JPH08502404A

JPH08502404A - チオールプロテアーゼを含有するワクチン

Info

Publication number: JPH08502404A
Application number: JP6509802A
Authority: JP
Inventors: ダルトン，ジョン，ピー．; アンドリュース，スチュアート，ジェイ．
Original assignee: マリンクロットベテリナリー，アイエヌシー，
Priority date: 1992-10-21
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 1996-03-19
Also published as: EP0666919A1; EP0666919B1; CA2147378A1; WO1994009142A1; US20050208063A1; PT666919E; DE69332977T2; NZ257148A; DE69332977D1; ATE240397T1; DK0666919T3; US6623735B1; ES2199947T3; AU5340094A

Abstract

(57)【要約】本発明は、嬬虫寄生虫を撲滅するためのワクチンの処方への、カテプシンＬ型の酵素活性を有するチオールプロテアーゼの使用に関する。好ましくはこのプロテアーゼは、Fasciola hepatica 等のような吸虫から誘導される。

Description

【発明の詳細な説明】チオールプロテアーゼを含有するワクチン本発明は、蠕虫（helminth）寄生虫に対する防御抗原としての、ある種類のチオールプロテアーゼ、即ちこのような寄生虫により外分泌／内分泌生成物としてしばしば放出されるカテプシンL-様プロテアーゼの使用に関する。家畜のそれぞれの種は、蠕虫の多数の異なる種に感染することがあり、この感染は一般に病気を引き起こす過程である。例えば寄生性吸虫である肝蛭（Fascio la hepatica ）は、ウシおよびヒツジのような反芻動物に、経済上重要な病気である肝蛭症を引き起こすことが知られている。この寄生虫は腸壁を貫通することにより哺乳類宿主に入り、そして胆管内に移行する前に、肝臓隗上で栄養摂取しながらまたは肝臓隗に穴を掘って、約７週間を過ごす。感染の後、宿主中での免疫の発生は貧弱であり、既に感染した宿主の再感染に対する耐性は部分的にすぎないか、または存在しない。他の吸虫類としては、巨大肝蛭（Fasciola giganti ca ）および二腔吸虫属（Dicrocoelium spp.）、そしてまた、パラムフィストムム属（Paramphistomum spp.）が挙げられる。問題は、鉤虫類（例えば、Necator、Ancylostoma、Uncinariaおよび Bunosto mum spp.）などの線虫によっても引き起こされる。血液栄養性（blood-feeding）線虫のうち、ヘモンカス属（Haemonchus）は反芻動物の第四胃の内壁に感染し、貧血および体重減少を引き起こし、かつ治療しない場合には、しばしば死に至らしめる。関連する非血液栄養性（non-bloodfee ding）の線虫類オステルタジア属（Ostertagia）に感染した動物も、同様に成長せず、治療しない場合には死亡することがある。経済上重要な他の寄生性蠕虫としては、次に示される種々の蠕虫属：Trichostrongylus 、Nematodirus、Dictyocaulus、Cooperia、Ascaris、Dirofila ria 、TrichurisおよびStrongylusが挙げられる。家畜に加えて、ペットおよびヒトにも、致命的な結果になることは頻繁ではないが感染することがあるので、蠕虫の感染および侵入は無視できない世界的に重要な問題を提起する。放牧家畜の蠕虫寄生虫の制御は、現在、放牧管理と組み合わせた殺蠕虫剤の使用に主に基づいている。このような技術は、第一に、殺蠕虫剤を頻繁に投与する必要があるために、第二に、殺蠕虫剤に対する耐性がますます広がるようになるために、第三に、幾つかの牧場では適切な放牧管理がしばしば不可能であり、それが可能だとしても、利用できる牧草地の最善の使用に制約が生じることがあるために、しばしば不十分である。家畜の寄生虫を免疫学的手段で制御しようとする多くの試みがなされてきた。極めて少ない例（例えばウシの肺寄生虫、Dictyocaulus viviparus）を除いて、これが可能であることは証明されていない。 WO90/08819では、F．hepaticaに対するワクチンが提案されており、これはF． hepatica からのグルタチオン-s-トランスフェラーゼを抗原性物質として含む。 Bennett（英国特許 2169606B 号）は、ファスキオラ属（Fasciola）の器官からの種々の抗原を、幼虫期および成虫期をとおして存在する抗原から幼虫期に特異的な抗原を分離する方法によって抽出した。インビトロで培養されたF．hepaticaは、パパイン型またはカテプシン-B-型の活性により、免疫グロブリンを切断しうるプロテアーゼ酵素を放出することが知られている（Chapman and Mitchell，Vet．Parasitol．11 (1982)，p．165-178 ）。これらプロテアーゼ酵素は、表面グリコカリクスを脱ぎ捨てるという知られた能力と組み合わされて免疫応答の回避を援助し、このようにして結合した抗体を離脱させるだろうということが示唆された（Hanna，Exp．Prasitol 50(1980 )，p．155-70）。さらに、粗製のインビトロ外分泌／内分泌性生成物は、ある状況下でラットに免疫を与えることができ（Rajasekariah et al，Parasitol．79 (1979)，p．393-400）、これは多分、このような酵素に対する抗体が産生され、従ってこれらを阻害することによる。しかしながら、これら酵素の正確な性質は、明確であることからはほど遠い。ゼラチン基質ポリアクリルアミドゲル電気泳動（GS-PAGE）を伴う外分泌／内分泌性プロテアーゼの研究（Dalton and Heffernan，Mol．Biochem．Parasitol ．35 (1989)，p．161-166）は、広範囲の分子量を有し、かつ全般的に２つのグループ（即ちpH 4.5〜8.0で活性な27.5 KDa〜46 KDa、およびpH 3.0〜4.5で活性な60 KDa〜88 KDa）に属する多数のシステインプロテアーゼを示した。後者のグループは、ChapmanおよびMitchellの免疫グロブリン切断酵素に相当するかもしれないこと、および１種以上のプロテアーゼ酵素の自己分解および／または凝集が、多重バンド構造を与えているのかもしれないことが示唆された。続いてHPLC手法が用いられ、３つのピークに分けられた。15 kDaピークからのタンパク質は、最適pH 4.5でIgGを切断する能力を有することが分かった（Heffe rnan et al，Biochem．Soc．Trans．19 (1991)，page 275）。成虫期 F．hepaticaのプロテアーゼ酵素を特性決定しようとする別の研究は、 Rege et．al．（Mol．Biochem．Parasitol．35 (1989)，p．89-96）の研究であり、この研究では、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびモレキュラーシーブ HPLCにより、14,500 Daタンパク質が精製された。基質CBZ-Phe-Arg-AFCの最大加水分解はpH 6.0において認められた。Rege et alは、凍結乾燥した蠕虫全体をプロテアーゼ源として用いたので、彼らのプロテアーゼが外分泌されたか否かは明らかでない。彼らは、プロテアーゼが免疫回避または栄養に関連するかもしれないと考えた。 ”Fasciola spp．”から単離されたプロテアーゼが、Yamasaki et al．によって報告されている（Japan J．Parasitol.，38 （1989），p．373-384）。このプロテアーゼは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDSー PAGE）で測定して27 kDaの分子量を有し、ヘモグロビンを加水分解することができ、この加水分解活性はシステインプロテアーゼ阻害剤で阻害された。このプロテアーゼに特異的なモノクローナル抗体もまた、ヘモグロビン加水分解を阻害することができた。嬬虫寄生虫により放出されるプロテアーゼに関する他の研究は、Fasciolagiga ntica に関するFagbemi and Hillyer，Vet．Parasitol．40（1991），p．217-226 ；Ascaris suumに関するKnox and Kennedy，Mol．Biochem．Parasitol．28（198 8），p．207-216：およびParagoniumus westermaniに関するYamakami and Hamaj ima，Comp．Biochem．Physiol．87B（1987），p．643-648である。本発明者らは、DaltonおよびHeffernanによりゼラチン基質（GS）PAGE上で27. 5-88 kDaの範囲の分子量範囲を有すると開示されたシステインプロテアーゼが、実際には、還元性SDS-PAGEにより27 kDaおよび29.5の２つのプロテアーゼに分解できること；これらのプロテアーゼが、基質特異性、イオン交換カラムに対する親和性およびＮ-末端配列決定により決定して２つの異なるカテプシンL-様活性を示すこと：これらプロテアーゼが、免疫グロブリンを切断する能力をも有すること；精製プロテアーゼでのウサギの免疫処置が、酵素活性を中和しうる抗体を刺激できることを見出し；そして、この発見が、よく特性決定された精製保護抗原を用いて、かつ、毒性および副作用、例えば未分解の粗製外分泌／内分泌性生成物の使用に内在する免役の抑制および優勢に関する欠点を避けて、嬬虫寄生虫、特にF．hepaticaに対する効果的なワクチンの可能性を開くことを見出した。従って、本発明の第一の態様は、抗原性物質が、少なくとも部分的に精製された形態におけるカテプシンL型酵素活性を有したプロテアーゼ、あるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープを、担体および／またはアジュバントと一緒に含む、哺乳動物の嬬虫寄生虫感染を撲滅するのに使用するためのワクチンを提供する。本発明はまた、前記で定義した本発明に係るワクチンを、嬬虫寄生虫感染の撲滅に有効な量で哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物の嬬虫寄生虫感染を撲滅する方法を提供する。哺乳動物は好ましくは反芻動物、例えばウシまたはヒツジであるが、本発明のワクチンおよび方法はヒトにも適用できる。好ましくは、カテプシンL-様プロテアーゼは、吸虫類、例えばFasciolaまたはDicrocoelium 、特に肝蛭Fasciola hepaticaから誘導される。あるいは、カテプシンL-様プロテアーゼは、FasciolaまたはDicrocoelium、特に肝蛭F．hepatica およびF．giganticaに対して有効であろう免役応答を刺激できることが好ましく、従って、交叉−保護免役応答を付与しうるような他の種からのカテプシンL-様分子は、本発明の特に好ましい態様を形成する。以下において、還元性条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して約27 KDaの分子量を有することが示されるF．hepatic a カテプシンL-様プロテアーゼは、本発明のワクチンおよび方法に使用するために特に好ましい。このプロテアーゼはまた、モレクラーシーブHPLCによる15 KDa の見掛け分子量を有する。これをカテプシンL1と記載する。以下において、還元性条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して約29.5 KDaの分子量を有することが示されるF．hepat ica カテプシンL-様プロテアーゼもまた、ワクチンに使用するために特に好ましく、それ自体新規なタンパク質として本発明のもう一つの態様を形成する。このカテプシンは、カテプシンL1と区別する必要がある場合に、カテプシンL2と記載される。本発明に係るワクチンに導入されるカテプシンL-様活性は、少なくとも部分的に精製された形態にある。好ましくは、カテプシンL-様活性は、ワクチン中に存在する外分泌／内分泌性タンパク質の合計の少なくとも７５%を含み、より好ましくはカテプシンLは少なくとも95%の純度である。少なくとも95%純度のカテプシンLが一旦得られると、これを、１種以上のさらなる外分泌／内分泌性タンパク質を含む１種以上のさらなる精製抗原性タンパク質と混合して、多価ワクチンを形成することができる。カテプシンL-様活性は、合成ペプチド基質Z-phe-arg-AMC（ベンジルオキシカルボニル-L-フェニルアラニル-L-アルギニル-7-アミド-4-メチルクマリン）を切断する能力と、関連ペプチドZ-arg-arg-AMCおよびZ-arg-AMCの切断に対して比較的無能力であることとを組み合わせて説明することができ、こうしてこの酵素をカテプシンＢおよびカテプシンＨと区別することができる。カテプシンLとしてのプロテアーゼの確認は、Ｎ-末端アミノ酸配列を既知のカテプシンL分子の配列と比較することによっても得ることができる。ラット肝カテプシンL（哺乳類カテプシンL）は、２本鎖タンパク質として存在することが示されている（Ishidoh et al，FEBS Letters 223（1987），pages 6 9-73）。類似構造が非-哺乳類カテプシンL中に存在するか否かは明らかではないが、以下に示すアミノ酸配列結果を参照されたい。本発明に係るワクチンは、従来の担体および／またはアジュバントと共に処方することができ、そして本発明はまた、カテプシンL型の酵素活性を有する精製プロテアーゼ、あるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープと、１種以上のアジュバントまたは担体とを一緒にすることからなるワクチンの製造方法を提供する。好適なアジュバントとしては、１種以上の製剤上許容される担体または希釈剤の存在下の、水酸化アルミニウム、サポニン（ISCOMS）、ムラミルジペプチド、鉱物油および植物油、DEAEデキストラン、非イオン性ブロックコポリマーまたはリポソーム、例えばNovasomes（Micro Vesicular Systems Inc．の商品名）等が挙げられる。本発明に係るカテプシンＬ-様プロテアーゼエピトープに相当するペプチド配列のための担体は、Ｂ型肝炎コア抗原多重抗原ペプチド等、またはトリパルミトイル-S-グリセリルシステイニルセリルセリン（P，CSS）等のリポペプチド等のようなタンパク質である。好適な希釈剤としては、液状媒体、例えばビヒクルとしての使用に適する食塩溶液が挙げられる。追加の成分、例えば保存剤を含めることができる。宿主へのワクチンの投与は、任意の従来の経路で、例えば経口的または非経口的に、例えば筋肉内注射により、所望により間隔をおいて、例えば7〜35日の間隔で２回の注射により行なうことができる。注射により投与する場合の好適な投与量は、10〜500μｇの範囲のカテプシンL-様タンパク質の量を与えるような投与量であってよい。本発明に係るワクチンに使用するためのカテプシンＬ-様プロテアーゼは、幼虫期および／または成虫期嬬虫の外分泌／内分泌性生成物から単離することにより製造できるが、既知の利点を有する組み換えDNA技術（このような技術は生成物の純度、生産性のスケールアップおよび再現性に関して利点を与える）により製造することも好都合でありうる。従って、本発明はまた、組み換えDNA技術により製造されたカテプシンL-様プロテアーゼ、あるいはそのプロエンザイム、またはその抗原性フラグメントまたはエピトープを提供する。上記に関する本発明の追加の態様には、カテプシンＬ-様プロテアーゼあるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープをコードするDNA分子；このようなDNA配列の１種以上を含有するべクター：このようなベクター、例えばバクロウイルスベクターにより形質転換された宿主細胞、例えばE．coliのようなバクテリア、より好ましくは真核細胞；および、このような形質転換宿主細胞を培養し、培養細胞からカテプシンL-様プロテアーゼ、あるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープを単離することからなる、組み換えカテプシンL-様プロテアーゼ、あるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープの製造方法を提供する。カテプシンL-様プロテアーゼの三次構造は、予防接種した動物の抗体応答において重要であるため、真核細胞性発現システムが好ましい。何故ならば、三次構造がより正確に再現されるからである。もう一つの生ワクチンまたは不活化ワクチン製剤は、挿入された核酸分子によってコードされたポリペプチドに対する免役応答を刺激するために、本発明に係るDNA分子が挿入されている弱毒化または有毒のウイルスあるいは宿主細胞、例えばバクテリアのような微生物を含有することができる。ワクチン中に追加の抗原性物質を存在させて、問題の嬬虫寄生虫に対する増強された保護効果を与えるか、または１つ以上の追加の寄生虫感染に対する組み合わせ保護効果を与えることもできる。本発明のさらにもう一つの態様は、哺乳類に投与した場合に、この哺乳類においてカテプシンL-様プロテアーゼに対する免役を誘発することのできるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を提供する。この抗体は、１種以上のさらなる抗体の可変部に対して親和性を有し、これらのさらなる抗体は、前記カテプシンLに対して親和性を有する。このアプローチ、いわゆる”アンチーイディオタイプ”アプローチは、全く起源の抗原なしで済ませ、かつ、安全性、副作用の回避および製造の利便性に関してより大きな利点を提供しうるワクチンの処方を可能にする。本発明を下記の実施例により説明する。１）カテプシンL1の精製屠殺場で不適格と判定された動物の感染肝臓から、成熟した吸虫を得た。これらの吸虫を洗浄し、一夜培養し、Dalton and Heffernan，Mol．Biochem．Parasi tol．35（1989）p．161-166に記載のようにして、培地を遠心した。この培地500 ml（E/S）を、3000mwカットオフを有する膜で限外濾過して10mlに濃縮し、試料を４℃で、燐酸塩緩衝生理食塩水（PBS）pH7.3で平衡化した120mlのSephacryl S -200カラム（1.9 x 42 cm，Pharmacia，Uppsala，Sweden）にかけた。このカラムの空隙容積は110mlであると認められた。（空隙容積が溶離された後）フラクション（容積５ml）を集め、LKB Uvicordモニターを用いてO．D．280nmで、フラクションのタンパク質含有量を監視した。異なるフラクション中のカテプシンＬ -様酵素活性を、カテプシンＬ酵素に特異的であることが知られている合成発蛍光性ペプチドZ-Phe-Arg-AMCを用いてアッセイした。蛍光性脱離基（leavinｇ gr oup）7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）の放出を、それぞれ370および440nmの励起および発光波長において、Perkin-Elmer Luminescence Spectrometerモデル LS 50で監視した（図１Ａ）。カテプシンL-様活性を有するフラクションをプールし、50mlのQAESephadex（Pharmacia，Uppsala，Sweden）にかけた。このカラムは下記のようにして調製した。 QAE Sephadex A-50を、1.0 M NaC1を補充した0.1M Tris-HCI pH 7.0中で予備膨潤させ、50mlカラム内に注いだ。次いでカラムを、0.1M Tris pH7.0で平衡化した。プールしたカテプシンL-様プロテアーゼを、４℃で２回カラムにかけて、 E/S生成物中に存在する非-カテプシンLタンパク質の最高結合を確実にした。カラムの流速は約１ml/minであった。通過したフラクション、すなわちQAE Sephad exに吸着しなかったタンパク質を含有するフラクション（約50ml）を集め、3000 mwカットオフを有する膜で限外濾過して容積10ml に濃縮し、超−純水に対して透析し、凍結乾燥した。この精製カテプシン-L1プロテイナーゼの最終特異的活性は、11.67x10³単位/m gタンパク質（ここで、１単位はAMC1μmol/minを放出する）であった。精製操作からの試料を採取し、プロテイナーゼ活性を評価するため、およびカテプシン-L1の純度を確立するため、GS、SDS-非-還元性およびSDS-還元性ポリアクリルアミドゲル（10%アクリルアミド、0.1%SDS）にかけた。その結果は図１Ｂに示されている。この図において、レーン１および３は、ＧＳおよびSDS非-還元性ゲル上の全E/S生成物であり、レーン２および４は、GSおよびSDS非−還元性ゲル上の精製カテプシンL1であるが、レーン５は、還元条件下でのSDSゲル上の精製カテプシンL1である。SDS-PAGE分析は、精製カテプシン-L1が、分子量範囲60 KDaおよびそれ以上にあるプロテイナーゼ活性の多重バンドからなり（図１Ｂ）レーン２、上記Dalton&Heffernan参照）、これらのバンドはSDS-非-還元性ゲル上での類似の分子量バンドに対応するが、SDS-還元性ゲル上では、これら多重バンドは分子量27 KDaのバンドに分離されたことを示した（図１Ｂ）レーン５）。２）Ｎ-末端配列決定この精製酵素の分類がカテプシンL-様プロテイナーゼであると確認するために、ゲル濾過カラムからプールしたカテプシン-L1の濃縮試料を、AppliedBiosyste ms 477Aタンパク質シーケンサーを用いて配列決定した。得られたアミノ酸配列を、予め決定した既知のカテプシン-L分子の配列およびSchistosoma mansoniのカテプシン-Ｂ配列と整列させた（以下の表）。F．hepatica カテプシン-L1の配列と同一の配列は、点で示されている。Ｎ-末端配列の最初の19の残基において、この吸虫カテプシン-L1は、ウシおよびニワトリの肝臓源の両方からのカテプシン-L分子と63%の同一性を有し、ラット、ヒトおよびTrypanosoma cruziからの分子とは、それぞれ53、59および53%の相同性を有し、S．mansoniからのカテプシン-Ｂとは26%の相同性を有する。３）カテプシン-L1抗体の産生カテプシン-L1に対するポリクローナル抗血清を、完全フロイントアジュバント中の精製酵素52μｇを皮下注射することにより、白ウサギにおいて生じさせた。最初の免役処置に続いて、40日目、90日目、120日目および150日目に不完全アジュバント中の酵素52μｇを追加免役し、１週間後に動物から採血した。抗体の力価は、ELISAを用いて測定した。マイクロタイターに成体期E/S生成物 50μｌを塗布し、カバーをかけずに37℃で一夜放置した。抗血清からプロテイン -Ａカラムを用いてIgG2a免役グロブリンを精製した。４）ウエスターンブロッティング実験ウェスターンブロット免役分析を用いて、特異性を測定し、次いでF．hepatic a からの精製プロテイナーゼカテプシンL1に対して生じさせたウサギ抗体の交叉 −反応性を測定した。これらは、E/S生成物および精製カテプシン-L1を用いて行なった。タンパク質をSDS-PAFEで分離し、半乾燥ブロッティングシステムを用いてニトロセルロース紙に電気泳動的に移行させた。１％ウシ胎児血清（FCS）および0.5%Tween-20（PBS中）を用いて、非特異的結合性部位をブロックした。ニトロセルロースを抗-カテプシン-L1と共にインキュベートし、結合した免役グロブリンを、アルカリ性ホスファターゼ接合抗−ウサギ血清を用いて検出した。ジメリルホルムアミド中で調製したニトロブル−トリアゾリウムおよび5-ブロモ-5 -クロロ-3-インドリルホスフェートを、基質として用いた。精製免役グロブリンは、E/S生成物中に存在する他のタンパク質との反応を示さず、それらの全ての結合特異性は、精製カテプシン-L1のプロテイナーゼ活性の原因となるE/S生成物中のタンパク質バンド（非-還元性条件下でのSDSーPAGEにけるMW 60 KDa）に限られていた。還元性条件下で走行させたSDS-PAGEのブロットは、抗−カテプシン-L1抗-血清で探査すると、E/Sおよび精製カテプシン-L1の両者において、タンパク質KW 27 KDaの唯一のバンドとの特異的結合を示した。これは、精製カテプシン-L1のSDS還元性ゲルを走行させる場合に見られるタンパク質の単一バンドに相関する。５）酵素活性の阻害ウサギにおいて生じさせた抗−カテプシン-L1抗体がカテプシン-L1の活性を阻害するかどうかを決定するために、精製抗体を次のように使用した。図２Ａは、カテプシン-L1および増量されていく抗−カテプシン-L1 IgGを加えた10%ゼラチン基質非−還元性ポリアクリルアミドゲルを示す。このゲルから、暗色バックグラウンド上の鮮明なバンドの強度の増加で示されるように（レーン１〜７）、抗 −カテプシン-L1 IgGの濃度が高まるにつれて、酵素のプロテイナーゼ活性が低下し、その一方で、類似の濃度の非−免役ウサギIgGは、カテプシン-L1のプロテイナーゼ活性に影響を及ぼさなかったこと（レーン８はカテプシンＬ単独、レーン９はカテプシンＬと非−免役ウサギIgG）が明らかである。 F．hepaticaからのカテプシン-L1の最も顕著な特性の一つは、抗体をヒンジ領域で切断することのできるその能力である。精製カテプシン-L1を抗−カテプシン-L1 IgGまたはコントロールIgGと混合し、37℃でインキュベート、種々の時間的間隔で試料を採取し、反応混合物中の抗体分子をSDS-PAGEで測定した。これらのゲルの濃度測定スキャンにより、抗−カテプシン-L1が酵素に結合することは、酵素が抗体の重鎖中の切断部位に接近できるのを防止することを実証した。それ故に、重鎖の消化から生じたフラグメントを表わすピーク（図２、パネルＢ）（ii））は、カテプシン-L1をコントロールIgGと共にインキュベートした場合に観察されるピーク（図２、パネルＢ）（i））と比べてかなり減少している。６）成虫期吸虫E/S生成物中のIgG切断酵素の特性決定既知の方法により得られたマウスモノクローナル抗体IgG2aを、モデル基質として用いた。この抗体を、成虫期F．hepatica E/S生成物またはチオールプロテイナーゼパパインと共にインキュベートした。SDS-PAGE分析は、E/S生成物中のプロテイナーゼがマウスIgGa2重鎖を２つのフラグメントに切断することを示した。これらのフラグメントは、パパインにより産生されたフラグメントと分子サイズが類似していた。従って、成虫期吸虫は、IgGa2をパパイン切断部位に近接して、すなわち抗体重鎖のヒンジ領域内で切断することのできる酵素を分泌する。この吸虫酵素はIgGa2抗体に対して特異的でなく、マウスおよびウサギ全血清からのプロテイン-Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製したIgG2b およびIgG1aをも切断した。また、成熟吸虫E/S生成物をHPLCで分析した。E/S生成物を凍結乾燥により10倍に濃縮し、0.1M燐酸カリウムpH7.0に対して一夜透析した。次いで透析物を、0.45μMメンブランフィルター（Gelman Sciences，Michigan，USA）を通して濾過し、試料100μｇをTSK3000SWカラム（Waters，Milford，USA）上でのモレキュラーシーブHPLCにて処理した。移動相は0.1M燐酸カリウムpH7.0であり、流速は0.3ml/minであり、溶離したタンパク質を、0.05の感度範囲を用いた280nmでの吸光度により監視した。タンパク質の分子量サイズを、次のタンパク質；IgGa 2a（150 kDa）、ウシ血清アルブミン（67 kDa）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（45 kDa）およびリゾチーム（14.3 kDa）でカラムを検定することにより決定した。 HPLCから溶離したGS-PAGEでの分析は、＞150kDa（ピークＩ）、45 kDa（ピークII）および15 kDa（ピークIII）の３つの主タンパク質ピークを生じた（図３ａ参照）。各フラクションの試料をIgG2aモノクローナル抗体と共にインキュベートし、反応生成物をSDS-PAGEで処理した。IgG2a切断酵素は、第３の15 kDaピークと会合した（図３ｂ参照）。また各フラクションを、合成ペプチド基質Z-phe-arg-AMCを用いてカテプシン- Ｌ様活性について試験した。カテプシン-Ｌ様活性は15 kDaピークと会合した。カテプシン-L様活性のための最適PHは、Z-phe-arg-AMCを用いて15kDaプロテアーゼについて決定した（図３ｃ参照）。次いで各ピークからプールしたフラクションについて、GS-PAGE分析を行なった。GS-PAGEを用いて全成虫期吸虫E/S生成物中で検出されたタンパク質分解性バンドは、45 kDaまたは15 kDaピークの何れかに存在しており、どのプロテイナーゼも、＞150 kDaと会合しなかった。45 kDaピークIIのGS-PAGE分析は、これが46 〜27.5 kDaの範囲のいくつかのプロテイナーゼを含有することを示した。これらのプロテイナーゼは、pH 4.5〜8.0の間で最適活性を有するので、DaltonおよびH effernan［Mol．Biochem．Parasitol．35（1989）］により記載されたグループ２に正しく相関した。15 kDaピークは、いくつかのプロテイナーゼからなっており、これらの酵素は60〜90 kDaの範囲にある驚くほど高い見掛け分子サイズを示した。これらのプロテイナーゼは、pH 4.5に活性のための最適PHをするDaltonおよびHeffernan［同上］により記載されたグループ１のチオールプロテイナーゼと相関していた。従って、還元性条件下でのSDS-PAGEにより27 kDa分子量を有することが実証されたカテプシン-L1は、用いられた技術に応じて変型の分子量を示すことは明らかである。こうして、HPLC上では異常に低い分子量が観察されるが、GSーPAGE上では自己消化および凝集が一連のより高い分子量バンドを与えるようである。７）F．hepaticaの種々の時期のE/S生成物中のカテプシンL様活性セロファン上の被嚢（シスト：cyst）を有するF．hepaticaメタセルカリア（P fizer系統）を、パスツールピペットで２%次亜塩素酸ナトリウム中に移し、渦動させ、37℃で30分間インキュベートした。この操作はメタセルカリアの外部シストを除去する。今や透明な内部シストのみを有するメタセルカリアを、立体顕微鏡を用いて自動ピペットでマイクロタイターウェル中に入れ、蒸留水で洗浄した。次いでこれらメタセルカリアを、等容積の0.05 M HCIと、１%重炭酸ナトリウム、0.8%NaC1および0.2%タウロコール酸ナトリウムを含有する溶液とを混合して調製した培地中でインキュベートした。37℃で３時間後に、吸虫の70〜80%が脱嚢され、そして活発に動いていた。脱嚢幼虫を、立体顕微鏡下で20μｌ自動ピペットを用いて内部シストから分離した。屠殺場で得られたウシ肝臓の胆管から、成熟期吸虫を分離した。未成熟寄生虫は、メタセルカリア20匹を感染させた後３週間および５週間の雄性Wisterラットから得た。新たに脱嚢した幼虫（NEJ）、３週令、５週令および成熟期のF．hepaticaを、インビトロで３日間にわたり維持した。次いで、毎日除去される培地を、発蛍光性基質Z-phe-arg-AMCを用いてカテプシンＬ-様活性についてアッセイした。カテプシンL-様活性は、調査した全ての時期からのE/S生成物中に存在していた。カテプシンL-様活性は、NEJ E/S生成物中に日毎に増加し、その分泌が経時的に増加することを示したが、他の全ての時期のE/S生成物中のこのプロテイナーゼの活性は、同じ時間にわたって減少した。各肝吸虫期のE/S生成物中のプロテイナーゼ活性を、３種のアルギニン含有発蛍光性ペプチド基質を用いて比較した。３種の基質は、リソソーム性カテプシン酵素に対するそれらの親和性に基づいて、すなわち、カテプシンL（Z-phe-arg-AMC）、カテプシンＢ（Z-arg-arg-AM C）、およびカテプシンＨ（Z-arg-AMC）を選択した。有意な活性は、Z-phe-arg- AMC基質を用いてのみ検出され、類似の結果は、調査した全ての肝吸虫期について得られた（以下の表２）。８）E/S生成物中の抗体-切断活性 IgGは嬬虫寄生虫に対する抗体−依存細胞性の細胞毒性に関連するので、かつ、成虫期吸虫カテプシン-L1はマウスIgG2aを切断するため（上記参照）、NEJ、３週令、５週令および成虫期の吸虫からのE/S生成物を、抗体切断活性について試験した。F．hepaticaの全ての時期からのE/S生成物は、精製IgGを重鎖のヒンジ領域で切断することができ、これにより抗体結合領域からのFC部分を放出した。カテプシン-L阻害剤Z-phe-ala-CHN₂は50μMの最終濃度で、成虫期およびNEJ吸虫からのE/S生成物のIgG切断活性を完全に阻害した。 DMSOは１%の最終濃度で、IgG切断活性を阻害しなかった。９）好酸球の付着性におけるE/S生成物およびカテプシンL1プロテイナーゼの影響抗体で媒介される好酸球付着がNEJに結合するのを阻害する際のF．hepaticaカテプシンL1の可能な役割を、インビトロアッセイを用いて調査した。 20匹の新たに脱嚢した幼虫期F．hepaticaを、マイクロタイターウェル中のラット好酸球に富んだ懸濁液100μｌ内に分配した。この実験に従って、免役血清またはコントロール血清のいずれかの100μｌアリコ−トを、E/S生成物または精製カテプシンL1と共に、あるいはそれ無しで加えた。いくつかの実験では、システインプロテイナーゼ阻害剤ロイペプチンを５μg/mlの最終濃度で加えた。全ての希釈は、Roswell Park Memorial Institute 1640において４%加熱不活性化ウシ胎児血清を用いて行なった。実験の終了時に、幼虫期吸虫を注意深く顕微鏡スライドに移し、40Xおよび100Xの倍率にて顕微鏡的に調査した。個々の吸虫をを調査し、結合した好酸球の数をカウントした。結合した細胞が20を越えるNEJを陽性と考えた。ラット好酸球に富んだ細胞集団を、免役ラット血清（30個のF．hepaticaメタセルカリアで経口的に感染させた雌性Wisterラットから得られたIRS；感染の５日後に採血し：得られた血清をプールし、アリコートとして必要となるまで−２０℃で貯蔵し；コントロール血清を未感染ラットから集めた）の存在下に NEJに加えた場合、細胞付着性は一貫して高かった（２時間後に＞90%陽性NEJ）図４、パネルＡ；この図の基線に沿った目盛は上記で定義したとおりの陽性NEJ のパーセントを表わし；５本のバーは２時間間隔でのカウント数を表わす）。この細胞付着性は、正常血清の存在下には観察されず（図４、パネルＢ）それ故に、これが抗-NEJ抗体により媒介されると推測されねばならない。最高の細胞結合は、２時間のインキュベート後に記録された。NEJまたは成熟期吸虫E/S生成物を免役血清と一緒に加えると、免役血清単独と比べて、陽性NEJの数が＞70%減少する結果となった（図４、パネルＣおよびＤ）。同様に、精製カテプシンL1は、好酸球の結合を防止した（図４、パネルＥ）。システインプロテイナーゼ阻害剤ロイペプチンを、免役血清と、NEJまたは成熟期吸虫E/S生成物あるいは精製カテプシンL1のいずれかとの存在下に加えた場合、好酸球結合は、免役血清単独を用いて得られた好酸球結合と同様であった（図４、パネルＡ、Ｆ、ＧおよびＨ。それ故に、ロイペプチンはE/S生成物およびカテプシンL1の効果を阻害する。培養中のNEJに加えたロイペプチンは、それらの生存力に影響を及ぼさなかったが（データは示さない）、免役血清の存在下では、好酸球がNEJ表面から失われる速度を僅かに減少させる（図４、パネルＩ）。精製カテプシンL1を、免役血清の添加後２時間のアッセイに加え、これにより好酸球が最初に結合するのを許容した場合、これら結合した好酸球はNEJ表面から急速に脱離した（図４、パネルＪ）パネルＡおよびＥと比較）。１０）ウシの試験 10匹のウシを屋内で飼育した。ウシを５つのグループＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥにそれぞれウシ３匹または４匹で割当て、７日にわたり順化させた。最初の免疫処理は、０日目に行なった。グループＡの動物を陰性コントロールとし、ウマ牌臓フェリチン150μｇを与え、グループＢ、Ｃ、ＤおよびＥには、上記（１）に記載したようにして調製したカテプシンL1をそれぞれ10、200および500μｇを与えた。全ては注射によった。最初の免疫処理はフロイント完全アジュバント（FCA）中でアジュバント処理した。28日後、全ての動物に第二の免疫処理を行ない、また56日目に第三の免疫処理を行なった。これらのワクチン接種はフロイント不完全アジュバント（FIA）中でアジュバント処理した。抗体力価は、この期間をとおして監視した。全ての動物に、その幾匹かの試料中に線虫卵が見出された後、76日目にレバミソール25mlを与えた。 84日目に、ウシの全てのグループに、約500匹の肝吸虫メタセルカリアの外因性チャレンジを、ゼラチンカプセルにより投与ガンから投与した（F．hepatica は英国起源であった）。感染の経過を、血中酵素レベルおよび糞中卵カウント数により監視した。動物グループの概要グループの動物の数ワクチン接種同定Ａ４ 150μg ウマ牌臓フェリチンＢ４ 10μg カテプシン L1 Ｃ４ 50μg カテプシン L1 Ｄ３ 200μg カテプシン L1 Ｅ３ 500μg カテプシン L1 全ての動物は、ELISAにより決定されるように、免疫処理に応答しーチャレンジに続いて全ての動物は、それぞれ肝吸虫によって引き起こされた肝臓実質および胆管ダメージの指標であるグルタミン酸脱水素酵素およびグルタミルガンマトランスフェラーゼの増加した血中レベルを示した。コントロールグループの動物だけが、糞中に卵を示した。１１）カテプシン-L2の精製カテプシンL1について上記したようにして吸虫を洗浄し、培養し、培地を遠心した。E/S生成物500mlを融解し、Amicon 8400濃縮器（Amicon，W1，USA）上で、Amicon YM3メンブラン（3,000 Da m．w．カット−オフ）を用いて10mlの容積に濃縮し、Sephacryl S200HR樹脂（pharmacia，Uppsala，Sweden）を含有する0.1 M Tris-HCI pH7中で４℃にて平衡化したゲル濾過カラムにかけた。カラムを0.1 M Tris-HCI pH7で溶離し、70x5mlのフラクションを集めた。0.1 Mグリシン中でPH7にて発蛍光性基質Tos-Gly-Pro-Arg-AMCを用い、Perkin-Elmer蛍光分光光度計上で370nmの励起波長および440nmの発光フィルターセッティングにてアッセイして、カテプシンL2活性を含有するフラクションをプールした。 Sephacryl S200フラクションを、0.1M Tris-HCI pH 7中で平衡化した50ml QAE Sephadexカラム（2.5cmx10.0cm,Pharmacia,Uppsala,Sweden）にかけた。このQA E Sephadexカラムを、0.1M Tris-HCI pH7の300mlおよび0.1 M Tris-HCI pH7中の 75mM NaC1の150mlで洗浄し、次いで0.1MTris-HCI pH7中の0.4M NaC1で溶離した。各溶離および洗浄工程からの５mlフラクション（合計180フラクション）を集めた。Tos-Gly-Pro-Arg-AMC切断活性を含有することが認められたフラクションをプールした（QAE 400フラクション）。このQAE 400フラクションを、Amicon 8 400濃縮器上でYM3メンブランを用いて20mlに濃縮し、次いで蒸留水で容積100ml に希釈した。次いで希釈QAE 400フラクションを最終容積10mlに濃縮すると、これは約80mMと計算されたNaC1濃度を含有していた。濃縮QAE400フラクションをを 10x1mlのアリコートとして-80℃で保存した。精製カテプシンL2の均質性を、12胎ポリアクリルアミドを含有する変性SDS-PA GEゲルを用いて測定した。精製カテプシンL2は還元性SDS-PAGEゲル上で29.5 kDA の単一バンドとして移行する（図５Ｃ、レーン１は分子量マーカー、レーン２は成虫期吸虫E/S生成物、レーン３は精製カテプシンL2）。 12%PAGEゲルを用い、Dalton and Heffernan，Mol．Biochem．Parasitol．35（ 1989）p．161-166の方法に従い、SDSの存在および非存在の両方で、ザイモグラフィーを行なった。SDS存在下での分析は、酵素が４本のバンドとして移行し、これらバンドが成虫期吸虫E/S生成物全体中にも観察されることを示す（図５Ａ、レーン１は成虫期吸虫E/S生成物、レーン２は精製カテプシンL2）。しかしながら、SDS非存在下でのザイモグラフィーは、精製カテプシンL2が単一のタンパク質分解バンドとして移行することを示す（図５Ｂ）レーンは図５Ａの場合と同じ）。１２）アミノー末端配列分析 E/S生成物のアリコート5.4ml（タンパク質約５mg）を、凍結乾燥により200μl に濃縮した。濃縮試料40μlを、上記のようにして非変性12%SDSーPAGEゲルにかけ、電気泳動した。電気泳動後、ゲルをトランスファー緩衝液（25mM Tris、190mM グリシンおよび10%（v/v）メタノール）中で30分間インキュベートした。PVDF（ problott）膜のストリップ（10cmx4.5cm）を、メタノール中に10秒間浸漬し、次いでトランスファー緩衝液中で５分間平衡化した。分離したタンパク質を、半乾燥エレクトロブロッティング装置（Atto corp.，Tokyo，Japan）を用い製造業者の指示に従って、PVDF膜に移した。この膜を染色および脱色し、空気乾燥し、関心のあるタンパク質バンドを切り取り、Applied Siosystems 477Aタンパク質シーケンサーによりケンブリッジ大学で配列決定した。Ｎ-末端配列は、F．hepaticaカテプシンL1、ニワトリ、ラットおよびヒトの肝臓からのカテプシンL、ウシ牌臓からのカテプシンＳ、T.cruzi（cruzipain）からのカテプシンL-様プロテアーゼおよびS．mansoniからのカテプシンBについて決定されたＮ-末端配列と並べて下記の表３に示されている。カテプシンL1は、カテプシンL2と93%相同性であることが分かる（カテプシンL2中の位置７の一つのアミノ酸、アルギニンが、カテプシンL1中の位置７のプロリンで置換されている）。カテプシンL2は、ニワトリ肝臓カテプシンL、ラット肝臓カテプシンLおよびヒト肝臓カテプシンLとは47 %しか相同性を示さず、ウシ牌臓カテプシンSとは47%相同性であり、T.cruziカテプシンL-様ロテアーゼ（cruzipain）とは40%相同性であり、S．mansoniカテプシンＢとは20胎相同性であるにすぎない。哺乳類カテプシンLに関して存在が知られている２本鎖構造とは対照的に、カテプシンL1およびL2の両者について単一のＮ-末端アミノ酸配列が見出されたことは、１本鎖の配列のみが存在することを意味する。しかしながら、第二のＮ- 末端ブロック鎖が存在することも可能である。１３）反応動力学的研究 F.hepatica カテプシンL1およびL2酵素の反応動力学定数を、次の11種の異なる基質について測定した。Z-Phe-Arg-AMC、Bz-Phe-Val-Arg-AMC、Suc-Leu-Leu-V al-Tyr-AMC、H-Leu-Val-Tyr-AMC、Tos-Gly-Pro-Lys-AMC、Tos-Gly-Pro-Arg-AMC、B oc-Val-Pro-Arg-AMC、Z-Arg-Arg-AMC、Z-Arg-AMC、Suc-Ala-Phe-Lys-AMCおよびB oc-Val-Leu-Lys-AMC。発蛍光性物質１mgをジメチルホルムアミド100μｌに溶解した。このストック溶液を0.1MグリシンPH7.0中に希釈して、所望の基質濃度を得た。基質濃度毎に３個の試料を用い、最終アッセイ容積は1.0mlであった。アリコート１mlには、酵素20μｌおよびジチオトレイトール10mMが含まれていた。試料を、1.7M 酢酸200μｌの添加により反応を停止する前に、37℃で30分間インキュベートした。試料を、放出された７ -アミノメチルークマリンについて上記のようにアッセイした。反応動力学定数ＶmaxおよびＫmは、20μｌのカテプシンL2を20μｌの1.0μM〜0.1μME-64と共に、0.1MグリシンPH7.0の最終容積80μｌ中にて、37℃で30分間インキュベー卜した以外は、Barrett et al（Biochem J．201、p.189-198）の方法に従って、非線形回帰により得られた。20μｌの1/10カテプシンL1を、20μｌの５μM〜0.5μME -64と共に、0.1MグリシンPH7.0の最終容積80μｌにて、37℃で30分間インキュベートした。インキュベートした全ての試料を、発蛍光性基質Z-Phe-Arg-AMCについて上記のようにアッセイした。反応動力学定数の結果を表４に示す。これらデータは、両方の酵素が基質Boc- Val-Leu-Lys-AMCを好み、カテプシンL2がBoc-Val-Leu-Lys-AMCに対する親和性（ Kcat/Km）をカテプシンL1の2.5倍有することを示している。２番目によい基質は Z-Phe-Arg-AMCであり、カテプシンL2はこの基質に対してカテプシンL1よりも２倍高い親和性を有した。カテプシンL2は発蛍光性基質H-Leu-Val-Tyr-AMC、Bz-Ph e-Val-Arg-AMC、Tos-Gly-Pro-Lys-AMC、Tos-Gly-Pro-Arg-AMCおよびBoc-Val-Pro -Arg-AMCを、類似の親和性（Kcat/Km=38〜113 10^-3M^-1.S^-1）で切断する。カテプシンL1はこれらの基質を有意な程度には切断しない（Kcat/Km=0.26〜3.89 10^- ³ M^-1.S^-1）。１４）F.hepaticaカテプシンL DNA配列、他の嬬虫寄生虫におけるカテプシンL遺伝子従来のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて、F.hepatica cDNAを増幅することにより、DNA配列を得た。これらの配列は、これらがコードするアミノ酸と共に図６〜８に示されている。他の嬬虫寄生虫からのゲノムDNAを、サザンブロッティング技術および中緊縮条件を用いて、図６に示す F.hepatica 配列JD CLONECで探査した。イヌ糸条虫（Dirofilaria immitis）およびクロバエ（Lucil ia cuprina）チャンネルにおいてバンドが観察され、それぞれ、強いハイブリッド化および弱いハイブリッド化を示した。図９は、このような１つの実験のラジオオートグラフであり、カラム”Ａ”は λHindマーカーであり、カラムＢ、ＣおよびＤはF.hepatica、LuciliacuprinaおよびDirofilaria immitisからのゲノムDNAであり；カラムＥ）、ＦおよびＧはウシ、ヒツジおよびイヌのゲノムDNAであり；カラムＨは再びλ Hindマーカーである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アンドリュース，スチュアート，ジェイ. 英国ミドルセクスユービー９６エルエスアクスブリッジ，ヘアフィールドブレックスペアロードサウス（番地なし）マリンクロットベテリナリーリミテッド内

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原性物質が、少なくとも部分的に精製された形態におけるカテプシンＬ型酵素活性を有したプロテアーゼ、あるいはその抗原性フラグメントまたはエピトープを、担体および／またはアジュバントと一緒に含む、哺乳動物の蠕虫寄生虫感染を撲滅するのに使用するためのワクチン。２．前記抗原性物質が、ファスキオラ（Fasciola）種または二腔吸虫（Dicrocoe lium ）種から誘導される、請求項１に記載のワクチン。３．前記抗原性物質が、肝蛭（Fasciola hepatica）から誘導される、請求項２に記載のワクチン。４．前記抗原性物質が、還元性条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による27 kDaの分子量を有するカテプシンＬ１である、請求項３に記載のワクチン。５．前記抗原性物質が、還元性条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による29 kDaの分子量を有するカテプシンL2である、請求項３に記載のワクチン。６．前記抗原性物質が、蠕虫外分泌／内分泌性タンパク質の合計の75%〜100% からなる、前記請求項の何れかに記載のワクチン。７．還元性条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による29 kDaの分子量を有するカテプシンL2。８．前記抗原性物質と、１種以上のアジュバントおよび／または担体とを組み合わせることからなる、請求項１に記載のワクチンの製造方法。９．請求項１に記載のワクチンを、蠕虫寄生虫感染の撲滅に有効な量で哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物の蠕虫寄生虫感染を撲滅する方法。１０．前記有効量が、10〜500μｇの範囲にある、請求項９に記載の方法。１１．組み換えDNA技術により製造されたカテプシンＬ型の酵素活性を有するプロテアーゼ、あるいはその酵素前駆体、またはその抗原性フラグメントまたはエピトープ。１２．請求項１１に記載のプロテアーゼ、あるいはその酵素前駆体、またはその抗原性フラグメントまたはエピトープをコードするDNA分子。１３．添付の図６、図７または図８に示すDNA配列を含む、請求項１２に記載のDNA分子。