoma specific monoclonal antibody (anti-B5), anti- CD10 (anti-J5) and anti-CD19 (anti-B4) monoclonal antibodies It The antibodies used in the present invention must induce the lysis of tumor cells in the bone marrow in the presence of complement. It is necessary. The antibodies used here all induce lysis in the presence of rabbit complement.   Anti-B1 is a 35,000 dalton cell surface glycoprotein found on normal and malignant cells. It is a quality-specific IgG2a murine monoclonal antibody. Old antigens are peripheral blood, phosphorus It is found on all B cells isolated from the paragland, spleen, tonsils and bone marrow. Again this Antibodies are found in 50% of CALLA-positive acute lymphoblastic leukemia (ALL); normal T It is not found on cells, monocytes, granulocytes or tumors of these lineages. B1 antigen is B cell An essential component of the membrane, plus some null cell lymphoma and non-T cell ALL Can be found above. Anti-B1 monoclonal antibody was described by P. Stashenko et al., "Characterizat. ion of a human B lymphocyte-specific antigen ", J. Immunol., 125: 1678 or later See below (1980) and L.M. Nadler et al. , "A unique cell surface antigen i dentifying lymphoid malignancies of B cell origin ", J. Clin. Invest., 67 : 134 See below (1981). Reacts to react with old antigen in the same way as anti-B1 Any monoclonal antibody can be used in the practice of the present invention. Complement-mediated lysis The solution depends on the complement-mediated cytolytic activity of the monoclonal antibody.   Anti-B5 is a murine IgM monoclonal antibody described in U.S. Patent No. 4,692,405. It is the body. B5 antigen has a molecular weight of 75,000 daltons and also unstimulated lymph glands and spleen And expressed on a few activated B cells in the tonsils. Peripheral blood, lymph gland, spleen or It is not expressed on B cells obtained by isolation from tonsils.in vitroSo protein A, Active with anti-Ig, Epstein-Barr virus or pokeweed mitogen. The spleen B cells obtained after sexualization show the presence of the B5 antigen. B5 is a wide variety of B types Spore neoplasms and numerous B-Clls, Burkitt's lymphomas, poor nodular fractions Lymphocytic lymphoma that has not metastasized, diffusely poorly differentiated lymph Spherical lymphoma, diffuse large cell lymphoma, hairy cell leukemia, and diffuse It is found on well-differentiated lymphocytic lymphoma. B5 is non-T cell All, T cell or Expressed on myeloid leukemia cells, normal T cells, monocytes, granulocytes, red blood cells or platelets Absent. However, it appears in some non-hematopoietic malignancies, especially small cell lung carcinoma. Same as anti-B5 Any monoclonal antibody that reacts with the B5 antigen in one method is suitable for the practice of the present invention. Can be used.   Anti-J5 was directed against human normal acute lymphoblastic leukemia antigen (CALLA) about 1 0 IgG2a murine monoclonal antibody with a molecular weight of 0,000 daltons. This anti Hara accounts for 80% of patients with non-T cell ALL and 40-50% of blast crisis chronic myeloid leukemia Can be found on tumor cells from. This antigen is a minority in normal bone marrow and fetal liver. Present on cells. The J5 antigen was also found to be defective in some B cell and T cell lymphomas. Well-differentiated nodular lymphocytic lymphoma, Burkitt lymphoma and And T-cell lymphoblastic lymphoma, and on the tubular epithelium and glomerulus of normal kidney It is found on skin cells as well as on tumor cells, including breast smooth muscle epithelial cells. Anti-J5 monoclonal The antibody was used in tumor cells from patients with CALLA-positive non-T cell ALL by J. Ritz et al. , "A  monoclonal antibody to human acute lymphoblastic leukemias antigen. ", N ature, 283: 583 et seq. (1980), spleen cells from immunized BALB / cJ mice. It was derived from the hybridization of mouse NS / 1-AG cells. J as well as anti-J Use of any monoclonal antibody that reacts with 5 antigens in the practice of the present invention Can be.   Anti-B4 (anti-CD19) is a murine IgG for CD192aIt is a monoclonal antibody. This Antibodies on all B cells isolated from lymphoid organs and on normal adult bone marrow cells. It recognizes the B4 antigen which is present above about 5%. In addition, the B4 antigen is greater than 95% non-T cell. B-cell lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia Is expressed in 90% of   Anti-B1, Anti-B5, Anti-Old and Anti-J5 Monoclonal Antibodies are Hialeah, Florida Coolter Immunology Division of your local Coolter Corporation? Can be obtained commercially. Clonogenic assay   Bone marrow was obtained from a healthy volunteer donor, using heparin without preservatives Prevented blood clotting. Mononuclear cell fraction for Ficoll Hipack density gradient centrifugation 11.1 Gy cells before isolation and purging experiments before mixing cells with lymphoma cells Irradiate with 40 Gy of radiation per minute (137Cs, Gamma cell, Atomic Energy of Canada , Ottawa, Canada). Normal Bone Marrow Mononuclear Cells Irradiated with the Lymphoma Cell Line Large 2 × 10 by adding 1:20 to cells7Suspended in medium at individual cells / ml. This thin Monoclonal antibody using the same protocol in which the cell suspension was used for bone marrow harvest samples And a combination of complements were treated three times in total. The cells are then washed 3 times and the limiting dilution Plated in essays [33]. 5 x 10 for each sample in successionFive~ 0.5 cells / 10 Diluted to 100 ml RPMI medium supplemented with% FBS. 48-96 aliquots of each dilution Flat-bottom microculture well (Nunclo, Nunc, Denmark) Plate culture was performed. Add fresh medium every 4 days at 37 ℃, 5% CO2In the atmosphere, 14-18 days ink I was incubating. Growth of serial dilutions was "all or nothing" using an inverted phase microscope (inve It was evaluated in a positive or negative fashion under a rted phase microscope. This Under such conditions, only tumor cells that grow have high cloning efficiency. each Number of negative well plots for all cells at each point at dilution Follows the Poisson probability distribution. Minimize the frequency of clonogenic cells in the test population Evaluation was performed using the standardization (Chi-square minimization). Polymerase chain growth reaction   The DNA was heated at 96 ° C. for 10 minutes to inactivate proteinase K before amplification. In groups For each sample, amplification of bcl-2 / IgHHybrid remains Done in a large number of breakpoint (MBR) and a small number of cluster (mcr) regions of the gene It was The conditions for PCR amplification of MBR are the serially diluted cell line DH in normal bone marrow mononuclear cells. Optimized using L-6 106Easily detect dilution of 1 tumor cell in 1 normal cell I was able to put it out. Both cell lines use the primer for mcr. It was not useful for the accurate determination of PCR sensitivity. However, using patient tumor cells 10 dilution studies6Suggests sensitivity of at least one tumor cell in one normal bone marrow cell It Standard precautionary measures against cross contamination of amplified material The amplified material was not included in the region where DNA extraction was performed.   PCR amplification was performed with the Perkin Elmer Cetus thermal cycler (Cetus, USA). (Emeryville, PA) 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, 2.25 mM MgCl2, 0 0.01% gelatin, 1.5 mg DNA, 20 nM oligonucleotide primer, 200 each mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 1.5 U Taq polymerase (Cetas, USA 25 times in 50 ml of buffer containing Emeryville, PA). the first Amplification is 5'CAGCCTTAAACATTGATGG oligo nucleotide for MBR (SEQ ID NO: 1) , 5'CGTGTGGTACCACTCCTG3 '(SEQ ID NO: 2) and J for mcrH Consensus Performed using 5'ACCTGAGGAGACGGTGACC3 '(SEQ ID NO: 2) for the suspension region It was Each time, denaturation at 94 ℃ for 1 minute, 55 ℃ (MBR) or 58 ℃ (mcr) for 1 minute. Performed using kneeling and extension at 72 ° C for 1 minute. Last extension period is 10 minutes I put it off.   Aliquot 5 ml of the amplified mixture to 50 ml and add oligo Leotide Internal, 5'TATGGTGGTTTGACCTTTAG5 'for MBR (SEQ ID NO: 4) 5'GGACCTTCCTTGGTGTGTTG3 'for mcr (SEQ ID NO: 5) and   JH Use 5'ACAGGGTCCTTGGCCCA3 '(SEQ ID NO: 6) for consensus region Denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 58 ° C for 1 minute and elongation at 72 ° C for 1 minute. Long was performed and reamplified 30 times. The final extension period was extended again for 10 minutes. Final reaction An aliquot of the product is a 4% agarose gel containing ethidium bromide (NuSieve, FMC , Rockland, Maine, USA) and under UV light. Visualized. DNA is a Zeta probe blotting membrane (Bio Rad) USA Bcl-2 specific DNA by blotting onto Richmond, Calif.).32P Labeled oligonucletide probe, 5'CCCTCCTGCCCTCCTTCCG3 'for MBR Column No. 7), and 5'GGACCTTCCTTGGTGTTG3 '(SEQ ID No. 5) for mcr It was detected by hybridization overnight. The oligonucleotide of the manufacturer Follow T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Mass. (Beverly, CH)32P) Radiolabeled with ATP.   Controlled test of normal cell line DHL-6 in bone marrow cells-FiveNot composed of DNA from the dilution Crab positive control and PCR buffer containing heat inactivated proteinase K A sex control was used with each amplification. Repeat each sample at least 3 times for each It was analyzed at the breakpoint point. In addition, all samples that do not detect PCR products For the first oligonucleotide and a primer specific for the human B7 gene. Can be used to repeat the PCR reaction to amplify DNA in all samples. And made sure. Then serial dilutions of each DNA sample were made in PCR sample buffer . PCR was performed and the PCR was negative to evaluate the amount of DNA with translocation in the starting material. Has been determined. Evaluation and statistical methods   Prior to processing, the patient should be subject to whole blood chemistry, bone marrow aspirate and biopsy. It was evaluated by biopsy, physical examination, cell surface phenotype of bone marrow mononuclear cells and peripheral blood. other X-ray computed tomography, which is necessary to determine the spread of disease Line and gallium scanning are included. After reinfusion, retest every 6 months Was performed when clinically necessary.   Log relationships between patient characteristics, PCR postlysis results and time to relapse It was evaluated using the link test [38]. The relationship between patient characteristics and PCR is It was evaluated by a fish exact test [39]. Ordered random variables (ord ered contingency variable) Wilcoxon test Used for ordered taxonomy data. In addition, the classified log rank tests are Considered using patient variables that are considered to have a longer prognosis before relapse It was Cox proportional hazards regression [41 ] To construct a model to assess the effects of covariates on the risk of recurrence. saw. Disease-free survival curves for Kaplan and Meier The evaluation was performed using the method [42], and the results were compared by a log rank test. Survival rate of bone marrow transplant Calculated from the day. Table 1 contains the relevant characteristics of the patient that occur during the testing of the present invention. stop.   The ability to purge tumor cells from normal bone marrow with monoclonal antibodiesin v itro It was proved using the model. The hybridoma cell line large was used as a normal donor It was added to the nuclear cells at a ratio of 1:20. This suspension is then treated with anti-B cell monoclonal antibody Anti-B1 and anti-B5 and anti-J5, alone or in combination, in the presence of complement Processed. This cell suspension was added in total 3 to deplete large clonogenic cells. Processed twice.   Figure 1 uses complement alone or a combination of anti- (B5 + B1 + J5) without complement Treatment of large suspensions significantly reduced the fraction of clonogenic cells in suspension samples. Indicates not to reduce. However, with complement and one anti-B) anti-B1 or anti-J5 Ifin vitroCompared with purging using antibody or complement alone after purging In comparison there was a significant (p = 0.014) reduction in the proliferation of clonogenic cells.   In these assessments, antibody and complement lysis was approximately 3 logarithmic (103) Induces cell death We were able to. The combination of 2 or 3 kinds of antibodies and complement is complement and antibody. Greater growth of clonogenic tumor cells (p = 0.0066) than alone Caused a decrease. According to Figure 1, combined anti-B1 + anti-J5 + complement and anti-B1 + anti-B5 + Anti-J5 + complement is about 10-6Until the fraction of clonogenic cells was reduced. The latter Combinations are preferred.   Eradication of lymphoma cells from the bone marrow of patients when immunogenic purging is ABMT Translocation of the bcl-2 oncogene to the harvested bone marrow to determine whether Samples from 10 patients containing cells with the same were analyzed by immunogenic purging. It was determined whether these cells could be reduced to negative PCR. Each of these bone marrows was treated with a mixture containing anti-B1 + anti-B5 + anti-J5 + complement. This These samples were treated with the monoclonal antibody + complement treatment three times for the bcl-2 translocation. It was analyzed by PCR before and after this. Purging 6 of the bone marrow of 10 patients to negative It was In each case, 3 cycles of monoclonal antibody + complement treatment are PCR negative Needed to achieve. The results obtained in 3 representative patients from this group are shown in Figure 2a. Show. Patients 1 and 2 reach PCR negative after 3rd treatment, but patient 3 translocates bcl-2 Remained positive for PCR. Negrin et al. , Blood, 77: 654 ~ 660 (1991 ) [43] note that PCR is negative due to immunological purging of lymphoma cell lines. However, these authors also found that they were susceptible to purging in lymphoma cell lines. I noticed that there are differences. Overall, 50% of treated patients have 3 bone marrow PCR negative for bcl-2 after multiple complement / antibody treatment cycles.   The results presented here are for bcl-2 translocations as well as pre- and post-lysis samples. Were recorded in detail about the patient, both of which were available for analysis Obtained from analysis of treatment of patients with PCR amplifiable breakpoints. bcl-2 translocation to PC R confirmed the necessary samples in the diagnostic tissues of 125 patients in these cases. A total of 114 cases were available. In addition, pre- and post-lysed samples also have a bcl Available from 47 patients with B-cell NHL with non-PCR amplified translocations. these 47 samples were used as controls.   DNA was extracted from pre- and post-lysed samples and PCR was performed with MBR and bcl-2 mcr. Residual cells with a poor bcl-2 translocation during collection and subsequent complement / antibody purging It was evaluated whether or not it exists. 3 pre- and post-lysis samples And whether the bcl translocation was previously confirmed in that patient for clinical results. I hid it. PCR detects bcl-2 translocation in clinical tissues at the same time as bone marrow collection Bone marrow infiltration was detected in the pre-lysed bone marrow of all 114 patients treated.   57 post lysis of 114 patients described here by immunological purging This resulted in the loss of detectable PCR product in the sample. In the other 57 post-lysis samples After purging, PCR for the bcl-2 translocation was positive. 9 representative pre and post Results from the lysed sample are shown in Figure 2b. Lanes 1-4 have lymphoma with bcl-2 translocation The case where cells cannot be detected by PCR in post-lysed samples is shown. Lanes 5-9 show representative patients who remain PCR positive after lysis. Equal amount of DNA for each Although added to the PCR reaction, the ability to purge to PCR negative is Not expected to correlate with R signal strength. In fact, the sample shown in Lane 8 There was a slight increase in the intensity of the PCR product detected after aging. this thing May be just a normal variation of the technique or of normal cells in this patient The loss may have been relatively higher than the loss of neoplastic cells. PCR is a quantitative assay Since it is not a safe procedure, perform PCR using serially diluted pre- and post-lysed samples. Apply to determine the titer at which no PCR product can be detected. This is bcl-2 A semi-quantitative assessment of the amount of DNA in each sample with a translocation is provided. Pre-dissolution There is no correlation between the amount of DNA in the sample and the ability to purify to PCR negative [ p = 0.138, Wilcoxon test for ordered random variables]. Pre-dissolution The lack of correlation between the amount of DNA in the sample and its ability to purify to PCR negative Essential differences in susceptibility of lymphoma cells from different patients to purging control. Suggest that there is.   Purging the patient's clinical features and PCR negatives as part of the study analysis Attempted to correlate abilities. As shown in Table 1, PCR-negative and PCR-positive A group of sexual, histological and previous extranodal (EN) diseases. I inspected it. Many different correlations have been tried, but the best results are histological bone marrow (Involvement). Of 29 people without a history of bone marrow In patients, 69% became PCR negative. In 85 patients with a history of myeloid marrow, After ging, 44% were PCR negative (p = 0.0169). Another useful variable under study is this Did not improve the model.   Complement / antibody combination for purging all residual lymphoma from bone marrow The effect of lethargic ability correlated with disease-free survival (DFS) after ABMT. In Figure 3, ABM Post-T DFS depends on whether the patient was PCR negative or positive purged after lysis. It was shown that there was a strong correlation (p, 0.00001). Purged to PCR negative In the group of patients who had relapsed, only 4 of the 57 patients relapsed during the 8 years. 2 in this group Analysis of 24 and 28 months after ABMT after one additional patient died for unrelated reasons Removed from. Both of these two patients had gross and microscopic examination during dissection. No later was found to have lymphoma. In contrast, PCR for the bcl-2 translocation Of the 57 patients who remained positive, 26 relapsed and had a median DFS of 19.7 months in this group Reached in   4A-4C compare patients with complete recovery and patients with partial recovery, Complete remission patients show increased DFS (p = 0.0021). However, Figure 4 also shows ABMT Forty-nine patients with complete remission in 29 patients with PCR negative purging for bcl-2 Patients increase DFS after ABMT compared to 20 patients who remained PCR positive after purging It shows that it did (p = 0.0012). Similarly, in 65 patients with partial remission with ABMT, Twenty-eight patients with negative PCR purging had post-lysis samples PCRed after purging. Increased DFS compared to 37 patients who remained positive (p = 0.0011).   Figures 5A-5D show that histological bone marrow progression with ABMT also correlates with DFS after ABMT (p. = 0.0054). In 65 patients with no morphological evidence of bone marrow infiltration at the time of bone marrow harvest, Thirty-five patients who were purged PCR negative after lysis remained PCR positive after purging It shows that DFS was increased compared with 30 patients (p = 0.0001). Similarly, with ABMT 38 patients with minimal bone marrow progression (≤5% internal pillar space) 20 patients with negative PCR purging compared to 18 with positive PCR Increased DFS (p = 0.005). Eleven patients had unequivocal histological bone marrow serials at the time of bone marrow collection. It had a ridge (10-20% internal column space). Only 2 of these patients were after purging Became PCR negative. Histological subtypes of NHL did not correlate with DFS after ABMT (P = 0.249). However, within each subtype, patients with negative purging after lysis Increased DFS. After testing the data shown in Figure 4, it was concluded that PCR was negative. Purging increases DFS, and the combination of complement and antibody drives tumor cells , But not for all different bone marrow samples, from bone marrow cells to PCR negative Remove.   Evaluation of the relationship between PCR status after purging and time to recurrence using a log-rank test I paid. In addition, using the classified log-rank test as a classification factor It was performed using the variable of the prognosis of the duration of time. Single variable log rank analysis of data Identified various variables associated with suggestive differences in time to relapse after ABMT. This The analysis results for complete remission (p = 0.0021), bone marrow infiltration with ABMT (p = 0.0054) and PC Confirm history of bone marrow infiltration (p = 0.05) as a variable for potential explanation in addition to R It was In all cases, the effect of PCR persisted when using other variables for classification. P The effect of CR remained significant within each layer. These results show that complement / antibody The combination is easily evaluated for purging hidden tumor cells from the bone marrow. It has been shown to be useful in providing such a means. This combination is at least some Tumor cells in the patient's bone marrow can be reduced to PCR negative. PCR negative increases Correlate with DFS. Why is bone marrow in all patients purging to negative PCR? It's unclear if you can't. Other anti-B1 and anti-J5 monoclonal antibodies And other monoclonals specific for activated B-cell and B-cell lymphoma Antibodies increase the proportion of patients who can purse bone marrow tumor cells This is within the scope of the claims of the present invention.   After the ABMT method, the detection results of peripheral blood cells carrying the bcl-2 translocation are tumors of bone marrow. It was found to correlate with the ability to purging cells. Process for carrying out the invention In the peripheral blood of the patient when the lymphoma cells that can be analyzed and detected are ABMT Decided to exist. Twenty-five patients were included in this study. Blood again The samples were tested 6 months after ABMT. Multiple blood samples from each patient for PCR More analyzed. From bone marrow and two representative patients, patients 1 and 8 from Figure 2b A number of blood samples from E. coli are shown in FIG. Patients positive for bcl-2 translocation before and after ABMT There was no correlation with having peripheral blood cells (data not shown). However, cells containing the bcl-2 translocation remained PCR positive after purging in 14 individuals in this group. It was detected in the peripheral blood of 13 patients. In contrast, cells with the bcl-2 translocation were found to have CmAb bone. No detection was found in the peripheral blood of 11 patients who became PCR-negative after pith purging.   The use of 3 and 4 monoclonal antibodies in relation to complement was compared. 19 people Tumor cells contained in bone marrow samples from patients were complemented with their respective anti-B1, B5 and And J5 or anti-B1, B4, B5 and J5. The results are shown in Table 2 below. 10/19 samples with 3 monoclonal antibodies Remained PCR positive. 5/19 samples with 4 monoclonal antibodies Remained PCR positive.   II. Depletion of tumor cells using microspheresExample 1 ． Comparison of complement-induced lysis and magnetic sphere depletion of tumor cells from bone marrow samples   Normal bone marrow samples from healthy volunteers were serially diluted with lymphoma cell lines, Was contaminated with DHL and RL, including the bcl-2 translocation. These cell lines have the same target antigen Express equally, but marked differences in susceptibility of cell lines to complement-mediated lysis was there. These differences indicate that anti-B4 (anti-CD19) monoclonal antibodies are anti-B1, B5 and It was maintained whether or not it was added to the J5 antibody combination. But anti-B1, B5 and J5 Bone marrow contaminated with DHL or RL cell lines when used with magnetic microspheres Purging bone marrow samples into PCR negatives in a significantly more effective way, whether or not did.   Positive results obtained with normal bone marrow deliberately contaminated with lymphoma cells are more tumor A laboratory test with an aliquot of bone marrow containing cells was facilitated. Bone containing tumor cells Pith was collected from 5 patients with non-Hodgkin's lymphoma. Ants from all patients The coats were first treated with complement and monoclonal antibodies, anti-B1, B5 and J5. After the 3 rounds treatment described above, aliquots from 2 of 5 patients became PCR negative Reached Subsequent additional aliquots were done in the same manner, but with this combination anti-B4 Treated with monoclonal antibody. 2 out of 5 aliquots reach PCR negative, Identical results were obtained. PCR-negative aliquots from the same source for both tests Obtained.   Using a combination of complement and 3 or 4 monoclonal antibodies respectively After this consecutive study, bone marrow aliquots from 5 patients additionally containing tumor cells 3 types (anti-B1, B5 and J5) and 4 types of monoclonal antibodies (anti-B1, Laboratory tests were carried out with a combination of B5, J5 and B4). Complement induced lysis The bone marrow samples from all patients were processed in comparison to the results obtained above using the solution. After three rounds of processing, purging was performed until PCR was negative. PCR negative is Achieved using a noclonal antibody. These results indicate complement-mediated lysis of lymphoma cells. There are differences in solution susceptibility, and these differences are due to the combination of monoclonal antibodies. Instead of adding complement at the same time, the monoclonal antibody and magnetic microsphere What can be overcome or stabilized by using combinations It suggests.Example 2 ． Complement-induced lysis and magnetic spheres of tumor cells from bone marrow samples of lymphoma patients.           A further comparison of consumption   3 types (anti-B1, B5 and J5) and 4 types (anti-B1, B4, B5 and J5) monochrome A combination of internal antibodies was prepared. Get bone marrow collected from patients with lymphoma Divided into. Tumor cells in a part of bone marrow were complemented with the aforementioned complement and three monoclonal antibodies. Purging using a combination with the body. Mononuclear cells from the collected bone marrow remnants Fractions were isolated by Ficoll Hipack density centrifugation and divided into 4 fractions. These four fractions were processed separately. Saturate two fractions of centrifuged bone marrow Incubate for about 30 minutes at about 4 ℃ using 3 kinds of monoclonal antibodies And two were incubated with four monoclonal antibodies. Antibody incub The basation time may range from about 15 minutes to about 1 hour.   After incubation with the monoclonal antibody, 3 antibodies and 4 anti-antibodies Body incubations were performed at a sufficient concentration of rabbit serum from 3-4 week old rabbit sera. Complement using G. complement (Pel-freeze, Browndia, Wisconsin, USA) Tumor cells were exhausted by lysis. These cells are stored at about 37 ° C for about 15 minutes to about 1 hour. Incubated for a range of times, preferably about 30 minutes. After complement treatment, cells Of Deoxyribonuclease (Sigma, St. Louis, Mo., USA) It was washed in a medium containing a final concentration of 2.5 mg / ml. This prevents cell aggregation It was ensured that DNA from lysed cells was not simultaneously purified during DNA extraction.   The remaining 3 and 4 antibody incubations were performed with goat anti-mouse Ig-conjugated magnetic beads. It was consumed by magnetic separation using a laser. Goat anti-mouse Ig and IgM binding magnetism Beads (Advanced Magnetics, Cambridge, Mass., USA) Mix and wash twice as directed 106Add 100 μL final concentration per antibody-coated cell did. These cells are incubated at 4 ° C. for about 15 minutes to about 1 hour, preferably for about 30 minutes. Incubation with magnetic beads. Magnetic beads after incubation Approximately 1 using a magnetic particle concentrator (Dynal, Great Neck, NY, USA) Collected in two consecutive procedures for 5 minutes.   After complement-mediated lysis or magnetic bead depletion, these cells are pelleted by centrifugation. This procedure was repeated twice for a total of 3 treatment cycles. Respectively Before and after the three treatment cycles, aliquots of cells were collected from each fraction and genomic DNA was collected. Nonionic surfactant and proteinase K (Sigma, Sen, MO, USA) Isolation by cell lysis using Triuis. A group of oligonucleos Bcl-2 / Ig using tide amplification as described aboveHMBR or mcl region of hybrid gene I went in the area. The PCR results for 19 types of samples are shown in Table 2.   The results shown in Table 2 deplete antibody-coated tumor cells using magnetic microspheres. This increased the purging of tumor cells from bone marrow samples, and more samples were It indicates that purging is performed even to R-negative. PCR assay has 3 types of monochrome for complement 50% of the sample treated with the internal antibody was purged to PCR negative after 3 treatments It is possible to do this. These results indicate that tumors resist complement-mediated lysis There must be a subpopulation of cells and other methods eliminate tumor cells It suggests that it may be more effective in some cases. Supplemented with anti-B4 monoclonal antibody Addition to the body and 3 monoclonal antibodies will purse and become PCR negative Increased the number of samples that could be obtained; both complement-mediated lysis methods were magnetic micro Did not achieve results equal to those achieved with Spheres. Tumor-containing bone marrow Incubate samples with 3 or 4 monoclonal antibodies All samples were negatively purged by exhaustion with Fear.   The magnetic microspheres used in the present invention are magnetic polystyrene latex particles. Magnetic dextran or gelatin microspheres and similar microspheres Any magnetic microsphere such as a can be used. As used here A microsphere is any shape with appropriate dimensions; for example, spherical, cubic Immunologically acceptable containing magnetic, non-magnetic particles of any shape, rectangle or other shape. A base material that can be treated. Magnetic particles should be coated with polystyrene or gelatin. It can be surrounded by a covering material or the particles can be embedded in a coating. The dimensions of the magnetic microspheres used in the present invention range from about 0.3 to 5 microns. Good. Non-magnetic materials equivalent to the magnetic species described here can be used in the present invention. . A suitable separation method can be selected when using such non-magnetic particles.   Immunoglobulin coated magnetic microspheres were monochrome as described in Example 2. In addition to being used to deplete tumor cells saturated with null antibody, Prior to mixing microspheres with the bone marrow sample prior to mixing Can be attached to microspheres. For example, monoclonal Immunoglobulin before mixing the antibody with the tumor cells contained in the microspheres and bone marrow It can be attached to coated microspheres. Other examples are antibodies and microspheres Use of a carboxylic acid-diamine couple for cross-linking between. Microsphere A has a pendant group such as an amine, a carboxyl group or a thiol group. Antibody attaches to microspheres without making either species more functional Can be   The following examples are further non-limiting examples of the present invention. Magnetic micro The variation in composition of spheres and the combination of monoclonal Methods of attaching to a are within the scope of the invention. Here are the teachings for reference The methods described in the US patents described in US Pat. No. 4,152,563; 53,844; 3,639,558; 4,452,773; 3,639,558; 4,419,444; 4,738,932; 4,360,358 and 4,414,324. Other teachings given as reference are PCT countries This can be found in WO 90/04178.Example 3 ． Immunoglobulin coating with a combination of selective monoclonal antibodies           Preparation of magnetic microspheres.   Non-porous, generally monodispersed or of uniform size in the range of about 0.3 to about 5.0 microns Magnetic microspheres (sometimes called beads) such as rabbits or goats Pre-coating microspheres with anti-mouse immunoglobulin (GAM or RAM) Improves the combination of monoclonal antibodies to bind thereon.   First, 250 mg of beads is dispersed in 3 ml of distilled water and sonicated for 2 to 3 minutes. Next Cool the bead mixture in water at 4 ° C for several hours. Then these beads are magnetically Separate and dispose of water. Resuspend these beads in 5 mg RAM or GAM to 500 μ Dilute with l phosphate buffer (PBS). Incubate this mixture at room temperature Mix for 4-5 hours. Then, the beads were treated 6 times with 1% bovine serum albumin (BSA Wash with 4 ml portion of PBS containing). Then place these beads in 4 ml of PBS-1% BSA. Resuspend and mix.   5 x 108Pipette a quantity of resuspended beads into a siliconized test tube It These beads are magnetically separated from the liquid to be discarded. Then the beads in PBS Resuspended in 3% to 4% and then treated with a combination of 3 or 4 selective monoclonal antibodies described above. Add to this suspension to a total body concentration of approximately 0.5 mg / ml . The solution containing the beads and antibody is then allowed to incubate at a temperature in the range 10-30 ° C for about 1 hour. Cubate. The beads are then washed multiple times with PBS-1% BSA and resuspended in the same solution. Make it cloudy.Example 4 ． Selective monoclonal antibodies on immunoglobulin-coated magnetic microspheres           Removal of tumor cells from bone marrow using a combination of bodies.   Tumor cell-containing bone marrow was collected, concentrated, washed and separated for complement-mediated lysis as described above. Fraction and suspend in RPMI medium. Next, antibody-containing magnetic beads prepared according to Example 3 Is added to the bone marrow sample and the resulting mixture is added for a time in the range of about 10 minutes to about 1 hour, preferably Is incubated for about 15 minutes at a temperature of about 4 ° C. Then remove the magnetic sphere The cells are removed and the cells are washed and pelleted. This method can be applied to a total of 3 treatments Repeat twice. Bone marrow cells are then washed and tested for tumor cells by PCR It   Depletion of tumor cells using microspheres   Using the highly sensitive technique of the polymerase chain growth reaction to detect bcl-2 translocations This means that complement-mediated lysis and the use of three monoclonal antibodies (CmAb-3) Purges only 50% of various bone marrow samples containing PCR-detectable lymphoma cells I found that. This observation was due to reinfusion of bone marrow with residual lymphoma cells. It is clinically important because individuals significantly increase the frequency of recurrence. Only about 50% of patients' bone marrow In view of the fact that CmAb can be used for purging to PCR negative The microsphere depletion of tumor cells was further studied. The use of microspheres is a tumor It produces an unexpected and significant improvement in cell depletion. Microsphere and And 3 or 4 monoclonal antibodies (MmAb-3 or MmAb-4) And all PCR-detectable tumor cells in 25 bone marrow samples containing 25 different tumor cells. Purged from an aliquot. Various aliquots of these 25 identical samples When complement was treated with complement and 3 monoclonal antibodies (CmAb-3), 11 out of 25 Only (44%) were purged to PCR negative. The fourth monoclonal antibody And complement-mediated lysis (CmAb-4) to purify the bone marrow of an additional 5 patients, 16 out of 25 were selected. Also, the use of MmAbs causes a loss of interstitial myeloid progenitor cells. It was found to be specific because it is not. The result of using Microsphere is Microsphere. Suggest that the use of sialic acid is superior to complement-mediated lysis and Use of microspheres harms planting by not showing non-specific toxicity to Not expected to do. Then using microspheres and monoclonal antibodies Other tests to remove tumor cells from bone marrow samples will be described.   Materials and methods   After confirmation by the Human Protection Committee and informed consent, B Bone marrow was obtained from 25 patients with cellular NHL. Immunotyping for all lymphomas It was shown to express CD20. All patients should have a guidance or procedure during bone marrow collection. Following induction or salvage chemotherapy, the minimum eligible medical history The disease level (protocol eligidle minimal disease level) was reached. Minimal illness Criteria are complete remission (CR) or partial remission (PR) up to a tumor mass of 2 cm or less. And less than 20% of the internal pillar space contains marrow oil. Bone marrow aspirate and biopsy is bone marrow Obtained 1 month prior to collection to assess oil invasion of lymphoma and further PCR amplification of bcl-2 translocation It was confirmed that it can be detected more. All samples are PCR-detectable bcl-2 Included translocation.   Patient characteristics are summarized below. Twenty patients had follicular small dividing cells. have one cleaved cell and one patient has follicular mixed small and large cells (follicular). 4 patients with mixed small and large cells) and diffuse small cell histology I was Nine patients will have a CR here after induction or withdrawal chemotherapy and will remain in control here. The patient has reached a certain history-eligible PR. Fifteen patients varied from local infiltration to 90% internal column space Had a prior history of morphological morphological bone marrow infiltration. Eleven patients had bone marrow infiltration at the time of bone marrow collection It had morphological evidence of wetness. All 25 patients had a yield when assessed by PCR. It had detectable lymphoma cells remaining in the collected bone marrow. 19 patients have bcl-2 6 patients with translocation-containing major breakpoint region (MBR) It had a translocation in the (minor cluster region) (cmr). Microsphere   Microspheres, or beads used here, have many dimensions of 0.1-5 m Described as Ron's particle, spherical, cubic, and rectangular particles as well as other shaped particles Is included. The preferred particles are about 0.3 to 5.0 microns. These particles are police Tylene, polyacrylate, polymethacrylate, polyester, styrene-diene It can be made of polymeric materials such as vinylbenzene copolymers. Polyphe Nylene oxide and other polymers, copolymers or gelatin, dextran Substances such as aminodextran are these polymers, copolymers or substances It can be made of coated material.   Microspheres can be magnetic or non-magnetic. Magnetic microspheres are polymer mats It may be a polymer particle with a magnetic substance embedded in the lix, or a magnetic nucleus It may include a core having a polymer coating. Examples of gelatin-coated particles Can be found in US Pat. No. 5,062,991.   The magnetic beads used to process the bone marrow of 25 patients are commercially available from Massachusetts, USA. Goat Anti-Mouse (GAM) I purchased from Advanced Magnetics, Cambridge, CT I It consists of gG- and IgM-coupled magnetic beads. What is used here limits the invention Not a thing. Using any of the above types with any of the above types of beads Can be. IgG and IgM coating of uncoated beads is well known in the art .   Monoclonal antibody   Anti-B cell monoclonal antibodies have been previously described herein. Three antibody combinations ( mAb-3) was a mixture of murine anti-B1, anti-B5 and anti-J5 monoclonal antibodies. 4 antibody combinations (mAb-4) are anti-B4 monoclonal antibodies and 3 antibody combinations Formed by adding together. Excess saturating concentrations of monoclonal antibody Using.   The anti-T cell monoclonal antibodies used as controls were CD2, CD3, CD4 and CD28. Dana-Farber Cancer, specific to Boston, Massachusetts, USA  Obtained from Institute, Dr. C. Morimoto. Other anti-T cells with the indicated CD specificity Cell monoclonal antibodies can be used in their place. Anti-T cell monoc The local antibody was an isotype comparable to the anti-B cell monoclonal antibody. An excess saturating concentration of antibody was used.   Bone marrow purging   Aliquots of harvested bone marrow were used as described herein for three monoclonal antibodies. And purging using complement-mediated lysis (CmAb-3). These CmAb-3 purges Samples were used as control samples to determine the utility of the microsphere method. Unless otherwise specified, all tests included a small aliquot of the bone marrow sample. Using. The bulk of the bone marrow sample is referred to as the clinical sample and used as directed here Saved for.   Other aliquots of bone marrow were purged using the specific sequenced MmAB technique. In a single purging cycle, these aliquots were first washed with excess saturated concentration of 3 Incubated with seed antibody for 30 minutes at 4 ° C. Then with a monoclonal antibody These coated cells were coated with GAM IgG and IgM, and magnetic beads were also bound with antibodies. It was depleted using a double wash mixture. 10 these beads6100μ per cell L was added to the cells. This resulted in a bead to cell ratio of about 50. here Targets Monoclonal Antibodies Used in Parasites to Normal B Cells and Lymphoma Cells At, the bead to tumor cell ratios evaluated were in the range of about 250-500. Sample these Incubated for 30 minutes at 4 ° C with the beads. Magnetic after incubation Beads Magnetic Particle Concentrator (Dynal, Great Neck, NY, USA) Alternatively, another magnetic separation means was used to collect for 15 minutes. Clean exhausted bone marrow cell samples Transfer to a container and collect the residual magnetic beads contained therein during the second 15 minute magnetic separation. It was   Pellet treated bone marrow cells by centrifugation after initial CmAb or MmAb depletion And wash 3 times and repeat exhaustion or purging of tumor cells for a total of 3 cycles. I returned. Collect sample cells before the first exhaustion cycle and after each exhaustion cycle The genomic DNA was treated with a nonionic detergent and then with Proteinase K (Sigma, USA). (St. Louis, Zuri).   PCR amplification   PCR amplification of tumor cells present in the sample was performed as described herein. this In the analysis, the cell line RL was used instead of DHL-6 with 50 μL of sample. The cell line RL Dr.W.Urba, National Cancer Institute, Biologic Response Modifiers Branch , Frederick, Maryland, USA. RL is a major break Have PCR amplified translocations at points. Other cell lines with similar translocation instead of RL Can be used for. Obtain cell lines using translocations at major breakpoints Didn't come Also, using an oligonucleotide for human B cell activation antigen B7 , PCR amplification can be performed and the extracted DNA can be amplified by PCR in all samples. I confirmed that I can do it.   Colony assay   Bone marrow samples from 8 of 25 patients were pre-purged and CmAb-4 and MmAB Was assayed for hematopoietic progenitor cell proliferation after the third purging with -4. sample Were hidden from the subject performing the colony assay. Granulocyte Macrophage Coro Knee forming unit (CFUGMA) by a standard method using a two-layer agar assay [48]. I made a essay. Cystic carcinoma cell line 5637 (ATCC, Rockville, MD, USA) ) Conditioned medium was used at a final concentration of 10% for the source of colony stimulating factor. each 5 × 10 in total from bone marrow fractionFourBone marrow mononuclear cells were added to the upper layers of the double-layer agar system. Plated in El. 4 times the CFUGMCultures for 7 and 14 days and 0.3% Gill's upper layer collected, dried on a glass slide and further Gill's hematoxy Stained with phosphorus (Sigma, St. Louis, Missouri, USA). CFUGM7 5 × 10 8 and counted on day 14 and platedFourTotal colonies per cell and 5 x 10FourAs the total number of colonies per first "pre-depleted bone marrow mononuclear cells" I gave it away. Evaluation   In the present study, bone marrow with PCR-detectable tumor cells was obtained from 25 patients. Treated with the MmAB method and consumed less than the PCR tumor cell detection level compared to the CmAB method. It was determined whether improvements could be made in a large number of possible samples. Two people PCR analysis results of samples from a representative patient are shown in Figures 7A, 7B. As shown in Figure 7A, Person 6 had residual PCR detectable tumor cells after 3 cycles of CmAb-3 treatment. Shi However, all PCR-detectable tumor cells were removed after 3 rounds of CmAb-4 treatment. MmAB-3 And exhaustion with MmAb-4 removed all PCR-detectable tumor cells after 2 treatments Could be removed. Figure 7C shows the oligonucleotide for the B7 gene in this patient. The result obtained by PCR amplification using is shown. These results are for PCR amplifiable DNA It shows that it was extracted from each sample.   As shown in FIG. 7B, patient 7 was treated with CmAB-3 or CmAb-4 by a third post-treatment PCR. It had no detectable lymphoma cells. When using a similar MaAb process, the second No PCR-detectable tumor cells were found after the treatment cycle.   Purging of bone marrow samples using microspheres appears to be specific antibody Cells that do not contain are not lost by binding to microspheres. In repeated experiments Uses bone marrow cells with anti-T cell monoclonal antibody and GAM-coated microspheres Non-specific binding of tumor cells to microspheres when treated for 3 cycles. The combination did not result in the disappearance of PCR-detectable tumor cells. In addition, Microsuf The use of sia did not affect the sensitivity of PCR amplification. The results shown in Figure 8 show As you can see, PCR analysis6Detect one lymphoma cell in one normal bone marrow cell be able to.   Table 3 shows three CmAb-3, CmAb-4, bone marrow samples from all 25 patients. Multiple and minor numbers of bcl-2 translocations after undergoing MmAb-3 and MmAb-4 treatment cycles The result of PCR amplification in a breakpoint region is shown. Of the third cycle of CmAb-3 treatment Later, only 11 of the 25 samples (44%) had no PCR-detectable lymphoma cells. won. For these 11 species, 3 cycles are required to reach this state. It was. Identical results for bulk (clinical) bone marrow samples and 24 of 25 patients Obtained by using an aliquot of For patient 11, clinical sample remains detectable Purgin aliquots of all PCR-detectable cells, including lymphoma cells I'm sorry This means that the results obtained with a small amount of bone marrow aliquot were Suggests that it is typical.   CmAb-4 treatment of bone marrow samples up to 16 out of 25 patients (64%) after 3 cycles The number of samples with no PCR detectable tumor cells was increased. Residual lymphoma of the sample Cells can be purged with four, not three, monoclonal antibodies. The other 5 patients that can be identified are indicated by an asterisk after the patient number. However, three Or PC of any sample regardless of whether 4 kinds of monoclonal antibodies are used Three CmAb treatment cycles are required before purging R-detectable tumor cells It was. Considering the number of patients studied, a fourth monoclonal antibody was added to the CmAb treatment method. Does not seem to have a statistically significant advantage (p = 0.256, Fisher extraction test).   An attempt was made to correlate patient characteristics with purging success. Patient clinical characteristics ( Histology, ABMT [Cr vs. PR] status, previous bone marrow or bone marrow as collected) and Cm Purging ability of all PCR-detectable cells in bone marrow with Ab-3 or CmAb-4 No relationship was found between.   The results obtained with microspheres were significantly different and with complement-mediated lysis It was better than obtained. 3 after 3 treatment cycles with microspheres Or PCR detection of all 25 patient samples using 4 monoclonal antibodies The active lymphoma cells could be exhausted. Statistically, there are three types of progress P = 0.0001 with the lonal antibody and p = 0.0016 with the four antibodies. PCR-detectable cells from 11 patient samples (44%) after only two MmAb-3 treatment cycles Was purged. After 2 treatment cycles with MmAb-4 only 20 patient trials (80%) was PCR negative for tumor cells. Of the four monoclonal antibodies The use is a second treatment cycle using three monoclonal antibodies at the same point in the CmAb. And significantly more effective in removing residual lymphoma cells after curl (p = 0.0186). It was After two MmAb-3 treatment cycles, rather than after two MmAb-4 cycles, bone marrow These patients with residual PCR detectable lymphoma cells are indicated in Table 3 by the symbol ^^. table Of the results shown in 3, the significant ones are 4 patients, bones numbered 5, 14, 19 and 21. The marrow did not show PCR-detectable tumor cells after single MmAb-4 treatment . The patient 21 sample contained PCR-detectable cells using either CmAB-3 or CmAb-4. This is particularly significant because it cannot be exhausted.   During the study interest was the microsphere purging method was unacceptable for bone marrow mononuclear cells It could lead to some loss. The number of mononuclear cells from treated patients is ( 6.44 ± 1.23) x 109Was in the range. After CmAb-3 treatment, clinical samples were (4.4 ± 1.2 ) × 109The cells had a 68% recovery. Evaluation ant using CmAb-3 The cell recovery rate from the coat was 72%. The two values are extremely consistent. Miku Use of rospheres appears to reduce non-specific cell loss associated with use of complement Seems to be. Cell recovery was 78% after MmAb-3 and 82% after MmAb-4. You In all cases, in CmAb or MmAb, about 5% of the total cells were analyzed for total analysis. Removed during the purging cycle. Therefore, the maximum recovery rate is 95%. Flosa Itometry analysis shows B lineage cells after either CmAb or MmAb Indicates that there was no loss of data (data not shown).   Another concern is hematopoiesis from bone marrow through the use of microspheres or complement-mediated lysis The loss of the original species was to occur. CmAb-4 or MmAb with 3 treatment cycles In a parallel experiment with -4, the colony assay was as described for patients 18-25. Established. Results for three patient samples corrected for cell loss and tabulated. 4 shows. These results indicate that bone is not depleted 7 or 14 days after microsphere depletion. 5x10 compared to marrow sample (pre) or CmAbFourCFU per cellGMOf significant Indicates that no loss will occur. Correct the number of colonies to 5 x 10FourIndividual "pre-consumption" MmAb depleted samples compared to "pre" samples when shown per bone marrow mononuclear cell CFU on 7 or 14 daysGMNo significant loss (NS) of But modified C mAb samples were CFU on 7 or 14 days in 7 of the 8 patients studiedGMShows a significant loss of It was However, 7 of 8 patients had CFU at 7 and 14 days post CmAb.GMA significant loss of However, all of these patients have had their bone marrow reinfusion after high dose treatment. Immediately planted.   The results presented here use multiple monoclonal antibodies and microspheres. Tumor cell depletion is more likely than multiple monoclonal antibody and complement-mediated lysis methods It shows that it is more effective. Also, these results require three MmAb exhausts And reinfusion of MmAb-depleted bone marrow may yield better results than CmAb-depleted bone marrow. Yes The application of microspheres to spinal cord progenitor cells in applications where the use of It is shown to lack non-specific toxicity.   This could explain the failure of CmAb purging to remove all tumor cells. It may be due to three possible mechanisms. First, clonogenic tumors This is the case when the cells do not express the surface antigens expressed by many tumor cells. Second In addition, modulation of one or more surface antigens after attachment of the monoclonal antibody to the ligand is This is where body-mediated lysis is limited. Third, a subgroup of patients will undergo complement-mediated lysis Is suffering from a lymphoma that is inherently more resistant to. Monochrome If the same number of null antibodies are used for both methods, the complement-mediated lysis method will not completely remove the tumor cells. Although not removable, the microsphere method depletes residual lymphoma cells in all cases. The third mechanism is considered the most promising because it can be made. For lytic action of complement Many possible mechanisms of resistant cells have been described in the technical literature. Life in cells A relationship has been shown between chemical phenomena and sensitivity to complement-mediated lysis [49,50]. . It has been shown that anti-complement factors are present in human bone marrow [51]. Finally, In addition, some lymphoma cells can be removed by microspheres, such low density Is capable of expressing the target antigen of, but not complement-mediated lysis [52, 53].   Whether reinfusion of lymphoma cells in autologous bone marrow contributes to the next recurrence after ABMT However, the results of the CmAb shown here were PCR-induced on autologous bone marrow after purging. We show an increased incidence of recurrence in patients with detectable lymphoma cells. But, This observation does not prove that the reinfused lymphoma cells are responsible for the recurrence. Endogenous disease is associated with recurrence in some patients, even after reinfusion of syngeneic bone marrow Conceivable. Randomized trials or genetic marker studies are both intrinsic diseases Needed to detail the recurrent-related contributions caused by reinfusion tumor cells Has been demonstrated in some cases, but has been described in the claims of the present invention. The procedure is to re-inject the tumor-free bone marrow if the recurrence rate is significantly reduced. This is a strong indicator that bone marrow-derived cells are associated with recurrence. Long term shown in Figure 3 CmAb results PCR-negative or positive in patient's bone marrow with disease-free survival after ABMT It has a strong correlation with whether or not it has been purged. Purged negative In the group, by 8 years, only 4 of the 57 patients had relapsed. In contrast, bone marrow Twenty-six of 57 patients who were PCR-positive after CmAb had recurrent, disease-free survival The median of was 19.7 months. The significance of the CmAb result is the importance of removing the tumor cells. Any amelioration of the disease, for example the use of microspheres as described herein, may include disease. Increasing the number of patients and / or the length of survival that will experience unexplained survival I believe you can do it.Example 5 ． A set of selective monoclonal antibodies on gelatin-coated magnetic microspheres           Removal of tumor cells from bone marrow using alignment   Magnetic microspheres were prepared as described in US Pat. No. 5,062,991 and A ~ 20 atom long bridging group is used to attach the monoclonal antibody. Bone containing tumor cells The marrow was harvested, concentrated, washed, fractionated and RPMI medium as described above for complement-mediated lysis. Suspended in the ground. Next, antibody-containing magnetic beads were added to the bone marrow suspension to obtain a mixture. The experimentally determined time, if possible, from 10 minutes to about 2 hours, incubate at a temperature of about 4 ° C. Option. The magnetic spheres are then removed and the cells are washed and pelleted. To convert This method is repeated twice for a total of three treatments. Then the bone marrow cells Wash and test for tumor cells by PCR. Alternatively, U.S. Patent No. 5,062,9 The magnetic microspheres prepared as described in No. 91 are coated with GAM and described in Example 2. Use as you did.

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９４年２月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｂ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパ ージングするにあたり、前記骨髄を複数の選択的抗Ｂ細胞モノクローナル抗体と ミクロスフィアの特定の配列で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗 させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨髄中に腫瘍細胞が検出 されないレベルに消耗させ；前記複数のモノクローナル抗体が活性化Ｂ細胞およ びＢ細胞リンパ腫上の75,000ダルトンの分子量の抗原に特異的であるモノクロー ナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍細胞の免疫学的パージング方法。 ２．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜５ミクロンの範囲の寸法の免疫グロブ リン被覆磁性ミクロスフィアである請求項１に記載の方法。 ３．前記免疫グロブリンがヤギの抗マウス免疫グロブリンである請求項２に記載 の方法。 ４．前記複数のモノクローナル抗体がさらに抗CD20モノクローナル抗体および通 常の急性リンパ芽球性白血病抗原に対し特異的な抗CD20モノクローナル抗体を含 む請求項１に記載の方法。 ５．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項４に記 載の方法。 ６．Ｂ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパ ージングするにあたり、 （a）前記骨髄を複数のモノクローナル抗体と十分な腫瘍処理量において選択 した温度にて10〜30分間の範囲の時間インキュベーションし、前記複数の抗体が ： （i）抗CD20モノクローナル抗体、 （ii）抗CD10モノクローナル抗体および （ii）活性化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫上の75,000ダルトンの分子量の 抗原に特異的なモノクローナル抗体からなり； （b）段階（a）の生成物を免疫グロブリン被覆磁性ミクロスフィアと約４℃の 温度で15〜１時間の範囲の時間インキュベーションし； （c）段階（b）の生成物から磁性ミクロスフィアを分離し；さらに （d）段階（a）、（b）および（c）を複数回繰り返して前記骨髄中の腫瘍細胞 を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより腫瘍細 胞が検出されないレベルに消耗させることを特徴とする腫瘍細胞の免疫学的パー ジング方法。 ７．抗CD19モノクローナル抗体を段階（a）で用いるモノクローナル抗体に加え る請求項６に記載の方法。 ８．前記ミクロスフィアが約0.1〜5.0ミクロンの範囲の寸法である請求項６に記 載の方法。 ９．前記免疫グロブリンがヤギの抗マウス免疫グロブリンである請求項６に記載 の方法。 １０．自己骨髄移植によりＢ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者を処置するに あたり、 （a）前記患者から骨髄を収集し； （b）前記骨髄を複数の選択的抗Ｂ細胞モノクローナル抗体とミクロスフィア の特定の配列で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリ メラーゼ鎖成長反応アッセイにより腫瘍細胞が検出されないレベルに消耗させ、 前記複数のモノクローナル抗体が活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫上の75,000 ダルトンの分子量の抗原に特異的なモノクローナル抗体を含み；さらに （c）処理した骨髄をそれを得た患者に移植して戻すことを特徴とする患者の 処置方法。 １１．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜５ミクロンの範囲の寸法の免疫グロ ブリン被覆磁性ミクロスフィアである請求項１０に記載の方法。 １２．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項１１に記 載の方法。 １３．前記複数のモノクローナル抗体がさらに抗CD20モノクローナル抗体および 通常の急性リンパ芽球性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を 含む請求項１０に記載の方法。 １４．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項１３ に記載の方法。 １５．Ｂ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的に パージングするにあたり、前記骨髄をミクロスフィアに結合させた複数の選択的 抗Ｂ細胞モノクローナル抗体で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗 させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより腫瘍細胞が検出されないレベ ルに消耗させ；前記複数のモノクローナル抗体が活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リン パ腫上の75,000ダルトンの分子量の抗原に特異的なモノクローナル抗体を含むこ とを特徴とする腫瘍細胞の免疫学的パージング方法。 １６．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜５ミクロンの範囲の寸法の磁性ミク ロスフィアであり免疫グロブリン、ゼラチン、デキストランおよびアミノデキス トランからなる群より選択した物質で被覆した請求項１５に記載の方法。 １７．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項２２に記 載の方法。 １８．前記複数のモノクローナル抗体がさらに抗CD20モノクローナル抗体および 通常の急性リンパ芽球性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を 含む請求項１５に記載の方法。 １９．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項１８ に記載の方法。 ２０．自己骨髄移植によりＢ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者を処置するに あたり、 （a）前記患者から骨髄を得； （b）前記骨髄を複数の抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を結合した磁性ミクロス フィアとインキュベーションし、前記インキュベーションを約４℃の温度で実験 的に決定した時間で行いさらに前記複数のモノクローナル抗体が： （i）抗CD20モノクローナル抗体、 （ii）抗CD１０モノクローナル抗体および （iii）活性化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫上の75,000ダルトンの分子 量の抗原に特異的なモノクローナル抗体からなり； （c）段階（b）の生成物から磁性ミクロスフィアを分離し； （d）段階（a）、（b）および（c）を複数回繰り返して前記骨髄中の腫瘍細胞 を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより腫瘍細 胞が検出されないレベルに消耗させ；さらに （e）処理した骨髄をそれを得た患者に移植して戻すことを特徴とする患者の 処置方法。 ２１．抗CD19モノクローナル抗体を段階（a）で用いるモノクローナル抗体に加 える請求項２０に記載の方法。 ２２．前記ミクロスフィアが0.1〜5.0ミクロンの範囲の寸法である請求項２０に 記載の方法。 ２３．前記ミクロスフィアを免疫グロブリン、ゼラチン、デキストランおよびア ミノデキストランからなる群より選択した物質で被覆し、前記モノクローナル抗 体を前記被膜に結合した請求項２０に記載の方法。 ２４．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項２３に記 載の方法。 ２５．Ｂ細胞非ホジキンスリンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するた めの粒子であって、前記粒子が結合させた複数の抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を 有するミクロスフィアを含み、さらに前記粒子が前記骨髄から非腫瘍細胞を消耗 させることなく腫瘍細胞を消耗させることができ、さらに前記複数のモノクロー ナル抗体が活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫上の75,000ダルトンの分子量の抗 原に特異的なモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍細胞除去のための 粒子。 ２６．前記ミクロスフィアが0.3ミクロン〜５ミクロンの範囲の寸法の磁性ミク ロスフィアであり免疫グロブリン被覆ミクロスフィア、結合させた前記生物学的 物質を有する免疫グロブリン被覆ミクロスフィアおよび付着させた前記生物学的 物質を有する免疫グロブリン被覆ミクロスフィアからなる群より選択した請求項 ２５に記載の粒子。 ２７．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項２６に記 載の粒子。 ２８．前記複数のモノクローナル抗体がさらに抗CD20モノクローナル抗体および 通常の急性リンパ芽球性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体 を含む請求項２５に記載の粒子。 ２９．抗CD19モノクローナル抗体を前記複数のモノクローナル抗体に加える請求 項２８に記載の粒子。[Procedure Amendment] Patent Law Article 184-7, Paragraph 1 [Submission date] February 21, 1994 [Correction content]                         The scope of the claims 1. Tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell non-Hodgkin's lymphoma were immunologically immunologically isolated. The bone marrow with a plurality of selective anti-B cell monoclonal antibodies. Depletion of bone marrow tumor cells and non-tumor cells by treatment with specific sequences of microspheres Of tumor cells in the bone marrow by polymerase chain reaction To a level that is not reached; Monochrome specific for 75,000 dalton molecular weight antigen on B cell lymphoma A method for immunologically purging tumor cells, which comprises a null antibody. 2. The microspheres have an immunoglob size ranging from 0.1 micron to 5 microns. The method of claim 1 which is a phosphorus coated magnetic microsphere. 3. 3. The immunoglobulin according to claim 2, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. the method of. 4. The plurality of monoclonal antibodies further comprises anti-CD20 monoclonal antibodies and antibodies. Contains an anti-CD20 monoclonal antibody specific for the usual acute lymphoblastic leukemia antigen. The method according to claim 1. 5. The method according to claim 4, wherein an anti-CD19 monoclonal antibody is added to the monoclonal antibody. How to list. 6. Tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell non-Hodgkin's lymphoma were immunologically immunologically isolated. When aging   (A) Selection of the bone marrow with multiple monoclonal antibodies and sufficient tumor throughput Incubate for 10 to 30 minutes at the specified temperature to : (I) anti-CD20 monoclonal antibody,   (Ii) anti-CD10 monoclonal antibody and   (Ii) of a molecular weight of 75,000 daltons on activated B cells and B cell lymphomas Consisting of a monoclonal antibody specific for the antigen;   (B) The product of step (a) was treated with immunoglobulin-coated magnetic microspheres at about 4 ° C. Incubate at temperature for times ranging from 15 to 1 hour;   (C) separating the magnetic microspheres from the product of step (b);   (D) Steps (a), (b) and (c) are repeated several times to obtain tumor cells in the bone marrow Cells using a polymerase chain growth reaction assay without depleting non-tumor cells. Immunological parameters of tumor cells characterized by depleting cells to undetectable levels. Zing method. 7. Add anti-CD19 monoclonal antibody to the monoclonal antibody used in step (a) The method according to claim 6, wherein 8. 7. The microsphere according to claim 6, having dimensions in the range of about 0.1 to 5.0 microns. How to list. 9. 7. The immunoglobulin according to claim 6, which is goat anti-mouse immunoglobulin. the method of. 10. To treat patients with B-cell non-Hodgkin's lymphoma by autologous bone marrow transplant Around   (A) collecting bone marrow from the patient;   (B) The bone marrow is treated with a plurality of selective anti-B cell monoclonal antibodies and microspheres. Tumor cells of the bone marrow treated with a specific sequence of Depleted tumor cells to undetectable levels by the merase chain growth reaction assay, 75,000 monoclonal antibodies to activated B-cell and B-cell lymphoma A monoclonal antibody specific for a Dalton molecular weight antigen;   (C) Patients characterized by transplanting the treated bone marrow back into the patient who obtained it. Treatment method. 11. The microspheres have an immunoglobulin size ranging from 0.1 micron to 5 microns. 11. The method of claim 10, which is a magnetic microsphere coated with brin. 12. The method according to claim 11, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 13. The plurality of monoclonal antibodies further comprises an anti-CD20 monoclonal antibody and Anti-CD10 monoclonal antibody specific for normal acute lymphoblastic leukemia antigen 11. The method of claim 10 including. 14. 14. An anti-CD19 monoclonal antibody added to said monoclonal antibody. The method described in. 15. Immunologically studying tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell non-Hodgkins lymphoma When purging, multiple selective binding of the bone marrow to microspheres was performed. The bone marrow tumor cells and non-tumor cells are depleted by treatment with an anti-B cell monoclonal antibody. The level of tumor cells not detected by the polymerase chain growth reaction assay. The plurality of monoclonal antibodies are activated B cells and B cell phosphorus. It contains a monoclonal antibody specific for an antigen of molecular weight 75,000 daltons on papilloma. A method for immunologically purging tumor cells, which comprises: 16. The microsphere has a size of 0.1 μm to 5 μm. Rosphere is immunoglobulin, gelatin, dextran and aminodex 16. The method of claim 15 coated with a material selected from the group consisting of tolans. 17． 23. The method according to claim 22, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 18. The plurality of monoclonal antibodies further comprises an anti-CD20 monoclonal antibody and Anti-CD10 monoclonal antibody specific for normal acute lymphoblastic leukemia antigen 16. The method of claim 15 including. 19. 19. An anti-CD19 monoclonal antibody added to said monoclonal antibody. The method described in. 20. To treat patients with B-cell non-Hodgkin's lymphoma by autologous bone marrow transplant Around   (A) obtaining bone marrow from said patient;   (B) Magnetic microspheres obtained by binding a plurality of anti-B cell monoclonal antibodies to the bone marrow Incubate with Fear and experiment the incubation at a temperature of about 4 ° C For a plurality of monoclonal antibodies at the following time:     (I) anti-CD20 monoclonal antibody,     (Ii) anti-CD10 monoclonal antibody and     (Iii) 75,000 dalton molecule on activated B cells and B cell lymphomas A quantity of a monoclonal antibody specific for the antigen;   (C) separating the magnetic microspheres from the product of step (b);   (D) Steps (a), (b) and (c) are repeated several times to obtain tumor cells in the bone marrow Cells using a polymerase chain growth reaction assay without depleting non-tumor cells. The cells are exhausted to undetectable levels;   (E) Patients characterized by transplanting the treated bone marrow back into the patient who obtained it. Treatment method. 21. Add anti-CD19 monoclonal antibody to the monoclonal antibody used in step (a). 21. The method of claim 20, wherein 22. 21. The microsphere according to claim 20, wherein the size is in the range of 0.1 to 5.0 microns. The method described. 23. The microspheres are combined with immunoglobulins, gelatin, dextran and Coated with a substance selected from the group consisting of minodextran, 21. The method of claim 20, wherein a body is attached to the coating. 24. 24. The method according to claim 23, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 25. Removal of tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell non-Hodgkins lymphoma Particles for binding to a plurality of anti-B cell monoclonal antibodies Comprising microspheres, the particles further depleting non-tumor cells from the bone marrow Tumor cells can be depleted without Nal antibody has a molecular weight of 75,000 Daltons on activated B-cell and B-cell lymphomas. For the removal of tumor cells characterized by containing a monoclonal antibody specific for the original particle. 26. The microspheres have a size of 0.3 to 5 microns. Spheres and immunoglobulin-coated microspheres, bound to the biological Immunoglobulin-coated microspheres with substance and said biological attached A selected from the group consisting of immunoglobulin-coated microspheres with substances. 25. Particles according to item 25. 27. 27. The method of claim 26, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. Particles listed. 28. The plurality of monoclonal antibodies further comprises an anti-CD20 monoclonal antibody and Anti-CD10 monoclonal antibody specific for common acute lymphoblastic leukemia antigen 26. The particle of claim 25, which comprises. 29. Claim to add anti-CD19 monoclonal antibody to said plurality of monoclonal antibodies Item 28. The particle according to Item 28.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (72)発明者 ネドラー リー エム アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02159 ニュートン クロス ヒル ロー ド36 (72)発明者 フリードマン アーノルド エス アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02115 ボストン ビネイ ストリート 44─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI G01N 33/577 B 8310-2J // C12P 21/08 9358-4B (72) Inventor Nedler Lee M United States Massachusetts 02159 Newton Cross Hillroad 36 (72) Inventor Friedman Arnold Es. Massachusetts, USA 02115 Boston Vinay Street 44

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．Ｂ細胞リンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパージングする にあたり、前記骨髄を複数の選択的抗Ｂ細胞モノクローナル抗体とミクロスフィ アの特定の配列で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポ リメラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨髄中に腫瘍細胞が検出されないレベ ルに消耗させることを特徴とする腫瘍細胞の免疫学的パージング方法。 ２．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜約５ミクロンの範囲の寸法の免疫グロ ブリン被覆磁性ミクロスフィアである請求項１に記載の方法。 ３．前記免疫グロブリンがヤギの抗マウス免疫グロブリンである請求項２に記載 の方法。 ４．前記モノクローナル抗体が抗CD20モノクローナル抗体、活性化Ｂ細胞および Ｂ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体および通常の急性リンパ芽球性白 血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を含む請求項１に記載の方法 。 ５．前記抗CD20モノクローナル抗体が正常および悪性Ｂ細胞上に現れる35,000ダ ルトンの細胞表面糖タンパク質に特異的である請求項４に記載の方法。 ６．前記活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体が75 ,000ダルトンの分子量の抗原に特異的である請求項４に記載の方法。 ７．前記抗CD10モノクローナル抗体が約100,000ダルトンの分子量を有するヒト 通常急性リンパ芽球性白血病抗原に特異的である請求項４に記載の方法。 ８．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項４に記 載の方法。 ９．Ｂ細胞リンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパージングする にあたり、 （a）前記骨髄を複数のモノクローナル抗体と十分な腫瘍処理量において選択 した温度にて約10〜30分間インキュベーションし、前記複数のモノクローナル抗 体が： （i）抗CD20モノクローナル抗体、 （ii）抗CF10モノクローナル抗体および （iii）活性化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル 抗体であり； （b）段階（a）の生成物を免疫グロブリン被覆磁性ミクロスフィアと約４℃の 温度で15〜約１時間の範囲の時間インキュベーションし； （c）段階（b）の生成物から磁性ミクロスフィアを分離し； （d）段階（a）、（b）および（c）を複数回繰り返して前記骨髄中の腫瘍細胞 を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨 髄中に腫瘍細胞が検出されないレベルに消耗させることを特徴とする腫瘍細胞の 免疫学的パージング方法。 １０．抗CD19モノクローナル抗体を段階（a）で用いるモノクローナル抗体に添 加する請求項９に記載の方法。 １１．前記ミクロスフィアが約0.1〜5.0ミクロンの範囲の寸法である請求項９に 記載の方法。 １２．前記免疫グロブリンがヤギの抗マウス免疫グロブリンである請求項９に記 載の方法。 １３．自己骨髄移植によりＢ細胞リンパ腫を病む患者を処置するにあたり、（a ） 前記患者から骨髄を収集し； （b）前記骨髄を複数の選択的抗Ｂ細胞モノクローナル抗体とミクロスフィア の特定の配列で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリ メラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨髄中に腫瘍細胞が検出されないレベル に消耗させ；さらに （c）処理した骨髄をそれを得た患者に移植して戻すことを特徴とする患者の 処置方法。 １４．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜約５ミクロンの範囲の寸法の免疫グ ロブリン被覆磁性ミクロスフィアである請求項１３に記載の方法。 １５．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項１４に記 載の方法。 １６．前記モノクローナル抗体が抗CD20モノクローナル抗体、活性化Ｂ細胞およ びＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体、および通常の急性リンパ芽球 性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を含む請求項１３に記載 の方法。 １７．前記抗CD20モノクローナル抗体が正常および悪性Ｂ細胞上に現れる3500ダ ルトンの細胞表面糖タンパク質に特異的である請求項１６に記載の方法。 １８．前記活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体が 75,000ダルトンの分子量の抗原に特異的である請求項１６に記載の方法。 １９．前記抗CD10モノクローナル抗体が約100,000ダルトンの分子量を有するヒ ト通常急性リンパ芽球性白血病抗原に特異的である請求項１６に記載の方法。 ２０．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項１６ に記載の方法。 ２１．Ｂ細胞リンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を免疫学的にパージングす るにあたり、前記骨髄をミクロスフィアに結合させた複数の選択的抗Ｂ細胞モノ クローナル抗体で処理し前記骨髄の腫瘍細胞を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポ リメラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨髄中に腫瘍細胞が検出されないレベ ルに消耗させることを特徴とする腫瘍細胞の免疫学的パージング方法。 ２２．前記ミクロスフィアが0.1ミクロン〜約５ミクロンの範囲の寸法の磁性ミ クロスフィアであり免疫グロブリン、ゼラチン、デキストランおよびアミノデキ ストランからなる群より選択した物質で被覆した請求項２１に記載の方法。 ２３．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項２２に記 載の方法。 ２４．前記モノクローナル抗体が抗CD20モノクローナル抗体、活性化Ｂ細胞およ びＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体、および通常の急性リンパ芽球 性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を含む請求項２１に記載 の方法。 ２５．前記抗CD20モノクローナル抗体が正常および悪性Ｂ細胞上に現れる35,000 ダルトンの細胞表面糖タンパク質に特異的である請求項２４に記載の方法。 ２６．前記活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体が 75,000ダルトンの分子量の抗原に特異的である請求項２４に記載の方法。 ２７．前記抗CD10モノクローナル抗体が約100,000ダルトンの分子量を有するヒ ト通常急性リンパ芽球性白血病抗原に特異的である請求項２４に記載の方法。 ２８．抗CD19モノクローナル抗体を前記モノクローナル抗体に加える請求項２４ に記載の方法。 ２９．自己骨髄移植によりＢ細胞リンパ腫を病む患者を処置するにあたり、（a ）前記患者から骨髄を得； （b）前記骨髄を複数の抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を結合した磁性ミクロス フィアとインキュベーションし、前記インキュベーションを約４℃の温度で実験 的に決定した時間で行い、さらに前記複数のモノクローナル抗体が： （i）抗CD20モノクローナル抗体、 （ii）抗CF10モノクローナル抗体および （iii）活性化したＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル 抗体からなり； （c）段階(b)の生成物から磁性ミクロスフィアを分離し； （d）段階（a）、（b）および（c）を複数回繰り返して前記骨髄中の腫瘍細胞 を、非腫瘍細胞を消耗させずに、ポリメラーゼ鎖成長反応アッセイにより前記骨 髄中に腫瘍細胞が検出されないレベルに消耗させ； （e）処理した骨髄をそれを得た患者に移植して戻すことを特徴とする患者の 処置方法。 ３０．抗CD19モノクローナル抗体を段階（a）で用いるモノクローナル抗体に添 加する請求項２９に記載の方法。 ３１．前記ミクロスフィアが約0.1〜5.0ミクロンの範囲の寸法である請求項２９ に記載の方法。 ３２．前記ミクロスフィアを免疫グロブリン、ゼラチン、デキストランおよびア ミノデキストランからなる群より選択した物質で被覆し、前記モノクローナル抗 体を前記被膜に結合した請求項２９に記載の方法。 ３３．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項３２に記 載の方法。 ３４．Ｂ細胞リンパ腫を病む患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するための粒子が結 合した複数の抗Ｂ細胞モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを含み、前記 粒子が前記骨髄から非腫瘍細胞を消耗させることなく、前記腫瘍細胞を消耗させ ることができることを特徴とする腫瘍細胞除去のための粒子。 ３５．前記ミクロスフィアが0.3ミクロン〜約５ミクロンの範囲の寸法の磁性ミ クロスフィアであり免疫グロブリン被覆ミクロスフィア、結合させた前記生物学 的物質を有する免疫グロブリン被覆ミクロスフィアおよび付着させた前記生物学 的物質を有する免疫グロブリン被覆ミクロスフィアからなる群より選択した請求 項３４に記載の粒子。 ３６．前記免疫グロブリンがヤギ抗マウス免疫グロブリンである請求項３５に記 載の粒子。 ３７．前記複数のモノクローナル抗体が抗CD20モノクローナル抗体、活性化Ｂ細 胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体、および通常の急性リン パ芽球性白血病抗原に対し特異的な抗CD10モノクローナル抗体を含む請求項３４ に記載の粒子。 ３８．前記抗CD20モノクローナル抗体が正常および悪性Ｂ細胞上に現れる3500ダ ルトンの細胞表面糖タンパク質に特異的である請求項３４に記載の粒子。 ３９．前記活性化Ｂ細胞およびＢ細胞リンパ腫に特異的なモノクローナル抗体が 75,000ダルトンの分子量の抗原に特異的である請求項３４に記載の粒子。 ４０．前記抗CD10モノクローナル抗体が約100,000ダルトンの分子量を有するヒ ト通常急性リンパ芽球性白血病抗原に特異的である請求項３４に記載の粒子。 ４１．抗CD19モノクローナル抗体を前記多数のモノクローナル抗体に加えた請求 項３７に記載の粒子。[Claims] 1. Immunologically purging tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell lymphoma The bone marrow was treated with a plurality of selective anti-B cell monoclonal antibodies and microspheres. Of the bone marrow tumor cells treated with a specific sequence of Levels of tumor cells not detected in the bone marrow by limerase chain growth reaction assay A method for immunologically purging tumor cells, which comprises exhausting the cells. 2. The microspheres have an immunoglobulin size ranging from 0.1 micron to about 5 microns. The method of claim 1, which is a brin-coated magnetic microsphere. 3. 3. The immunoglobulin according to claim 2, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. the method of. 4. The monoclonal antibody is an anti-CD20 monoclonal antibody, activated B cells and Monoclonal antibody specific for B-cell lymphoma and normal acute lymphoblastic white The method according to claim 1, which comprises an anti-CD10 monoclonal antibody specific for a blood disease antigen. . 5. The anti-CD20 monoclonal antibody appears on normal and malignant B cells. The method according to claim 4, which is specific for the cell surface glycoprotein of Ruton. 6. 75 monoclonal antibodies specific for the activated B cells and B cell lymphomas The method according to claim 4, which is specific for an antigen having a molecular weight of 1,000 daltons. 7. The anti-CD10 monoclonal antibody has a molecular weight of about 100,000 daltons The method of claim 4, which is usually specific for the acute lymphoblastic leukemia antigen. 8. The method according to claim 4, wherein an anti-CD19 monoclonal antibody is added to the monoclonal antibody. How to list. 9. Immunologically purging tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell lymphoma Hits the,   (A) Selection of the bone marrow with multiple monoclonal antibodies and sufficient tumor throughput Incubate for about 10-30 minutes at Body is:     (I) anti-CD20 monoclonal antibody,     (Ii) anti-CF10 monoclonal antibody and     (Iii) Monoclonal specific for activated B cells and B cell lymphomas An antibody;   (B) The product of step (a) was treated with immunoglobulin-coated magnetic microspheres at about 4 ° C. Incubating at temperature for times ranging from 15 to about 1 hour;   (C) separating the magnetic microspheres from the product of step (b);   (D) Steps (a), (b) and (c) are repeated several times to obtain tumor cells in the bone marrow The bone marrow by the polymerase chain reaction assay without depleting non-tumor cells. Of tumor cells characterized by depleting the tumor cells to undetectable levels in the marrow Immunological purging method. 10. Add anti-CD19 monoclonal antibody to the monoclonal antibody used in step (a). The method according to claim 9, further comprising: 11. The microspheres have dimensions in the range of about 0.1-5.0 microns. The method described. 12. The method according to claim 9, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 13. In treating patients suffering from B-cell lymphoma by autologous bone marrow transplantation (a ) Collecting bone marrow from the patient;   (B) The bone marrow is treated with a plurality of selective anti-B cell monoclonal antibodies and microspheres. Tumor cells of the bone marrow treated with a specific sequence of No detectable levels of tumor cells in the bone marrow by merase chain growth reaction assay Depletes;   (C) Patients characterized by transplanting the treated bone marrow back into the patient who obtained it. Treatment method. 14. The microspheres have immunological sizes ranging from 0.1 micron to about 5 microns. 14. The method of claim 13, which is a lobulin coated magnetic microsphere. 15. 15. The immunoglobulin according to claim 14, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 16. The monoclonal antibodies are anti-CD20 monoclonal antibodies, activated B cells and And B-cell lymphoma-specific monoclonal antibodies and normal acute lymphoblasts 14. An anti-CD10 monoclonal antibody specific for a sex leukemia antigen. the method of. 17． The anti-CD20 monoclonal antibody appears on normal and malignant B cells 17. The method of claim 16, which is specific for the Luton cell surface glycoprotein. 18. A monoclonal antibody specific for the activated B cells and B cell lymphoma The method according to claim 16, which is specific for an antigen having a molecular weight of 75,000 daltons. 19. The anti-CD10 monoclonal antibody has a molecular weight of about 100,000 daltons. The method according to claim 16, which is usually specific for an acute lymphoblastic leukemia antigen. 20. 17. An anti-CD19 monoclonal antibody added to said monoclonal antibody. The method described in. 21. Immunologically purging tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell lymphoma In order to achieve this, a plurality of selective anti-B cell mononuclear cells in which the bone marrow is bound to microspheres are used. The bone marrow tumor cells treated with the clonal antibody were not depleted of non-tumor cells and Levels of tumor cells not detected in the bone marrow by limerase chain growth reaction assay A method for immunologically purging tumor cells, which comprises exhausting the cells. 22. The microspheres have a size ranging from 0.1 micron to about 5 microns. Cross-spheres, immunoglobulins, gelatin, dextran and aminodex 22. The method of claim 21, coated with a material selected from the group consisting of strans. 23. 23. The method according to claim 22, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 24. The monoclonal antibodies are anti-CD20 monoclonal antibodies, activated B cells and And B-cell lymphoma-specific monoclonal antibodies and normal acute lymphoblasts 22. An anti-CD10 monoclonal antibody specific for a sex leukemia antigen. the method of. 25. The anti-CD20 monoclonal antibody appears on normal and malignant B cells 35,000 25. The method of claim 24, which is specific for Dalton cell surface glycoproteins. 26. A monoclonal antibody specific for the activated B cells and B cell lymphoma 25. The method of claim 24, which is specific for an antigen with a molecular weight of 75,000 daltons. 27. The anti-CD10 monoclonal antibody has a molecular weight of about 100,000 daltons. 25. The method of claim 24, which is usually specific for the acute lymphoblastic leukemia antigen. 28. 25. An anti-CD19 monoclonal antibody is added to said monoclonal antibody. The method described in. 29. In treating patients suffering from B-cell lymphoma by autologous bone marrow transplantation (a ) Obtaining bone marrow from said patient;   (B) Magnetic microspheres obtained by binding a plurality of anti-B cell monoclonal antibodies to the bone marrow Incubate with Fear and experiment the incubation at a temperature of about 4 ° C For a predetermined time, and the plurality of monoclonal antibodies:     (I) anti-CD20 monoclonal antibody,     (Ii) anti-CF10 monoclonal antibody and     (Iii) Monoclonal specific for activated B cells and B cell lymphomas Consisting of antibodies;   (C) separating the magnetic microspheres from the product of step (b);   (D) Steps (a), (b) and (c) are repeated several times to obtain tumor cells in the bone marrow The bone marrow by the polymerase chain reaction assay without depleting non-tumor cells. Depletes tumor cells to undetectable levels in the marrow;   (E) Patients characterized by transplanting the treated bone marrow back into the patient who obtained it. Treatment method. 30. Add anti-CD19 monoclonal antibody to the monoclonal antibody used in step (a). 30. The method of claim 29, further comprising: 31. 30. The microspheres have dimensions in the range of about 0.1-5.0 microns. The method described in. 32. The microspheres are combined with immunoglobulins, gelatin, dextran and Coated with a substance selected from the group consisting of minodextran, 30. The method of claim 29, wherein a body is attached to the coating. 33. 33. The method of claim 32, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. How to list. 34. Particles are available to remove tumor cells from the bone marrow of patients with B-cell lymphoma. A microsphere having a plurality of combined anti-B cell monoclonal antibodies, Particles deplete the tumor cells without depleting non-tumor cells from the bone marrow Particles for removing tumor cells, which are characterized in that they can be. 35. The microspheres have a size ranging from 0.3 microns to about 5 microns. Crosssphere and immunoglobulin coated microsphere, bound to the biology Coated microspheres with biological substance and said attached biology Claims selected from the group consisting of immunoglobulin-coated microspheres with biological substances Item 34. The particle according to Item 34. 36. 36. The method according to claim 35, wherein the immunoglobulin is goat anti-mouse immunoglobulin. Particles listed. 37. The plurality of monoclonal antibodies are anti-CD20 monoclonal antibody and activated B antibody. Antibody specific for vesicle and B-cell lymphoma, and normal acute phosphorus 35. An anti-CD10 monoclonal antibody specific for a paioblastic leukemia antigen is included. Particles according to. 38. The anti-CD20 monoclonal antibody appears on normal and malignant B cells 35. The particle of claim 34, which is specific for the cell surface glycoprotein of Ruton. 39. A monoclonal antibody specific for the activated B cells and B cell lymphoma 35. The particle according to claim 34, which is specific for an antigen having a molecular weight of 75,000 Daltons. 40. The anti-CD10 monoclonal antibody has a molecular weight of about 100,000 daltons. 35. The particle according to claim 34, which is usually specific for the acute lymphoblastic leukemia antigen. 41. Claim to add anti-CD19 monoclonal antibody to the above-mentioned large number of monoclonal antibodies Item 38. The particle according to Item 37.
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