JPH08502257A - Treatment based on PP14 - Google Patents

Treatment based on PP14

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JPH08502257A
JPH08502257A JP6509255A JP50925594A JPH08502257A JP H08502257 A JPH08502257 A JP H08502257A JP 6509255 A JP6509255 A JP 6509255A JP 50925594 A JP50925594 A JP 50925594A JP H08502257 A JPH08502257 A JP H08502257A
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Abstract

(57)【要約】 生理学的条件下において、ＰＰ１４イソ形またはＰＰ１４イソ形の受容体に特異的に結合する試薬を投与することによって、非ＡＩＤＳ免疫抑制に苦しむ患者を治療する方法。ＰＰ１４遺伝子構造ならびにＰＰ１４遺伝子およびＰＰ１４.２蛋白質の部分的配列の模式図を図面に示す。 (57) Summary A method of treating a patient suffering from non-AIDS immunosuppression by administering, under physiological conditions, a reagent that specifically binds to the PP14 isoform or a receptor for the PP14 isoform. A schematic diagram of PP14 gene structure and partial sequences of PP14 gene and PP14.2 protein is shown in the drawing.

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＰ１４に基づく治療発明の背景 本発明は胎盤蛋白質１４（「ＰＰ１４」）およびそれに対するモノクローナル 抗体と、それらの使用に関する。 ヒト・ＰＰ１４は子宮内膜において妊娠の最初および２番目の３か月間ずっと 発現している２８キロダルトンの蛋白質である。この期間中、これは子宮内膜脱 落膜からの全分泌蛋白質中の５−１０％までを占める（ジュルクネン（Julkunen ）ら、９２、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・オブステトリックス・アンド ・ガイナコロジー（Br．J．Obstet．Gynaecol．）１１４５、１９８５）。ＰＰ １４は同様に妊娠した女性からの血清に顕著なレベルで蓄積する。それに加え、 ＰＰ１４は雄の精液中に高濃度で見いだされるが（１９−５１５mg／1）（ポッ クリー（Pockley）ら、４３、バイオケミカル・ソサイアティー・トランスアク ションズ（Biochem．Soc．Trans．）３１７、１９８９）、雄の生殖管でのＰＰ １４の細胞の源はまだ決定されていない。 ＰＰ１４はβ−ラクトグロブリンと呼ばれる蛋白質のクラスに属し、これはラ クトフェリン（ラド（Rado）ら、６４、ブラッド（Blood）１１０３、１９８４ ）およびレチノイン酸レセプター（パピズ（Papiz）ら、３２４、ネイチャー（N ature）３８３、１９６）を含む。ＰＰ１４のcＤＮＡが子宮内膜からクローン化 され、この子宮内膜のＰＰ１４ｃＤＮＡの分析より、ＰＰ１４をコードする領域 は他のβ−ラクトグロブリンに対し約７０％の相同性があり、それらのゲノムは 大きさと構成において類似していることが示されている（バイセ（Vaisse）ら、 ９、ＤＮＡセル・バイオル（Cell．Biol）４０１、１９９０）。 ＰＰ１４はリンパ球の分裂増殖を阻害することが示されてきた（ボルトン（Bo lton）ら、ランセット（Lancet）５９３、１９８７において）。ヒト・脱落膜組 織の抽出物を、混合したリンパ球の培養（MLC）に添加し、存在するＰＰ１４の 量と観察されたリンパ球の増殖阻害の間に線形の関係が観察された。同じ文献。 さら に、抗-ＰＰ１４モノクローナル抗体をＭＬＣｓに添加すると抗-分裂増殖効果を 阻害し、このことはＰＰ１４と抗-分裂増殖活性との間の機能的な結び付きを示 す。次の研究では末梢血液の単核細胞によるＩＬ−１、ＩＬ−２および可溶性の ＩＬ−２レセプターの合成に対するＰＰ１４の阻害効果に気が付いている（ポッ クリー（Pockley）ら、１６、バイオケミカル・ソサイアティ・トランスアクシ ョンズ（Biochem．Soc．Trans．）７９４、１９８８；ポックリー（Pockley）ら 、７７、クリニカル・アンド・エキスペリメンタル・イムノロジー（Clin．Exp ．Immunol．）２５２、１９８９；ポックリーとボルトン（Pockley & Bolton） 、６９、イムノロジー（Immunology）、２７７、１９９０）。オカモトら［２６ 、アメリカン・ジャーナル・オデ・リプロダクティブ・イムノロジー（Amer．J ．Reprod．Immunol．）１３７、１９９１］は、ＰＰ１４がナチュラルキラー細 胞活性を抑制することを示唆している。 自己免疫疾患、炎症疾患およびアレルギー疾患に苦しむ人々のように、非特異 的免疫抑制を必要とする患者においてＰＰ１４をそのような免疫抑制のために使 用することが提唱されている。［ボルトン（Bolton）ら、米国特許第５，０３９ ，５２１号］。特に、ボルトン（Bolton）らは関節炎、リューマチ関節炎、喘息 、移植組織対宿主の病気、内臓の拒絶、骨関節炎、全身エリトマトーデス、アト ピーアレルギー、多数の硬化症、アレルギー皮膚炎、炎症の腸の病気、乾癬、類 肉腫症、および他の炎症障害を治療するためのＰＰ１４の使用を提唱している。 それに加え、彼等は悪性非ホジキン性リンパ腫、ホジキン病または悪性の組織球 症のごときリンパ球分裂増殖障害の治療を示唆する。示唆は炎症および自己免疫 病の治療、不妊ならびに白血病のごとき新生物性障害の治療についてもなされて いる。最終的に、ＰＰ１４に対するモノクローナル抗体は免疫系の異常、特に後 天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に用いることができるということが述べ られる。発明の要約 出願人はＰＰ１４が雌および雄の生殖管外細胞において発現していることと、 特に、ＰＰ１４をコードするｍＲＮＡとＰＰ１４蛋白質は造血細胞において発現 していることを発見した。具体的には、（赤血球系と巨核球系の系統に沿って分 化するよう化学的に誘導されるごとく、両性の分化能力を有するヒト骨髄性白血 病系統Ｋ５６２は巨核球の系統に沿って分化を引き起こされるので、ＰＰ１４の ｃＤＮＡは検出可能である。 この造血系で発現されたＰＰ１４は２つのポリペプチドのイソ形を有し、これ はＰＰ１４遺伝子の二者択一のスプライシングによって起こる２つのｍＲＮＡの 種によりコードされている。これら２つのポリペプチドのイソ形とそれに対応す るｍＲＮＡは本明細書中において「ＰＰ１４.１」および「ＰＰ１４.２」と呼ば れる。（上記で論じた）雌および雄生殖管中のＰＰ１４についての以前の研究に おいては、ＰＰ１４に対応する１つのＰＰ１４のイソ形しか認識しなかった。 巨核球の系統の細胞、特にその系統における最後の細胞である血小板における ＰＰ１４の予期せぬ発見は、予期せぬ領域でのＰＰ１４の使用を示す。これらの 発見はＰＰ１４の病気生理学的役割の証拠となる。特に、（汎発性血管内凝固の ごとき）凝血異常症を含めた血小板障害における血小板からのＰＰ１４の放出は 、全てのＰＰ１４の付随する望まぬ（免疫抑制的）影響を伴い、そのような障害 に苦しむ患者における一般化された免疫抑制につながる。それゆえ、出願人は血 小板からのＰＰ１４の放出が発病に対し与える影響を引き下げることが重要であ ることを発見した。これは、種々の病気の状態について、増強作用とは反対に、 ＰＰ１４の遮断が、ある臨床状態に対し望ましい治療学上の目的点であることを 示唆する。この目的において、出願人は血小板の望まぬ影響に苦しむ患者を治療 し、およびそのような患者における血小板からのＰＰ１４の放出に関連する阻害 的免疫抑制のためのいくつかの方法を開示する。これらの方法は阻害的ＰＰ１４ の効果に基づく。これは、抗ＰＰ１４抗体、ＰＰ１４活性を阻害するペプチド、 可溶化されたＰＰ１４受容体、および抗ＰＰ１４レセプター抗体、またはそれら の同等物（例えば、その活性な断片であって、標準的な方法で同定可能なもの） の治療学的使用からなるが、それに限定されるものではない。これらの治療学的 薬剤を含む、組成または治療学的処方も開示する。 また、本発明は患者の造血細胞によるＰＰ１４生産を阻害するであろう薬剤の 、血小板誘導免疫抑制に苦しむ患者に投与することをも含む。アンチセンスＰＰ １ ４オリゴヌクレオチド類およびリボザイム類はＰＰ１４の転写および/または翻 訳を妨げるための適切な試薬である。ｍＲＮＡまたは蛋白質レベルにおいてＰＰ １４生産を阻害するためのさらなる試薬を同定する方法は簡単であって、当該分 野に精通した者によって容易になされる。 特に、本発明は白血病に苦しむ患者を治療する方法をその要旨とし、ここに患 者の白血病細胞は巨核球分化能力を有し、免疫抑制活性を有するＰＰ１４ポリペ プチドを生産する。ＰＰ１４の機能を阻害し、ＰＰ１４の生産を引き下げる上記 の方法もこの臨床的セッティングにおいて適用される。 また、本発明は治療学的および診断的適用のための、抗ＰＰ１４.１およびＰ Ｐ１４.２特異的な抗体ならびにＰＰ１４レセプターを生産することもその要旨 とする。造血細胞における２番目のイソ形の発見は、１または双方のイソ形に特 異的なよく特徴付けられた抗ＰＰ１４モノクローナル抗体の産生を可能とする。 抗ＰＰ１４.１特異的および抗ＰＰ１４.２特異的抗体の双方を産生する方法を開 示するが、これは２つのイソ形間のアミノ酸配列の相違の本発明における正確な 決定を使用する。この知識はＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２を区別する結合部お よび内部のアミノ酸配列に対応するペプチドの免疫源の生産と使用を可能とする 。 このようなイソ形特異的な抗ＰＰ１４抗体は、どの患者がＰＰ１４遮断治療か ら利益を受けられるかを決定するため、およびこのような治療への治療学上の応 答をモニターするために、患者血清中においてＰＰ１４のイソ形の検出するのに 有用である。これに加え、ＰＰ１４イソ形は汎発性の血管内凝固のごときある種 の血小板の障害のマーカーとして役立ち、ＰＰ１４イソ形特異的または非特異的 診断分析はこの臨床のセッティングにおいて有用である。妊娠した女性において 、ＰＰ１４イソ形特異的抗体は、造血細胞および子宮内膜細胞由来のＰＰ１４ポ リペプチドを識別する分析を可能とする。 また、本発明はＰＰ１４ポリペプチドとそのレセプターの間の機能的相互作用 を阻害するための、ＰＰ１４レセプターのポリペプチド誘導体（および/または そのようなレセプターに特異的な抗体）の生産および使用も可能とする。容易に 精製されたリガンド：イムノグロブリンＦｃ結合体の使用に基づくもののごとき 公知のリガンドについてのレセプターをクローニングする方法はよく確立されて おり、当該分野に精通した者によって迅速になされる。 それゆえ、それによってＰＰ１４ポリペプチドイソ形のどちらかが引き下げら れ、それによりＰＰ１４誘導免疫抑制を妨げる方法をその要旨とする。ＰＰ１４ 活性のかかる減少は、高いＰＰ１４レベルによって特徴付けられる（ＡＩＤＳ以 外の）病気の状態の治療に有用である。当業者ならば、上で論じた全ての種々の 方法、ならびに（ＰＰ１４ペプチドを阻害するかＰＰ１４の抗イディオタイプ抗 体を阻害するための使用のごとき）他の方法がお互いに模擬物、すなわち、体内 でＰＰ１４の目的機能または生産にいくぶん影響を与えることによるＰＰ誘導免 疫抑制を達成することを認識するであろう。 また、本発明は種々の免疫学的病気を標的とした治療学上の方法もその要旨と する。ＰＰ１４遮断療法の対象である病気であって、免疫抑制の逆を必要とする ものとは異なり、これらの他の免疫学的病気は外因性の免疫抑制剤を必要とする 。本発明によると、ＰＰ１４.２ペプチドのイソ形は、ＰＰ１４.１、または他の 免疫抑制ポリペプチドとは独立して（あるいはそれと共に）用いることができる 、製薬上の使用のための免疫抑制剤を提供する。造血系ＰＰ１４.２ポリペプチ ドを有するＰＰ１４治療製剤は専らＰＰ１４.１ポリペプチドからなるＰＰ１４ 治療製剤よりも、（血中および他の組織の液体中における安定性）および上記の ボルトン（Bolton）により記載された病気のための治療学的効果の双方に関して 、より優れた利点がある。それゆえ、ＰＰ１４ポリペプチドは免疫系の中のサイ トカイン・サーキットを標的とするインターロイキン−１：インターロイキン− １レセプター相互作用を阻害するための可溶性のインターロイキン−１レセプタ ーについて予言されたもののごとき公知の治療学的方法において、急性炎症疾患 を治療するために用いることができる。ＰＰ１４.２はナチュラルキラー細胞の 機能を抑制するためにも用いられる。 また、本発明は、免疫抑制活性を有するＰＰ１４の源としての造血細胞の使用 をその要旨とし、これはＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチドの双方を同 時に単離する可能性を提供する。さらに、造血細胞は、他の細胞と同様、望むＰ Ｐ１４イソ形を適当に加工し分泌するであろう組換えＰＰ１４.１およびＰＰ１ ４.２ポリペプチドを生産するために、細胞トランスフェクションの標的として 用いることができる。これらのポリペプチドの完全なバージョン、ならびに望む 生物学的活性を有するこれらのポリペプチドのポリペプチド誘導体は、容易に作 成できる。好ましい組成物はグリコホスファチジルイノシトール （glycophosphatidylinositol）（ＧＰＩ）部分と連結するＰＰ１４ポリヌクレ オチド配列を含む。この膜に固定されたＰＰ１４の変種は細胞表面で発現され、 ＧＰＩ膜アンカーにより優先的に表面から切り離され得る。 また、本発明はＰＰ１４.１：ＰＰ１４.２ヘテロダイマーおよびＰＰ１４.２ ホモダイマーの生産に関する。ＰＰ１４.２ポリペプチドからなるダイマーはＰ Ｐ１４.１：ＰＰ１４.２ホモダイマーよりも安定であり、より最適な治療学的お よび診断的試薬を供給する。標準的な共トランスフェクション法をヘテロダイマ ーを生産するために効果的に用いることができる。 それゆえ、第一の態様において、本発明は、生理学的状態にて、ＰＰ１４の少 なくともひとつのイソ形またはＰＰ１４イソ形のレセプターに特異的に結合する 試薬を当該患者に投与し、それにより、ＰＰ１４がそのレセプターに結合するの を妨げるかまたは減少させることにより、非ＡＩＤＳ免疫抑制状態に苦しむ患者 を、治療する方法をその要旨とする。 「非ＡＩＤＳ免疫抑制」とは、高レベルのＰＰ１４イソ形によって引き起こさ れる（または不利に影響されるまたはそれに関連する）状態を意味する。該試薬 の供給は、当該試薬がＰＰ１４イソ形（類）、またはそのレセプターに結合する ことを可能とし、それゆえＰＰ１４活性を中和する。そのような状態の例は汎発 性血管内凝固のごとき血小板の障害、血小板の注入に次ぐ血小板誘導の免疫抑制 、および血小板増多症、ならびに白血病を含む。 好ましい具体例において、試薬は、ＰＰ１４.１特異的抗体；ＰＰ１４.２に特 異的な抗体（モノクローナルまたはポリクローナルであって、ヒト化したマウス または非霊長動物の抗体であってよい）、およびＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ に特異的な抗体、ＰＰ１４イソ形に対するレセプター、ＰＰ１４イソ形に対する レセプターの一部、ＰＰ１４レセプターに対する抗体、ＰＰ１４イソ形のポリペ プチド部分、またはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＰ１４レセプタ ーへＰＰ１４が結合するのを競合的に阻害する他の試薬、例えば、ＰＰ１４レセ プター抗体または抗イディオタイプの抗体からなる群より選択される化合物を含 み、それらからなり、または実質的にそれらからなる。かかる抗体はヒト化され ていてよく、つまり、その骨組みはヒト抗体および他の生物、例えば、マウスま たは非ヒト霊長類からの相補的決定領域に由来してよい。試薬は好ましくはＰＰ １４およびそのレセプターの結合を競合的に阻害する。 一例において、ＰＰ１４のポリペプチド部分はＰＰ１４.１のアミノ酸３３か ら５４により定義されるポリペプチド部分（つまり、ＰＰ１４.１に対し特異的 であるがＰＰ１４.２には特異的でない）を含む；試薬は（ａ）ＰＰ１４に対す る細胞レセプターに結合する（が活性化しない）ことにつきＰＰ１４と競合する ＰＰ１４の抗イディオタイプ抗体模似物；（ｂ）レセプターの生のトランスメン ブランおよび細胞質のドメインがない、ＰＰ１４レセプターの細胞外ドメインを 有する、ＰＰ１４レセプターに対する可溶体ポリペプチド誘導体；または（ｃ） ＰＰ１４レセプターの可溶性ポリペプチド誘導体：イムノグロブリンＦｃ（また は他の有用な標的となるポリペプチド）キメラポリペプチドであってよい。 第二の態様において、本発明は、アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド プローブを用いて、ＰＰ１４レセプターのアミノ酸配列を決定し、および該レセ プタークローンについてのライブラリーをスクリーニングすることによってＰＰ １４レセプターをクローニングする方法をその要旨とする。 好ましい具体例において、該方法はイムノグロブリンのＦｃ領域の配列（また はその同等物）に連結したＰＰ１４ポリペプチドを有するキメラポリペプチドを 供給し；ＰＰ１４レセプターに結合したキメラポリペプチドの複合体を形成する のに適した条件下でＰＰ１４レセプターを発現する細胞からの細胞抽出物と該キ メラポリペプチドとを接触させ：不溶性のマトリックスに連結したプロテインＡ またはプロテインＧ（またはそれの同等物）と該複合体とを接触させることによ っ て複合体を沈澱させ；該マトリックスからＰＰ１４レセプターを回収し；次いで ＰＰ１４レセプターのアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用 いてＰＰ１４レセプターｃＤＮＡについてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ ングすることを含むＰＰ１４レセプターに対応する相補的ＤＮＡをクローニング する方法である。 第三の態様において、本発明は、ＰＰ１４ポリペプチドに対するレセプターの 一部で宿主を免疫することによってＰＰ１４ポリペプチドに対するレセプターに ついての特異性を有する抗体を生産する方法をその要旨とする。 第四の態様において、本発明は、ＰＰ１４遺伝子の転写および/またはＰＰ１ ４転写物の翻訳を阻害する試薬を患者に投与することによって該患者において免 疫抑制を阻害する方法をその要旨とする。 好ましい具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リホザイム、ま たはトリプレックスを形成する核酸がＰＰ１４ポリペプチドの転写および/また は翻訳を阻害するために用いられる。 第五の態様において、本発明はレポーター遺伝子のイソ形プロモーター駆動転 写を阻害するその能力により選択された化合物をスクリーニングすることによっ て、ＰＰ１４の転写を阻害する試薬を同定する方法をその要旨とする。 第六の態様において、本発明は、患者からの試料とＰＰ１４.１および/または ＰＰ１４.２に特異性を有する抗体または他の試薬とを接触させ、障害を持たな い正常な患者で観察される反応の量と比較して試料と抗体との反応の量を決定す ることによって血小板の障害を有する患者を同定する方法をその要旨とする。 第七の態様において、本発明は、ＰＰ１４.１のアミノ酸３３ないし５４によ って定義されるポリペプチドの抗原部分を有するポリペプチドで宿主を免疫する ことによってＰＰ１４.１特異的な抗体を調製する方法をその要旨とする。 関連する態様において、本発明は、ＰＰ１４.２のアミノ酸３２−３３の結合 部分と重なるアミノ酸配列を有するポリペプチドで宿主を免疫することによって ＰＰ１４.２特異的抗体を調製する方法；医薬上許容される緩衝液中の、ＰＰ１ ４.１またはＰＰ１４.２に特異的な抗体を含む医薬組成物または他の組成物；医 薬上許容される緩衝液中の、生のＰＰ１４ポリペプチドがそのレセプターに結合 するのを競争的に阻害するＰＰ１４ポリペプチドの一部を含む医薬組成物または 他の組成物；ＰＰ１４についての細胞レセプターへの結合で競合するが、それを 活性化はしないＰＰ１４の抗イディオタイプ抗体模擬物を含む医薬組成物または 他の組成物；レセプターの生のトランスメンブランおよび細胞質のドメインがな い、ＰＰ１４レセプターの細胞外ドメインを有するＰＰ１４についてのレセプタ ーの可溶性ポリペプチド誘導体を含む医薬組成物または他の組成物；およびイム ノグロブリンＨ鎖のＦｃドメインに連結したＰＰ１４レセプターの細胞外ドメイ ンのＰＰ１４結合部分を含む医薬組成物または他の組成物をその要旨とする。 「医薬上の」とは、ヒトまたは他の動物への投与に適した緩衝液中の少なくと も示した化合物をその活性な試薬として含む組成物を意味する。この用語はその 技術を認識しているように用いられ、当該分野で公知の標準的な試薬類を含む。 もう一つの関連する態様において、本発明は、ＰＰ１４.２ポリペプチドを患 者に投与することによって免疫抑制を必要とする患者を治療する方法をその要旨 とする。 好ましい具体例において、該患者は自己免疫病、慢性関節リウマチ、アレルギ ー性障害、移植拒絶、または移植組織対宿主の病気に苦しむものである。 もう一つの具体例において、本発明は、造血細胞、例えば、フォルボールミリ ステートアセテート誘導細胞、または血小板からＰＰ１４を単離することによっ てＰＰ１４ポリペプチドを調製する方法をその要旨とし；本発明は、得られた精 製ＰＰ１４ポリペプチドＰＰ１４.１またはＰＰ１４.２をその要旨とする。 関連する態様において、本発明は、ＰＰ１４.２をコードする配列の部分に転 写的に結合したプロモーターを有する転写カセットを導入することによって、Ｐ Ｐ１４.２のポリペプチドを調製する方法；ＰＰ１４.２をコードする配列の部分 に転写的に結合した真核もしくは原核生物のプロモーターを有する転写カセット を有する組成物；グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部位または その同等な細胞表面結合部分に連結したＰＰ１４ポリペプチドのＰＰ１４レセプ ター結合部分を含む組成物をその要旨とする。 さらにもう一つの関連する態様において、本発明は、細胞表面のシグナル配列 に結合したＰＰ１４ポリペプチドを発現するために、細胞標的化シグナル配列（ 例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ））に結合したＰＰ１ ４ポリペプチドの部分をコードする核酸を包含する転写カセットによって細胞を トランスフェクトし；次いで切断試薬でシグナル配列を切断し、それによって培 地中にＰＰ１４ポリペプチドを放出し、続いて回収することによってＰＰ１４ポ リペプチドを生産する方法をその要旨とする。 また、本発明は、特異的結合対（例えば、ビオチン結合ドメインを持つステレ プトアビジンとアビジン）のメンバーの部分に結合したＰＰ１４レセプター結合 ポリペプチドの部分を有する組成物；および精製されたまたは組み換えたＰＰ１ ４レセプター、ＰＰ１４レセプター抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびにそれ をコードする精製された核酸；また細胞表面においてＧＰＩ部位に結合したＰＰ １４ポリペプチドを発現するために、グリコシルホスファチジルイノシトール（ ＧＰＩ）シグナル配列のごとき細胞表面に存在する特異的シグナル配列に結合し たＰＰ１４ポリペプチドの部分をコードする核酸を含む転写カセットを有する細 胞もその要旨とする。 「精製する」とは、組成物が天然に生じるものとは、有効成分が、天然ではそ れと一緒にある１つまたは他の化合物と比較して高純度である点で異なることを 意味する。「組換え」とは、遺伝子工学的方法により生産されたこと、例えば、 それがクローン化された遺伝子またはその同等物から発現されたことを意味する 。 また、本発明は、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチド鎖のヘテロマル チマーまたはＰＰ１４.２ポリペプチド鎖のホモマルチマーを含む組成物、なら びにＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２転写カセットを細胞に共トランスフェクトす ることによってかかるヘテロマルチマーを生産する方法をその要旨とする。 他の態様において、本発明は、ナチュラルキラー細胞活性を、このような細胞 をＰＰ１４.２ポリヌクレオチドと接触させることによって抑制する方法；例え ば、ＧＰＩまたはその同等物のごときポリペプチド部分を共有結合させることに よって、細胞表面（例えば、抗原提示細胞）を標的とするように修飾されたＰＰ １４ポリペプチド；およびかかる標的化ＰＰ１４ポリペプチドを使用することに よって抗原提示細胞をコートする方法をその要旨とする。特に、ＰＰ１４-ＧＰ Ｉキメラポリペプチドは、抗原提示細胞の表面を標的とするか、またはＰＰ１４ −ストレプトアビジンポリペプチドはビオチンでコートされた細胞を標的とする であろう。このような細胞は、本明細書中で議論されたように、ＰＰ１４への結 合の検出に基づく治療学的または診断的な方法において有用である。 本発明の他の特徴および利点は以下の本発明の記述および好ましい具体例、な らびに請求の範囲から明らかであろう。好ましい具体例の記述 まず、図面を簡単に説明する。 図面 図１はＰＰ１４ｍＲＮＡ発現が巨核球の系統に沿って分化する白血病細胞にお いて誘導−および系統−特異的であることを示すＲＮＡトランスファーブロット である。誘導されていないまたは誘導されたＫ５６２、ＨＬ−６０、Ｕ９３７お よびＰＬＢ−９８５系統からの全ＲＮＡは、精製されたＰＰ１４プローブによっ てプローブした。Ｋ５６２細胞はＰＭＡ（１０ｎｍ）で０、２４、４８および７ ２時間巨核球の系統に沿って、またはヘマリン（５０μＭ）によって０、２４、 ４８、および７２時間赤血球系列に沿って誘導された。ＨＬ−６０細胞はＰＭＡ （１０ｎｍ）で０または４８時間マクロファージ系列に沿って、またはＤＭＳＯ （２％）で０または４８時間好中球の系列に沿って誘導された。Ｕ９３７細胞は ＰＭＡ（１０ｎｍ）により０または４８時間マクロファージ系列に沿って誘導さ れ、またＰＬＢ−９８５もまたＰＭＡ（１０ｎｍ）により０または４８時間、マ クロファージ系列に沿って誘導された。３日間抗ＣＤ３抗体により剌激された末 梢血液の単核細胞（ＰＢＬ）は陰性の対象として供した。ＰＰ１４ｍＲＮＡに対 応する該約８００ｂｐのバンドは矢印の頭によって示す。 図２はＰＭＡ誘導後のＰＰ１４発現の反応を示し、インデューサー処理後６時 間においてＰＰ１４ｍＲＮＡが検出可能であることを示している。ＰＭＡ（１０ ｎｍ）により０、０.５、１、２、３、６、１２または２４時間誘導されたＫ５ ６２細胞からの全ＲＮＡを単離し、精製全プローブにハイブリダイズさせた。 図３はＰＭＡ誘導のＫ５６２培養培地からのＰＰ１４免疫沈澱物を示すオート ラジオグラムのコピーである。Ｋ５６２細胞は35Ｓ−システインおよび35Ｓ-メ チオニンを添加したシステインおよびメチオニンを含まない培地で２４時間また は４８時間培養することによりラベルした。細胞を除去し、上清をプロテインＦ および抗-ＰＰ１４ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（Ａｂ）で免疫沈 降した。結合した産生物を１２％ＰＡＧＥ-ＳＤＳゲル上、還元条件下で泳動さ せた。ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２の期待された移動度が認められた。また、 長い暴露により、２４時間のうちに、２８ｋＤのバンド（ＰＰ１４.１を表す） は目に見えるようになる。 図４はアロ抗原に剌激された分裂増殖に際しＰＭＡにより誘導されるＫ５６２ 条件培地の潜在的阻害効果は抗ＰＰ１４抗体により中和できることを示している 、二方向混合リンパ球の培養である。Ｋ５６２細胞はＰＰ１４発現を誘導するた めにＰＭＡ（１０ｎｍ）で２４または４８時間誘導した。条件培地はウサギ・ポ リクローナル抗ＰＰ１４血清（１：１００希釈）有りまたは無しで、５０％v/v の割合で混合リンパ球培養（ＭＬＣ）に添加した。ＭＬＣは、５、６、または７ 日目に収穫し、取りこまれた3Ｈ-チミジンのｃｐｍを計数した。値は三連の培養 の平均値を表し、実験を２回繰り返し、同様な結果が得られた。正常なウサギの 血清または抗ＴＧＦＡｂについては、条件培地による観察された阻害に対して効 果は認められなかった（データは示さず）。 図５ａ−５ｃは、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ｍＲＮＡを模式的に示し、二 者間のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相違を強調する。図５ａ：ＰＰ１４遺 伝子のイントロン−１に沿ったエキソン−１およびエキソン−２を図式化し、エ キソン−２の２つの半分は異なるシェーディングを施されている；エキソン−２ の上流の部分は別のスプライシングによってＰＰ１４.２ｍＲＮＡから除去され る。ダッシュ線はかかる別のスプライシングにより欠失された配列のストレッチ を示す。図５ｂ：別のスプライシング事象に関与するＰＰ遺伝子の部分のヌクレ オチド配列を示す。共通のスプライスドナー（ＳＤ）部位および２つの別のスプ ライスアクセプター（ＳＡ）部位は矢印により強調し、スプライス部位のジヌク レオチドは四角で囲む。図５ｃ：ＰＰ１４.２ポリペプチドにおいて欠失されて いるＰＰ１４.１の部分のアミノ酸配列は四角で囲む。数字はＰＰ１４.１アミノ 酸配列のナンバリングに基づく欠失の境界を示す。 図６は、巨核球の系統のＰＭＡ誘導Ｋ５６２細胞および胎盤細胞におけるＰＰ １４.１およびＰＰ１４.２ｍＲＮＡ種を区別できるＰＰ１４特異的プライマーを 用いた逆転写酵素-ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）分析である。ＰＰ１４. ２ｍＲＮＡはＫ５６２細胞にのみ有意な量で存在し、１８、２８、３６および３ ７週令の胎盤から採取した胎盤細胞には存在しない。分子量の数字は右側に含め た。 図７は、ＰＰ１４特異的プライマーを用いるＲＴ-ＰＣＲ分析であり、ＰＰ１ ４発現が造血および生殖系の組織に限定されており、また、ＰＰ１４．１および ＰＰ１４.２の両イソ形が造血細胞、ＰＰ１４.１イソ形において有意に、かつ見 掛け上等モルのレベルにて発現されることが示される。ＰＰ１４用の３’-末端 特異的プライマーを用いて合計２.５μｇのＲＮＡを逆転写させた。得られた産 生物をＰＰ１４用の５’−末端特異的プライマーと共にＰＣＲ反応に直接用いた 。レーン１：非誘導Ｋ５６２細胞。レーン２および３：各々、２４および４８時 間におけるＰＭＡ誘導Ｋ５６２細胞。レーン４：脳。レーン５：脾臓。レーン６ ：小腸。レーン７：肝臓。レーン８：腎臓。レーン９：脳の髄膜。レーン１０： ＫＭ−１０２骨髄繊維芽細胞基質細胞。レーン１１：１８週の胎盤。レーン１２ ：出産予定時期の胎盤。レーン１３：繊維芽細胞。レーン１４：プライマー単独 。レーンＭ：分子量マーカー。矢印は分子量マーカーと同様ＰＰ１４.１および ＰＰ１４.２の相対的部分を示す。血小板由来ＰＰ１４イソ形およびダイマー 元来そこから由来するものと考えられた胎盤に因んで命名された胎盤蛋白質１ ４（ＰＰ１４）は、後になって、関連する子宮内膜組織に由来することが示され た（バイセ（Vaisse）ら、９ ディ・エヌ・エイ・セリュラー・バイオロジー（ DNA Cell．Biol．）４０１，１９９０）。引き続いての研究により、ＰＰ１４ は妊婦の子宮内膜脱落膜および血清のみならず男性の精液にも存在することが示 された。出願人は、ＰＰ１４は生殖管外細胞でも産生されることを発見した。Ｐ Ｐ１４ ｍＲＮＡおよび蛋白質は、巨核球系統に沿って分化するように誘導され るヒト白血病細胞系のみならず、その系統の最終細胞、すなわち、血小板にも存 在が突き止められている。ＰＰ１４ ｍＲＮＡのクローニングおよびハイブリダ イゼーション分析、ならびにＰＰ１４蛋白質の免疫沈降分析により、さらに、子 宮内膜ＰＰ１４は単一の優性種からなる一方、（ＰＭＡ-誘導Ｋ５６２で検出さ れる）造血系ＰＰ１４は２つの共優性種からなることが確立されている。ＰＰ１ ４ ｍＲＮＡ種の１つは、子宮内膜ＰＰ１４ ｍＲＮＡと共に移動する一方、第 ２のものはより短い。後者は、コードされた蛋白質における２２個のアミノ酸欠 失を生じることが予測される内部欠失を含む。これらの２つのｍＲＮＡ種および そのコードされた蛋白質産物の考慮を簡単にするために、未欠失および欠失変異 体（各々、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２と命名）を与える。 ＰＰ１４.２の欠失が終了するエクソン−２内の部位における適当なスプライ ス・アクセプター・コンセンサス配列の同定は、この変異体がＰＰ１４遺伝子の 別のスプライシングにより生起することを示す。 ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチド、ならびにその対応するｍＲＮＡ は、ＰＭＡ-誘導Ｋ５６２細胞において等モル量で生じるという観察は、巨核球 系統の細胞の場合、２者はヘテロダイマーを形成するという考えと一致する。従 前の研究は、ＰＰ１４.１からなる子宮内膜ＰＰ１４は、抗体によって容易に解 離される弱いホモダイマーよりなることを示唆している。巨核球系統の細胞の免 疫沈降におけるＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２の様子は、２者が、ＰＰ１４.１ ：ＰＰ１４.１ホモダイマーにおけるごとく、抗体によって解離されない比較的 安定なヘテロダイマーを形成すること、またはモノクローナル抗体が２つのイソ 形と交差反応することを示唆する。ＰＰ１４.１はモノマーとしては機能せず、 かつＰＰ１４.１ホモダイマーは容易に解離するので、本発明で開示するごとく 、ＰＰ１４.１：ＰＰ１４.２ヘテロダイマーは、免疫治療の適用で使用するのに より安定なホモダイマーの代替物を提供する。さらに、データは、ＰＰ１４.１ ホ モダイマーよりも高い安定性をも有し得るＰＰ１４.２ホモダイマーの存在を排 除する。 （アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American type culturec ollection）から入手可能な）Ｋ５６２ヒト骨髄性白血病細胞は、フォルボール １２-ミリステート１３-アセテート（ＰＭＡ）によって巨核球系統に沿って分化 するように誘導でき、巨核球細胞系において分子流出をアドレスするモデル細胞 系を提供する。同等の細胞系が当該分野で公知の方法によって単離できる。かか る細胞によって発現されることが知られている巨核球マーカーは、血小板糖蛋白 質ＩＩＩａ（ｇｐＩＩＩａ）、血小板由来成長因子（ＰＤＥＦ）αおよびβ鎖、 および形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）（アリタロ（Alitalo）、１４ リュー ケミア・リサーチ（Leukemia Res．）５０１、１９９０）を誘導する。巨核球系 統に沿ったＫ５６２分化に伴うｍＲＮＡ発現プロフィールにおける変化を検討し 、巨核球分化および血小板に関連した新規な遺伝子をクローン・同定するために 、Ｋ５６２細胞系のＰＭＡ誘導後に分化時に発現されるｍＲＮＡをクローンする ために、分化ｃＤＮＡスクリーニングを適用した。実施例１：骨髄性細胞分化 ヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２（ＡＴＣＣ２４３）を、１０％熱不活化胎児 子ウシ血清（ＦＣＡ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.２、４０μｇ/ｍｌゲン タマイシン、および２ｍＭグルタミンを補足したＲＰＭＩ培地（ウィッタカー・ バイオブロダクツ（Whittaker Bioproducts））中に維持した。細胞は５％ＣＯ2 にて、３７℃で増殖させた。分化を引き起こすのに用いたフォルボールエステル はフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、シグマ（Sigma ））であり、これはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に希釈し、使用するまで １ｍＭ−３ｍＭにて−２０℃で保存した。ＰＭＡの最終濃度は１００ｎＭおよび １０ｎＭの間の範囲であった。Ｋ５６２分化に対するＰＭＡの効果を測定するた めに、Ｋ５６２細胞を組織培養フラスコ中、２×１０5細胞/ｍｌで培養した。Ｐ ＭＡをフラスコに直接添加し、細胞を添加後２４、４８または７２時間に収穫し た。実施例２：ＰＰ１４遺伝子のクローニング 別々に２４、４８および７２時間ＰＭＡで誘導した３群のＫ５６２細胞のプー ルからファージｃＤＮＡライブラリーを構築した。かかるプールは、確率的Ｋ５ ６２分化プログラムを通じて活性化された異なる遺伝子を見い出すチャンスを最 大化するように選択した。「誘導した」Ｋ５６２ｃＤＮＡライブラリーの複製リ フトを、減算した（誘導マイナス非誘導Ｋ５６２）、および非減算の（非誘導Ｋ ５６２）一本鎖プローブで区別的にスクリーニングした。 標準的なイソチオシアン酸グアニジニウム/塩化セリウム法を用いて全ＲＮＡ を細胞から単離した。オリゴ（ｄＴ）セルロースを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを 単離した。ＰＭＡ（１００ｎＭ）で２４、４８および７２時間（合計４．５μｇ ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリ ーは、製造業者の推奨（ストラタジーン（Stratagene）、ラ・ジョラ（La Jolla ）、カリフォルニア州）に従い、Uni-ZAP XRクローニングキットを用いて構築し た。 誘導したＫ５６２ ｃＤＮＡライブラリーを区別的にスクリーニングするため に、６００００の個々の初代クローンを用いてＰＬＫ-Ｆ’菌（ストラタジーン （Stratagene））を感染させた。ストラタジーン（Stratagene））Duralon U.V. 膜を用いて複製膜リフトを採取した。該膜を１.５Ｍ ＮａＣｌ-０.５ＭＮａＯ Ｈ中で４分間インキュベートすることによって変性し、１.５ＭＮａＣｌ-０.５ Ｍトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）の溶液中で５分間中和し、最終的に、０.２Ｍト リス-Ｃｌ（ｐＨ７.２）-２×ＤＤＣ（１×ＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ-１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）中ですすいだ。 ＵＶStratalinker1800（ストラタジーン（Stratagene））を用いて該ＤＮＡをＵ Ｖ架橋し、フィルターを乾燥した。 初代スクリーンのための膜を、非処理Ｋ５６２細胞（非誘導）からの非減算一 本鎖ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、ＰＭＡ処理Ｋ５６２細胞（誘導） からの減算一本鎖ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた複製リフトと比較し た。二次および三次スクリーンを非処理Ｋ５６２細胞からの一本鎖ｃＤＮＡプロ ーブとハイブリダイズさせ、ＰＭＡ−処理Ｋ５６２細胞からの非減算一本鎖ｃＤ ＮＡプローブとハイブリダイズさせた複製リフトと比較した。非誘導ｃＤＮＡプ ローブおよび非減算誘導ｃＤＮＡプローブを生成させるために、各々、非処理Ｋ ５６２細胞からの、またはＰＭＡ−処理Ｋ５６２細胞からの１μｇポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを、１００μＣｉ｛α−32Ｐ｝ｄＣＴＰ（アメルシャム（Amersham）、ア ーリントン・ハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）、１０ＵSuperscript 逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labs） 、ガイセルスブルグ、マディソン州）、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、 ７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2および０.１ｍＭ ＤＴＴと共に０.１ｍ Ｍオリゴ（ｄＴ）12-18プライマー、０.５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ Ｐを含有する緩衝液中、３７℃で１時間逆転写した。最後の１５分間、非標識ｄ ＣＴＰを０.５ｍＭまで添加した。このＲＴ反応の後、ＲＮＡを６５℃で３０分 間、１００ｍＭ ＮａＯＨ中で加水分解し、一本鎖ｃＤＮＡをBio-Spin３０カラ ム（バイオ−ラド（Bio-Rad）、リッチモンド、カリフォルニア州）に通して遊 離ヌクレオチドを除去した。 減算誘導ｃＤＮＡプローブを生成させるため、２４、４８および７２時間ＰＭ Ａで処理した０Ｋ５６２細胞からの０.３３μｇポリ（Ａ）＋ＲＮＡをプールし （合計してポリ（Ａ）＋ＲＮＡの１.０μｇ）し、２５０μＣｉ｛α−32Ｐ｝ｄ ＣＴＰを用いることを除き、前記したごとくに逆転写した。ＲＮＡ加水分解およ びｃＤＮＡ沈殿に続き、非処理Ｋ５６２細胞からの３０倍過剰の光ビオチン化ポ リ（Ａ）＋ＲＮＡでアニールし、製造業者の指示（インビトローゲン（Invitrog en）、サンジエゴ、カリフォルニア州）に従って減算した。 ５０％脱イオン化ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ ０％デキストラン硫酸塩（ＭＷ３０００００）、１Ｍ ＮａＣｌ、および変性剪 断処理サケ精子ＤＮＡ（シグマ（Sigma））の１５０μｇ/ｍｌ中、４２℃で一晩 膜をプレハイブリダイズした。一本鎖ｃＤＮＡプローブを添加し、回転するオー ブン（ヒバイド（Hybaid）、ミドルセックス（Middlesex）、英国）中、４２℃ で４８時間インキュベートした。リフトを、２２℃で１０分間、２×ＳＳＣ、１ ％ＳＤＳ中で２回洗浄し、次いで、６５℃で３０分間、０.１×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ中で３回洗浄した。−７０℃にて、必要に応じて増感スクリーンを用い、 膜 をコダックＡＲフィルムに暴露した。 ほぼ６万のｃＤＮＡクローンを分析し、第１ラウンドのスクリーニングの後、 １２７の推定陽性を選択した。クローンのすべてをランダムに分析し、配列決定 し、引き続いてGenbank配列データベース（ペアソン（Pearson）ら、８５、プロ シーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc． Natl．Acad．Sci．）ＵＳＡ２４４４、９８８）との比較の後、１２７のｃＤＮ Ａクローンのうち２つはＰＰ１４であると同定された。実施例３：ＰＰ１４ｍＲＮＡ発現 Ｋ５６２におけるＰＰ１４ｍＲＮＡ発現の証明および、そのＰＭＡ誘導性の確 認は、ＲＮＡトランスファーブロット分析によって達成された（図１および２参 照）。 全ＲＮＡ（１０μｇ）を前記したごとくに単離し、５０％ホルムアミド、６％ ホルムアルデヒド、１×ＥＰＰＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン −Ｎ’−３−プロパンスルホン酸）緩衝液（１×ＥＰＰＳ緩衝液：２０ｍＭ Ｅ ＰＰＳ（ｐＨ８.２）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）、２ｍＭ ＥＤＴ Ａ）中で６５℃まで１５分間加熱し、１×ＥＰＰＳ緩衝液および６％ホルムアル デヒドを含有する１.２％アガロースゲルで分離した。ＲＮＡは受動的にDuralon ＵＶ膜（ストラタジーン（Stratagene））に移行し、ＵＶ架橋された。プローブ は、精製したＰＰ１４ ＤＮＡ２０ｎｇをランダム起点とすることによって生成 させた。１００℃まで１０分間加熱することによってＤＮＡを変性し、次いで、 ランダムなヘキサヌクレオチド（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannh eim）、インディアナポリス、イリノイ州）を含有する緩衝液中の５０μＣｉ｛3 2 Ｐ｝ｄＣＴＰ（アメルシャム（Amersham））、０.２ｍＭの各ｄＧＴＰ、ｄＴＴ Ｐ、ｄＡＴＰおよび１０Ｕのクレノウ酵素中、３７℃で３０分間インキュベート した。プローブを４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜を洗浄し、前記したご とくに暴露させた。 特に、非誘導Ｋ５６２細胞からの、０.５、１、２、３、６、１２および２４ 時間ＰＭＡ（１０ｎＭ）で誘導した誘導Ｋ５６２細胞からの細胞ＲＮＡを標識Ｐ Ｐ １４ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＰＰ１４ｍＲＮＡは非誘導Ｋ５ ６２細胞では検出できず、ＰＭＡ処理から６時間内に明確となった（図１）。Ｐ Ｐ１４ｍＲＮＡは２４時間でプラトーレベルに達し、少なくとも７２時間までは 比較的一定のままであった（図１および２）。ほぼ０.８キロベース長に対応す る単一のブロードなＰＰ１４ｍＲＮＡバンドがすべての場合に観察され、子宮内 膜ＰＰ１４ｍＲＮＡについて報告されているサイズと一致した。実施例４：ＰＰ１４の細胞特異性 ＰＰ１４誘導事象が細胞、系統、および/またはインデューサー特異的である かを決定するために、いくつかの白血病系を別々の化学的インデューサーで誘導 した（図２）。巨核球系統に沿ったＫ５６２のＰＭＡ誘導は高レベルのＰＰ１４ ｍＲＮＡ蓄積に関連している一方、赤血球系統（アンダーソン（Anderson）ら、 ２７８ネイチャー（Nature）３６４、１９７９）に沿ったＫ５６２細胞のヘミン （５０μＭ）誘導は、同様のＰＰ１４活性化を示さなかった。もう１つの両能性 白血病系であるＨＬ−６０をＰＰ１４誘導性についてテストした。骨髄−単球系 統（ロベラ（Rovera）ら、７６、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ デミー・オブ・サイエンシズ（Proc．Natl．Acad．Sci．）ＵＳＡ ２７７９、 １９７９）に沿っで分化するＰＭＡ誘導ＨＬ−６０細胞、または好中球系統に沿 って分化するＤＭＳＯ処理ＨＬ−６０細胞は、いずれも検出可能なＰＰ１４発現 を示さなかった。同様に、２つの他の白血病系Ｕ９３７およびＰＬＢ−９８５の 、骨髄−単球系統に沿ったＰＭＡ誘導は、ＰＰ１４ｍＲＮＡ発現を誘導しなかっ た。これらの種々の白血病系からの用いたｍＲＮＡの完全性は、アクチンプロー ブを用いて確認した（データは示さず）。従って、ＰＰ１４は単純にフォルボー ルエステル応答性遺伝子であるというのではないようである。さらに、これらの データは、ＰＰ１４は白血病細胞で無差別的には発現されないことを示唆する。 その代わり、これらのデータは、ＰＰ１４とＰＭＡ−誘導Ｋ５６２細胞の巨核球 系統との間に特異的関係が存在するという考えに一致する。実施例５ ：ＰＰ１４蛋白質の発現 造血系のＰＰ１４のｍＲＮＡが実際にＰＰ１４蛋白質に翻訳されているか否か を確認するため、免疫沈降分析を行った。 Ｋ５６２細胞を、５×１０6細胞/ｍｌにて培養し、前記のごとくＰＭＡで処理 した。ＰＢＳ中で十分に透析した１０％ＦＣＳを補足したシステインおよびメチ オニンを含まない培地中にて、０.５ｍＣｉの35Ｓ-システインおよび35Ｓ-メチ オニン（ＩＣＮバイオメディカルズ社（ICN Biomedicals，Inc．）カリフォルニ ア州、アーバイン（Irvine，CA））で細胞を標識した。翌日、細胞を遠心によっ て採取し、条件培地を供給した。細胞を１％のトリトン（triton）Ｘ-１００、 １％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホ ニル（シグマ（Sigma）社）中に溶解した。条件培地は直接用いた。プロテイン- Ｇ・セファロース（protein-G Sepharose）（ファルマシア社（Pharmacia）、ニ ュージャージー州、ピスカタウェイ（Piskataway，NJ））で細胞溶解物または条 件培地を予め清澄とした後に、プロテイン-Ｇ セファロースの５０％スラリー１ ００μlを抗-ＰＰ１４マウス・モノクローナル抗体（１０５ＤＨ１Ｆ１；リイテ ィネン（Riittinen）ら、１３６頁、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ ッズ（J．Immunol．Meth．）第８５巻、１９９１年）２μlと共に添加した。ゆ っくりと回転撹拌しつつ４℃にて一晩インキュベートした後に、該ビーズを遠心 によりペレット化し：０.１％のトリトンＸ-１００、０.１％のＢＳＡ中で５回 ；次いで、０.０１Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.１４ＭのＮａＣｌ、０ .０２５％のＮａＮ3中で１回；最後に、０.０１Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７.５ ）中で１回洗浄した。煮沸することによって結合蛋白質を溶出し、３％スタッキ ング、１５％分解能のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。該ゲルを乾燥し 、−７０℃にて増感スクリーンを用いてコダックＸＲフィルム（Kodak XR film ）に暴露した。 Ｋ５６２細胞を、35Ｓ-システインおよび35Ｓ-メチオニンの組合せにて代謝に より標識した。次いで、抗-ＰＰ１４マウス・モノクローナル抗体またはポリク ローナル抗体を用いて、条件培地および細胞溶解抽出物を免疫沈降させた。ＰＭ Ａ誘導した条件培地でのみＫ５６２細胞はＰＰ１４蛋白質を示したが、非誘導の ものからは認められなかった（図３）。重要なことには、２つの蛋白質種が２８ キロダルトンのサイズ範囲にて記録され、上側の１つは精製した子宮内膜 ＰＰ１４と共に移動した（データは示さず）。２つのＰＰ１４イソ形は、およそ 等量で存在していた。非誘導Ｋ５６２細胞の細胞溶解抽出物ではＰＰ１４は認め られず、誘導Ｋ５６２細胞の抽出物では少量のＰＰ１４のみが検出され、これは 分泌蛋白質であるＰＰ１４と一致する（データは示さず）。従って、ＰＰ１４蛋 白質は、Ｋ５６２細胞におけるそのＰＭＡ-誘導性においてＰＰ１４のｍＲＮＡ と同等である。実施例６ ：ＰＰ１４の生物学的作用 末梢血液リンパ球増殖性に対するＫ５６２細胞からの条件培地の効果を評価す るために、２方向混合リンパ球培養（ＭＬＣ）を以下のごとく準備した。２人の 無関係なドナーからの血液をヘパリン（１０Ｕ/ｍｌ血液）中に採取した。血液 を１×ＰＢＳ中で２回希釈し；０.３容量のフィコル・パーク（ficoll-paque） （ファルマシア社（Pharmacia）、スウェーデン、アップサラ（Uppsala，Sweden ））を下側に積層し、次いで、３０分間遠心した（１０００×ｇ）。白血球層を 除去し、１×ＰＢＳで３回洗浄した後に、リンパ球を血球測定器中で計数した。 細胞は９６ウェルプレート中で２×１０5細胞／ウェルにて３区培養した。用い る場合、上清を細胞培養ウェル中に５０％v/v添加した。１：１００希釈にて、 抗体を直接添加した。前記したごとく、細胞を５-７日間培養した。収穫１２〜 １５時間前に、０.５μＣｉの［3Ｈ］チミジン（ニュー・イングランド・ニュー キュラー社（New EnglandNuclear）、マサチューセッツ州、ボストン（Boston， MA））を各ウェルに添加した。ミニマッシュII・セル・ハーベスター（MiniMash II cell harvester）で細胞をフィルター上に収穫し、該フィルターを乾燥した 後に、１ｍｌのシンチレーション・カクテル中にて、ベックマン社（Beckman） （カリフォルニア州、フラートン（Fullerton，CA））のＬＳ３８０１・ベータ ・カウンターで計測した。 以前の研究において、子宮内膜ＰＰ１４はリンパ球増殖の潜在的なサプレッサ ーであることが示されている。造血細胞起源のＰＰ１４がこの免疫調節効果を有 するか否かを評価するために、ＰＭＡ誘導Ｋ５６２細胞からの条件培地を、２方 向混合リンパ球培養に添加し、５、６および７日目の3Ｈ-チミジンの取込みによ り測定される増殖への効果をモニターした。これらの実験において、条件培地は １：２の比にて該ＭＬＣに添加した。陽性対照のＭＬＣにおいては、２人の無関 係な個人からのリンパ球を共培養した場合、６および７日目にピークとなる高度 の増殖が検出された（データは示さず）。２４時間（図４）または４８時間（デ ータは示さず）ＰＭＡ誘導したＫ５６２からの条件培地を添加すると顕著な増殖 抑制が生じたが、非誘導Ｋ５６２からのものでは生じなかった。実施例７ ：ＰＰ１４の抗体ブロッキング ＰＭＡ誘導Ｋ５６２の条件培地により影響を受けたリンパ球の増殖阻害が、実 際にＰＰ１４蛋白質の存在によるものなのかを証明するために、抗体-ブロッキ ング実験を行った。効率的にＰＰ１４蛋白質を免疫沈降させることが知られてい る精製ＰＰ１４に対するウサギ・ポリクローナル抗血清を、Ｋ５６２の条件培地 を含有する共培養に添加した。抗-ＰＰ１４抗血清（１：１００希釈）は、７日 までに、２４時間（図４）および４８時間誘導（データは示さず）したＫ５６２ の条件培地の双方について、条件培地の抗-増殖効果を逆転させた。従って、Ｐ Ｐ１４は明らかにＫ５６２の免疫抑制効果に関係している。 ＰＭＡ誘導Ｋ５６２の条件培地の抗-増殖活性は、ウサギ・正常血清または中 和抗-形質転換成長因子（ＴＧＦ）βモノクローナル抗体（アール・アンド・デ ィ・システムス社（R&D Systems）、ミネソタ州、ミネアポリス（Minneapolis， MN））によっては影響を受けなかった（データは示さず）。ＴＧＦβはＫ５６２ 細胞によって産生されることが報告されており、さらに、ＴＧＦβはリンパ球増 殖を阻害することが知られているため、存在するＴＧＦβはその活性な免疫調節 形態に分解されていないと仮定できる。重要なことには、ＰＰ１４は機能の活性 化に蛋白質加水分解的な分解を要しない。実施例８ ：ＰＰ１４イソ形のｍＲＮＡ種 免疫沈降分析が２つのＰＰ１４ポリペプチドイソ形を明らかに区別したのに対 し、ＲＮＡトランスファー・ブロット分析ではポリペプチドイソ形に対応する異 なったＰＰ１４のｍＲＮＡ種を明らかには解明しなかった。しかしながら、ＲＮ Ａのトランスファー・ブロットを弱く暴露した再実験では、ＰＰ１４プローブに ハイブリダイズする強固な二本鎖の存在が示唆された。このことをさらに詳細に 検討するため、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）クローニングお よび分析を行った。 ＰＰ１４のｍＲＮＡのＰＣＲ分析のために、ＰＰ１４特異的プライマー（５’ -ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴ ＧＣ-３’；配列番号１）を用いて前記したごとくに全ＲＮＡを逆転写させた。 ２５ｍＭのＴＡＰＳ-ＨＣｌ（ｐＨ９.３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣ ｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ Ｐおよび２.５Ｕのタック・ポリメラーゼ（パーキン・エルマー社（Perkin Elme r）コネチカット州、ノウォーク（Norwalk，CT））を含有する緩衝液中の５’プ ライマー（５’-ＧＧＴＡＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣ ＡＣＡＧ-３’：配列番号２）および３’プライマー（５’-ＧＴＧＣＡＧＡＡＣ ＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧ-３’；配列番号３）で、得られた生成物をＰＣＲ 増幅させた。増幅は、ＰＴＣ-１００・サーマル・サイクラー（ＰＴＣ-１００ t hermal cycler）（エムジェイ・リサーチ社（MJ Research）、マサチューセッツ 州、ウォータータウン（Watertown，MA））上で、９４℃にて１分間、６５℃に て４５秒間、次いで７２℃にて１分間の２５サイクル行った。ＰＣＲ生成物は、 ＥｔＢｒで染色した１.２％のアガロースゲル上で分析した。 （前掲の）異なったｃＤＮＡスクリーニングを通して得た最初の２つのＰＰ１ ４・ｃＤＮＡクローンは、ＰＰ１４のｍＲＮＡの３’-末端のみを包含する部分 的なクローンに過ぎなかったことが判明した。ＰＰ１４・ｃＤＮＡの全長のＰＣ Ｒクローニングは、ＰＰ１４の３’-末端に特異的なプライマー（５’-ＣＡＴＧ ＣＴＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＧＣ-３’；配列番号４ ）をアニーリングさせ、次いで前記したごとくに逆転写させることにより行った 。３’-末端に特異的なプライマーと５’-末端に特異的なプライマー（５’-Ａ ＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ-３’；配列番号５）を用 い、（前記した）ＰＣＲにて、得られた生成物を直接用いた。該ＰＣＲ生成物を ゲル精製し、Ｔ-ベクターにクローン化した。 （子宮内膜のＰＰ１４のｍＲＮＡ配列と同一の）Ｋ５６２のＰＰ１４のｍＲＮ Ａ に基づいたプライマーと子宮内膜のＰＰ１４のｍＲＮＡの公表されている５’- 末端配列とを用いて、ＰＭＡ誘導したＫ５６２のｍＲＮＡからＰＰ１４の全長ｃ ＤＮＡをＲＴ-ＰＣＲクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、タバーおよびリチャ ードソン（Tabor and Richardson）の配列決定法と業界推奨によるところのシー クエナーゼR配列決定キット（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥR）（ユナイティッド・ステー ツ・バイオケミカルズ社（United States Biochemicals）、クリーブランド（Cl eveland））とを用いて行った。Ｋ５６２のＰＰ１４クローンの配列分析により 、６６個のヌクレオチド長のフレーム内欠損の結果、予想される２２個のアミノ 酸がコード蛋白質内で欠損したという重大な相違を有しつつ、コードされたＰＰ １４蛋白質が子宮内膜のＰＰ１４に同一であることが明らかとなった（図５）。 ゲノミックＰＰ１４構造を解析すると、この欠失はエキソン-２の上流末端に対 応し、コンセンサス・スプライス・アクセプター部位がエキソン-２内の適当な 部位に検出された。このことは、短いＰＰ１４のｍＲＮＡ変異型の生成における 操作機構として別のスプライシングを指摘している。 ＰＰ１４末端プライマーを用いたＰＣＲ生成物をサイズ分画してアガロース・ ゲル上に視覚化すると、２つの区別されるＰＣＲ生成物が認められた（図６）。 ２つの該ｍＲＮＡ種をＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２（後者が小さなＲＮＡ種に 対応する）と命名した。これら２つのＰＣＲ生成物間のサイズの相違は、ＰＣＲ -クローン化したＫ５６２のＰＰ１４のｍＲＮＡ中において文献記載されている ６６個のヌクレオチド欠失と一致した。注目すべきは、ＰＰ１４.１のｍＲＮＡ 変異型のみが子宮内膜にて容易に検出できた。実施例９ ：血小板におけるＰＰ１４蛋白質の検出 血小板からの免疫沈降は、修飾クエン酸緩衝液を用いて単離した血小板から行 った。簡単には、１０ｍｌの全血液当たりに、クエン酸/リン酸/デキストロース /アデニンの抗凝固剤である１.４ｍｌのＣＰＤＡ（ＣＰＤＡは、１５.８ｍＭの クエン酸、９１.３ｍＭのクエン酸ナトリウム、１６.６ｍＭのデキストロース、 １.７ｍＭのアデニン、および１６.６ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムを含む） 中に全血液を採取した。細胞を２００×ｇ、２２℃にて１０分間遠心した。上側 の血小 板に富む血漿（ＰＲＰ）を取り出し、該血小板を通常のリンゲル/クエン酸/デキ ストロース、ｐＨ６.５（ＲＣＤ）、７１.９ｍＭのＮａＣｌ、０.７ｍＭのＫＣ ｌ、０.６ｍＭのＣａＣｌ2、０.８ｍＭのＮａＨＣＯ3、２０ｍＭのクエン酸三ナ トリウム、２７.８ｍＭのデキストロース、４３ｎｇ/ｍｌのプロスタグランジン Ｅ1（ＰＧＥ1、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co）、セントルイス（St ．Louis））を含有する）中で２回洗浄した。洗浄と洗浄との間に、該血小板を １,１００×ｇ、２２℃にて１５分間遠心した。５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ ｐＨ７.０）、１％のＮＰ-４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２μｇ/ｍｌのロイペ プチン、２μｇ/ｍｌのアプロチニン、２０μｇ/ｍｌのＰＭＳＦを含有する修飾 溶解緩衝液中に該血小板ペレットを最後の遠心の後に再懸濁することにより、血 小板抽出物の還元メチル化を行った。ＮａＣＮＢｒＨ3（シグマ社（Sigma））を 添加して５０ｍＭに、［14Ｃ］ホルムアルデヒド（アマシャム社（Amersham）） を添加して１０ｍＭとした。混合物を、３７℃にて１時間還元的にメチル化させ た。メチル化に続いて、該反応物を１×ＰＢＳ中で一晩透析し、次いで、翌朝に １×ＰＢＳ中で１時間再度透析して残存しているＮａＣＮＢｒＨ3および［14Ｃ ］ホルムアルデヒドを除去した。透析の後に、前記のごとく放射性抽出物を免疫 沈降させて分析した。 前記したごとく、ＰＭＡ誘導Ｋ５６２白血病細胞中にはＰＰ１４が見い出され たが、ヘミン（hemin）誘導Ｋ５６２白血病細胞には見い出されなかったことは 、他のＰＭＡ誘導白血病系におけるＰＰ１４の不存在と共に、一緒になって、Ｐ ＭＡ誘導Ｋ５６２細胞におけるＰＰ１４発現がＰＰ１４と血小板系統との間にあ る関連性を反映していることを実証するものであった。この点を確認するため、 抗-ＰＰ１４ポリクローナル抗体および血小板抽出物を用いて、免疫沈降/ＳＤＳ -ＰＡＧＥ分析を行った。血小板抽出物中に２つのＰＰ１４ポリペプチドが存在 するという記載が得られた（データは示さず）。実施例１０ ：ＰＣＲによるＰＰ１４のスクリーニング 骨髄巨核球毛一等の造血細胞におけるＰＰ１４のｍＲＮＡおよび蛋白質の知見 は、ＰＰ１４のｍＲＮＡの存在につき、生殖路外のさらなる組織部位のスクリー ニングを鼓舞した。ＰＣＲ分析を用いて感度を最適化した。解剖組織から単離し た全細胞性ＲＮＡを、ＰＰ１４特異的プライマー（配列番号１）を用いて逆転写 し、３’プライマーとして同一のオリゴヌクレオチドおよび２つのＰＰ１４のｍ ＲＮＡ変異型が解明できるよう設計した５’プライマー（配列番号２）を用いて 増幅した。図７に示されるごとく、対照として供したＰＭＡ誘導Ｋ５６２細胞に おいて、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２が検出され、明らかに解明された（レー ン２およびレーン３）。さらに、（ＰＰ１４を含む汚染子宮内脱落膜で汚染され た）胎盤組織も、予期されるごとく、大きなＰＰ１４.１のｍＲＮＡ変異型のみ を示した（レーン１１およびレーン１２）。それに対して、検定した他の組織の パネルは、ＰＰ１４転写物につき全て陰性であった。これらの組織には、脳（レ ーン４）、脾臓（レーン５）、小腸（レーン６）、肝臓（レーン７）、腎臓（レ ーン８）および髄膜（レーン９）が含まれる。同様にして、２つの繊維芽細胞系 、ＫＭ-１０２（ヒト骨髄間質細胞；レーン１０）および真皮繊維芽細胞（レー ン１１）も陰性であった。従って、ＰＰ１４のｍＲＮＡの発現は、生殖系および 造血系に限られているようである。方法 血小板系統の細胞において構成的に活性な免疫抑制分子が存在することは、か なり生理学的に重要であり、以前には予期できなかったＰＰ１４の役割を示唆し ている。これらのデータは、この潜在的な免疫抑制分子が、凝固が起こる組織部 位に濃縮されていることを示している。従って、ＰＰ１４は、障害治癒部位での 炎症過程の消散で役割を担っているようである。従って、この知見は、凝固と免 疫系との間の以前は知られなかった重大な分子のつながりを示している。 ＰＰ１４が血小板系統の細胞により産生されるという知見は、血小板により駆 動される免疫抑制を逆転させる新規な治療につながる。女性および男性の生殖質 中のアロ反応のブロッカーとしての生理学的な役割が示唆されていた点で、以前 ＰＰ１４は有利な分子であると考えられていた。本発明は、凝固障害のごときあ る種の臨床状態において血小板により放出される一般的共通の免疫抑制剤として の病体生理学的な役割において、ＰＰ１４も身体に有害な分子であり得ることを 開示する。この知見は、ＰＰ１４およびその免疫抑制作用を遮断する方法を開発 する最初の動機を提供する。このＰＰ１４遮断を達成する方法を開示する。これ らの方法には、ＰＰ１４蛋白質のＰＰ１４レセプターとの相互作用を妨害する方 法、ならびにＰＰ１４の転写および/または翻訳を阻害する方法（すなわち、Ｐ Ｐ１４遮断療法）が含まれる。 この実験において報告されたヒト白血病細胞系の調査は、ＰＰ１４が白血病系 において無差別に発現されているのではないということを示している。実際に、 Ｋ５６２においてでさえ、１つの特別な化学インデューサーで化学誘導した後で のみそれは発現される。そえれにも拘わらず、イン・ビボ（in vivo）条件下で は、Ｋ５６２の巨核球の分化能を有する骨髄性白血病細胞は、ＰＰ１４を発現で きるさらに分化した状態へとトリガーされ得る。このことは、自発的もしくは治 療剤に反応して起こり得る。かかる状態下では、ＰＰ１４は、その潜在的な免疫 抑制機能により、効果的な抗-腫瘍免疫反応の遮断において病原性の役割を担う と予測される。本明細書中にＫ５６２白血病細胞につき示されたごとく、分泌さ れたＰＰ１４はその生物学的に活性な形態である。本発明は、患者の血清中のＰ Ｐ１４.２を検出する方法を提供する。かかる方法は、白血病または関連疾患を 患う患者に容易に適用して、患者がＰＰ１４遮断治療の候補であるか否かを判断 できる。 以下に本発明の治療方法および診断方法の実施例をつけ加える。これらの実施 例は、本発明を限定するものではなく、当業者なら、請求の範囲内において多く の同等の方法および試薬が見付け出せることを認識できよう。ＰＰ１４遮断治療 血清中のＰＰ１４ポリペプチドイソ形の１つもしくは双方のレベルが上昇した 患者は、ＰＰ１４遮断治療の候補である。かかるＰＰ１４レベルの上昇は、血小 板が過剰なＰＰ１４を血流中に放出する種々の疾患状態で起こり得る。例えば、 血小板内容物が血小板凝固物として血液中へ放出されることへとつながる症状で ある散在性の血管内凝集と敗血症とはしばしば関連している。この臨床的状態に おいて放出されるＰＰ１４は、全身性免疫抑制の一因となり、次いで、敗血症を さらに悪化させる。従って、ＰＰ１４遮断は、この病原性サイクルを阻害し回復 を助けるよう作用する。 第一段階は、ＰＰ１４遮断治療を要する患者を同定することである。これを達 成するための好ましい診断方法を以下に記載する。一般に、ＰＰ１４.１もしく はＰＰ１４.２またはその双方の正常な組織中または血清中レベルよりも高いレ ベルの患者を、本発明の方法により治療する。かかるレベルは、抗体に基づいた アッセイを使用することにより測定できる。 本発明は、ＰＰ１４遮断が治療的な利点を有し得ることを開示する。ＰＰ１４ 作用を遮断するための方法には、治療的な終点に到達するために蛋白質を遮断す る標準的な方法が含まれる。例えば、モノクローナル抗体および/またはポリク ローナル抗体を、ＰＰ１４の２つのイソ形についての特異性をもって、ＰＰ１４ 遮断剤として用いることができる。ＰＰ１４に特異的な抗体は、以前に記載され ているが、治療的な利点が免疫系不全の治療であることを示唆しているに過ぎず 、その唯一供されている例はＡＩＤＳに過ぎず、２つのＰＰ１４イソ形について の知識が不足しており、抗体のイソ形特異性は依然知られていなかった。本発明 におけるＰＰ１４.２イソ形の知見により、ＰＰ１４.１もしくはＰＰ１４.２特 異性を有する抗体の開発およびそれらの治療的な使用が可能となった。かくして 、本発明は、患者もしくは組織中の過剰量のＰＰ１４によって特徴付けられる全 ての他の非-ＡＩＤＳ-疾患（または、他の免疫系不全までも）を治療する方法を その要旨とする。また、本発明は、ＰＰ１４レベルの上昇に関連する全ての疾患 を治療するための、ＰＰ１４.２-特異的抗体の使用もその要旨とする。 抗-ＰＰ１４.１-特異的抗体を生成する好ましい戦略は、ＰＰ１４.２には欠け ているＰＰ１４.１-特異的配列内のアミノ酸配列に大きく限定されたペプチドで 免疫することである。別法として、この配列と残りのＰＰ１４.１との間の結合 部に重複するペプチドならびに他のＰＰ１４.１配列を用いることもできる。後 者の場合においては、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２の双方に交差反応性を有す る抗体は、常法により除去できる。 抗-１４.２-特異的抗体を生成するのに好ましい戦略は、ＰＰ１４.１配列の挿 入が存在する部位に対応する結合部にわたるペプチドで免疫することである。標 準的なペプチド免疫プロトコールを用いることができる。 天然ＰＰ１４ポリペプチドの部分のみを有するＰＰ１４ペプチドを用いて、Ｐ Ｐ１４とＰＰ１４に対するレセプター（ＰＰ１４レセプター）との相互作用を競 合的に阻害し、それによって、天然ＰＰ１４ポリペプチドにより媒介される非特 異的免疫抑制を妨げることができる。競合的ペプチド阻害および/または部位特 異的突然変異誘導に基づくイン・ビトロ（in vitro）実験をそのまま用いて、か かる遮断を行う適当なＰＰ１４結果（subsequence）を局在化することができ、 当業者により標準的な方法に基づいて行える。好ましい結果とは、一般的に、親 水性アミノ酸配列のストレッチ範囲と一致するものである。さらに、治療すべき 患者にイン・ビボ（in vivo）投与するスケジュールを最適化する戦略はよく知 られている。 同様にして、そのレセプターに結合するその能力においてＰＰ１４にまねた抗 -イディオタイプ抗体を、ＰＰ１４レセプターの競合的遮断に用いることができ る。かかる抗-イディオタイプ抗体の作製方法およびそれらの使用方法は、当業 者によく知られており、とりわけ、感染症の文献中によく記載されている。 また、ＰＰ１４：ＰＰ１４レセプター相互作用を遮断する目的で、ＰＰ１４自 体の代わりにＰＰ１４レセプターに焦点を当てることもできる。リガンドが精製 形態にて入手できる状況では、レセプターの精製およびクローニングは当業者に は簡単な仕事となる。本発明以前には、強いてＰＰ１４レセプターを精製しクロ ーン化する治療的な理由を提供する刊行物はない。さらに、２つの異なったＰＰ １４イソ形が存在するという先行知識がなければ、ＰＰ１４レセプターについて のイソ形特異性の流出はアドレスされ得なかった。ＰＰ１４が、単に妊娠の副生 成物でなく、あるいは、男性生殖管の末端部位に限定されるものでもなく、その 代わり、病態生理学に寄与する血小板に由来し得ることを教示することにより、 本発明はＰＰ１４のレセプターを精製しクローン化することを強いる理由を提供 する。ＰＰ１４レセプターの構造的な特徴により、ＰＰ１４：ＰＰ１４レセプタ ー相互作用を遮断する剤の生成が可能となる。 ＰＰ１４レセプターを単離しクローニングする好ましい方法には、ＰＰ１４： イムノグロブリンＦｃのキメラポリペプチドの作製および使用が含まれる。この キメラポリペプチドは、イムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域に連結さ れた、ＰＰ１４の完全配列またはその機能性ポリペプチド誘導体を有する。後者 は、該キメラポリペプチドを検出し単離するのに有用な目印として機能する。と いうのは、イムノグロブリンのＦｃ領域はプロテインＡもしくはプロテインＧに よく結合するためである。類似のリガンド：Ｆｃキメラポリペプチドは、特異的 レセプターを単離するために、多くの研究グループによって用いられている。単 球およびリンパ球のごとき造血系細胞はＰＰ１４に反応するため、単核細胞プー ルは、ＰＰ１４レセプターを単離する適当な細胞源である。該細胞から活性剤抽 出物を調製し、標準的なＮＯＳ細胞またはそれらの同等物中で組換えＤＮＡ法に より作製されたＰＰ１４：イムノグロブリンＦｃキメラを該抽出物に添加する。 プロテインＡ-セファロース・クロマトグラフィーを行って、ＰＰ１４レセプタ ーがＰＰ１４：イムノグロブリンＦｃキメラと複合体を形成しているところの複 合体を単離する。ｐＨ溶出を用いて、精製したＰＰ１４レセプターを回収する。 アミノ末端のアミノ酸配列とペプチダーゼ切断により生成した明確な亜ペプチド とを、通常のアミノ酸配列決定法により決定する。このアミノ酸配列に基づいて 、オリゴヌクレオチド・シンセサイザーを用いてこのアミノ酸配列をコードする 変性オリゴヌクレオチドを合成する。次いで、これらの変性オリゴヌクレオチド を標識し、該レセプターを元来精製したのと同一の細胞からｃＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングするためのプローブとして用いる。従って、ＰＰ１４レセプ ターの精製およびクローニングは、常法を用いる簡単な方法で行うことができる 。 ＰＰ１４：Ｆｃキメラをレセプタートラップとして用いた実施例を本明細書に 提供したが、同一目的に用いることができる多数の別法もある。検出および単離 目的のために、別のポリペプチド目印をＰＰ１４に付すことができる。さらに、 本発明細書に概説した工程の手順は、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２の双方なら びにヘテロダイマーＰＰ１４、イソ形-特異的レセプターを単離しクローン化す るためのポリペプチドに繰り返すことができる。さらに、レセプターに結合させ るために非修飾形態にて天然ＰＰ１４を用いることができ、次いで、ＰＰ１４： ＰＰ１４レセプター複合体を回収するために抗-ＰＰ１４抗体を用いることがで きる。 ＰＰ１４を介したＰＰ１４遮断を行う１つの療法によると、ＰＰ１４誘導性の 全身性または局所性の免疫抑制を要する患者に、抗-ＰＰ１４レセプター抗体を 注入する。抗-ＰＰ１４レセプター抗体は、免疫原として、ＰＰ１４レセプター 、組換えＰＰ１４レセプターまたはＰＰ１４レセプターペプチドを用いて生成で きる。ヒト治療に有用なモノクローナル抗体を作製する方法は、科学刊行物によ く記載されている。ＰＰ１４レセプターを介したＰＰ１４遮断を行うもう１つの 療法によると、ＰＰ１４誘導性の全身性の免疫抑制を要する患者に、ＰＰ１４レ セプターの可溶性誘導体を注入する。ＰＰ１４レセプターのこの可溶性誘導体は 、標準的な組換えＤＮＡ法により容易に生成できる。例えば、部位特異的突然変 異誘発法を用いて、ＰＰ１４レセプター細胞外ドメインのカルボキシ末端に終止 コドンを導入できる。この可溶性ＰＰ１４レセオウターのこの突然変異暗号配列 は、この分子を大量に産生するための数多くの真核生物または原核生物の発現ベ クターのいずれか１つにサブクローン化できる。ＰＰ１４レセプターの別の治療 的な可溶性誘導体は、イムノグロブリンＧのＦｃドメインに連結されたＰＰ１４ レセプターの細胞外ドメインよりなる。この後者の分子は、ＣＤ４：イムノグロ ブリンＦｃのごとき他のイムノグロブリンＦｃ・キメラポリペプチドで示された ように、イン・ビボ（in vivo）で安定な分子であるという利点を有する。ＰＰ１４産生の阻害に基づく治療 患者の血液および組織中のＰＰ１４蛋白質の結合、それによりその免疫抑制活 性が阻害されることに基づく治療法に加えて、ＰＰ１４産生レベルを低下させる ことに基づく治療法も用いることができる。かかる低下は、転写および前-転写 レベル可能である。 従って、血小板系統の細胞によるＰＰ１４発現を阻害する遺伝的な治療剤を用 いることができる。ＰＰ１４産生を低下させる好ましい剤は、イン・ビボ（in v ivo）安定性および細胞膜浸透性を上昇させる公知の方法により共有的に誘導体 化した アンチセンスＰＰ１４オリゴヌクレオチドである。イソ形-特異的アンチセンス ＰＰ１４オリゴヌクレオチドは、機能性アンチセンス・オリゴヌクレオチドを最 適化する当業者によく知られた一般的なガイドラインに沿って、本明細書に開示 したＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ヌクレオチド配列情報に基づいて容易に設計 できる。ＰＰ１４.１の場合においては、該アンチセンス・オリゴヌクレオチド を、ＰＰ１４.２には存在しない６６個のヌクレオチド・ストレッチに対して向 けることができる。ＰＰ１４.２の場合においては、該アンチセンス・オリゴヌ クレオチドは、該オリゴヌクレオチドが結合部にのみ結合するよう、ＰＰ１４配 列の６６個のヌクレオチド欠失に重複する結合部位をまたがったものとする。他 の調整ポリヌクレオチドも、リボザイムを取り入れたものまたは三重鎖形成調節 エレメントとして機能するもののごとく容易に設計できる。かかる剤を開発しそ れらの効率性および毒性をスクリーニングするよく確立された方法がある。 ＰＰ１４遺伝子-特異的転写阻害剤のごとく機能する化学剤に基づく他の療法 が開発できる。特異的な遺伝子プロモーターからの転写を遮断するであろうもの についての化学物質バンクをスクリーニングする、現在よく記載されている方法 がある。１つの実験アプローチには、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼま たはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼのごとき容易に検出で きるプロモーターをコードする遺伝子配列に連結した、ＰＰ１４プロモーターエ レメントを有する、ＰＰ１４遺伝子の上流配列を含めたレポーター遺伝子構築物 を作製することが含まれる。ＰＰ１４プロモーターからの活性な転写を支持でき る標的細胞に安定にこの転写カセットを安定にトランスフェクトする。Ｋ５６２ 細胞は、この目的に適する細胞系の１例である。巨核球分化能を有する別の細胞 系、ならびに子宮内膜系および精巣系は容易に同定できる。キメラレポーターで トランスフェクトしたＫ５６２細胞の場合においては、該細胞をマルチウェル組 織カルチャープレートに分散させ、スクリーニングすべき化学物質をＰＭＡと一 緒に個々のウェルに添加してＰＰ１４プロモーターを活性化させる。レポーター を発現できなかった細胞を含有するウェルを同定する。これは、関連する薬物候 補につき多数の化学物質をスクリーニングするための比較的迅速な方法を表す。 一旦候補を同定したら、薬理学の分野でよく確立された方法を用いて効果および 毒性を試験し、投与法を最適化する。白血病の治療 ＰＰ１４は血小板系統の細胞の特徴を有し、この系統に対応する白血病細胞も ＰＰ１４を発現している。イン・ビボ（in vivo）においてこの潜在的な免疫抑 制分子を産生する白血病細胞は、効果的な抗-白血球Ｔ細胞反応から保護できる 。さらに、これらの細胞由来のＰＰ１４は、患者における全身的な免疫抑制つな がり、感染症を包含する他の疾患に対して患者を感受性とするであろう。従って 、ある種の白血病細胞がＰＰ１４を産生するという知見は、血中および白血病細 胞中のＰＰ１４発現につき、白血病に患った患者をスクリーニングする動機も提 供する。ＰＰ１４-陽性である患者は、前記に開示した方法のうちの１つによっ て、ＰＰ１４遮断治療により治療できる。巨核球分化能を有する巨核白血病細胞 もしくは慢性骨髄性白血病細胞を持つ患者は、特にこの治療様式に適する候補で ある。 本発明は、ＰＰ１４.２イソ形の存在を開示する。抗体、ＰＰ１４ペプチドま たはＰＰ１４レセプター誘導体化治療組成物でターゲッティングしなければなら ない両イソ形において、どのようにして効率的に血小板由来ＰＰ１４を遮断する かを当業者に教示する点でこの開示は重要である。ＰＰ１４.２イソ形のクロー ニングは、ＰＰ１４イソ形-特異的試薬の生成を可能にする非常に重要な配列情 報を提供する。かかる試薬は、組み合わせるかまたは単独かのいずれかで用いる ことができる。例えば、治療的な利点は、例えば、妊娠-関連凝固障害の臨床的 な状態のように、血小板誘導性の全身性免疫抑制の緩和を要する妊娠患者で得る ことができる。かかる患者においては、胎児の発育に悪影響を及ぼしかねるため ＰＰ１４.１遮断は望ましくなく、選択的なＰＰ１４.２遮断が好ましい。患者中 の子宮内膜および血小板からの残存性ＰＰ１４.１がある場合でさえ、患者に投 与するＰＰ１４を減少させることにより治療的な利点が得られよう。ＰＰ１４診断アッセイ 血小板系統の細胞中のＰＰ１４の開示は診断的意義を有する。前記した方法に より調製したモノクローナルおよび/またはポリクローナル抗体により、血清中 のＰＰ１４発現を測定するＥＬＩＳＡアッセイの単純な開発が可能となる。ＰＰ １４.１-および/またはＰＰ１４.２-特異的抗体は、この目的に用いることがで きる。高感度のＥＬＩＳＡは、血清試料中のＰＰ１４検出に用いることができる 。ＰＰ１４蛋白質の区別される非重複部分につき特異性を有する２つの抗-ＰＰ １４抗体は、通常の二重-抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで組合わせることができ る。本発明は、ＰＰ１４の２つのイソ形は血小板により産生されることを教示し 、よって、どのようにして適当な診断アッセイを開発するかを当業者に提供する 。ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチドのイソ形の間で区別できる能力は 、妊娠女性における血小板不全を診断する場合特に有用である。というのは、血 小板および子宮内膜細胞由来のＰＰ１４ポリペプチドは解像できるからである。 このアッセイは、ＰＰ１４遮断治療の候補を正確に定義するのに有用であるの みならず、このアッセイは、診断が未確定の患者において凝固障害が事実である か否かを判断する敏感な診断ツールとしても機能できる。後者によると、しばし ば診断するのが困難な散在性の血管内凝固のごとき臨床的な不全の診断試験とし て、Ｐ１４検出は機能できる。従って、ＰＰ１４.２ポリペプチドは血小板につ いての有用な診断マーカーである。ＰＰ１４.２ポリペプチドでの免疫抑制治療 本発明は、免疫抑制が望ましい終点である疾患を患った患者を治療するのに用 いることができる新規な免疫抑制剤を提供する。かかる疾患には、限定するもの ではないが、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、ならびにアレルギー性皮膚炎、 移植片拒絶反応のごときアレルギー性疾患、ならびに骨髄移植に関連する移植片 対宿主の疾患が含まれる。本発明は、免疫抑制を要する患者においてそれを達成 するためのＰＰ１４.１の代替としてのＰＰ１４.２を提供する。 患者とは、免疫抑制を要すると同定されたものである。ＰＰ１４ポリペプチド またはその機能性ポリペプチド誘導体を含有する組成物を該患者に投与する。投 与経路および医薬調製物の正確な成分は、治療すべき特定の疾患により指示され る。例えば、全身性自己免疫疾患の治療においては、血管内または筋肉内の投与 が好ましい。対照的に、アレルギー性皮膚炎には局所適用が好ましい一方で、 慢性関節リウマチの関連には関節内注射が好ましい。治療的なポリペプチドを含 む臨床的プロトコールを最適化する方法はよく確立されており、ＰＰ１４ポリペ プチドに用いるべき方法はこれらに匹敵する。例えば、１〜１０００μ/ｋｇ動 物体重/日のＰＰ１４量が適当である。治療した患者におけるＰＰ１４.１および /またはＰＰ１４.２血清レベルは、治療効率の１目安を提供するためにモニター できる。ＰＰ１４ポリペプチド生成法 本発明は、新規なＰＰ１４.２イソ形のみならずＰＰ１４.１イソ形の小スケー ルおよび大スケール生産に重要な一連の新しい潜在的な供給源を開示する。以前 には、容易にヒトＰＰ１４ポリペプチドが得られる天然の細胞供給源がなかった 。流産した場合からの第一および第二の３ヶ月子宮内膜（trimester endometriu m）の利用性は、いくつかの要因によって明らかに限定される。本発明によると 、天然ＰＰ１４供給源として血小板を用いることができる。細胞培養で迅速に増 殖するＰＭＡ誘導Ｋ５６２細胞におけるＰＰ１４ポリペプチドの知見は、天然（ すなわち、非組換え）ＰＰ１４のもう１つの潜在的な供給源を提供する。重要な ことには、ＰＰ１４の両イソ形が、これらの供給源から得ることができ、これら は機能性ダイマー分子の供給源としてさらに供する。さらに、巨核球系統に対応 する他の細胞系も、天然ＰＰ１４の別の供給源である。 別法として、ＰＰ１４の過剰発現の目的でＫ５６２または他の巨核球系にＰＰ １４.２の発現構築物を導入できる。組換えモノマーＰＰ１４.２、ホモダイマー ＰＰ１４.２およびヘテロダイマーＰＰ１４.１：ＰＰ１４.２は全てこの方法で 生産できる。かかる細胞は、ＰＰ１４のｍＲＮＡおよび蛋白質の適当な転写後修 飾が起こり得る最適な細胞環境を提供する。遺伝子トランスファー法および発現 法ならびに組換え蛋白質の精製方法は、当該分野でよく確立されている。 可溶性ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチドを生産する別の方法も考案 できる。１つの好ましい方法には、付着性細胞表面上の、モノマーおよびヘテロ ダイマー形態のこれらのポリペプチドを包含するキメラＰＰ１４.１：ＧＰＩお よびＰＰ１４.２：ＧＰＩポリペプチドの発現、ならびに、該ＧＰＩ膜アンカー の切 断による可溶性ＰＰ１４.１またはＰＰ１４.２ポリペプチドの回収が含まれる。 この型の方法は、他の可溶性分子の生産に首尾よく用いることができ、連続流動 細胞培養系に適合するという特別な利点を供する。 他の具体例も以下の請求の範囲内である。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：マーク，エル・タイコシンスキー（Mark L.Tykocinski） （ii）発明の名称：ＰＰ１４に基づく治療 （iii）配列数：５ （iv）通信住所： （Ａ）受信人：ライオン・アンド・ライオン（Lyon&Lyon） （Ｂ）通り：ウエスト・シックス・ストリート６１１番 （611 West Sixth Street） （Ｃ）都市：ロス・アンゼルス（Los Angeles） （Ｄ）州：カリフォルニア州（California） （Ｅ）国：合衆国（Ｕ.Ｓ.Ａ.） （Ｆ）郵便番号：０２１１１-２６５８ （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）媒質型：３.５''ディスケット、１.４４Ｍｂ容量 （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ・コンパチブル（IBM Compatible） （Ｃ）オペレーティング・システム：ＩＢＭ Ｐ.Ｃ.ＤＯＳ（バージョン ５．０） （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（Wordperfect）（バージョン ５．０） （vi）最新出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先行出願データ： 先行出願には全て以下に記載する出願が包含される： （viii）代理人/代理事務所情報： （Ａ）氏名：ワーバーグ，リチャード・ジェイ（Warburg,Richard J.） （Ｂ）登録番号：３２，３２７ （Ｃ）参照/ファイル番号：１９９/１８７ （ix）遠距離通信情報： （Ａ）電話番号： （２１３）４８９-１６００ （Ｂ）ファクス番号： （２１３）９５５-０４４０ （Ｃ）テレックス番号： ６７-３５１０ （２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３７ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号１： （３）配列番号：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３２ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号２： （４）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号３： （５）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号４： （６）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２５ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号５： Detailed Description of the Invention                           Treatment based on PP14Background of the Invention   The present invention relates to placental protein 14 (“PP14”) and its monoclonals. Antibodies and their use.   Human PP14 in the endometrium during the first and second three months of pregnancy It is an expressed 28 kilodalton protein. During this period, this is the endometrial prolapse It accounts for up to 5-10% of total secreted proteins from the decidua (Julkunen ) Et al., 92, British Journal of Obstetrics & -Gainacology (Br. J. Obstet. Gynaecol.) 1145, 1985). PP 14 also accumulates in serum from pregnant women at significant levels. In addition to that, PP14 is found in high concentration in male semen (19-515 mg / 1) (pot Pockley et al., 43, Biochemical Society Transac. (Biochem. Soc. Trans.) 317, 1989), PP in the male reproductive tract The source of 14 cells has not yet been determined.   PP14 belongs to a class of proteins called β-lactoglobulin, which Ctoferrin (Rado et al., 64, Blood 1103, 1984) ) And retinoic acid receptors (Papiz et al., 324, Nature (N ature) 383, 196). PP14 cDNA cloned from the endometrium From this analysis of the PP14 cDNA of the endometrium, the region coding for PP14 Has about 70% homology to other β-lactoglobulins and their genome It has been shown to be similar in size and composition (Vaisse et al. 9, DNA Cell Biol 401, 1990).   PP14 has been shown to inhibit lymphocyte proliferation and proliferation (Bolton (Bo Lton et al., Lancet 593, 1987). Human / decidual membrane set The woven extract was added to the mixed lymphocyte culture (MLC) to detect the presence of PP14. A linear relationship was observed between the amount and the observed growth inhibition of lymphocytes. Same literature. Further In addition, addition of anti-PP14 monoclonal antibody to MLCs resulted in anti-mitotic growth effect. Inhibition, which indicates a functional link between PP14 and anti-mitogenic activity. You In the next study, IL-1, IL-2 and solubles by peripheral blood mononuclear cells We have noticed the inhibitory effect of PP14 on the synthesis of IL-2 receptor (see Pockley et al. 16, Biochemical Society Transaxi Biochem. Soc. Trans. 794, 1988; Pockley et al. , 77, Clinical and Experimental Immunology (Clin.Exp) ． Immunol. 252, 1989; Pockley & Bolton , 69, Immunology, 277, 1990). Okamoto et al. [26 , American Journal Ode Reproductive Immunology (Amer. J ． Reprod. Immunol. ) 137, 1991], PP14 is a natural killer Suggesting that it suppresses vesicular activity.   Non-specific, such as people suffering from autoimmune, inflammatory and allergic diseases PP14 was used for such immunosuppression in patients in need of selective immunosuppression. It is proposed to use. [Bolton et al., US Pat. No. 5,039, , 521]. In particular, Bolton et al. Have arthritis, rheumatoid arthritis, and asthma. , Transplant versus host disease, visceral rejection, osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, ato Pea allergy, multiple sclerosis, allergic dermatitis, inflammatory bowel disease, psoriasis, kind The use of PP14 for treating sarcoma and other inflammatory disorders has been proposed. In addition, they have malignant non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's disease or malignant histiocytes. Suggests treatment for impaired lymphoproliferative disorders such as illness. Suggestions are inflammation and autoimmunity It has also been used to treat diseases, infertility and neoplastic disorders such as leukemia. There is. Finally, monoclonal antibodies against PP14 are associated with abnormalities of the immune system, especially after Stated that it can be used to treat acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) Can beSummary of the Invention   Applicants have demonstrated that PP14 is expressed in female and male extragerminal cells, In particular, mRNA encoding PP14 and PP14 protein are expressed in hematopoietic cells. I found out what I was doing. Specifically, (dividing along the red blood cell and megakaryocyte lineages Human myeloid leukemia with amphoteric differentiation potential as chemically induced to metabolize Since the disease line K562 is caused to differentiate along the line of megakaryocytes, The cDNA is detectable.   PP14 expressed in this hematopoietic system has two polypeptide isoforms, Is the two mRNAs produced by alternative splicing of the PP14 gene. Coded by seed. The isoforms of these two polypeptides and their corresponding Are referred to herein as "PP14.1" and "PP14.2". Be done. In previous work on PP14 in the female and male reproductive tract (discussed above) At that time, only one isoform of PP14 corresponding to PP14 was recognized.   In cells of the megakaryocyte lineage, especially in the last cell of the lineage, platelets The unexpected discovery of PP14 indicates the use of PP14 in unexpected areas. these The findings provide evidence of the pathophysiological role of PP14. In particular, (of diffuse intravascular coagulation Release of PP14 from platelets in platelet disorders including blood clotting disorders , With all the associated unwanted (immunosuppressive) effects of PP14, such disorders Leading to generalized immunosuppression in patients suffering from depression. Therefore, the applicant is blood It is important to reduce the impact of PP14 release from platelets on disease development I discovered that. This is the opposite of the potentiating effect for various disease states, Blocking PP14 is a desirable therapeutic goal for certain clinical conditions Suggest. To this end, the applicant treats patients suffering from the unwanted effects of platelets. And inhibition associated with release of PP14 from platelets in such patients Several methods for targeted immunosuppression are disclosed. These methods inhibit PP14 Based on the effect of. This is an anti-PP14 antibody, a peptide that inhibits PP14 activity, Solubilized PP14 receptor and anti-PP14 receptor antibody, or them Equivalent of (eg, an active fragment thereof identifiable by standard methods) , But not limited thereto. These therapeutics Compositions or therapeutic formulations containing the agents are also disclosed.   The present invention also provides a drug that will inhibit PP14 production by the hematopoietic cells of the patient. , Including administration to patients suffering from platelet-induced immunosuppression. Antisense PP 1 4 oligonucleotides and ribozymes are involved in transcription and / or transcription of PP14. It is a suitable reagent to prevent translation. PP at the mRNA or protein level 14 The method of identifying additional reagents for inhibiting production is simple and Made easily by those who are familiar with the field.   In particular, the present invention is directed to a method of treating a patient suffering from leukemia, wherein Leukemia cells have the ability to differentiate into megakaryocytes and have PP14 polypeptide with immunosuppressive activity. Produce Petit. Inhibits PP14 function and reduces PP14 production Method is also applied in this clinical setting.   The present invention also provides anti-PP 14.1 and P for therapeutic and diagnostic applications. Production of P14.2-specific antibody and PP14 receptor is also summarized And The discovery of the second isoform in hematopoietic cells is specific to one or both isoforms. Allows the production of distinct and well characterized anti-PP14 monoclonal antibodies. A method for producing both anti-PP14.1-specific and anti-PP14.2-specific antibodies has been developed. As shown, this is the exact difference in the present invention of the amino acid sequence differences between the two isoforms. Use decision. This knowledge is the combination of PP14.1 and PP14.2 distinguishing joints. Enable the production and use of immunogens of peptides corresponding to the internal and internal amino acid sequences .   Such isoform-specific anti-PP14 antibody is the patient who is PP14 blockade treatment To determine if they would benefit from it, and the therapeutic response to such treatment. To detect the isoform of PP14 in the serum of patients to monitor the answer It is useful. In addition to this, the PP14 isoform is associated with certain species such as generalized intravascular coagulation. PP14 isoform-specific or non-specific Diagnostic analysis is useful in this clinical setting. In pregnant women , PP14 isoform-specific antibody is a PP14-derived antibody derived from hematopoietic and endometrial cells. Allows analysis to discriminate lipid peptides.   The present invention also provides a functional interaction between a PP14 polypeptide and its receptor. A polypeptide derivative of the PP14 receptor (and / or It also enables the production and use of antibodies specific for such receptors). easily Purified ligand: such as based on the use of immunoglobulin Fc conjugates Methods for cloning receptors for known ligands are well established It is done promptly by a person familiar with the field.   Therefore, it does reduce either of the PP14 polypeptide isoforms. A method of preventing PP14-induced immunosuppression thereby is the gist. PP14 Such a decrease in activity is characterized by high PP14 levels (AIDS and below). Useful in the treatment of (external) disease states. One of ordinary skill in the art would appreciate all of the various types discussed above. Methods, and (Inhibiting PP14 peptide or anti-idiotypic anti-PP14 peptide Other methods (such as use to block the body) mimic each other, ie the body Induction of PP by affecting PP14's intended function or production somewhat We will recognize that we will achieve quarantine control.   The present invention also provides a therapeutic method targeting various immunological diseases. To do. Diseases that are the subject of PP14 blockade and require reverse immunosuppression Unlike those, these other immunological diseases require exogenous immunosuppressants . According to the present invention, the isoform of PP14.2 peptide is PP14.1, or another Can be used independently of (or with) an immunosuppressive polypeptide , To provide immunosuppressive agents for pharmaceutical use. Hematopoietic PP14.2 Polypepti A therapeutic preparation of PP14 containing a peptide is PP14 consisting exclusively of PP14.1 polypeptide. More than therapeutic formulations (stability in blood and other tissue fluids) and above Regarding both the therapeutic effects for the illness described by Bolton , There are more advantages. Therefore, the PP14 polypeptide has a size in the immune system. Interleukin-1 Targeting the Tocaine Circuit: Interleukin- Soluble Interleukin-1 Receptor for Inhibiting One-Receptor Interactions In known therapeutic methods, such as those predicted for Can be used to treat PP14.2 is a natural killer cell It is also used to suppress functions.   The present invention also provides the use of hematopoietic cells as a source of PP14 having immunosuppressive activity. , Which is identical to both PP14.1 and PP14.2 polypeptides. Sometimes it offers the possibility of isolation. Furthermore, hematopoietic cells, like other cells, have the desired P Recombinant PP14.1 and PP1 which will properly process and secrete the P14 isoform As a target for cell transfection to produce 4.2 polypeptide Can be used. Complete versions of these polypeptides, as well as desired Polypeptide derivatives of these polypeptides with biological activity can be easily prepared. Can be achieved. A preferred composition is glycophosphatidylinositol PP14 polynucleotide linked to (glycophosphatidylinositol) (GPI) moiety Includes octido sequence. A variant of PP14 anchored to this membrane is expressed on the cell surface, It can be preferentially detached from the surface by the GPI membrane anchor.   The present invention also relates to PP14.1: PP14.2 heterodimers and PP14.2. Regarding the production of homodimers. The dimer consisting of PP14.2 polypeptide is P P14.1: more stable than PP14.2 homodimer and more optimal therapeutic And to provide diagnostic reagents. Heterodimer standard co-transfection method Can be effectively used to produce   Therefore, in a first aspect, the present invention provides for the reduction of PP14 in physiological conditions. Binds specifically to at least one isoform or PP14 isoform receptor Administration of a reagent to the patient whereby PP14 binds to its receptor Suffering from a non-AIDS immunosuppressive condition by preventing or reducing , The method of treating is the gist.   "Non-AIDS immunosuppression" is caused by high levels of the PP14 isoform (Or adversely affected or related). The reagent Supply of the reagent binds to the PP14 isoform (s), or its receptor And therefore neutralizes PP14 activity. An example of such a condition is generalized Platelet disorders such as intracerebral intravascular coagulation, platelet-induced immunosuppression secondary to platelet infusion , And thrombocytosis, and leukemia.   In a preferred embodiment, the reagents are specific to PP14.1-specific antibodies; PP14.2. Heterologous antibody (monoclonal or polyclonal, humanized mouse Or a non-primate antibody), and PP14.1 and PP14.2. Specific antibody, receptor for PP14 isoform, PP14 isoform Part of receptor, antibody against PP14 receptor, PP14 isoform polypeptide Peptide moiety or PP14 receptor in vivo or in vitro Other reagents that competitively inhibit the binding of PP14 to A compound selected from the group consisting of antibody antibodies or anti-idiotype antibodies. , Consist of them, or consist essentially of them. Such antibodies are humanized , I.e., the framework is human antibody and other organisms, such as a mouse. Alternatively, it may be derived from a complementary determining region from a non-human primate. The reagent is preferably PP Competitively inhibits the binding of 14 and its receptor.   In one example, the polypeptide portion of PP14 is amino acid 33 of PP14.1. Et al., Part of the polypeptide defined by 54 (ie, specific for PP14.1. But not specific for PP14.2); the reagents are (a) for PP14 Compete with PP14 for binding to (not activating) cellular receptors Anti-idiotypic antibody mimics of PP14; (b) live transduction of the receptor The extracellular domain of the PP14 receptor, which lacks the Bran and cytoplasmic domains. Or a soluble polypeptide derivative for the PP14 receptor; or (c) Soluble polypeptide derivative of PP14 receptor: immunoglobulin Fc (also May be other useful targeting polypeptides) chimeric polypeptides.   In a second aspect, the invention provides an oligonucleotide corresponding to an amino acid sequence. The probe was used to determine the amino acid sequence of the PP14 receptor, and the receptor PP by screening the library for putter clones The outline of the method is to clone 14 receptors.   In a preferred embodiment, the method comprises the sequence of an immunoglobulin Fc region (also Is a chimeric polypeptide having a PP14 polypeptide linked to its equivalent). Supply; forming a complex of chimeric polypeptides bound to the PP14 receptor Cell extracts from cells expressing the PP14 receptor under conditions suitable for Contact with Mela polypeptide: Protein A linked to an insoluble matrix Or by contacting Protein G (or its equivalent) with the complex What To precipitate the complex; recover the PP14 receptor from the matrix; Uses an oligonucleotide probe corresponding to the amino acid sequence of the PP14 receptor The cDNA library for the PP14 receptor cDNA was screened. Cloning complementary DNA corresponding to PP14 receptor including Is the way to do it.   In a third aspect, the invention provides a receptor for a PP14 polypeptide By immunizing the host in part, the receptor for PP14 polypeptide The gist of the invention is a method for producing an antibody having specificity for the above.   In a fourth aspect, the invention provides for transcription of the PP14 gene and / or PP1. Inhibition in a patient by administering to the patient a reagent that inhibits translation of the 4 transcript. The gist is the method of inhibiting epidemic control.   In a preferred embodiment, antisense oligonucleotides, rephozymes, or Nucleic acid forming a triplex or a PP14 polypeptide and / or Is used to inhibit translation.   In a fifth aspect, the invention provides isoform promoter-driven translocation of a reporter gene. By screening compounds selected for their ability to inhibit replication Thus, the gist is a method for identifying a reagent that inhibits the transcription of PP14.   In a sixth aspect, the invention provides a sample from a patient and PP 14.1 and / or Contact with antibodies or other reagents that have specificity for PP14.2 to prevent damage. Determine the amount of sample-antibody reaction relative to the amount of reaction observed in normal patients A method for identifying a patient having a disorder of platelets by the method is summarized.   In a seventh aspect, the present invention relates to amino acids 33 to 54 of PP14.1. Immunize a host with a polypeptide having an antigenic portion of the polypeptide defined by The gist is a method for preparing a PP14.1-specific antibody.   In a related aspect, the invention provides for the binding of amino acids 32-33 of PP14.2. By immunizing a host with a polypeptide having an amino acid sequence that overlaps a portion Method for preparing PP14.2 specific antibody; PP1 in a pharmaceutically acceptable buffer Pharmaceutical composition or other composition comprising an antibody specific for 4.1 or PP14.2; Raw PP14 polypeptide binds to its receptor in a pharmaceutically acceptable buffer Or a pharmaceutical composition comprising a portion of a PP14 polypeptide that competitively inhibits Other compositions; competing for binding to cellular receptors for PP14, but A pharmaceutical composition comprising an anti-idiotype antibody mimic of PP14 that does not activate or Other compositions; lacking the raw transmembrane and cytoplasmic domains of the receptor Receptor for PP14 having the extracellular domain of PP14 receptor Or other compositions comprising a soluble polypeptide derivative of Extracellular domain of PP14 receptor linked to Fc domain of immunoglobulin heavy chain A pharmaceutical composition or other composition comprising a PP14 binding portion of a peptide is featured.   "Pharmaceutical" means at least in a buffer suitable for administration to humans or other animals. It also means a composition comprising the compound also indicated as its active reagent. This term is It is used art-recognized and includes standard reagents known in the art.   In another related aspect, the invention is directed to a PP14.2 polypeptide. Of a method of treating a patient in need of immunosuppression by administering it to an elderly person And   In a preferred embodiment, the patient is an autoimmune disease, rheumatoid arthritis, allergic -Afflicted with sexual dysfunction, transplant rejection, or transplant-vs-host disease.   In another embodiment, the invention relates to a hematopoietic cell, eg, phorbol millimetre. By isolating PP14 from state acetate-derived cells, or platelets The gist of the present invention is a method for preparing a PP14 polypeptide according to the present invention; The manufactured PP14 polypeptide PP14.1 or PP14.2 is the gist.   In a related aspect, the present invention relates to a portion of the sequence encoding PP14.2. By introducing a transcription cassette with a promoter that is photo-ligated, P Method for preparing the polypeptide of P14.2; part of the sequence encoding PP14.2 Cassette having a eukaryotic or prokaryotic promoter transcriptionally linked to Having a glycosylphosphatidylinositol (GPI) site or PP14 receptor of PP14 polypeptide linked to its equivalent cell surface binding moiety The subject matter is a composition containing a ter-binding moiety.   In yet another related aspect, the invention provides a cell surface signal sequence. To express the PP14 polypeptide bound to the cell targeting signal sequence ( For example, PP1 linked to glycosylphosphatidylinositol (GPI) Cells by a transcription cassette containing a nucleic acid encoding a portion of the 4 polypeptide Transfection; then cleaving the signal sequence with a cleavage reagent, which By releasing PP14 polypeptide into the ground and subsequently recovering it, PP14 The gist of the method is to produce a polypeptide.   The present invention also provides a specific binding pair (eg, a stereo with a biotin-binding domain). PP14 Receptor Binding to Part of a Member of Ptoavidin and Avidin) A composition comprising a portion of a polypeptide; and purified or recombinant PP1 4 receptor, PP14 receptor antibody, anti-idiotype antibody, and the same Purified nucleic acid encoding the same; PP bound to a GPI site on the cell surface In order to express 14 polypeptides, glycosylphosphatidylinositol ( GPI) signal sequence, which binds to a specific signal sequence present on the cell surface A transcription cassette containing a nucleic acid encoding a portion of a PP14 polypeptide. The cell is also its gist.   “Purify” means that the composition is naturally occurring and the active ingredient is not The difference in high purity compared to one or the other compounds with which it is means. “Recombinant” means that it is produced by a genetic engineering method, for example, Means it was expressed from a cloned gene or its equivalent .   The present invention also relates to heteromeric PP14.1 and PP14.2 polypeptide chains. A composition comprising a chimer or a homomultimer of PP14.2 polypeptide chains, And co-transfect cells with PP14.1 and PP14.2 transcription cassettes The gist of the method is to produce such a heteromultimer.   In another aspect, the invention provides for natural killer cell activity in such cells. Method for inhibiting phospholipase by contacting it with a PP14.2 polynucleotide; For example, to covalently attach a polypeptide moiety such as GPI or its equivalent. Thus, PP modified to target the cell surface (eg, antigen presenting cells) 14 polypeptides; and using such targeted PP14 polypeptides Therefore, the method of coating antigen-presenting cells is the gist thereof. Especially PP14-GP The I chimeric polypeptide targets the surface of antigen presenting cells or PP14. -Streptavidin polypeptides target biotin-coated cells Will. Such cells will bind to PP14 as discussed herein. It is useful in therapeutic or diagnostic methods based on detection of binding.   Other features and advantages of the invention include the following description of the invention and preferred embodiments. It will be apparent from the claims.Description of preferred embodiments   First, the drawings will be briefly described. Drawing   Fig. 1 shows leukemia cells in which PP14 mRNA expression differentiates along megakaryocyte lineages. And transfer-specific RNA transfer blots Is. Uninduced or induced K562, HL-60, U937 and And total RNA from the PLB-985 strain was treated with purified PP14 probe. I probed. K562 cells were 0, 24, 48 and 7 with PMA (10 nm) 0, 24 along the line of megakaryocytes for 2 hours or by hemalin (50 μM), It was induced along the erythroid lineage for 48 and 72 hours. HL-60 cells are PMA 0 or 48 hours at (10 nm) along the macrophage lineage or DMSO (2%) were induced along the lineage of neutrophils for 0 or 48 hours. U937 cells Induced by PMA (10 nm) for 0 or 48 hours along macrophage lineage PLB-985 was also administered by PMA (10 nm) for 0 or 48 hours. It was induced along the crophage lineage. After being stimulated by anti-CD3 antibody for 3 days Tree cell mononuclear cells (PBL) served as negative controls. Pair with PP14 mRNA The corresponding approximately 800 bp band is indicated by the arrow head.   FIG. 2 shows the reaction of PP14 expression after PMA induction, 6 hours after the inducer treatment. It shows that PP14 mRNA can be detected during the period. PMA (10 nm) induced K5 for 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12 or 24 hours Total RNA from 62 cells was isolated and hybridized to purified total probe.   Figure 3 shows oat PP14 immunoprecipitates from PMA-induced K562 culture medium. It is a copy of the radiogram. K562 cells35S-cysteine and35S-Me 24 hours in cysteine- and methionine-free medium supplemented with thionine Was labeled by culturing for 48 hours. Remove cells and use supernatant for protein F And immunoprecipitated with anti-PP14 polyclonal or monoclonal antibody (Ab) I gave it up. Bound product was run on a 12% PAGE-SDS gel under reducing conditions. I let you. The expected mobilities of PP14.1 and PP14.2 were observed. Also, 28 kD band (representing PP 14.1) within 24 hours due to long exposure Becomes visible.   Figure 4 shows K562 induced by PMA during mitotic proliferation stimulated by alloantigen. Shows that the potential inhibitory effect of conditioned medium can be neutralized by anti-PP14 antibody , Bidirectional mixed lymphocyte culture. K562 cells induce PP14 expression For 24 or 48 hours with PMA (10 nm). Conditioned medium is rabbit po 50% v / v with or without reclonal anti-PP14 serum (1: 100 dilution) Was added to mixed lymphocyte culture (MLC). MLC is 5, 6, or 7 Harvested and taken in on the day3The cpm of H-thymidine was counted. Values are triplicate cultures Represents the average value of and the experiment was repeated twice, and similar results were obtained. Normal rabbit Serum or anti-TGFAbs are effective against the observed inhibition by conditioned medium. No fruit was observed (data not shown).   5a-5c schematically show PP14.1 and PP14.2 mRNA, The differences in nucleotide and amino acid sequences between individuals are emphasized. Figure 5a: PP14 remains Schematicize exon-1 and exon-2 along the gene's intron-1, The two halves of exon-2 are differently shaded; exon-2 The upstream part of the is removed from PP14.2 mRNA by alternative splicing It Dashed lines are stretches of sequences deleted by such alternative splicing Is shown. Figure 5b: Nucleus of the part of the PP gene involved in another splicing event. The octido sequence is shown. Common splice donor (SD) site and two separate splices The rice acceptor (SA) site is highlighted by an arrow and the splice site Reotide should be boxed. Figure 5c: Deletion in PP14.2 polypeptide The amino acid sequence of the PP14.1 portion is boxed. Numbers are PP 14.1 amino The boundaries of the deletions based on the numbering of the acid sequences are shown.   Figure 6 PP in PMA-induced K562 cells and placental cells of the megakaryocyte lineage A PP14-specific primer capable of discriminating between 14.1 and PP14.2 mRNA species Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis used. PP14. 2 mRNA is present in significant amounts only in K562 cells, 18, 28, 36 and 3 It is not present in placental cells collected from 7-week-old placenta. Include molecular weight numbers on the right It was   Figure 7 is an RT-PCR analysis using PP14 specific primers, PP1 4 expression is restricted to hematopoietic and reproductive system tissues, and PP14.1 and Both isoforms of PP14.2 were found significantly and in hematopoietic cells, PP14.1 isoforms. It is shown to be expressed at equimolar levels. 3'-end for PP14 A total of 2.5 μg of RNA was reverse transcribed using specific primers. Obtained Organisms were used directly in PCR reactions with 5'-end specific primers for PP14 . Lane 1: uninduced K562 cells. Lanes 2 and 3: 24 and 48 hours, respectively. PMA-induced K562 cells in between. Lane 4: brain. Lane 5: spleen. Lane 6 : Small intestine. Lane 7: liver. Lane 8: kidney. Lane 9: Meninges of the brain. Lane 10: KM-102 bone marrow fibroblast matrix cells. Lane 11: placenta at 18 weeks. Lane 12 : Placenta at the time of delivery. Lane 13: fibroblast. Lane 14: Primer alone . Lane M: molecular weight marker. The arrow indicates PP14.1 and the same as the molecular weight marker. The relative part of PP14.2 is shown.Platelet-derived PP14 isoforms and dimers   Placental protein 1 named after the placenta originally thought to be derived from it 4 (PP14) was later shown to be derived from related endometrial tissue. (Vaisse et al., 9 DNA Cellular Biology ( DNA Cell. Biol. ) 401, 1990). Subsequent research shows that PP14 Is shown not only in the uterine decidua of pregnant women and serum but also in the semen of men Was done. Applicants have discovered that PP14 is also produced in extra-genital cells. P P14 mRNA and protein are induced to differentiate along the megakaryocyte lineage Not only in human leukemia cell lines, but also in the final cells of that line, namely in platelets. The existence has been identified. Cloning and hybridisation of PP14 mRNA In addition, the pups were further analyzed by the ization analysis and the immunoprecipitation analysis of PP14 protein The inner membrane PP14 consists of a single dominant species, while (PMA-induced K562 detected It has been established that the hematopoietic lineage PP14 consists of two codominant species. PP1 One of the 4 mRNA species migrates with the endometrial PP14 mRNA while the other The two are shorter. The latter is missing 22 amino acids in the encoded protein. Includes internal deletions that are predicted to result in loss. These two mRNA species and Undeleted and deleted mutations to simplify consideration of the encoded protein product The bodies (designated PP14.1 and PP14.2, respectively) are given.   A suitable splice at the site within exon-2 where the PP14.2 deletion ends. Identification of the S. acceptor consensus sequence It is shown to occur by alternative splicing.   PP14.1 and PP14.2 polypeptides and their corresponding mRNAs Was observed in PMA-induced K562 cells in equimolar amounts. In the case of lineage cells, the two are consistent with the idea that they form heterodimers. Obedience Previous studies have shown that endometrial PP14, which consists of PP14.1, is easily resolved by antibodies. It is suggested that they consist of weak homodimers that are separated. Megakaryocyte lineage immunity The situation of PP14.1 and PP14.2 in epidemiological sedimentation was : As in the PP14.1 homodimer, relatively undissociated by the antibody Forming a stable heterodimer, or a monoclonal antibody Suggests cross-reactivity with shape. PP14.1 does not function as a monomer, And since PP14.1 homodimers are easily dissociated, as disclosed in the present invention, , PP14.1: PP14.2 heterodimers for use in immunotherapeutic applications It provides a more stable homodimer alternative. In addition, the data is PP 14.1 E Eliminates the presence of PP14.2 homodimers, which may also have higher stability than modimers Remove.   (American type culturec K562 human myeloid leukemia cells (available from Differentiation along the megakaryocyte lineage by 12-myristate 13-acetate (PMA) Model cells that can be induced to activate and address molecular outflow in megakaryocyte cell lines Provide the system. Equivalent cell lines can be isolated by methods known in the art. Scarecrow A megakaryocyte marker known to be expressed by cells IIIa (gpIIIa), platelet derived growth factor (PDEF) α and β chains, And transforming growth factor β (TGFβ) (Alitalo, 14 Liu Chemia Research (Leukemia Res.) 501, 1990). Megakaryocyte system To examine changes in mRNA expression profile associated with K562 differentiation along the lineage To clone and identify novel genes associated with megakaryocyte differentiation and platelets , Clones mRNA expressed during differentiation after PMA induction in K562 cell line For this, a differentiated cDNA screen was applied.Example 1: Myeloid cell differentiation   Human myeloid leukemia cell line K562 (ATCC243) was heat-inactivated with 10% fetus Calf serum (FCA), 10 mM HEPES, pH 7.2, 40 μg / ml Gen RPMI medium supplemented with tamycin and 2 mM glutamine (Whittaker Maintained in Whittaker Bioproducts). Cells are 5% CO2 Were grown at 37 ° C. Phorbol ester used to induce differentiation Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma )), Which is diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) and used until It was stored at -20 ° C in 1 mM-3 mM. The final concentration of PMA is 100 nM and The range was between 10 nM. To measure the effect of PMA on K562 differentiation K562 cells in a tissue culture flask at 2 x 10FiveCultured at cells / ml. P MA was added directly to the flask and cells were harvested 24, 48 or 72 hours after addition. It wasExample 2: Cloning of the PP14 gene   Pools of 3 groups of K562 cells induced with PMA for 24, 48 and 72 hours separately. , A phage cDNA library was constructed. Such pools are stochastic K5 62 Best chance to find different genes activated through differentiation program Selected to grow. Replication of "derived" K562 cDNA library Ft is subtracted (induction minus non-induction K562) and non-subtracted (non-induction K562) 562) Differentially screened with single stranded probe.   Total RNA using standard guanidinium isothiocyanate / cerium chloride method Was isolated from the cells. Poly (A) + RNA using oligo (dT) cellulose Isolated. PMA (100 nM) for 24, 48 and 72 hours (4.5 μg total) A cDNA library was constructed using poly (A) + RNA). The library Is the manufacturer's recommendation (Stratagene, La Jolla ), California) and using the Uni-ZAP XR cloning kit. It was   To differentially screen the derived K562 cDNA library In addition, 60,000 individual primary clones were used to produce PLK-F 'strains (Stratagene). (Stratagene)). Stratagene Duralon U.V. The membrane was used to collect duplicate membrane lifts. The membrane was washed with 1.5M NaCl-0.5M NaO. Denatured by incubating in H for 4 minutes, 1.5 M NaCl-0.5 Neutralize for 5 minutes in a solution of M Tris-HCl (pH 8.0) and finally Lis-Cl (pH 7.2) -2 × DDC (1 × SSC: 150 mM NaCl-15 Rinse in mM sodium citrate, pH 7.0). The DNA was labeled with U using UVStratalinker1800 (Stratagene). V-crosslinked and the filter dried.   Membranes for primary screen were non-subtracted from untreated K562 cells (non-induced). PM562-treated K562 cells hybridized with a single-stranded cDNA probe (induced) From the replication lift hybridized with the single-stranded cDNA probe It was Secondary and tertiary screens were screened for single-stranded cDNA from untreated K562 cells. Non-subtracted single-stranded cD from PMA-treated K562 cells hybridized with Compared to replication lift hybridized with NA probe. Uninduced cDNA Untreated K, respectively to generate lobes and non-subtractive induction cDNA probes. 1 μg poly (A) + from 562 cells or from PMA-treated K562 cells RNA was added to 100 μCi {α-32P} dCTP (Amersham, A Arlington Heights, Illinois, 10U Superscript Reverse transcriptase (Bethesda Research Labs) , Geiselsberg, Madison), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2And 0.1m with 0.1mM DTT M oligo (dT)12-18Primer, 0.5 mM of each dATP, dGTP, dTT Reverse transcription was performed in a buffer containing P at 37 ° C. for 1 hour. Unlabeled d for the last 15 minutes CTP was added to 0.5 mM. After this RT reaction, RNA at 65 ° C for 30 minutes During this period, the single-stranded cDNA was hydrolyzed in 100 mM NaOH and the Bio-Spin 30 Play through Bio-Rad, Richmond, CA. Isolated nucleotides were removed.   24, 48 and 72 hours PM to generate subtraction induced cDNA probe Pool 0.33 μg poly (A) + RNA from 0K562 cells treated with A. (Total of 1.0 μg of poly (A) + RNA), and 250 μCi {α-32P} d Reverse transcription was performed as described above, except that CTP was used. RNA hydrolysis and And cDNA precipitation, followed by a 30-fold excess of photobiotinylated cells from untreated K562 cells. Anneal with Re (A) + RNA and follow manufacturer's instructions (Invitrog en), San Diego, CA).   50% deionized formamide, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 0% dextran sulfate (MW 300000), 1M NaCl, and denaturing shear Strained salmon sperm DNA (Sigma) in 150 μg / ml at 42 ° C. overnight The membrane was prehybridized. Add a single-stranded cDNA probe and rotate 42 ° C in Bun (Hybaid, Middlesex, UK) Incubated for 48 hours. Lift at 22 ° C. for 10 minutes, 2 × SSC, 1 Wash twice in SDS, then at 65 ° C. for 30 minutes, 0.1 × SSC, 0.1% Washed 3 times in SDS. At -70 ° C, use intensifying screen if necessary, film Was exposed to Kodak AR film.   Approximately 60,000 cDNA clones were analyzed and after the first round of screening, 127 putative positives were selected. All clones are randomly analyzed and sequenced Then the Genbank sequence database (Pearson et al., 85, Pro. Seedings of National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. ) USA 2444, 988), after comparison with 127 cdN Two of the A clones were identified as PP14.Example 3: PP14 mRNA expression   Demonstration of PP14 mRNA expression in K562 and confirmation of its PMA inducibility Confirmation was achieved by RNA transfer blot analysis (see Figures 1 and 2). See).   Total RNA (10 μg) was isolated as described above, 50% formamide, 6% Formaldehyde, 1 x EPPS (N- (2-hydroxyethyl) -piperazine -N'-3-propanesulfonic acid) buffer (1 x EPPS buffer: 20 mM E PPS (pH 8.2), 10 mM sodium acetate (pH 5.2), 2 mM EDT Heat in A) to 65 ° C. for 15 minutes, 1 × EPPS buffer and 6% formal Separated on a 1.2% agarose gel containing dehydrate. RNA is passively Duralon Transferred to a UV membrane (Stratagene) and UV crosslinked. probe Was produced by using 20 ng of purified PP14 DNA as a random origin. Let Denature the DNA by heating to 100 ° C. for 10 minutes, then Random Hexanucleotide (Boehringer Mannh eim), Indianapolis, Ill.) in a buffer containing 50 μCi {3 2 P} dCTP (Amersham), 0.2 mM of each dGTP, dTT Incubate for 30 minutes at 37 ° C in P, dATP and 10 U Klenow enzyme did. The probe was hybridized overnight at 42 ° C. Wash the membrane and Especially exposed.   In particular, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12 and 24 from uninduced K562 cells. Cellular RNA from induced K562 cells induced with PMA (10 nM) for hours labeled P P Hybridized with 14 cDNA probe. PP14 mRNA is uninduced K5 It was undetectable in 62 cells and became apparent within 6 hours of PMA treatment (Fig. 1). P P14 mRNA reached plateau levels at 24 hours and up to at least 72 hours It remained relatively constant (Figures 1 and 2). Corresponds to almost 0.8 kilobase length A single broad PP14 mRNA band was observed in all cases Consistent with the size reported for membrane PP14 mRNA.Example 4: Cell specificity of PP14   PP14-induced events are cell, lineage, and / or inducer specific Induction of several leukemia lines with different chemical inducers to determine (Fig. 2). PM562 induction of K562 along the megakaryocyte lineage is associated with high levels of PP14 While associated with mRNA accumulation, the red blood cell lineage (Anderson et al., Hemin of K562 cells along 278 Nature 364, 1979) (50 μM) induction did not show similar PP14 activation. Another amphibian The leukemia line HL-60 was tested for PP14 inducibility. Bone marrow-monocyte system T. (Rovera et al., 76, Proceedings of National Aca. Demy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 2779, 1979) that differentiates along PMA-induced HL-60 cells or neutrophil lineages. DMSO-treated HL-60 cells that differentiated by Did not show. Similarly, for two other leukemic lines U937 and PLB-985 , PMA induction along the bone marrow-monocyte lineage did not induce PP14 mRNA expression It was The integrity of the mRNA used from these various leukemia lines was determined by It was confirmed using a probe (data not shown). Therefore, PP14 is simply Volvo It does not seem to be a luster responsive gene. In addition, these The data suggest that PP14 is not expressed indiscriminately on leukemic cells. Instead, these data show that PP14 and PMA-induced K562 cell megakaryocytes. Consistent with the idea that there is a specific relationship with the lineage.Example 5 :Expression of PP14 protein   Whether PP14 mRNA of hematopoietic system is actually translated into PP14 protein Immunoprecipitation analysis was performed to confirm   5562 K562 cells6Culture in cells / ml and treat with PMA as above did. Cysteine and methyl supplemented with 10% FCS, fully dialyzed in PBS In an onin-free medium, 0.5 mCi35S-cysteine and35S-Met Onin (ICN Biomedicals, Inc.) California Cells were labeled with Irvine, Calif.). The next day, centrifuge the cells. And conditioned medium was supplied. The cells were treated with 1% triton X-100, 1% bovine serum albumin (BSA) and 1 mM fluorinated phenylmethyl sulfo Dissolved in Nil (Sigma). The conditioned medium was used directly. protein- G-Sepharose (Pharmacia), Ni Cell lysates or strips in Piskataway, NJ, New Jersey 50% slurry of Protein-G Sepharose 1 after clarifying the medium in advance 00 μl of anti-PP14 mouse monoclonal antibody (105DH1F1; Riittinen et al., P. 136, Journal of Immunological Meso Woods (J. Immunol. Meth.) Vol. 85, 1991) with 2 μl. Yu Incubate at 4 ° C overnight with gentle agitation and then centrifuge the beads. Pellet with: 5% in 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA Then 0.01M Tris-HCl (pH 8.0), 0.14M NaCl, 0 0.025% NaN3Once in; finally, 0.01M Tris-HCl (pH 7.5) ) Washed once in). The bound protein is eluted by boiling to remove the 3% stack Electrophoresis on a SDS-PAGE gel at 15% resolution. Dry the gel , -70 ℃, using Kodak XR film (Kodak XR film ) Was exposed to.   K562 cells,35S-cysteine and35Metabolism by combination of S-methionine More labeled. Then, anti-PP14 mouse monoclonal antibody or poly Conditioned media and cell lysate extracts were immunoprecipitated using lonal antibody. PM K562 cells showed PP14 protein only in the A-induced conditioned medium, but uninduced It was not observed in the food (Fig. 3). Importantly, the two protein species are 28 Recorded in the kilodalton size range, the upper one is purified endometrium Migrated with PP14 (data not shown). The two PP14 isoforms are approximately It was present in equal amounts. PP14 was found in the cytolytic extract of uninduced K562 cells Not detected, only a small amount of PP14 was detected in the extract of induced K562 cells. It is consistent with the secreted protein PP14 (data not shown). Therefore, PP14 White matter shows PP14 mRNA in its PMA-inducibility in K562 cells. Is equivalent toExample 6 :Biological action of PP14   To evaluate the effect of conditioned medium from K562 cells on peripheral blood lymphocyte proliferation For this purpose, bidirectional mixed lymphocyte culture (MLC) was prepared as follows. Of two Blood from an irrelevant donor was collected in heparin (10 U / ml blood). blood Diluted twice in 1 × PBS; 0.3 volume of ficoll-paque (Pharmacia, Sweden, Uppsala, Sweden )) Was layered on the underside and then centrifuged for 30 minutes (1000 × g). The white blood cell layer After removal and washing 3 times with 1 × PBS, lymphocytes were counted in a hemacytometer. 2x10 cells in 96-well plateFiveThe cells / well were cultured in 3 sections. Use When added, the supernatant was added to the cell culture well at 50% v / v. At 1: 100 dilution, The antibody was added directly. Cells were cultured for 5-7 days as described above. Harvest 12- 15 hours ago, 0.5 μCi [[3H] Thymidine (New England New Culler (New England Nuclear), Boston, Massachusetts MA)) was added to each well. MiniMash II cell harvester  II cell harvester) harvested the cells on the filter and dried the filter. Later, in 1 ml scintillation cocktail, Beckman (Fullerton, CA) LS3801 Beta ・ Measured at the counter.   In a previous study, endometrial PP14 was a potential suppressor of lymphocyte proliferation. Is shown to be PP14 of hematopoietic cell origin has this immunoregulatory effect. In order to evaluate whether or not to perform, the conditioned medium from PMA-induced K562 cells is Add to mixed lymphocyte cultures, days 5, 6 and 73Incorporation of H-thymidine The effect on proliferation, as measured by In these experiments, the conditioned medium was Added to the MLC in a ratio of 1: 2. In the positive control MLC, two irrelevant When co-cultured with lymphocytes from related individuals, the peak altitude on days 6 and 7 Was detected (data not shown). 24 hours (Fig. 4) or 48 hours (data (Not shown) Prominent growth when PMA-induced conditioned medium from K562 was added Suppression occurred but not from uninduced K562.Example 7 :PP14 antibody blocking   Inhibition of lymphocyte proliferation affected by PMA-induced K562 conditioned medium In order to prove that this is due to the presence of PP14 protein, antibody-blocky Experiment was performed. It is known to efficiently immunoprecipitate PP14 protein Rabbit polyclonal antiserum against purified PP14 Was added to the co-culture containing Anti-PP14 antiserum (1: 100 dilution), 7 days By the time, K562 induced for 24 hours (Fig. 4) and 48 hours (data not shown). The anti-proliferative effect of the conditioned media was reversed for both of the conditioned media. Therefore, P P14 is clearly associated with the immunosuppressive effect of K562.   The anti-proliferative activity of PMA-induced K562 conditioned medium was Japanese Anti-Transforming Growth Factor (TGF) β Monoclonal Antibody (R & D R & D Systems, Minneapolis, Minnesota MN)) was not affected (data not shown). T562β is K562 It has been reported to be produced by cells, and in addition, TGFβ is Present TGFβ, which is known to inhibit replication, is an active immunomodulator It can be assumed that it has not been broken down into morphology. Importantly, PP14 is functionally active It does not require proteolytic degradation for oxidization.Example 8 :PP14IsoformMRNA species   Whereas immunoprecipitation analysis clearly distinguished the two PP14 polypeptide isoforms However, RNA transfer blot analysis revealed that the The mRNA species of PP14 that became deficient was not clearly elucidated. However, RN In a re-experiment with a weak exposure of the transfer blot of A, the PP14 probe was used. The presence of a strong duplex that hybridizes was suggested. This in more detail For the purpose of study, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) cloning and And analysis was performed.   For PCR analysis of PP14 mRNA, PP14 specific primers (5 ' -GGATCCCATGCTCCCAAGGGTTTATTAATAACCTCT Total RNA was reverse transcribed as described above using GC-3 '; SEQ ID NO: 1). 25 mM TAPS-HCl (pH 9.3), 50 mM KCl, 2 mM MgC l21 mM DTT, 200 μM each dATP, dCTP, dGTP, dTT P and 2.5 U Tack Polymerase (Perkin Elme r) 5'Pur in buffer containing Norwalk, CT. Limer (5'-GGTACCGCTCCAGAGCTCAGAGCCACCC ACAG-3 ': SEQ ID NO: 2) and 3'primer (5'-GTGCAGACAC GATCTCCAGGTTG-3 '; SEQ ID NO: 3) was used to PCR the resulting product. Amplified. Amplification is based on the PTC-100 thermal cycler (PTC-100 t hermal cycler (MJ Research, Massachusetts) At 65 ° C for 1 minute at 94 ° C in Watertown, MA For 45 seconds and then at 72 ° C. for 1 minute for 25 cycles. The PCR product is Analyzed on a 1.2% agarose gel stained with EtBr.   First two PP1 obtained through different cDNA screens (supra) 4. The cDNA clone is a portion including only the 3'-end of PP14 mRNA. It turned out that it was nothing more than a clone. PC with full-length PP14 cDNA R cloning was performed using a primer (5'-CATG) specific to the 3'-end of PP14. CTCCAAGGGTTTTATTAATAACCTCTGC-3 '; SEQ ID NO: 4 ) And then reverse transcribed as described above. . 3'-end specific primer and 5'-end specific primer (5'-A For GCTCAGAGCCACCCACAGCCGCAG-3 '; SEQ ID NO: 5) The product obtained was used directly in PCR (described above). The PCR product Gel purified and cloned into T-vector.   PP14 mRN of K562 (identical to PP14 mRNA sequence of endometrium) A -Based primers and published 5'-of endometrial PP14 mRNA Using the end sequence, the full-length c of PP14 from PMA-induced K562 mRNA The DNA was RT-PCR cloned. DNA sequencing is based on Taber and Licha Seed by sequencing method and industry recommendations by Tabor and Richardson QuenaseRSequencing kit (SEQUENASER) (United Stay United States Biochemicals, Cleveland (Cl eveland)) and. By sequence analysis of PP562 clone of K562 , An expected 22 amino acids as a result of an in-frame deletion of 66 nucleotides in length The encoded PP with the significant difference that the acid was deleted in the encoded protein It was revealed that the 14 protein was identical to PP14 in the endometrium (Fig. 5). Analysis of the genomic PP14 structure revealed that this deletion was paired with the upstream end of exon-2. Therefore, the consensus splice acceptor site should be a suitable site within exon-2. It was detected at the site. This in the generation of short PP14 mRNA variants He points out another splicing as an operating mechanism.   The PCR product using the PP14 terminal primer was size-fractionated into agarose Two distinct PCR products were visible when visualized on the gel (Figure 6). The two mRNA species were converted to PP14.1 and PP14.2 (the latter being a small RNA species). (Corresponding). The size difference between these two PCR products is due to PCR -Documented in cloned K562 PP14 mRNA Consistent with a 66 nucleotide deletion. Noteworthy is the mRNA of PP14.1 Only the variant was easily detected in the endometrium.Example 9 :Detection of PP14 protein in platelets   Immunoprecipitation from platelets was performed from platelets isolated using modified citrate buffer. It was. Briefly, citrate / phosphate / dextrose per 10 ml whole blood / 1.4 ml CPDA, which is an adenine anticoagulant (CPDA is 15.8 mM Citric acid, 91.3 mM sodium citrate, 16.6 mM dextrose, Contains 1.7 mM adenine and 16.6 mM monobasic sodium phosphate) Whole blood was collected inside. The cells were centrifuged at 200 xg at 22 ° C for 10 minutes. Upper side Small blood Plate-rich plasma (PRP) is removed and the platelets are treated with normal Ringer / citrate / dexamethasone. Stroze, pH 6.5 (RCD), 71.9 mM NaCl, 0.7 mM KC l, 0.6 mM CaCl2, 0.8 mM NaHCO320 mM tri-citrate Thorium, 27.8 mM dextrose, 43 ng / ml prostaglandin E1(PGE1, Sigma Chemical Co, St. Louis ． Louis)))). Between the washes, the platelets It was centrifuged at 1,100 × g and 22 ° C. for 15 minutes. 50 mM sodium phosphate ( pH 7.0), 1% NP-40, 150 mM NaCl, 2 μg / ml leupe Modification containing putin, 2 μg / ml aprotinin, 20 μg / ml PMSF The blood platelets were resuspended in lysis buffer after the last centrifugation by Reductive methylation of the platelet extract was performed. NaCNBrH3(Sigma) Add to 50 mM, [14C] Formaldehyde (Amersham) Was added to make 10 mM. The mixture is reductively methylated at 37 ° C for 1 hour. It was Following methylation, the reaction was dialyzed overnight in 1 × PBS and then the next morning. NaCNBrH remaining after dialysis in 1 × PBS for 1 hour3and[14C ] Formaldehyde was removed. After dialysis, immunize with radioactive extract as described above. It was sedimented and analyzed.   As described above, PP14 was found in PMA-induced K562 leukemia cells. However, it was not found in hemin-induced K562 leukemia cells. , Together with the absence of PP14 in other PMA-induced leukemia systems, PP14 expression in MA-induced K562 cells is between PP14 and the platelet lineage. It was demonstrated that it reflects the relevance. To confirm this point, Immunoprecipitation / SDS using anti-PP14 polyclonal antibody and platelet extract -A PAGE analysis was performed. Two PP14 polypeptides are present in the platelet extract Was obtained (data not shown).Example 10 :Screening of PP14 by PCR   Findings of PP14 mRNA and protein in hematopoietic cells such as bone marrow megakaryocytes Screens for additional tissue sites outside the reproductive tract for the presence of PP14 mRNA. Inspired Ning. Sensitivity was optimized using PCR analysis. Isolated from anatomy Reverse transcription of total cellular RNA using a PP14-specific primer (SEQ ID NO: 1) The same oligonucleotide as the 3'primer and two PP14 m Using a 5'primer (SEQ ID NO: 2) designed to clarify the RNA variant Amplified. As shown in FIG. 7, PMA-induced K562 cells served as a control PP14.1 and PP14.2 were detected and clearly elucidated (ray 2 and lane 3). In addition (contaminated with contaminated uterine decidua containing PP14 Placental tissue also, as expected, only large mRNA variants of PP14.1 Is shown (lane 11 and lane 12). In contrast, the other organizations The panel was all negative for PP14 transcripts. These tissues include the brain ( 4), spleen (lane 5), small intestine (lane 6), liver (lane 7), kidney (lane 4). Lane 8) and meninges (lane 9). Similarly, two fibroblast cell lines , KM-102 (human bone marrow stromal cells; lane 10) and dermal fibroblasts (Leh). 11) was also negative. Therefore, the expression of PP14 mRNA is It seems to be limited to the hematopoietic system.Method   Is there a constitutively active immunosuppressive molecule present in cells of the platelet lineage? Is physiologically important, suggesting a previously unexpected role for PP14. ing. These data indicate that this potential immunosuppressive molecule causes tissue coagulation to occur. It is shown that it is concentrated in the place. Therefore, PP14 is the It seems to play a role in resolution of the inflammatory process. Therefore, this finding is It represents a previously unknown critical molecular link to the epidemiological system.   The finding that PP14 is produced by cells of the platelet lineage is driven by platelets. It leads to new therapies that reverse the immune suppression that is driven. Female and male germplasm Was previously suggested to have a physiological role as a blocker of allo-reaction in PP14 was thought to be the preferred molecule. The present invention is applicable to coagulation disorders. As a common immunosuppressive agent released by platelets in some clinical situations That PP14 may also be a harmful molecule in the pathophysiological role of Disclose. This finding develops methods to block PP14 and its immunosuppressive effects Provide the first motivation to do so. A method of achieving this PP14 blockade is disclosed. this Those methods that interfere with the interaction of the PP14 protein with the PP14 receptor. And methods of inhibiting PP14 transcription and / or translation (ie, P P14 blockade therapy).   The study of human leukemia cell lines reported in this experiment showed that PP14 It is not expressed indiscriminately in. actually, Even in K562 after chemical induction with one special chemical inducer Only it is expressed. Nonetheless, under in vivo conditions Is a myeloid leukemia cell capable of differentiating K562 megakaryocytes and expressing PP14. Can be triggered to a more differentiated state. This can be voluntary or curative. It can occur in response to medical agents. Under such conditions, PP14 will Suppressive function plays a pathogenic role in blocking effective anti-tumor immune responses Is predicted. Secreted as indicated for K562 leukemia cells herein. PP14 is the biologically active form. The present invention relates to P in serum of patients. A method of detecting P14.2 is provided. Such methods treat leukemia or related diseases. Easily applied to affected patients to determine if they are candidates for PP14 blockade therapy it can.   Examples of the therapeutic method and diagnostic method of the present invention will be added below. Implementation of these The examples are not intended to limit the invention, and one of ordinary skill in the art will appreciate that there are many within the scope of the claims. It will be appreciated that equivalent methods and reagents of can be found.PP14 blockade treatment   Elevated levels of one or both PP14 polypeptide isoforms in serum The patient is a candidate for PP14 blockade therapy. Such an increase in PP14 level is It can occur in various disease states where the plate releases excess PP14 into the bloodstream. For example, It is a condition that leads to the release of platelet contents into the blood as platelet coagulum. Certain sporadic intravascular aggregations and sepsis are often associated. To this clinical condition Released at 14 contributes to systemic immunosuppression, which in turn leads to sepsis Make it worse. Therefore, PP14 blockade inhibits and restores this pathogenic cycle Acts to help.   The first step is to identify patients in need of PP14 blockade therapy. Reach this A preferred diagnostic method for making it is described below. In general, PP 14.1 Is higher than normal tissue or serum levels of PP14.2 or both. Bell patients are treated by the method of the present invention. Such levels were antibody-based It can be measured by using an assay.   The present invention discloses that PP14 blockade may have therapeutic benefits. PP14 Methods to block the action include blocking the protein to reach a therapeutic end point Standard methods are included. For example, monoclonal antibodies and / or poly The lonal antibody was labeled with PP14 with specificity for the two isoforms of PP14. It can be used as a blocking agent. Antibodies specific for PP14 have been previously described. But only suggests that the therapeutic benefit is treatment of immune system deficiency , The only example provided is AIDS, for the two PP14 isoforms , And the isoform specificity of the antibody was still unknown. The present invention According to the findings of PP14.2 isoform in It has enabled the development of antibodies with opposite isomers and their therapeutic use. Thus , The invention is characterized by an excess of PP14 in the patient or tissue. How to treat all other non-AIDS-disorders (or even other immune system deficiencies) The summary will be given. The present invention also relates to all diseases associated with elevated PP14 levels. The use of PP14.2-specific antibodies for the treatment of is also summarized.   A preferred strategy for generating anti-PP14.1-specific antibodies is lacking in PP14.2 Peptides that are largely restricted to amino acid sequences within the PP14.1-specific sequence Immunize. Alternatively, the binding between this sequence and the rest of PP14.1 It is also possible to use partial overlapping peptides as well as other PP14.1 sequences. rear In the case of the human, it has cross-reactivity with both PP14.1 and PP14.2. Antibodies can be removed by standard methods.   A preferred strategy for generating anti-14.2-specific antibodies is to insert the PP14.1 sequence. Immunization with peptides spanning the junction corresponding to the site where the entry exists. Standard A canonical peptide immunization protocol can be used.   Using a PP14 peptide having only a portion of the native PP14 polypeptide, P Compete for interaction between P14 and the receptor for PP14 (PP14 receptor) That are non-specifically mediated by the native PP14 polypeptide. Heterologous immune suppression can be prevented. Competitive peptide inhibition and / or site feature Using in vitro experiments based on direct mutagenesis, It is possible to localize a suitable PP14 subsequence that performs such a block, It can be performed by those skilled in the art based on standard methods. A good outcome is generally a parent It is consistent with the stretch range of the aqueous amino acid sequence. In addition, should be treated Strategies to optimize schedules for in vivo administration to patients are well known. Have been.   Similarly, in its ability to bind to its receptor, anti-mimicking PP14 -Idiotypic antibodies can be used to competitively block the PP14 receptor It Methods of making such anti-idiotype antibodies and methods of using them are well known in the art. It is well known to those skilled in the art and, inter alia, well in the literature of infectious diseases.   In addition, in order to block the PP14: PP14 receptor interaction, PP14 itself is blocked. It is also possible to focus on the PP14 receptor instead of the body. Ligand purified Purification and cloning of the receptor is available to those of skill in the Will be a simple task. Prior to the present invention, the PP14 receptor was forcibly purified and purified. There are no published publications that provide therapeutic reasons for becoming established. In addition, two different PP If there is no prior knowledge that the 14 isoform exists, the PP14 receptor The isoform-specific efflux of C. PP14 is simply a byproduct of pregnancy It is not a product, nor is it limited to the terminal part of the male reproductive tract, Instead, by teaching that they can be derived from platelets that contribute to pathophysiology, The present invention provides a reason to force the purification and cloning of the PP14 receptor. To do. Due to the structural features of the PP14 receptor, the PP14: PP14 receptor -Allows the generation of agents that block interactions.   A preferred method for isolating and cloning the PP14 receptor is PP14: Production and use of chimeric polypeptides of immunoglobulin Fc are included. this The chimeric polypeptide is linked to the Fc region of immunoglobulin G1 (IgG1). Has the complete sequence of PP14 or a functional polypeptide derivative thereof. the latter Serves as a useful marker for detecting and isolating the chimeric polypeptide. When Because the Fc region of immunoglobulin is protein A or protein G This is because they combine well. Similar ligand: Fc chimeric polypeptide is specific It is used by many research groups to isolate receptors. single Since hematopoietic cells such as lymphocytes and lymphocytes respond to PP14, Is a suitable source of cells to isolate the PP14 receptor. Extracting the active agent from the cells Sources are prepared and subjected to recombinant DNA technology in standard NOS cells or their equivalent. The PP14: immunoglobulin Fc chimera produced by the above is added to the extract. Perform protein A-Sepharose chromatography to detect PP14 receptor Is complexed with PP14: immunoglobulin Fc chimera. Isolate the coalescence. Purified PP14 receptor is recovered using pH elution. Amino-terminal amino acid sequence and a defined subpeptide generated by peptidase cleavage. And are determined by conventional amino acid sequencing methods. Based on this amino acid sequence Encodes this amino acid sequence using an oligonucleotide synthesizer Degenerate oligonucleotides are synthesized. Then these modified oligonucleotides CDNA library from the same cells from which the receptor was originally purified. To be used as a probe for screening. Therefore, PP14 reception Can be purified and cloned by a simple method using standard methods. .   An example using the PP14: Fc chimera as a receptor trap is described herein. Although provided, there are many alternatives that can be used for the same purpose. Detection and isolation Another polypeptide landmark may be affixed to PP14 for purposes. further, The procedure of the process outlined in the detailed specification of the present invention is the same for both PP14.1 and PP14.2. And clone the heterodimer PP14, an isoform-specific receptor Can be repeated for the polypeptide. Furthermore, it binds to the receptor The native PP14 can be used in unmodified form for An anti-PP14 antibody can be used to recover the PP14 receptor complex. Wear.   One therapy that results in PP14-mediated PP14 blockade is PP14-induced Anti-PP14 receptor antibody for patients requiring systemic or local immunosuppression inject. The anti-PP14 receptor antibody is used as an immunogen for the PP14 receptor. , Using recombinant PP14 receptor or PP14 receptor peptide Wear. Methods for producing monoclonal antibodies useful in human therapy are described in scientific publications. Well described. Another that blocks PP14 through the PP14 receptor According to the therapy, patients who require PP14-induced systemic immunosuppression will receive PP14 levels. Inject a soluble derivative of Scepter. This soluble derivative of the PP14 receptor , Can be easily produced by standard recombinant DNA methods. For example, site-specific sudden changes Termination at the carboxy terminus of the PP14 receptor extracellular domain using allogeneic induction Codons can be introduced. This mutant coding sequence of this soluble PP14 receptor Is used in many eukaryotic or prokaryotic expression vectors to produce large quantities of this molecule. Can be subcloned into any one of the vectors. Alternative therapies for the PP14 receptor Soluble derivative is PP14 linked to the Fc domain of immunoglobulin G. It consists of the extracellular domain of the receptor. This latter molecule is a CD4: immunoglobin. Shown with other immunoglobulin Fc chimeric polypeptides, such as Brin Fc Thus, it has the advantage of being a stable molecule in vivo.Treatment based on inhibition of PP14 production   Binding of PP14 protein in the blood and tissues of patients, and thereby its immunosuppressive activity To reduce PP14 production levels in addition to sex-based therapy Treatments based on can also be used. Such reductions include transcription and pre-transcription Level is possible.   Therefore, the use of genetic therapeutic agents that inhibit PP14 expression by cells of the platelet lineage Can be A preferred agent that reduces PP14 production is in vivo (in v ivo) Covalently derived by known methods to increase stability and cell membrane permeability Turned into Antisense PP14 oligonucleotide. Isoform-specific antisense PP14 oligonucleotide is a functional antisense oligonucleotide. Disclosed herein in accordance with general guidelines well known to those of skill in the art of optimization. Easily designed based on PP14.1 and PP14.2 nucleotide sequence information it can. In the case of PP 14.1, the antisense oligonucleotide To a 66 nucleotide stretch not present in PP14.2. You can kick. In the case of PP14.2, the antisense oligonu Cleotide has a PP14 motif so that the oligonucleotide binds only to the binding site. Let's span a binding site that overlaps the 66 nucleotide deletion of the string. other Regulatory polynucleotides also incorporate ribozymes or regulate triplex formation It can be easily designed as if it functions as an element. We have developed such agents There are well established methods of screening for their efficiency and toxicity.   Other therapies based on chemical agents that act like PP14 gene-specific transcription inhibitors Can be developed. Those that would block transcription from specific gene promoters Currently Well Described Methods to Screen Chemical Banks for There is. One experimental approach was to use luciferase, β-galactosidase or Or chloramphenicol acetyltransferase for easy detection. PP14 promoter linked to the gene sequence encoding the Reporter gene construct containing an upstream sequence of the PP14 gene having an element Is included. Can support active transcription from the PP14 promoter The target cell is stably transfected with this transcription cassette. K562 Cells are an example of a cell line suitable for this purpose. Another cell with megakaryocyte differentiation potential The system, as well as the endometrial and testicular systems, are easily identifiable. With Chimera Reporter In the case of transfected K562 cells, the cells were Disperse the chemicals on the woven culture plate and screen the chemicals with PMA. They are added to individual wells to activate the PP14 promoter. Reporter Identify the wells containing cells that failed to express. This is a related drug indication Represents a relatively rapid method for screening multiple chemicals per complement. Once candidates have been identified, efficacy and efficacy can be assessed using methods well established in the field of pharmacology. Test for toxicity and optimize dosing regimen.Leukemia treatment   PP14 has characteristics of cells of the platelet lineage, and leukemia cells corresponding to this lineage are also present. It expresses PP14. This potential immunosuppression in vivo Leukemia cells producing regulatory molecules can be protected from effective anti-leukocyte T cell responses . Furthermore, PP14 derived from these cells is a systemic immunosuppressive link in patients. It will sensitize the patient to other diseases, including infections. Therefore The finding that some leukemia cells produce PP14 has been found in blood and leukemia cells. Motivation to screen patients with leukemia for PP14 expression in cells To serve. Patients who are PP14-positive are treated by one of the methods disclosed above. And can be treated with PP14 blockade therapy. Megakaryotic leukemia cells with megakaryocyte differentiation potential Alternatively, patients with chronic myelogenous leukemia cells are particularly suitable candidates for this treatment modality. is there.   The present invention discloses the presence of the PP14.2 isoform. Antibody, PP14 peptide Or targeting with a PP14 receptor derivatized therapeutic composition How to efficiently block platelet-derived PP14 in both isoforms This disclosure is important in that it teaches those skilled in the art. PP 14.2 isoform claw Is a very important sequence information that allows the production of PP14 isoform-specific reagents. Provide information. Such reagents are used either in combination or alone be able to. For example, the therapeutic benefit is, for example, the clinical consequences of pregnancy-related coagulopathy. In pregnant patients who require relief of platelet-induced systemic immunosuppression, such as in severe conditions be able to. In such patients, fetal development may be adversely affected PP14.1 blockade is undesirable and selective PP14.2 blockade is preferred. In the patient Patients with residual PP14.1 from their endometrium and platelets A therapeutic benefit may be obtained by reducing the PP14 provided.PP14 diagnostic assay   The disclosure of PP14 in cells of the platelet lineage has diagnostic significance. In the method described above In serum with monoclonal and / or polyclonal antibodies prepared from It allows the simple development of an ELISA assay that measures PP14 expression in E. coli. PP 14.1- and / or PP14.2-specific antibodies can be used for this purpose. Wear. Sensitive ELISA can be used for PP14 detection in serum samples . Two anti-PPs with specificity for distinct non-overlapping parts of the PP14 protein 14 antibodies can be combined in a conventional double-antibody sandwich ELISA It The present invention teaches that the two isoforms of PP14 are produced by platelets. Thus providing the person skilled in the art with how to develop a suitable diagnostic assay . The ability to distinguish between the isoforms of PP14.1 and PP14.2 polypeptides is , Especially useful for diagnosing platelet failure in pregnant women. Because blood This is because PP14 polypeptides derived from platelets and endometrial cells can be resolved.   This assay is useful for accurately defining candidates for PP14 blockade therapy Not only this assay is evidence of coagulopathy in undiagnosed patients It can also function as a sensitive diagnostic tool to determine whether or not. According to the latter, Diagnostic tests for clinical failure such as diffuse intravascular coagulation, which is difficult to diagnose. Thus, P14 detection can work. Therefore, the PP14.2 polypeptide is associated with platelets. It is a useful diagnostic marker.Immunosuppressive treatment with PP14.2 polypeptides   The present invention is useful for treating patients with diseases in which immunosuppression is a desirable endpoint. To provide a novel immunosuppressive drug. Limited to such diseases But not autoimmune diseases, rheumatoid arthritis, as well as allergic dermatitis, Grafts associated with allergic diseases such as graft rejection and bone marrow transplants Includes host versus disease. The present invention achieves this in patients in need of immunosuppression To provide PP14.2 as an alternative to PP14.1.   A patient is one that has been identified as in need of immunosuppression. PP14 polypeptide Alternatively, a composition containing the functional polypeptide derivative is administered to the patient. Throw The route of administration and the exact components of the pharmaceutical preparation will be dictated by the particular disease being treated. It For example, in the treatment of systemic autoimmune diseases, intravascular or intramuscular administration Is preferred. In contrast, while topical application is preferred for allergic dermatitis, Intra-articular injection is preferred in the context of rheumatoid arthritis. Includes therapeutic polypeptide Methods for optimizing clinical protocols are well established and include PP14 The methods used for Petit are comparable to these. For example, 1 to 1000 μ / kg motion A proper body weight / day amount of PP14 is appropriate. PP 14.1 and in treated patients / Or PP14.2 serum levels are monitored to provide one indication of treatment efficiency it can.Method for producing PP14 polypeptide   The present invention is directed to a small scale of the PP14.1 isoform as well as the novel PP14.2 isoform. And a series of new potential sources important for large-scale production. Before Has no natural cell source from which human PP14 polypeptides can be readily obtained. . First and second 3-month endometrium (trimester endometriu) from miscarriage The availability of m) is clearly limited by several factors. According to the invention Platelets can be used as a natural source of PP14. Rapid increase in cell culture The finding of PP14 polypeptide in PMA-induced K562 cells growing in That is, it provides another potential source of (non-recombinant) PP14. important In particular, both isoforms of PP14 can be obtained from these sources, Further serve as a source of functional dimer molecules. Supports megakaryocyte system Other cell lines that perform are another source of native PP14.   Alternatively, K562 or other megakaryocyte lineages can be isolated by PP for overexpression of PP14. The 14.2 expression construct can be introduced. Recombinant monomer PP 14.2, homodimer PP14.2 and the heterodimer PP14.1: PP14.2 are all in this way Can be produced. Such cells will have suitable post-transcriptional repair of PP14 mRNA and protein. It provides the optimal cellular environment in which decoration can occur. Gene transfer method and expression Methods and methods for purifying recombinant proteins are well established in the art.   Alternative methods for producing soluble PP14.1 and PP14.2 polypeptides have also been devised it can. One preferred method involves the attachment of monomers and Chimeric PP14.1: GPI containing these polypeptides in dimer form And PP14.2: Expression of GPI polypeptide and the GPI membrane anchor Off Recovery of soluble PP14.1 or PP14.2 polypeptides by disruption is included. This type of method has been successfully used for the production of other soluble molecules and has the advantage of continuous flow. It offers the special advantage of being compatible with cell culture systems.   Other embodiments are within the following claims.                                 Sequence listing (1) General information:   (I) Applicant: Mark L. Tykocinski   (Ii) Title of invention: Treatment based on PP14   (Iii) Number of sequences: 5   (Iv) Communication address:     (A) Recipient: Lion and Lion (Lyon & Lyon)     (B) Street: West Sixth Street 611                 (611 West Sixth Street)     (C) City: Los Angeles     (D) State: California (California)     (E) Country: United States (U.S.A.)     (F) Postal code: 02111-2658   (V) Computer readable form:     (A) Medium type: 3.5 '' diskette, 1.44Mb capacity     (B) Computer: IBM compatible     (C) Operating system: IBM PC DOS (version         5.0)     (D) Software: Wordperfect (version         5.0)   (Vi) Latest application data:     (A) Application number:     (B) Application date:     (C) Classification:   (Vii) Prior application data:     The prior applications all include the applications described below:   (Viii) Agent / Agent Information:     (A) Name: Warburg, Richard J.     (B) Registration number: 32,327     (C) Reference / File number: 199/187   (Ix) Telecommunications information:     (A) Telephone number: (213) 489-1600     (B) Fax number: (213) 955-0440     (C) Telex number: 67-3510 (2) Information on SEQ ID NO: 1:   (I) Sequence features:     (A) Sequence length: 37     (B) Sequence type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 1: (3) Information on SEQ ID NO: 2   (I) Sequence features:     (A) Sequence length: 32     (B) Sequence type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 2: (4) Information regarding SEQ ID NO: 3:   (I) Sequence features:     (A) Sequence length: 22     (B) Sequence type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 3: (5) Information regarding SEQ ID NO: 4:   (I) Sequence features:     (A) Sequence length: 30     (B) Sequence type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 4: (6) Information on SEQ ID NO: 5:   (I) Sequence features:     (A) Sequence length: 25     (B) Sequence type: nucleic acid     (C) Number of chains: single chain     (D) Topology: linear   (Xi) Sequence: SEQ ID NO: 5:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ ＡＢＹ Ｄ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 16/18 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 39/395 ABG ABY D 9284-4C C07K 16/18 8318-4H C12N 1/21 8828-4B 15/09 ZNA C12P 21/02 9282-4B 21/08 9358-4B C12Q 1/68 A 9453-4B G01N 33/53 D 8310-2J 33/531 A 8310-2J // (C12P 21/02 C12R 1:91)

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生理学的な状況下にて、ＰＰ１４イソ形に対する受容体とＰＰ１４のイソ 形との結合を特異的に妨害または減少させる試薬を非−ＡＩＤＳ免疫抑制に苦し む患者に投与する工程よりなる非-ＡＩＤＳ免疫抑制に苦しむ患者を治療する方 法。 ２．該試薬が、ＰＰ１４.１に特異的なポリクローナル抗体またはモノクロー ナル抗体；ＰＰ１４.２に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗 体、Ｐ１４.１およびＰＰ１４.２に特異的なポリクローナル抗体またはモノクロ ーナル抗体、ＰＰ１４イソ形に対する受容体、ＰＰ１４イソ形に対する受容体の 一部；ＰＰ１４イソ形のペプチドの部分；ＰＰ１４の抗-イディオタイプ抗体模 擬物またはそのＰＰ１４結合断片；およびＰＰ１４受容体に対するポリクローナ ル抗体もしくはモノクローナル抗体またはその受容体結合断片よりなる群から選 択される化合物よりなる請求項１記載の方法。 ３．該ＰＰ１４イソ形のペプチドの部分が、ＰＰ１４.１のアミノ酸３３から ５５により定義されるポリペプチドの部分よりなる請求項２記載の方法。 ４．該試薬が、ＰＰ１４に対する受容体の天然のトランスメンブランおよび細 胞質ドメインのない該受容体の細胞外ドメインよりなる、ＰＰ１４に対する受容 体の可溶性ポリペプチド誘導体からなる請求項２記載の方法。 ５．該可溶性ポリペプチド誘導体が、ＰＰ１４受容体：イムノグロブリンＦｃ キメラポリペプチドである請求項４記載の方法。 ６．該患者が血小板不全に苦しむ請求項１記載の方法。 ７．該血小板不全が、散在性血管内凝固症、血小板移入に対し二次的な血小板 誘導性免疫抑制および血栓症である請求項６記載の方法。 ８．該患者が白血病に苦しむ請求項１記載の方法。 ９．該患者が、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、アレルギー性疾患、移植片 拒絶反応または移植片対宿主疾患に苦しむ請求項１記載の方法。 １０．ＰＰ１４レセプターのアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド・ プローブを用いて該ＰＰ１４受容体のアミノ酸配列を決定し、次いで該受容体ク ローンのライブラリーをスクリーニングする工程よりなるＰＰ１４受容体のクロ ーニング方法。 １１．該方法が、 （ａ）ポリペプチド・タッグに連結したＰＰ１４ポリペプチドよりなるキメラ ポリペプチドを供し； （ｂ）該ＰＰ１４レセプターに結合した該キメラポリペプチドよりなる複合体 を形成するのに適した条件下にて、ＰＰ１４受容体を発現する細胞からの細胞性 抽出物と該キメラポリペプチドとを接触させ； （ｃ）不溶性マトリックスに結合する該ポリペプチド・タッグと反応できる試 薬と該複合体とを接触させることによって該複合体を沈殿させ； （ｄ）該マトリックスから該ＰＰ１４受容体を回収し； （ｅ）該ＰＰ１４受容体の部分のアミノ酸配列を決定し；次いで、 （ｆ）該ＰＰ１４受容体のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド・プロ ーブを用いてＰＰ１４受容体ｃＤＮＡのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング する工程よりなることを特徴とするＰＰ１４に対するＰＰ１４受容体に対応する 相補的ＤＮＡをクローニングする方法よりなる請求項１０記載の方法。 １２．宿主をＰＰ１４ポリペプチドに対する受容体の部分で免疫する工程よりな る、ＰＰ１４ポリペプチドに対する受容体に特異的な抗体を生産する方法。 １３．ＰＰ１４遺伝子の転写および/またはＰＰ１４転写物の翻訳を遮断する試 薬を患者に投与する工程よりなる該患者において免疫抑制を遮断する方法。 １４．アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、または三重鎖形成核酸 を用いてＰＰ１４ポリペプチドの転写および/または翻訳を遮断する請求項１３ 記載の方法。 １５．レポーター遺伝子のＰＰ１４プロモーター駆動転写を遮断する能力につき 試薬をスクリーニングする工程よりなる、ＰＰ１４の転写を遮断する試薬を同定 する方法。 １６．該患者からの試料とＰＰ１４.１および/またはＰＰ１４.２に特異的な抗 体とを接触させ、次いで、血小板不全を患っていない正常な患者において観察さ れる反応量に比較して該試料と該抗体との反応量を測定する工程よりなる血小板 不全を患った患者を同定する方法。 １７．ＰＰ１４.１のアミノ酸３３ないし５５によって定義されるポリペプチド の抗原部分よりなるポリペプチドで宿主を免疫する工程よりなるＰＰ１４.１特 異的抗体を調製する方法。 １８．ＰＰ１４.２のアミノ酸３２-３３の結合部に重複するアミノ酸配列よりな るポリペプチドで宿主を免疫する段階よりなるＰＰ１４.２特異的抗体を調製す る方法。 １９．ＰＰ１４.１につき特異的な抗体。 ２０．ＰＰ１４.１のアミノ酸３３ないし５４により定義されるポリペプチドの 抗原部分より実質的になる医薬組成物。 ２１．ＰＰ１４.２につき特異的な抗体。 ２２．天然ＰＰ１４ポリペプチドがその受容体に結合するのを競合的に阻害し、 かつ、免疫抑制活性を有しないＰＰ１４ポリペプチドの部分。 ２３．ＰＰ１４に対する細胞性受容体の結合に競合するがそれを活性化はしない ＰＰ１４抗-イディオタイプ抗体模擬物。 ２４．ＰＰ１４受容体の天然膜内ドメインおよび細胞質ドメインがないＰＰ１４ 受容体の細胞外ドメインよりなるＰＰ１４に対する受容体の可溶性ポリペプチド 誘導体。 ２５．ポリペプチド・タッグに連結したＰＰ１４に対する受容体の細胞外ドメイ ンのＰＰ１４結合部分。 ２６．免疫抑制を要する患者にＰＰ１４.２ポリペプチドを投与する工程よりな る該患者を治療する方法。 ２７．造血細胞からＰＰ１４を単離する工程よりなるＰＰ１４ポリペプチドを調 製する方法。 ２８．該造血系細胞がフォルボールミリステートアセート誘導性の細胞である請 求項２７記載の方法。 ２９．該細胞が血小板である請求項２７記載の方法。 ３０．該ＰＰ１４ポリペプチドがＰＰ１４.１よりなる請求項２７記載の方法。 ３１．該ＰＰ１４ポリペプチドがＰＰ１４.２よりなる請求項２７記載の方法。 ３２．ＰＰ１４.２について暗号配列の部分に転写可能に連結したプロモーター よりなる転写カセットを導入する工程よりなるＰＰ１４.２ポリペプチドを調製 する方法。 ３３．ＰＰ１４.２の暗号配列の部分に連結したプロモーターよりなる転写カセ ット。 ３４．ＰＰ１４ポリペプチドのＰＰ１４受容体結合部分を粘着性細胞の表面へと ターゲティングするポリペプチド部位に連結した該ＰＰ１４ポリペプチドのＰＰ １４受容体結合部分。 ３５．（ａ）ポリペプチド部位に連結したＰＰ１４ポリペプチドの部分を粘着性 細胞の表面へとターゲティングする当該部分よりなる転写カセットで細胞をトラ ンスフェクトして、該部位に連結したＰＰ１４ポリペプチドを細胞表面に発現さ せ；次いで、 （ｂ）分解剤で該部位を分解することにより該ＰＰ１４ポリペプチドを培地中 に放出させる工程よりなるＰＰ１４ポリペプチドの生産方法。 ３６．ビオチン-結合ドメインよりなるストレプトアビジンまたはアビジンの部 分に連結したＰＰ１４受容体-結合ＰＰ１４ポリペプチドの部分よりなる組成物 。 ３７．ポリペプチド部位に連結したＰＰ１４ポリペプチドの部分を粘着性細胞の 表面へとターゲティングして、該細胞表面でＰＰ１４ポリペプチドを発現させる ポリペプチド部位に連結した当該部分をコードする核酸よりなる転写カセットか らなる細胞。 ３８．ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチド鎖よりなる精製ヘテロマルチ マー。 ３９．ＰＰ１４.２ポリペプチド鎖よりなる精製ホモマルチマー。 ４０．ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２転写カセットを細胞にコトランスフェクト させる工程よりなる、ＰＰ１４.１およびＰＰ１４.２ポリペプチド鎖よりなるヘ テロマルチマーの生産方法。 ４１．精製または組換えＰＰ１４受容体。 ４２．精製または組換えＰＰ１４受容体抗体。 ４３．ＰＰ１４受容体に結合できる精製抗-イディオタイプ抗体。 ４４．ナチュラル・キラー細胞にＰＰ１４.２を接触させることを特徴とするナ チュラル・キラー細胞活性を抑制する方法。 ４５．ＰＰ１４ポリペプチドを細胞表面へとターゲティングするポリペプチド部 位と共有結合したＰＰ１４ポリペプチド。 ４６．該ポリペプチド部位がＧＰＩの細胞表面ターゲティング部分である請求項 ４５記載のＰＰ１４ポリペプチド。 ４７．該細胞が抗原提示細胞から選択される請求項４５記載のＰＰ１４ポリペプ チド。 ４８．該細胞の表面へとターゲティングするのに適したＰＰ１４ポリペプチドを 供する、ＰＰ１４ポリペプチドで抗原提示細胞を被覆する方法。[Claims]   1. Under physiological conditions, the receptor for the PP14 isoform and the isoform of PP14 Sufficient non-AIDS immunosuppression with reagents that specifically interfere with or reduce binding to forms For treating patients suffering from non-AIDS immunosuppression comprising the step of administering to patients Law.   2. The reagent is a polyclonal antibody specific for PP 14.1 or monochrome Null antibody; polyclonal antibody or monoclonal antibody specific to PP14.2 Antibodies or Monoclonal Antibodies Specific for the Body, P14.1 and PP14.2 Internal antibody, receptor for PP14 isoform, receptor for PP14 isoform Part; Peptide part of PP14 isoform; Anti-idiotype antibody model of PP14 Mimic or PP14 binding fragment thereof; and polycloner for PP14 receptor Antibody or monoclonal antibody or receptor-binding fragment thereof. The method of claim 1 comprising a selected compound.   3. The peptide portion of the PP14 isoform is derived from amino acid 33 of PP14.1. The method of claim 2 which comprises a portion of the polypeptide defined by 55.   4. The reagent is a natural transmembrane and subunit receptor for PP14. Receptor for PP14 consisting of the extracellular domain of the receptor without a cytoplasmic domain The method of claim 2 which comprises a soluble polypeptide derivative of the body.   5. The soluble polypeptide derivative is a PP14 receptor: immunoglobulin Fc. The method according to claim 4, which is a chimeric polypeptide.   6. The method of claim 1, wherein the patient suffers from platelet failure.   7. The platelet deficiency is due to disseminated intravascular coagulation, platelet transfer secondary to platelet transfer The method according to claim 6, which is induced immunosuppression and thrombosis.   8. The method of claim 1, wherein said patient suffers from leukemia.   9. The patient has autoimmune disease, rheumatoid arthritis, allergic disease, graft The method of claim 1, wherein the method suffers from rejection or graft-versus-host disease. 10. An oligonucleotide corresponding to the amino acid sequence of the PP14 receptor A probe is used to determine the amino acid sequence of the PP14 receptor and then the receptor The process of screening a library of loans for the PP14 receptor Learning method. 11. The method is   (A) Chimera comprising PP14 polypeptide linked to a polypeptide tag Providing a polypeptide;   (B) Complex consisting of the chimeric polypeptide bound to the PP14 receptor From cells expressing the PP14 receptor under conditions suitable to form Contacting the extract with the chimeric polypeptide;   (C) A test capable of reacting with the polypeptide tag bound to an insoluble matrix Precipitating the complex by contacting a drug with the complex;   (D) recovering the PP14 receptor from the matrix;   (E) determining the amino acid sequence of the portion of the PP14 receptor;   (F) an oligonucleotide proteo corresponding to the amino acid sequence of the PP14 receptor Probe to screen a cDNA library for the PP14 receptor cDNA Corresponding to the PP14 receptor for PP14 characterized by comprising the steps of: The method according to claim 10, which comprises a method of cloning complementary DNA. 12. Immunizing the host with a portion of the receptor for PP14 polypeptide A method of producing an antibody specific for a receptor for a PP14 polypeptide. 13. Trials to block transcription of the PP14 gene and / or translation of the PP14 transcript A method of blocking immunosuppression in a patient comprising administering the drug to the patient. 14. Antisense oligonucleotides, ribozymes, or triplex forming nucleic acids Is used to block the transcription and / or translation of PP14 polypeptide. The method described. 15. The ability of the reporter gene to block PP14 promoter-driven transcription Identification of reagents that block PP14 transcription, consisting of screening reagents how to. 16. Samples from the patient and specific anti-PP14.1 and / or PP14.2 Contact with the body, then observed in normal patients without platelet failure. Platelet comprising the step of measuring the reaction amount between the sample and the antibody in comparison with the reaction amount A method of identifying a patient suffering from insufficiency. 17． Polypeptide defined by amino acids 33 to 55 of PP14.1 PP14.1 features comprising immunizing a host with a polypeptide consisting of the antigenic portion of A method of preparing a heterologous antibody. 18. It consists of an amino acid sequence that overlaps at the amino acid 32-33 junction of PP14.2. A PP14.2 specific antibody comprising the step of immunizing a host with a polypeptide How to do. 19. An antibody specific for PP14.1. 20. Of the polypeptide defined by amino acids 33 to 54 of PP14.1 A pharmaceutical composition consisting essentially of an antigenic portion. 21. An antibody specific for PP14.2. 22. Competitively inhibits the native PP14 polypeptide from binding to its receptor, And a portion of the PP14 polypeptide that has no immunosuppressive activity. 23. Competes for but does not activate the binding of cellular receptors to PP14 PP14 anti-idiotype antibody mimic. 24. PP14 lacking the native intramembrane and cytoplasmic domains of the PP14 receptor Soluble polypeptide of the receptor for PP14 consisting of the extracellular domain of the receptor Derivative. 25. Extracellular domain of the receptor for PP14 linked to a polypeptide tag PP14 binding part of the protein. 26. The process of administering a PP14.2 polypeptide to a patient in need of immunosuppression A method of treating the patient. 27. The preparation of PP14 polypeptide comprising the step of isolating PP14 from hematopoietic cells. How to make. 28. A contract in which the hematopoietic cells are phorbol myristate asate-inducible cells. The method according to claim 27. 29. 28. The method of claim 27, wherein the cells are platelets. 30. 28. The method of claim 27, wherein said PP14 polypeptide consists of PP14.1. 31. 28. The method of claim 27, wherein said PP14 polypeptide consists of PP14.2. 32. A promoter operably linked to a part of the coding sequence for PP14.2 A PP14.2 polypeptide comprising the steps of introducing a transcription cassette consisting of how to. 33. Transcription cassette consisting of promoter linked to part of coding sequence of PP14.2 And 34. Transfer the PP14 receptor-binding portion of the PP14 polypeptide to the surface of adherent cells PP of the PP14 polypeptide linked to a targeting polypeptide site 14 receptor binding moieties. 35. (A) The portion of PP14 polypeptide linked to the polypeptide site is adhesive Tracing the cell with a transcription cassette consisting of that portion that targets the surface of the cell. To express the PP14 polypeptide linked to the site on the cell surface. Let; then   (B) the PP14 polypeptide in the medium by degrading the site with a degrading agent A method for producing a PP14 polypeptide, which comprises the step of: 36. Streptavidin or avidin part consisting of biotin-binding domain A composition comprising a portion of a PP14 receptor-binding PP14 polypeptide linked to a moiety . 37. The portion of the PP14 polypeptide linked to the polypeptide site is Targeting to the surface to express the PP14 polypeptide on the cell surface Is it a transcription cassette consisting of a nucleic acid encoding the part linked to the polypeptide site? Cells consisting of. 38. Purified heteromultis consisting of PP14.1 and PP14.2 polypeptide chains Mar. 39. A purified homomultimer consisting of PP14.2 polypeptide chains. 40. Cotransfecting PP14.1 and PP14.2 transcription cassettes into cells The PP14.1 and PP14.2 polypeptide chains. Method of producing terrorism multimers. 41. Purified or recombinant PP14 receptor. 42. Purified or recombinant PP14 receptor antibody. 43. A purified anti-idiotype antibody capable of binding to the PP14 receptor. 44. Characterized by contacting PP14.2 with natural killer cells A method of suppressing the activity of a Tular-killer cell. 45. Polypeptide moiety that targets PP14 polypeptide to the cell surface PP14 polypeptide covalently linked to a position. 46. The polypeptide portion is a cell surface targeting portion of GPI. 45. The PP14 polypeptide according to 45. 47. 46. PP14 polypep according to claim 45, wherein said cells are selected from antigen presenting cells. Chid. 48. A PP14 polypeptide suitable for targeting to the surface of the cell A method of coating antigen presenting cells with a PP14 polypeptide.
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