JPH08502044A

JPH08502044A - Treatment of human viral infections

Info

Publication number: JPH08502044A
Application number: JP6506587A
Authority: JP
Inventors: パーディー，アーサー・ビー; リー，ジア−キヤン; クラムパツカー，クライド; ツアン，リン
Original assignee: デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート; ベス・イスラエル・ホスピタル
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 1993-08-23
Publication date: 1996-03-05
Also published as: EP0655919A4; WO1994004160A1; CA2142831A1; EP0655919A1

Abstract

(57)【要約】免疫不全症を誘発することが可能なウイルスを有するか又はこれに感染した細胞又はヒトを、式（Ｉ）：（式中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は水素、置換及び非置換アルキル、非環状ヘテロアルキル並びに置換及び非置換アルケニルからなる群から各々独立して選択され、但しＲ、Ｒ₁及びＲ₂の置換基の少なくとも２個は水素以外のものである）の化合物により治療する治療法。 (57) [Summary] Cells or humans having or infected with a virus capable of inducing an immunodeficiency are treated with a compound of formula (I) (Wherein R, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R ₁ and R ₂ At least two of the substituents are other than hydrogen).

Description

【発明の詳細な説明】ヒトウイルス感染の治療発明の背景１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、別称ＨＴＬＶ−ＩＩＩ，ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ）及び、その程度はもっと低いが２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連疾患の原因物質である。Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０：８６８−８７１（１９８３）；Ｇａｌｌｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５００−５０３（１９８４）；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５：８４０−８４２（１９８４）；Ｐｏｐｏｖｉｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：４９７−５００（１９８４）；Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：５０６ −５０８（１９８４）；Ｓｉｅｇａｌら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：１４３９−１４４４（１９８１）；Ｃｌａｖｅｌ，Ｆ．，ＡＩＤＳ，１：１３５−１４０。この疾患は、長期間の無症候とそれに続く免疫系及び中枢神経系の進行性変性により特徴付けられる。ウイルスの研究によると、複製は高度に制御され、Ｔリンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセットの潜伏感染及び溶菌感染の両者が組織培養物中で生じることが示されている。Ｚａｇｕｒｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：８５０−８５３（１９８６）。感染性ウイルスの力価は全疾患期間にわたって低いままであるので、感染患者におけるウイルスの発現も制御されると思われる。ＨＩＶ−１及び２は、ｅｎｖ、ｇａｇ及びｐｏｌのような構造遺伝子以外にｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆのような調節遺伝子を有する類似の構造及び機能ゲノム構成を有する。ＡＩＤＳ自体は必ずしも死を誘発しないが、多くの個体で免疫系が著しく抑制されるため、特にヘルペス、サイトメガロウイルス、カポジ肉腫及びエプスタイン−バールウイルス関連リンパ腫のような種々の他の疾患（二次感染又は異常腫瘍）を発症し、ついには死に至る。これらの二次感染は他の投薬法を使用して治療することができる。しかしながら、このような治療は弱った免疫系に悪影響を与える恐れがある。ＡＩＤＳウイルスに感染しながら症状がほとんど又は全く現れずに何年も生存するヒトもいると思われるが、感染は持続すると思われる。また、別のヒトグループでは軽度の免疫系低下と体重減少、倦怠感、発熱及びリンパ節膨張のような種々の症状を併発する。これらの症候群は持続性全身型リンパ節障害症候群（ＰＧＬ）及びＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）と呼称され、ＡＩＤＳを発症する場合としない場合がある。いずれの場合も、ＨＩＶ感染患者は他者に対して持続的に感染性であると考えられる。無症候期間からの潜伏ＨＩＶプロウイルスの活性化は、ウイルスＤＮＡにおける長い末端反復配列（ＬＴＲ）により支配されることが報告されている。Ｒａｎｋｉ，Ａら，Ｌａｎｃｅｔｉｉ：５８９−５９３（１９８７）；Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：６１７−６２２（１９８８）；Ｚａｇｕｒｙ，Ｄ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１：８５０−８５３（１９８５）；Ｍｏｓｃａ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３２５：６７−７０（１９８７）。ＨＩＶ−１の活性はＬＴＲ内の特定配列に結合する陽性及び陰性転写調節因子の複雑な相互作用により決定される。Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，ら，Ｃｅｌｌ，５８：４２３−４２６（１９８９）。これらの因子の量及び品質が変化すると、多数の刺激によりＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２潜伏プロウイルスの転写の活性化を誘発し得る。Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：６１７−６２２（１９８８），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３３９：７０−７３（１９８９）；Ｎａｂｅｌ，Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１２９９−１３０２（１９８８）。具体的には、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は強力な活性化物質であると考えられる。特に、ＴＮＦαはＨＩＶ感染個体中に非常に高濃度で存在するので、サイトカインはＡＩＤＳの病因に重要な役割を果たすと予想される。Ｌａｈｄｅｖｉｒｔａ，Ｊ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８５：２８９−２９１（１９８８）。ＨＩＶ感染個体を治療するためのほとんどの公知方法は、宿主細胞の染色体へのウイルスの組込みの阻止又はプロウイルス以外の段階に集中していた。例えば関心分野の１つは逆転写酵素に作用する薬剤であった。しかしながら、提案された治療方法の多くは臨床的に有効であることが立証されなかった。実際に、ＡＺＴ（ジドブジン）のように臨床効用を生じた治療でさえも長年の治療後に多数の患者で免疫系の低下を阻止したとは報告されていない。組込まれたプロウイルスの発現とＨＩＶ−１の慢性感染のいずれをも抑制する方法はほとんど報告されていない。逆転写酵素阻害剤（例えばＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄｄＩ）は慢性感染に抑制効果を及ぼすことが報告されていない。Ｒｏ３−３３３５は慢性感染に有効であることが報告された。Ｈｓｕ，Ｍ−Ｃ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１７９９−１８００（１９９２）。従って、ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶのプロウイルスの発現を抑制すると共に、慢性感染を抑制することが可能な新規化合物を入手できることが望ましい。プロウイルスの発現を抑制することにより既に感染した細胞を治療するために使用可能な新規治療法又は感染細胞内でプロウイルスを休眠状態に維持する手段を入手できることが特に望ましい。発明の要約本発明者らは、下式Ｉ：（式中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は水素、置換及び非置換アルキル、非環状ヘテロアルキル並びに置換及び非置換アルケニルからなる群から各々独立して選択され、但しＲ、Ｒ₁及びＲ₂の置換基の少なくとも２個は水素以外のものである）の化合物が例えばＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１のような免疫不全プロウイルスの発現を抑制し、従ってＨＩＶのような免疫不全ウイルスに急性もしくは慢性感染した細胞を治療するために有用であることを知見した。これらの化合物は少なくとも１つのキラル中心を有する。本発明は前記化合物の立体異性体のラセミ混合物の使用を包含する。好ましくは、化合物は光学的に強化され、即ち特定のエナンチオマー（又はジアステレオマー）が他の立体異性体よりも実質的に強化されている。光学的に活性な立体異性体の生物活性は、本明細書に開示するように実験的に決定することができる。一般には、４位炭素が（Ｒ）配置を有する化合物がより好ましい。式Ｉの好適化合物としては、Ｒがアルキルであり、Ｒ₁がヒドロキシルであり、及び／又はＲ₂がヘテロアルキルである化合物を挙げることができる。特に好適な化合物としては、Ｒが水素であり、Ｒ₁がヒドロキシルであり、Ｒ₂がヘテロアルキル、特にアルキレンアミノ（モノアルキル又はジアルキル（アルキレン）アミノを含む）である化合物を挙げることができる。特に好適な化合物としては、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ即ちＲが水素であり、Ｒ₁が９−ヒドロキシルであり、Ｒ₂が１０−Ｎ−Ｎ−ジメチル（メチレン）アミノ（即ち（ＣＨ₃）₂ＮＣＨ₂−）である式Ｉの化合物、及びＲがエチルであり、Ｒ₁が水素であり、Ｒ₂が９−ヒドロキシルである式Ｉの化合物を挙げることができ、ここで前記９−及び１０−なる数字は上記式Ｉ中に示した環員の位置を表す。式Ｉの化合物は、ＨＩＶＬＴＲのような免疫不全ウイルスのＬＴＲの活性を抑制し、ＨＩＶＬＴＲに作動的に連結した遺伝子の発現を低下又は抑制することができる。１態様によると、式Ｉの化合物は免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ、好ましくはＨＩＶ−１に感染した細胞を治療することが可能であり、従って、ＨＩＶに感染したヒトを治療するために使用することができる。例えば、ＡＩＤＳと診断されたヒトや、ＡＲＣ、ＰＧＬに罹病したヒト及びこのような症状がまだ現れていないヒトの治療に用いることができる。これらの化合物は、ＨＩＶに感染したヒトを治療するために使用されている慣用薬剤、例えばジドブジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）及び２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）のような逆転写酵素阻害剤とは異なるターゲットに対して使用することができる。このような薬剤を本発明の化合物と併用すると相乗効果が生じると予想される。また、本発明の化合物はこのような化合物に対して耐性の細胞において有効であると考えられる。例えば、本発明の化合物はＡＺＴ耐性細胞系においてＨＩＶ−１ＬＴＲに誘発される発現を阻止するために使用することができる。本発明は更に、式Ｉの化合物と該化合物に適切なキャリヤーとを含有する、上記症状で使用するための医薬組成物を提供する。図面の簡単な説明図１はサイトカインにより刺激されたＨＩＶＬＴにより誘発される遺伝子発現の、（種々の濃度の）Ｔｏｐｏｔｅｃａｎによる抑制を示す。図２は細胞生存率に及ぼすＴｏｐｏｔｅｃａｎの効果を示す。図３は活性化ＨＩＶＬＴＲに及ぼすＴｏｐｏｔｅｃａｎの抑制効果を示す。図４は急性感染ヒト末梢血単核細胞における（種々の濃度の）ＴｏｐｏｔｅｃａｎによるＨＩＶ−１複製の抑制を示す。図５は急性感染ヒト末梢血単核細胞における逆転写酵素のｍＲＮＡ濃度により決定した、ＴｏｐｏｔｅｃａｎによるＨＩＶ−１複製の抑制を示す。図６は慢性感染ヒトＴ細胞における（種々の濃度の）ＴｏｐｏｔｅｃａｎによるＨＩＶ−１発現の抑制を示す。図７はＨＩＶＬＴＲにより誘発されるｍＲＮＡ及び細胞βアクチンｍＲＮＡの蓄積に及ぼすＴｏｐｏｔｅｃａｎの選択的効果を示す。図８はＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発されるｍＲＮＡの蓄積に及ぼす（種々の濃度の）Ｔｏｐｏｔｅｃａｎによる用量依存抑制を示す。図９は細胞の全ＲＮＡ合成に及ぼす（種々の濃度の）Ｔｏｐｏｔｅｃａｎの効果を示す。発明の詳細な説明本発明者らは、免疫不全プロウイルスの発現を抑制するため、例えばＨＩＶのような免疫不全ウイルスに感染した細胞を治療するために、下式Ｉ（式中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は水素、置換及び非置換アルキル、非環状ヘテロアルキル並びに置換及び非置換アルケニルからなる群から各々独立して選択され、但しＲ、Ｒ₁及びＲ₂の置換基の少なくとも２個は水素以外のものである）の化合物を使用することができ、従ってＨＩＶ感染個体の治療に使用できることを知見した。アルキル基は好ましくは１〜約１２個、より好ましくは約１〜６個の炭素原子を有する。本明細書中で使用するアルキルなる用語は特に指定しない限り、環状及び非環状基の両方を表すが、当然のことながら環状基は少なくとも３個の炭素環員を含む。直鎖又は分枝鎖非環状基のほうが環状基よりも一般に好ましい。更に直鎖基のほうが好ましい。アルケニル置換基は好ましくは２〜約１２個、より好ましくは２〜約６個の炭素原子を有する。ヘテロアルキル基は、１個以上のヘテロ原子を含む非環状基を含み、各ヘテロ原子は１個以上のアルキル結合（例えば炭素原子数１〜８又は１〜４のアルキル結合）を有する。従って、適切なヘテロアルキル基は、ヘテロ原子が式Ｉの一般環系に直接結合した基、及びヘテロ原子が例えば炭素原子数１〜４のアルキレン結合を介して環系に結合された基を含む。特に好適なヘテロアルキル基としては、第１、第２及び第３アルキルアミンを含むアミノアルキル基が挙げられ、特に好適な基はＮ−Ｎ−ジアルキル（アルキレン）アミノ基、例えば式（アルキル）₂Ｎ（ＣＨ₂）_n（式中、ｎは１〜４の整数である）の基である。特に好適な基はＮ−Ｎ−ジメチルメチレンアミノである。「非環状」ヘテロアルキルなる用語は、直鎖及び分枝鎖部分を含むものであり、閉環構造を含む基（上記式Ｉ中に示したような７〜１０位に２個以上の芳香族炭素を含む環を形成する基を含む）を意味しない。前記置換基Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は例えばハロゲン（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）、アルキル（例えば炭素原子数１〜１２、又は１〜６のアルキル）、アルケニル（例えば炭素原子数２〜１０、又は２〜６のアルケニル）、炭素原子数６〜１０のアリール、Ｎ、Ｏ、Ｓを含むヘテロアルキル（例えば前記ヘテロ原子の１個以上と１〜１０個又は１〜６個の炭素原子とを有するヘテロアルキルアルキル）のような１個以上の適切な基により１個以上の使用可能な位置を置換され得る。本発明は式Ｉの化合物のラセミ混合物及び光学的に活性な立体異性体の両者の使用を包含する。式Ｉの光学的に活性な立体異性体が好適である。一般には、ラクトン部分のキラル炭素（即ち上記４位の環炭素）がＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ− Ｐｒｅｌｏｇ命名法による（Ｒ）配置を有する光学活性化合物が更に好適である。Ｃａｒｅｙ，Ｆ．Ａ．，ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＰａｒｔＡ，ｐ６５−６６（第２版，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ１９８４）。式Ｉの化合物は、例えばＨＩＶＬＴＲにより誘発される遺伝子発現の低下、好ましくは完全な抑制により立証される通り、慢性感染細胞（即ちＦＩＶ、ＳＩＶ、ＨＩＶ等のような免疫不全ウイルスであるウイルスに感染した細胞）の有効な治療法を提供すると考えられる。即ち、ＨＩＶ感染細胞に有効量の式Ｉの化合物を加えると、ＨＩＶＬＴＲに作動的に連結した遺伝子の発現が低下する。好ましくは、遺伝子はＨＩＶ−１ＬＴＲに作動的に連結している。本明細書中で使用する作動的に連結なる用語は、遺伝子がＨＩＶＬＴＲの制御下にあり、このためのヌクレオチド配列で配置されていることを意味する。典型的には、遺伝子はプロモーターとして機能するＬＴＲの下流に位置する。好ましくは、遺伝子はＨＩＶｅｎｖ遺伝子、ＨＩＶｔａｔ遺伝子、ＨＩＶｒｅｖ遺伝子等のようなウイルス遺伝子に対応する。従って、１好適態様によると本発明は血清陽性であるが無症候の患者を治療するのに使用することができる。例えば予防薬としては、危険の高い個体に予防薬として予防的に使用することができる。有効量の式Ｉの化合物を投与することからなるこの保護方法は下記のように実施される。式Ｉの化合物は、ＨＩＶ感染細胞のように免疫不全ウイルスに感染した細胞、特に哺乳動物細胞、特にヒト細胞を治療するために使用することができる。式Ｉの化合物で治療した結果としてウイルス発現は著しく低下する。例えば、ＨＩＶのウイルス発現はプロモーターとして機能するＨＩＶＬＴＲに作動的に連結した例えばＣＡＴ、ＬａｃＺ等のようなマーカー遺伝子の発現を調べるなどの多数の方法により試験することができる。Ｔｏｐｏｔｅｃａｎのような本発明の化合物を使用すると、このようなマーカーの発現を著しく低下させることができる。ＨＩＶ−１ウイルス発現は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）又はホルボール− １２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）のようなＨＩＶＬＴＲスティミュレーターにより開始及び強化される。この発現の１つの産物即ちｔａｔはＨＩＶ−１遺伝子発現を更に増加させることができる。ＨＩＶ感染細胞でＨＩＶＬＴＲに作動的に連結したＬａｃＺのようなマーカー遺伝子を使用する場合に有効量の式Ｉの化合物を添加すると、ｌａｃＺ遺伝子の発現は著しく抑制され、従って、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質発現のようなＨＩＶＬＴＲの制御下のＨＩＶ発現は完全には停止しないとしても抑制されたと考えられる。主要構造タンパク質（ｇａｇの産物）であるＰ²⁴は、細胞におけるＨＩＶ−１複製及び個体におけるウイルス血症を監視するために広く使用されている。細胞にさほど悪影響を与えない濃度でＴｏｐｏｔｅｃａｎのような本発明の化合物を使用すると、Ｐ²⁴濃度により決定されるようなＨＩＶ−１複製を劇的に低下させることができ、好ましくはＰ²⁴濃度により決定した場合に＞２５％の低下、より好ましくは＞５０％の低下、更に好ましくはＰ²⁴濃度により決定した場合に＞８０％のＨＩＶ−１複製の低下が得られる。このような結果を得るために有効な使用量はマイクロモル、更にはナノモル濃度である。更に、例えばＨＩＶ発現を抑制する有効濃度で本発明の化合物を投与すると、細胞に悪影響を与えない。本発明の化合物は、ＨＩＶに感染した個体又はＨＩＶ感染の危険が高い個体に投与することができる。例えば、ＨＩＶ感染パートナーと性的関係のある者、静脈内薬物使用者等に投与できる。その抑制効果により、本発明のウイルスはこのような個体に危険を最小限にするために予防的に使用することができる。式Ｉの化合物は容易に製造又は入手できる。一般論としては米国特許第５，００４，７５８号を参照されたい。式Ｉの他の化合物は合成分野の当業者に周知の方法により製造することができる。後記実施例に示すように、式Ｉの化合物はＨＩＶ−１ＬＴＲの活性化を阻止するか又はその活性を抑制し、こうして慢性及び急性感染細胞の両者においてその制御下の遺伝子の発現を抑制する。特に、式（Ｉ）の化合物はＨＩＶＬＴＲにより誘発されるＴＮＦα及びＰＭＡ刺激遺伝子発現を用量依存的に抑制することが知見された。更に、このような抑制は細胞生存率又は細胞ｍＲＮＡもしくは全細胞ＲＮＡ合成に実質的に悪影響を与えない。従って、式Ｉの化合物は細胞及びヒトにおけるＨＩＶ感染及び他のレトロウイルス感染の進行を抑制するのに有用であり、例えばヒトにおけるＨＩＶ感染の潜伏期間を延長するのに有用であると考えられる。理論に拘束する意図はないが、式Ｉの化合物は非細胞毒性であるため、宿主細胞よりもレトロウイルスに密接な関係のあるＨＩＶＬＴＲ、好ましくはＨＩＶ −１ＬＴＲの陽性又は陰性調節剤に作用すると考えられる。一般に免疫不全感染、例えばＨＩＶ感染に適切な式Ｉの１種以上の化合物の有効用量は０．４〜１０，０００μｇ／ｋｇ受容者体重／日、好ましくは１〜１，０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは５〜５００μｇ／ｋｇ体重／日である。所要用量を一度に投与してもよいし、１日の間に適当な間隔又は他の適切なスケジュールで数回に分けて投与してもよい。これらの分用量は例えば０．１〜２５０μ ｇ、好ましくは５〜２５０μｇを含有する単位剤形として投与することができる。本発明の化合物は経口、経直腸、経鼻孔、局所（経頬及び舌下を含む）、経膣及び腸管外（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）を含む適切な経路により投与することができ、経口又は腸管外が好ましい。好適経路は例えば受容者の症状及び年齢により異なることが理解されよう。投与される成分は、例えばジデオキシヌクレオシド類［例えばジドブジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）及び２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）］のような逆転写酵素阻害剤；Ｒｏ３−３３３５及びＲｏ２４−７４２９のようなＴＡＴアンタゴニスト；プロテアーゼ阻害剤［例えば９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン（アシクロビール）］及び他の物質、例えばインターフェロン（例えばα−インターフェロン）、インターロイキン１１並びにホスホノホルメート（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）のような他の医薬と併用療法してもよいし、骨髄もしくはリンパ球移植片を含む他の免疫調節剤、又はリンパ球数及び／又は機能を適宜増加する他の医薬（例えばレバミソール又はチモシン）と併用してもよい。これらの薬剤の多くは異なるターゲット、例えば逆転写を対象とするので、この併用により相乗作用が得られると予想される。更に、本発明の化合物は上記薬剤が有効でないか又は有効でなくなった場合にも有効であり得る。例えば、本発明の化合物はＡＺＴ、ｄｄＩ及びｄｄＣのような逆転写酵素阻害剤に対して耐性の細胞で使用することができる。例えば、式（Ｉ）の化合物はこのような耐性細胞系においてＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発されるＬＴＲ発現を阻止し、このような耐性系を治療するために使用することができる。例えば、本発明の化合物はＨＩＶ−１のＡＺＴ耐性系においてＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発される発現を阻止することができる。従って、本発明は種々のターゲットに作用する例えばＡＺＴＮｄｄＩ、ｄｄＣ、ＲＯ３−３３３５等のような薬剤に対する耐性を生じる個体で治療的に使用することができる。本発明はウイルス生活環において本発明の化合物と異なる状態をターゲットとする薬剤に対する耐性を生じるＨＩＶ−１感染個体の治療に使用することができる。式Ｉの１種以上の化合物を単独て使用してもよいが、医薬組成物の一部として使用することもできる。本発明の組成物は１種以上の許容可能なキャリヤー（例えばリポソーム）及び任意に他の治療成分（上記治療剤を含む）と共に式Ｉの少なくとも１種の化合物を含有する。キャリヤーは組成物の他の成分と適合可能であり且つ受容体に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。組成物は経口、経直腸、経鼻孔、局所（経頬及び舌下を含む）、経膣又は腸管外（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与に適した組成物を含む。製剤は単位剤形（例えば錠剤及び徐放性カプセル）及びリポソームとすると適切であり、製薬業者に周知の任意の方法により製造することができる。このような方法は、１種以上の補助成分を構成するキャリヤーと被投与成分を配合する段階を含む。一般に、組成物は活性成分を液体キャリヤー、リポソームもしくは微粉砕固体キャリヤー又はその両方と均質且つ緊密に配合した後、必要に応じて生成物を成形することにより製造される。経口投与に適した本発明の組成物は、所定量の活性成分を各々含有するカプセル、カシェ剤もしくは錠剤のような分離単位；散剤もしくは粒剤；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液；又は水中油液体エマルジョンもしくは油中水液体エマルジョンのような不連続形態でもよいし、リポソームに充填してもよいし、丸塊等でもよい。錠剤は任意に１種以上の補助成分と共に圧縮又は成形により製造することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤又は分散剤と任意に混合した散剤又は粒剤のような自由流動形態で活性成分を適切な機械で圧縮することにより製造することができる。湿製錠剤は、不活性液体希釈剤で湿化した粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより製造することができる。錠剤は任意にコーテッド錠剤又はスコアド錠剤でもよいし、活性成分の放出を遅延又は制御するように製剤化してもよい。局所投与に適した組成物としては、香味剤入り基剤、通常はスクロース及びアラビヤゴムもしくはトラガカントゴム中に成分を含有する甘味入り錠剤；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビヤゴムのような不活性基剤中に活性成分を含有するトローチ；並びに適切な液体キャリヤー中に被投与成分を含有するマウスウォッシュを挙げることができる。皮膚への局所投与に適切な組成物は、式Ｉの１種以上の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤーとを含有する軟膏、クリーム、ゲル及びペーストの形態であり得る。適切な局所送達系は被投与成分を含有する経皮パッチである。経直腸投与に適切な組成物は、例えばココアバター又はサリチル酸塩を含む適切な基剤からなる座剤の形態であり得る。キャリヤーが固体である経鼻孔投与に適切な組成物は、嗅剤即ち鼻に近接するように保持した散剤容器から鼻孔に迅速に吸入することにより投与する例えば粒度２０〜５００μｍの粗粉末を含む。キャリヤーが流体であり、例えば鼻孔スプレー又は鼻孔液滴として投与するのに適した組成物としては、活性成分の水性又は油性溶液が挙げられる。経膣投与に適切な組成物は、活性成分以外に当業者に適切であるとして知られているようなキャリヤーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤を含む。腸管外投与に適切な組成物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤及び、組成物を所期受容体の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含有し得る水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位用量又は多重用量容器、例えば密閉アンプル及びバイアルの形態でもよいし、滅菌液体キャリヤー（例えば注射用水）を使用直前に添加することのみを必要とする凍結乾燥条件下で保存してもよい。上記型の滅菌散剤、粒剤及び錠剤から調合注射溶液及び懸濁液を調製することができる。具体的に列挙した上記成分以外に本発明の製剤は該当製剤の型に関して当業者に慣用の他の物質を含有してもよく、例えば経口投与に適した製剤は香味剤を含有し得ることを理解されたい。本明細書中に言及する全文献は参考資料として本明細書の一部とする。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は本発明を理解し易くするためのものであり、発明を制限する意図はない。一般注解実施例に具体的に記載するように以下の試薬及び手順を使用した。ウイルス。ＨＩＶ−１はＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B産生Ｈ９（Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B）細胞の培養上清から得た。指数増殖期の間に無細胞上清を回収し、逆転写酵素（ＲＴ）活性を標準化し、−７０℃でアリコートとして凍結した。ヒト免疫不全ウイルス陽性の患者からＨＩＶ−１の臨床単離物を調製し、ＲＴ活性を標準化した。細胞。細胞クローン２９３．２７．２は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｓｉｇｍａ）＋Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコの修正イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養したヒト胚腎上皮細胞に由来するものをＬ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｔ（スタンフォード大学）から入手した。Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４８８４−４８８８（１９９０）。この細胞クローンはＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発されるｌａｃＺ遺伝子の発現構築物であるＰＮＡＺで安定的にトランスフェクトしておいた。β −ガラトクシダーゼの発現はＰＭＡ又はＴＮＦαにより高度に誘発することができる。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＨＩＶ−血清陰性個体からの血液のＦｉｃｏｌ１−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント遠心分離により調製し、ＰＨＡ（３μ ｇ／ｍｌ）の存在下で２０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＲＰＭＩ８４０２細胞系はＴｏｓｈｉｗｏＡｎｄｏ（愛知癌研究所、東京、日本）から入手したヒトＴ細胞系である。１５％ＦＣＳ及びＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で該細胞系を成長させた。ストック溶液。濃度２０ｍＭのＴｏｐｏｔｅｃａｎ水溶液中でストック溶液を調製した。ストック溶液のアリコートを−２０℃で凍結保存した。ＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発される遺伝子発現の定量。指数的に増殖する２９３．２７．２（スタンフォード大学のＬ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）細胞を増殖培地２ｍｌ中、２×１０⁵細胞／ウェルの割合で６穴プレートに接種した。４８時間後、細胞をＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）４０ｕ／ｍｌ又はＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）２ｎｇ／ｍｌで刺激した。刺激後指定時刻に種々の濃度の式Ｉの指定化合物を培地に加えた。対照は＜０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終エタノール濃度となるように操作した。３７℃で６〜８時間インキュベーション後、培地を吸引し、細胞を回収し、４× ＰＢＳで洗浄し、ｌａｃＺ緩衝液（６０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、４０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭＫＣ１、１ｍＭＭｇＳＯ₄）に溶菌させた。ＯＮＰＧを基質として使用することにより細胞溶菌のβ−ガラクトシダーゼ活性を定量した。Ｈｅｒｂｏｍｅｌら，Ｃｅｌｌ，３９：６５３−６６２（１９８４）。タンパク質濃度を測定した。細胞を上述のように処理した後、コロニー形成アッセイにより細胞視感度を決定した。全細胞ＲＮＡ合成。２９３．２７．２細胞を成長培地２０ｍｌ中、１×１０⁶ 細胞／Ｐ１５０プレートの割合で接種した。４８時間インキュベーション後、細胞を種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで２時間処理した。その後、細胞を１ｕＣｉ／ｍｌの濃度の³Ｈ−ウリジンの存在下で更に１時間インキュベートした。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ１ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１（ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ１９９０）に記載されているようなグアニジウム−ＣｓＣｌステップグラジエント法により全細胞ＲＮＡを調製した。２６０ｎｍで測定したＲＮＡ濃度に対して調整したシンチレーション計数により、新たに合成されたＲＮＡを定量した。ノーザンブロット分析。対数増殖期の２９３．２７．２細胞を薬剤の存在下又は不在下でＴＮＦα４０ｕ／ｍｌで剌激した。２〜６時間インキュベーション後、細胞を回収した。上記手順によりグアニジウム−ＣｓＣｌステップグラジエント法により全細胞ＲＮＡを調製した。ＲＮＡを均等に充填し、分画し、ノーザン移行させた後、１ａｃＺ遺伝子フラグメント（ＰＨＳＶ１ａｃ１９からのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ）又はβ−アクチンプローブとハイブリダイズした。急性ＨＩＶ−１感染の治療。３μｇ／ｍｌＰＨＡで７２時間刺激後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B又はＨＩＶ−１の臨床単離物を１逆転写酵素単位（ＲＴＵ）／１０細胞の割合で感染させた。感染は３７℃で２時間行った。次にＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄して遊離ウイルスを除去し、種々の濃度の薬剤の不在下又は存在下で４．５×１０⁶細胞／ウェルの割合で２ｍｌ培地に再接種した。次いで細胞を連続的に薬剤に６日間暴露した。３日目には培地１ｍｌを各ウェルから除去し、前記濃度の薬剤を含有する新鮮な培地１ｍｌに交換した。６日目に細胞及び培地を回収した。トリパンブル−排除法及びＭＴＴ代謝アッセイにより細胞生存率を決定した。Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３（１９８３）参照。ＨＩＶ −１Ｐ²⁴ＡｎｔｉｇｅｎＫｉｎｅｔｉｃｓＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を製造業者のプロトコルに従って使用することにより、培養上清中のＰ²⁴濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより定量した。ＨＩＶ− １ＲＮＡＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＧｅｎｅＴｒａｋ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を製造業者の指示に従って使用することにより、ＨＩＶ−１逆転写酵素のＲＮＡをアッセイした。要約すると、全細胞ＲＮＡを調製し、ニトロセルロース膜にドットブロットし、ＲＴＲＮＡの³²Ｐ標識プローブとハイブリダイズした。慢性ＨＩＶ−１感染の治療。ＲＰＭＩ８４０２細胞にＨＴＬＶ−ＩＩＩ_Bを慢性感染させ、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎの存在下又は不在下で４×１０⁵細胞／ウェルの割合で培地２ｍｌ中で培養した。３及び６日目に上記手順で培養上清中のＰ²⁴ 濃度を測定した。Ｍｏｓｍａｎ，Ｔ．，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３（１９８３）に記載されているようなトリパンブルー排除及びＭＴＴ代謝アッセイにより細胞生存率を決定した。実施例１６時間に２０倍を越えるまで２９３．２７．２細胞のＨＩＶＬＴＲ活性をＴＮＦα及びＰＭＡで刺激した。図１に示す種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで細胞を処理した。Ｔｏｐｏｔｅｃａｎは０．５μＭのＴｏｐｏｔｅｃａｎ用量でＬＴＲ刺激を有効に抑制した。図１中、酵素活性は薬剤非処理サンプルにおける最大発現（１００とする）に対する百分率として表す。基本β−ガラクトシダーゼ活性はサイトカイン刺激なしのサンプルにおける活性として定義される。各データ得点は３つの培養ウェルの平均である。実験は少なくとも３回別々に行った。ＩＣ₅₀は約５０ｎＭであった。ＲＰＭＩ８４０２（ＰＮＡＺで一時的にトランスフェクトしたＣＤ４⁺Ｔ細胞系）をＴｏｐｏｔｅｃａｎで同様に処理した処、同様の抑制効果が観察された。特に、１２５ｎＭのＴｏｐｏｔｅｃａｎ濃度では非処理対照に対して６２％の遺伝子発現抑制が観察された（データは図示せず）。実施例２上記実施例１に記載したように２９３．２７．２細胞をＴｏｐｏｔｅｃａｎで処理した。種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで６時間処理後、細胞をトリプシン化し、１００、１，０００、１０，０００細胞／６０ｍｍプレートの割合で３回再接種した。７日間インキュベーション後、細胞コロニー（＞５０細胞）を計数した。培養効率は約２０％であった。結果を図２に示し、同図中、各データ得点は対照生存率即ち薬剤で処理しなかったプレート（１００とする）に対する百分率として表す。実施例３上記実施例１に記載したように２９３．２７．２細胞をプレート培養した。４８時間後にＴＮＦα（４０μ／ｍｌ）を培地に加えた。ＴＮＦαの添加から０．５、２及び５．５時間後に細胞にＴｏｐｏｔｅｃａｎ（０．５μＭ）を加え、即ちＨＩＶＬＴＲ活性化後にＴｏｐｏｔｅｃａｎを細胞に加えた。ＴＮＦαの添加から６時間後に細胞を回収した。図３はβ−ガラクトシダーゼのアッセイ結果を示し、同図中、各データ得点は３つの培養ウェルの平均を表す。実験は２回別々に行った。図３に示すように、β−ガラクトシダーゼはＴｏｐｏｔｅｃａｎの不在下ではＴＮＦαで刺激後に時間依存的に蓄積した。ＴＮＦαで剌激した細胞を上述のように２．０及び５．５時間目にＴｏｐｏｔｅｃａｎで処理すると、蓄積は迅速かつ十分に停止した。ＴＮＦα刺激前に細胞を０．５μＭの濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで２．０時間処理し、新たな培地で洗浄（３×）すると、β−ガラクトシダーゼ蓄積の６０％抑制が観察された。細胞をＴｏｐｏｔｅｃａｎ及びＴＮＦαで同時に刺激すると、β−ガラクトシダーゼ蓄積は実質的に０であった。（図３参照）。実施例４急性感染ヒトＰＢＭＣにおいて式Ｉの化合物によるＨＩＶ−１複製の抑制を試験した。ウイルス複製に及ぼすＴｏｐｏｔｅｃａｎの効果は、培養上清へのＰ²⁴ 放出により測定した。ヒトＰＢＭＣにＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B又は臨床単離物）を３７℃で２時間感染させた。ＰＢＳで洗浄することにより遊離ウイルスを除去した。次に感染ＰＢＭＣを４．５×１０⁵細胞／ウェルの割合で分配した。種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎを培地に加えた。６日後、細胞生存率をトリパンブルー排除により決定した。上記一般注解に記載したようにＰ²⁴濃度を決定し、ＲＴｍＲＮＡを分析した。Ｐ²⁴濃度を非処理サンプル（１００とする）に対する薬剤処理サンプルのＰ²⁴濃度百分率として表し、各データ得点を２つのサンプルから得た２回の別々の試験の結果として図４に示す。図４中、実験室株（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ_B ）及びウイルスの臨床単離物の両者のＰ²⁴産生により示すように、ＴｏｐｏｔｅｃａｎはＨＩＶ−１複製を劇的に減少させた。ＨＩＶ複製抑制濃度の中央値は、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎの有効ＨＩＶＬＴＲ活性抑制濃度と同様に約２０ｎＭであり、これはＨＩＶＬＴＲが式Ｉの化合物のターゲットであることを示唆している。この抑制は細胞生存率にさほど大きな悪影響を及ぼすことなく達せられた。刺激ＰＢＭＣの細胞生存率をトリパンブルー排除により決定した処、約９０％であった。５００ｎＭＴｏｐｏｔｅｃａｎで処理した非刺激ＰＢＭＣにおける細胞生存率は１００％であった。濃度３１ｎＭでは、ＴｏｐｏｔｅｃａｎはＲＴｍＲＮＡをほぼ検出不能なレベルまで低下させた（図５の結果参照）。実施例５ＲＰＭＩ８４０２細胞にＨＴＬＶ−ＩＩＩＢを感染させた。Ｔｏｐｏｔｅｃａｎを慢性感染細胞の培地に加えた（２×１０⁵細胞／ｍｌ）。Ｔｏｐｏｔｅｃａｎの添加から３及び６日後に一般注解の項に記載したように培養上清中のＰ²⁴を定量した。こうして決定したＰ²⁴ 濃度を図６に示す。特に、濃度３１ｎＭのＴｏｐｏｔｅｃａｎはＨＩＶ−１複製を＞８０％低下させることが判明した。図６に示す細胞生存率は、一般注解に記載したようにＭＴＴアッセイにより決定した。実施例６２９３．２７．２細胞を１×１０⁶細胞／プレートの割合で１７５ｍｍプレートに接種した。４８時間後、種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎの存在下で細胞をＴＮＦα（４０ｕ／ｍｌ）で処理した。ＴＮＦαの添加から０時間、２時間又は６時間後に全細胞ＲＮＡを調製した。一般注解に記載したようにノーザンブロット分析を実施し、結果を図７に示す。実施例７上記実施例６に記載したように２９３．２７．２細胞をプレート培養し、種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで処理した。ＴＮＦαの添加から６時間後に全細胞ＲＮＡを調製した。一般注解に記載したようにノーザンブロット分析を実施した。オートラジオグラムを走査した。ＨＩＶＬＴＲにより誘発されるβ −ガラクトシダーゼｍＲＮＡをデンシトメトリーにより決定した。結果を図８に示す。実施例８上記実施例６に記載したように２９３．２７．２細胞をプレート培養した。４８時間後、細胞を図９に示すような種々の濃度のＴｏｐｏｔｅｃａｎで３時間処理した。３時間目の初めに³Ｈ−ウリジンを培地に加えた（１μＣｉ／ｍｌ）。３時間目の終わりに全細胞ＲＮＡを調製した。新たに合成された全細胞ＲＮＡをシンチレーション計数により定量し、ＲＮＡ濃度をスペクトロフォトメトリーにより測定し、結果を図９に示す。同図中、各データ得点は２回の別々の実験の代表的試験における３つのプレートの平均である。実施例９逆転写酵素阻害剤に対して耐性のＨＩＶ−１感染細胞におけるＨＩＶ−１複製の抑制を試験した。ＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１株に急性感染させたＰＢＭＣ中では用量約０．００６〜０．００８μＭ（ＩＣ₅₀）のＴｏｐｏｔｅｃａｎ（ＴＰＴ）が測定された。ＡＺＴ耐性株は、ＨＩＶＰ²⁴抗原の産生及びＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子ＲＮＡ発現により測定されるような用量でＴＰＴにより抑制された。慢性感染Ｔリンパ球系及び前骨髄細胞系ＯＭ１０．１も同様にＴＰＴ処理後にＩＣ₅₀＝０．００８μＭという顕著な抑制を示したが、ＡＺＴ及びｄｄＩはほとんど無効であった。前骨髄細胞系ＯＭ１０．１はＴＮＦα２０単位で処理後にＨＩＶ−１Ｐ²⁴抗原の活性化を示し、これはＴＰＴ処理により有効に阻止される。従って、ＴＰＴはＨＩＶ−１ＬＴＲにより誘発される発現と、このような急性及び慢性感染細胞系におけるウイルスＰ²⁴抗原及びＨＩＶＲＮＡ産生とを最小細胞毒性で抑制する。ＴＰＴは更に、ＴＮＦαにより媒介されるＨＩＶＰ²⁴ 及びＯＭ１０．１細胞の活性化を阻止する。実施例１０Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（ＴＰＴ）をＴＮＦα（２０単位／ｍｌ）と同時にＯＭ１０．１細胞培養物（１０⁵細胞／ｍｌ）に加えた。対数増殖期のＯＭ１０．１細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、２４穴微量培養プレートに３×１０⁵ 細胞／ウェルの割合で分配した。０．００２〜０．０３１μＭの範囲のＴＰＴを２つの細胞培養物に加えた。ＯＭ１０．１細胞をＴＮＦ−α（ＥｎｄｏｇｅｎＩｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で３６時間剌激し、試料の１：２５０希釈液を用いてＣｏｕｌｔｅｒＰ²⁴動力学的アッセイによりＰ²⁴抗原を定量した。アッセイは２回実施し、結果を２回の代表的アッセイの平均値として下表に示す。前骨髄細胞系ＯＭ１０．１はそのゲノムに組込んだ細胞当たり１コピーのＨＩＶ−１を含み、低レベルのＨＩＶ−１タンパク質を絶えず産生する。この細胞系はＮＩＨ−ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＲｅａｇｅｎｔＰｒｏｇｒａｍから寄贈された。以上、好適態様に関して本発明を詳細に説明した。当業者は以上の開示に鑑み、本発明の趣旨及び範囲に適合するように変形及び改善し得ることが理解されよう。Detailed Description of the InventionTreatment of human viral infections Background of the Invention Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1, also known as HTLV-III, LAV or HTLV-III / LAV) and to a lesser extent human immunodeficiency type 2 Irus (HIV-2) is the cause of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and related diseases It is a substance. Barre-Sinoussi et al.,Science,220: 86 8-871 (1983); Gallo et al.,Science,224: 500-5 03 (1984); Levy et al.,Science,225: 840-842 (1984); Popovic et al.,Science,224: 497-500 (1984); Sarngharan et al.,Science,224: 506 -508 (1984); Siegal et al.,N. Engl. J. Med.,30 5 : 1439-1444 (1981); Clavell, F .; ,AIDS，1 : 135-140. This disease is a long-term asymptomatic event followed by an immune system and central deity. Characterized by progressive degeneration of the transsystem. Viral studies show high replication Infection and lysis of CD4-positive helper subsets of T lymphocytes Both stainings have been shown to occur in tissue culture. Zagury et al.,Sci ence ,231: 850-853 (1986). Infectious virus titers are all Controls viral expression in infected patients as it remains low over the duration of the illness It seems to be done. HIV-1 and 2env,gagas well aspolStructure like In addition to the genestat,rev,nefSimilar structures with regulatory genes such as And a functional genomic organization. AIDS itself does not always induce death, but in many individuals the immune system is significantly suppressed For herpes, cytomegalovirus, Kaposi's sarcoma and Epstein Various other diseases (secondary infections or abnormal tumors), such as Ulcer) and eventually death. These secondary infections can be cured using other medications. Can be treated. However, such treatment adversely affects the weakened immune system. May give. Almost all or no symptoms appear while being infected with AIDS virus It is likely that some humans will survive for many years, but the infection will persist. Well In another human group, mild immune system depression and weight loss, malaise, fever and phosphorus It causes various symptoms such as swelling of the phalanx. These diseases Symptom groups include persistent systemic lymphadenopathy syndrome (PGL) and AIDS-related syndrome (A RC) and may or may not develop AIDS. In either case However, HIV-infected patients are considered to be persistently infectious to others. Activation of the latent HIV provirus from the asymptomatic period is restricted to viral DNA. It has been reported to be dominated by a long terminal repeat sequence (LTR). Ran ki, A et al.Lancet ii: 589-593 (1987); Fauci. , A. S. ,Science,239: 617-622 (1988); Za gury, D.D. ,Science,231: 850-853 (1985); Mosca, J .; D. ,Nature(London),325: 67-70 (1987). HIV-1 activity binds to specific sequences in LTR positive and negative It is determined by the complex interactions of transcription factors. Cullen, B .; R. , Et al ,Cell,58: 423-426 (1989). The amount and quality of these factors Altered, multiple stimuli cause HIV-1 and HIV-2 latent provirus translocation. It can trigger the activation of copying. Fauci, A .; S. ,Science,239: 6 17-622 (1988), Griffin, G. E. FIG. ,Nature(London),339: 70-73 (1989) Nabel, G .; ,Science,239: 1299-1302 (19 88). Specifically, phorbol-12-myristate-13-acetate (P MA) and tumor necrosis factor-α (TNFα) are believed to be potent activators It In particular, TNFα is present in HIV-infected individuals at very high concentrations, so Cain is expected to play an important role in the pathogenesis of AIDS. Lahdevir ta, J .; ，Am. J. Med.,85: 289-291 (1988). Most known methods for treating HIV-infected individuals have been directed to the host cell chromosome. Of the virus was blocked at stages other than provirus. For example One of the areas of interest has been agents that act on reverse transcriptase. However, it is suggested Many of the treatments have not been proven clinically effective. In fact, AZ Even treatments that have produced clinical benefits, such as T (zidovudine), have been No reduction in the immune system has been reported to be prevented in patients. Integrated provirus Methods for suppressing both the expression of HIV and chronic infection with HIV-1 have been mostly reported. Not in. Reverse transcriptase Inhibitors (eg AZT, ddC, ddI) may have a suppressive effect on chronic infections Not reported. Ro3-3335 reportedly effective against chronic infection . Hsu, M-C,Science,254: 1799-1800 (1992) . Therefore, it is important to suppress the expression of HIV provirus in HIV-infected cells. Moreover, it is desirable to have available new compounds that can suppress chronic infections. Used to treat already infected cells by suppressing the expression of provirus. Available new therapies or means to keep the provirus dormant in infected cells Availability is particularly desirable.Summary of the Invention We have the following formula I: (In the formula, R, R₁And R₂Is hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl Independently selected from the group consisting of alkenyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R₁And R₂At least two of the substituents of are other than hydrogen) Suppresses the expression of immunodeficiency proviruses such as HIV, preferably HIV-1. Cells, which are therefore acutely or chronically infected with an immunodeficiency virus such as HIV It was found to be useful for treating At least one of these compounds With a chiral center. The present invention uses a racemic mixture of stereoisomers of said compound Includes. Preferably, the compound is optically enhanced, i.e. a specific enantiomer. -(Or diastereomer) is substantially enriched over other stereoisomers. The biological activity of the optically active stereoisomer can be determined experimentally as disclosed herein. Can be specified. In general, a compound having a (R) configuration at the 4-position carbon is more preferable. Good. Preferred compounds of formula I are those wherein R is alkyl, R₁Is hydroxyl And / or R₂There may be mentioned compounds in which is heteroalkyl. Particularly preferred compounds are those in which R is hydrogen and R₁Is hydroxyl and R₂But Heteroalkyl, especially alkyleneami (Including monoalkyl or dialkyl (alkylene) amino) Can be mentioned. A particularly preferred compound is Topotecan or R Hydrogen, R₁Is 9-hydroxyl and R₂Is 10-NN-dimethyl (me (Tylene) amino (ie (CH₃)₂NCH₂A compound of formula I, wherein R is Chill and R₁Is hydrogen and R₂Includes compounds of formula I wherein 9 is hydroxyl. Where the numbers 9- and 10- are the ring members shown in formula I above. Represents the position of. The compounds of formula I inhibit the activity of LTRs of immunodeficiency viruses such as the HIV LTR. Suppress and reduce or suppress the expression of genes operably linked to the HIV LTR. You can According to one aspect, the compound of formula I is an immunodeficiency virus, such as HIV, preferably Is capable of treating cells infected with HIV-1 and is therefore susceptible to HIV. It can be used to treat dyed humans. For example, diagnosed with AIDS Humans, those with ARC, PGL, and such symptoms are still present. Can be used to treat humans. These compounds treat humans infected with HIV. Conventional drugs used for example zidovudine (AZT), 2 ', 3'-dide Oxyinosine (ddI) and 2 ', 3'-dideoxycytidine (ddC) It can be used for different targets than reverse transcriptase inhibitors. This It is expected that the combination of such agents with the compounds of the present invention will produce a synergistic effect. Well Also, the compounds of the invention are effective in cells resistant to such compounds. it is conceivable that. For example, the compounds of the present invention are useful for HIV-1 in AZT resistant cell lines. It can be used to block LTR-induced expression. The present invention further comprises a compound of formula I and a carrier suitable for said compound, Provided is a pharmaceutical composition for use in the above symptoms.Brief description of the drawings Figure 1. Gene expression induced by HIV LT stimulated by cytokines. The current inhibition by Topotecan (at various concentrations) is shown. Figure 2 shows the effect of Topotecan on cell viability. FIG. 3 shows the effect of Topoteca on the activated HIV LTR. The suppressive effect of n is shown. FIG. 4 shows Topotec (at various concentrations) in acutely infected human peripheral blood mononuclear cells. 5 shows inhibition of HIV-1 replication by an. Figure 5 shows reverse transcriptase mRNA levels in acutely infected human peripheral blood mononuclear cells. Figure 4 shows the determined inhibition of HIV-1 replication by Topotecan. Figure 6 shows Topotecan (at various concentrations) in chronically infected human T cells. 5 shows suppression of HIV-1 expression. FIG. 7 shows HIV LTR-induced mRNA and cellular β-actin mRNA. 3 shows the selective effect of Topotecan on the accumulation of A. FIG. 8: Effects of HIV-1 LTR-induced mRNA accumulation (various Dose-dependent inhibition by Topotecan (of the concentration) is shown. Figure 9: Effect of Topotecan (at varying concentrations) on total RNA synthesis in cells. Show the result.Detailed Description of the Invention In order to suppress the expression of immunodeficiency provirus, we Infected with an immunodeficiency virus such as Formula I below for treating cells (In the formula, R, R₁And R₂Is hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl Independently selected from the group consisting of alkenyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R₁And R₂At least two of the substituents of are other than hydrogen) It has been found that it can be used and thus can be used to treat HIV infected individuals. . The alkyl group is preferably 1 to about 12 carbon atoms, more preferably about 1 to 6 carbon atoms. Having. The term alkyl, as used herein, unless otherwise specified, is cyclic. And a non-cyclic group, but of course the cyclic group is at least 3 carbons. Including ring members. Straight or branched chain acyclic groups are generally preferred over cyclic groups. Change A straight chain group is more preferable. The alkenyl substituents are preferably 2 to about 12, more It preferably has from 2 to about 6 carbon atoms. A heteroalkyl group is one or more Terrorist atom Including acyclic groups, in which each heteroatom contains one or more alkyl bonds (eg, carbon atoms). The number 1 to 8 or the alkyl bond of 1 to 4). Therefore, a suitable heteroalkyl A group is a group in which a heteroatom is directly attached to the general ring system of formula I, and a heteroatom is for example It includes groups attached to the ring system via an alkylene bond having 1 to 4 carbon atoms. Especially good Suitable heteroalkyl groups include amines containing primary, secondary and tertiary alkyl amines. Noalkyl group is mentioned, and a particularly preferable group is N-N-dialkyl (alkylene) a. Mino groups, eg of formula (alkyl)₂N (CH₂)_n(In the formula, n is an integer of 1 to 4. ) Is the basis. A particularly preferred group is N-N-dimethylmethyleneamino. The term "acyclic" heteroalkyl is intended to include straight chain and branched chain moieties, A group containing a ring-closing structure (two or more aromatic carbons at 7 to 10 positions as shown in the above formula I). (Including groups forming a ring containing prime). The substituents R, R₁And R₂Is, for example, halogen (eg fluoro, chloro or bromo). Lomo), alkyl (for example, alkyl having 1 to 12 carbon atoms, or alkyl having 1 to 6 carbon atoms), ar Kenyl (for example, alkenyl having 2 to 10 carbon atoms or 2 to 6 carbon atoms), 6 carbon atoms Heteroaryl including 10 aryl, N, O, S Kill (for example, one or more of the above heteroatoms and 1-10 or 1-6 carbon atoms) One or more by one or more suitable groups such as heteroalkylalkyl) Of the available positions can be replaced. The present invention provides both racemic mixtures of compounds of formula I and optically active stereoisomers. Including use. The optically active stereoisomers of formula I are preferred. In general, The chiral carbon (that is, the ring carbon at the 4th position) of the kton portion is Cahn-Ingold- More preferred are optically active compounds having the (R) configuration according to the Prelog nomenclature. . Carey, F.M. A. ,Advanced Organic Chemist ry , Part A, p65-66 (2nd edition, Plenum Press 19). 84). The compounds of formula I may be used to reduce, for example, HIV LTR-induced gene expression, Chronically infected cells (ie FIV, SI, preferably as evidenced by complete inhibition). Effectiveness of cells infected with viruses that are immunodeficiency viruses such as V, HIV, etc.) It is thought to provide various treatment methods. That is, an effective amount of a compound of formula I for HIV infected cells. Addition reduces the expression of genes operably linked to the HIV LTR. Good Get better Is operably linked to the HIV-1 LTR. Used in this specification The term operably linked means that the gene is under the control of the HIV LTR and is therefore It means that it is arranged in the nucleotide sequence of. Typically, a gene is It is located downstream of the LTR that functions as a motor. Preferably the gene is HI VenvGene, HIVtatGene, HIVrevC like genes Corresponds to the Ils gene. Thus, according to one preferred embodiment, the present invention treats seropositive but asymptomatic patients. Can be used to For example, as a prophylactic drug, a prophylactic drug should be given to individuals at high risk. Can be used prophylactically. Administering an effective amount of a compound of formula I This protection method consisting of is carried out as follows. The compound of formula I may be used in immunodeficiency virus infected cells, such as HIV infected cells, In particular it can be used to treat mammalian cells, especially human cells. Formula I Viral expression is significantly reduced as a result of treatment with the compounds of For example, the viral expression of HIV is the HIV LTR that functions as a promoter. Expression of marker genes such as CAT, Lac Z, etc. operably linked to Look up Can be tested by a number of methods. Invention of the invention like Topotecan The use of a compound of 5 can significantly reduce the expression of such markers. Wear. HIV-1 viral expression can be tumor necrosis factor (TNFα) or phorbol- HIV LTR test such as 12-myristate-13-acetate (PMA) It is started and enhanced by the imulator. One product of this expressiontatIs HIV-1 gene expression can be further increased. HIV in HIV infected cells When using a marker gene such as Lac Z operably linked to the LTR The addition of an effective amount of the compound of formula I significantly suppressed the expression of the lac Z gene. Therefore, regulation of HIV LTRs such as HIV envelope glycoprotein expression is It is considered that the HIV expression of the lower leg is suppressed even if it is not completely stopped. P, the major structural protein (product of gag)^{twenty four}Is HIV-1 in cells It is widely used to monitor replication and viremia in individuals. cell Compounds of the invention such as Topotecan at concentrations that do not significantly adversely affect When used, P^{twenty four}Dramatically reduces HIV-1 replication as determined by concentration Can be, preferably P^{twenty four}> 25% reduction, more preferably> 50% reduction as determined by concentration , And more preferably P^{twenty four}> 80% low HIV-1 replication as determined by concentration Get below. To obtain such results, the effective amount used is micromolar or even nanomolar. It is degree. Furthermore, for example, the compound of the present invention is administered at an effective concentration that suppresses HIV expression. Then, the cells are not adversely affected. The compounds of the present invention are useful in individuals infected with HIV or those at high risk of HIV infection. It can be administered. For example, if you have a sexual relationship with an HIV-infected partner, It can be administered to intravascular drug users. Due to its inhibitory effect, the virus of the present invention It can be used prophylactically to minimize the risk to such individuals. Compounds of formula I are readily prepared or available. In general terms, US Pat. No. 5,0 See 04,758. Other compounds of formula I are well known to those skilled in the art of synthesis. It can be manufactured by a method. As shown in the Examples below, compounds of Formula I block HIV-1 LTR activation. Or suppresses its activity, thus reducing its activity in both chronically and acutely infected cells. Remains under control Suppress gene expression. In particular, the compound of formula (I) is induced by the HIV LTR. Was found to suppress the expression of TNFα and PMA-stimulated genes in a dose-dependent manner It was Furthermore, such inhibition can be due to cell viability or cellular mRNA or total cellular RNA. It has virtually no adverse effect on the synthesis. Therefore, compounds of formula I are found in cells and humans Useful for controlling the progression of HIV infection and other retroviral infections Thought to be useful in prolonging the latency of HIV infection in humans . Without intending to be bound by theory, the compounds of formula I are non-cytotoxic and therefore may HIV LTR more closely related to the retrovirus than the cell, preferably HIV It is considered to act on the positive or negative regulator of -1 LTR. In general, the presence of one or more compounds of formula I suitable for immunodeficiency infections such as HIV infection An effective dose is 0.4-10,000 μg / kg recipient weight / day, preferably 1-1, 000 μg / kg, more preferably 5 to 500 μg / kg body weight / day. Required The doses may be administered at once, at appropriate intervals during the day or other suitable schedule. You may administer in several divided doses. These divided doses are, for example, 0.1 to 250 μm. g, It can be administered as a unit dosage form preferably containing 5-250 μg. The compounds of the present invention are orally, rectally, nasally, topically (including buccal and sublingual), vaginal And by suitable routes, including parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous and intradermal). Oral or parenteral administration is preferred. Suitable routes are for example recipient symptoms And it will be understood that it depends on the age. The components to be administered are, for example, dideoxynucleosides [eg zidovudine (A ZT), 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddI) and 2', 3'-dideoxy. Reverse transcriptase inhibitors such as Cycitidine (ddC); Ro 3-3335 and R o TAT antagonists such as 24-7429; protease inhibitors [eg 9- (2-hydroxyethoxymethyl) guanine (acyclovir)] and others Substances such as interferon (eg, α-interferon), interlo Ikin 11 as well as other drugs such as phosphonoformate (Foscarnet) Other immunomodulatory agents, including bone marrow or lymphocyte transplants, Or other drugs (eg levamisole or Can be used in combination with thymosin) Yes. Since many of these agents target different targets, such as reverse transcription, It is expected that a synergistic effect will be obtained by this combined use. In addition, the compounds of the present invention are useful if the above agents are ineffective or become ineffective. Can also be valid. For example, the compounds of the invention are like AZT, ddI and ddC. It can be used in cells resistant to various reverse transcriptase inhibitors. For example, the expression ( The compounds of I) were induced by the HIV-1 LTR in such resistant cell lines. Can be used to block LTR expression and treat such resistant systems. Wear. For example, the compounds of the present invention can be used in the HIV-1 AZT resistant system to LTR-induced expression can be blocked. Therefore, the present invention has various Acting on the target of AZTN ddI, ddC, RO3-3335, etc. It can be used therapeutically in individuals who develop resistance to drugs such as. Departure Akira is a drug that targets a condition different from the compound of the present invention in the viral life cycle It can be used to treat HIV-1 infected individuals who develop resistance to the drug. One or more compounds of formula I may be used alone, It can also be used as part of a pharmaceutical composition. The compositions of the present invention are more than one acceptable Possible carriers (eg liposomes) and optionally other therapeutic ingredients (including the therapeutic agents described above). Including) with at least one compound of formula I. The carrier is the composition "Acceptable" in the sense of being compatible with other ingredients and not harmful to the receptor There must be. The composition may be oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), vaginal or intestinal tract. Compositions suitable for external (including subcutaneous, intramuscular, intravenous and intradermal) administration are included. The formulation is Appropriate in unit dosage form (eg tablets and sustained release capsules) and liposomes It can be produced by any method known to pharmaceutical manufacturers. Such methods combine a carrier with one or more adjunct ingredients with the administered ingredient. Including the step of compounding. In general, the composition comprises the active ingredient as a liquid carrier, liposomes. Or necessary after homogeneous and intimate blending with finely divided solid carrier or both Manufactured by molding the product accordingly. Compositions of the invention suitable for oral administration include capsules each containing a predetermined amount of active ingredient. Separate units such as capsules, cachets or tablets; powders or granules; aqueous or In non-aqueous liquid Solution or suspension of; or oil-in-water liquid emulsion or water-in-oil liquid emulsion It may be in a discontinuous form such as John, may be filled in liposomes, or may be a lump, etc. But it's okay. A tablet may be made by compression or molding, optionally with one or more accessory ingredients. Wear. Compressed tablets include binders, lubricants, inert diluents, preservatives, surface active agents or dispersions. A suitable machine for the active ingredient in a free-flowing form such as powder or granules, optionally mixed with the agent. It can be manufactured by compressing with. Molded tablets are an inert liquid diluent Can be prepared by molding a mixture of moistened powdered compounds on a suitable machine. it can. The tablets may optionally be coated or scored tablets and may be made up of the active ingredient. It may be formulated to delay or control release. Compositions suitable for topical administration include flavored bases, usually sucrose and an alcohol. Sweetened tablets containing ingredients in labia gum or tragacanth gum; gelatin And active in inert bases such as glycerin or sucrose and arabic gum Troches containing the ingredients; as well as containing the administered ingredients in a suitable liquid carrier Mouthwash can be mentioned. Compositions suitable for topical administration to the skin include one or more compounds of Formula I and pharmaceutically acceptable In the form of ointments, creams, gels and pastes containing possible carriers obtain. A suitable topical delivery system is a transdermal patch containing the administered component. Compositions suitable for rectal administration include, for example, cocoa butter or a salicylate. It may be in the form of a suppository consisting of a painful base. Compositions suitable for nasal administration, where the carrier is a solid, are olfactory or nasal proximate To be administered by rapid inhalation into the nostril from a powder container held as 20 to 500 μm of coarse powder is included. The carrier is a fluid, eg nostril sp Compositions suitable for administration as lacquer or nasal drops include aqueous or active ingredients. Is an oily solution. Compositions suitable for vaginal administration are known to those of skill in the art as well as the active ingredient. Pessaries, tampons, creams, gels, pests containing carriers such as Includes paste, foam or spray formulations. Suitable compositions for parenteral administration include antioxidants, buffers, bacteriostats, and compositions Aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions that may contain solutes that make the product isotonic with the blood of the intended receptor ; And suspension Aqueous and non-aqueous sterile suspensions that may contain agents and thickeners are included. Formulation is a unit It may be in the form of a dose or multi-dose container, such as a sealed ampoule and vial, or Requires only the addition of a fungal liquid carrier (eg water for injection) just before use It may be stored under freeze-dried conditions. Formulated from sterile powders, granules and tablets of the above type Injectable solutions and suspensions can be prepared. In addition to the components specifically listed above, the formulations of the present invention are within the ordinary skill in the art with regard to the type of formulation in question. Other substances conventionally used in pharmaceuticals may be included, for example formulations suitable for oral administration include flavoring agents. It should be appreciated that one may have. All documents referred to in this specification are incorporated herein by reference. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples illustrate the invention. It is for ease of understanding and is not intended to limit the invention.General commentary The following reagents and procedures were used as specifically described in the examples. Virus. HIV-1 is HTLV-III_BProduction H9 (H9 / HTLV-III_B) Obtained from cell culture supernatant. Fine during exponential growth Cell supernatants were collected and standardized for reverse transcriptase (RT) activity and aliquoted at -70 ° C. And frozen. HIV-1 clinical isolates from human immunodeficiency virus-positive patients Prepared and standardized for RT activity. cell. Cell clone 293.27.2 contains 10% fetal calf serum (FCS, S igma) + L-glutamine supplemented Dulbecco's Modified Eagle Medium (GIB) Those derived from human embryonic kidney epithelial cells cultured in L. A. Herzenb ert (Stanford University). Roederer, M.A. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,87: 4884-4888 ( 1990). This cell clone is lacZ induced by HIV-1 LTR. It has been stably transfected with PAZ, the expression construct for the gene. β -Galatoxidase expression can be highly induced by PMA or TNFα. Wear. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are F-derived from blood from HIV-seronegative individuals. Prepared by icol1-Hypaque gradient centrifugation and PHA (3μ g / ml) in the presence of 20% FCS (Sigma), penicillin, strept Cultured in RPMI 1640 supplemented with mycin and L-glutamine. RP The MI 8402 cell line was developed by Toshiwo Ando (Aichi Cancer Institute, Tokyo, Japan). ) Human T cell line. Supplemented with 15% FCS and L-glutamine The cell line was grown in RPMI 1640 medium. Stock solution. Stock solution in 20 mM Topotecan aqueous solution Prepared. Aliquots of stock solution were stored frozen at -20 ° C. Quantification of gene expression induced by HIV-1 LTR. Exponentially growing 293.27.2 (LA Herr at Stanford University 2 x 10 cells in 2 ml of growth medium.^Five6 cells / well Well plates were inoculated. After 48 hours, the cells were transferred to TNFα (Genzyme, Cam. (Bridge, MA) 40u / ml or PMA (Sigma) 2ng / ml I was fierce. Various concentrations of the specified compound of formula I were added to the medium at the indicated times after stimulation. Contrast Was operated to give a final ethanol concentration of <0.1% (vol / vol). After incubation at 37 ° C. for 6-8 hours, the medium is aspirated, the cells are harvested and 4 × Washed with PBS, la cZ buffer (60 mM Na₂HPO_Four, 40 mM NaH₂PO_Four10 mM K C1, 1 mM MgSO_Four). Using ONPG as a substrate The β-galactosidase activity of cell lysis was quantified by. Herbomel et al.Cell ,39: 653-662 (1984). The protein concentration was measured. Fine The cells were treated as described above and then the cell visibility was determined by a colony formation assay. It was Whole cell RNA synthesis. 293.27.2 cells in 1 ml of 20 ml growth medium⁶ Cells / P150 plates were seeded. After 48 hours incubation, Vesicles were treated with various concentrations of Topotecan for 2 hours. Then, the cells are i / ml concentration³Incubated for an additional hour in the presence of H-uridine. A usubel, F.F. ,Current Protocols in Mole color Biology ,1(Wiley Interscience 1 990) guanidinium-CsCl step gradient. Total cell RNA was prepared by the method. Adjusted to RNA concentration measured at 260 nm Newly synthesized RNA was quantified by routine scintillation counting. Northern blot analysis. 293.27.2 cells in logarithmic growth phase were Was stimulated with TNFα40u / ml in the absence. After 2-6 hours incubation , Cells were collected. According to the above procedure, guanidinium-CsCl step gradient Total cell RNA was prepared by the G. method. Fill RNA evenly, fractionate, and After transfer, 1acZ gene fragment (HiS from PHSV 1ac19 ndIII / EcoRI) or β-actin probe. Treatment of acute HIV-1 infection. Peripheral blood after 72 hours stimulation with 3 μg / ml PHA HTLV-III in mononuclear cells (PBMC)_BOr 1 reverse clinical isolate of HIV-1 Transcriptase units (RTU) / 10 cells were infected. Infection at 37 ℃ for 2 hours went. The PBMCs are then washed with PBS to remove free virus and various concentrations of 4.5 × 10 in the absence or presence of drug⁶Reconstitute into 2 ml medium at the ratio of cells / well I inoculated. The cells were then continuously exposed to the drug for 6 days. 1 ml of medium on day 3 Was removed from each well and replaced with 1 ml of fresh medium containing the drug at the above concentration . Cells and medium were harvested on day 6. Trypan Bull-Exclusion Method and MTT Metabolism Cell viability was determined by assay. Mosman, T .; ,J. Immuno logical methods ,65: 55-63 (1983). HIV -1 P^{twenty four}Antigen Kinetics Assay Kit (Coul ter, Hialeah, FL) according to the manufacturer's protocol. The P in the culture supernatant^{twenty four}The concentration was quantified by an ELISA assay. HIV- 1 RNA Detection Kit (GeneTrak, Framing (Ham, MA) according to the manufacturer's instructions. Transcriptase RNA was assayed. In summary, total cell RNA was prepared and Dot blot on Rulose membrane and³²P-labeled probe and hybrida I did it. Treatment of chronic HIV-1 infection. HTLV-III in RPMI 8402 cells_BTo 4 x 10 with chronic infection and in the presence or absence of Topotecan^FiveCell / way Culture was carried out in 2 ml of medium. On day 3 and 6, P in the culture supernatant was^{twenty four} The concentration was measured. Mosman, T .; ,J. Immunological M methods ，65: 55-63 (1983). Mumble Cell viability was determined by exclusion and MTT metabolism assay.Example 1 The HIV LTR activity of 293.27.2 cells was increased to 20 times or more by 6 hours. Stimulated with NFα and PMA. Finely with various concentrations of Topotecan shown in FIG. The cells were processed. Topotecan is L at a Topotecan dose of 0.5 μM The TR stimulation was effectively suppressed. In Figure 1, the enzyme activity is the highest in the non-drug treated sample. Expressed as a percentage of high expression (denoted as 100). Basic β-galactosidase Activity is defined as the activity in samples without cytokine stimulation. Each day Data score is the average of 3 culture wells. Experiments were performed at least 3 separate times. IC₅₀Was about 50 nM. RPMI 8402 (Temporarily Perfect CD4⁺T cell line) was similarly treated with Topotecan, A similar inhibitory effect was observed. Especially at a Topotecan concentration of 125 nM 62% gene repression was observed relative to untreated controls (data not shown) .Example 2 293.27.2 cells with Topotecan as described in Example 1 above. Processed. After treatment with various concentrations of Topotecan for 6 hours, the cells were trypsinized. 3 times at a ratio of 100, 1,000, 10,000 cells / 60 mm plate I was vaccinated again. Count cell colonies (> 50 cells) after 7 days of incubation did. The culture efficiency was about 20%. The results are shown in Fig. 2, where each data score is shown. Is the control survival rate, ie, the percentage relative to the plate not treated with the drug (assumed to be 100) Expressed as a rate.Example 3 293.27.2 cells were plated as described in Example 1 above. 4 After 8 hours, TNFα (40 μ / ml) was added to the medium. From the addition of TNFα to 0. Topotecan (0.5 μM) was added to the cells after 5, 2 and 5.5 hours and immediately After the HIV LTR activation, Topotecan was added to the cells. Addition of TNFα The cells were collected 6 hours after the addition. Figure 3 shows the β-galactosidase assay results. In the figure, each data score represents the average of three culture wells. Experiment is separated twice I went everywhere. As shown in FIG. 3, β-galactosidase was isolated from Topotecan. In the absence of TNFα Accumulation was time-dependent after stimulation. The cells stimulated with TNFα were treated with 2.0 as described above. And treatment with Topotecan at 5.5 hours resulted in a rapid and sufficient arrest of accumulation. I stopped. Prior to TNFα stimulation, cells were treated with Topotecan at a concentration of 0.5 μM.2. After treatment for 0 hour and washing with fresh medium (3 ×), β-galactosidase accumulation was observed. A 60% inhibition was observed. Simultaneously stimulate cells with Topotecan and TNFα Then, β-galactosidase accumulation was substantially zero. (See Figure 3).Example 4 Inhibition of HIV-1 replication by compounds of formula I in acutely infected human PBMC I tried The effect of Topotecan on viral replication is due to the fact that P^{twenty four} Measured by release. HIV-1 (HTLV-III was added to human PBMC._BOr clinical Isolate) was infected at 37 ° C. for 2 hours. Free virus by washing with PBS Removed. Next, infect PBMC 4.5 × 10^FiveDistribute at the ratio of cells / well It was Various concentrations of Topotecan were added to the medium. After 6 days, test cell viability. Determined by Ripan Blue exclusion. P as described in the general comment above^{twenty four}Determine concentration RT mRN A was analyzed. P^{twenty four}Drug-treated sample for untreated sample (100) Sample P^{twenty four}Expressed as a percentage of concentration, each data score was obtained from two samples. The results of one separate test are shown in FIG. In FIG. 4, the laboratory strain (HTLV-III_B ) And clinical isolates of the virus.^{twenty four}As shown by production, Topot ecan dramatically reduced HIV-1 replication. The median HIV replication inhibitory concentration is , About 20 nM, similar to the effective HIV LTR inhibitory concentration of Topotecan Yes, suggesting that the HIV LTR is a target for compounds of formula I There is. This suppression was achieved without significant adverse effects on cell viability . Cell viability of stimulated PBMC was determined by trypan blue exclusion to be about 90% Met. In unstimulated PBMC treated with 500 nM Topotecan Cell viability was 100%. At a concentration of 31 nM, Topotecan is RT mRNA was reduced to almost undetectable levels (see results in Figure 5).Example 5 RPMI 8402 cells were infected with HTLV-IIIB. Topotec an was added to the medium of chronically infected cells (2 x 10^FiveCells / ml). General 3 and 6 days after addition of Topotecan As described in the note section, P in the culture supernatant was^{twenty four}Was quantified. P determined in this way^{twenty four} The concentration is shown in FIG. In particular, Topotecan at a concentration of 31 nM was HIV-1 replicating. Was found to be reduced by> 80%. The cell viability shown in Figure 6 is described in the general notes. Determined by MTT assay as listed.Example 6 293.27.2 cells at 1 x 10⁶175 mm play at cell / plate ratio Inoculated into After 48 hours, cells were incubated in the presence of various concentrations of Topotecan. It was treated with TNFα (40 u / ml). 0 hours, 2 hours or after the addition of TNFα Total cell RNA was prepared after 6 hours. Northern blocks as described in the general commentary Analysis was performed and the results are shown in FIG. 7.Example 7 Plate 293.27.2 cells as described in Example 6 above and Was treated with Topotecan at a concentration of. Whole cells 6 hours after addition of TNFα RNA was prepared. Northern blot analysis as described in the general notes Carried out. The autoradiogram was scanned. Β induced by HIV LTR -Galactosidase mRNA was determined by densitometry. The result is shown in Figure 8. Show.Example 8 293.27.2 cells were plated as described in Example 6 above. 4 After 8 hours, the cells were treated with various concentrations of Topotecan for 3 hours as shown in FIG. I understood At the beginning of the third hour³H-uridine was added to the medium (1 μCi / ml). Total cellular RNA was prepared at the end of the 3rd hour. The newly synthesized total cellular RNA Quantify by scintillation counting and measure RNA concentration by spectrophotometry The measurement was performed and the result is shown in FIG. In the figure, each data score represents the cost of two separate experiments. It is the average of 3 plates in the table test.Example 9 HIV-1 replication in HIV-1-infected cells resistant to reverse transcriptase inhibitors Was tested for inhibition. For use in PBMCs acutely infected with AZT-resistant HIV-1 strain Amount of about 0.006-0.008 μM (IC₅₀) Topotecan (TPT) Was measured. The AZT resistant strain is HIV P^{twenty four}antigen Β-galactosidase gene R induced by HIV-1 LTR It was suppressed by TPT at doses as measured by NA expression. Chronically infected T lymphocyte lineage and promyelocytic cell line OM10.1 also after TPT treatment IC₅₀It showed a remarkable inhibition of 0.008 μM, but AZT and ddI It was invalid. Promyelocytic cell line OM10.1 was treated with 20 units of TNFα and then treated with H IV-1 P^{twenty four}Shows activation of antigen, which is effectively blocked by TPT treatment . Therefore, TPT is associated with the expression induced by the HIV-1 LTR and such abruption. Virus P in sexually and chronically infected cell lines^{twenty four}Antigen and HIV RNA production It is suppressed by small cell toxicity. TPT is further mediated by HIV P mediated by TNFα.^{twenty four} And block activation of OM10.1 cells.Example 10 Topotecan (TPT) was simultaneously added to TNFα (20 units / ml) and OM1. 0.1 cell culture (10^FiveCells / ml). OM 10.1 fine in logarithmic growth phase Resuspend cells in RPMI 1640 medium and add 3x10 in 24-well microculture plate.^Five The cells / well were distributed. 0.002-0. TPT in the range of 031 μM was added to the two cell cultures. OM10.1 cells to T Excited for 36 hours with NF-α (Endogen Inc., Boston, MA) , Coulter P using 1: 250 dilution of sample^{twenty four}By kinetic assay Ri P^{twenty four}Antigen was quantified. The assay was performed in duplicate and the results are from two representative assays. The average values are shown in the table below. The promyelocytic cell line OM10.1 is a cell line that has integrated into its genome. Contains 1 copy of HIV-1 per cell and is able to withstand low levels of HIV-1 protein Produce without. This cell line is NIH-AIDS Research and Re Donated by the ference Reagent Program. The present invention has been described in detail with reference to the preferred embodiments. One skilled in the art in view of the above disclosure It should be understood that modifications and improvements can be made to fit the spirit and scope of the present invention. U

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者パーディー，アーサー・ビーアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02146、ブルツクリン、コツドマン・ロード・30 (72)発明者リー，ジア−キヤンアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02120、ボストン、トレモント・ストリート・1575、アパートメント・608 (72)発明者クラムパツカー，クライドアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01930、グローススター、レオナード・ストリート・65 (72)発明者ツアン，リンアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02215、ボストン、スイート・511、バスウエル・ストリート・14─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventor Purdy, Arthur Bee United States, Masachi Youth 02146, Burtskrin, Kotdman Law De 30 (72) Inventor Lee, Jia Kyan United States, Masachi Youth 02120, Boston, Tremont Story To 1575, apartment 608 (72) Inventor Clam Packer, Clyde United States, Masachi Youth 01930, Growth Star, Leonard S. Treat 65 (72) Inventor Tuan, Lin United States, Masachi Youth 02215, Boston, Suite 511, Basuu L Street 14

Claims

[Claims] 1. A pharmaceutically acceptable carrier and an antiviral therapeutically effective amount of Formula I: (Wherein R, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R ₁ and R ₂ A compound for treating a mammal having an immunodeficiency virus, which comprises at least two of the substituents other than hydrogen). 2. A method for suppressing or reducing the expression of a gene operably linked to the LTR of an immunodeficiency virus, the method comprising the following formula I in an amount effective to reduce gene expression: (Wherein R, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R ₁ and R ₂ At least two of the substituents are other than hydrogen). 3. A method of treating cells infected with a virus capable of inducing an immunodeficiency in humans, wherein the anti-viral therapeutically effective amount of Formula I: (Wherein R, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R ₁ and R ₂ At least two of the substituents are other than hydrogen). 4. A method of treating a human suffering from an immunodeficiency resistant to a reverse transcriptase inhibitor, the method comprising: (Wherein R, R ₁ and R ₂ are each independently selected from the group consisting of hydrogen, substituted and unsubstituted alkyl, acyclic heteroalkyl and substituted and unsubstituted alkenyl, provided that R, R ₁ and R ₂ At least two of the substituents are other than hydrogen). 5. The method of claim 1, wherein the cell line is a reverse transcriptase inhibitor resistant cell line. 6. The reverse transcriptase inhibitor is selected from the group consisting of zidovudine (AZT), 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddI) and 2', 3'-dideoxycytidine (ddC). The method according to any one of 1. 7. The method according to claim 6, wherein the reverse transcriptase inhibitor is AZT. 8. The method according to claim 1 or 2, wherein the LTR is an HIV LTR. 9. The method of claim 8, wherein the LTR is the HIV-1 LTR. 10. The compound according to any one of claims 1 to 4, wherein R is ethyl, R ₁ is hydrogen and R ₂ is 9-hydroxyl. 11. 5. A compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the compound of formula I is Topotecan. 12. The method of claim 3, wherein the virus that infects the cell is resistant to a reverse transcriptase inhibitor. 13. The method according to claim 2 or 12, wherein the cells are human cells. 14. 13. The method of any one of claims 1, 2, 4, 5 and 12, wherein the virus is capable of inducing acquired immunodeficiency syndrome or acquired immunodeficiency syndrome-related syndrome in humans. 15. 15. The method of claim 14, wherein the virus is HIV. 16. The method according to claim 15, wherein the virus is HIV-1.