【発明の詳細な説明】
試験管内受精を改良するための二成分フィブリングルー組成物
本発明は、試験管内受精を改良するための成分ＡおよびＢからなる二成分フィ
ブリングルー組成物に関する。
１９８７年、最初の試験管内受精（in vitro fertilization）ベビーがイング
ランドに誕生した。それから後、試験管内受精は、広く世界中で行われるように
なった。試験管内受精の適用症には、ほとんど全ての不妊症が含まれる。
試験管内受精が導入されてから、この方法のあらゆる面について、例えば排卵
誘発や卵採取のような技術が改良されてきた。ただし、一つの領域のみ、例外的
に深刻な問題と複雑な要因とを残している。その領域とは、胎芽の子宮への着床
である。子宮内への胚芽の着床の成功率は、胎芽当り８乃至９％、あるいは妊娠
率で２０乃至３０％（一度の試験管内受精で、一般に３または４胎芽を移植する
ため）程度に留まっている。高い着床率を得るために考えられるのは、この失敗
例において若い胎芽（２乃至８細胞）の子宮への移植が重要な役割をしうること
である。このような胎芽は、その段階で着床するには充分に成熟していない。他
方、子宮外で長時間胎芽を培養すると、胎芽を損傷し、それらの３０％程度しか
通常の着床が起こる発生段階である未分化胚芽細胞期へ発達しない。従来の技術
で知られているフィブリングルーを用いて着床の改良する試みは、失敗に終わっ
ている。その考え方は、このフィブリングルーを用いて胎芽を子宮の壁（子宮内
膜）に付着させるというものである。
本発明の目的は、試験管受精を改良する組成物および方法を提供することであ
る。
本発明に従うと、上記の問題は、下記成分ＡおよびＢからなる二成分フィブリ
ングルー組成物により解決することができる。
−成分Ａは、フィブリノーゲンおよびプロテアーゼ阻害剤からなり、
−成分Ｂは、フィブリノーゲンを特異的に切断し、フィブリンポリマーの形成
を起こすことができる蛋白分解酵素からなり、そして
−哺乳類の胎芽細胞を培養するための因子が、成分ＡおよびＢの一方または両
方に含まれている。
好ましくは、全血または血漿の寒冷沈降物が、成分Ａのフィブリノーゲン含有
分画として用いられる。なお、市販されている寒冷沈降物の製品も利用できる。
寒冷沈降物を、第２因子と第５因子の間に濃縮すると都合がよい。
寒冷沈降物は、好ましくはウイルス不活性化されている。ウイルス不活性化の
操作は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９１／００５０３号明細書に記載されている。こ
の方法の基本原理は、寒冷沈降物を特定の洗浄剤で処理して、その後、洗浄剤を
寒冷沈降物から除去することである。
成分Ａに存在するプロテアーゼ阻害剤は、好ましくはアプロチニンである。そ
の濃度は、成分Ａの総量に対して、１００００Ｕ／ｍｌ以下であることが好まし
い。アプロチニンは市販れており、TrasylolRあるいはAntagosanRとの商標の製
品が利用できる。また、トラネキサム酸（４−（アミノメチル）シクロヘキサン
カルボン酸）やその許容できる塩も、アプロチニンの代わりに、あるいはそれと
組み合わせて用いるのに適当な薬剤である。
本発明の二成分フィブリングルー組成物の第二成分Ｂは、フィブリノーゲンを
特異的に切断できる蛋白分解酵素の溶液で調製される。好ましくは、トロンビン
が使用される。好ましくはトロンビンは、ヒトまたはウシのような哺乳類の血漿
から単離される。トロンビンは、凍結乾燥状態での扱いが可能である。トロンビ
ンの再構成は、塩化カルシウムを含む溶液中で起こる。フィブリノーゲンの切断
に特異的なプロテアーゼの濃度は、胎芽を子宮に移植する方法により決定する。
基本的には、遅く作用する二成分フィブリングルー組成物が必要とされる場合に
は、トロンビンの濃度を低くしなければならない。これに対して、速く作用する
フィブリングルーが必要である場合には、トロンビンの濃度を高くする（速効性
フィブリングルー）。トロンビンの典型的な濃度範囲は、遅い作用のフィブリン
グルーにおいて、０．４乃至４ユニット／ｍｌである。
本発明のフィブリングルーの他の好ましい態様は、成分Ｂとして、蛇毒から単
離された蛋白分解酵素を含む。蛇毒酵素としては、南アメリカの毒蛇であるBoth
rpos moujiniから単離したバトロキソビン（batroxobin）を利用できる。この毒
素は化学的には、約３６０００の分子量を有する単鎖のグリコペプチドである。
この蛇毒は、デフィブラーゼ（DefibraseR）の名称で知られており、フィブリノ
ーゲンのala/16-arg/17 におけるグルー結合の切断を起こす。その結果、フィブ
リノペプチドＡの放出と、単量性フィブリンＩの形成が起きる。
寒冷沈降物が自家組織由来で調製された場合には、デフィブラーゼやレプチラ
ーゼ（Reptilase）のようなフィブリノーゲンをフィブリンに変換する蛇毒の使
用が好ましい。また、蛇毒の使用により、ヒトの全血製品の使用を回避すること
もできる。
本発明に従う場合、本発明のフィブリングルー中には、哺乳類の胎芽細胞を培
養するための因子が存在していなければならない。この因子を存在させるために
は、成分ＡおよびＢの一方または両方に、因子を混合すればよい。あるいは、因
子を液体中に溶かして、その液体を成分ＡおよびＢの一方または両方と混合して
もよい。哺乳類の胎芽細胞を培養するための好ましい因子は、塩化カルシウム、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸
二水素ナトリウム、Ｄ−グルコースおよびフェノールを含む。溶液は、好ましく
は約７．２のｐＨを有する。ピルビン酸と抗生物質（例、ゲンタマイシン）をさ
らに添加することも有効である。
ウイルスが存在しない条件下で成分Ａを調製するための代表的な方法について
は、ＰＣＴ／ＥＰ９１／０１８５０号明細書に示唆されている。
典型的な方法においては、寒冷沈降物とトロンビンを胎芽を培養するための培
地中に溶解する。もちろん、両方の成分は凝血反応を防止するために、分離して
おく。培養のための培地の好ましい組成として、二種類を以下に示す。一つは、
ＥＢＳＳと呼ばれるもので、Gibco社から市販されている。ＥＢＳＳは、アール
の平衡塩類溶液（Earle's Balanced Salt Solutions）の略語である。これは、
液体または粉末として購入することができる。液体は、無水塩化カルシウムを０
．２ｇ／ｌ、塩化カリウムを０．４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０．２ｇ／ｌ
、塩化ナトリウムを６．８ｇ／ｌ、重炭酸ナトリウムを２．２ｇ／ｌ、ＮａＨ2
ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを０．１５８ｇ／ｌ、さらにＤ−グルコースを１．０ｇ／ｌおよ
びフェノールレッドを０．０１ｇ／ｌの量で含む。粉末状のものを１リット
ルに溶解した溶液は、無水塩化カルシウムを０．２０ｇ／ｌ、塩化ナトリウムを
０．４ｇ／ｌ、無水硫酸マグネシウムを０．０９７７ｇ／ｌ、塩化ナトリウムを
６．８０ｇ／ｌ含み、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、Ｄ−グルコースおよびフェノー
ルレッドの量は、液体と同じ含有量である。ピルビン酸を好ましくは０．０１５
ｇ／ｌの量で、ゲンタマイシンを５０ｍｇ／ｌの量で更に添加することも有効で
ある。
試験管内受精を実施する分野によって、特定の要求に従うように培地を変更す
ることができる。例えば、繁殖のような農業分野においては、要求が異なる。上
記の培養のための培地は、ヒトにおける試験管内受精においても利用できる。
試験管内受精の成果の向上に失敗していた従来のフィブリングルー製品と比較
すると、本発明のフィブリングルーの有利な点は、その抗繊維素溶解作用が高く
なっているため、一方では胎芽の子宮への固着を防止または遅延し、他方では凝
血を阻害する。本発明の二成分フィブリングルー組成物は、胎芽が子宮壁に留ま
り永久的に固着するまで、子宮内の環境下で胎芽が生存することを可能にする。
胎芽の生存は、胎芽細胞培養のための因子を含む培地によって維持される。驚く
べきことに、アプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤は、高濃度でも胎芽に影
響を与えずに、グルーの分解を防止する。さらに、本発明の他の好ましい態様で
は、二成分フィブリングルー組成物は、等浸透圧性である。このため、従来技術
のグルーが高浸透圧性であることによる不利な点が解消されている。高浸透圧性
であると、乾燥現象による胎芽の死が起こる。
本発明のフィブリングルーの有利な特徴は、試験管内での胎芽の成長に必須で
ある塩と栄養成分の存在である。また、本発明の組成物は、胎芽あるいは子宮に
よるグルーの早期の分解を遅延させる抗繊維素溶解作用を有している。さらに、
胎芽の抗繊維素溶解能は、胎児がその周囲の一定の領域を分解して、フィブリン
グルーに囲まれた量状の液体領域を形成することができる程度に、つりあいが取
れていなければならない。
ある種の条件下では、胎児の成熟を強化し、加速する成長因子を含めることが
推奨できる。
フィブリノーゲン源としては、寒冷沈降物の使用の方が、フィブリノーゲン濃
縮物よりも有利である。すなわち、前者の方は、接着に必要とされるフィブロネ
クチンやフォンビルブラント因子のような成分を含むからである。さらに、寒冷
沈降物は、胎芽の発達や定着を促進する蛋白質や低分子物質のような他の薬品も
含むことができる。さらに、ヒアルロン酸のような傷をいやす作用を有する化合
物を使用できる。
本発明の二成分フィブリングルー組成物の調製のためには（上記の実験におい
て使用できるように）、寒冷沈降物を上記の培養用の培地中に溶解する。次に、
アプロチニンまたはトラネキサム酸を寒冷沈降物に加える。成分Ａを含む寒冷沈
降物中のアプロチニンの濃度は、好ましくは６０００乃至１００００ｕ／ｍｌの
範囲内である。トラネキサム酸の濃度は、好ましくは１０乃至２００μｇ／ｍｌ
（最終濃度）である。これは、約３０００乃至１００００ＫＩＵ／ｍｌのアプロ
チニンの活性と同等である。成分Ｂを加える際の希釈により、成分ＡおよびＢの
混合物におけるアプロチニンの最終濃度は低くなる。希釈要因は、添加する成分
Ｂの量に依存する。寒冷沈降物溶液におけるフィブリノーゲンの濃度は、他のフ
ィブリングルーと比較すると相対的に低くなる。これは、強い引っ張り強度を必
要としないからである。フィブリノーゲンの好ましい濃度は、５乃至２０ｇ／ｌ
である。
胎芽は、例えば、以下の方法により注入できる。胎芽は、培養皿内の再構成し
た寒冷沈降物中に置く。次に、トロンビンを０．４乃至４ユニットの濃度で加え
る。トロンビン濃度により、グルーの凝血時間が決定される。胎芽は培養液中に
吸入され、子宮内に注入される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Two-component fibrin glue composition for improving in vitro fertilization. The present invention relates to a two-component fibrin glue composition for improving in vitro fertilization comprising components A and B. In 1987, the first in vitro fertilization baby was born in England. Since then, in vitro fertilization has become widespread worldwide. In vitro fertilization applications include almost all infertility. Since the introduction of in vitro fertilization, techniques such as ovulation induction and egg collection have improved in all aspects of this method. However, only one area leaves exceptionally serious problems and complex factors. That area is the implantation of the embryo into the uterus. The success rate of implantation of the embryo in the uterus is 8 to 9% per embryo, or 20 to 30% of the pregnancy rate (for in vitro fertilization of one in vitro, generally 3 or 4 embryos are transferred). There is. It is conceivable that transplantation of young embryos (2-8 cells) into the uterus may play an important role in this failure in order to obtain high implantation rates. Such embryos are not mature enough for implantation at that stage. On the other hand, culturing embryos for a long time outside the uterus damages the embryos, and only about 30% of them develop to the undifferentiated germ cell stage, which is a developmental stage in which normal implantation occurs. Attempts to improve implantation using fibrin glue known in the prior art have failed. The idea is to use this fibrin glue to attach the embryo to the wall of the uterus (endometrium). It is an object of the present invention to provide compositions and methods that improve in vitro fertilization. According to the invention, the above problems can be solved by a two-component fibrin glue composition consisting of the following components A and B: -Component A consists of fibrinogen and protease inhibitors-Component B consists of proteolytic enzymes capable of specifically cleaving fibrinogen and causing the formation of fibrin polymers, and-culturing mammalian embryonic cells Is included in one or both of components A and B. Preferably, whole blood or plasma cryoprecipitate is used as the fibrinogen-containing fraction of component A. It should be noted that commercially available products of cold precipitation can also be used. Conveniently, the cryoprecipitate is concentrated between Factor 2 and Factor 5. The cryoprecipitate is preferably virus inactivated. The procedure for virus inactivation is described, for example, in PCT / EP91 / 00503. The basic principle of this method is to treat the cryoprecipitate with a specific detergent and then remove the detergent from the cryoprecipitate. The protease inhibitor present in component A is preferably aprotinin. The concentration is preferably 10,000 U / ml or less with respect to the total amount of the component A. Aprotinin marketed and available trademark product of Trasylol R or Antagosan R. Also, tranexamic acid (4- (aminomethyl) cyclohexanecarboxylic acid) and its acceptable salts are suitable agents to be used in place of or in combination with aprotinin. The second component B of the two-component fibrin glue composition of the present invention is prepared with a solution of a proteolytic enzyme capable of specifically cleaving fibrinogen. Preferably thrombin is used. Preferably thrombin is isolated from plasma of a mammal such as human or bovine. Thrombin can be handled in the freeze-dried state. Reconstitution of thrombin occurs in a solution containing calcium chloride. The concentration of protease specific for fibrinogen cleavage is determined by the method of transplanting the embryo into the uterus. Basically, if a slow-acting two-component fibrin glue composition is needed, the concentration of thrombin must be low. On the other hand, if a fast-acting fibrin glue is required, the concentration of thrombin is increased (fast-acting fibrin glue). A typical concentration range for thrombin is 0.4-4 units / ml in slow-acting fibrin glue. Another preferred embodiment of the fibrin glue of the present invention comprises as component B a proteolytic enzyme isolated from snake venom. As the snake venom enzyme, batroxobin isolated from South American viper, Both rpos moujini, can be used. The toxin is chemically a single chain glycopeptide with a molecular weight of approximately 36000. This snake venom, known by the name Defibrase R , causes cleavage of the glue bond at filainogen ala / 16-arg / 17. This results in the release of fibrinopeptide A and the formation of monomeric fibrin I. When the cryoprecipitate is prepared from autologous tissue, it is preferable to use a snake venom such as defibrase or reptilase which converts fibrinogen into fibrin. The use of snake venom can also avoid the use of human whole blood products. In accordance with the invention, the factors for culturing mammalian embryonic cells must be present in the fibrin glue of the invention. In order for this factor to be present, the factor may be mixed with one or both of the components A and B. Alternatively, the factor may be dissolved in a liquid and the liquid mixed with one or both of components A and B. Preferred factors for culturing mammalian embryonic cells include calcium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, sodium chloride, sodium bicarbonate, sodium dihydrogen phosphate, D-glucose and phenol. The solution preferably has a pH of about 7.2. Further addition of pyruvate and antibiotics (eg gentamicin) is also effective. A representative method for preparing component A in the absence of virus is suggested in PCT / EP91 / 01850. In a typical method, the cryoprecipitate and thrombin are dissolved in a medium for culturing embryos. Of course, both components should be separated to prevent the clotting reaction. Two types of preferable composition of the culture medium are shown below. One is called EBSS, which is commercially available from Gibco. EBSS is an abbreviation for Earle's Balanced Salt Solutions. It can be purchased as a liquid or powder. The liquid was anhydrous calcium chloride at 0. 2 g / l, potassium chloride 0.4 g / l, MgSO 4 .7H 2 O 0.2 g / l, sodium chloride 6.8 g / l, sodium bicarbonate 2.2 g / l, NaH 2 PO 4 It contains 0.158 g / l of 2H 2 O, 1.0 g / l of D-glucose and 0.01 g / l of phenol red. A solution prepared by dissolving powdered matter in 1 liter was 0.20 g / l of anhydrous calcium chloride, 0.4 g / l of sodium chloride, 0.0977 g / l of anhydrous magnesium sulfate and 6.80 g / l of sodium chloride. Including, the amounts of NaH 2 PO 4 .2H 2 O, D-glucose and phenol red are the same as the liquid. It is also effective to further add pyruvic acid in an amount of preferably 0.015 g / l and gentamicin in an amount of 50 mg / l. Depending on the area where in vitro fertilization is performed, the medium can be modified to meet specific needs. In the agricultural sector, for example breeding, the requirements are different. The above culture medium can also be used for in vitro fertilization in humans. Compared with conventional fibrin glue products that have failed to improve the outcome of in vitro fertilization, the advantage of the fibrin glue of the present invention is that, on the one hand, its anti-fibrinolytic action is increased Prevents or delays adherence to blood vessels, while inhibiting coagulation. The two-component fibrin glue composition of the present invention allows the embryo to survive in the environment of the uterus until the embryo remains on the uterine wall and permanently adheres. Embryo survival is maintained by a medium containing factors for embryo cell culture. Surprisingly, protease inhibitors such as aprotinin prevent glue degradation without affecting the embryo even at high concentrations. Further, in another preferred aspect of the invention, the two component fibrin glue composition is isotonic. Thus, the disadvantages of the prior art glue having high osmotic pressure are eliminated. Hyperosmolarity causes embryo death due to the phenomenon of desiccation. An advantageous feature of the fibrin glue of the present invention is the presence of salts and nutrients that are essential for embryonic growth in vitro. Further, the composition of the present invention has an antifibrinolytic action that delays the early decomposition of glue by the embryo or uterus. Furthermore, the antifibrinolytic capacity of the embryo must be balanced to the extent that the fetus can degrade certain areas around it to form a volume of liquid area surrounded by fibrin glue. I won't. Under certain conditions, it may be advisable to include growth factors that enhance and accelerate fetal maturation. As a source of fibrinogen, the use of cryoprecipitate has advantages over fibrinogen concentrate. That is, the former contains components such as fibronectin and von Willebrand factor required for adhesion. In addition, the cryoprecipitate can also include other agents such as proteins and low molecular weight substances that promote embryo development and colonization. Further, a compound having a wound-healing action such as hyaluronic acid can be used. For the preparation of the binary fibrin glue composition of the present invention (as can be used in the experiments described above), the cryoprecipitate is dissolved in the culture medium described above. Next, aprotinin or tranexamic acid is added to the cryoprecipitate. The concentration of aprotinin in the cryoprecipitate containing component A is preferably in the range of 6000 to 10000 u / ml. The concentration of tranexamic acid is preferably 10 to 200 μg / ml (final concentration). This is equivalent to the activity of aprotinin of about 3000 to 10000 KIU / ml. Due to the dilution in adding component B, the final concentration of aprotinin in the mixture of components A and B is low. The dilution factor depends on the amount of component B added. The concentration of fibrinogen in the cryoprecipitate solution is relatively low compared to other fibrin glue. This is because strong tensile strength is not required. The preferred concentration of fibrinogen is 5 to 20 g / l. The embryo can be injected, for example, by the following method. Embryos are placed in the reconstituted cryoprecipitate in culture dishes. Then thrombin is added at a concentration of 0.4 to 4 units. The thrombin concentration determines the clotting time of the glue. The embryo is inhaled into the culture medium and injected into the uterus.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 35/16 ＡＣＶ 7431−4Ｃ
38/46
38/55
9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54
9052−4Ｃ Ａ６１Ｍ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，
ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ
Ｗ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ
，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI A61K 35/16 ACV 7431-4C 38/46 38/55 9455-4C A61K 37/54 9052-4C A61M 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG) , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BB, BG, BR, CA, CZ, FI, HU, JP, KP, KR, LK, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SK, UA, VN