【発明の詳細な説明】
生体適合性ポリマー結合体技術分野
本発明は、２種またはそれ以上のポリマー同士の共有結合によって形成された
生体適合性結合体、特に、天然に存在するポリマーまたはそれらの誘導体と親水
性合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG））との結合によって
形成された結合体、ならびに、この結合体を含有する組成物、成分、および移植
片に関する。発明の背景
天然に存在するが生物学的に不活性なポリマーが、多数知られている。このよ
うな例には、コラーゲンおよび多様なグリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロ
ン酸、コンドロイチン硫酸、キチン、およびヘパリン）が含まれる。これらのポ
リマーの誘導体も、生成され、ある誘導体は、医療用途のために処方されている
。生物学的に不活性な合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG）
）もまた多数知られている。多様な天然ポリマーと合成ポリマーとの組み合わせ
は、多様な医療用途において用いるための広範囲の特性を与える。本発明者らは
、天然ポリマーと合成ポリマーとの特性を組み合わせた、新しくそして有用な結
合体を発明し、そして、これらの結合体を、特に上記特性の利点を生かせる医療
用組成
物、成分、および移植片に適用した。発明の要旨
結合体は、天然に存在する生物学的に不活性な不溶性ポリマーおよびそれらの
誘導体と、親水性合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（PEG））と
の共有結合によって形成されている。天然に存在するポリマーおよびそれらの誘
導体には、ヒアルロン酸のような多糖類、コンドロイチン硫酸Ａ（４−スルフェ
ート）、コンドロイチン硫酸Ｃ（６−スルフェート）、およびデルマタン硫酸（
コンドロイチン硫酸Ｂ）のようなプロテオグリカン類；キチン；ヘパリンおよび
ヘパリン硫酸；サイクロデキストラン、ヒドロキシルエチルセルロース、セルロ
ースエーテル、およびデンプンのようなデキストラン類；トリグリセリド、リン
脂質などのような脂質（トリヒドロキシルアルコールグリセロールと脂肪酸との
エステル）が含まれる。この親水性合成ポリマーは、好ましくは、約100〜約100
,000）好ましくは約1,500〜20,000の範囲の重量平均分子量を有する、ポリエチ
レングリコールおよびそれらの誘導体である。組成物および成分は、この結合体
、および、他の成分（例えば、注入可能な処方物を形成するための薬学的に受容
可能な流動性キャリア、および／または、サイトカインおよび増殖因子のような
生物学的に活性なタンパク質）を用いて処方され得る。本発明の生体適合性結合
体は、一般に、それが形成されるときには多量の水を含み、比較的
固形の物（再吸水（rehydration）して５倍またはそれ以上の大きさに膨張する
）を形成するために脱水され得る。特有の所望の特性を得るために、移植片は、
結合体処方物によりコートされ得、チューブおよび糸状物（string）のような物
品（article）は、特定の結合体および処方物を用いて構築され得る。
本発明の生体適合性の結合体は、種々の医療用途および薬学的用途において適
用され、用いられる。最も基本的な実施態様には、生体適合性の結合体およびそ
れらの結合体を用いて処方された薬学的組成物（タイプおよび量の異なる薬学的
に受容可能な流動性キャリアを含む組成物である）が含まれる。この結合体を形
成する際、多様な天然ポリマーがポリエチレングリコールのような合成ポリマー
と共有結合する。この特定のポリマーは、最終用途および所望の特性に基づいて
選択される。結合するポリマーを選択することに加えて、異なるタイプの共有結
合（エステル結合、エーテル結合、およびウレタン結合を含む）が用いられ得る
。
本発明の特定の結合体および組成物の最も重要な用途の一つは、軟組織の増強
方法にある。この組成物は、軟組織の増強の目的で、流動性形態に処方され、そ
して被験体（顔面など）に注入される。この方法は、天然に存在するポリマーと
合成ポリマーとの間の反応がインサイチュで起きるように変更され得る。この結
合体は、脱水され得、次いで粒子へと粉砕され得、不活性な非水性キャリア中に
懸濁され得、そして
被験体に注入され得る。注入後、キャリアは、通常の生理学的条件で除去され、
そして、粒子は、再吸水し、それらの元の大きさまで膨張する。結合体から形成
された糸状物も、また、軟組織の増強を得るために注入され得る。
本発明の結合体および結合体組成物は、組織増殖を促進させるサイトカインま
たは増殖因子と組み合わされ得、そして／またはさらに粒子、ファイバー、また
は他の材料と、組成物の構造的完全性（structural integrity）を増加するため
に組み合わされ得るので、骨や軟骨などの硬組織の増強にもまた用いられ得る。
結合体の他の用途には、体内に組み込む多様な医療用デバイス（カテーテル、移
植骨、および動脈瘤を治療するための白金ワイヤ）へのコーティングが含まれる
。結合体はまた、レンチクルスまたは角膜シールドのような多様な眼科用デバイ
スに処方され得る。結合体処方物は、縫合および血管または神経修復用などの医
療用途を有する糸状物およびチューブのような形状に、押し出され、注形され、
および／または、形成される。
本発明の第１の目的は、ポリエチレングリコールのようなポリマーと、天然に
存在する、非免疫原性形態の、不溶性の、生物学的に不活性なポリマーまたはそ
れらの誘導体との共有結合により形成される生体適合性結合体を提供することで
ある。
本発明の他の目的は、異なる結合タイプによる結合体を提供することであり、
注入するのに適した薬学的に受容可能な
流動性キャリア中に結合体を含有する組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、結合体を形成する工程、該結合体を脱水して固形物を形
成する工程、該固形物を粉砕して粒子にする工程、そして増強（その時、該粒子
は再吸水し、約５倍の大きさに膨張する）する部位に注入するために該粒子を非
水性流動性キャリア中に懸濁させる工程により製造される、組織の増強のための
組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、表面が生体適合性結合体処方物でコートされた移植片の
ような物品を提供することである。
さらに他の目的は、結合体材料で作製された糸状物を提供することである。
さらに他の目的は、結合体材料で作製されたチューブを提供することである。
生体適合性結合体を含有する本発明の重要な利点は、エーテル結合などの特定
のタイプの共有結合が、生理学的条件下での長期にわたる高度な安定性を提供す
るために用いられ得ることである。
本発明の特徴は、結合体が、多様な天然および合成ポリマー（それぞれ、得ら
れる組成物の物理的および化学的特性を調節するために分子量の範囲を有する（
occur））を用いて形成され得ることである。
本発明の他の利点は、この生体適合性結合体が、従来のコラーゲン組成物と比
較して、優れた取り扱い特性を有するこ
とである。
本発明の他の利点は、この生体適合性結合体組成物が、従来のコラーゲン組成
物と比較して、免疫反応を低下させることである。
本発明の他の特徴は、この生体適合性結合体組成物が、従来の組成物と比較し
て、改良された成形性、順応性、および弾性を有することである。
本発明の他の特徴には、生理学的条件下で、例えば、サイトカインまたは増殖
因子の活性および利用可能な半減期を改良するために、この組成物および結合体
を、薬学的に活性なタンパク質（例えば、サイトカインまたは増殖因子）と組み
合わせて処方する能力が含まれる。
本発明の他の利点は、天然ポリマーと合成ポリマーとを連結するためにエーテ
ル結合が用いられ得ることであり、この結合が加水分解に対して耐性であること
である。
本発明のこれらのおよび他の目的、利点、および特徴は、本明細書の一部であ
る特定の例および処方物を参照し、以下に充分に記載されている、この生体適合
性結合体の構造、合成、および使用に関する詳細な説明を、読むことにより、当
業者に明らかとなる。図面の簡単な説明
図１は、種々の糸状物の膨張能試験の結果を示す棒グラフである；
図２、３、４および５は、それぞれ、種々の糸状物の物理的性質の試験結果を
示す棒グラフである；
図６および７は、それぞれ、コラーゲン含有組成物のDSC測定値の比較を示す
；
図８は、ヒアルロン酸のカルボキシル基とPEG-ヒドラジンとの反応の反応スキ
ームを示す；
図９は、ヒアルロン酸のアセチル基がスクシンイミジル-PEGと反応する反応ス
キームを示す；
図１０は、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃおよびデルマタン硫
酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）の構造を示す；
図１１は、エステルとPEGとの求核置換反応を示す反応スキームである；
図１２は、ポリエチレンとE-PEGの多官能性活性化形態とが反応する反応スキ
ームを示す；
図１３は、ポリエチレンとS-PEGの多官能性活性化形態とが反応する反応スキ
ームを示す；
図１４は、実施例１３によって製造された糸状物の測定結果を示す表である；
図１５は、コラーゲンおよびコラーゲン結合体を含む糸状物に関する物理的デ
ータを示す表である；
図１６は、実施例１５によって製造された材料の測定から得られるデータを示
す表である；
図１７は、実施例１８によって製造された材料について得
られた測定結果を示す表である。本発明の好適な実施態様の詳細な説明
本発明の生体適合性結合体およびその製造および使用工程を記載する前に、本
発明が記載された特定の結合体、工程、および方法に限定されず、これらは当然
変更し得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、個々の
実施態様のみを記載することを目的としており、限定することを意図せず、本発
明の範囲は添付された請求の範囲によってのみ限定されることもまた理解される
べきである。
本明細書中および添付の請求の範囲で用いられる単数の形態は、文中で特にこ
とわりのない限り、複数の指示物を包含することに注意すべきである。従って、
例えば、「天然に存在するポリマー」との表記は、そのような複数のポリマーの
混合物を包含し、「結合基」または「架橋基」との表記は、当業者に公知かまた
は共有結合を形成し得る、１種またはそれ以上の異なるタイプの基を包含し、そ
して、「合成ポリマー」との表記は、異なるタイプの複数のポリマー（例えば、
ポリエチレングリコール（PEG）など）の混合物を包含する。
他に定義しなければ、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語
は、本発明の属する分野の当業者に一般に理解されるのと同様の意味を有する。
本明細書に記載されるのと類似するか、または同等の任意の方法および材料が、
本発明の実施または試験において有用であり得るが、好まし
い方法および材料のみについて以下に記載される。本明細書中に記載される全て
の文献は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本発明の説明に特に重
要な特定の用語を以下に定義する。
Ａ．定義
本明細書中で用いられる用語「コラーゲン」は、テロペプチド含有コラーゲン
およびアテロペプチドコラーゲン（加工または修飾されている）を包含する、任
意の形態のコラーゲンを意味する。コラーゲンは、ヒトまたは動物起源であり得
、そして組み換え技術により産生され得る。形態には多様な型（すなわちＩ、II
、III型、繊維性、非繊維性など）が包含される。コラーゲンは、動物の骨、軟
骨、皮膚、および結合組織の主要タンパク質成分である材料である。天然型のコ
ラーゲンは、典型的には剛直な棒状の分子で、長さおよそ300nmおよび直径1.5nm
である。このコラーゲンは、３本のコラーゲンポリペプチドからなり、密着した
３重らせんを形成している。コラーゲンポリペプチドは繰り返し配列-Gly-X-Y-
を有する長い中央部分により特徴付けられ（ここで、ＸおよびＹはしばしばプロ
リンまたはヒドロキシプロリンである）、各末端は「テロペプチド」領域（分子
の約５％未満を構成する）と結合している。コラーゲン鎖のテロペプチド領域は
、典型的には、天然に存在する鎖間での架橋、およびタンパク質の免疫原性に寄
与する。コラーゲンには数種類の「型」があり、そ
れぞれ異なる物理的特性を有する。最も豊富な型は、Ｉ型〜III型である。本発
明の開示は、これらのコラーゲン、および他の公知の型のコラーゲン（天然コラ
ーゲン、および加工または修飾したコラーゲン（つまり、種々のコラーゲン誘導
体））を包含する。コラーゲンは、典型的には、天然ソース（例えば、ウシの皮
、軟骨、または骨）から単離される。骨からは通常、乾燥、脱脂、粉砕、そして
無機質脱落を行ってコラーゲンが抽出される。一方、皮および軟骨は、通常、細
かく刻まれ、そしてコラゲナーゼ以外のタンパク質分解酵素で消化される。コラ
ーゲンは、大部分のタンパク質分解酵素に耐性であるので、好都合には、この手
法によりコラーゲンと共に存在する不純タンパク質の大部分が除去される。
用語「脱水された」は、材料を空気乾燥するか、または凍結乾燥して実質的に
全ての結合していない水を除去することを意味する。
本明細書で用いられる用語「天然に存在するポリマー」および「天然ポリマー
」は、生物学的に不活性な、不溶性の、天然に存在する、生体適合性ポリマーお
よびそれらの誘導体を意味する。天然ポリマーの例としては、ヒアルロン酸のよ
うな多糖類、コンドロイチン硫酸Ａ（４−スルフェート）、コンドロイチン硫酸
Ｃ（６−スルフェート）、およびデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）のよ
うなプロテオグリカン類；サイクロデキストラン、ヒドロキシルエチルセルロー
ス、セルロースエーテル、およびデンプンのようなデキスト
ラン類；トリグリセリド、リン脂質などのような脂質（トリヒドロキシルアルコ
ールグリセロールと脂肪酸とのエステル）、およびこれらの混合物ならびに誘導
体が含まれる。この用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などの生物学
的に活性な天然ポリマーが特に含まれないことを意図している。
用語「生物学的に不活性な結合体」、「生体適合性結合体」、および「生物学
的に不活性な生体適合性結合体」は、本明細書中では交換可能に用いられる。こ
れらの用語は、生物学的に不活性で不溶性の、本発明の生体適合性結合体（ここ
で天然ポリマーは、親水性合成ポリマーと共有結合している。）を意味する。こ
の結合体は、生物学的に不活性で不溶性の非毒性のポリマーであって、生体に組
み込まれても、顕著な免疫反応を生じさせない天然ポリマーと同様のいくつかの
特性を有する。
本明細書で用いられる用語「親水性合成ポリマー」は、本質的に親水性である
が完全に水溶性でないポリマーになるような平均分子量および組成を有する合成
ポリマーを意味する。好ましいポリマーは、薬学的に純粋であるように高度に精
製されている。最も親水性のポリマーは、水溶液中で水素結合を形成させるため
に、十分な数の酸素原子を組み込むことにより（または、あまり用いないが、窒
素原子を組み込むことにより）水溶性にされ得る。好ましいポリマーは、親水性
であるが、必ずしも水溶性ではない。本明細書中で用いられる親水性ポリマーと
しては、ポリエチレングリコール（PEG）、ポ
リオキシエチレン、ポリメチレングリコール、ポリトリメチレングリコール、ポ
リビニルピロリドン、およびそれらの誘導体が挙げられ、PEGが特に好ましい。
ポリマーは、直鎖状であり得るかまたは多分岐状であり得、実質的に架橋してい
ない。他の適切なポリマーとしては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
ンブロックポリマーおよびコポリマーが挙げられる。エチレンジアミン核を有す
る（従って、４つの末端を有する）ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
ブロックポリマーも、入手可能であり、そして本発明の実施に用いられ得る。天
然に存在するポリマー（例えば、タンパク質、デンプン、セルロース、ヘパリン
など）は、この定義の範囲から明らかに除外される。全ての適切な合成ポリマー
は、皮下投与されたときに、非毒性、非炎症性、そして非免疫原性であり、そし
て好ましくは、少なくとも数カ月の期間にわたって、インビボで本質的に非分解
性である。親水性ポリマーは、天然ポリマーの親水性を増大し得るが、水溶性に
はしない。現在、好ましい親水性合成ポリマーとしては、一官能性、二官能性、
および多官能性の活性化ポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。一官能
性PEGは、一つの反応性のヒドロキシ基のみを有するのに対して、二官能性PEGは
、分子の各末端に反応性の基を有する。一官能性PEGは、好ましくは約100と約15
,000との間、さらに好ましくは約200と約8,000との間、そして最も好ましくは約
4,000の重量平均分子量を有する。二官能性PEGは、好ましくは約400〜約100,000
、さらに好
ましくは約3,000と約20,000との間の重量平均分子量を有する。多官能性PEGは、
好ましくは、約3,000と100,000との間の平均分子量を有する。
本明細書中で用いられる用語「多官能性」は、１分子あたり、２またはそれよ
り多い反応基を有する合成ポリマーを意味し、この用語自体が、用語「二官能性
」を包含する。
用語「一官能性」、「二官能性」、および「多官能性」は、本明細書中では、
用語「一官能性活性化」「二官能性活性化」および「多官能性活性化」とそれぞ
れ交換可能に用いられる。
PEGは、一つの末端でアルキレンエーテル基を形成することにより、一官能性
となり得る。アルキレンエーテル基は、１〜６個の炭素原子を有する任意の適切
なアルコキシ基であり得、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２-プロ
ポキシ、ブトキシ、ヘキシルオキシなどであり得る。現在のところ、メトキシが
好ましい。二官能性活性化PEGは、直鎖状分子の各末端に反応性のヒドロキシ基
を与えることにより提供される。反応性の基は、好ましくは、ポリマーの末端に
位置するが、その鎖状方向わたって提供されてもよい。多官能性活性化合成分子
は、本発明の組成物を架橋し得、そしてさらに、サイトカインまたは増殖因子と
天然ポリマーとを結合するために用いられ得る。合成ポリマーに関して、略語が
以下のように用いられる：
モノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）；二官能性PEGスクシンイミジル
グルタレート（SG-PEG）：二官能性PEGス
クシンイミジル（S-PEG）；二官能性PEGスクシンイミジルカーボネート（SC-PEG
）；二官能性PEGプロピオンアルデヒド（A-PEG）；および二官能性PEGグリシジ
ルエーテル（E-PEG）。省略語「d PEG」には、種々のタイプの二官能性ポリエチ
レングリコールが包含される。
本明細書中で用いられる用語「化学的に結合した」は、化学的共有結合を介し
て結合していることを意味する。本発明の実施において、親水性合成ポリマーと
天然ポリマーまたはその誘導体とは、好ましくは共有結合（単数および複数）を
介して互いに直接結合している。しかし、結合基を用いることにより化学的に結
合され得る（親水性合成ポリマーおよび天然ポリマーは、それぞれ結合基に結合
するが、互いに直接は結合しない）。用語「生体適合性の結合体」は、本発明に
おける意味の中では、親水性合成ポリマーと化学的に結合した天然ポリマーを意
味する。従って、「天然ポリマー/PEG」（または「PEG/天然ポリマー」）とは、
天然ポリマーがPEGと化学的に結合している本発明の組成物を示す。「天然ポリ
マー/PEG」は、二官能性活性化PEGと化学的に結合した、本発明の天然ポリマー
を意味し、ここで、ポリマー分子は架橋し得る。合成ポリマーは、多くの異なる
タイプの化学的結合を介して、天然ポリマーと「化学的に結合」され得る。例え
ば、この結合は、エステル結合またはウレタン結合を介していてもよいが、さら
に好ましくはエーテル結合を介している。毒性化学材料を使用せずに形成され得
ること、およびインビボ
で加水分解を容易には受けないという点で、エーテル結合が好ましい。
合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）は、実際には正確な分子量
を有するように調製され得ないこと、および、本明細書中で用いられる用語「分
子量」は、当該分野において一般に用いられるように、任意の所定のサンプル中
の多数の分子の重量平均分子量を意味することが当業者に理解される。従って、
PEG 2,000のサンプルは、例えば、1,500〜2,500ダルトンの重量範囲のポリマー
分子の統計学的混合物を含み得、１つの分子は、ある範囲にわたって他の分子と
わずかに異なる。分子量範囲の記載により、平均分子量が、指定した範囲の間の
いかなる値でもよく、そしてこれらの制限を越える分子を包含し得ることが示さ
れる。従って、約800〜約20,000の分子量範囲は、少なくとも約800〜約20kDaま
での範囲の平均分子量を示す。
本明細書中で用いられる用語「使用可能なリシン残基」は、活性化PEGと反応
する様式で位置する、天然ポリマー分子の外側表面上にさらされたリシン側鎖を
意味する。使用可能なリシン残基の数は、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸
ナトリウム（TNBS）との反応により決定され得る。
本明細書中で用いられる用語「処置」および「治療」は、欠損、特に、軟組織
または軟組織支持体の損失または欠落、あるいは骨または軟骨の損失または欠落
による欠損の増強、修復、予防、または緩和を意味する。さらに用語「処置」は
、
本発明の糸状物を創傷の縫合に用いること、および本発明のチューブを、生物、
特にヒトの体のチャネル（channel）の修復、置換、または増強に用いることを
包含する。さらに、「処置」および「治療」はまた、本発明の結合体含有組成物
と結合および／または混合した生物学的に活性なタンパク質を用いた、障害また
は疾患の予防、維持、または緩和を意味する。従って、軟組織の治療としては、
軟組織の増強（例えば、皮膚のしわまたは溝の除去において、または、老化のた
めに脂肪が失われる上顎部分の皮下脂肪の置換において、通常のまたは所望の皮
膚外形を再形成するための本発明の結合体の移植）、または粘膜下組織（例えば
、泌尿系括約筋または食道下部括約筋）の増強における軟組織の増強が挙げられ
る。骨および軟骨の治療としては、骨組織を置換または修復するための（例えば
、骨偽関節または骨折の治療における）、結合体の使用、特に、適切な粒子状材
料と組み合わせた天然ポリマー/PEGの使用が挙げられる。骨の治療にはまた、付
加的な骨増殖因子を存在させて、または存在させずに、結合体含有組成物を使用
することが包含される。結合体と共にセラミック粒子（好ましくは、ヒドロキシ
アパタイトおよび／またはリン酸三カルシウムのようなリン酸カルシウム）を含
有する組成物は、その優れた引張強度のために、応力に耐える骨を修復するのに
特に有用である。
用語「サイトカイン」および「増殖因子」は、正常組織の回復または再増殖を
促進する生物学的に活性な分子および活
性なペプチド（天然に存在し得るか、または合成され得る）を記載するのに用い
られる。サイトカインおよび増殖因子の機能は、以下の二点である：（１）これ
らは、新しいコラーゲンまたは組織をつくるために局所細胞を刺激し得るか、ま
たは（２）これらは、修正を必要とする部位へ細胞を誘引し得る。このように、
サイトカインおよび増殖因子は、移植片の「生物学的つなぎとめ（biological a
nchoring）」を宿主組織内で促進させるために作用する。前記のように、サイト
カインまたは増殖因子は、結合体と混合され得るか、または結合体と化学的に結
合され得るかのいずれかである。例えば、ある結合体は、サイトカイン（例えば
、インターフェロン（IFN）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン、コロニ
ー刺激因子（CSF）など）、または増殖因子（例えば、骨形成因子抽出物（osteo
genic factor extract）（OFE）、上皮増殖因子（EGF）、形質転換増殖因子（TG
F）α、TGF-β（TGF-βのいかなる組み合わせも包含する）、TGF-β１、TGF-β
２、血小板由来増殖因子（PDGF-AA、 PDGF-AB、 PDGF-BB）、酸性線維芽細胞増
殖因子（FGF）、塩基性FGF、結合組織活性化ペプチド（CTAP）、β‐トロンボグ
ロブリン、インシュリン様増殖因子、エリスロポエチン（EPO）、神経成長因子
（NGF）、骨形態形成タンパク質（bonemorphogenic protein）（BMP）、骨形成
因子など）を組み込み得る。このようなサイトカイン、または増殖因子、および
サイトカインと増殖因子との適切な組み合わせを取り込むことにより、移植片の
正常組織への再増殖および再成形が促進され
得るか、または傷の治療に用いられ得る。さらに、合成段階で、多官能性ポリマ
ー分子を適量用いることにより、サイトカインまたは増殖因子は、生体適合性結
合体と化学的に結合し得る。次いで、PEGを任意の天然ポリマーと結合させるの
に用いたのと同様の方法によって、または任意の他の適切な方法によって、サイ
トカインまたは増殖因子が、ポリマーの遊離末端に結合され得る。サイトカイン
または増殖因子分子を移植片につなぎとめることにより、効果的な治療に必要と
されるサイトカインまたは増殖因子の量が、実質的に減少する。サイトカインま
たは増殖因子が組み込まれた結合体は、効果的なコントロールされた放出薬物送
達手段として機能し得る。サイトカインと結合体との間の化学結合を変化させる
ことによって、サイトカインまたは増殖因子の放出に関する効果を変化させるこ
とが可能である。例えば、「エステル」結合が用いられると、結合は生理学的条
件下でより容易に切断され、マトリックスからの増殖因子またはサイトカインの
放出が維持される。しかしながら、「エーテル」結合が用いられると、結合は容
易には切断されず、そして、サイトカインまたは増殖因子は、その活性部位をさ
らしながら、より長期間その場所に残留し、タンパク質の活性部位に対する本来
の基質に対して生物学的効果を提供する。サイトカインまたは増殖因子の放出に
関する効果の多様性を得るために、異なる結合を有する結合体の混合物を含むこ
とが可能である。つまり、所望の放出速度を得るために、放出持続効果が変更さ
れ得る。
用語「有効な量」は、所望する効果を得るために必要とされる組成物の量を意
味する。従って、サイトカインまたは増殖因子を含有する組成物の「組織の増殖
を促進する量」とは、検出可能な程度に組織の増殖を刺激するのに必要とされる
サイトカインまたは増殖因子の量を意味する。ここでいう組織とは、結合組織、
骨、軟骨、上皮および真皮、血液、および他の組織を包含する。有効な量である
とされる実際の量は、さまざまな因子（例えば、患者の大きさ、病状（conditio
n）、性別、および年齢）に依存して変化し、医師（caregiver）により容易に決
定され得る。
本明細書中で用いられる用語「十分な量」は、本発明の結合体と組み合わせて
用いられるキャリアの量を示すのに用いられる。十分な量とは、それを結合体と
混合したときに、所望の物理的形態（例えば、注入可能な溶液、注入可能な懸濁
液、可塑性または順応性の移植片、応力に耐える固い移植片、糸状物、チューブ
など）が得られる量である。注入可能な処方物は、一般に、組成物をなめらかで
注入可能にするのに十分な量の流動性キャリアを含むのに対して、順応性の移植
片は、キャリアの量が実質的に少量であり、そして粘度様の硬度（consistency
）を有する。応力に耐える固い移植片は、キャリアを全く含み得ず、そして高度
の構造的完全性を有し得る。キャリアの量は、用いる特定の結合体、および所望
する最終結果に依存して変化し得、そして調節され得る。このような調節は、本
発明の開示を読むことにより当業者に明らかとな
る。
本明細書中で用いられる用語「適切な粒子状材料」は、実質的に水に不溶であ
り、非免疫原性であり、生体適合性であり、そして本発明の生体適合性結合体と
混和しない粒子状材料を意味する。材料粒子は、繊維状であり得、あるいは直径
約20〜250μmの大きさの範囲であり得、そして、形状がビーズ様または不規則で
あり得る。典型的な粒子状材料としては、繊維性架橋コラーゲン、ゼラチンビー
ズ、架橋コラーゲン−dPEG粒子、ポリテトラフルオロエチレンビーズ、シリコー
ンゴムビーズ、ヒドロゲルビーズ、炭化ケイ素ビーズ、およびガラスビーズが挙
げられるが、これらに限定されない。好ましい粒子状材料とは、リン酸カルシウ
ム、最も好ましくは、ヒドロキシアパタイト粒子および／またはリン酸三カルシ
ウムである。
用語「固い（solid）移植片」は、体内での挿入および使用のために設計され
る任意のブロックを意味し、そしてこれには、骨および軟骨移植片（例えば、金
属、プラスチック、および／または他の材料から構成される人工関節、保持ピン
（retaining pin）、頭部プレートなど）、縫合のために使用され得、あるいは
軟組織の増強のために注入され得る糸状物、胸部移植片（例えば、シリコーンゲ
ルエンベロープ、発泡体など）、長期間（約３日を越える）の使用を意図したカ
テーテルおよびカニューレ、本発明のチューブから形成される人工器官およびチ
ューブ（例えば、人工心臓、膵臓、腎臓、血管など）、
薬物送達用デバイス（モノリスの移植片、ポンプ、およびコ
同化成長または避妊のためのステロイドペレットなどを包含する）、皮膚または
内部使用のための縫合糸、歯根膜、レンチクル、角膜シールド、動脈瘤治療のた
めの白金ワイヤなどが包含される。用語「固い移植片」は、それ自体、本発明の
生体適合性結合体組成物から形成された移植片と、本発明の組成物でコートされ
得る、他の合成材料（例えば、シリコーン、ポリウレタン、チタニウム、白金な
ど）との両方を包含する。
本明細書中で用いられる用語「適切な繊維材料」は、実質的に水に不溶であり
、非免疫原性であり、生体適合性であり、そして本発明の生体適合性の結合体と
混和しない繊維材料を意味する。繊維材料は、これらの特性を有する種々の材料
を包含し得、そして、医療用および薬学的用途に関連して用いられる種々の移植
片またはデバイス（例えば、結合体を含有するチューブ）の構造的完全性を形成
および／または提供するために、結合体組成物と組み合わされる。本発明の結合
体組成物は、「適切な繊維材料」上にコートし得、次に、これで骨の周りを包み
得、骨の構造的完全性が提供される。従って、「適切な繊維材料」は、本発明の
「固い移植片」を形成することにおいて有用である。
本明細書中で用いられる用語「インサイチュ」は、「投与の部位で」を意味す
る。従って、注入可能な反応混合組成物
は、増強が必要な部位へ注入されるか、あるいは付与され、そして注入部位で架
橋する。適切な部位は、一般に、皮膚の支持を増強するためには皮内または皮下
領域であり、傷の治癒および骨の修復のためには骨折部位であり、そして、括約
筋増強のためには（例えば、自制の回復のためには）括約筋組織内である。
用語「水性混合物」としては、天然ポリマーおよび水を含有する流体溶液、懸
濁液、分散体、コロイドなどが挙げられる。
本明細書で用いられる用語「NFC軟骨」は、生理学的硬度の点で軟骨と類似し
ている本発明の組成物を意味する。NFC軟骨は、非繊維性コラーゲン（例えば、
コラーゲン溶液）から調製され、親水性ポリマー（特にdPEGが用いられる）と架
橋している。製造工程の加工品（artifact）として、またはデザインにより、NF
C軟骨は、約０〜２０％の繊維性コラーゲンを含み得る。NFC軟骨は、通常、コラ
ーゲンの酸性溶液に、酸性溶液中のdPEGを加えること、および、中和の前に結合
を生じさせることにより調製される。用語「NFC-FC軟骨」は、NFC軟骨と類似の
組成物（繊維性コラーゼンのパーセンテージが約２０〜８０％である）を意味す
る。NFC-FC軟骨は、通常、コラーゲンの酸性溶液に、中性緩衝液中のdPEGを加え
ることにより調製される。中性緩衝液は、結合工程の間にコラーゲン繊維の形成
を起こさせる。同様に、「FC軟骨」は、繊維性コラーゲンおよび二官能性親水性
ポリマーから調製される本発明
の組成物を意味する。FC軟骨は、通常、中性溶液／懸濁液中のdPEGおよび繊維性
コラーゲンを用いることにより調製され得る。
Ｂ．一般的方法
Ｂ． １ 調製：
本発明の生体適合性結合体を形成するために、天然ポリマーまたはそれらの誘
導体は、親水性合成ポリマーと化学的に結合するべきである。これは、多くの方
法を用いて達成され得る。好適な方法に従えば、親水性合成ポリマーが活性化さ
れ、次いで、天然ポリマーと直接反応する。他の方法においては、天然ポリマー
に存在するヒドロキシル基またはアミノ基が活性化され得、活性化基がポリマー
と反応して結合体を形成する。あまり好適でない方法に従えば、天然および合成
ポリマーが同時に反応し、生体適合性結合体が形成されるような方法で、活性化
されたヒドロキシル基またはアミノ基を有する結合基が、合成ポリマーおよび天
然ポリマーと組み合わせられ得る。他の生体適合性結合体を形成する方法は、本
明細書の開示を読めば当業者において明白となる。本発明の結合体は人体内で用
いられるので、全ての成分（ポリマーおよび結合基の両方を含む）が患者と反応
しまたは患者により拒絶されるおそれのない結合体を形成することが重要である
。従って、毒性の、および／または、免疫反応性の成分は、出発材料として好ま
しくない。いくつかの好ましい出発材料お
よび結合体の形成方法を、以下にさらに記載する。
種々の親水性合成ポリマーが、結合体を形成するために用いられ得るが、この
ポリマーは、生体適合性で、比較的不溶性で、さらに親水性でなければならず、
そして好ましくは、生体適合性が知られていることから１種またはそれより多い
ポリエチレングリコール（PEG）の形態である。種々の形態のPEGが、生物学的に
活性な分子の修飾に広く用いられる。なぜなら、PEGは、広範囲の溶解性を有す
るように処方され得、そして、それは、毒性、抗原性、免疫原性がなく、そして
典型的には酵素活性および／またはペプチドの立体配座を妨げないからである。
さらに、PEGは、一般に非生分解性であり、そしてヒトを含む殆どの生体から容
易に抽出される。
本発明の結合体を形成する際の第一の工程には、PEG分子の官能化が一般に包
含される。種々の官能化ポリエチレングリコールが、さまざまな分野（例えば、
タンパク質修飾（Abuchowskiら、Enzymes as Drugs， John Wiley＆Sons: New Y
ork，
NY（1981）pp．367〜383;およびDreborgら、Crit． Rev．Therap． Drug Carr ier Syst．
（1990）6:315（これら両者は本明細書中で参考として援用されてい
る）を参照のこと）、ペプチドの化学（Mutterら、The Peptides， Academic: N
ew York，NY 2:285〜332；およびZalipskyら、Int． J． Peptide ProteIn Res ．
（1987）30:740（これら両者は本明細書中で参考として援用されている）を参
照のこと）、およびポリマー薬物の合成（Zalipskyら、Eur．Polym．J．（1983
）19:1177；および
Ouchiら、J．Macromol．Sci．-Chem．（1987）A24:1011 （これら両者は本明細
書中で参考として援用されている）を参照のこと））において効果的に用いられ
てきた。ポリエチレングリコールと薬学的に活性な特定のタンパク質との結合に
より形成される種々のタイプの結合体は、生体内におけるタンパク質の消化、免
疫原性の低下、および半減期の増加に関連するこのような結合体の安定性を有す
るために、部分的な医療用途に有用であることがすでに開示され、そして認めら
れている。
特に有用であると認められるポリエチレングリコールの一形態は、モノメトキ
シ−ポリエチレングリコール（mPEG）であり、これは、塩化シアヌールのような
化合物の添加により活性化され得、次いでタンパク質と結合し得る（Abuchowski
ら、J．Biol．Chem．（1977）252:3578（これら両者は本明細書中で参考として
援用されている）を参照のこと）。活性ポリエチレングリコールのこのような製
造方法は、本発明のある実施態様に関して用いられ得るが、これらの方法は、塩
化シアヌールが比較的毒性であり、そして薬学的に受容可能な組成物を提供する
ためには、得られたいずれの生成物からもこの塩化シアヌールを完全に除去しな
ければならないので、特に望ましくはない。
PEGの活性化形態（mPEGの活性化形態を包含する）は、市販で購入され得る反
応成分から作成され得る。本発明に関して特に有用であると認められる活性化PE
Gの一形態は、mPEG-ス
クシネート-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SS-PEG）である（Abuchowsk
iら、Cancer Biochem.Biohvs．（1984）7:175（これは本明細書中で参考として
援用されている）を参照のこと）。SS-PEGのようなPEGの活性化形態は、比較的
穏やかな条件下でタンパク質と反応し、そして、PEGと結合したタンパク質の特
定の生物学的活性および特異性を損なうことなく結合体を製造する。しかしなが
ら、このような活性化PEGは、タンパク質と反応する際、それらが反応し、そし
てエステル結合を介した結合を形成する。エステル結合は本発明に関して用いら
れ得るが、それらは、長期間にわたって生理学的条件下に供されると加水分解を
受けるので、特に好ましくはない（Dreborgら、Crit． Rev． Therap． Drug Ca rrier Syst．
（1990）6:315；およびUlbrichら、J． Makromol． Chem．（1986
）187:1131（これら両者は本明細書中で参考として援用されている）を参照のこ
と）。
ウレタン結合を介してPEGとタンパク質とを結合させることは可能であり、そ
れによって、エステル結合よりも加水分解に対してさらに耐性のさらに安定な結
合が提供される（Zalipskyら、Polvmeric Drug and Drug Deliverv Svstems、第
１０章、「ポリエチレングリコールのスクシンイミジルカーボネート」（1991）
（これは、特定の生物学的活性タンパク質に対するPEGの種々の形態を結合する
ことに包含される化学を開示するために本明細書中で参考として援用されている
）を参照のこと）。ウレタン結合の安定性は、生理学的条件下におい
て示された（Veroneseら、Appl．Biochem．Biotechnol．（1985）11:141；およ
びLarwoodら、J． Labelled Compounds Radiopharm（1984）21:603（これら両者
は本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。PEGとタンパク質
とを結合させる他の手段は、カルバメート結合によるものであり得る（Beaucham
pら、Anal．Biochem．（1983）131:25；およびBergerら、Blood （1988）71:164
1 （これら両者は本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。カ
ルバメート結合は、カルボニルジイミダゾール−活性化PEGを用いることにより
生成される。この結合はいくつかの利点を有するが、反応は比較的遅く、そして
完結するのに２〜３日かかり得る。
上記のPEGを活性化する種々の手段、および、活性手段に関して引用した文献
（これらは全て本明細書中で参考として援用されている）では、PEGと特定の生
物学的に活性なタンパク質とを結合することに関して記載されているが、不活性
な（生物学的に活性でない）天然ポリマーと結合することは記載されていない（Polymeric Drug and Drug De1ivery Systems
、第10章、「ポリエチレングリコ
ールのスクシンイミジルカーボネート」（1991）（これは、特定の生物学的活性
タンパク質に対するPEGの種々の形態を結合することに包含される化学を開示す
るために本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。コラーゲン
はまた、1992年11月10日に発行された米国特許第5,162,430号に教示されている
ように、エステル結合を介したPEGと結合する（これもまた本明細書中で参
考として援用されている）。本発明は、活性化PEG化合物が、不活性で種々の異
なるタイプの結合と共に保持する生体適合性の結合体の形成に関して用いられ得
ることを開示するものである。このような結合体は、一連の改良された予想し得
ない性質を提供し、そして、本発明の種々の組成物および物品を形成するために
用いられ得る。
Ｂ．２ 活性化ＰＥＧの特定の形態
上述したように、本発明の結合体は、多様な異なるタイプの親水性合成ポリマ
ーと天然ポリマーまたはそれらの誘導体との共有結合により調製され得る。しか
しながら、得られた最終生成物または結合体は、生体適合性および非免疫原性な
どの多くの性質を有していなければならないという点で、親水性合成ポリマーと
してポリエチレングリコールを用いることが有効であることが見い出されている
。ポリエチレングルコールは、分子の１つまたは好ましくは２つの末端に活性化
基を提供するためには修飾されていなければならず、その結果、PEGと天然ポリ
マーとの間で共有結合が生じる。いくつかの官能化されたPEGの特定の形態を以
下に構造的に示し、これらのPEGの官能化された形態と天然ポリマーまたはそれ
らの誘導体との反応により得られた反応生成物も同様に示す。
１．天然ポリマーのＰＥＧ結合：
最初の官能化PEGは、二官能性PEGスクシンイミジルグルタレートであり、本明
細書中では（SG-PEG）と表記する。この分子の構造式、およびそれとアミノ基NH2
を有する天然ポリマー（NTL-PLYMと示す）とを反応させて得られる反応生成物
を以下の式１に示す。
SG-PEG：二官能性PEGスクシンイミジルグルタレート
他のPEGの二官能性活性化形態は、PEGスクシンイミジル（S-PEG）と称される
。この化合物の構造式、およびそれと天然ポリマーとを反応させて得られる反応
生成物を以下に示す。メ
チル基が分子の各末端に３回繰り返されることに注目するべきである。この化合
物の一般構造式においては、下付き文字３は、「ｎ」で置換される。式１および
２に示される特定の実施態様においては、PEGの両側に繰り返しのCH2基が３つあ
るので、ｎは３である。式２における構造体は、二官能性PEGと各末端の天然ポ
リマーとの間の「エーテル」結合を含む。このエーテル結合は加水分解されない
。これは、エステル結合が提供された式１に示される結合体とは異なる。このエ
ステル結合は、生理学的条件下で加水分解を受ける。
S-PEG， ｎ＝３：二官能性ＰＥＧスクシンイミジル
さらに、誘導体化PEGとコラーゲンとを反応させることにより形成される結合
体である、他のポリエチレングリコールの誘導体化形態（ｎ＝２）を式３に示す
。
S-PEG，ｎ＝２：二官能性ＰＥＧスクシンイミジル
式２および３において提供される結合体と同様の本発明の他の好ましい実施態
様は、ｎ＝１のときに提供される。構造式および得られる結合体を式４に示す。
この結合体が、エーテル結合およびペプチド結合の両方を含むことが注目される
。
これらの結合は、生理学的条件下で安定である。
S-PEG，ｎ＝１：二官能性ＰＥＧスクシンイミジル
PEGのさらに他の誘導体化形態は、ｎ＝０のときに提供される。この二官能性
形態は、PEGスクシンイミジルカーボネート（SC-PEG）と称される。この化合物
の構造式、およびSC-PEGとコラーゲンとを反応させることにより形成される結合
体を式５に示す。この結合はウレタン結合を含んでいるが、この結合体は生理学
的条件下で高度な安定性を有することは認められない。
SC-PEG，ｎ＝０：二官能性PEGスクシンイミジルカーボネート
上記の全ての誘導体は、スクシンイミジル基を中に含む。しかしながら、異な
る活性基が、PEG分子の一端または両端に結合し得る。例えば、PEGは、A-PEGと
天然のポリマーまたはその誘導体との反応により形成される結合体であるような
式６に示す二官能性PEGプロピオンアルデヒド（A-PEG）を形成するために誘導体
化され得る。
A-PEG：二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド
さらに、ポリエチレングリコールの他の二官能性形態は、天然のポリマーまた
はその誘導体とを反応させることにより形成される結合体であるような、式７に
示すPEGグリシジルエーテル（E-PEG）である。
E-PEG：二官能性ＰＥＧグリシジルエーテル
官能化された形態のPEGを用いて形成された結合体は、反応に用いられるPEGの
官能化された形態に依存して変化する。さらに、最終生成物も、PEGの分子量を
変化させることにより、その性質に関連して変化し得る。一般に、結合体の安定
性は、PEGと天然ポリマーとの間のすべてのエステル結合を排除すること、およ
び、エーテル結合および／またはウレタン結合を含有することにより改良される
。ある状況では、所望により弱いエステル結合を含有し、この結合が生理学的条
件下での加水分解、マトリックスの破壊、そして内部に保持されている成分（例
えば、増殖因子またはサイトカイン）の放出によ
り、徐々に破壊される。結合の化学的構造の変化により、持続する放出の速度を
変化させ得る。
２．多糖類のPEG結合：
ヒアルロン酸は、以下の式８に示すような繰り返しモノマーユニットのポリマ
ーを含む。
ヒアルロン酸は、多くの異なる方法を用いてPEGに結合し得る。好ましい方法
としては、カルボキシル基の修飾およびアセチル基の修飾が包含される。PEG-ヒ
ドラジンを用いたヒアルロン酸のカルボキシル基の修飾を示す反応スキームを、
図
８に示す。スクシンイミジル-PEG（S-PEG）によるアセチル基の修飾を示す反応
スキームを図９に示す。
３．プロテオグリカンのPEG結合：
図１０に示すように、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、および
デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）は、ヒアルロン酸と同様の構造をして
おり、そしてヒアルロン酸を誘導体化するために用いられる方法とほぼ同じ方法
を用いて、誘導体を製造することによってPEGに結合され得る。
４．ポリ乳酸のPEG結合：
エステルは、求核置換を受ける。これはカルボン酸誘導体に典型的である。攻
撃は、電子が不足しているカルボニル炭素に起こる。これらの反応は、しばしば
、酸の存在下で行われる。これらの酸-触媒化反応において、H+がカルボニル基
の酸素に結合し、カルボニル炭素が求核攻撃をさらに受け易いようにする。この
ようなことを示す反応スキームを図１１に示す。
５．ポリエチレンのPEG結合：
多くの異なる活性化PEG（二官能性および多官能性の両方）が、ポリエチレン
を架橋するために用いられ得る。高度に張力がかかった（highly strained）三
員環は開環が容易であるので、二官能性または多官能性のE-PEGが、ポリエチレ
ンを架橋する
ために用いられ得る。環の結合角（平均60度）は、通常の４面体構造の炭素の角
度である109度よりかなり小さい。ポリエチレンは温度を上げても、多くの天然
のポリマー、例えば、コラーゲンと同様には容易に変性しないので、温度を上げ
てポリエチレンを架橋するためにE-PEGが用いられ得る。
二官能性のE-PEGとポリエチレンとの反応を以下に示す：
二官能性のS-PEGとポリエチレンとの反応を以下に示す：
2 PEG-NH2 + d S-PEG→PEG-NH-CO-PEG-CO-NH-PEG
ポリエチレンとE-PEGおよびS-PEGの多官能性活性化形態との反応を、それぞれ
、図１２および１３に示す。
天然のポリマーと合成のポリマーとの間の架橋反応はインビトロで行われ得る
か、あるいは反応混合物はインサイチュで架橋させるために注入され得る。十分
な密度において、架橋した生体適合性結合体は軟骨に似ており、その代替物（例
えば、頭部アンレー、耳および鼻の再構築など）として有用である。天然のポリ
マー間で結合体を形成することに加えて、
多官能性ポリマーはまた、創傷治癒、骨形成、および免疫調節に特に適切な組成
物のために、天然のポリマーと他のタンパク質（特にサイトカインまたは増殖因
子）とを共有結合するためにも用いられ得る。このような増殖因子またはサイト
カインと生体適合性ポリマー（例えば、コラーゲン）とをつなぎとめることによ
り、効果的に遅い放出のドラッグデリバリーシステムが提供される。天然ポリマ
ーと合成ポリマーとの結合のためにエーテル結合が用いられ得るのに対し、サイ
トカインまたは増殖因子を結合するためにエステル結合が用いられ得、そしてそ
れによってサイトカインまたは増殖因子の遅い放出が得られる。
６．コラーゲンのPEG結合：
本発明で使用するための適切なコラーゲンには、あらゆるタイプのコラーゲン
（免疫応答感受性が著しくない状態において用いられ得る天然のテロペプチド含
有コラーゲンを含む）が含まれる。しかし、大多数の用途としては、非免疫原性
アテロペプチドコラーゲン、特にＩ、II、およびIII型が好まし
100コラーゲン溶液）そしてテロペプチド領域を有し得るかまたは有し得ない。
好ましくは、コラーゲンは、再構成された
ゲン移植片（Collagen Implant）（ZCI）またはアテロペプチドコラーゲン溶液
（CIS）である。種々の形態のコラーゲンが市販さ
れているか、または、例えば米国特許第3,949,073号；同第4,488,911号；同第4,
424,208号；同第4,582,640号；同第4,642,117号；同第4,557,764号；および同第
4,689,399号（すべて本明細書中で参考として援用されている）に記載の方法に
よって調製され得る。非繊維性コラーゲン、アテロペプチドコラーゲン、再構成
されたコラーゲンは、ある種の生成物を形成するために好ましい。コラーゲンと
親水性合成ポリマー（例えば、PEG）とを結合する方法は、米国特許第5,162,430
号に詳細に記載されている。
本発明の組成物は、天然のポリマー、またはその誘導体（これは、一種または
複数の選択された親水性合成ポリマーに化学的に結合している）を含む。天然ポ
リマー（例えば、コラーゲン誘導体）は、親水性合成ポリマーと結合するために
用いられ得る多くの利用可能なアミノ基およびヒドロキシ基を含有する。このポ
リマーは「連結基」を用いて結合され得る。これは天然のポリマーおよび合成ポ
リマー上の本来のヒドロキシ基またはアミノ基が、連結され得る前に、しばしば
活性化を必要とするからである。例えば、ジカルボン酸無水物（例えば、グルタ
ル酸無水物またはコハク酸無水物）のような化合物を用い得、ポリマー誘導体（
例えば、スクシネート）を形成し得る。次いで、これは適切な脱離基によるエス
テル化によって活性化され得る。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド、N,N’-
ジスクシンイミジルオキサレート、N，N’-ジスクシンイミジルカーボネートな
ど。さらなる連結基に
ついては、Davisの米国特許第4,179,337号もまた参照のこと。ポリマー-グルタ
レート組成物を形成するために用いられる現在のところ好ましいジカルボン酸無
水物には、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物、1,8-ナフタレンジカルボン酸
無水物、および1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物が包含される。こ
のようにして活性化されたポリマーは、次いで、天然のポリマーと反応して本発
明の生体適合性結合体を形成する。エステル結合による結合体
ある実施態様においては、薬学的に純粋な形態のモノメチルポリエチレングリ
コール（mPEG）（mw 5,000）をグルタル酸無水物（純粋な形態）と反応させて、
mPEGグルタレートを作成する。次いで、このグルタレート誘導体をN-ヒドロキシ
スクシンイミドと反応させて、スクシンイミジルモノメチルポリエチレングリコ
ールグルタレートを形成する。次いで、スクシンイミジルエステル（mPEG*、活
性化PEG中間体を示す）は、ある種の天然ポリマー上に存在する遊離アミノ基（
リシン残基）と反応し得る。この反応によって、PEG分子の一つの末端が遊離し
ているかまたは結合していない、本発明の天然ポリマー-PEG結合体が生成する。
他のポリマーは、上記のように、モノメチルPEGに置換され得る。同様に、この
結合反応は、タンパク質および合成ポリマーを誘導体化するための公知のいかな
る方法を用いても達成され得る。結合しているリシンの
数は、１つの残基〜リシンの100％まで変化し得、好ましくは10％〜50％であり
、そしてさらに好ましくは20〜30％である。反応性リシン残基の数は、標準的な
方法（例えば、TNBSとの反応）により決定され得る。
二官能性PEGを用いることにより、同一または異なる天然ポリマーあるいはサ
イトカインを、PEGの他の末端に結合させることが可能である。さらに、PEGと任
意の天然ポリマーおよび／または他の分子とを結合させる結合は、エステル、エ
ーテル、および／またはウレタン結合であり得、そして好ましくはエーテル結合
である。骨修復のための組成物
骨欠損または偽関節の修復に適切な処方物は、必要に応じて適切な粒子状材料
と混合して、生体適合性結合体の高濃度組成物を与えることによって調製され得
る。骨の修復組成物を作成するときには、コラーゲンとポリマーとの結合は、好
ましくは、エステル結合の加水分解による劣化を避けるため、エーテル結合であ
る。このような結合体／粒子状組成物は、取り込まれた液体の量に依存して、順
応性または剛直であり得る。応力に耐える骨の治療のための処方物は、好ましく
は乾燥され、そして剛直であり、そして一般に約４５％と８５％との間の粒子状
のリン酸カルシウム無機質（例えば、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カル
シウム、あるいは、これらの混合物）を含有する。引張強度および剛直さは、こ
の
組成物を真空で約６０〜９０℃）好ましくは約７５℃で、約５〜１５時間、好ま
しくは約１０時間、加熱することによってさらに増大され得る。順応性の組成物
は、応力がかからない骨または軟骨の修復のために用いられ得る。
活性化mPEG*が、二官能性活性化PEG（dPEG*、例えば、非メチル化PEGであり、
次いで各末端を活性化する）で、全体または一部置換されることにより、架橋ま
たは部分的架橋組成物が提供され得る。このような組成物は、しかしながら、従
来の（例えば、熱、放射線、グルタルアルデヒドなどを用いた）架橋コラーゲン
組成物とは全く異なる。それは、長鎖の親水性合成ポリマーが、組成物に対して
実質的な親水性特性を与えるからである。現在の好ましい実施態様において、PE
Gの約１〜20％は二官能性活性化PEGである。組成物の特性は、含まれる二官能性
活性化PEGの量を変化させることによって、所望のように調節され得る。
現在の他の好ましい実施態様において、二官能性活性化PEG*（ｐＨ ７で実質
的に100％）は、天然ポリマーまたはその誘導体を架橋するために用いられる。
ある例において、CIS（約３〜100mg/mL、好ましくは約10〜40mg/mL）を、約2,00
0〜約100,000（好ましくは約3,400〜20,000）の分子量を有するdPEG*（酸無水物
の添加により各末端が活性化した二官能性PEGであって、スクシンイミドのよう
な脱離基を有する）と反応させる（濃縮溶液として、反応混合物の最終濃度が約
５〜40％、好ましくは約10〜20％となるように加える）。これは、
モル基準で、コラーゲンに対してdPEG*の５〜10倍過剰を表す。コラーゲン分子
は、機械的混合または撹拌なしでdPEG*と結合し、そして溶液から沈殿して、約2
0〜80％の繊維性コラーゲンを含有する軟骨様のコラーゲン−ポリマー結合体を
生成する。次いで、この結合体をPBSで洗浄し、残留するいかなる未反応dPEG*を
も除去することによって、本発明の材料が提供される。軟骨様のコラーゲン−ポ
リマー結合体はまた、dPEG*溶液（ｐＨ３）とコラーゲン溶液とを２本のシリン
ジの間で均質に混合し、次いで適切な容器（例えば、ペトリ皿）ヘキャスティン
グすることにより調製され得る。次いで、20％w/vのdPEG*溶液（ｐＨ７）を非繊
維性コラーゲン−PEG溶液に加えると、少し軟骨様の繊維性コラーゲン−ポリマ
ー結合体が生成する。得られたNFC-FC結合体軟骨は、約１〜40％の繊維性コラー
ゲンを含有する。
最終生成物の特性は、最初の反応成分および反応条件を変化させることによっ
て調節され得る。例えば、コラーゲン以外の天然ポリマーが用いられ得る。一般
に、天然ポリマーまたはPEGの濃度が増加すると、より密度の高い、孔の殆どな
い生成物が得られる。コラーゲン溶液およびdPEG*溶液のｐＨを変化させること
によって、組成物は、繊維性コラーゲン含量が広範囲にわたって製造され得る。
所望であるならば、高密度処方物は、望ましい任意の形状（例えば、シート、膜
、チューブ、円柱状、糸状物、コード、ロープなど）にキャストまたは成形され
得る。いくつかの形状は、押出しにより製造
され得る。胸部移植片
生体適合性ポリマー結合体はまた、胸部移植片のコーティングとして使用され
得る。標準的なシリコーンのシェル状移植片の表面は、化学的に誘導体化され、
天然ポリマーと結合した二官能性または多官能性PEGのための活性な結合部位を
与え得る。そして以下のような三部分結合体が得られる：（天然ポリマー−PEG
−シリコーン）。PEGを介してシリコーンに直接結合した結合体コーティングの
存在は、瘢痕組織の形成および被膜の痙縮（capsular contracture）を減少させ
るように機能する。典型的なコートされた胸部移植片とは違って、瘢痕組織は、
結合体コーティングと移植片自身の表面との間では成長できない。
あるいは、結合体は、胸部移植片シェルとして使用するための中空スフェアに
形成され得る。このシェルを、次いでマンモグラフィを容易にするためにトリグ
リセリドのような放射線不透過物質で充填し得る。コートされた医療用デバイス
注入可能な結合体処方物（ゲルまたは溶液）は、移植片、カテーテル、チュー
ブ（例えば、血管代替物として）、メッシュ（例えば、組織強化のために）、糸
状物などをコートするために用いられ得る。生体適合性結合体処方物はまた、白
金ワイヤをコートするために用いられ得、次いでカテーテルを介して動脈瘤部分
に施され得る。ゲルは、種々のポリマー濃度および異なる反応時間で調製され得
る。所望の特性が高密度、剛性、粘度、および半透明性であるときは、CISが好
ましい出発材料である。しかしながら、異なる特性（例えば、高不透明性、フレ
キシビリティー、および移植後の細胞のコロニー化に対する感受性）を有する生
成物を得るためには、繊維性コラーゲン（好ましくは、ZCIのようなアテロペプ
チド繊維性コラーゲン）および他の天然ポリマーが代用され得る。移植のために
設計されたコーティング物品（例えば、カテーテルおよび応力に耐える骨移植片
）には、CISベースの材料が現在のところ好ましい。CIS材料は、エーテル結合で
PEGと結合している。
本発明の組成物（特に架橋したコラーゲン組成物）はまた、移植のための、
すなわち体内において比較的長期間残留させるためのコーティング物品に有用で
ある。このような表面処理によって、目的物は非免疫原性となり、そして同様に
異物反応の発生が低下する。従って、本発明の組成物は、カテーテル、カニュー
レ、骨補てつ、軟骨代替物、胸部移植片、ミニポンプおよび他の薬物送達デバイ
ス、人工器官などに応用され得る。この応用は、架橋が起こっている間に目的物
を反応混合物に浸漬し、そして粘着性の粘性コーティングを乾燥させることによ
って達成され得る。浸漬が不可能な場合は、反応混合物を浴びせるか、刷毛で塗
るか、または塗布し得る。
あるいは、フレキシブルなシート状または膜状の形態のコラーゲン−ポリマー結
合体を用いて目的物に巻き付け、隅部および端部を反応混合物で密封し得る。
他の実施態様において、目的物は、目的物が完全にコートされるまで、粘性の
コラーゲン溶液浴または繊維性コラーゲン溶液中に浸漬され得る。コラーゲンで
コートされた目的物をdPEG*（ｐＨ７）溶液浴に浸漬し、次いでコラーゲン−ポ
リマーでコートされた目的物を乾燥させることによって、コラーゲン溶液は目的
物に固定される。あるいは、上記のように、粘性のコラーゲン溶液をdPEG*（ｐ
Ｈ３）溶液と混合し、そして迅速に重合させる。目的物を酸性のコラーゲン−ポ
リマー溶液中に浸漬し、そしてコートされた目的物を、約20重量％のdPEG*（ｐ
Ｈ７）を含有する中和化緩衝液へ浸漬して硬化させることによって、コラーゲン
−ポリマーでコートされた目的物が生成する。コートされた移植片
胸部移植片に加えて、本発明の生体適合性結合体は、種々の異なるタイプのコ
ートした移植片を製造するために用いられ得る。結合体は、例えば、PEGのよう
な合成ポリマーとヒアルロン酸のような天然ポリマーとを結合させることにより
形成され得る。形成された生体適合性結合体は、任意のタイプの移植片デバイス
の表面上へコートされ得、そして移植片の生体適合性を改良するのに有用である
。多官能性PEGを用いる
こともまた可能である。多官能性PEGを用いるとき、PEGの別の活性部位が、サイ
トカインのような生物学的に活性な化合物と結合させるために用いられ得る。三
部分結合体が形成される際、それは移植片の表面上にコートされ得る。サイトカ
イン−PEG−ヒアルロン酸から構成される結合体が移植片の表面上に含まれると
、周辺細胞の移植片への成長の統合が促進される。
コートされた移植片の好ましい実施態様に従えば、多官能性PEGのような多官
能性合成ポリマーが用いられ樺る。多官能性PEGの活性部位の一つは、天然ポリ
マー（例えば、ヒアルロン酸またはコラーゲン）と結合し、多官能性PEGの別の
活性部位は、移植片表面の活性化部位と直接反応する。従って、結合体は、移植
片表面に直接、共有結合している。多くの移植片は、骨を増強または修復するた
めに、そして移植片が載置される空間内に隙間なく装着されるために用いられる
。このような場合、コートされた移植片（コーティングに用いられる結合体（例
えば、コラーゲン−PEG結合体）は、最初は多量の水を含む）を作製することが
望ましい。コラーゲン−PEG結合体を製造しそして移植片表面にコートするとき
は、次いでコーティングを乾燥し得ることにより、コーティングの大きさが実質
的に減少する。次いで、コートされた移植片は、修復または増強されるべき骨の
所定の位置に配置され、そして再吸水して組織内で膨張する。コーティングに種
々の生物学的活性化合物（例えば、サイトカインおよび増殖因子）を結
合させることに加えて、コーティングの構造的完全性を向上する助けとなり得、
そしてより不規則な表面に備え得る特定の材料を含有することによって、周辺組
織の統合の促進を補助することが可能である。コートされた移植片は、好ましく
は、エーテル結合が形成された結合体でコートされている。これは、結合体を生
体内で用いるときにはそれを維持することが好ましく、そしてエーテル結合は加
水分解に対してエステル結合よりも感受性でないからである。結合体およびサイトカインならびに／または増殖因子
生物学的に活性なサイトカインまたは増殖因子（例えば、EGFおよびTGF-β）
を含有する本発明の組成物は、適切な量のサイトカインまたは増殖因子を組成物
中に混合することによって、または、サイトカインまたは増殖因子を天然ポリマ
ーと結合させてから活性化PEGで処理することによって調製される。親水性合成
ポリマーによってサイトカインまたは増殖因子が結合した天然ポリマーからなる
結合体に関して、適量の二官能性活性化PEGを用いることにより、架橋の度合い
が規定され得る。
好ましくは、サイトカインまたは増殖因子を、まず、希釈溶液中でモル過剰の
dPEG*と３〜４時間にわたって反応させる。dPEG*を、好ましくは最終濃度が３０
〜５０倍モル過剰になるまで加え、そしてサイトカインまたは増殖因子には、好
ましくは約１μg/mL〜約５mg/mLの濃度が与えられる。次に、生成
した結合サイトカインを、ｐＨ７〜８で、水性のコラーゲン混合物（約１〜約６
０mg/mL）に加え、そしてさらに反応させる。得られる組成物を、室温で一晩放
置する。ペレットを遠心分離によって集め、そしていかなる非結合サイトカイン
または増殖因子分子をも除去するために、強くボルテックスをかけることにより
ＰＢＳで洗浄する。生体適合性糸状物
本発明のある実施態様では、生体適合性結合体は、長く延びた円柱または糸状
物を形成するために用いられる。糸状物は、約0.10mm〜約20mmの範囲の直径を有
し、そしてさらに好ましくは、約0.25mm〜約2.5mmの直径を有する。糸状物はい
かなる長さでもよいが、好ましくは約0.25cm〜約25cmの範囲の長さを有する。糸
状物の長さおよび直径は、所望の用途にかなり依存する。糸状物は、結合体材料
の成形または押し出しにより製造され得る。組織に溶解する糸状物は、外科用縫
合糸として用いられ得、そして、加水分解することによって破壊されるエステル
結合を用いた結合体から構成され得る。これらの糸状物は小片に分割され、脱水
され、そして軟組織増強のために注入され得る。軟組織増強においてさらなる組
織の定着を促進するために、糸状物は、他の生物学的活性成分（例えば、サイト
カインまたは増殖因子）を含有するように修飾され得る。膜状形態物
フレキシブルなシート状または膜状の形態物は、当該分野で公知の方法（例え
ば、米国特許第4,600,533号；同第4,412,947号；および同第4,242,291号）によ
って調製され得る。これらの方法は、本発明の生体適合性結合体を使用する膜を
製造するために用いられ得る。膜を製造するために、天然ポリマー（高濃度（10
〜100mg/mL）CISまたは繊維性コラーゲン（好ましくは、ZCIのようなアテロペプ
チド繊維性コラーゲン））を平坦なシート状の容器にキャストする。mPEG*の溶
液（約5,000の分子量を有する）をキャストコラーゲン溶液に加え、そして室温
で一晩反応させる。生成したコラーゲン−ポリマー結合体を、減菌スパチュラな
どを用いて反応溶液から取り出し、そしてPBSで洗浄して過剰の未反応mPEG*を除
去する。
次いで、得られた結合体を一定圧力をかけて圧縮し、均一な平坦シートまたは
マットを形成し得る。次いで、乾燥させて本発明の膜状移植片を形成する。より
フレキシブルな膜状形態物は、より低濃度の天然ポリマー（例えば、コラーゲン
）および高濃度の合成ポリマー濃縮物を用いることによって得られる。
あまりフレキシブルではない膜状形態物は、mPEG*ではなく、dPEG*溶液を用い
ることにより調製される。CISと緩衝溶液とを室温で混合し、そして37℃で一晩
インキュベートする。生成したゲルを一定圧力をかけて圧縮し、乾燥し、そして
洗浄により脱塩する。次いで、得られた膜をdPEG*で処理すること
により架橋させ、洗浄し、そして次に低温で乾燥させる。
あるいは、CISまたは繊維性コラーゲン（10〜100mg/mL）を、平坦なシート状
の容器にキャストする。dPEG*の溶液（22〜50％w/v）をキャストコラーゲンに加
える。この混合物を室温で数時間反応させる。反応時間を短くすると、よりフレ
キシブルな膜が生成する。得られたコラーゲン−ポリマー膜は、必要に応じて、
真空オーブンにより、あるいは凍結乾燥または風乾により脱水され得る。スポンジ
生体適合性結合体はまた、結合後の組成物の水性スラリーを凍結乾燥すること
によってスポンジの形態に調製され得る。生体適合性ポリマーチューブ
本発明の生体適合性結合体は、成形または押出しによりチューブを形成するた
めに用いられ得る。チューブは、0.25mm〜約5.0cmの範囲の外径、および0.05mm
〜約4.9cmの範囲の内径を有する。チューブは、一般に、それらの内径および外
径に関して円形の断面を有する。チューブはいかなる長さでもよいが、一般に10
mmを超える長さ、そしてさらに好ましくは10cmを超える長さを有する。チューブ
は、いかなるタイプの結合（エステル、エーテル、またはウレタン結合を包含す
る）をも有する結合体で製造され得るが、エーテル結合を用いてチューブを製造
することが好ましい。チューブは、生体の種
々のタイプのチャネル（例えば、静脈、動脈、およびファロピウス管）を修復す
るために用いられ得る。しかしながら、チューブの使用はこれらに限定されない
。軟組織の増強
本発明の組成物は種々の用途を有する。順応性で可塑性の組成物は、皮膚の増
強（例えば、皮膚の溝の充填および皮膚表面の支持）に適する注入可能な処方物
として調製され得る。このような組成物はまた、括約筋組織を増強するのに（例
えば、自制を回復するのに）有用である。このような場合では、処方物は、括約
筋組織に直接注入されてバルクを増大し、閉塞組織（occluding tissue）をより
容易に、しかも効果的に適応させる。これらの組成物は均質であり得るか、また
はマイクロゲル結合体小粒子の懸濁液として、あるいは非水性流体キャリア中に
送達されたビーズの懸濁液として調製され得る。ビーズ／粒子は再吸水し、そし
てインサイチュで膨張する。このことは、所望の接合を行うためには注入される
生成物の容量が少ないことが必要であるという点において、市販の調製物に対し
て有利である。
驚くべきことに、架橋が完結する前に、反応混合物は注入によって投与され得
る。例えば、水性コラーゲン混合物を低濃度のdPEG*溶液と配合、混合し、そし
て注入を困難にする程度（通常は約20分）まで粘度が上昇する前に、配合物を注
入または付与する。ルーアーロックハブを備えた２本のシリン
ジの間に、または二区画（dual compartment）を有する１本のシリンジ（例えば
、二連シリンジ（double barrel））を介して混合物を通すことにより、混合が
行われ得る。組成物はインサイチュで架橋し、そして移植片を所定の位置につな
ぎとめながら、内因性の組織にさらに架橋し得る。この方法では、約10〜100mg/
mLの濃度のコラーゲン（好ましくは、繊維性コラーゲン）が用いられ得るが、約
30〜80mg/mLが好ましく、最も好ましくは約33mg/mLである。dPEG*の濃度は、好
ましくは約0.1〜約３％であるが、所望であるならば、30％程度の高濃度が用い
られ得る。混合物は、増強が必要とされる部位へ直接注入され、そして炎症また
は異物反応を本質的に生じさせない。コラーゲンの反応混合物中に粒子材料（例
えば、ヒドロゲルまたはコラーゲン−dPEGビーズ、あるいはヒドロキシアパタイ
ト／リン酸三カルシウム粒子）がさらに含まれることによって、架橋後に、より
かさ高いまたはより剛直な移植片が提供される。軟骨の修復
本発明の組成物は、十分稠密かつ剛直で、軟骨の代用になる形態で調製され得
る。これらの組成物は、ある程度の構造を必要とする組織を修復しそして支持す
るために（例えば、鼻、耳、膝、喉頭、気管リング（tracheal ring）、および
関節表面の再構築において）有用である。また、適切に形成された軟骨様材料を
用いて、腰、靭帯、および血管とも置換し得
る。これらの適用では、材料は、一般にキャストまたは成形されて形状化される
。鍵および靭帯の場合は、コードまたはロープに編むために、単繊維を形成する
ことが好ましいことであり得る。構造的完全性を増強するために、強化メッシュ
（例えば、ナイロンなど）が必要に応じて取り込まれ得る。サイトカインおよび増殖因子の投与
サイトカインおよび増殖因子を含有する本発明の組成物は、特に、創傷の治癒
促進の場合のように持続的な投与に適している。骨形成誘導因子および補助因子
（TGF-βを包含する）ならびに骨形態発生タンパク質（BMP）は、骨の置換、増
強、および／または欠損修復のための組成物に有利に取り込まれ得る。膜形態で
提供される組成物は、拒絶を抑制しそして組織成長の向上を誘導するために、移
植器官を包む（wrap）またはコートするのに用いられ得る。同様に、増殖因子−
ポリマー結合体およびコラーゲンの架橋反応混合物を用いて、移植のための器官
がコートされ得る。あるいは、TNF、インターフェロン類、CSF類、TGF-βなどの
ような抗ウィルスおよび抗腫瘍因子が、それらの薬学的活性を得るために投与さ
れ得る。使用する組成物の量は、処置する状態の程度、組成物中に取り込まれた
因子の量、所望の送達速度などに依存する。しかしながら、これらのパラメータ
は、通常の実験で（例えば、以下の実施例に挙げるモデル組成物を調製し、そし
て適切な実験モデルで活性化合物の放出速度をアッセイすることによ
り）、容易に決定され得る。
実施例
結合体、そのような結合体を取り込んだ処方物、物品、および移植片の作成方
法の完全な開示および説明を当業者に提供するために、以下の実施例を示す。こ
れらの実施例は本発明の範囲の限定を意図していない。使用される数値（例えば
、量、温度、分子量など）に関して正確にする試みがなされているが、いくらか
の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されていなければ、部は
重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大
気圧または大気圧付近である。
実施例１
（コラーゲン−PEGの調製）
（Ａ）モノメチル−PEG5000（50g、10mmol、Aldrich Chemical Co．）を1,2-
ジクロロエタン（250mL）に溶解し、そしてグルタル酸無水物（５ｇ）およびピ
リジン（４mL）と共に窒素下で３日間還流状態で加熱する。次に、この溶液を濾
過し、溶媒をエバポレートし、そして残渣を水（100mL）に溶解し、ジエチルエ
ーテル（２×50mL）で洗浄する。得られるＰＥＧ−グルタレートを、水中からク
ロロホルム（２×50mL）で抽出し、そしてこのクロロホルムをエバポレートして
、ＰＥＧ−グルタレート約43gを得る。次に、このPEG−グルタレートを37℃でジ
メ
チルホルムアミド（DMF、200mL）に溶解し、そしてN−ヒドロキシスクシンイミ
ド（10％モルxs）を加える。この溶液を０℃に冷却し、そして当量のジシクロヘ
キシルカルボジイミドをDMF溶液（10mL）に加える。この混合物を室温で24時間
放置し、次いで濾過する。次に、冷ベンゼン（100mL）を加え、そして０℃で石
油エーテル（200mL）を加えることで、PEG-スクシンイミジルグルタレート（PEG
-SG）を沈殿させる。この沈殿物を焼結ガラスフィルター上に集める。ベンゼン
に溶解し、その後石油エーテルで沈殿させることを３回繰り返して、「活性化」
PEG（PEG-SG）を与える。
0.004mmol）を0.2Mリン酸緩衝液（44mL）と混合し、pHを7.4まで上昇させた。次
に、３倍モル過剰のSG-PEG（6.00g、1.2mmol）を、注入のため水に溶解し（40mL
）、そして滅菌濾過した。次いで、このSG-PEG溶液を上記コラーゲン溶液に加え
、そしてこの混合物を17〜22℃で約15時間置いた。次に、この溶液を遠心分離し
、そして得られたペレット状の再構成フィブリル（25g）を集め、リン酸緩衝生
理食塩水（PBS、３×400mL）で洗浄して、残留したPEGを除去した。得られた材
料は固形で、緊密な弾性を有し、スパチュラでつまみ上げることができる
植片はもっと流動体である）。得られた材料はPBSで希釈されることにより、濃
度20.5mg/mLのコラーゲン−PEGを有する分散液を与え得る。
（Ｂ）ポリエチレングリコールの代わりにポリプロピレングリコールおよびPO
E-POPブロックポリマーを用いること以外は、上記（Ａ）と同様に行い、対応す
るコラーゲン−PPGおよびコラーゲン−POE-POP組成物を調製する。
（Ｃ）二官能性PEG3400（34g、10mmol、Aldrich ChemicalCo．）を1,2-ジクロ
ロエタン（250mL）に溶解し、そしてグルタル酸無水物（10g）およびピリジン（
４mL）と共に窒素下で３日間還流状態で加熱する。次に、この溶液を濾過し、溶
媒をエバポレートし、そして残渣を水（100mL）に溶解し、ジエチルエーテル（
２×50mL）で洗浄する。得られるPEG−ジグルタレートを、水中からクロロホル
ム（２×50mL）で抽出し、そしてこのクロロホルムをエバポレートして、PEG−
ジグルタレートを得る。次に、このPEG−ジグルタレートを３７℃でDMF（200mL
）に溶解し、そしてN−ヒドロキシスクシンイミド（10％モルxs）を加える。こ
の溶液を０℃に冷却し、そして当量のジシクロヘキシルカルボジイミドのDMF溶
液（10mL）を加える。この混合物を室温で24時間放置し、そして濾過する。次に
、冷ベンゼン（100mL）を加え、そして０℃で石油エーテル（200mL）を加えるこ
とで、PEG-ジ（スクシンイミジルグルタレート）（dPEG-SG）を沈殿させる。こ
の沈殿物を焼結ガラスフィルター上に集める。ベンゼンに溶解し、その後石油エ
ーテルで沈殿させることを３回繰り返して、「活性化」dPEG（dPEG*）を与える
。
0.004mmol）を0.2Mリン酸緩衝液（44mL）と混合し、pHを7.4まで上昇させた。次
に、３倍モル過剰のdPEG*（6.00g、1.2mmol）を、注入のため水に溶解し（40mL
）、そして滅菌濾過した。次いで、このdPEG*溶液を上記コラーゲン溶液に加え
、撹拌し、そしてこの混合物を17〜22℃で約15時間置いた。この溶液を遠心分離
し、そして得られたペレット状の再構成フィブリルを集め、PBS（３×400mL）で
洗浄して、残留したdPEG*を除去した。次に、このペレットをシリンジに入れ（
このシリンジはルアーロックハブで二番目のシリンジとつながっている）、そし
て、均質になるまでシリンジ間を交互に通過させた。得られた材料は、溶液中に
不均一なサイズのフィブリルが懸濁したマイクロゲルまたは粒子状の懸濁液であ
る（マイクロゲル結合体）。この材料は平滑で、柔軟な、ゴム状の固まりであり
、光沢のある外観を有している。
（Ｄ）軟骨結合体の調製：
約20重量％のdPEG*（pH７）をコラーゲン溶液（33.8mg/mL）に加え、21℃で約
16時間インキュベートした。得られた結合体を、12時間かけてPBS 100mLで３〜
５回洗浄した。得られた軟骨非繊維性コラーゲン−ポリマー結合体（NFC-FC軟骨
）は緊密な弾性を有する半透明の固体であった。この生成物は約20〜80％の繊維
性コラーゲンを含んでいた。
他のNFC軟骨組成物を、dPEG*溶液（0.6g、pH3）とコラーゲン溶液（33.8mg/mL
、pH2）とを混合することにより調製した。この溶液を、ルアーロックでつなげ
た２本のシリンジの間を通
過させて、均質な溶液を調製した。次に、dPEG*の中和緩衝液溶液を（20％w/v）
添加し、実質的に非繊維性のコラーゲン（NFC）軟骨材料とした。得られた生成
物は約１〜40％の繊維性コラーゲンを含んでいた。
あるいは、CISのかわりに繊維性コラーゲンを用い、不透明な外観と高い繊維
含量を有する軟骨繊維性コラーゲン−ポリマー結合体（FC軟骨）を生成し得る。
このようなFC軟骨は、非繊維性生体適合性結合体よりも、多孔質でかつ透過性で
ある。
実施例２
（定性（characterization））
（Ａ）実施例１Ａで調製したコラーゲン−mPEGを定性し、
ヒド−架橋繊維性コラーゲン（GAX）と比較した。押出し（extrusion）
：
このアッセイでは、30ゲージの針からテスト組成物を押出すのに必要とされる
力を測定した。得られた結果は、滑らかにZCIを押出すことができる、プランジ
ャーの移動距離に対する必要とされる力（ニュートン）を示すグラフで表され得
、必要とされる力は約20〜30ニュートンであった。しかし、GAXについてグラフ
化すると、力の軌跡が「スパイキング」を表し、GAXは滑らかに押出されないこ
とが示される。押出しの間、特定の部分においては、GAXは押出しのために約10
〜15Nを必
要とした。これに対して、コラーゲン−mPEGは非常に低い押出し力（８〜10N）
を示し、スパイキングはほとんどあるいは全くなかった。イントリュージョン（intrusion）
：
イントリュージョンは、組成物が、小さな固まりとして残るより、むしろ多孔
質の床（bed）に「指状に広がる（finger）」または流れ込む傾向の測定である
。柔らかな組織の増強には、イントリュージョンが低い方が、注入した移植片が
真皮を通って拡散せず、その場所に留まるので、好ましい。
30ゲージの針を取り付けた１mLシリンジの半分まで、ヒトの真皮を模した炭化
ケイ素粒子（60mesh）で満たした。このシリンジの上半分を、35mg/mLのテスト
組成物（GAX、ZCI、またはコラーゲン−mPEG）0.5mLで満たした。次に、プラン
ジャーをはめて、押し下げた。押し下げると、ZCIは針のところに出てきた。こ
れは炭化ケイ素床を通してのイントリュージョンを示している。GAXまたは本発
明のコラーゲン−mPEGを満たしたシリンジはコラーゲンを通さず、そのかわり、
緩衝液だけが放出され、イントリュージョン性（intrudability）がないことを
示した。らせん性（helicity）
：
各組成物の部分が非らせん性を示すことを、トリプシンによる消化に対する感
受性を用いて測定した。サンプルをプロ
テアーゼトリプシンで処理した。このプロテアーゼトリプシンはコラーゲンタン
パク質のフラグメント部分のみを攻撃し得る。加水分解の程度は、安定化したペ
プチドに対するフルオレサミンアッセイにより測定し、この結果を非らせん性コ
ラーゲンの割合で表す。非らせん性コラーゲンのパーセンテージは、消化を始め
てから30分後に測定した。結果は、ZCIが感受性３〜10％であり、GAXが感受性１
〜２％であり、そしてコラーゲン−mPEGが感受性約１％であることを示した。ト
リプシンに対する感受性はまた、移植の後の固有の（endogenous）プロテアーゼ
に対する感受性と相関関係にあり得る。コラゲナーゼ感受性
：
各組成物のコラゲナーゼに対する感受性もまた測定した。ZCIは65.2％消化さ
れ、それに比べて、GAXは2.2％であり、そしてコラーゲン−mPEGは45.8％であっ
た。相転移
：
温度に対する各組成物の挙動を示差走査熱量計を用いて試験した。加熱すると
、ZCIは約45℃および53℃に多重ピークを示した。GAXは67〜70℃にピークを示し
た。コラーゲン−mPEGは56〜61℃にピークを示した。リシン含量
：
各組成物について、１モル当たりの遊離のリシンの数を、
TNBSを用いて反応性のイプシロンアミノ基を定量することによって測定した。ZC
Iは、（１らせん）分子あたり約30（K/m）のリシンを含むことを示し、他方、GA
Xは26〜27K/mであり、そしてコラーゲン−mPEGは21〜26K/mであった。
（Ｂ）架橋した生体適合性結合体の定性：
実施例１Ｃに記載のように調製されたコラーゲン−dPEG結合体を示差走査熱量
測定法（DSC）を用いて定性した。このテストにより、コラーゲン分テの顕微鏡
レベルでのフラグメンテーションの間の転移温度を測定する。転移温度が低くな
ることは、トリプシン感受性によって測定されたのと同様に、フラグメンテーシ
ョンの増加を意味する。
コラーゲン−dPEG結合体は、DSCによって56℃に、単一の変性転移を示す。こ
れは、実施例１Ａで調製されたコラーゲン−PEG結合体の典型的な融点と同様で
ある。比較すると、ZCIは融点45〜53℃であり、多重の変性転移を示し、そしてG
AXは融点67〜70℃であり、単一の変性転移を示す。
実施例２Ａに記載の押出しテストはコラーゲン−dPEG結合体の定性には用いる
ことができなかった。なぜなら、この材料は30ゲージの針から押し出すことがで
きなかったからである。
実施例２Ａに記載のイントリュージョンテストを用いると、コラーゲン−dPEG
の通過は炭化ケイ素の床によって完全に阻まれ、このことはコラーゲン分子が高
度に架橋していること、
およびイントリュージョン性が低いか、あるいはないことを示す。
実施例３
（免疫原性）
（Ａ）非架橋PEG−コラーゲン：
この実験は、本質的に同一の原料から調製され、そして同様の硬度を有する市
販のウシコラーゲン処方物に対する、本発明のコラーゲン−mPEG調製物の相対的
な免疫原性を示すために行われた。アテロペプチドコラーゲン（これは、弱い免
疫原性しか有さない）を用いて両方のコラーゲン調製物を調製し、免疫応答を増
大させるために、完全フロイントアジュバント（CFA）またな不完全フロイント
アジュバント（IFA）のいずれかと共に処方した。これは、厳しいテストであり
、可能性のあるいかなる免疫反応よりも強いことを意図している。
コラーゲン−mPEGを上記実施例１Ａのように調製した。雄のHartleyモルモッ
ト（11匹）に麻酔をかけ、免疫化の前の血清学的評価のために、心臓を穿刺して
採血した。CFA中にエマル
左および右の大腿に筋肉内注射することによって、５匹の動物を処置した。他の
５匹の動物を、CFA中にエマルジョン化したコラーゲン−PEG（35mg/mL）を用い
て、同様の方法で処置した。１匹の動物をIFA中のコラーゲン−PEGで処置した。
免疫化から14日後、すべての動物から、再び、心臓穿刺によって採血
し、抗体滴定測定（ELISA使用）のために血清を得た。血清学的評価を、30日目
に再び行った。
血清サンプルの採集から30日目に、各動物にZCIおよびコラーゲン−PEGの両方
を、皮内に抗原投与した（各0.1mL、両横腹に片方ずつ）。細胞性免疫の測定値
として、遅延型過敏症（DTH）を定量した。抗原投与後、24、48、および72時間
後に、マイクロメーターカリパスを用いて、すべての丘疹の直径を測定し、そし
て紅斑およ硬結の程度を記録することによってDTHを評価した。次に、この動物
をCO2で安楽死させ、そして注射した部分を切り取って、組織学的研究のために
、中性に緩衝したホルマリンで固定した。
血清学的結果は、ZCIに比べてコラーゲン−PEGの方が免疫原性が低いことを示
した。14日目に、ZCIで免疫化された動物の80％は「陽性」の抗体応答（14日目
で力価≧160）を示したのに対し、コラーゲン−PEGで免疫化した動物のうち陽性
の応答を示したのは０％であった。30日目に、ZCIで免疫化された動物はすべて
高い抗体力価を示したが、コラーゲン−PEG（C−PEG）で免疫化した動物のうち
高い力価を示したものはなかった。データを表１に示す。
DTH抗原投与に対する応答はまた、本発明のコラーゲン−mPEGは免疫原性が少
ないことを示していた。ZCIで免疫化され、そしてZCIで抗原投与されたモルモッ
トは、直径1.128±0.058cmと測定された丘疹を示した。コラーゲン−mPEGで免疫
化され、そしてコラーゲン−mPEGで抗原投与された動物は0.768±0.036cmと測定
された丘疹を示した。ZCIで免疫化され、そしてコラーゲン−mPEGで抗原投与さ
れた動物、またはコラーゲン−mPEGで免疫化され、そしてZCIで抗原投与された
動物は、ZCIで免疫化され、ZCIで抗原投与された場合の丘疹と比べて、より小さ
な丘疹しかできなかった。各部位で、48および72時間で測定された応答は、２４
時間での応答と本質的に同じか、あるいは低かった。紅斑は、すべての動物にお
いて本質的に同じであった。
組織学的研究によれば、どちらの材料も、似たようなイントリュージョンを示
すことが明らかとなり、真皮および皮下
の空間へ指状に広がった。ZCI免疫化動物へのZCIによる皮内抗原投与を行った部
位は、最も広範囲に渡る炎症反応を示し、この炎症反応は、好酸球および場合に
よっては巨細胞と共にリンパ組織炎球増多性の要素の細胞湿潤を包含する。移植
部分のうち２つは、表皮を覆うびらん性の炎症および焼痂形成を示した。ZCIで
免疫化された動物において、コラーゲン−mPEGで皮内抗原投与された部位は、炎
症性湿潤は中程度しか集合せず、急性の細胞およびリンパ系要素は顕著に低減し
た。組織球および巨細胞は、より広く行き渡り、そしていくつかのサンプルにお
いては、移植片を厚く覆い、かつコロニーを形成（colonized）していた。コラ
ーゲン−mPEGで免疫化された動物は、わずかあるいは中程度の反応しか示さず、
ZCI抗原投与部位には、わずかの好酸球および巨細胞と共に、それほど多くない
リンパ組織炎球増多性の脈管周囲の湿潤が伴っていた。コラーゲン−mPEG抗原投
与部位には、典型的には、集合した（associated）脈管構造の近傍の、リンパ細
胞のごくわずかの散乱が伴っていた。
（Ｂ）架橋したdPEG−コラーゲン結合体：
コラーゲン−dPEG結合体を実施例１Ｄのように調製した。サンプルをラットの
背側の表皮下および頭部のアンレーとして移植した。表皮下で、移植後30日で、
NFC軟骨およびNFC−FC軟骨材料は均質な微小繊維状構造を有した。NFC−FC軟骨
サンプルの周囲に、結合組織細胞の少量の（mild）コロニー化が
起こり、そして少量の被包形成が存在した。NFC軟骨材料ではコロニー化は起こ
らず、そして少量の被包形成が存在した。FC軟骨は十分に繊維状の構造を有し、
少量ではあるが頻度の高い、結合組織細胞および少数の脂肪細胞の深いコロニー
化が起こった。痕跡量の被包が、FC軟骨サンプルの限られた領域に存在した。NF
C軟骨材料は、その移植前の形状を保持する傾向にあり、角の輪郭もはっきりと
していた。他方、NFC−FC軟骨サンプルは時間がたつと平らになり、かつ丸い輪
郭になっていく傾向にあった。
頭部のアンレーとして移植した場合も、各材料の外観は表皮下の場合と同様で
あるが、骨膜と、被包または、周囲の緩やかに結合組織の形成を通して、サンプ
ルが頭骨につなぎ止められ始める傾向にあった。
すべてのサンプルが明らかに生体適合性であり、宿主組織によるコロニー化の
程度が異なり、そして機械的特性が違っていた。
実施例４
（インサイチュ架橋）
dPEG溶液を上記の実施例１Ｃに記載のように調製した。次に、以下のサンプル
を調製した：
(1)５mgのdPEGを80μLの水に入れ、0.5mLの繊維性コラーゲン（35mg/mL）と混
合し、最終dPEG濃度を１容量％としたもの；
(2)15mgのdPEGを80μLの水に入れ、0.5mLの繊維性コラーゲ
ン（35mg/mL）と混合し、最終dPEG濃度を３容量％としたもの；
(4)５mgのdPEGを80μLの水に入れ、0.5mLの非繊維性コラーゲン（35mg/mL）と
混合し、最終dPEG濃度を１容量％としたもの；；
(5)15mgのdPEGを80μLの水に入れ、0.5mLの非繊維性コラーゲン（35mg/mL）と
混合し、最終dPEG濃度を３容量％としたもの；；
(6)５mgのdPEGを0.5mLのPBSに入れ、最終dPEG濃度を１容量％としたもの；お
よび
(7)GAX。
サンプル１、２、４、および５のdPEG溶液を、ルアーロック部品およびコネク
ターを備えた１mLのシリンジに入れ、コラーゲン材料を入れた他のシリンジと接
続した。溶液を、２つのシリンジ間を行き来させることにより混合し、均質な反
応混合物を作成した。
次に、シリンジコネクターをはずし、27ゲージの針に替え、そしてこの反応混
合物約50μLを、それぞれ20匹のモルモットに皮内に注入した。サンプル３、６
、および７を同様に27ゲージの針を通して投与した。注入から30日までの間、間
隔をおいて処置部位を採収し、そして組織学的に研究した。
30日で、すべての材料が明らかに生体適合性となった。サンプル１および２は
真皮のコラーゲンファイバーとの指状突起鉗合が中程度であり、広く分散してい
た。結合組織細胞に
よるコロニー化は中程度であり、そして痕跡量の好酸球を有する丸い細胞湿潤が
見られた。
サンプル３、４、および５は高度に分散され、そして真皮のコラーゲンファイ
バーとの指状突起鉗合が微細に生じた。コロニー化は少量から中程度まで生じ、
そして痕跡量レベルの細胞湿潤が見られた。
サンプル６は検出可能な影響はなかった。サンプル７は中程度のコロニー化お
よび痕跡量から少量レベルまでの炎症を共なう、大きな島が生じた。
実施例５
（移植片のコーティング）
コラーゲン−dPEG反応混合物を上記の実施例１Ｃに記載のようにして調製した
。架橋が開始した後、チタン製移植片を反応混合物中に約20分間浸漬した。次い
で、この移植片を、架橋を終了させ、一晩乾燥させた。
実施例６
（コラーゲンーポリマー-増殖因子結合体）
（Ａ）架橋したコラーゲン-dPEG-TGF-β１を含有する結合体を、以下のように
して調製した：
TGF-β１および125Ｉ-TGF-β１（105cpm；１mg/mLを25μL）を、CH2C12（100
μL）中のdPEG*（４mg）の溶液に加え、そしてこの混合物を12分間（サンプル＃
３）または35分間（サンプル＃５）17℃で反
応させた。これにコラーゲン溶液（3mg/mLのアテロペプチド非繊維性コラーゲン
）2.5mLを加え、そして得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。形成
されたペレットを、遠心分離によって集めて、コラーゲン-dPEG-TGF-β１を得た
。
（Ｂ）繊維性アテロペプチドコラーゲンに基づく組成物を、TGF-β１/dPEG*の
反応時間を２分間に限定し、そしてコラーゲン溶液の替わりに繊維性コラーゲン
７mgを（使用前２分以内にコラーゲン溶液から沈殿させた）を用いたこと以外は
、上記のＡ項と同様にして調製した。
（Ｃ）dPEGで架橋したコラーゲンおよび遊離のTGF-β１を含有する組成物を以
下のように調製した：
CH2Cl2（100μL）中のdPEG*（４mg）溶液を、CIS（３mg/mLのアテロペプチド
非繊維性コラーゲン）2.5mLに加え、そして得られた混合物を室温で一晩インキ
ュベートした。形成されたペレットを洗浄して未反応のdPEG*を除去し、そして
それにTGF-β25μgを混合してコラーゲン-dPEG+TGF-β１を得た。
（Ｄ）結合するTGF-β１の割合を以下のように測定した：
未結合のTGF-β１を除去するために、上記のＡ項〜Ｃ項において調製された各
組成物に、激しくボルテックスをかけて、次いで遠心分離することで、緩衝液（
0.02Mのリン酸緩衝液、0.1％BSA）0.5mLで６回洗浄した。ペレットおよび上清を
洗浄操作毎に集め、そして数えた。結果は、単純な混合物におけるTGF-β１は洗
浄約６回以内に定量的に放出されるのに対し、Ｂ項の組成物ではTGF-β１約40％
が保持され、そしてＡ項の組成
物では50％が保持されることを示すグラフとして表し得る。
（Ｅ）上記で調製された材料の生物学的活性を以下のようにアッセイした：
Ａ項（CIS-dPEG-TGF-β１）（TGF-β１/dPEG*の反応時間12分）およびＣ項（C
IS-dPEG+TGF-β１）に従って調製された組成物を調製し、さらにTGF-β１（CIS-
dPEG）を用いずに、Ｃ項に従って調製したコントロールを調製した。これらのサ
ンプルをＤ項に記載のようにPBS/BSAにおいて８回洗浄し、次いで37℃で胎仔ウ
シ血清（Gibco）によってさらに３回洗浄した。この洗浄プロトコルによって、
視覚的に検出可能な材料の損失が生じたので、残留したTGF-β１含量は残留した125
Ｉを数えることによって測定した。次いで、TGF-β１活性をELISAによってア
ッセイした。この結果を以下の表２に示す。
このデータは、本発明の組成物に保持されているTGF-β１が実質的に活性な形
態を維持することを示す。
実施例７
（処方物）
（Ａ）注入による移植に適切な処方物を、注射用減菌水にコラーゲン-PEGを35
mg/mLで懸濁することにより、調製した。得られた処方物の性質を上記の実施例
２に記載する。
（Ｂ）応力に耐える骨の欠損（例えば、骨折、偽関節など）の修復に有用な処
方物は、本発明のコラーゲン-PEGと適切な粒子状の不溶性成分とを混合すること
により調製され得る。この不溶性成分は、繊維性架橋コラーゲン、ゼラチンビー
ズ、ポリテトラフルオロエチレンビーズ、シリコーンゴムビーズ、ヒドロゲルビ
ーズ、炭化ケイ素ビーズ、無機質ビーズ、またはガラスビーズであり得、好まし
くは、カルシウム無機質、例えば、ヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸
三カルシウムである。
ゲン）またはコラーゲン-mPEG（63mg/mL）と粒子状ヒドロキシアパタイトおよび
リン酸三カルシウム（HA+TCP）とを混合し、そして空気乾燥して、65重量％のHA
を含有する固いブロックを形成することによって調製した。必要に応じて、ブロ
ックを75℃で10時間加熱することによって加熱処理した。得られたブロックを試
験前12時間0.13Mの生理食塩水で吸水させた（hy
drate）。
その間、PEG-コラーゲン-HA+TCP（PC-HA）組成物は１相のま
に分かれたことが観察された。
各ブロックを、５％伸長し、解放後、その応力緩和を１分間モニターした。こ
の試験の後、各ブロックを、破損するまで、１cm/分の一定の割合で伸長した。
この結果を表３に示す：
全ての力は、ニュートンで記載した。破断（引張）における伸度は、％伸度
で記載した。
このデータは、コラーゲンーポリマーが、実質的により大きな引張強度を示す
HA+TCP組成物を形成することを示す。このように、同量の非結合コラーゲンを用
いた組成物より実質的に強い、コラーゲンーポリマーを有する移植片組成物が調
製され得るか、または用いるコラーゲンーポリマーの量を低減して同様の強度の
組成物が形成され得る。
実施例８
（ヒアルロン酸と二官能性SC-PEGとの架橋）
ヒアルロン酸ナトリウム（LifeCore Biomedicalから入手）
１ｇを、PBS 15mlに加え、一晩溶解させて、均質な溶液を形成した。このヒアル
ロン酸／PBS溶液５mlを、シリンジ−シリンジ混合を用いてPBS 0.5ml中の二官能
性SC-PEG 50mgと混合した。
得られた材料をシリンジからペトリ皿に押出し、そして37℃で16時間インキュ
ベートした。次いで、この材料を室温で８時間冷却させた。24時間後、この材料
は、架橋したゲルを形成した。
S-PEGを含有しないヒアルロン酸を、この実験のコントロールとして用いた。
同一のインキュベーション時間の後、このコントロールはまだ流体で流動的であ
った。
実施例９
（平滑なコラーゲン-ポリマーチューブの調製）
Palo Alto， Californiaから入手可能）を含有する内径4.5mmの標準的なシリン
ジの針の末端を切断した。このシリンジのプランジャーを用いて、このコラーゲ
ンを、切断したシリンジから押出して、固い円柱状にした。コラーゲンの円柱を
ペトリ皿に載せ、そして二官能性S-PEGの10％溶液（PES 10ml中の二官能性S-PE
G 1.0g）中に浸漬した。
このコラーゲン円柱を室温で10％S-PEG溶液中でインキュべートした。コラー
ゲン円柱の外側から内側に、PEGが拡散するように、架橋反応が生じる。S-PEG溶
液中でのインキュベーシ
ョンの20〜30分後、コラーゲン円柱の外側は架橋されており、内側は架橋されて
いないままであった。
インキュベーションの20〜30分後、コラーゲン円柱を架橋剤溶液から取り出し
た。内側の架橋していないコラーゲンは、手による圧力を用いて、外側の架橋し
たシェルから容易にしぼり出され得、PEGで架橋されたコラーゲンの中空のチュ
ーブが残る。
次いで、中空のチューブを、10％S-PEG溶液に戻し、架橋プロセスを完了させ
るために、37℃で一晩インキュベートした。
中空のPEG-コラーゲンチューブの外径は、コラーゲン円柱である出発材料のサ
イズを変化させることによって、変えられ得る。このチューブの内径は、PEG溶
液中でのコラーゲン円柱の最初のインキュベーションの時間の長さを短くするこ
とによって、増大され得る。逆に、チューブの内径は、最初のインキュベーショ
ン時間を長くすることにより、小さくされ得る。
実施例１０
（ひだを有する（pleated）コラーゲン-ポリマー
チューブの調製）
平滑なコラーゲン-ポリマーチューブを実施例９に記載の方法に従って調製し
た。まだ湿潤なうちに、このチューブをZy
様のシリンジのプランジャーに滑らせてかぶせた。チューブ
はシリンジのプランジャーにぴったりと適合していた。次いで、PEG-コラーゲン
チューブをシリンジのプランジャーの軸に沿って押し下げ、湿潤なチューブに、
ひだ、または、うねを形成した。その結果、そのとき、ひだを有するチューブは
、元の平滑なチューブの長さの約半分となった。
シリンジのプランジャーにかぶせたままの状態で、ひだを有するPEG-コラーゲ
ンチューブを、室温で煙霧フード（fumehood）下で乾燥した。２４時間後、乾燥
したひだを有するチューブをシリンジのプランジャーから押出してはずした。こ
のチューブは、シリンジのプランジャーからはずした後も、ひだを有する形状を
維持していた。
次いで、このひだを有するPEG-コラーゲンチューブを水を入れたペトリ皿に載
せた。このチューブは、再吸水の後もひだを有する形状を維持していた。
実施例１１
（小さい直径のひだを有する
コラーゲン-ポリマーチューブの調製）
0.9ccを、二官能性S-PEGの5％溶液（PBS 0.1CC中S-PEG 5mg）0.1ccと混合した
。混合に引き続いて直ちに、PEG-コラーゲン材料を、18ゲージの針を用いて、TF
Eチューブ（外径1.5mm、内径1.3mm）中に押出した。（小さい直径の円柱形状を
維持する
の場合より大きな構造的完全性を有する出発材料を提供することが必要であった
。）
室温でのインキュベーションの20〜30分後、チューブを切って開け、そしてPE
G-コラーゲンの固い円柱を、このチューブから剥がした。次いで、PEG-コラーゲ
ン円柱を、二官能性S-PEGの10％溶液5ccを入れたペトリ皿に載せた。PEGが、コ
ラーゲン円柱の外側から内側に拡散するように、架橋反応が生じる。室温におい
て、S-PEG溶液中で3時間インキュベーションした後、円柱の内側を、直径1mmの
マンドレルを用いて押出し、中空で平滑なPEG-コラーゲンチューブを得た。
次いで、PEG-コラーゲンチューブをマンドレルの軸に沿って押し下げ、湿潤な
チューブに、ひだ、または、うねを形成した。その結果、ひだを有するチューブ
は、そのとき、元の平滑なチューブの長さの約半分であった。
マンドレルにかぶせた状態のままで、ひだを有するPEG-コラーゲンチューブを
、室温で煙霧フード下で乾燥した。24時間後、乾燥したひだを有するチューブを
マンドレルから押しはずした。このチューブは、マンドレルからはずした後も、
ひだを有する形状を維持していた。
次いで、このひだを有するPEG-コラーゲンチューブを水を入れたペトリ皿に入
れた。このチューブは、再吸水の後もひだを有する形状を維持していた。
種々の直径のPEG-コラーゲンチューブは、種々のサイズのTFEチューブを用い
、そして架橋反応が生じる時間を変化させ
ることによって、調製され得る。
実施例１２
（薄い管壁を有する（Thin-Walled）
チューブの調製）
0.90mlを、PBS 0.10ml中の二官能性S-PEG 10mgの溶液と混合した。
内径0.9mmを有するTFEチューブを、内径1.2mmを有する他のTFEチューブの中に
入れた。PEG-コラーゲン混合物を、内側のチューブと外側のチューブとの間の空
間に27ゲージの針によって注入した。次いで、このチューブを37℃で2時間イン
キュベートした。
外側のチューブを引き抜き、そして周りにPEG-コラーゲンのシェルを有する内
側のチューブを、さらに2時間、37℃でインキュベートした。
次いで、薄いPEG-コラーゲンのシェルを内側のTFEチューブから注意深く押し
てはずした。得られたPEG-コラーゲンチューブは、透明でセロファン様の硬度で
あった。
次いで、PEG-コラーゲンを、水中に置いて再吸水させた。このチューブは非常
に薄く、そして小さい直径を有していたが、このチューブを用いて水を注入する
ことができた。
このチューブの管壁の厚みおよびコラーゲン-ポリマーチューブの内径は、コ
ラーゲン-ポリマー材料を成形するために用
いられる内側および外側のTFEチューブのサイズを変化させることによって、変
えられ得る。上記の方法によって製造される薄い管壁を有するチューブは、神経
再生を促進するための神経ガイドチューブとしての使用に、特に適し得る。
実施例１３
（PEG-コラーゲン糸状物の調製）
（35mg/ml） 5mlを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.5ml中の二官能性SG-PEG 50
mgと混合した。直ちに、この材料を直径1.5mm
37℃で16時間インキュベートした。架橋したコラーゲンゲルを、チューブから取
り出して、一晩乾燥した。乾燥中、糸状物をぴんと張り、糸状物が軸状の次元よ
り、放射状の次元で、乾燥することを確実にした。
よって、架橋していないコラーゲン糸状物をコントロールとして製造した。上記
の方法を用いて２つの異なる直径の糸状物を製造した。
糸状物の直径、長さ、および重量を、新鮮な（湿潤）状態、脱水した状態、お
よび再吸水した状態において測定した。これらの測定の結果を図１のグラフ、お
よび、図１４に示す表に表した。
架橋していない糸状物は親水性PEGを含有していないので、
水を留めておくことができず、再吸水し得ない。従って、再吸水した状態でのこ
れらの糸状物の測定値は得られなかった。これらの糸状物は、再吸水によって、
元の長さの全てを維持しており、元の直径および重量のほとんど全てを維持して
いた。
種々の粘弾性的測定を、脱水した状態における架橋した糸状物および架橋して
いない糸状物について行った。粘弾性的評価の前に、全ての糸状物を20mmの一定
の長さに切断した。結果を図１５に示す表に表した。糸状物の膨張能を示す棒グ
ラフを、図１に示す。４つの糸状物のタイプそれぞれにおける数種の粘弾性的測
定の、標準偏差を示すエラーバーを有する棒グラフを図２〜５に表す。
引張応力（N/mm2）は、糸状物の破損（破断）における力を断面積の関数とし
て測定した値である。ひずみ（Δ長さ／長さ）およびΔ長さは、糸状物の弾性の
測定値である（張力下でどのくらい伸長するか）。ヤング率（N/mm2）は、応力
をひずみで割ることによって算出される。これは特定の材料の粘弾性的な「指紋
」として知られている。
図２〜５における棒グラフは、架橋していない糸状物について得られた粘弾性
的な測定値の大きな標準偏差および変動を例示しており、架橋していない材料が
不均質であることを示す。PEG-架橋した糸状物によって得られた一様な結果は、
PEG架橋が、均質性、ならびに、より大きな機械的強度および弾性を、コラーゲ
ン材料に与えることを示す。
実施例１４
（コイル状の糸状物の調製）
二官能性S-PEG １％溶液中のコラーゲンを18ゲージの針によってTFEチューブ
（外径0.9mm、内径0.6mm）中に注入することによって、実施例１３に記載のよう
に、小さい直径の架橋したコラーゲン糸状物を製造した。
チューブから取り出した後、湿潤な糸状物を外径1.5mmを有する第２のTFEチュ
ーブの回りにコイル状に巻き付けた。コイル状の糸状物を煙霧フード下で室温に
て２日間チューブ上で乾燥した。
脱水したPEG-コラーゲンコイルを、チューブから押してはずした。乾燥状態の
コイル状の糸状物を、手でまっすぐに引っ張った。このときのまっすぐな糸状物
を水に浸漬すると素早く再吸水によってコイル状の形状に戻った。
コイル状の湿潤な糸状物を水浴から取り出し、引っ張り、そして張力下でまっ
すぐの状態で乾燥した。まっすぐの状態に乾燥した糸状物を水に再び浸漬すると
再吸水によって元のコイル状の形状に再び戻った。
コラーゲン-ポリマーコイルをまっすぐに引っ張ると針またはカテーテルによ
る送達を促進し得る。これらのコイルは、再吸水によってコイルの形状になる能
力および中空を満たすように膨張する作用のために、動脈瘤の治療に特に有用で
ある。
上記の実施例は、コラーゲン-ポリマー材料の「記憶」を例示している。吸水
によって、この材料は最初に乾燥したときの元の形状に戻る。
実施例１５
（PEG-コラーゲン材料の粘弾性的特性）
活性化二官能性SG-PEGの10％溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中で10
0mgの粉末の二官能性SG-PEG（3400ダルトンMW）を希釈することによって調製し
た。10％二官能性SG-PEG溶
最終的なPEG濃度を１％とした。コラーゲンおよび架橋剤溶液を10mlシリンジに
入れ、そしてシリンジ-シリンジ混合を用いて混合した。
方法を用いて、二官能性SG-PEGで架橋した。
Z-I-PEGとZ-II-PEGとの複合体を含有するシリンジを、37℃で16時間インキュ
ベートし、そして重合したゲルを形成した。
２つのシリンジのそれぞれの針の末端を切り取り、そしてゲルをそれぞれのシ
リンジのプランジャーを用いてシリンジの筒内から押出した。次いで、固いゲル
を2mmの厚みの円板状に薄く切り、脱水し、次いで再吸水した。円板の直径、厚
み、および重量を、新鮮な（湿潤）状態、脱水した状態、および再吸水した状態
で測定した。これらの測定の結果を図１６に示す表に表した。
架橋したコラーゲンの円板（両方のコラーゲン濃度において）は、再吸水によ
ってほとんど元の寸法にまで回復した。
実施例１６
（白金ワイヤのコーティング）
Collagen Corporation，Palo Alto，CAから入手可能）を、減菌濾過したリン
酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて32.5mg/mlまで希釈した。活性化二官能性S-PE
Gの10％溶液を、滅菌濾過したPBS中で粉末の二官能性S-PEGを希釈することによ
り調製した。S-PEG 100μlを、コラーゲン900μlに加えて最終S-PEGを濃度１％
とした。S-PEG溶液およびコラーゲンを3mlシリンジに入れ、そしてシリンジ-シ
リンジ混合を用いて混合した。
マンドレル（コイルをまっすぐに保つための内側のワイヤ）上で直径0.25mmの
コイル状にした白金ワイヤ（#1、Target Therapeutics，Santa Clara，CAから
入手可能）を、超マイクロピペットチップ（0.5〜10μl）の内側に、チップ１個
につきコイル１個を装填した。その結果、マンドレルはピペットチップの狭い開
口部および広い開口部の両方を通過した。シリンジ中のS-PEG-コラーゲン混合物
を、22ゲージの針を用いて各ピペットに注入した。
コイルを装填したピペットを、ペトリ皿に載せ、そして37℃で24時間インキュ
ベートした。コイルを装填したチップを、室温で６日間層流フード（laminar f
low hood）下に置いた。次
いで、コートしたコイルをピペットチップから取り出した。
乾燥時間が適切でない場合には、コーティングはコイルにうまく接着しない。
Therapeutics）または他の同様のタイプのカテーテルを用いて送達され得る。
実施例１７
（白金ワイヤのコーティング）
過したPBSを用いて32.5mg/mlまで希釈した。活性化二官能性S-PEGの10％溶液を
、滅菌濾過したPBS中で粉末の二官能性S-PEGを希釈することにより調製した。S-
PEG溶液100μlを、コラーゲン900μlに加えて最終S-PEG濃度を１％とした。S-PE
G溶液およびコラーゲンを3mlシリンジに入れ、そしてシリンジ-シリンジ混合を
用いて混合した。
マンドレル上のコイル状の白金ワイヤを直径1mmのTeflon
混合物を、22ゲージの針を用いてコイルを覆うチューブ中に注入した。プラグを
チューブの末端に挿入し、そしてこのチューブを棚に置いてチューブの中央にコ
イルの末端をまっすぐに保持した。この棚を37℃のインキュベーター内に16時間
置いた。
チューブを、インキュベーターから取り出した後、外科用
メスで側面を切り、コイルから剥がした。コートしたコイルを室温で数時間空気
乾燥させ、次いで、マンドレルから取りはずした。
コートしたコイルは、カテーテルによって送達され得る。
本発明は、最も実用的で、そして好ましい実施態様と考えられることに対して
本明細書中で示され、そして記載されている。しかし、これらからの逸脱は、本
発明の範囲内で行われ得、明らかな変更は、この開示内容を読むことにより当業
者により行われ得ることが理解される。
実施例１８
（テロペプチド含有コラーゲン-ポリマー結合体の調製）
テロペプチド含有コラーゲンおよびアテロペプチドコラーゲンを、二官能性活
性化SG-PEG（MW=3400ダルトン）を用いて架橋した。得られた材料の物理的特性
を比較した。PEGで架橋したテロペプチド含有コラーゲンの調製
雌ウシの皮のスラリー（ペプシン消化の直前にサンプリングした）900mlを、
水浴中で１時間で17℃に安定化させた。0.2Mリン酸緩衝液（pH11.4）100mlを、
速く撹拌しながら皮のスラリーに加えた。この材料を17℃で16時間インキュベー
トした後、遠心分離を行い、テロペプチド含有コラーゲンのペレット91ｇを製造
した。ペレットのタンパク質濃度は、ビウレット法を用いて40mg/mlと測定され
た。
ペレットのサンプル3mlを0.1M塩酸（HCl）0.5mlを加えることによって酸性化
した。得られた材料は、極めて不透明であり、そして酸性（ｐＨ４〜５）で繊維
状であった。酸性化したテレペプチド含有コラーゲン0.5mlを型内に入れ、そし
て濃度35.7％（重量％／容量％）の二官能性活性化SG-PEG溶液0.25mlを加えた。
コラーゲンおよび架橋剤溶液が入っている型を一晩37℃でインキュベートした。
架橋は、PEG溶液がコラーゲンゲル中に拡散するにつれて、生じた。しっかりと
架橋したテロペプチド含有コラーゲンゲルの５つの小片（30mm×10mm×厚み2mm
）が得られた。PEGで架橋したアテロペプチドコラーゲンの調製
tion，Palo Alto，CAから入手可能）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用い
て40mg/mlの濃度まで希釈した。得られた40mg/mlのアテロペプチドコラーゲン3m
lを酸性化し、そして上記の方法によって二官能性活性化SG-PEGを用いて架橋し
た。しっかりと架橋したアテロペプチド含有コラーゲンゲルの５つの小片（30mm
×10mm×厚み2mm）が得られた。フィブリルの形成
テロペプチド含有コラーゲンのペレット3mlおよびZyderm11コラーゲン3mlを上
記と同様にして酸性化した。２種類の酸性化したコラーゲン材料各0.5mlを型内
に入れた。酸性化し
たテロペプチド含有コラーゲンおよびアテロペプチドコラーゲンが入った型を、
37℃で一晩インキュベートした。
37℃で一晩インキュベートした後、中程度に架橋したテロペプチド含有コラー
ゲンゲルが得られた。アテロペプチドコラーゲンは、いかなる架橋したゲルも製
造しなかった。示差走査熱量測定法（DSC）
示差走査熱量測定法（DSC）を用いて材料の溶融温度を測定する。架橋してい
ないテロペプチド含有コラーゲンおよびPEGで架橋したテロペプチド含有コラー
ゲンについてのDSCの測定結果を、以下に示す表４および図６および７に表す。
表４．DSC測定 材料 ピーク Tm（℃）
アテロペプチドコラーゲン 二重線 45,55
テロペプチド含有コラーゲン 二重線 52,57
架橋したアテロペプチドコラーゲン 一重線 59
（シャープ）
架橋したテロペプチド含有コラーゲン ブロード 66
架橋していないアテロペプチドコラーゲンは、２つの温度転移ピーク（１つ目
は約46℃および２つ目は約54℃）を示す。架橋していないテロペプチド含有コラ
ーゲンもまた、２つの温度転移ピーク（１つ目は49℃に生じ、そして２つ目は57
℃に生じた）を有する。テロペプチド含有コラーゲンについてのピークは、アテ
ロペプチドコラーゲンについてのピークよりブロードである。なぜなら、テロペ
プチド含有コラーゲンは固有の架橋を含有するからである。この架橋は酵素処理
の間に取り除かれ、得られる精製されたアテロペプチドコラーゲンには存在しな
い。
アテロペプチドコラーゲンを二官能性活性化S-PEGで架橋するとき、転移温度
は約58℃に上昇し、そして一重線のピークとして現れる。テロペプチド含有コラ
ーゲンを二官能性活性化S-PEGで架橋するとき、転移温度は約66℃まで上昇し、
そして一重線の転移ピークからなる。このピークは、PEGで架橋したアテロペプ
チドコラーゲンについての同等の転移ピークより幾分かブロードである。架橋し
たテロペプチド含有コラーゲンについて得られたブロードなピークは、架橋した
アテロペプチドコラーゲン（これは酵素処理および精製の結果としてさらに均質
となる）と比較すると、固有の架橋の結果として増加する不均質性のためである
と考えられる。粘弾性的特性
架橋していないおよび架橋したテロペプチド含有コラーゲ
ンおよびアテロペプチドコラーゲンを、引張強度（N）、引張応力（N/mm2）、ひ
ずみ（ΔL/L）、およびヤング率（N/mm2）について試験した。粘弾性的試験の結
果を図１７に示す表に表す。
引張応力（N/mm2）は、材料の破損（破断）における力を断面積の関数として
測定した値である。ひずみ（Δ長さ／長さ）は、材料の弾性の測定値である（張
力下でどのくらい伸長するか）。ヤング率（N/mm2）は、応力をひずみで割るこ
とによって算出される。これは、特定の材料の粘弾性的な「指紋」として知られ
ている。
図１７の表におけるデータによって示されるように、架橋したテロペプチド含
有コラーゲンは、架橋したアテロペプチド材料より著しく強い。膨張能
架橋していないおよびPEGで架橋したテロペプチド含有コラーゲンおよびアテ
ロペプチドコラーゲンを、膨張能について試験した。データを表５に表す。
架橋していないアテロペプチドコラーゲンはゲルではないので、水に浸漬した
ときにこの架橋していないアテロペプチドコラーゲンはばらばらに壊れる。従っ
て、再吸水した重量の値を得ることはできない。
データによって示されるように、PEGで架橋したテロペプチド含有コラーゲン
は、架橋したアテロペプチドコラーゲンより良好な再吸水特性を示し、再吸水後
に元の湿潤な重量の100％に回復した。
本発明は、最も実用的で、そして好ましい実施態様と考えられることに対して
本明細書中で示され、そして記載されている。しかし、これらからの逸脱は、本
発明の範囲内で行われ得、明らかな変更は、この開示内容を読むことにより当業
者により行われ得ることが理解される。Detailed Description of the Invention
Biocompatible polymer conjugateTechnical field
The present invention was formed by the covalent attachment of two or more polymers
Biocompatible conjugates, particularly naturally occurring polymers or their derivatives and hydrophilic
By conjugation with a hydrophilic synthetic polymer (eg polyethylene glycol (PEG))
Formed Conjugates, and Compositions, Components, and Implants Containing the Conjugates
Regarding the piece.Background of the Invention
Many naturally occurring but biologically inactive polymers are known. This
Examples include collagen and various glycosaminoglycans (eg, hyaluronan).
Acid, chondroitin sulfate, chitin, and heparin). These po
Derivatives of limers are also produced, some derivatives are formulated for medical use
. Synthetic biologically inactive polymers (eg polyethylene glycol (PEG))
) Is also known in large numbers. Combination of various natural and synthetic polymers
Provides a wide range of properties for use in a variety of medical applications. We have
, A new and useful combination of properties of natural and synthetic polymers.
Medical inventions that invent coalescence and make these conjugates particularly advantageous for the above properties
Composition
Applied to objects, ingredients, and implants.Summary of the invention
The conjugates are naturally occurring biologically inactive insoluble polymers and their
Derivatives and hydrophilic synthetic polymers (eg polyethylene glycol (PEG))
Is formed by a covalent bond of. Naturally occurring polymers and their derivatives
The conductors include polysaccharides such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate A (4-sulfate).
), Chondroitin sulfate C (6-sulfate), and dermatan sulfate (
Proteoglycans such as chondroitin sulfate B); chitin; heparin and
Heparin sulfate; cyclodextran, hydroxylethyl cellulose, cellulo
Dextranes such as ethers and starches; triglycerides, phosphorus
Lipids such as lipids (trihydroxyl alcohol glycerol and fatty acids
Ester) are included. The hydrophilic synthetic polymer is preferably about 100 to about 100.
Polyethylene having a weight average molecular weight in the range of about 1,500 to 20,000.
Lenglycol and derivatives thereof. The composition and ingredients are
, And other ingredients (eg, pharmaceutically acceptable to form an injectable formulation).
Possible fluid carriers and / or such as cytokines and growth factors
Biologically active protein). Biocompatible bond of the invention
The body generally contains large amounts of water when it is formed and is relatively
Solids (rehydration and expand to 5 times or more)
) Can be dehydrated to form a). To obtain the specific desired properties, the implant
Can be coated with the conjugate formulation, such as tubes and strings
Articles can be constructed with specific conjugates and formulations.
The biocompatible conjugates of the present invention are suitable for various medical and pharmaceutical applications.
Used and used. The most basic embodiment includes biocompatible conjugates and
Pharmaceutical compositions formulated with these conjugates (pharmaceuticals of different types and amounts)
A composition containing an acceptable flowable carrier). Shape this combination
When made, various natural polymers are synthetic polymers such as polyethylene glycol.
Covalently bind to. This particular polymer is based on end use and desired properties.
To be selected. In addition to choosing the polymer to attach, different types of covalent bonds
Compounds (including ester bonds, ether bonds, and urethane bonds) can be used
.
One of the most important uses of the particular conjugates and compositions of the present invention is soft tissue augmentation.
On the way. This composition is formulated in a flowable form for the purpose of soft tissue augmentation,
Then, it is injected into the subject (face, etc.). This method works with naturally occurring polymers
The reaction with the synthetic polymer can be modified to occur in situ. This result
The coalesce can be dehydrated and then ground into particles and placed in an inert non-aqueous carrier.
Can be suspended, and
It can be injected into the subject. After injection, the carrier is removed under normal physiological conditions,
The particles then reabsorb water and expand to their original size. Formed from a conjugate
Filamentous filaments can also be injected to obtain soft tissue augmentation.
The conjugates and conjugate compositions of the invention include cytokines or tissue-stimulating cytokines that promote tissue growth.
Or growth factors, and / or further particles, fibers, or
To increase the structural integrity of the composition with other materials
Can also be used for the augmentation of hard tissues such as bone and cartilage.
Other uses for the conjugate include a variety of medical devices (catheter, transfer
Includes bone grafts and coatings on platinum wires to treat aneurysms)
. The conjugate can also be used with a variety of ophthalmic devices such as lenticulars or corneal shields.
Can be prescribed to Conjugate formulations may be used in medical applications such as sutures and vascular or nerve repair.
Extruded, cast into shapes like filaments and tubes with medical applications,
And / or is formed.
The first object of the present invention is to provide a polymer such as polyethylene glycol
Any non-immunogenic form of insoluble, biologically inert polymer or its
By providing biocompatible conjugates formed by covalent attachment to these derivatives
is there.
Another object of the invention is to provide conjugates with different binding types,
Pharmaceutically acceptable for injection
It is to provide a composition containing a conjugate in a flowable carrier.
Another object of the invention is the step of forming a conjugate, dehydrating the conjugate to form a solid.
Forming, solids are crushed into particles, and augmentation (at which time the particles are
Re-absorbs water and expands it to about 5 times its size).
For tissue augmentation, produced by suspending in an aqueous fluid carrier
It is to provide a composition.
Another object of the invention is the use of an implant whose surface is coated with a biocompatible conjugate formulation.
To provide such an article.
Yet another object is to provide filaments made of the conjugate material.
Yet another object is to provide a tube made of a conjugate material.
An important advantage of the present invention of containing biocompatible conjugates is that they can be identified as ether linkages and the like.
Types of covalent bonds provide a high degree of long-term stability under physiological conditions.
Can be used to:
A feature of the invention is that the conjugates can be made from a wide variety of natural and synthetic polymers (
Having a range of molecular weights to control the physical and chemical properties of the composition (
occur)) can be formed.
Another advantage of the present invention is that this biocompatible conjugate is comparable to conventional collagen compositions.
In comparison, it has excellent handling characteristics.
And.
Another advantage of the present invention is that this biocompatible conjugate composition has a conventional collagen composition.
It is to reduce the immune response as compared to the thing.
Another feature of the invention is that this biocompatible conjugate composition is compared to conventional compositions.
To have improved formability, conformability, and elasticity.
Other features of the invention include, for example, cytokines or proliferation under physiological conditions.
This composition and conjugates to improve the activity and available half-life of the factor
With a pharmaceutically active protein (eg, a cytokine or growth factor)
Includes the ability to prescribe together.
Another advantage of the present invention is the ability to link the natural and synthetic polymers to the art.
That the bond is resistant to hydrolysis.
Is.
These and other objects, advantages, and features of the present invention are part of this specification.
This biocompatibility, which is fully described below with reference to specific examples and formulations
By reading the detailed description of the structure, synthesis and use of sex conjugates,
It will be clear to the trader.Brief description of the drawings
FIG. 1 is a bar graph showing the results of the expandability test of various filaments;
Figures 2, 3, 4 and 5 respectively show the results of testing the physical properties of various filaments.
Is a bar chart showing;
6 and 7 show comparison of DSC measurements of collagen-containing compositions, respectively.
;
Figure 8 shows the reaction scheme of the reaction between the carboxyl group of hyaluronic acid and PEG-hydrazine.
Show the system;
Figure 9 shows the reaction of acetyl group of hyaluronic acid with succinimidyl-PEG.
Indicating a chime;
FIG. 10 shows chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C and dermatan sulfate.
Shows the structure of the acid (chondroitin sulfate B);
FIG. 11 is a reaction scheme showing a nucleophilic substitution reaction of an ester with PEG;
FIG. 12 shows a reaction scheme in which polyethylene and a polyfunctional activated form of E-PEG react with each other.
Show the system;
FIG. 13 shows a reaction scheme in which polyethylene and a polyfunctional activated form of S-PEG react with each other.
Show the system;
FIG. 14 is a table showing the measurement results of the filamentous material produced according to Example 13;
FIG. 15 is a physical depiction of filaments containing collagen and collagen conjugates.
Is a table showing data;
FIG. 16 shows the data obtained from the measurement of the material produced according to Example 15.
Is a table;
FIG. 17 shows the results obtained for the material produced according to Example 18.
It is a table showing the measured results.Detailed Description of the Preferred Embodiments of the Invention
Before describing the biocompatible conjugates of the present invention and the process of making and using the same,
The invention is not limited to the particular conjugates, steps, and methods described, which of course
It should be understood that changes can be made. The terms used in this specification refer to individual
It is intended to describe the embodiments only and is not intended to be limiting.
It is also understood that the scope of clarity is limited only by the scope of the appended claims.
Should be.
The singular forms used herein and in the appended claims are especially referred to in the text.
It should be noted that it includes multiple indicators unless otherwise noted. Therefore,
For example, the expression "naturally occurring polymer" refers to a plurality of such polymers.
A mixture including a mixture is referred to as a "linking group" or a "bridging group" by those skilled in the art.
Includes one or more different types of groups capable of forming a covalent bond,
Thus, the expression "synthetic polymer" refers to a plurality of polymers of different types (eg,
Includes mixtures of polyethylene glycol (PEG) and the like.
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein
Has the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
Any method and material similar or equivalent to those described herein may be
Although useful in the practice or testing of the present invention, it is preferred.
Only those methods and materials are described below. All described herein
Are incorporated herein by reference. Furthermore, the description of the present invention is particularly important.
The specific terms required are defined below.
A.Definition
As used herein, the term “collagen” refers to telopeptide-containing collagen.
And including atelopeptide collagen (modified or modified),
Meaning any form of collagen. Collagen can be of human or animal origin
, And can be produced by recombinant technology. There are various types of morphology (ie I, II
, Type III, fibrous, non-fibrous, etc.). Collagen is the bone and soft of animals
A material that is a major protein component of bone, skin, and connective tissue. Natural type
Lagens are typically rigid rod-shaped molecules with a length of approximately 300 nm and a diameter of 1.5 nm.
Is. This collagen consisted of three collagen polypeptides and adhered closely.
It forms a triple helix. Collagen Polypeptide Repeat Sequence-Gly-X-Y-
Characterized by a long central portion (where X and Y are often pro
Phosphorus or hydroxyproline), each end is a "telopeptide" region (molecule
Constitutes less than about 5% of the). The telopeptide region of the collagen chain
, Typically involves cross-linking between naturally occurring chains and contributes to the immunogenicity of the protein.
Give. There are several types of collagen,
Each has different physical properties. The most abundant types are types I-III. Departure
Ming's disclosure discloses these collagens, as well as other known types of collagen (natural collagen).
And modified or modified collagen (ie, various collagen derivatives
Body)). Collagen is typically a natural source (eg, bovine hide).
, Cartilage, or bone). Bone is usually dried, degreased, crushed, and
Collagen is extracted by demineralization. On the other hand, skin and cartilage are usually fine.
It is minced and digested with proteolytic enzymes other than collagenase. Photoshop
Since this gene is resistant to most proteolytic enzymes, it is convenient to use this
The method removes most of the impure proteins that are present with the collagen.
The term "dehydrated" means that the material is air dried or freeze dried to substantially
This means removing all unbound water.
As used herein, the terms "naturally occurring polymer" and "natural polymer"
Is a biologically inert, insoluble, naturally occurring, biocompatible polymer.
And derivatives thereof. An example of a natural polymer is hyaluronic acid.
Una polysaccharide, chondroitin sulfate A (4-sulfate), chondroitin sulfate
C (6-sulfate), and dermatan sulfate (chondroitin sulfate B)
Una proteoglycans; cyclodextran, hydroxylethyl cellulose
Dexters such as starch, cellulose ether, and starch
Orchids; lipids such as triglycerides and phospholipids (trihydroxyl alcohol
Ester of glycerol and fatty acid), and mixtures and derivatives thereof
The body is included. The term includes biology such as DNA, RNA, and proteins
It is intended that no naturally active natural polymers be specifically included.
The terms "biologically inactive conjugate", "biocompatible conjugate", and "biology"
"Inert biocompatible conjugate" is used interchangeably herein. This
These terms refer to biologically inert, insoluble, biocompatible conjugates of the invention (here
And the natural polymer is covalently bonded to the hydrophilic synthetic polymer. ) Means. This
Is a biologically inert, insoluble, non-toxic polymer that can be incorporated into living organisms.
When incorporated, some natural polymers similar to those that do not produce a significant immune response
Have characteristics.
The term “hydrophilic synthetic polymer” as used herein is hydrophilic in nature.
Having an average molecular weight and composition such that the polymer is not completely water-soluble
Means a polymer. Preferred polymers are highly purified to be pharmaceutically pure.
It is made. Most hydrophilic polymers form hydrogen bonds in aqueous solution
By incorporating a sufficient number of oxygen atoms (or, rarely,
It can be made water-soluble (by incorporating elementary atoms). Preferred polymers are hydrophilic
However, it is not always water-soluble. A hydrophilic polymer used herein
For polyethylene glycol (PEG),
Lioxyethylene, polymethylene glycol, polytrimethylene glycol, polyethylene
Rivinylpyrrolidone and their derivatives are mentioned, with PEG being particularly preferred.
The polymer may be linear or hyperbranched and is substantially crosslinked.
Absent. Other suitable polymers include polyoxyethylene-polyoxypropylene.
Block polymers and copolymers. Has an ethylenediamine nucleus
(Hence having four ends) polyoxyethylene-polyoxypropylene
Block polymers are also available and can be used in the practice of the invention. Heaven
Natural polymers (eg proteins, starch, cellulose, heparin)
Etc.) are explicitly excluded from the scope of this definition. All suitable synthetic polymers
Is non-toxic, non-inflammatory, and non-immunogenic when administered subcutaneously, and
And preferably essentially non-degraded in vivo over a period of at least several months.
It is sex. Hydrophilic polymers can increase the hydrophilicity of natural polymers but make them water soluble.
I don't. Currently, the preferred hydrophilic synthetic polymers are monofunctional, difunctional,
And polyfunctional activated polyethylene glycol (PEG). Monofunctional
Sexual PEG has only one reactive hydroxy group, while bifunctional PEG has
, With reactive groups at each end of the molecule. The monofunctional PEG is preferably about 100 and about 15
Between 1,000, more preferably between about 200 and about 8,000, and most preferably about
It has a weight average molecular weight of 4,000. The bifunctional PEG is preferably about 400 to about 100,000.
, Even better
It preferably has a weight average molecular weight of between about 3,000 and about 20,000. Multifunctional PEG is
Preferably, it has an average molecular weight of between about 3,000 and 100,000.
As used herein, the term "polyfunctional" refers to 2 or more molecules per molecule.
A synthetic polymer having more reactive groups, the term itself being the term "difunctional".
Is included.
The terms "monofunctional", "difunctional", and "multifunctional" are used herein to refer to
The terms "monofunctional activation", "bifunctional activation" and "multifunctional activation" and the respective
Used interchangeably.
PEG is monofunctional by forming an alkylene ether group at one end.
Can be. The alkylene ether group is any suitable having 1 to 6 carbon atoms.
An alkoxy group such as methoxy, ethoxy, propoxy, 2-propoxy
It can be poxy, butoxy, hexyloxy and the like. Currently, methoxy
preferable. Bifunctional activated PEG consists of a reactive hydroxy group at each end of a linear molecule.
Is provided by giving. The reactive group is preferably at the end of the polymer.
Although located, it may be provided across its chain direction. Polyfunctional activated synthetic molecule
May crosslink the composition of the invention, and further with a cytokine or growth factor.
It can be used to bond with natural polymers. Abbreviations for synthetic polymers are
It is used as follows:
Monomethoxy polyethylene glycol (mPEG); bifunctional PEG succinimidyl
Glutarate (SG-PEG): Bifunctional PEG
Cucinimidyl (S-PEG); Bifunctional PEG Succinimidyl carbonate (SC-PEG)
); Bifunctional PEG propionaldehyde (A-PEG); and Bifunctional PEG glycidyl
Ruether (E-PEG). The abbreviation "d PEG" refers to various types of bifunctional polyethylene.
Len glycol is included.
As used herein, the term “chemically linked” is via a chemical covalent bond.
It means that they are connected. In the practice of the present invention, a hydrophilic synthetic polymer
The natural polymer or its derivative preferably has covalent bond (s).
Are directly connected to each other via. However, it can be chemically bound by using a linking group.
(Hydrophilic synthetic polymer and natural polymer are respectively bound to the linking group)
Yes, but not directly linked to each other). The term "biocompatible conjugate" refers to the present invention.
Within the meaning of the meaning, a natural polymer chemically bound to a hydrophilic synthetic polymer is meant.
To taste. Therefore, "natural polymer / PEG" (or "PEG / natural polymer") means
1 illustrates a composition of the present invention in which a natural polymer is chemically linked to PEG. "Natural Poly
Mer / PEG "is a natural polymer of the present invention chemically bound to a bifunctional activated PEG.
Means that the polymer molecules can be crosslinked. Synthetic polymers are many different
It may be "chemically linked" to the natural polymer via a type of chemical bond. example
For example, this bond may be via an ester bond or a urethane bond,
And preferably via an ether bond. Can be formed without the use of toxic chemical materials
And in vivo
The ether bond is preferred because it is not easily hydrolyzed.
Synthetic polymers (eg polyethylene glycol) are actually
Cannot be prepared to have the term "min" as used herein.
"Amount" in a given sample, as commonly used in the art.
It is understood by those skilled in the art that it means the weight average molecular weight of a large number of molecules. Therefore,
Samples of PEG 2,000 include, for example, polymers in the weight range of 1,500 to 2,500 daltons.
It can include a statistical mixture of molecules, one molecule over a range of other molecules.
Slightly different. According to the description of the molecular weight range, the average molecular weight is between the specified range.
It can be any value and is shown to include molecules that exceed these limits.
Be done. Thus, a molecular weight range of about 800 to about 20,000 is at least about 800 to about 20 kDa.
In the range ofaverageIndicates the molecular weight.
As used herein, the term "usable lysine residue" refers to a reactive PEG.
Lysine side chains exposed on the outer surface of the natural polymer molecule, located in a manner that
means. The number of lysine residues that can be used is 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid.
It can be determined by reaction with sodium (TNBS).
As used herein, the terms "treatment" and "therapy" refer to defects, especially soft tissue.
Or loss or lack of soft tissue support, or loss or loss of bone or cartilage
Means enhancement, repair, prevention, or alleviation of a defect by. Furthermore, the term "treatment"
,
Use of the filamentous material of the present invention for suturing a wound, and the tube of the present invention
Especially for use in repairing, replacing, or enhancing channels in the human body
Include. Furthermore, "treatment" and "therapy" also refer to the conjugate-containing composition of the present invention.
Using a biologically active protein bound and / or mixed with
Means prevention, maintenance, or alleviation of disease. Therefore, as a treatment for soft tissue,
Soft tissue augmentation (eg, in the removal of skin wrinkles or furrows, or in aging)
In order to replace the subcutaneous fat in the upper jaw where fat is lost due to normal or desired skin
Implantation of the conjugates of the invention to reshape the skin), or submucosa (eg,
, Augmentation of the urinary system sphincter or lower esophageal sphincter)
It Bone and cartilage treatments include the replacement or repair of bone tissue (eg,
, In the treatment of bone nonunions or fractures), the use of conjugates, in particular suitable particulate materials
The use of natural polymers / PEG in combination with the ingredients is included. Bone treatment also comes with
Use of the conjugate-containing composition with or without the presence of additional bone growth factor
Is included. Ceramic particles (preferably hydroxy) with the binder
Apatite and / or calcium phosphate such as tricalcium phosphate)
The composition having, due to its excellent tensile strength, is suitable for repairing stress-resistant bone.
Especially useful.
The terms "cytokine" and "growth factor" cause the recovery or regrowth of normal tissue.
Promoting biologically active molecules and activities
Used to describe natural peptides (whether naturally occurring or synthetic)
Can be The functions of cytokines and growth factors are twofold: (1) this
Or they may stimulate local cells to create new collagen or tissue, or
Or (2) they can attract cells to sites in need of modification. in this way,
Cytokines and growth factors can be used to “implant” biological grafts.
nchoring) "in the host tissue. As mentioned above, the site
The kine or growth factor can be mixed with the conjugate or chemically bound to the conjugate.
Either can be combined. For example, one conjugate is a cytokine (eg,
, Interferon (IFN), tumor necrosis factor (TNF), interleukin, colony
-Stimulating factor (CSF), or growth factor (eg osteogenic factor extract (osteo
genic factor extract (OFE), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor (TG)
F) α, TGF-β (including any combination of TGF-β), TGF-β1, TGF-β
2. Platelet-derived growth factor (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), increase in acidic fibroblasts
Growth factor (FGF), basic FGF, connective tissue activating peptide (CTAP), β-thrombog
Roblin, insulin-like growth factor, erythropoietin (EPO), nerve growth factor
(NGF), bone morphogenic protein (BMP), bone formation
Factors, etc.) can be incorporated. Such cytokines, or growth factors, and
By incorporating the appropriate combination of cytokines and growth factors,
Promotes repopulation and remodeling into normal tissue
Can be obtained or used to treat wounds. In addition, during the synthesis stage, polyfunctional polymers
-By using an appropriate amount of the molecule, the cytokine or growth factor can be biocompatible.
It can be chemically bound to the coalesce. The PEG is then attached to any natural polymer.
By a method similar to that used in the above, or by any other suitable method.
Tokines or growth factors can be attached to the free ends of the polymer. Cytokine
Or by tethering growth factor molecules to the implant, it may be necessary for effective treatment.
The amount of cytokine or growth factor that is reduced is substantially reduced. Cytokine or
Conjugates incorporating growth factors or growth factors are effective for controlled release drug delivery.
It can function as a means of reaching. Alters the chemical bond between the cytokine and the conjugate
Thereby altering the effects on cytokine or growth factor release.
And are possible. For example, when an "ester" bond is used, the bond is a physiological link.
Is more easily cleaved under conditions, and growth factors or cytokines from the matrix
Release is maintained. However, when an "ether" bond is used, the bond is
It is not easily cleaved, and cytokines or growth factors block its active site.
However, it remains in its place for a longer period of time, and the
Provide a biological effect on the substrate of. For release of cytokines or growth factors
In order to obtain a variety of related effects, a mixture of conjugates with different bonds should be included.
And are possible. That is, the sustained release effect is modified to obtain the desired release rate.
Can be
The term "effective amount" means the amount of composition required to achieve the desired effect.
To taste. Therefore, the "tissue growth" of compositions containing cytokines or growth factors
"Promoting amount" is required to detectably stimulate tissue growth
By amount of cytokine or growth factor. Tissue here means connective tissue,
Includes bone, cartilage, epithelium and dermis, blood, and other tissues. Is an effective amount
The actual amount to be taken depends on various factors (eg, patient size, medical condition (conditio
n), gender, and age) and easily determined by a doctor (caregiver).
Can be set.
As used herein, the term "sufficient amount" in combination with a conjugate of the invention
Used to indicate the amount of carrier used. Sufficient amount means that it is a conjugate
When mixed, the desired physical form (eg, injectable solution, injectable suspension)
Liquid, plastic or conformable implants, stress-resistant rigid implants, filaments, tubes
Etc.) is the amount that can be obtained. Injectable formulations generally make the composition smooth and
Containing a sufficient amount of fluent carrier to make it injectable, while providing a flexible implant
The strips have a substantially low amount of carrier and a viscosity-like consistency.
) Has. A solid implant that withstands stress can contain no carrier, and
May have the structural integrity of The amount of carrier will depend on the particular conjugate used and the desired.
It can vary and can be adjusted depending on the final result. This kind of adjustment
It will be apparent to those skilled in the art upon reading the disclosure of the invention.
It
The term "appropriate particulate material" as used herein is substantially insoluble in water.
, Non-immunogenic, biocompatible, and biocompatible conjugates of the invention.
Means immiscible particulate material. The material particles can be fibrous, or diameter
It can range in size from about 20 to 250 μm, and is bead-like or irregular in shape.
possible. Typical particulate materials include fibrous cross-linked collagen and gelatin beads.
, Cross-linked collagen-dPEG particles, polytetrafluoroethylene beads, silicon
Rubber beads, hydrogel beads, silicon carbide beads, and glass beads.
However, it is not limited to these. Calcium phosphate is a preferred particulate material.
And most preferably hydroxyapatite particles and / or tricalcium phosphate.
Umm.
The term "solid implant" is designed for insertion and use in the body.
Any block that contains bone and cartilage implants (for example, gold
Artificial joints, retention pins made of metal, plastic, and / or other materials
(Retaining pin), head plate, etc.), may be used for suturing, or
Filaments, breast implants (eg silicone gel) that may be injected for soft tissue augmentation.
Envelopes, foams, etc., intended for long-term use (more than about 3 days)
A catheter and cannula, a prosthesis and chisel formed from the tube of the present invention.
Tube (eg artificial heart, pancreas, kidney, blood vessel, etc.),
Drug delivery devices (monolith implants, pumps, and
Including steroid pellets for anabolic growth or contraception), skin or
For internal use suture, periodontal ligament, lenticle, corneal shield, aneurysm treatment
For example, platinum wire for the purpose is included. The term "solid implant" is itself a term of the invention.
An implant formed from a biocompatible conjugate composition and coated with the composition of the present invention
Other synthetic materials (eg silicone, polyurethane, titanium, platinum etc.)
Etc.) and both.
As used herein, the term "suitable fibrous material" is substantially insoluble in water.
Non-immunogenic, biocompatible, and biocompatible conjugates of the invention
It means a non-miscible fiber material. Textile materials are various materials with these properties.
And various implants used in connection with medical and pharmaceutical applications.
Form the structural integrity of a piece or device (eg, a tube containing a conjugate)
And / or is combined with a conjugate composition to provide. The inventive combination
The body composition may be coated onto a “suitable fibrous material” which is then wrapped around the bone.
As a result, structural integrity of the bone is provided. Therefore, a "suitable fibrous material" is the invention
Useful in forming a "solid implant".
The term "in situ" as used herein means "at the site of administration".
It Therefore, an injectable reaction mixture composition
Is either infused or given to the site where augmentation is needed and is placed at the site of infusion.
To bridge Suitable sites are generally intradermal or subcutaneous to enhance skin support.
Area, the site of fracture for wound healing and bone repair, and sphincter
Within the sphincter tissue for muscle augmentation (eg, for restoration of restraint).
The term "aqueous mixture" refers to a fluid solution containing a natural polymer and water, a suspension.
Examples include suspensions, dispersions and colloids.
The term "NFC cartilage" as used herein is similar to cartilage in terms of physiological hardness.
A composition of the present invention. NFC cartilage is a non-fibrous collagen (eg,
Collagen solution) and hydrophilic polymer (especially dPEG is used)
It's a bridge As an artifact in the manufacturing process or by design, NF
C cartilage may contain about 0-20% fibrillar collagen. NFC cartilage is usually
To the acidic solution of the enzyme, adding dPEG in the acidic solution and binding before neutralization
It is prepared by giving. The term "NFC-FC cartilage" is similar to NFC cartilage
Mean composition, wherein the percentage of fibrous colasins is about 20-80%
It NFC-FC cartilage is usually prepared by adding dPEG in a neutral buffer to an acidic collagen solution.
It is prepared by Neutral buffer forms collagen fibers during the binding process
Wake up. Similarly, "FC cartilage" is a combination of fibrous collagen and bifunctional hydrophilic
The invention prepared from a polymer
Means the composition of. FC cartilage is usually dPEG and fibrous in neutral solution / suspension
It can be prepared by using collagen.
B.General method
B. 1Preparation:
To form the biocompatible conjugates of the present invention, natural polymers or their derivatives are used.
The conductor should be chemically bonded to the hydrophilic synthetic polymer. This is a lot of people
Method can be used to achieve this. According to the preferred method, the hydrophilic synthetic polymer is activated.
And then reacts directly with the natural polymer. In other methods, natural polymers
Hydroxyl groups or amino groups present in the
Reacts with to form a conjugate. According to less preferred methods, natural and synthetic
Activation in such a way that the polymers react simultaneously to form a biocompatible conjugate.
The attached group having a hydroxyl group or an amino group is
It can be combined with natural polymers. Other methods of forming biocompatible conjugates are described in
It will be apparent to those skilled in the art upon reading the disclosure of the specification. The conjugate of the present invention is for use in the human body
All components (including both polymer and linking group) react with the patient because
It is important to form a conjugate that is not likely to be rejected by the patient or by the patient
. Therefore, toxic and / or immunoreactive components are preferred as starting materials.
Not good. Some preferred starting materials
And methods of forming conjugates are described further below.
A variety of hydrophilic synthetic polymers can be used to form the conjugate.
The polymer must be biocompatible, relatively insoluble and even hydrophilic,
And, preferably, one or more kinds are known because of known biocompatibility.
It is in the form of polyethylene glycol (PEG). Various forms of PEG are biologically
Widely used to modify active molecules. Because PEG has a wide range of solubility
And it is nontoxic, antigenic, immunogenic, and
This is because it typically does not interfere with the enzymatic activity and / or the conformation of the peptide.
In addition, PEG is generally non-biodegradable and is compatible with most living organisms, including humans.
Easily extracted.
The first step in forming the conjugates of the invention generally involves functionalization of the PEG molecule.
Included. Different functionalized polyethylene glycols are used in different fields (eg,
Protein modification (Abuchowski et al.,Enzymes as Drugs， John Wiley & Sons: New Y
ork,
NY (1981) pp. 367-383; and Dreborg et al.,Crit. Rev. Therap. Drug Carr ier Syst.
(1990)6: 315 (both of which are incorporated herein by reference)
)), Peptide chemistry (Mutter et al.,The Peptides， Academic: N
ew York, NY2: 285-332; and Zalipsky et al.,Int. J. Peptide ProteIn Res .
(1987)30: 740 (both of which are incorporated herein by reference).
, And the synthesis of polymeric drugs (Zalipsky et al.,Eur. Polym. J.(1983
)19: 1177; and
Ouchi et al.J. Macromol. Sci. -Chem.(1987)A24: 1011 (both of these specifications
, Which is incorporated by reference in the text))))
Came. For binding polyethylene glycol to specific pharmaceutically active proteins
The various types of conjugates formed by the
Has stability of such conjugates associated with reduced epidemiology and increased half-life
Has already been disclosed and found to be useful in partial medical applications for
Have been.
One form of polyethylene glycol found to be particularly useful is monomethoxy
C-polyethylene glycol (mPEG), which is like cyanuric chloride
It can be activated by the addition of compounds and then bound to proteins (Abuchowski
,J. Biol. Chem.(1977)252: 3578 (both of which are for reference in this specification)
See also))). Made of activated polyethylene glycol like this
Although methods of making may be used in connection with certain embodiments of the present invention, these methods are
Cyanuride provides a relatively toxic and pharmaceutically acceptable composition
In order to completely remove this cyanuric chloride from any of the products obtained.
It is not particularly desirable because it must be done.
Activated forms of PEG (including activated forms of mPEG) are commercially available
It can be created from response components. Activated PE found to be particularly useful in connection with the present invention
One form of G is mPEG-
Succinate-N-hydroxysuccinimide ester (SS-PEG) (Abuchowsk
i et al.Cancer Biochem. Biohvs.(1984)7: 175 (this is for reference purposes herein)
See also))). Activated forms of PEG, such as SS-PEG, are relatively
It reacts with proteins under mild conditions and is characterized by PEG-conjugated proteins.
The conjugates are prepared without compromising the defined biological activity and specificity. But Naga
Et al., Such activated PEGs react with proteins as they react and
Form a bond via an ester bond. Ester bonds are not used in the context of the present invention.
However, they undergo hydrolysis when subjected to physiological conditions for extended periods of time.
It is not particularly preferable because it is received (Dreborg et al.Crit. Rev. Therap. Drug Ca rrier Syst.
(1990)6: 315; and Ulbrich et al.,J. Makromol. Chem.(1986
)1871131 (both of which are incorporated herein by reference).
When).
It is possible to bond PEG and protein via a urethane bond, and
This results in a more stable bond that is more resistant to hydrolysis than the ester bond.
Are provided (Zalipsky et al.,Polvmeric Drug and Drug Deliverv Svstems, First
Chapter 10, "Succinimidyl carbonate of polyethylene glycol" (1991)
(This binds various forms of PEG to specific biologically active proteins
Incorporated herein by reference to disclose the chemistry involved in
)checking). The stability of the urethane bond is
(Veronese et al.,Appl. Biochem. Biotechnol.(1985)11: 141; and
And Larwood et al.J. Labeled Compounds Radiopharm(1984)twenty one: 603 (both of these
Are incorporated herein by reference))). PEG and protein
Another means of coupling and may be by carbamate coupling (Beaucham
p et al.Anal. Biochem.(1983)131: 25; and Berger et al.,Blood (1988)71: 164
1 (both of which are incorporated herein by reference)). Mosquito
The lubamate linkage is achieved by using carbonyldiimidazole-activated PEG
Is generated. This bond has several advantages, but the reaction is relatively slow, and
It may take 2-3 days to complete.
Various means for activating the above PEG and references cited regarding the activating means
(All of which are incorporated herein by reference), PEG and specific live
Described for binding to physically active proteins, but inactive
No binding to natural polymers (not biologically active) is described (Polymeric Drug and Drug De1ivery Systems
, Chapter 10, "Polyethylene Glycol
Succinimidyl carbonate ”(1991) (which has a specific biological activity
Unveils the chemistry involved in linking various forms of PEG to proteins
Incorporated herein by reference))). collagen
Is also taught in US Pat. No. 5,162,430 issued Nov. 10, 1992.
Likewise attached to PEG via an ester bond (also referred to herein).
It is incorporated as a consideration). In the present invention, the activated PEG compound is inactive and various
Can be used for the formation of biocompatible conjugates that retain with certain types of bonds
Is disclosed. Such a conjugate would have a series of improved and predictable
To provide various properties and to form various compositions and articles of the present invention.
Can be used.
B. TwoSpecific forms of activated PEG
As mentioned above, the conjugates of the present invention may comprise a variety of different types of hydrophilic synthetic polymers.
Can be prepared by covalent attachment of the polymer with natural polymers or their derivatives. Only
However, the final product or conjugate obtained is biocompatible and non-immunogenic.
With hydrophilic synthetic polymers in that it must have many properties
Has been found to be effective in using polyethylene glycol
. Polyethylene glycol is activated at one or preferably two ends of the molecule
It must be modified to provide a group, so that PEG and natural poly
A covalent bond is formed with the mer. Some functionalized PEG specific forms
Structurally shown below, these functionalized forms of PEG and natural polymers or
The reaction products obtained by the reaction with these derivatives are also shown.
1.PEG attachment of natural polymers:
The first functionalized PEG was the bifunctional PEG succinimidyl glutarate, which
In the detailed document, it is written as (SG-PEG). Structural formula of this molecule and it and amino group NH2
Reaction product obtained by reacting with a natural polymer (shown as NTL-PLYM) having
Is shown in Equation 1 below.
SG-PEG: Bifunctional PEG Succinimidyl glutarate
Another bifunctional activated form of PEG is referred to as PEG succinimidyl (S-PEG)
. Structural formula of this compound and reaction obtained by reacting it with a natural polymer
The products are shown below. Me
It should be noted that the tyl group is repeated 3 times at each end of the molecule. This compound
In the general structural formula of an object, the subscript 3 is replaced by "n". Equation 1 and
In a particular embodiment shown in 2, repeated PEG on both sides of PEG2There are 3 groups
Therefore, n is 3. The structure in Formula 2 has a bifunctional PEG and a natural PEG at each end.
It contains an "ether" bond with the limer. This ether bond is not hydrolyzed
. This differs from the conjugate shown in Formula 1 where an ester bond was provided. This d
Stell bonds undergo hydrolysis under physiological conditions.
S-PEG, n = 3: bifunctional PEG succinimidyl
Furthermore, the bond formed by reacting the derivatized PEG with collagen.
Other derivatized forms of polyethylene glycol (n = 2) are shown in Formula 3.
.
S-PEG, n = 2: bifunctional PEG succinimidyl
Other preferred embodiments of the invention similar to the conjugates provided in formulas 2 and 3.
Is provided when n = 1. The structural formula and the resulting conjugate are shown in Formula 4.
It is noted that this conjugate contains both ether and peptide bonds
.
These bonds are stable under physiological conditions.
S-PEG, n = 1: bifunctional PEG succinimidyl
Still other derivatized forms of PEG are provided when n = 0. This bifunctionality
The form is called PEG succinimidyl carbonate (SC-PEG). This compound
Structural formula and the bond formed by reacting SC-PEG with collagen
The body is shown in Equation 5. This bond contains a urethane bond, but this bond
It is not found to have a high degree of stability under physiological conditions.
SC-PEG, n = 0: bifunctional PEG succinimidyl carbonate
All of the above derivatives contain a succinimidyl group therein. However, different
Active groups may be attached to one or both ends of the PEG molecule. For example, PEG and A-PEG
Such as a conjugate formed by reaction with a natural polymer or its derivatives
Derivatives for forming the bifunctional PEG propionaldehyde (A-PEG) shown in formula 6
Can be transformed.
A-PEG: Bifunctional PEG Propionaldehyde
In addition, other bifunctional forms of polyethylene glycol are natural polymers and
Is a conjugate formed by reacting with its derivative,
It is PEG glycidyl ether (E-PEG) shown.
E-PEG: Bifunctional PEG glycidyl ether
The conjugate formed with the functionalized form of PEG is the
It varies depending on the functionalized morphology. In addition, the final product also contains the molecular weight of PEG.
By changing, it can change in relation to its nature. In general, the stability of the conjugate
The property is to eliminate all ester bonds between PEG and the natural polymer, and
And improved by containing an ether bond and / or a urethane bond.
. In some situations, optionally containing weak ester linkages, which are physiologically linked.
Hydrolysis under conditions, matrix destruction, and internal retained components (eg,
Release of growth factors or cytokines)
And gradually destroyed. A change in the chemical structure of the bond may lead to a sustained release rate.
Can be changed.
2.PEG attachment of polysaccharides:
Hyaluronic acid is a polymer of repeating monomer units as shown in formula 8 below.
Including
Hyaluronic acid can be attached to PEG using many different methods. Preferred method
Includes a modification of a carboxyl group and a modification of an acetyl group. PEG-hi
A reaction scheme showing the modification of the carboxyl group of hyaluronic acid with drazine,
Figure
8 shows. Reaction showing modification of acetyl group by succinimidyl-PEG (S-PEG)
The scheme is shown in FIG.
3.PEG attachment of proteoglycans:
As shown in FIG. 10, chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C, and
Dermatan sulfate (chondroitin sulfate B) has the same structure as hyaluronic acid.
And almost the same method used to derivatize hyaluronic acid
Can be conjugated to PEG by producing a derivative.
4.PEG attachment of polylactic acid:
Esters undergo nucleophilic substitution. This is typical of carboxylic acid derivatives. Offensive
The strike occurs on a carbonyl carbon that lacks electrons. These reactions are often
, In the presence of acid. In these acid-catalyzed reactions, H+Is a carbonyl group
Binds to the oxygen of the and makes the carbonyl carbon more susceptible to nucleophilic attack. this
A reaction scheme showing this is shown in FIG.
5.PEG attachment of polyethylene:
Many different activated PEGs (both difunctional and polyfunctional) are polyethylene
Can be used to crosslink. Highly strained
Since the member ring is easy to open, bifunctional or polyfunctional E-PEG is
Bridge
Can be used for. The bond angle of the ring (60 degrees on average) is the angle of carbon in a normal tetrahedral structure.
It is considerably smaller than the degree of 109 degrees. Polyethylene has a lot of natural
It does not denature as easily as other polymers, eg collagen, so raise the temperature
E-PEG can be used to crosslink polyethylene.
The reaction of bifunctional E-PEG with polyethylene is shown below:
The reaction of bifunctional S-PEG with polyethylene is shown below:
2 PEG-NH2 + d S-PEG → PEG-NH-CO-PEG-CO-NH-PEG
Reaction of polyethylene with polyfunctional activated forms of E-PEG and S-PEG, respectively
, Shown in FIGS. 12 and 13.
Cross-linking reactions between natural and synthetic polymers can be performed in vitro
Alternatively, the reaction mixture can be injected to crosslink in situ. sufficient
At various densities, the cross-linked biocompatible conjugate resembles cartilage and its
It is useful as a head onlay, ear and nose reconstruction, etc.). Natural poly
In addition to forming conjugates between the
The polyfunctional polymer also has a composition that is particularly suitable for wound healing, bone formation, and immune regulation.
Natural polymers and other proteins, especially cytokines or growth factors.
Child) can also be used for covalently linking. Such growth factors or sites
By binding kine to a biocompatible polymer (eg collagen)
Thus, an effective slow release drug delivery system is provided. Natural polymer
While ether linkages can be used to bond the polymer to the synthetic polymer,
Ester linkages can be used to bind tocaine or growth factors, and
This results in a slow release of cytokines or growth factors.
6.Collagen PEG attachment:
Suitable collagen for use in the present invention includes any type of collagen.
(Natural telopeptide-containing compounds that can be used in situations where immune response sensitivity is not significant
Including collagen). However, for the majority of uses, it is non-immunogenic
Atelopeptide collagen, especially types I, II, and III are preferred
100 collagen solution) and with or without telopeptide regions.
Preferably the collagen is reconstituted
Collagen Implant (ZCI) or atelopeptide collagen solution
(CIS). Various forms of collagen are commercially available
Or, for example, US Pat. Nos. 3,949,073; 4,488,911;
No. 424,208; No. 4,582,640; No. 4,642,117; No. 4,557,764; and No.
4,689,399 (all incorporated herein by reference).
Therefore, it can be prepared. Non-fibrous collagen, atelopeptide collagen, reconstitution
Collagen formed is preferred for forming certain products. With collagen
Methods for conjugating hydrophilic synthetic polymers (eg, PEG) are described in US Pat. No. 5,162,430.
Issue is detailed.
The composition of the present invention comprises a natural polymer, or a derivative thereof (which may be one or
Chemically bonded to a plurality of selected hydrophilic synthetic polymers). Natural po
Limers (eg, collagen derivatives) to bind hydrophilic synthetic polymers
It contains many available amino and hydroxy groups that can be used. This port
The limers can be attached using "linking groups". This is a natural polymer and synthetic
Often before the native hydroxy or amino group on the limer can be linked.
This is because it requires activation. For example, dicarboxylic acid anhydrides (eg, gluta
Compounds such as acid anhydrides or succinic anhydrides) can be used, and polymer derivatives (
For example, succinate) can be formed. This is then followed by the appropriate leaving group.
It can be activated by tellurization. For example, N-hydroxysuccinimide, N, N'-
Disuccinimidyl oxalate, N, N'-disuccinimidyl carbonate
What. For further linking groups
See also Davis U.S. Pat. No. 4,179,337. Polymer-Gluta
No presently preferred dicarboxylic acid used to form rate compositions
Water products include glutaric anhydride, adipic anhydride, and 1,8-naphthalenedicarboxylic acid.
Anhydrides and 1,4,5,8-naphthalenetetracarboxylic dianhydride are included. This
The polymer activated in this way then reacts with the natural polymer
Form a clear biocompatible conjugate.Conjugate by ester bond
In some embodiments, pharmaceutically pure form of monomethyl polyethylene glycol.
Reacting Kohl (mPEG) (mw 5,000) with glutaric anhydride (pure form),
Create mPEG glutarate. Then, this glutarate derivative was treated with N-hydroxy.
Reacts with succinimide to give succinimidyl monomethyl polyethylene glycol
To form gluglutarate. Then succinimidyl ester (mPEG*, Live
A derivatized PEG intermediate) is a free amino group present on certain natural polymers (
Lysine residue). This reaction releases one end of the PEG molecule.
Natural polymer-PEG conjugates of the invention, with or without conjugation, are produced.
Other polymers can be substituted with monomethyl PEG, as described above. Similarly, this
Coupling reactions are well known for derivatizing proteins and synthetic polymers.
Can also be achieved by using the method described above. Of bound ricin
The number can vary from one residue to 100% of lysine, preferably 10% to 50%.
, And more preferably 20 to 30%. The number of reactive lysine residues is
It can be determined by a method (eg, reaction with TNBS).
By using bifunctional PEG, the same or different natural polymer or
Itokine can be attached to the other end of PEG. In addition, PEG and
The bond linking the natural polymer and / or other molecule of interest is an ester, ether
Ether and / or urethane bond, and preferably an ether bond
Is.Composition for bone repair
Formulations suitable for repairing bone defects or non-union joints are made with appropriate particulate materials as needed.
Can be prepared by mixing with a biocompatible conjugate to provide a concentrated composition.
It When making a bone repair composition, the combination of collagen and polymer is preferred.
It is preferable to use an ether bond in order to avoid deterioration of the ester bond due to hydrolysis.
It Such a conjugate / particulate composition may be ordered depending on the amount of liquid taken up.
It can be responsive or rigid. Formulations for the treatment of stress-resistant bone are preferred
Are dry and rigid, and are generally between about 45% and 85% particulate
Calcium phosphate minerals (eg hydroxyapatite or tricalcium phosphate)
Sium, or a mixture thereof). Tensile strength and rigidity
of
The composition is vacuumed at about 60-90 ° C), preferably at about 75 ° C for about 5-15 hours, preferably
More preferably by heating for about 10 hours. Compliant composition
Can be used for stress-free bone or cartilage repair.
Activated mPEG*However, the bifunctional activated PEG (dPEG*, For example, unmethylated PEG,
Then each end is activated) to replace the crosslinker, either completely or partially.
Alternatively, a partially crosslinked composition can be provided. Such compositions, however, are
Traditional cross-linked collagen (eg with heat, radiation, glutaraldehyde, etc.)
It is completely different from the composition. It is a long-chain hydrophilic synthetic polymer for the composition
This is because it imparts a substantially hydrophilic property. In a presently preferred embodiment, PE
About 1-20% of G is bifunctional activated PEG. Composition properties include difunctionality included
It can be adjusted as desired by varying the amount of activated PEG.
In another presently preferred embodiment, the bifunctional activated PEG*(Substantially at pH 7
100%) is used to crosslink the natural polymer or its derivatives.
In one example, CIS (about 3-100 mg / mL, preferably about 10-40 mg / mL) is added to about 2,000
DPEG having a molecular weight of 0 to about 100,000 (preferably about 3,400 to 20,000)*(Acid anhydride
Is a bifunctional PEG with each end activated by the addition of
With a different leaving group (as a concentrated solution, the final concentration of the reaction mixture is about
5 to 40%, preferably about 10 to 20%). this is,
DPEG to collagen on a molar basis*5 to 10 times excess. Collagen molecule
DPEG without mechanical mixing or stirring*Bound to, and precipitated from solution, about 2
Cartilage-like collagen-polymer conjugate containing 0-80% fibrous collagen
To generate. The conjugate was then washed with PBS to remove any residual unreacted dPEG.*To
Removing also provides the material of the present invention. Cartilage-like collagen
The limmer conjugate is also dPEG*A solution (pH 3) and a collagen solution of 2 syrin
Mix evenly between the tubes and then cast into a suitable container (eg Petri dish)
Can be prepared by Then 20% w / v dPEG*Non-fiber solution (pH 7)
When added to fibrous collagen-PEG solution, it is a little cartilage-like fibrous collagen-polymer
-A conjugate is generated. The obtained NFC-FC conjugate cartilage contained about 1-40% of fibrous collagen.
Contains Gen.
The properties of the final product can be varied by varying the initial reaction components and reaction conditions.
Can be adjusted. For example, natural polymers other than collagen can be used. General
In addition, as the concentration of natural polymer or PEG increased, the density of
A good product is obtained. Collagen solution and dPEG*Changing the pH of the solution
Thereby, the composition can be manufactured over a wide range of fibrous collagen content.
If desired, the high density formulation may be of any desired shape (eg, sheet, membrane, etc.).
, Tubes, cylinders, filaments, cords, ropes, etc.)
obtain. Some shapes manufactured by extrusion
Can be done.Chest implant
Biocompatible polymer conjugates are also used as coatings on breast implants.
obtain. The surface of a standard silicone shell implant is chemically derivatized,
An active attachment site for bifunctional or polyfunctional PEG attached to natural polymers
Can be given. The following three-part conjugate is obtained: (natural polymer-PEG
-Silicone). Of the conjugate coating directly bonded to silicone via PEG
Presence reduces scar tissue formation and capsular contracture
Function like. Unlike typical coated breast implants, scar tissue
It cannot grow between the conjugate coating and the surface of the implant itself.
Alternatively, the conjugate can be a hollow sphere for use as a chest implant shell.
Can be formed. This shell is then trigged to facilitate mammography.
It may be filled with a radiopaque material such as lyserides.Coated medical device
Injectable conjugate formulations (gels or solutions) can be used in implants, catheters, chews
Fibers (eg, as a vascular substitute), meshes (eg, for tissue strengthening), threads
It can be used to coat the like. The biocompatible conjugate formulation is also white
Can be used to coat gold wire and then through catheter to aneurysm segment
Can be applied to. Gels can be prepared with different polymer concentrations and different reaction times
It CIS is preferred when the desired properties are high density, stiffness, viscosity, and translucency.
A good starting material. However, different properties (eg high opacity, frame
, And susceptibility to colonization of cells after transplantation)
In order to obtain a product, fibrous collagen (preferably an atheropep such as ZCI)
Tide fibrillar collagen) and other natural polymers can be substituted. For transplant
Designed coated articles (eg, catheters and stress-resistant bone grafts)
CIS-based materials are currently preferred for). CIS material is an ether bond
Combined with PEG.
The composition of the present invention (particularly a crosslinked collagen composition) may also be used for transplantation,
That is, it is useful as a coated article to remain in the body for a relatively long period of time.
is there. Such surface treatment renders the target non-immunogenic and also
Occurrence of foreign body reaction is reduced. Accordingly, the compositions of the present invention are useful in catheters, cannulas.
, Bone prostheses, cartilage substitutes, breast implants, minipumps and other drug delivery devices
The invention can be applied to artificial organs and artificial organs. This application applies to the target while crosslinking is taking place.
By soaking it in the reaction mixture and drying the viscous viscous coating.
Can be achieved. If dipping is not possible, soak the reaction mixture or brush.
It can be applied or applied.
Alternatively, a flexible sheet-shaped or membrane-shaped collagen-polymer binder is used.
The merging may be used to wrap around the target and seal the corners and edges with the reaction mixture.
In another embodiment, the target is viscous until the target is completely coated.
It can be immersed in a collagen solution bath or a fibrous collagen solution. With collagen
DPEG coated target*(PH 7) Immerse in a solution bath, then collagen
By drying the target substance coated with limmer, the collagen solution is
It is fixed to the thing. Alternatively, a viscous collagen solution can be added to dPEG as described above.*(P
H3) Mix with solution and polymerize rapidly. Target the product with acidic collagen
Immerse it in the limmer solution and coat the target with about 20% by weight of dPEG.*(P
Collagen by immersing in a neutralization buffer containing H7) and curing
-The polymer-coated target is formed.Coated graft
In addition to breast implants, the biocompatible conjugates of the present invention can be used in a variety of different types of co-
It can be used to make customized grafts. The conjugate is, for example, PEG
By combining various synthetic polymers with natural polymers such as hyaluronic acid
Can be formed. The formed biocompatible conjugate can be used in any type of implant device.
Can be coated onto the surface of, and is useful for improving the biocompatibility of implants
. Use multifunctional PEG
It is also possible. When using multifunctional PEG, another active site of PEG is
It can be used to bind biologically active compounds such as tocaine. three
When the partial conjugate is formed, it can be coated on the surface of the implant. Cytoca
When a conjugate composed of in-PEG-hyaluronic acid was included on the surface of the implant
, Promotes the integration of growth of peripheral cells into the graft.
According to a preferred embodiment of the coated implant, a multi-functional agent such as a multifunctional PEG.
Birch is made of a functional synthetic polymer. One of the active sites of multifunctional PEG is natural poly
PEG (eg, hyaluronic acid or collagen) to bind polyfunctional PEG
The active site reacts directly with the activation site on the surface of the implant. Therefore, the conjugate is transplanted
Directly covalently bonded to one surface. Many implants are used to augment or repair bone.
Used to fit the implant in the space in which it is placed
. In such cases, the coated implant (the conjugate used for coating (eg
For example, the collagen-PEG conjugate) initially contains a large amount of water).
desirable. When making collagen-PEG conjugates and coating them on the surface of implants
Can then be dried so that the size of the coating is substantially
Decrease. The coated implant is then placed on the bone to be repaired or augmented.
It is placed in place and reabsorbs and swells within the tissue. Seed to coating
Various biologically active compounds (eg cytokines and growth factors)
In addition to combining, it can help improve the structural integrity of the coating,
And by including certain materials that can provide for more irregular surfaces, the peripheral assembly
It is possible to help promote weaving integration. Coated implants are preferred
Is coated with a conjugate in which an ether bond has been formed. This produces a conjugate
It is preferred to maintain it when used in the body, and to add ether linkages.
It is less sensitive to water splitting than ester bonds.Conjugates and cytokines and / or growth factors
Biologically active cytokines or growth factors (eg EGF and TGF-β)
The composition of the present invention containing a composition containing an appropriate amount of cytokine or growth factor
Or by mixing cytokines or growth factors into the natural polymer.
It is prepared by conjugating with PEG followed by treatment with activated PEG. Hydrophilic synthesis
Consisting of natural polymers with cytokines or growth factors attached by the polymer
For the conjugate, the degree of cross-linking can be improved by using an appropriate amount of bifunctional activated PEG.
Can be defined.
Preferably, the cytokine or growth factor is first added in molar excess in a dilute solution.
dPEG*And react for 3-4 hours. dPEG*Preferably a final concentration of 30
Add to ~ 50-fold molar excess and favor cytokines or growth factors.
Preferably, a concentration of about 1 μg / mL to about 5 mg / mL is given. Then generate
Bound cytokines in an aqueous collagen mixture (about 1 to about 6) at pH 7-8.
0 mg / mL) and react further. Allow the resulting composition to stand overnight at room temperature.
Place. The pellet was collected by centrifugation and any unbound cytokine
Or by vortexing vigorously to remove growth factor molecules as well
Wash with PBS.Biocompatible thread
In one embodiment of the invention, the biocompatible conjugate is an elongated cylinder or thread.
Used to form objects. Filaments have diameters in the range of about 0.10 mm to about 20 mm.
And, more preferably, has a diameter of about 0.25 mm to about 2.5 mm. Filament Yes
It may be of any length, but preferably has a length in the range of about 0.25 cm to about 25 cm. yarn
The length and diameter of the features are highly dependent on the desired application. Filament is a combined material
Can be manufactured by molding or extrusion. Filaments that dissolve in tissue are
Esters that can be used as synthetic yarns and are destroyed by hydrolysis
It may consist of a conjugate using conjugation. These filaments are divided into small pieces and dehydrated
And can be injected for soft tissue augmentation. Further sets in soft tissue augmentation
In order to promote weave anchorage, the filaments may be incorporated with other biologically active ingredients (eg, cytosines).
Kine or growth factor).Membranous form
Flexible sheet-like or film-like morphology can be prepared by methods known in the art (eg,
For example, U.S. Pat. Nos. 4,600,533; 4,412,947; and 4,242,291).
Can be prepared. These methods involve membranes using the biocompatible conjugates of the invention.
It can be used for manufacturing. In order to produce a membrane, a natural polymer (high concentration (10
~ 100 mg / mL) CIS or fibrillar collagen (preferably ateropep such as ZCI)
Ctide fibrous collagen)) is cast into a flat sheet container. mPEG*Melting
Liquid (having a molecular weight of about 5,000) is added to the cast collagen solution and room temperature
Let react overnight. The resulting collagen-polymer conjugate was treated with a sterile spatula.
Excess unreacted mPEG was removed from the reaction solution using a throat and washed with PBS.*Excluding
Leave.
The resulting conjugate is then compressed under constant pressure to produce a uniform flat sheet or
A mat may be formed. It is then dried to form the membranous implant of the present invention. Than
The flexible membranous morphology has a lower concentration of natural polymers (eg collagen).
) And a high concentration of synthetic polymer concentrate.
The less flexible membrane morphology is mPEG*Not dPEG*With solution
It is prepared by Mix CIS and buffer solution at room temperature and at 37 ° C overnight
Incubate. Compress the resulting gel under constant pressure, dry, and
Desalinate by washing. The resulting membrane is then dPEG*To process with
Crosslinked, washed, and then dried at low temperature.
Alternatively, CIS or fibrous collagen (10 to 100 mg / mL) can be used as a flat sheet.
Cast into the container. dPEG*Solution (22-50% w / v) was added to the cast collagen.
Get The mixture is left to react for several hours at room temperature. The shorter the reaction time, the more
A kisible film is produced. The obtained collagen-polymer film is, if necessary,
It can be dehydrated by a vacuum oven or by freeze drying or air drying.sponge
The biocompatible conjugate can also be lyophilized from the aqueous slurry of the composition after conjugation.
Can be prepared in the form of a sponge.Biocompatible polymer tube
The biocompatible conjugate of the present invention is formed into a tube by molding or extrusion.
Can be used for The tube has an outside diameter in the range of 0.25 mm to about 5.0 cm, and 0.05 mm
Has an inner diameter in the range of about 4.9 cm. Tubes are generally
It has a circular cross section with respect to diameter. Tubing can be any length, but typically 10
It has a length greater than mm, and more preferably greater than 10 cm. tube
Includes any type of bond (including ester, ether, or urethane bonds)
Can be manufactured with a conjugate that also has
Is preferred. Tube is a species of living organism
Repairs various types of channels (eg, veins, arteries, and fallopian tubes)
Can be used for. However, the use of tubes is not limited to these
.Soft tissue augmentation
The compositions of the present invention have various uses. A malleable and plastic composition will enhance skin
Injectable formulations suitable for high strengths (eg filling skin grooves and supporting skin surface)
Can be prepared as Such compositions may also be used to enhance sphincter tissue (eg,
It is useful, for example, to restore self-control. In such cases, the formulation should be
It is directly injected into the muscle tissue to increase the bulk and increase the occluding tissue.
Adapt easily and effectively. These compositions may be homogeneous, or
As a suspension of microgel-conjugated small particles or in a non-aqueous fluid carrier
It can be prepared as a suspension of delivered beads. The beads / particles reabsorb water and then
And expands in situ. This is injected to make the desired bond.
Compared to commercial preparations, in that less volume of product is required
Is advantageous.
Surprisingly, the reaction mixture can be administered by infusion before crosslinking is complete.
It For example, use an aqueous collagen mixture with a low concentration of dPEG.*Mix with the solution, mix, and then
The formulation before the viscosity has risen to the point where it is difficult to inject (usually about 20 minutes).
Enter or grant. Two shirin with luer lock hub
Between one or two syringes with dual compartments (eg
, The mixture can be mixed by passing the mixture through a double barrel.
Can be done. The composition is cross-linked in situ and the implant is tied in place.
It may be further crosslinked to the endogenous tissue while stagnating. With this method, about 10-100 mg /
A concentration of mL of collagen (preferably fibrillar collagen) can be used, but
30-80 mg / mL is preferred and most preferably about 33 mg / mL. dPEG*The concentration of
It is preferably about 0.1 to about 3%, but if desired, a high concentration of about 30% is used.
Can be done. The mixture is injected directly into the site where augmentation is needed, and inflammation or
Causes essentially no foreign body reaction. Particulate material in the reaction mixture of collagen (eg
For example, hydrogel or collagen-dPEG beads, or hydroxyapatite
(Tri / calcium phosphate particles) is further included, resulting in more
Bulky or stiffer implants are provided.Cartilage repair
The composition of the present invention may be prepared in a sufficiently dense and rigid, cartilage substitute form.
It These compositions repair and support tissues that require some structure
For example (eg, nose, ear, knee, larynx, tracheal ring, and
Useful in joint surface reconstruction). In addition, a properly formed cartilage-like material
Can be used to replace hips, ligaments, and blood vessels
It In these applications, the material is typically cast or molded and shaped.
. For keys and ligaments, form filaments for braiding into cords or ropes
It may be preferable. Reinforced mesh to enhance structural integrity
(Eg, nylon, etc.) can be incorporated as needed.Administration of cytokines and growth factors
Compositions of the invention containing cytokines and growth factors are particularly useful for wound healing.
Suitable for continuous administration as in the case of acceleration. Bone formation inducers and cofactors
(Including TGF-β) as well as bone morphogenetic protein (BMP)
It may be advantageously incorporated into compositions for strong and / or defect repair. In membrane form
The provided compositions are transferred to suppress rejection and induce improved tissue growth.
It can be used to wrap or coat an organ. Similarly, growth factor-
Organs for transplantation using a cross-linking reaction mixture of polymer conjugate and collagen
Can be coated. Alternatively, TNF, interferons, CSFs, TGF-β, etc.
Antiviral and antitumor factors such as are administered to obtain their pharmaceutical activity.
Can be The amount of composition used depends on the degree of condition being treated, incorporated into the composition.
It depends on the amount of factors, the desired delivery rate, and the like. However, these parameters
In a normal experiment (for example, preparing the model compositions listed in the examples below,
And assaying the release rate of the active compound in a suitable experimental model.
Can be easily determined.
Example
Methods of making conjugates, formulations, articles, and implants incorporating such conjugates
The following examples are provided to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of the method. This
These examples are not intended to limit the scope of the invention. The number used (eg
, Amount, temperature, molecular weight, etc.)
Experimental error and deviation of should be taken into account. Unless otherwise indicated,
Parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is large.
At or near atmospheric pressure.
Example 1
(Preparation of collagen-PEG)
(A) Monomethyl-PEG5000 (50 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) was added to 1,2-
Dissolve in dichloroethane (250 mL), and glutaric anhydride (5 g) and pi
Heat at reflux with lysine (4 mL) under nitrogen for 3 days. Then, the solution is filtered.
Filter, the solvent was evaporated, and the residue was dissolved in water (100 mL).
Wash with ether (2 x 50 mL). The resulting PEG-glutarate was purified from water.
Extract with loroform (2 x 50 mL) and evaporate this chloroform.
, About 43 g of PEG-glutarate is obtained. The PEG-glutarate was then diluted at 37 ° C.
Me
Dissolve in tylformamide (DMF, 200 mL) and N-hydroxysuccinimid
Add 10% mol xs. The solution was cooled to 0 ° C. and an equivalent volume of dicyclohexane
Add xylcarbodiimide to DMF solution (10 mL). This mixture is left at room temperature for 24 hours
Allow to stand and then filter. Then add cold benzene (100 mL) and stir at 0 ° C.
By adding oil ether (200 mL), PEG-succinimidyl glutarate (PEG
-SG) to precipitate. The precipitate is collected on a sintered glass filter. benzene
"Activation" was repeated three times by dissolving in water and then precipitating with petroleum ether.
Give PEG (PEG-SG).
0.004 mmol) was mixed with 0.2 M phosphate buffer (44 mL) and the pH was raised to 7.4. Next
, A 3-fold molar excess of SG-PEG (6.00 g, 1.2 mmol) was dissolved in water for injection (40 mL
), And sterile filtered. Then add this SG-PEG solution to the collagen solution
, And the mixture was placed at 17-22 ° C for about 15 hours. Then centrifuge this solution
, And the resulting pelletized reconstituted fibrils (25 g) were collected and phosphate buffered
The residual PEG was removed by washing with saline (PBS, 3 × 400 mL). Obtained material
The material is solid, has a tight elasticity and can be picked up with a spatula
The plant is more fluid). The resulting material was diluted with PBS to
A dispersion having a degree of 20.5 mg / mL collagen-PEG can be provided.
(B) Polypropylene glycol and PO instead of polyethylene glycol
The procedure is the same as in (A) above except that the E-POP block polymer is used.
Collagen-PPG and collagen-POE-POP compositions are prepared.
(C) Bifunctional PEG3400 (34 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) was treated with 1,2-dichloro.
Dissolve in loethane (250 mL), and glutaric anhydride (10 g) and pyridine (
4 mL) under nitrogen and heated at reflux for 3 days. Then, the solution is filtered and dissolved.
The medium was evaporated and the residue was dissolved in water (100 mL), diethyl ether (
2 x 50 mL). The PEG-diglutarate obtained was dissolved in water from chloroform.
With chloroform (2 x 50 mL) and the chloroform was evaporated to give PEG-
Get diglutarate. Next, this PEG-diglutarate was added to DMF (200 mL) at 37 ° C.
) And added N-hydroxysuccinimide (10% mol xs). This
Was cooled to 0 ° C. and an equivalent amount of dicyclohexylcarbodiimide in DMF was dissolved.
Add liquid (10 mL). The mixture is left at room temperature for 24 hours and filtered. next
, Cold benzene (100 mL) was added, and petroleum ether (200 mL) was added at 0 ° C.mL)
And to precipitate PEG-di (succinimidyl glutarate) (dPEG-SG). This
Collect the precipitate on a sintered glass filter. Dissolve in benzene, then petroleum
Repeat the precipitation with ether three times to obtain "activated" dPEG (dPEG*)give
.
0.004 mmol) was mixed with 0.2 M phosphate buffer (44 mL) and the pH was raised to 7.4. Next
A 3-fold molar excess of dPEG*(6.00 g, 1.2 mmol) was dissolved in water for injection (40 mL
), And sterile filtered. Then this dPEG*Add the solution to the collagen solution above
, Stirred, and the mixture was placed at 17-22 ° C for about 15 hours. Centrifuge this solution
And collect the resulting pelletized reconstituted fibrils in PBS (3 x 400 mL)
Washed and left dPEG*Was removed. Then put this pellet in a syringe (
This syringe is connected to the second syringe with a luer lock hub),
And alternated between syringes until homogeneous. The resulting material is in solution
A microgel or particulate suspension in which fibrils of non-uniform size are suspended.
(Microgel conjugate). This material is a smooth, flexible, rubbery mass
, Has a glossy appearance.
(D) Preparation of cartilage conjugate:
About 20% by weight dPEG*Add (pH 7) to the collagen solution (33.8mg / mL) and add at 21 ℃.
Incubated for 16 hours. The resulting conjugate was treated with 100 mL of PBS for 3 to 12
Washed 5 times. The obtained cartilage non-fibrous collagen-polymer conjugate (NFC-FC cartilage
) Was a translucent solid with close elasticity. This product contains about 20-80% fiber
It contained natural collagen.
Other NFC cartilage compositions, dPEG*Solution (0.6g, pH3) and collagen solution (33.8mg / mL)
, PH 2). Connect this solution with a luer lock.
Between the two syringes
And a homogeneous solution was prepared. Then dPEG*Neutralization buffer solution (20% w / v)
Was added to provide a substantially non-fibrous collagen (NFC) cartilage material. Obtained generation
The article contained about 1-40% fibrillar collagen.
Alternatively, use fibrous collagen instead of CIS, with an opaque appearance and high fiber
A cartilage fibrous collagen-polymer conjugate (FC cartilage) having a content can be produced.
Such FC cartilage is more porous and permeable than non-fibrous biocompatible conjugates.
is there.
Example 2
(Characterization)
(A) qualify the collagen-mPEG prepared in Example 1A,
Compared with hydr-crosslinked fibrillar collagen (GAX).Extrusion
:
This assay is required to extrude the test composition from a 30 gauge needle
The force was measured. The results obtained show that plunge ZCI can be extruded smoothly.
Can be represented by a graph showing the required force (Newton) against the distance traveled by the car
, The force required was about 20-30 Newtons. But about GAX
When turned into, the trajectory of force represents "spiking" and GAX does not extrude smoothly.
And are indicated. During the extrusion, in certain parts, GAX has about 10
~ 15N required
I needed it. In contrast, collagen-mPEG has a very low extrusion force (8-10N).
With little or no spiking.Intrusion
:
Intrusion is a composition in which the composition is porous rather than remaining in small chunks.
A measure of the tendency to "finger" or pour into a quality bed
. For soft tissue augmentation, the lower the infusion, the better the injected graft.
It is preferred because it does not diffuse through the dermis and stays there.
Carbonization imitating human dermis up to half of a 1 mL syringe fitted with a 30 gauge needle
Filled with silicon particles (60 mesh). Test the top half of this syringe at 35 mg / mL
The composition (GAX, ZCI, or collagen-mPEG) was filled with 0.5 mL. Then plan
I put the jar in and pushed it down. When pushed down, the ZCI came out at the needle. This
This shows intrusion through the silicon carbide bed. GAX or this
The collagen filled with light collagen-mPEG does not pass through the collagen, instead,
Only the buffer solution is released and there is no intrudability.
Indicated.Helicity
:
The fact that parts of each composition are non-helical indicates that they are susceptible to digestion by trypsin.
It was measured using acceptability. Sample professional
Treated with thease trypsin. This protease trypsin is collagen
It can attack only the fragmented part of the protein. The extent of hydrolysis depends on the stability of the
The results were measured by the fluoresamine assay for peptide and the results were determined by
Expressed as a ratio of Lagen. The percentage of non-helical collagen begins to digest
It was measured 30 minutes after the start. The results show that ZCI is sensitive 3-10% and GAX is sensitive 1
~ 2%, and showed that collagen-mPEG is about 1% sensitive. To
Sensitivity to lipsin is also associated with endogenous proteases after transplantation.
Can be correlated with sensitivity to.Collagenase sensitivity
:
The sensitivity of each composition to collagenase was also measured. ZCI is 65.2% digested
In comparison, GAX was 2.2% and collagen-mPEG was 45.8%.
It wasPhase transition
:
The behavior of each composition against temperature was tested using a differential scanning calorimeter. When heated
, ZCI showed multiple peaks at about 45 ℃ and 53 ℃. GAX shows a peak at 67-70 ° C
It was Collagen-mPEG showed a peak at 56 to 61 ° C.Lysine content
:
For each composition, the number of free lysine per mole was calculated as
It was measured by quantifying reactive epsilon amino groups with TNBS. ZC
I indicates that it contains approximately 30 (K / m) lysine per (helical) molecule, while GA
X was 26-27 K / m and collagen-mPEG was 21-26 K / m.
(B) Characterization of cross-linked biocompatible conjugates:
Differential scanning calorimetry of collagen-dPEG conjugates prepared as described in Example 1C.
It was qualitatively measured using a measurement method (DSC). By this test, collagen content
The transition temperature during fragmentation at the level is measured. Low transition temperature
Is similar to that measured by trypsin sensitivity.
It means an increase in temperature.
The collagen-dPEG conjugate shows a single denaturing transition at 56 ° C by DSC. This
This is similar to the typical melting point of the collagen-PEG conjugate prepared in Example 1A.
is there. By comparison, ZCI has a melting point of 45-53 ° C, exhibits multiple denaturing transitions, and G
AX has a melting point of 67-70 ° C and exhibits a single denaturing transition.
The extrusion test described in Example 2A is used to characterize collagen-dPEG conjugates.
I couldn't do that. Because this material can be extruded through a 30 gauge needle
I didn't come.
Using the intrusion test described in Example 2A, collagen-dPEG
Passage is completely blocked by the bed of silicon carbide, which means that the collagen molecules are
Being cross-linked,
And low or no intrusion.
Example 3
(Immunogenicity)
(A)Non-crosslinked PEG-collagen:
This experiment was carried out on the market with essentially the same raw materials and with similar hardness.
Relative of the collagen-mPEG preparation of the present invention to the marketed bovine collagen formulation
Was performed to demonstrate its immunogenicity. Atelopeptide collagen (this is a weak immune
Both collagen preparations have been prepared to increase the immune response.
Complete Freund's Adjuvant (CFA) or incomplete Freund's
Formulated with either adjuvant (IFA). This is a rigorous test
, Intended to be stronger than any possible immune response.
Collagen-mPEG was prepared as in Example 1A above. Male Hartley Guinea Pig
(11) anesthetized and punctured the heart for serological evaluation prior to immunization
Blood was taken. Emaru during the CFA
Five animals were treated by intramuscular injection in the left and right thigh. other
Five animals were used with collagen-PEG (35 mg / mL) emulsified in CFA
And treated in a similar manner. One animal was treated with collagen-PEG in IFA.
14 days after immunization, all animals were bled again by cardiac puncture
And serum was obtained for antibody titration measurements (using ELISA). Serological evaluation, day 30
Went again.
At day 30 after collection of serum samples, each animal received both ZCI and collagen-PEG.
Were intradermally administered (0.1 mL each, one on each flank). Cellular immunity measurements
As a result, delayed hypersensitivity (DTH) was quantified. 24, 48, and 72 hours after challenge
Later, using a micrometer caliper, measure the diameter of all papules and
DTH was assessed by recording the extent of erythema and induration. Then this animal
CO2Euthanize and cut the injected part for histological study.
Fixed with neutral buffered formalin.
Serological results indicate that collagen-PEG is less immunogenic than ZCI.
did. On day 14, 80% of ZCI-immunized animals had a "positive" antibody response (day 14
Titers> 160), while positive among animals immunized with collagen-PEG
Was 0%. All animals immunized with ZCI on day 30
Among the animals immunized with collagen-PEG (C-PEG), which showed high antibody titers,
None showed high titers. The data are shown in Table 1.
The response to DTH challenge is also less immunogenic with the collagen-mPEGs of the invention.
It was not. Guinea pigs immunized with ZCI and challenged with ZCI.
Showed papules measuring 1.128 ± 0.058 cm in diameter. Immunize with collagen-mPEG
0.768 ± 0.036 cm for animals that have been derivatized and challenged with collagen-mPEG
Showed a papule that was taken. Immunized with ZCI and challenged with collagen-mPEG.
Animals, or immunized with collagen-mPEG and challenged with ZCI
Animals are smaller than papules when immunized with ZCI and challenged with ZCI
I could only make a papule. The response measured at 48 and 72 hours at each site was 24
It was essentially the same as or less than the response over time. Erythema affects all animals
And they were essentially the same.
Histological studies show that both materials show similar intrusion.
Dermal and subcutaneous
It spread like a finger into the space. ZCI immunized animal intracutaneously challenged with ZCI
Position shows the most widespread inflammatory response, which is eosinophils and sometimes
Thus, it includes cell infiltration of the elements of lymphohistiocytosis with giant cells. Transplantation
Two of the parts showed erosive inflammation over the epidermis and eschar formation. At ZCI
In immunized animals, the site of intradermal challenge with collagen-mPEG was
The symptomatic infiltrates are only moderately aggregated and the acute cellular and lymphoid elements are significantly reduced
It was Histiospheres and giant cells are more prevalent and in some samples
In addition, the graft was thickly covered and colonized. Photoshop
Animals immunized with gen-mPEG showed only slight or moderate responses,
ZCI challenge site is less abundant, with few eosinophils and giant cells
It was accompanied by perivascular infiltration of lymphohistiocytosis. Collagen-mPEG antigen
The donor site typically contains lymphatic cells in the vicinity of the associated vasculature.
It was accompanied by negligible scatter of the cells.
(B)Cross-linked dPEG-collagen conjugate:
The collagen-dPEG conjugate was prepared as in Example 1D. Sample of rat
It was implanted as a dorsal epidermal and head onlay. Subcutaneously, 30 days after transplantation,
The NFC cartilage and NFC-FC cartilage material had a homogeneous microfibrous structure. NFC-FC cartilage
Around the sample there is a mild colonization of connective tissue cells.
It occurred and there was a small amount of encapsulation. Colonization does occur in NFC cartilage material.
None, and there was a small amount of encapsulation. FC cartilage has a sufficiently fibrous structure,
A small, but frequent, deep colony of connective tissue cells and a few adipocytes
Has happened. Trace amounts of encapsulation were present in a limited area of the FC cartilage sample. NF
C cartilage material tends to retain its pre-implanted shape, with sharply defined corners.
Was. On the other hand, the NFC-FC cartilage sample flattens over time and has a round ring.
There was a tendency to become Guo.
When implanted as an onlay of the head, the appearance of each material is similar to that under the epidermis.
However, through the formation of periosteum and the enveloping or loose connective tissue surrounding it,
Le tended to start being tethered to his skull.
All samples were clearly biocompatible and could not be colonized by host tissue.
Different degrees, and different mechanical properties.
Example 4
(In-situ bridge)
The dPEG solution was prepared as described in Example 1C above. Then the following sample
Was prepared:
(1) Put 5 mg dPEG in 80 μL water and mix with 0.5 mL fibrous collagen (35 mg / mL).
And the final dPEG concentration was 1% by volume;
(2) Add 15 mg dPEG to 80 μL water and add 0.5 mL fibrous collagen.
(35 mg / mL) to give a final dPEG concentration of 3% by volume;
(4) Add 5 mg dPEG to 80 μL water and add 0.5 mL non-fibrillar collagen (35 mg / mL)
Mixed to give a final dPEG concentration of 1% by volume;
(5) Add 15 mg dPEG to 80 μL water and add 0.5 mL non-fibrillar collagen (35 mg / mL)
Mixed to give a final dPEG concentration of 3% by volume;
(6) 5 mg dPEG was added to 0.5 mL PBS to give a final dPEG concentration of 1% by volume;
And
(7) GAX.
Samples 1, 2, 4, and 5 dPEG solutions were applied to luer lock parts and connectors.
Put it in a 1 mL syringe equipped with a cartridge and connect it with another syringe containing collagen material.
Continued. The solution is mixed by moving it back and forth between two syringes,
A reaction mixture was made.
Then disconnect the syringe connector, replace with a 27 gauge needle, and mix the reaction mixture.
About 50 μL of the compound was intradermally injected into 20 guinea pigs each. Samples 3 and 6
, And 7 were also administered through a 27 gauge needle. For up to 30 days from infusion
The treatment sites were harvested at intervals and studied histologically.
By 30 days, all materials were clearly biocompatible. Samples 1 and 2
Finger interdigitation with collagen fibers in the dermis is moderate and widely dispersed.
It was To connective tissue cells
Colonization with medium is moderate, and round cell infiltration with trace amounts of eosinophils
I was seen.
Samples 3, 4, and 5 are highly dispersed and dermal collagen fibrils
Fine interdigitating force with the bar. Colonization occurs from small to moderate,
And a trace level of cell wetting was seen.
Sample 6 had no detectable effect. Sample 7 is a medium colonization
And large islands with trace to low levels of inflammation were associated.
Example 5
(Coating of graft)
The collagen-dPEG reaction mixture was prepared as described in Example 1C above.
. After crosslinking was initiated, the titanium implant was immersed in the reaction mixture for about 20 minutes. Next
The graft was then terminated and dried overnight.
Example 6
(Collagen-polymer-growth factor conjugate)
(A) A conjugate containing cross-linked collagen-dPEG-TGF-β1 was prepared as follows.
Was prepared by:
TGF-β1 and125I-TGF-β1 (10Fivecpm; 25 μL of 1 mg / mL), CH2C12(100
μL) dPEG*(4 mg) solution and add this mixture for 12 minutes (Sample #
3) or 35 minutes (Sample # 5) at 17 ° C
I responded. Collagen solution (3 mg / mL atelopeptide non-fibrous collagen
) 2.5 mL was added and the resulting mixture was incubated overnight at room temperature. Formation
The pellets collected were collected by centrifugation to obtain collagen-dPEG-TGF-β1
.
(B) A composition based on fibrillar atelopeptide collagen was treated with TGF-β1 / dPEG.*of
The reaction time was limited to 2 minutes, and fibrous collagen was used instead of collagen solution.
Except that 7 mg (precipitated from collagen solution within 2 minutes before use) was used
Was prepared in the same manner as in the above section A.
(C) A composition containing collagen crosslinked with dPEG and free TGF-β1.
Prepared as below:
CH2Cl2DPEG in (100 μL)*(4 mg) solution to CIS (3 mg / mL atelopeptide
2.5 mL of non-fibrous collagen), and the resulting mixture is allowed to ink overnight at room temperature.
Was added. Wash the formed pellet to remove unreacted dPEG*Removed, and
25 μg of TGF-β was mixed with it to obtain collagen-dPEG + TGF-β1.
(D) The percentage of TGF-β1 bound was measured as follows:
In order to remove unbound TGF-β1, each prepared in the above A-C
The composition was vortexed vigorously and then centrifuged to remove the buffer (
Washed 6 times with 0.5 mL of 0.02 M phosphate buffer, 0.1% BSA). Pellet and supernatant
Collected and counted for each wash operation. The results show that TGF-β1 in a simple mixture was washed.
Approximately 40% of TGF-β1 is released in the composition of Section B, whereas it is quantitatively released within about 6 times of purification
Is retained, and the composition of section A
Can be represented as a graph showing that 50% is retained in the object.
(E) The biological activity of the material prepared above was assayed as follows:
Item A (CIS-dPEG-TGF-β1) (TGF-β1 / dPEG*Reaction time of 12 minutes) and term C (C
A composition prepared according to IS-dPEG + TGF-β1) was prepared, and further, TGF-β1 (CIS-
A control prepared according to Section C without dPEG) was prepared. These services
The samples were washed 8 times in PBS / BSA as described in Section D and then at 37 ° C.
Washed 3 more times with sera serum (Gibco). This wash protocol allows
Residual TGF-β1 content remained due to loss of visually detectable material125
It was measured by counting I. The TGF-β1 activity was then assayed by ELISA.
I made a essay. The results are shown in Table 2 below.
This data indicates that the TGF-β1 retained in the composition of the invention is in a substantially active form.
Indicates that the state is maintained.
Example 7
(Formulation)
(A) Formulation suitable for transplantation by injection, collagen-PEG 35 in sterile water for injection
Prepared by suspending at mg / mL. The properties of the resulting formulations were determined according to the above examples.
It describes in 2.
(B) A treatment useful for repairing a bone defect that withstands stress (eg, bone fracture, non-joint, etc.)
Paraffin is prepared by mixing the collagen-PEG of the present invention with a suitable particulate insoluble component.
Can be prepared by This insoluble component is composed of fibrous cross-linked collagen and gelatin beads.
, Polytetrafluoroethylene beads, silicone rubber beads, hydrogel
Beads, silicon carbide beads, mineral beads, or glass beads, preferred
Calcium minerals such as hydroxyapatite and / or phosphoric acid
It is tricalcium.
Gen) or collagen-mPEG (63mg / mL) and particulate hydroxyapatite and
Mixed with tricalcium phosphate (HA + TCP) and air dried to 65 wt% HA
Was prepared by forming a solid block containing If necessary,
Cooked by heating the cook at 75 ° C. for 10 hours. Try the obtained block
Water was absorbed with 0.13 M saline for 12 hours before the test (hy
drate).
Meanwhile, the PEG-collagen-HA + TCP (PC-HA) composition is in single phase.
It was observed that it was divided into
Each block was stretched 5% and after release its stress relaxation was monitored for 1 minute. This
After the test, each block was stretched at a constant rate of 1 cm / min until it broke.
The results are shown in Table 3:
All forces are listed in Newton. Elongation at break (tensile) is% elongation
Described in.
This data shows that collagen-polymer shows substantially greater tensile strength
It is shown to form a HA + TCP composition. In this way, use the same amount of unbound collagen.
The implant composition with collagen polymer is substantially stronger than
Can be made or reduce the amount of collagen-polymer used to achieve similar strength
The composition may be formed.
Example 8
(Crosslinking of hyaluronic acid and bifunctional SC-PEG)
Sodium hyaluronate (obtained from LifeCore Biomedical)
1 g was added to 15 ml PBS and allowed to dissolve overnight to form a homogeneous solution. This hyal
Dilute 5 ml of the Lonic Acid / PBS solution in 0.5 ml of PBS using syringe-syringe mixing
Mixed with 50 mg of sex SC-PEG.
The resulting material is extruded from a syringe into a Petri dish and incubated at 37 ° C for 16 hours.
I got it. The material was then allowed to cool at room temperature for 8 hours. 24 hours after this material
Formed a crosslinked gel.
Hyaluronic acid without S-PEG was used as a control in this experiment.
After the same incubation time, this control is still fluid and fluid.
It was.
Example 9
(Preparation of smooth collagen-polymer tube)
4.5 mm ID standard syrin containing Palo Alto, available from California)
The end of the needle was cut off. Using the plunger of this syringe,
The resin was extruded from a cut syringe into a solid cylinder. Collagen column
Place on a Petri dish and add a 10% solution of bifunctional S-PEG (bifunctional S-PE in 10 ml PES).
G 1.0 g).
The collagen casts were incubated at room temperature in a 10% S-PEG solution. Coller
A crosslinking reaction occurs as the PEG diffuses from the outside to the inside of the Gen cylinder. S-PEG soluble
Incubation in liquid
20 ~ 30 minutes after the injection, the outside of the collagen column is cross-linked and the inside is cross-linked.
It was still there.
After 20-30 minutes of incubation, remove the collagen cast from the crosslinker solution.
It was The inner, non-crosslinked collagen is crosslinked on the outside using hand pressure.
Hollow tubing of PEG-crosslinked collagen that can be easily squeezed out of the open shell.
Remains.
The hollow tube was then returned to the 10% S-PEG solution to complete the crosslinking process.
Incubate overnight at 37 ° C.
The outer diameter of the hollow PEG-collagen tubing is
It can be changed by changing the iz. The inner diameter of this tube is PEG
Shortening the length of time of the first incubation of collagen casts in liquid
Can be increased by. On the contrary, the inner diameter of the tube is
It can be reduced by increasing the operating time.
Example 10
(Pleated collagen-polymer
Tube preparation)
Smooth collagen-polymer tubes were prepared according to the method described in Example 9.
It was Zy this tube while it's still wet
I slipped it on the plunger of the syringe. tube
Fits exactly into the syringe plunger. Then PEG-collagen
Push the tube down along the axis of the plunger of the syringe to a wet tube,
Folds or ridges formed. As a result, the pleated tube is then
, About half the length of the original smooth tube.
PEG-collagen with folds, still on the syringe plunger
The tube was dried at room temperature under a fume hood. 24 hours later, dry
The pleated tube was pushed out of the syringe plunger. This
The tube should have a pleated shape even after it has been removed from the syringe plunger.
I was keeping.
The PEG-collagen tube with the folds was then placed on a Petri dish containing water.
I let you. The tube retained its pleated shape after reabsorption.
Example 11
(Has folds of small diameter
Preparation of collagen-polymer tube)
0.9 cc was mixed with 0.1 cc of a 5% solution of bifunctional S-PEG (5 mg S-PEG in PBS 0.1 CC)
. Immediately following mixing, the PEG-collagen material was treated with TF using an 18 gauge needle.
It was extruded into an E-tube (outer diameter 1.5 mm, inner diameter 1.3 mm). (Cylinder shape with small diameter
maintain
It was necessary to provide a starting material with greater structural integrity than
. )
After 20-30 minutes of incubation at room temperature, cut and open the tube, and PE
A solid cylinder of G-collagen was peeled from this tube. Then PEG-collage
The column was placed in a Petri dish containing 5 cc of a 10% solution of bifunctional S-PEG. PEG
The cross-linking reaction occurs so that it diffuses from the outside to the inside of the Lagen cylinder. Room temperature
Then, after incubating in the S-PEG solution for 3 hours, the inside of the cylinder was
It was extruded using a mandrel to obtain a hollow and smooth PEG-collagen tube.
Then push the PEG-collagen tube down along the axis of the mandrel and keep it wet.
The tube was pleated or ridged. As a result, tubes with pleats
Was then about half the length of the original smooth tube.
With the draped PEG-collagen tube still covered with the mandrel,
Dried under a fume hood at room temperature. After 24 hours, dry the tube with the folds.
I pushed it out of the mandrel. This tube, even after removing from the mandrel,
It retained its pleated shape.
Then place the PEG-collagen tube with the folds in a Petri dish containing water.
It was The tube retained its pleated shape after reabsorption.
PEG-collagen tubes of various diameters use TFE tubes of various sizes.
, And change the time for the cross-linking reaction to occur
Can be prepared by
Example 12
(Thin-Walled)
Tube preparation)
0.90 ml was mixed with a solution of 10 mg bifunctional S-PEG in 0.10 ml PBS.
TFE tubing with an inner diameter of 0.9 mm inside another TFE tubing with an inner diameter of 1.2 mm
I put it in. Apply the PEG-collagen mixture to the space between the inner and outer tubes.
Injected with a 27 gauge needle in between. The tube was then placed at 37 ° C for 2 hours.
I had a cube.
Pull out the outer tube, and inside with the PEG-collagen shell around
The side tubes were incubated for an additional 2 hours at 37 ° C.
Then carefully push the thin PEG-collagen shell from the inner TFE tube.
I took it off. The resulting PEG-collagen tube is transparent and has a cellophane-like hardness.
there were.
The PEG-collagen was then placed in water to reabsorb water. This tube is very
It was thin and had a small diameter, but use this tube to inject water
I was able to.
The wall thickness of this tube and the inner diameter of the collagen-polymer tube are
Lagen-for molding polymeric materials
Change by changing the size of the inner and outer TFE tubes
Can be obtained. A tube with a thin tube wall produced by the above method is
It may be particularly suitable for use as a nerve guide tube to promote regeneration.
Example 13
(Preparation of PEG-collagen filamentous material)
(35 mg / ml) 5 ml bifunctional SG-PEG 50 in 0.5 ml phosphate buffered saline (PBS)
mixed with mg. Immediately use this material with a diameter of 1.5 mm
Incubated at 37 ° C for 16 hours. Remove the crosslinked collagen gel from the tube.
It ran out and dried overnight. During the drying, the filaments are stretched tightly, and the filaments are in the axial dimension.
And ensured to dry in a radial dimension.
Therefore, non-crosslinked collagen filaments were produced as a control. the above
Two different diameter filaments were produced using the method of.
Determine the diameter, length, and weight of filaments in the fresh (wet), dehydrated,
And the state of re-absorption of water. The results of these measurements are shown in the graph in Figure 1.
And the table shown in FIG.
Since non-crosslinked filaments do not contain hydrophilic PEG,
The water cannot be retained and cannot be reabsorbed. Therefore, the saw with re-absorbed water
No measurements of these filaments were obtained. These filaments are reabsorbed,
It maintains all of its original length and maintains almost all of its original diameter and weight.
I was there.
Various viscoelastic measurements were performed on crosslinked filaments and crosslinked filaments in the dehydrated state.
It carried out about the thread-like thing which is not. Prior to viscoelastic evaluation all filaments should be kept at 20 mm
Cut to length. The results are shown in the table shown in FIG. A stick that shows the expandability of filamentous material
The rough is shown in FIG. Several viscoelastic measurements for each of the four thread types
Bar graphs with constant, standard deviation error bars are shown in FIGS.
Tensile stress (N / mm2) Is the force at the breakage of the filamentous material as a function of the cross-sectional area.
It is the value measured by Strain (Δ length / length) and Δ length are
It is a measured value (how much it expands under tension). Young's modulus (N / mm2) Is the stress
It is calculated by dividing by the strain. This is the viscoelastic "fingerprint of a particular material.
Known as.
The bar graphs in Figures 2-5 show the viscoelasticity obtained for uncrosslinked filaments.
Exemplifies the large standard deviations and variations of
Indicates heterogeneous. The uniform results obtained with PEG-crosslinked filaments are:
PEG cross-linking provides homogeneity and greater mechanical strength and elasticity to collagen.
Indicates that the material is given to the material.
Example 14
(Preparation of coiled filamentous material)
Collagen in bifunctional S-PEG 1% solution in TFE tube by 18 gauge needle
As described in Example 13 by injecting (outer diameter 0.9 mm, inner diameter 0.6 mm) into
In addition, small diameter cross-linked collagen filaments were produced.
After removing from the tube, the wet filaments are put into a second TFE tube with an outer diameter of 1.5 mm.
It was coiled around the tube. Coil the filaments to room temperature under a fume hood
And dried on the tube for 2 days.
The dehydrated PEG-collagen coil was pushed out of the tube. Dry
The coiled filament was pulled straight by hand. Straight thread at this time
When it was immersed in water, it quickly returned to its coiled shape by reabsorbing water.
Remove the coiled, moist filaments from the water bath, pull, and strain under tension.
Immediately dried. Soaking the dried filaments in a straight state again in water
By re-absorption, it returned to its original coiled shape.
Pull the collagen-polymer coil straight up to remove it with a needle or catheter.
Delivery can be facilitated. These coils have the ability to re-absorb water into the shape of the coil.
It is particularly useful in the treatment of aneurysms because of its force and its ability to expand to fill the hollow.
is there.
The above example illustrates the "memory" of collagen-polymer material. Water absorption
This causes the material to return to its original shape when first dried.
Example 15
(Viscoelastic properties of PEG-collagen material)
A 10% solution of activated bifunctional SG-PEG in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS)
Prepared by diluting 0 mg powder bifunctional SG-PEG (3400 Dalton MW)
It was 10% bifunctional SG-PEG soluble
The final PEG concentration was 1%. Collagen and crosslinker solution in a 10 ml syringe
And mixed using a syringe-syringe mix.
The method was used to crosslink with bifunctional SG-PEG.
Inject the syringe containing the complex of Z-I-PEG and Z-II-PEG for 16 hours at 37 ° C.
Bate and formed a polymerized gel.
Cut off the end of each needle on the two syringes and remove the gel from each sheath.
It was extruded from within the barrel of a syringe using a RINGE plunger. Then a stiff gel
Was sliced into a disc having a thickness of 2 mm, dehydrated, and then reabsorbed. Disk diameter, thickness
And weight, fresh (wet), dehydrated, and reabsorbed
It was measured at. The results of these measurements are shown in the table shown in FIG.
Cross-linked collagen discs (at both collagen concentrations) were rehydrated.
That's why it was almost restored to its original size.
Example 16
(Platinum wire coating)
Collagen Corporation, available from Palo Alto, CA).
Diluted to 32.5 mg / ml with acid buffered saline (PBS). Activated bifunctional S-PE
A 10% solution of G was prepared by diluting the powdered bifunctional S-PEG in sterile filtered PBS.
Prepared. Add 100 μl of S-PEG to 900 μl of collagen to give a final S-PEG concentration of 1%
And Place the S-PEG solution and collagen in a 3 ml syringe, and
Mixed using fringe mixing.
0.25 mm diameter on the mandrel (inner wire to keep the coil straight)
Coiled platinum wire (from # 1, Target Therapeutics, Santa Clara, CA
(Available), inside the ultramicropipette tip (0.5-10 μl), 1 tip
One coil was loaded for each. As a result, the mandrel has a narrow opening of the pipette tip.
It passed through both the mouth and wide opening. S-PEG-collagen mixture in syringe
Was injected into each pipette using a 22 gauge needle.
Place the coiled pipette in a Petri dish and incubate at 37 ° C for 24 hours.
I got it. Place the coil-loaded tip in a laminar hood (laminar f
low hood). Next
The coated coil was then removed from the pipette tip.
If the drying time is not adequate, the coating will not adhere well to the coil.
Therapeutics) or other similar type of catheter.
Example 17
(Platinum wire coating)
Dilute to 32.5 mg / ml with PBS passed over. 10% solution of activated bifunctional S-PEG
, Prepared by diluting powdered bifunctional S-PEG in sterile filtered PBS. S-
100 μl of PEG solution was added to 900 μl of collagen to give a final S-PEG concentration of 1%. S-PE
Place the G solution and collagen in a 3 ml syringe, and mix the syringe-syringe.
Used and mixed.
1mm diameter Teflon coiled platinum wire on the mandrel
The mixture was injected into the tube over the coil using a 22 gauge needle. Plug
Insert it into the end of the tube, then place the tube on a shelf and
Hold the end of the ile straight. Place this shelf in a 37 ° C incubator for 16 hours.
placed.
After removing the tube from the incubator,
The side was cut with a scalpel and peeled from the coil. Air the coated coil for several hours at room temperature.
It was dried and then removed from the mandrel.
The coated coil can be delivered by a catheter.
The present invention is believed to be the most practical and preferred embodiment.
Shown and described herein. But the deviation from these is the book
Modifications that may be made within the scope of the invention, and obvious changes are made by reading this disclosure.
It is understood that this can be done by a person.
Example 18
(Preparation of telopeptide-containing collagen-polymer conjugate)
Bifunctional active collagen containing telopeptide and atelopeptide collagen
Cross-linking was carried out using activated SG-PEG (MW = 3400 Dalton). Physical properties of the obtained material
Were compared.Preparation of telopeptide-containing collagen cross-linked with PEG
900 ml of cowhide slurry (sampled just before pepsin digestion),
Stabilized to 17 ° C in a water bath for 1 hour. 100 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 11.4),
It was added to the skin slurry with rapid stirring. Incubate this material at 17 ° C for 16 hours.
After centrifugation, centrifuge to produce 91g of telopeptide-containing collagen pellets
did. The protein concentration of the pellet was determined to be 40 mg / ml using the Biuret method.
It was
Acidify a 3 ml sample of the pellet by adding 0.5 ml of 0.1 M hydrochloric acid (HCl)
did. The resulting material is extremely opaque and acidic (pH 4-5) and
It was a shape. Place 0.5 ml of acidified collagen containing telepeptide in the mold and
0.25 ml of bifunctional activated SG-PEG solution with a concentration of 35.7% (wt% / vol%) was added.
The mold containing collagen and crosslinker solution was incubated overnight at 37 ° C.
Crosslinking occurred as the PEG solution diffused into the collagen gel. Firmly
5 small pieces of collagen gel containing cross-linked telopeptide (30mm x 10mm x thickness 2mm
)was gotten.Preparation of PEG-crosslinked atelopeptide collagen
, available from Palo Alto, CA) using phosphate buffered saline (PBS)
Diluted to a concentration of 40 mg / ml. The obtained 40 mg / ml atelopeptide collagen 3 m
acidify and cross-link with bifunctional activated SG-PEG by the method described above.
It was Five small pieces (30 mm) of tightly crosslinked atelopeptide-containing collagen gel
X 10 mm x thickness 2 mm) was obtained.Fibril formation
Add 3 ml of telopeptide-containing collagen pellets and 3 ml of Zyderm11 collagen.
Acidification was carried out as described above. 0.5ml each of two types of acidified collagen material in the mold
I put it in. Acidified
A type containing telopeptide-containing collagen and atelopeptide collagen,
Incubated overnight at 37 ° C.
Collars containing moderately cross-linked telopeptides after overnight incubation at 37 ° C
Gengel was obtained. Atelopeptide collagen is made of any crosslinked gel
I didn't build it.Differential scanning calorimetry (DSC)
The melting temperature of the material is measured using differential scanning calorimetry (DSC). Cross-linked
Collagen containing telopeptides and Collar containing telopeptides cross-linked with PEG
The results of DSC measurement for Gen are shown in Table 4 below and FIGS. 6 and 7.
Table 4. DSC measurement Material Peak Tm (℃)
Atelopeptide collagen double line 45,55
Telopeptide-containing collagen double line 52,57
Crosslinked atelopeptide collagen singlet 59
(sharp)
Cross-linked telopeptide-containing collagen broad 66
The uncrosslinked atelopeptide collagen has two temperature transition peaks (first
About 46 ° C and the second about 54 ° C). Photoshop containing telopeptides that are not cross-linked
Also has two temperature transition peaks (the first occurring at 49 ° C and the second at 57 ° C).
Occurred in ° C). The peak for telopeptide-containing collagen is
Broader than the peak for lopeptide collagen. Because telope
This is because the peptide containing collagen contains inherent crosslinks. This cross-link is enzymatically treated
Present in the purified atelopeptide collagen that was removed during
Yes.
Transition temperature when cross-linking atelopeptide collagen with bifunctional activated S-PEG
Rises to about 58 ° C and appears as a singlet peak. Photoshop containing telopeptide
When cross-linking the collagen with bifunctional activated S-PEG, the transition temperature rises to about 66 ° C,
And it consists of a singlet transition peak. This peak is attributed to PEG-crosslinked
It is somewhat broader than the equivalent transition peak for tide collagen. Cross-linked
Broad peaks obtained for telopeptide-containing collagen were cross-linked
Atelopeptide collagen (which is more homogeneous as a result of enzymatic treatment and purification
Due to the increased heterogeneity as a result of the inherent cross-linking
it is conceivable that.Viscoelastic properties
Collagen containing uncrosslinked and crosslinked telopeptides
And atelopeptide collagen, tensile strength (N), tensile stress (N / mm2), Hi
Depth (ΔL / L) and Young's modulus (N / mm2) Was tested. Viscoelastic test results
The results are shown in the table shown in FIG.
Tensile stress (N / mm2) Is the force at material failure (fracture) as a function of cross-sectional area
It is the measured value. Strain (Δlength / length) is a measure of the elasticity of a material (tension
How much it stretches under force). Young's modulus (N / mm2) Is the stress divided by the strain
Calculated by and. This is known as the viscoelastic "fingerprint" of certain materials
ing.
As shown by the data in the table of FIG. 17, the crosslinked telopeptide containing
Collagen with collagen is significantly stronger than the crosslinked atelopeptide material.Expandability
Uncrosslinked and PEG crosslinked telopeptide-containing collagen and
Lopeptide collagen was tested for swelling capacity. The data are presented in Table 5.
Uncrosslinked atelopeptide collagen is not a gel, so it was dipped in water
Sometimes this uncrosslinked atelopeptide collagen breaks apart. Follow
Therefore, it is not possible to obtain the value of the weight of water reabsorbed.
As shown by the data, PEG-crosslinked telopeptide-containing collagen
Shows better re-water absorption properties than cross-linked atelopeptide collagen and after re-water absorption
It has recovered to 100% of its original wet weight.
The present invention is believed to be the most practical and preferred embodiment.
Shown and described herein. But the deviation from these is the book
Modifications that may be made within the scope of the invention, and obvious changes are made by reading this disclosure.
It is understood that this can be done by a person.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 38/22
Ｃ０８Ｇ 65/32 ＮＱＪ 9272−4Ｊ
81/00 ＮＵＳ 8416−4Ｊ
Ｃ０８Ｈ 1/00 ＮＶＤ 8215−4Ｊ
9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/66 Ｈ
(31)優先権主張番号 ０７／９８４，９３３
(32)優先日 1992年12月２日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０７／９８４，１９７
(32)優先日 1992年12月２日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０７／９８５，６８０
(32)優先日 1992年12月２日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／０２５，０３２
(32)優先日 1993年３月２日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＪＰ
(72)発明者 マイケルズ，アラン エス.
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
02167，チェスナット ヒル，アパートメ
ント ３エイ，アランデール ロード
210
(72)発明者 バーンズ，レイモン エイ．，ジュニア
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94539,
フレモント，ベケイド プレイス 563
(72)発明者 フリース，ルイス
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94024,
ロス アルトス，クレイ ドライブ 1684
(72)発明者 デラストロ，フランク
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002,
ベルモント，デコーベン アベニュー
2517
(72)発明者 ベンツ，ハンネ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94560,
ニューアーク，トゥールーズ ストリート
36125
(72)発明者 マッカルラフ，キンバリー
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94544,
ヘイワード，ナンバー124，クリアブルッ
ク サークル 29858
(72)発明者 ダマニ，ラメシュ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94041,
マウンテン ビュー，ナンバー223，ビラ
ストリート 1600
(72)発明者 バーグ，リチャード エイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94024,
ロス アルトス，サウス スプリンガー
ロード 660─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 38/22 C08G 65/32 NQJ 9272-4J 81/00 NUS 8416-4J C08H 1/00 NVD 8215-4J 9455 -4C A61K 37/66 H (31) Priority claim number 07 / 984,933 (32) Priority date December 2, 1992 (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 07 / 984,197 (32) Priority date December 2, 1992 (33) Priority claiming country United States (US) (31) Priority claim number 07 / 985,680 (32) Priority date December 2, 1992 (33 ) Priority claiming country United States (US) (31) Priority claiming number 08 / 025,032 (32) Priority date March 2, 1993 (33) Priority claiming country United States (US) (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, DE, DK, S, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), AU, JP (72) Inventor Michaels, Alan Es. USA Massachusetts 02167, Chestnut Hill, Apartment 3A. , Alandale Road 210 (72) Inventor Barnes, Raymond A .. , Junior USA California 94539, Fremont, Vecade Place 563 (72) Inventor Fleece, Lewis United States California 94024, Los Altos, Clay Drive 1684 (72) Inventor Destro, Frank United States California 94002, Belmont, Decoven Avenue 2517 (72) Invention Benz, Hanne USA California 94560, Newark, Toulouse Street 36125 (72) Inventor McCarraf, Kimberley United States California 94544, Hayward, No. 124, Clearbrook Circle 29858 (72) Inventor Damani, Ramesh United States California 94041, Mountain View , Number 223, Vila Street 1600 (72) Inventor Berg, Richard A. United States California 94024, Los Altos, South Springer Road 660