JPH08501453A - Vector for delivering and expressing foreign genes - Google Patents

Vector for delivering and expressing foreign genes

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JPH08501453A
JPH08501453A JP6508518A JP50851894A JPH08501453A JP H08501453 A JPH08501453 A JP H08501453A JP 6508518 A JP6508518 A JP 6508518A JP 50851894 A JP50851894 A JP 50851894A JP H08501453 A JPH08501453 A JP H08501453A
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vector
sense rna
gene
foreign gene
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ウォーカー，ピーター・ジョン
プレハウド，クリストフ・ジーン
カウリー，ジェフ・アレクサンダー
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コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション
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Abstract

(57)【要約】 外来遺伝子を発現させるために外来遺伝子を標的細胞に送達するためのベクターを提供する。該ベクターは、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白より構成されるウイルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれる（−）ＲＮＡセンスＲＮＡゲノムからなる。（−）センスＲＮＡゲノムは、１種またはそれ以上の外来遺伝子を含むが、（−）センスＲＮＡウイルスの複製のための遺伝子を含まない。該ベクターを含有する医薬組成物、ならびに外来遺伝子の発現産物を標的細胞に送達する方法のみならず、該ベクターの製造方法も記載する。   (57) [Summary] A vector is provided for delivering a foreign gene to a target cell for expressing the foreign gene. The vector consists of the (-) RNA sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex in a virus-like particle composed of the structural protein of the (-) sense RNA virus. The (-) sense RNA genome contains one or more foreign genes, but not the genes for replication of the (-) sense RNA virus. Not only a pharmaceutical composition containing the vector and a method for delivering an expression product of a foreign gene to a target cell, but also a method for producing the vector are described.

Description

【発明の詳細な説明】 外来遺伝子を送達し、発現させるベクター 技術分野 本発明は、外来遺伝子を真核細胞に送達（デリバリー）し、発現させるために 用いられうる送達システムに関する。詳細には、該送達システムを用いて、アン チーセンスＲＮＡ、触媒的ＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドを、選択された タイプの特別な標的細胞中に送達することができる。該送達システムをインビト ロで用いて培養中の真核細胞を標的とすることができ、あるいはインビボで用い て予防薬または治療薬を、疾患のある、または感染した、あるいは疾患、感染も しくは体内侵入の危険性のある動物またはヒトの特別な細胞に送達することがで きる。 背景技術 今までのところ、治療薬を送達するための従来のシステムとしては、主として ゼラチン混合物から製造され、着色料、可塑剤、保存料および乳化剤のごとき少 量の他の成分を含むカプセルのごとき医薬剤形が挙げられていた。これらのカプ セル剤は、薬剤を所望の部位に送達するための可溶性の外殻または外套として機 能する。軟カプセルは、液体に用いられ、一方、硬カプセルは浮遊性粉末の送達 に用いられる。マイクロカプセル封入法もよく知られている。他の形態の剤形と しては、加工をしやすくし、薬剤の特性を改善するためのある種の賦形剤を含有 する処方を打錠することにより製造される圧縮錠剤が挙げられる。これらの賦形 剤としては、結合剤、崩壊剤、充填剤、または希釈剤および潤滑剤が挙げられる 。フィルム被覆した錠剤は、フィルム被覆をされた圧縮錠剤である。一例として 、被覆が胃では溶けないために薬剤を腸に送達させうる腸溶被覆錠剤が挙げられ る。長時間にわたり薬剤を放出させうる徐放性錠剤も知られている。 上記の両剤形において、通常には、薬剤は胃腸管（ＧＩ管）に到達し、胃腸の 膜を通って血流中へ拡散する。錠剤剤形中に含有されている薬剤は、ＧＩ管にお いて、崩壊剤により崩壊して血流中に入るであろうし、カプセル剤形は、薬剤は 血流中に入る前に溶解するであろう。 しかしながら、薬剤および他の巨大分子の細胞中への送達における主な問題は 、細胞質膜によりもたらされる透過性障壁である。錠剤またはカプセルからなる 医薬剤形は、特に、毒素のごときポリペプチド、酵素または抗体、あるいはＤＮ ＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドよりなる可能性のある巨大分子に関し ては、該透過性障壁を通ることができない。 種々の方法が、巨大分子の細胞内への送達に用いられてきた。これらの方法と しては、マイクロインジェクション、溶解剤または高圧電場による透過およびリ ン酸カルシウムの誘導的取り込みまたはポリエチレングリコール共沈が挙げられ る。送達担体と細胞質膜との融合による細胞内への導入は、リポソームおよび再 構成ウイルス外套（ＲＶＥｓ）を用いて行われる。生ウイルスベクターおよび他 の加工されたウイルス性送達担体も使用されてきた。これらの多くの方法が、巨 大分子の培養細胞へのインビトロ送達には有用であるが、そのうちのわずかの方 法しかインビトロでの巨大分子送達にうまく適用されていない。 ＲＶＥｓは、無処理のウイルスを界面活性剤中に可溶化し、界面活性剤を除去 する際にウイルス外套を再構成することにより形成されるウイルス外套からなる 。巨大分子を含む治療薬の存在下においてＲＶＥｓを形成することができ、これ をカプセルに封入し、インビトロおよびインビボにおける薬剤送達に使用するこ とができる。巨大分子に関するカプセル封入効率は、リポソームに関する効率よ りも低い（３〜５％）が、ＲＶＥ膜中のウイルススパイク糖蛋白の存在により、 送達効率および細胞標的率は高い。スパイク糖蛋白は、標的細胞の細胞膜にある 受容体を認識する。特異的な受容体を欠く細胞は、ＲＶＥｓによっては認識され ず、それゆえ、送達の標的にならない。スパイク糖蛋白はまた、ＲＶＥと細胞膜 との融合を促進する融合ドメインを有している。スパイク糖蛋白への種々のリガ ンドの共有結合によりＲＶＥｓの標的特異性を調節する方法は、すでに記載され ており、特異的表面受容体認識ドメインを有する遺伝子工学により得られるキメ ラ付 着蛋白が示唆されている。 ワクチン抗原およびインターロイキンのごとき予防および治療薬剤をコードし ている遺伝子を送達し、そして標的細胞における生産物の合成を効果的に行わせ るために、生ウイルスベクターが、インビトロおよびインビボにおいて使用され ている。治療薬剤をコードしている遺伝子をウイルスゲノムに組み込んで、標的 細胞に感染させて生産物を発現させるのである。 生ＤＮＡウイルスベクターにおいては、ウイルスの感染性を阻害しないゲノム の部位に外来遺伝子を組み込む。標的宿主に対してウイルスの毒性を弱めるよう に操作することもできる。宿主細胞の感染後、ウイルスは、外来産物のみならず ウイルス産物をも発現する。生きた、複製をする送達担体として作られたＤＮＡ ウイルスとしては、ポキシウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポ ヴァウイルス、パルボウイルスおよび昆虫のバキュロウイルスが挙げられる。 生きた、複製をするウイルスベクターは、効果的で効率のよい担体であるが、 疾病を引き起こす危険性および標的でない種の感染による潜在的な環境汚染の危 険性のために、それらは、通常、一般的なヒトまたは家畜用途には不適である。 ＤＮＡウイルスはまた、宿主遺伝子の構造を修飾し、腫瘍および関連疾患を誘発 する危険性をもたらす可能性のある組み込みエレメントを有していることがある 。 動物細胞に外来遺伝子を送達するのに用いられるＲＮＡウイルスとしては、レ トロウイルス、アルファウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイル スおよびインフルエンザウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、通 常、レトロウイルスの末端ドメイン（ＬＴＲｓ）およびアッセンブリーエレメン ト（ｐｓｉ領域）を含み、外来遺伝子の暗号領域を有するＤＮＡ分子でのヘルパ ー細胞のトランスフェクションにより構築される。ヘルパー細胞は、レトロウイ ルスの構造的蛋白を発現する。トランスフェクションされたＤＮＡ分子をヘルパ ー細胞のＤＮＡ中に組み込むと、修飾レトロウイルスゲノムに対応したＲＮＡ分 子が発現される。外来遺伝子を含んでいる修飾ゲノムを、ヘルパー細胞において 発現された構造的蛋白を用いることにより、レトロウイルス様粒子中に集めるこ とができる。ＤＮＡに転写され、宿主染色体に組み込まれ、ついで、宿主細胞に より発現されうるＲＮＡの形態にして外来遺伝子を細胞中に送達するために、レ トロウイルスベクターを用いることができる。レトロウイルスベクターは、有用 な研究室での道具であり、特に、遺伝子治療に使用されてきたが、宿主遺伝子の 構造が修飾されて腫瘍および関連疾患を生じうるという懸念により一般的な利用 は制限されている。 アルファウイルスであるシンドビスは、インビトロにおける動物細胞中での外 来遺伝子の発現のための送達担体として用いられてきた。シンドビスウイルスは 、ヒトの熱病を引き起こし、昆虫に噛まれることにより伝達される。レトロウイ ルスとは異なり、シンドビスウイルスは、ＤＮＡを合成せず、感染動物において 腫瘍を誘導しない。ゲノムからカプシド構造蛋白をコードしている遺伝子を除去 し、外来遺伝子と置換することによりシンドビスウイルスベクターが構築されて きた。しかしながら、（＋）センスＲＮＡウイルスとしては、シンドビスは、粒 子の構成成分としてのウイルスＲＮＡトランスクリプターゼを担持していない。 標的細胞中での外来遺伝子の効果的な発現には、ゲノムの５’側の３分の２にお いてコードされているウイルスレプリカーゼおよびトランスクリプターゼ成分が 必要である。よって、インビボにおける治療薬の送達のためのシンドビス発現ベ クターの使用には３つの不利な点がある：（i）あるウイルス蛋白（レプリカー ゼおよびトランスクリプターゼ蛋白）の発現が起こらないと、治療薬をコードし ている遺伝子は送達され発現されない；（ii）感染性ヘルパーウイルスの不存在 下における外来遺伝子の挿入用のクローニング容量が３４７５ヌクレオチドに限 定されており；かつ（iii）ベクター調製中に該ベクターとヘルパーウイルスと の間で起こる組換えのために、野生型感染性ウイルスに汚染される。 インフルエンザウイルスＡウイルスＮＳ遺伝子を外来インジケーター遺伝子と 置換したインフルエンザウイルスが記載されている。哺乳動物細胞を外来遺伝子 でトランスフェクションした場合、精製インフルエンザウイルスポリメラーゼ複 合体およびヘルパーウイルス、ならびに組換え型ウイルス粒子が形成される。シ ンドビスベクターと同様に、上記組換え型インフルエンザウイルスベクターは、 標的細胞中においてベクターはインフルエンザ蛋白を発現する能力を保持してお り、生ウイルスとの組換えにより毒性に戻り得るという不利な点を有する。 パトネイク（Pattnaik）およびウェルツ（Wertz）（プロシーディングス・オ ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl. Acad.Sci.USA）第８８巻，１３７９〜１３８３頁（１９９１年））は、５種の口 内炎ウイルスすべてを発現するためのベクターを有する細胞にＤＩ粒子を感染さ せることにより生産される蛋白感染性欠陥干渉性（ＤＩ）水泡性口内炎ウイルス 粒子を記載している。 他の組換え型（−）センスＲＮＡウイルス粒子は、パーク（park）ら（プロシ ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエス エイ第８８巻，５５３７〜５５４１頁（１９９１年））およびコリンズ（Collin s）ら（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン シズ・ユーエスエイ第８８巻，９６６３〜９６６７頁（１９９１年））により記 載されている。これらの刊行物は、それぞれ、外来遺伝子を包み込むセンダイウ イルス粒子および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）粒子を記載している。しかし ながら、両方の例において、組換え型ウイルス粒子の形成は、感染性ウイルス粒 子の生産を引き起こす生センダイウイルスまたはＲＳＶ粒子での同時トランスフ ェクションに依存していた。よって、ウイルス感染による危険性のために、パー クらおよびコリンズらにより記載された方法は、外来遺伝子を標的細胞に送達す るには不適である。 レトロウイルスベクターを用いるインビボにおけるケラチノサイトへの治療蛋 白の送達は、抗−白血病および抗−腫瘍薬として有用な蛋白薬剤配列を含んでい るレトロウイルス外套中の薬剤送達用ウイルス粒子と同様に知られている。ワク チン抗原送達用のポキシウイルス発現系およびウイルスベクターを用いて遺伝物 質を脳細胞中に送達するための系も記載されている。 上記先行技術は、蛋白性治療または予防薬をコードしている外来遺伝子のため のウイルスベクター送達系は新しいものではないことを明らかにするが、それら の遺伝子のインビボでの使用に関する困難性が残っている。生ウイルスベクター は、毒性に戻り、宿主において望ましくない効果を引き起こすか、または非標的 宿主中に拡散する可能性がある。複製をしないレトロウイルスベクターは、宿主 染色体への変化に関連した危険性を有しており、それにより腫瘍が引き起こされ 、利用可能な他のＲＮＡウイルス送達系の適用範囲が制限され、さらに、外来遺 伝子のみならずある種のウイルス生産物も発現されるという不利な点もある。 ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）と呼ばれる粒子に関する記載は、先行技術に包含 され、該粒子は、培養真核細胞においてウイルス構造遺伝子を発現させることに より構築される。該方法を用いていくつかの動物およびヒトウイルスの合成ＶＬ Ｐｓが構築されている。例えば、ポリオウイルスの完全なポリシストロニックｍ ＲＮＡのバキュロウイルスの多面体遺伝子中への挿入が報告されている。組換え 型バキュロウイルスに感染した昆虫細胞は、ポリオウイルスのポリ蛋白を合成し プロセッシングし、さらに「空の」ポリオウイルス様粒子を生成した。これらの 合成された「空の」カプシドは、ＲＮＡを有しておらず、感染性でなかったが、 いくつかの面において完全ウイルスと同様であった。同様の方法を用いて、ブル ータング、Ｂ型肝炎ウイルスおよびウシ免疫不全ウイルスをはじめとする他のい くつかのウイルスのコア様粒子（ＣＬＰｓ）およびＶＬＰｓが構築されている。 現在に至るまで、この方法により作られる粒子は、蛋白−蛋白相互作用のみによ ってのみ生じ、一定の核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含んでいない。それゆ え、粒子の集合過程の開始にＲＮＡゲノムまたはゲノムフラグメントを必要とす ると思われる（−）センスＲＮＡウイルスのＶＬＰｓの形成には、該方法は用い られていなかった。 感染性ウイルス粒子を、ある種のウイルスの全ゲノムを表しているｃＤＮＡク ローンから回収することができることも示されている。この方法において、真核 細胞において作動可能なプロモーターを有するプラスミドベクター中にｃＤＮＡ を挿入する。かかるベクターでの真核細胞のトランスフェクションは、感染性ウ イルスの生産をもたらす。この一般的なアプローチは、ポリオウイルス、シンド ビスウイルスおよびブロメモザイクウイルスをはじめとする多くのヒト、動物お よび植物ウイルスに関して使用されてきた。しかしながら、該方法は、ｍＲＮＡ として直接的に機能するゲノムを有するある種のＤＮＡウイルスおよびセンス （＋）ＲＮＡウイルスに対してのみ用いられてきたにすぎない。 発明の概要 本発明の目的は、外来遺伝子を動物またはヒトの細胞に送達するための効果的 かつ完全な非感染性の系を提供することである。外来遺伝子は（−）センスＲＮ Ａの形態であろう。 本発明の第１の具体例によれば、外来遺伝子を該外来遺伝子発現用標的細胞に 送達するためのベクターであって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白から 構築されたウイルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれている（−）センス ＲＮＡゲノムであって１種またはそれ以上の外来遺伝子を含んでいるが該（−） センスＲＮＡウイルスの複製に関する遺伝子を含んでいない（−）センスＲＮＡ ゲノムからなるベクターが提供される。 本発明の第２の態様によれば、外来遺伝子を該外来遺伝子発現用標的細胞に送 達するためのベクターであって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白から構 築されたウイルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれている（−）センスＲ ＮＡゲノムであって該（−）センスＲＮＡゲノムが１種またはそれ以上の外来遺 伝子を含んでいるが該（−）センスＲＮＡウイルスの複製に関する遺伝子を含ん でいない（−）センスＲＮＡゲノムからなるベクターの製造方法であって、以下 のステップ： ｉ）該（−）センスＲＮＡゲノムに対応するＤＮＡを含んでいるＤＮＡ分子を 含んでいる発現ベクターを製造し； ii）ステップ（i）で製造された発現ベクターを、ウイルス様粒子の形成のた めの蛋白を発現させるためのＤＮＡと一緒に真核宿主細胞中に導入し； iii）該（−）センスＲＮＡゲノムおよび該蛋白を発現しうる条件下で真核細 胞を培養し、該（−）センスＲＮＡゲノムをウイルス様粒子中に取り込ませ、つ いで； iv）該ウイルス様粒子をステップ（iii）の該真核細胞培養物から収集するか らなる製造方法が提供される。 本発明の第３の具体例によれば、外来遺伝子を該外来遺伝子発現用標的細胞に 送達するためのベクターであって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白から 構築されたウイルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれている（−）センス ＲＮＡゲノムであって１種またはそれ以上の外来遺伝子を含んでいるが該（−） センスＲＮＡウイルスの複製に関する遺伝子を含んでいない（−）センスＲＮＡ ゲノムからなるベクターを伴った医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント および／または賦形剤からなる医薬組成物が提供される。 本発明の第４の具体例によれば、外来遺伝子発現産物を標的細胞に送達する方 法であって、該標的細胞を第１の具体例によるベクターと接触させ、ＲＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼ活性を提供するベクターで該細胞を同時形質転換または同 時トランスフェクションすることからなる方法が提供される。 本発明の第５の具体例によれば、外来遺伝子発現産物を標的細胞に送達する方 法であって、さらに該（−）センスＲＮＡゲノムからの（＋）センスＲＮＡを合 成するためのリボ核蛋白複合体中のポリメラーゼよりなる第１の具体例によるベ クターと該標的細胞とを接触させることからなる方法が提供される。 本発明の第６の具体例によれば、哺乳動物対象の組織の標的細胞に外来遺伝子 発現産物を送達する方法であって、さらに該（−）センスＲＮＡゲノムからの（ ＋）センスＲＮＡを合成するためのリボ核蛋白複合体中のポリメラーゼよりなる 第１の具体例によるベクター、または第３の具体例による医薬組成物を該対象に 投与することからなる方法が提供される。 ゲノムをウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）中に包み込むのを容易ならしめるために 、第１の具体例の（−）センスＲＮＡゲノムは（−）センスＲＮＡウイルスのゲ ノムの末端フラグメントを含んでいる。ＶＬＰｓは、特異的な細胞を標的としこ れに侵入するために必要なウイルス蛋白を含んでおり、好ましくは、外来遺伝子 の（＋）センスＲＮＡ（すなわちｍＲＮＡ）転写物を合成するための蛋白を含ん でいる。ペプチド発現産物は生物学的に活性な分子であり、特異的な薬剤または 免疫原であってよい。同様に、ＶＬＰベクターによっても、標的細胞へのアンチ センスＲＮＡまたは触媒的ＲＮＡの送達が可能になる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明ＶＬＰベクターの製造および標的細胞への遺伝子産物の送達の ためのＶＬＰベクターの使用をスキームとして表した図である。 図２は、５’および３’ドメイン、リボザイムドメインＲ１およびＲ２、なら びに好ましくは図示されたＮｃｏＩ部位のごとき単一の制限エンドヌクレアーゼ 部位に外来遺伝子が挿入されうるフィラードメイン（filler domain）からなる ＤＮＡ構造を示す図である。 図３は、５’および３’ドメイン、リボザイムドメインおよびフィラードメイ ンからなるゲノム構造の製造方法を示す図である。 図４は、図３の工程から得られたゲノム構造からのＶＬＰ粒子の製造方法を示 す図である。以下の略号を制限エンドヌクレアーゼ部位を示すために用いる：Ｂ ，ＢａｍＨＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；およびＳ，ＳｍａＩ。 図５ａないし５ｄは、キメラなＧ蛋白遺伝子の構築およびクローニングにおけ る典型的なステップを示す図である。図５ａは、「アンカー」遺伝子フラグメン トの構築を示し；図５ｂは、「供与体」遺伝子フラグメントの構築を；図５ｃは 、キメラなＧ蛋白遺伝子の構築を；そして図５ｄはキメラなＧ蛋白遺伝子のクロ ーニングを示す。 図６は、ＴＢ２−ＣＡＴゲノム構造を有するバキュロウイルス転移ベクターの 構築のスキームを示す図である。多面体遺伝子プロモーターの位置およびｐＡｃ ＹＭ１ならびに誘導体における該プロモーターからの転写方向を、シンボル「Ｐ 」および隣接した矢印でそれぞれ示す。以下の略号を制限エンドニクレアーゼ部 位を示すために用いる：Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｎ，ＮｃｏＩ；およびＶ，ＥｃｏＲＶ 。 図７は、ＣＡＴおよびＣＡＴ３のＰＣＲ産物の配列を、末端および内部Ｎｃｏ Ｉ制限酵素部位とともに示す図である。ＣＡＴ３配列全体を、上記配列で示した ＣＡＴ配列中のヌクレオチドの相違とともに示す。ＣＡＴ配列は：ＩｌｅからＬ ｅｕへのアミノ酸変化を起こさせる位置３５７におけるヌクレオチド修飾（Ａの かわりにＴ）を有し；ＣＡＴ３遺伝子翻訳ストップコドン（ＴＡＡ）の近 傍に続く狂犬病ウイルス転写終結／ポリアデニル化配列ＣＡＴＧ［Ａ］を有して いない。 本発明実施の最良の様式および他の様式 以下の本発明の記載において、次の略号を用いる： ＣＡＴ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ ＤＩＧ ジゴキシゲニン ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸塩 ＩＰＴＧ イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド ＬＭＴ 低融解温度 ＰＣＲ ポリメラー連鎖鎖反応 ＴＤ ０．８ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌおよび０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 からなる溶液であって、ＨＣｌでｐＨ７．５に調節されオート クレーブされた溶液 ＶＬＰ ウイルス様粒子 Ｘ−ｇａｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクト シド 「外来遺伝子」なる語を、通常は、ＶＬＰベクターにより標的とされる特異的 細胞に存在しないか、または特異的細胞に存在する場合には、本発明ＶＬＰベク ターによる外来遺伝子送達後に得られるレベルに至るまでには発現されない遺伝 子を表すために、以下の記載および請求の範囲に用いる。 （−）センスＲＮＡウイルスに関する別の命名法において、Ｍ１、ＰおよびＮ 遺伝子およびそれぞれの発現産物は、Ｍ２およびＭ遺伝子ならびにそれぞれの発 現産物が等価であるのと同じように等価である。 ＶＬＰベクターを製造し、標的細胞への外来遺伝子発現産物の送達に用いるこ とのできる本発明の好ましい方法は、以下のステップ： （i）（−）センスＲＮＡウイルスの修飾されたゲノムまたはゲノムフラグメ ントに対応するＤＮＡ分子であって、１の外来遺伝子の暗号領域あるいは２種ま たはそれ以上の外来遺伝子の暗号領域に対応する配列を含むＤＮＡ分子を構築し ； （ii）ステップ（i）で製造したＤＮＡ分子を、真核細胞のトランスフェクシ ョンに適した発現ベクター中に挿入し； （iii）ステップ（ii）で製造した組換え型発現ベクターで真核細胞をトラン スフェクションし、同時に（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白を発現するベ クターおよび所望によりＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する蛋白の 発現用ベクターで同じ真核細胞をトランスフェクションし； （iv）ステップ（iii）でトランスフェクションした細胞から、ステップ（i） で構築されたＤＮＡ分子から転写された修飾ゲノムまたはゲノムフラグメントか らなるウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）であって、脂質外套中に封じ込められたリボ 核蛋白複合体を形成するためのウイルス蛋白と複合体化したＶＬＰｓを得、つい で； （v）標的細胞を、ステップ（iv）で得たＶＬＰｓと接触させて外来遺伝子発 現産物を細胞に送達するか、または動物組織の標的細胞にＶＬＰｓを送達するた めの組成物を製造して外来遺伝子発現産物をそれらの細胞に送達する を包含する。 有利には、ステップ（iii）にいう構造蛋白およびＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリ メラーゼ活性を有する蛋白は、狂犬病のＬ蛋白、Ｇ蛋白、Ｎ蛋白、Ｍ１蛋白およ びＭ２蛋白と同様の機能を有する蛋白を包含するものとする。Ｇ蛋白は、修飾さ れた外部ドメインを含んでいるキメラなＧ蛋白であってもよい。よって、ステッ プ（iv）で形成されるるＶＬＰは、ステップ（i）で構築されたＤＮＡ分子から 転写された修飾ゲノムまたはゲノムフラグメントからなり、Ｌ蛋白およびＭ１蛋 白と複合体となっており、さらに、Ｍ２蛋白からなり、かつＧ蛋白を含んでいる 脂質外套中に封じ込められた内部マトリックスにより囲まれたリボ核蛋白複合体 中のＮ蛋白のさやに囲まれている。 該方法は狂犬病ウイルスに限定されないが、構造蛋白、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡ ポリメラーゼ活性を有する蛋白およびサブゲノミックな（−）センスＲＮＡフラ グメントを、分割されたゲノムまたは分割されていないゲノムのいずれかを有す るいかなる（−）センスＲＮＡウイルスからも得ることができる。かかるウイル スとしては、以下の科由来のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない： オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウ イルス科、アレナウイルス科およびフィロウイルス科。好ましいウイルスは、ラ ブドウイルスおよびパラミクソウイルス属由来である。 前記パラグラフに記載した方法のスキームを図１に示す。 上記ステップ（i）で述べたＤＮＡ分子は、典型的には、１種またはそれ以上 の外来遺伝子の暗号領域に対応する配列のほかに、特別な（−）センスＲＮＡウ イルスゲノムの５’末端および３’末端非暗号領域に対応するＤＮＡ配列を含む ドメインからなる。好ましくは、５’および３’ドメインは、ラブドウイルスま たはパラミクソウイルスのゲノムの５’および３’非暗号領域の配列由来である 。 有利には、ＤＮＡ分子は、リボザイムをコードしているドメインを含むもので ある。そのいくつかがハセロフ（Haseloff）およびガーラック（Gerlach），（ ネイチャー（Narture）第３３４巻，５８５〜５９１頁（１９８８年））により 記載されている既知リボザイム構造のいずれのものからもリボザイムドメインを 構築することができる。リボザイムドメインは、上記方法のステップ（iii）を 行っている間は活性であろうし、真核細胞中で発現された（−）ＲＮＡ転写物が ＶＬＰｓの集合に適した構造を有することを保証するであろう。 ＤＮＡ構造中に含まれる外来遺伝子は、開始および終止コドンを有する選択外 来ポリペプチドの完全な暗号領域であってもよく、あるいは機能的ドメインもし くはポリペプチドのドメインに対応する遺伝子のフラグメントであってもよい。 外来遺伝子によりコードされているポリペプチドは、免疫原、治療的または生物 学的に活性なペプチドあるいはポリペプチド、もしくは抗体様分子のごとき人工 的に操作された蛋白であってもよい。別法として、外来遺伝子が、アンチセンス ＲＮＡまたは細胞内ＲＮＡ分子に対して指向される触媒的ＲＮＡをコードしてい てもよい。選択遺伝子またはＤＮＡ分子を形成するための遺伝子の挿入を容易に するために、有利には、例えば、制限酵素部位ＮｃｏＩが通常のＤＮＡ構造中に 含まれる。 ＶＬＰｓ中に効果的に封じ混まれるのに十分なほど該構造を長くするために、 ＤＮＡ分子がウイルスまたは他の起源の配列からなるフィラードメインを含んで いてもよい。フィラードメインは、ＶＬＰｓの形成を可能にする性質を有するい かなるヌクレオチド配列をも構成することができる。好ましくは、フィラードメ インは、（−）ＲＮＡゲノムの５’末端非暗号領域に隣接したラブドオウイルス またはパラミクソウイルスのＬ蛋白暗号領域の一部分由来のフラグメントを構成 するであろう。フィラードメインは、ステップ（iii）で発現されるゲノムが、 ＶＬＰｓを形成するのに十分なサイズであることを保証するであろう。そのサイ ズは、好ましくは、約１０００ヌクレオチドより大きい。 有利には、ＤＮＡ分子は、プラスミドベクターの選択制限酵素部位への挿入に 適した付着末端を有している。 当該方法のステップ（i）に関して、典型的なＤＮＡ構造を図２に示す。 外来遺伝子の運搬に適したＤＮＡ構造は、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９２／００ ３６３号（ＷＩＰＯ公開第ＷＯ９３／０１８３３号）に記載されており、その全 体的な開示を、相互参照により本明細書に取り入れる。その構造であるＴＢ２は 、上記ステップ（ii）記載のように真核細胞発現ベクター中に取り入れられ、上 記ステップ（iii）ないし（v）記載のように用いられた後、ＶＬＰｓの形成を可 能にする。ＴＢ−２構造のＮｃｏＩ部位への外来遺伝子または遺伝子の取り込み により、真核細胞における外来遺伝子の発現のための外来遺伝子送達用ベクター として用いることのできる狂犬病ＶＬＰの上記ステップ（i）ないし（v）による 構築が可能となる。 ＴＢ−２において、５’および３’ドメインは、狂犬病ウイルス（ＰＶおよび ＣＶＳ株）のゲノムの５’および３’末端領域の既知ヌクレオチド配列由来であ る。Ｒ１ドメインは、ＴＢ−２ＤＮＡ構造の（−）ＲＮＡ転写物中の部位を標的 とするよう設計される。転写物中のＲ１リボザイムは、ＲＮＡを開裂して転写物 の外側の部分を除去し、その結果、転写物の５’末端が狂犬病ウイルスゲノムの ５’末端に対応またはほぼ対応することを保証するであろう。同様に、Ｒ２リボ ザイム ドメインは、ＴＢ−２ＤＮＡ構造の（−）ＲＮＡ転写物中の部位を標的とするよ うに設計される。Ｒ２リボザイムは、ＲＮＡを開裂して転写物の外側の部分（Ｒ ２ドメインを含む）を除去し、その結果、転写物の３’末端が狂犬病ウイルスゲ ノムの３’末端に対応またはほぼ対応することを保証するであろう。ＴＢ−２構 造中のフィラードメインは、狂犬病ウイルス（ＰＶ株）のＬ蛋白遺伝子の５’末 端における１１６７個のヌクレオチドからなる既知ヌクレオチド配列由来である 。さらに、ＴＢ−２構造は、いかなる選択外来遺伝子または遺伝子でも挿入され うるＮｃｏＩ部位を有している。（−）センスＲＮＡウイルスの修飾されたゲノ ムからなるＤＮＡ分子の製造を、例として、狂犬病ウイルスゲノム由来のＴＢ− ２ＤＮＡ分子を用いて、図３に示す。ＶＬＰｓの製造のためのかかる分子の使用 を図４に示す。 図３に示す方法によれば、ＴＢ−２ＤＮＡは、３つのフラグメント（図３中、 フラグメントＡ、フラグメントＢおよびフラグメントＣ）から構築される。フラ グメントＡは、ＴＢ−２の５’ドメインおよびＲ１ドメインを含み、重複相補的 オリゴヌクレオチドから調製される。適当なオリゴヌクレオチドは、ＰＪＷ．５ Ｒ１ＡおよびＰＪＷ．５Ｒ１Ｂである。以下に、当該方法の他のステップにおけ る使用に適した他のオリゴヌクレオチドとともに配列を示す。 オリゴヌクレオチドＰＪＷ．５Ｒ１ＡおよびＰＪＷ．５Ｒ１Ｂをアニーリング し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を充填してブラントエンドの所望配列 二本鎖ＤＮＡ分子を得、ついで、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋の ごとき適当なプラスミドベクターのＳｍａＩ部位中に組み込んでクローニングす ることができる。ついで、適当な制限酵素、例えば、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ Ｉを用いてＤＮＡをベクターから切り出して所望の方向の付着末端を有する所望 フラグメントを得ることができる（図３のフラグメントＡ）。 フラグメントＣは、ＴＢ−２の３’ドメイン、Ｒ２ドメインおよび外来遺伝子 挿入部位（ＮｃｏＩ部位）を有し、重複相補的オリゴヌクレオチドプライマーＰ ＪＷ．３Ｒ２ＡおよびＰＪＷ．３Ｒ２Ｂから構築される。フラグメントＡの構築 について記載したのと同様の方法により、該オリゴヌクレオチドをアニーリング し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を充填してブラントエンドの所望配列 二本鎖ＤＮＡ分子を得、ついで、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋の ごとき適当なプラスミドベクターのＳｍａＩ部位中に組み込んでクローニングす ることができる。ついで、適当な制限酵素、例えば、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ を用いてＤＮＡをベクターから切り出して所望の方向の付着末端を有する所望フ ラグメントを得ることができる（図３のフラグメントＣ）。 フラグメントＢは、フィラードメインを含み、これをプライマーＰＪＷ．Ｌ２ Ｒ（上）および逆転写酵素を用いて、例えば、狂犬病ウイルス（ＰＶ株）のゲノ ムから構築してＬ蛋白遺伝子の所望部分の１本鎖ｃＤＮＡコピーを調製し、つい で、プライマーＰＪＷ．Ｌ２ＲおよびＰＪＷ．Ｌ４Ｒ（上）ならびにポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて所望ヌクレオチド配列の二本鎖ＤＮＡ分子を増幅 することができる。ついで、該ＤＮＡ分子を、例えば、ｐＵＣ８のごとき適当な プラスミドベクターのＳｍａＩ部位中に組み込みクローニングすることができる 。ついで、適当な制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩおよびＰＳＴＩを用いてＤＮＡ をベクターから切り出して所望の方向の付着末端を有する所望フラグメントを得 ることができる（図３のフラグメントＢ）。 ついで、フラグメントＡ、フラグメントＢおよびフラグメントＣをＴ４ＤＮＡ リガーゼでライゲーションして所望の方向に付着末端を結合することによりＴＢ −２ＤＮＡ構造を組み立てる（図３）。 狂犬病ＶＬＰｓを製造するためには、ＴＢ−２ＤＮＡ構造を（−）センスＲＮＡ を合成するためのベクター中に挿入する。有利には、バキュロウイルス発現ベク ターを用いて昆虫細胞中で（−）センスＲＮＡを合成する。図４に示すように、 ＴＢ−２構造を、ｐＡｃＵＷ３１のごときバキュロウイルス転移ベクターのＢａ ｍＨＩ部位中に挿入してｐＡｃＵＷ３１．ＴＢ２を得る。ＴＢ−２（−）センス ＲＮＡを発現できる組換え型バキュロウイルスを、昆虫細胞中でのｐＡｃＵＷ３ １．ＴＢ２とＡｃＮＰＶのごときバキュロウイルスとの組換えにより形成してＡ ｃＮＰＶ．ＴＢ２を得る。しかしながら、該転移ベクターは、Ｐｏｌおよびｐ１ ０のごときバキュロウイルスプロモーターを含むいかなる転移ベクターであって もよい。 （−）センスＲＮＡ修飾ゲノムまたはゲノムフラグメントを含んでいる狂犬病 ウイルスＶＬＰｓを、図４に示すように、組換え型バキュロウイルスＡｃＮＰＶ ．ＴＢ２および狂犬病ウイルスのＬ蛋白、Ｇ蛋白、Ｎ蛋白、Ｍ１蛋白およびＭ２ 蛋白を発現する他の組換え型バキュロウイルスでの昆虫細胞の同時感染により製 造する。 狂犬病ウイルスのＧ蛋白およびＮ蛋白を発現する組換え型バキュロウイルスの 製造方法は、プレハウド（Prehaud）ら，（１９８９年）ウイロロジー（Virolog y）第１７３巻，３９０〜３９９頁、およびプレハウドら，（１９９０年）ウイ ロロジー第１７８巻，１８６〜４９７頁に記載されており、狂犬病ウイルスのＮ 、Ｍ１、Ｍ２およびＧ蛋白のバキュロウイルス発現は、プレハウドら，（１９９ ２年）ウイロロジー第１８９巻，７６６〜７７０頁に開示されている。これらの 全開示を、相互参照により本明細書に取り込む。同様の方法を用いて昆虫細胞中 で狂犬病ウイルスのＬ蛋白を発現する組換え型バキュロウイルスを製造すること ができる。Ｌ遺伝子の配列は、トード（Tordo）ら，（１９８８年）ウイロロジ ー第１６５巻，５６５〜５７６頁に開示されている。既知遺伝子配列から、当業 者は、容易に、他の（−）センスＲＮＡウイルス由来の蛋白を発現するためのベ クターを製造することができる。 本発明方法の上記ステップ（i）に示すように、１種またはそれ以上の外来遺 伝子がＤＮＡ分子中に包含される。一例としてＴＢ−２構造を用いて、構造を修 飾して、ＮｃｏＩ部位に選択遺伝子または遺伝子群を挿入することにより、いか なる選択外来遺伝子または遺伝子群を取り込ませてもよい。ＮｃｏＩ部位を用い ることにより、選択遺伝子または遺伝子群を構造中に置くことができ、その結果 、開始コドンは、末端ドメインが由来するウイルスの核蛋白（Ｎ）遺伝子の開始 コドンの代わりとなる。しかしながら、外来遺伝子または遺伝子群を、フィラー ドメインが存在すればフィラードメイン中の、あるいは（−）センスＲＮＡゲノ ムの５’または３’ドメインに対応するＤＮＡ配列の近傍の、いかなる適当な部 位に挿入してもよい。 好ましくは、外来遺伝子からなるＤＮＡは、開始コドン、終止コドンおよび選 択外来遺伝子の暗号領域、狂犬病ウイルスのＮ蛋白ｍＲＮＡのポリアデニル化部 位を含む３’非暗号領域の全部または一部、ならびにＤＮＡ分子中へのＤＮＡの 挿入に適した付着末端を含んでいる。最後に述べた特徴の一例として、ＤＮＡは 、ＴＢ−２構造のＮｃｏＩ部位へのＤＮＡ挿入用のＮｃｏＩ制限末端を有する。 外来遺伝子からなるＤＮＡがＤＮＡ分子中へ挿入されると、標的細胞中で形成さ れる（＋）センスＲＮＡは外来遺伝子のセンス鎖（sense strand）を有するよう になるということが、当業者に理解されよう。 当該分野でよく知られた分子クローニングについての確立された方法により、 外来遺伝子を得ることができる。３’非暗号領域、ポリアデニル化部位および付 着末端の付加を、例えば、ＰＣＲおよび所望配列を有する適当なオリゴヌクレオ チドプライマーを用いて行うことができる。遺伝子からなるＤＮＡへのオリゴヌ クレオチドリンカーのライゲーションのごとき当該分野で知られている他の修飾 方法も使用することができる。 狂犬病ＶＬＰｓの製造のための上記方法は、他のいかなる（−）センス未分割 （unsegmented）ＲＮＡウイルス、特に、ラブドウイルスおよびパラミクソウイ ルスにも適用することができることが理解されよう。必然的には、所望ＶＬＰは 、必要なアッセンブリーおよびＤＮＡ構造の５’および３’ドメインにより提供 され る転写信号を含む外来遺伝子または遺伝子群を含んでいる適当に修飾されたゲノ ムまたはゲノム断片を有するであろう。ＲＮＡ転写物が適当な末端配列を有する ことを保証するために、リボゾームドメインＲ１およびＲ２を提供することがで きる。選択外来遺伝子を、ＤＮＡ構造中のいかなる適当な部位に挿入することも できる。ＤＮＡ構造のＲＮＡ転写物は、同種の（−）センスＲＮＡウイルスの構 造蛋白とともに真核細胞中で同時発現された場合、ＶＬＰ中に取り込まれる。 本発明方法のステップ（v）に記載したように、外来遺伝子を含む（−）セン スゲノムからなるＶＬＰベクターを用いて外来遺伝子を真核細胞に送達し、該標 的細胞において該外来遺伝子のポリペプチド産物またはＲＮＡを発現させること ができる。 真核細胞における外来遺伝子の送達および発現は、細胞表面上の特異的受容体 へのＶＬＰｓの吸着、およびそれに続く細胞質中へのＶＬＰｓの侵入により起こ るであろうということが理解されよう。有利には、外来遺伝子の発現は、標的細 胞中で活性化されるＶＬＰのリボ核蛋白複合体の成分により起こる。詳細には、 リボ核蛋白複合体は、狂犬病ウイルスのＬ蛋白のごときＲＮＡ−依存性ＲＮＡポ リメラーゼを有している。しかしながら、リボ核蛋白複合体におけるＲＮＡ−依 存性ＲＮＡポリメラーゼの存在は、不可欠なものではなく、該活性は、ＲＮＡ− 依存性ＲＮＡポリメラーゼが発現されるベクターとともに標的細胞を同時トラン スフェクションすることにより提供される。ベクターは、プラスミドまたはウイ ルスであってよい。典型的には、該ベクターは、同種の（−）センスＲＮＡウイ ルスである。 ウイルスによる細胞認識および細胞中への侵入は、ウイルス表面の外套糖蛋白 の機能であることは知られている。狂犬病ウイルスおよび他の（−）センスＲＮ Ａウイルスの場合、この機能はＧ蛋白により保存されている。それゆえ、本発明 ＶＬＰベクターの標的細胞特異性は、外套糖蛋白の構造を修飾することにより変 化されることができる。このことを、上記方法のステップ（iii）を行っている 間、外套糖蛋白遺伝子（遺伝子群）と置き換えることのできるキメラな外套蛋白 遺の伝子を構築することにより行うことができる。キメラなウイスル糖蛋白の構 築および発現方法は知られており、例えば、パディントン（Puddington）ら，プ ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ第８４ 巻，２７５６〜２７６０頁（１９８７年）、シューバート（Schubert）ら，ジャ ーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）第６６巻，１５７９〜１５８９頁（１ ９９２年）およびオウエンス（Owens）ならびにローズ（Rose），ジャーナル・ オブ・ウイロロジー第６７巻，３６０〜３６５頁（１９９３年）により記載され ている。キメラな糖蛋白遺伝子の構築方法を図５ａないし図５ｄに示す。この説 明図において、例えば、狂犬病ウイルスおよびラブドウイルス、水泡性口内炎ウ イルス（ＶＳＶ）の外套糖蛋白遺伝子から、キメラな糖蛋白遺伝子のヌクレオチ ド配列が構築される。示されたキメラな遺伝子は、狂犬病ウイルスの糖蛋白の内 部およびトランスメンブランドメインを保持しているが、ＶＳＶの外部ドメイン を含んでいる。該キメラ遺伝子成分を、有利には、オリゴヌクレオチドプライマ ーを用いる鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅により合成する。かかるプライマーを、「オ リゴ２１」および「オリゴ２４」として図５ａおよび５ｂに示す。発現ベクター 中において、キメラな糖蛋白遺伝子を、狂犬病Ｇ蛋白遺伝子と置き換えることが でき、例えば、組み替え型バキュロウイルスを、狂犬病ＶＬＰベクターの構築に 用いることができる。かかるキメラな構造を用いて形成されたＶＬＰｓは、ＶＳ Ｖ糖蛋白により認識された細胞に吸着し、侵入するであろう。かかる方法を用い て、ＶＬＰｓの表面構造に含まれうるいかなる選択外部ドメインをも含んでいる キメラな外套蛋白を構築することができる。ＶＬＰｓが、修飾された外部ドメイ ンに対する受容体を有する特異的細胞に吸着し、侵入し、外来遺伝子をその中で 発現できるように、キメラな構造を選択することができる。 本発明ＶＬＰベクターの標的細胞特異性を変化させるのに用いられうる外部ド メインは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト・免疫不全ウイルス（Ｈ ＩＶ）ｇｐ１６０、およびパラミクソウイルス・赤血球凝集素−ノイラミニダー ゼであるが、これらに限定されない。これとは別に、キメラな外套蛋白は、ＶＬ Ｐが基礎としているウイルスのトランンスメンブランおよび内部ドメインに融合 したウイルス由来の外部ドメインからなっていてもよい。ここに、前者のウ イルスは後者のウイルスと異なる。 上記方法のステップ（ii）に関連して、修飾ゲノムまたはゲノムフラグメント およびＶＬＰ形成のためのウイルス蛋白を発現させるために、いかなる適当なベ クター−宿主細胞系を用いてもよいことが当業者に理解されよう。適当な宿主細 胞としては、ポキシウイルス、乳頭腫ウイルスまたはレトロウイルスベクターを 用いる植物細胞のごとき高等真核細胞、あるいは酵母細胞のごとき下等真核細胞 が挙げられる。しかしながら、好ましい発現系は、組み換え型バキュロウイルス ベクターを有するスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）のご とき昆虫宿主細胞である。 ＴＢ−２構造に基づく狂犬病ＶＬＰｓ発現について記載したのと同様の方法に 従い、他の（−）センスＲＮＡ遺伝子を、バキュロウイルスベクターを用いて項 中細胞中で発現させることができる。昆虫細胞における、（−）センスＲＮＡ転 写物と同種の（−）センスＲＮＡウイルス構造蛋白としてのゲノム構造の同時発 現，によりＶＬＰｓ形成が可能になる。 外来遺伝子を対象とする標的細胞に送達するためには、本発明ＶＬＰベクター を以下のように投与する：粘膜の局部的治療による；組織への筋肉内、皮下、腹 腔内または静脈注射による；あるいは、そのままもしくは酸およびペプシン耐性 カプセルに入れて腸粘膜へ送達することによる。粘膜の局部的治療の例は、経口 、鼻腔内、目、呼吸器、肛門、膣または尿道を経るものである。別法として、イ ンビトロにおいて、ＶＬＰベクターを、細胞または組織にＶＬＰｓを直接接触さ せることにより、細胞または組織に投与してもよい。 本発明ＶＬＰベクターの医薬組成物を、ＶＬＰｓと医薬上許容される担体、希 釈剤、アジュバントまたは賦形剤もしくはそれらの混合物と混合することにより 製造する。 標的細胞または組織の標的細胞に投与するＶＬＰｓの数は、外来遺伝子の発現 産物に依存する。細胞１個あたり１個のＶＬＰで充分である場合もあれば、例え ば、外来遺伝子発現産物がアンチセンスＲＮＡである場合のように、多数のＶＬ Ｐｓが１個の細胞に必要な場合もある。当業者は、外来遺伝子の発現残物を 考慮して、投与すべきＶＬＰｓの数を決定することができる。 本発明に記載し、ラブドウイルスＴＢ−２ゲノムを用いて説明した方法により 、ッヘルパーウイルス、欠陥干渉粒子または転写物複合体なしで、合成（−）セ ンスＲＮＡウイルスのＶＬＰｓを製造することができる。この方法により合成さ れたＶＬＰｓを修飾して、真核細胞中に送達され発現しうる外来遺伝子を有する ようにすることができる。本発明ＶＬＰベクターを修飾して、選択されたタイプ の細胞への吸着および侵入を可能にする外部ドメインを有するようにすることが できる。ＶＬＰｓは、同種の（−）センスＲＮＡウイルス由来の完全な遺伝子を 含んでいないので、合成粒子は非感染性である。 以下の限定的でない実施例により本発明を説明する。特に断らないかぎり、記 載された核酸の単離および取り扱いには、例えば、サムブルック（Sambrook）ら ，「ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）」（第２版），ニ ューヨークのコールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）のコール ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring HarborLabora tory Press）（１９８９年）による標準的方法を用いた。 実施例１ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）受容体遺伝子を含 むＶＬＰゲノム構造を有する組み換え型プラスミドの製造 この実施例において、外来遺伝子を有する狂犬病ウイルスの亜ゲノムフラグメ ントを説明する。国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９２／００３６３号記載のＴＢ−２構 造は、狂犬病ウイルスの亜ゲノムのフラグメントとして用いられ、使用したＣＡ Ｔ受容体遺伝子は外来遺伝子として用いられている。 該組み換え型プラスミドの構築に用いたプラスミドを、以下の起源から得た： ｐＳＶＬ−ＣＡＴ（キャメロン（Cameron）およびジェニングス（Jennings）（ １９８９年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ エンシズ・ユーエスエイ第８６巻，９１３９頁）をオーストラリア，ＮＳＷのノ ース・ライ（North Rye）にあるＣＲＩＳＯ・ディビジョン・オブ・バイオモレ キュラー・エンジニアリング(CRISO division of Biomolecular Engineering ）から 得、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋を米国ウィスコンシン州マディソン（ Madison）のプロメガ・コーポレイション（Promega Corporation）から得、ｐＡ ｃＹＭ１（マツウラ（Matsuura）ら，（１９７８年）ジャーナル・オブ・ジェネ ラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.）第６８巻，１２２３頁）を英国オックスフ ォード（Oxford）のインスティチュート・オブ・ウイロロジー・アンド・エンバ イオロンメンタル・マイクロバイオロジー（Institute of Virology and Envir onmental Microbiology)）から得た。 プラスミドｐＴＢ２は国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９２／００３６３号に記載され ている。ｐＴＢ２のＢａｍＨＩ ＴＢ−２挿入物も、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ９ ２／００３６３号記載のｐＡｃＴＢ２ベクター中に含まれている。ｐＡｃＴＢ２ は、オーストラリア、ＮＳＷ２０７３，パインブル（Pymble），スアキン・スト リート１のオーストラリアン・ガバンメント・アナリティカル・ラボラトリーズ （Australian Government Analytical Laboratories）に、受託番号９２／３２ ５８８の下、寄託されている。 所望のＤＮＡフラグメント（ＣＰＲ１、ＣＰＲ２およびＣＰＲ３）ならびにＤ ＮＡ配列（Ｂａｃ１およびＢａｃ２）をＰＣＲ増幅するために、オリゴヌクレオ チドプライマーを合成した。ＣＰＲ１、ＣＰＲ２およびＣＰＲ３は、ＣＡＴ遺伝 子の末端配列、およびｐＴＢ２のＮｃｏＩ部位中へのサブクローニングを容易に するためのＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を有していた。ＣＰＲ３の場合 は、狂犬病ウイルスＮ−遺伝子転写終結／ポリアデニル化配列（ＣＡＴＡ［Ａ］7 ）を有していた。各オリゴヌクレオチドプライマーの配列は次の通り： Ａ．プラスミドｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴおよびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒの構築 プライマーＣＰＲ１およびＣＰＲ２ならびに増幅用鋳型としてｐＳＶＬ− ＣＡＴ ＤＮＡを用いるＰＣＲにより、ＣＡＴ遺伝子の全長コピーを得た。Ｔａ ｑバッファー、３．５ｍＭ ＭｇＣ１2、各ｄＮＴＰ０．２５ｍＭ、Ｔａｑポリ メラーゼ５ユニット（プロメガ・コーポレイション社製）、各プライマー１μｇ およびｐＳＶＬ−ＣＡＬプラスミドＤＮＡ７．５ｎｇを用いて反応を行った。反 応混合物を８５℃で３分間加熱した後ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加し、９５ ℃で９０秒、５１℃で９０秒、ついで、７２℃で９０秒からなる４０サイクルの 反応に供し、ついで、７２℃で５分間インキュベーションした後２５℃に維持し てＤＮＡ生成物を得た。 ＣＡＴ ＤＮＡ産物を０．８％ＬＭＴアガロースゲルに適用し、分離された約 ０．７ｋｂのＤＮＡバンドを切り出した。同体積のＴＥバッファー（ｐＨ７．６ ）を添加し、混合物を６８℃で５〜８時間、時々ボルテックス撹拌しながらイン キュベーションした。ＤＮＡをフェノールで１回抽出し、フェノール：クロロホ ルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出し、ついで、０．３ Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、担体としてグリコーゲン２０ｍｇ（ベーリ ンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社製）および２．５倍体積のエタ ノールを添加することによりＤＮＡを沈澱させた。−２０℃で３０分インキュベ ーションした後、ＤＮＡを微量遠心分離により集め、７０％エタノールで洗浄し 、ついで、真空乾燥した。 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ伸張により生じる３’−末端アデノシン突出部を 、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウフラグメントに付随する３’→５’エキソヌ クレアーゼ活性を用いて除去した。精製ＤＮＡ生成物を、制限酵素バッファーＨ （ベーリンガー・マンハイム社製）中において２．５ユニットのクレノウフラグ メントと２２℃で１５分間反応させ、上記のごとくフェノール：クロロホルム： イソアミルアルコールで抽出し、沈澱させた。 ＣＡＴ遺伝子ＤＮＡを平滑化し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋（ストラ タジーン（Stratagene）社製）脱リン酸化したＥｃｏＲＶ部位中にライゲーショ ンし、ついで、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅイー・コリ（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ）宿主細胞を形質転換し、ＴＹＭ培地およびアンピシリン、Ｘ−ｇａｌならびに ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上のアンピシリン耐性白色コロニーを選択した 。ＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドを確認し、ｐＢｌｕｅ−ＣＡＴ中の挿入物の 配列を、Ｔ３およびＴ７シークエンス用プライマー（プロメガ・コーポレーショ ン（Promega Corp.）社製）ならびにシクエナーゼTM（ユナイティッド・ステイ ツ・バイオケミカルズ（United States Biochemicals）社製）シークエンス用試 薬を用いてシークエンスを行った。 プラスミドｐＢ１ｕｅ−ＣＡＴを、ＮｃｏＩで部分消化し、得られたＤＮＡフ ラグメントを１．２％ＬＭＴアガロースゲルに溶解した。約０．７ｋｂのＣＡＴ 遺伝子全体を単離し、精製し、青色／白色選択系が使用できないことを上記のご とくｐＴＢ２構造の脱リン酸化ＮｃｏＩ部位中にサブクローニングした。ＣＡＴ 遺伝子を順方向（ｐＴＢ２−ＣＡＴ）および逆方向（ｐＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ）に 挿入した２種のクローンを、図６に示すように選択した。 プラｐＴＢ２−ＣＡＴおよびｐＴＢ２−ＣＡＴ−ＲをＢａｍＨＩで消化してＣ ＡＴ遺伝子を両方向に有しているＴＢ２ ＤＮＡ構造を含む挿入物を得た。約２ ．１ｋｂの挿入物を単離し、上記のごとく精製し、バキュロウイルス転移ベクタ ーｐＡｃＹＭ１の脱リン酸化したＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした。組 換え型プラスミドを同定し、組換え型ｐＡｃＹＭ１ベクターの作りかえられた２ つのＢａｍＨＩ部位を越えた鎖の伸張を可能にするプライマーＢａｃ１およびＢ ａｃ２で上記のごとくシークエンスを行うことにより、挿入物の方向を確認した 。Ｂａｃ１およびＢａｃ２プライマーの配列は上に示している。所望の方向の挿 入物を有するクローンｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴおよびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒを 選択し、プラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ勾配遠心により精製した。ｐＡｃＴＢ２− ＣＡＴおよびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒの構築を図式的に図６に示す。 Ｂ．プラスミドｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ３およびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ３−Ｒの構 築 プライマーＣＰＲ１およびＣＰＲ３を用いるＰＣＲ増幅によりＣＡＴ遺伝子を プラスミドｐＳＶＬ−ＣＡＴ ＤＮＡから得ること以外は、プラスミド ｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴおよびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒに関して上で述べたのと 全く同じようにしてプラスミドｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ３およびｐＡｃＴＢ２−Ｃ ＡＴ３−Ｒを製造した。これにより、ＴＢ−２中のポリアデニル化配列のほかに ＣＡＴ遺伝子終結コドンのすぐ後に狂犬病ウイルスのポリアデニル化配列（ＣＡ ＴＧ［Ａ］7）を含むこととなった。 プラスミドｐＴＢ２−ＣＡＴおよびｐＴＢ２−ＣＡＴ３中のＣＡＴ遺伝子挿入 物の配列を図７に示す。プラスミドおよび末端ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ 部位の外側のプライマー配列は示していない。 実施例２ ＴＢ２−ＣＡＴゲノム構造を含む組換え型バキュロウイルスの構築 バキュロウイルスＡｃＰＡＫ６をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）（Sp odoptera frugiperda(Sf9)）細胞中で増殖させ、スクロース勾配遠心により精製 した。ＤＮＡを単離し、ＣｓＣｌ勾配遠心により精製し、Ｂｓｕ３６Ｉで消化し て完成させた。リポフェクションTM（ギブコ／ＢＲＬ社製）を用いて、Ｂｓｕ３ ６Ｉで線形化したＡｃＰＡＫ６ ＤＮＡ１００ｎｇおよび４種のプラスミド構造 （ｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ、ｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ、ｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ３ およびｐＡｃＴＢ２−ＣＡＴ３−Ｒ）各１μｇでＳｆ９細胞を同時トランスフェ クションした。細胞を２８℃で４日間インキュベーションし、プラーク選択によ り組換え型バキュロウイルスを同定した。細胞をＸ−ｇａｌで処理して野生型（ 青）を組換え型バキュロウイルスコロニー（白）と区別し、プラークをニュート ラルレッドで染色することにより可視化した。明確に識別できる白色プラークを 選択し、２系の９６ウェルプレートでＳｆ９細胞を２８℃で３〜６日増殖させた 。 ３日後、細胞溶解物を２系培養の１セットから調製し、４種のＴＢ２−ＣＡＴ ゲノム構造の組み込みを確認するためのハイブリダイゼーション分析用とした。 鋳型としてゲル精製したＣＡＴ３ ＰＣＲ生成物１２ｎｇ、ＣＰＲＩおよびＣＰ Ｒ３プライマー０．５μｇ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ およびｄＧＴＰ、０．３２ｍＭ ｄＴＴＰ、８ｎｍｏｌ ＤＩＧ−１１−ｄＵＴ Ｐ（ベーリンガー・マンハイム）、Ｔａｑポリメラーゼ２．５ユニット（プロメ ガ・コーポレイション）、ならびに上記サイクリング温度を用いるＰＣＲにより 、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルしたプローブを調製した。ＤＩＧでラベル したＣＡＴプローブでのドットハイブリダイゼーションにより、ＴＢ２−ＣＡＴ 、ＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ、ＴＢ２−ＣＡＴ３およびＴＢ２−ＣＡＴ３−Ｒゲノム構 造を有する組換え型バキュロウイルスが同定された。 ４日後、所望ゲノム構造を有すると確認された組換え型バキュロウイルスに感 染した２系の培養物からの培地の一部を用いてＳｆ９細胞の２４ウェルプレート 培養物を感染させ、規模の大きな細胞培養を引き続き感染させるためのウイルス の種ストックを得た。Ｓｆ９細胞培養物を、ＰＣＲ増幅用ＤＮＡ源として感染さ せて切形されたものよりもむしろ完全なＤＮＡ構造が組換え型バキュロウイルス 中に組み込まれたことを確認した。細胞溶解物から得たＤＮＡを、上記Ｂａｃ１ およびＢａｃ２プライマーでのＰＣＲ増幅用鋳型として用いた。増幅生成物を０ ．８％アガロースゲルに溶解し、適当なサイズ（約２．１ｋｂ）のフラグメント を同定し、組換え型バキュロウイルスが全長にわたるＴＢ２−ＣＡＴ、ＴＢ２− ＣＡＴ−Ｒ、ＴＢ２−ＣＡＴ３およびＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ構造を有することを確 認した。 クローン化されたウイルスのストックを得るために、２４ウェル培養物からの ウイルス種ストックを、Ｓｆ９細胞における次のラウンドのプラーク精製に付し た。十分に分離したプラークを選択し、単離し、これを用いて引き続きの操作に 用いるクローン化された組換え型バキュロウイルスのストックを作った。 実施例３ ＴＢ２−ＣＡＴゲノム構造を有する狂犬病ＶＬＰｓの製造 狂犬病ウイルスの構造蛋白（デュアル発現ベクターにおけるＮ／Ｍ１およびＭ ２／Ｇ）を発現する組換え型バクイロウイルスおよびゲノム構造ＴＢ２−ＣＡＴ 、ＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ、ＴＢ２−ＣＡＴ３ならびにＴＢ２−ＣＡＴ３−Ｒ を発現する４種の組換え型バキュロウイルスのそれぞれを用いてＳｆ９細胞の撹 拌培養物を感染させた。２８℃で３日間培養を行い、培養液を集め、遠心分離に より清澄化させ、ベックマン（Beckman）ＳＷ２８ローター中、４℃、１時間、 ２７０００ｒｐｍで超遠心することによりＶＬＰｓを集めた。１ｍＭ ＥＤＴＡ を含有するＴＤバッファー中にＶＬＰｓを再懸濁し、ベックマンＳＷ４０Ｔｉロ ーター中、４℃、３０分、３５０００ｒｐｍでＴＤ緩衝化４０％（ｗ／ｗ）スク ロースのクッション上のＴＤ緩衝化１０％（ｗ／ｗ）スクロース中を通過させて 遠心分離した。界面におけるバンドを集め、希釈し、ベックマンＳＷ４０Ｔｉロ ーター中、４℃、９０分、３００００ｒｐｍで遠心分離することにより半精製Ｖ ＬＰｓを得た。 粉砕したペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナルな狂犬病ウイルス 抗血清を用いるウェスタンブロットによりＶＬＰ形成が示された。狂犬病ウイル スの構造蛋白Ｇ、Ｎ、Ｍ１およびＭ２を、ＣＡＴ遺伝子を含む４種すべてのＴＢ ２ゲノム構造−ＴＢ２−ＣＡＴ、ＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ、ＴＢ２−ＣＡＴ３および ＴＢ２−ＣＡＴ３−Ｒとともに、ＶＬＰ中において同定した。４種のＴＢ２−Ｃ ＡＴゲノム構造を用いて得られたＶＬＰｓ中の構造蛋白の強度を、ＴＢ２ゲノム とともに得られたＶＬＰｓについての強度と視覚的に比較することにより、Ｓｆ ９細胞は、用いたＴＢ２ゲノムの性質にかかわらず、同程度の量のＶＬＰｓを生 成することが示された。 実施例４ ＣＡＴ遺伝子発現の検出 この実施例において、実施例３において製造されたＶＬＰｓでトランスフェク ションされた標的細胞におけるＣＡＴリポーター遺伝子の発現を説明する。ＶＬ ＰｓがＬ遺伝子産物を含まないため、生狂犬病ウイルスで細胞をトランスフェク ションしてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を提供した。かくしてＶＬＰｓ の（−）センスＲＮＡを（＋）センスＲＮＡに変換し、ＣＡＴ発現を可能にした 。 実験１ 乳児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１，ＢＳＲクローン）５ｘ１０5個の単層 を、８ｘ１０6プラーク形成単位の狂犬病ウイルス（ＣＶＳ株）に感染させた。 感染４時間後、感染した単層および未感染のＢＨＫ−２１細胞単層を、下記のゲ ノム構造を有する２ｘ１０9個のＶＬＰｓで処理した：（ａ）ＴＢ２−ＣＡＴ； （ｂ）ＴＢ２−ＣＡＴ３；（ｃ）ＴＢ２−ＣＡＴ−Ｒ；（ｄ）ＴＢ２−ＣＡＴ３ −Ｒで処理；または（ｅ）ＶＬＰｓなし。感染２日後、すべての単層を集め、Ｃ ＡＴ−ＥＬＩＳＡ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いることにより、ＣＡ Ｔ遺伝子についてアッセイした。 実験２ 次の実験において、狂犬病ウイルス感染およびＶＬＰ処理を同時に行うこと以 外は、ＢＨＫ細胞単層を、実施例１記載と同様に処理した：すなわち、感染とＶ ＬＰ処理との間を４時間間隔とすることができなかったのである。 両実験の結果を表Ｉに示す。 表Ｉに示す結果は、外来遺伝子（この場合ＣＡＴ）が、（−）センスＶＬＰゲ ノム中に含まれる配列の情報により発現されうることを示す。発現は、ＴＢ２− ＣＡＴおよびＴＢ２−ＣＡＴ３ ＶＬＰゲノムでトランスフェクションされた細 胞においてのみ検出可能なＣＡＴを伴った外来遺伝子の正しい方向に依存的であ った。また、狂犬病ウイルスに感染した細胞中でのみＣＡＴが検出可能であるた め、発現は、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性に依存的であった （表Ｉの各実験の左欄）。 免疫原性蛋白を発現しうる本発明ＶＬＰｓを、疾病、感染または体内侵入の危 険にさらされている動物あるいはヒトに投与することは、不活性化または弱毒化 ウイルスを含むワクチンと同じやりかたで免疫性を引き起こすであろう。しかし ながら、本発明ＶＬＰｓにはウイルスゲノムのフラグメントしか用いないので、 感染性ウイルスの存在、または毒性への復帰の可能性がないために、利点がある 。同様に、本発明ＶＬＰｓを用いて治療薬を患部または感染部位の組織に送達す ることができる。しかしながら、現在用いられている他の送達系とは異なり、Ｖ ＬＰｓは、特異的細胞または組織を標的とすることができ、標的組織における治 療薬の合成、そして増幅が可能であり、さらに完全に非感染性であり、典型的に 感染性要因の遺伝子を持たない。そのうえ、ＶＬＰｓはＤＮＡ、組み込みエレメ ントおよびＤＮＡ合成能のある酵素を含まないため、腫瘍または関連疾患を引き 起こす可能性のある宿主ゲノムの修飾の危険性がない。 本発明の広い範囲から逸脱することなく、多くの変法が、上記本発明に対して なされうることも理解されよう。 本発明に関する材料の寄託 プラスミドｐＡｃＴＢ２の試料を、オーストラリアのＮＳＷ２０７３、パインブ ル（Pymble）、スアキン・ストリート（Suakin Street）１のオーストラリアン ・ガバンメント・アナリテイカル・ラボラトリーズ（Australian GovernmentAna lytical Laboratories）に、１９９２年９月１５日に寄託し、受託番号９２／３ ２５８８を与えられた。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a delivery system that can be used to deliver (express) a foreign gene to a eukaryotic cell and express the foreign gene. In particular, the delivery system can be used to deliver antisense RNA, catalytic RNA, peptides or polypeptides into special target cells of a selected type. The delivery system can be used in vitro to target eukaryotic cells in culture, or in vivo to prophylactic or therapeutic agents to treat diseased or infected or disease, infection or invasion. It can be delivered to specific cells of the animal or human at risk. BACKGROUND OF THE INVENTION To date, conventional systems for delivering therapeutic agents are primarily manufactured from a gelatin mixture and include a pharmaceutical such as a capsule containing small amounts of other ingredients such as colorants, plasticizers, preservatives and emulsifiers. The drug form was listed. These capsules act as a soluble shell or mantle for delivering the drug to the desired site. Soft capsules are used for liquids, while hard capsules are used for the delivery of free-flowing powders. The microencapsulation method is also well known. Other form dosage forms include compressed tablets made by tabletting a formulation containing certain excipients to facilitate processing and improve drug properties. These excipients include binders, disintegrants, fillers or diluents and lubricants. Film-coated tablets are film-coated compressed tablets. One example is an enteric coated tablet that allows the drug to be delivered to the intestine because the coating does not dissolve in the stomach. A sustained-release tablet capable of releasing a drug over a long period of time is also known. In both of the above dosage forms, the drug normally reaches the gastrointestinal tract (GI tract) and diffuses through the gastrointestinal membrane into the bloodstream. The drug contained in the tablet dosage form will disintegrate into the bloodstream by the disintegrant in the GI tract and the capsule dosage form will dissolve before the drug enters the bloodstream. . However, a major problem in delivering drugs and other macromolecules into cells is the permeability barrier provided by the cytoplasmic membrane. Pharmaceutical dosage forms consisting of tablets or capsules may cross the permeability barrier, especially for macromolecules which may consist of polypeptides such as toxins, enzymes or antibodies, or polynucleotides such as DNA or RNA. Can not. Various methods have been used for intracellular delivery of macromolecules. These methods include microinjection, permeation with lysing agents or high piezoelectric fields and inducible uptake of calcium phosphate or polyethylene glycol co-precipitation. Introduction into the cell by fusion of the delivery carrier and the cytoplasmic membrane is performed using liposomes and reconstituted viral envelopes (RVEs). Live viral vectors and other engineered viral delivery carriers have also been used. Many of these methods are useful for in vitro delivery of macromolecules to cultured cells, but only a few of them have been successfully applied to in vitro macromolecule delivery. RVEs consist of a viral mantle that is formed by solubilizing intact virus in a detergent and reconstituting the virus mantle upon removal of the detergent. RVEs can be formed in the presence of therapeutic agents, including macromolecules, which can be encapsulated and used for drug delivery in vitro and in vivo. The encapsulation efficiency for macromolecules is lower than that for liposomes (3-5%), but the delivery efficiency and cell targeting rate are higher due to the presence of viral spike glycoproteins in the RVE membrane. Spike glycoproteins recognize receptors on the cell membrane of target cells. Cells lacking specific receptors are not recognized by RVEs and are therefore not targets for delivery. The spike glycoprotein also has a fusion domain that promotes fusion of RVE with the cell membrane. Methods for regulating the target specificity of RVEs by covalent attachment of various ligands to spike glycoproteins have been previously described, suggesting genetically engineered chimeric attachment proteins with specific surface receptor recognition domains. There is. Live viral vectors have been used in vitro and in vivo to deliver genes encoding prophylactic and therapeutic agents such as vaccine antigens and interleukins, and to effect efficient product synthesis in target cells. There is. The gene encoding the therapeutic drug is integrated into the viral genome to infect target cells and express the product. In a live DNA virus vector, a foreign gene is integrated at a site in the genome that does not inhibit virus infectivity. It can also be engineered to reduce the virulence of the virus to the target host. After infection of the host cell, the virus expresses not only foreign products but also viral products. DNA viruses made as live, replicating delivery vehicles include poxyvirus, herpesvirus, adenovirus, papovavirus, parvovirus and insect baculovirus. Live, replicating viral vectors are effective and efficient carriers, but due to the risk of causing disease and the potential risk of environmental pollution from the infection of untargeted species, they are usually Not suitable for general human or livestock use. DNA viruses may also carry integration elements that may modify the structure of host genes and pose the risk of inducing tumors and related diseases. RNA viruses used to deliver foreign genes to animal cells include retroviruses, alphaviruses, Semliki Forest virus, Sindbis virus and influenza virus. Retroviral vectors usually contain retroviral terminal domains (LTRs) and assembly elements (psi regions) and are constructed by transfection of helper cells with a DNA molecule containing the coding region for a foreign gene. Helper cells express retroviral structural proteins. Incorporation of the transfected DNA molecule into the helper cell DNA results in the expression of an RNA molecule corresponding to the modified retroviral genome. Modified genomes containing foreign genes can be assembled in retrovirus-like particles by using structural proteins expressed in helper cells. Retroviral vectors can be used to deliver foreign genes into cells in the form of RNA that is transcribed into DNA, integrated into the host chromosome, and then expressed by the host cell. Retroviral vectors have been useful laboratory tools, especially for gene therapy, but their general use is limited by the concern that host gene structure may be modified to cause tumors and related diseases. Has been done. The alphavirus Sindbis has been used as a delivery vehicle for expression of foreign genes in animal cells in vitro. Sindbis virus causes fever in humans and is transmitted by being bitten by insects. Unlike retroviruses, Sindbis virus does not synthesize DNA and does not induce tumors in infected animals. Sindbis virus vectors have been constructed by removing the gene encoding the capsid structural protein from the genome and replacing it with a foreign gene. However, as a (+) sense RNA virus, Sindbis does not carry viral RNA transcriptase as a constituent of particles. Effective expression of foreign genes in target cells requires the viral replicase and transcriptase components encoded in the two-thirds of the 5'end of the genome. Thus, the use of Sindbis expression vectors for delivery of therapeutics in vivo has three disadvantages: (i) the absence of expression of certain viral proteins (replicase and transcriptase proteins) The encoded gene is delivered and not expressed; (ii) the cloning capacity for insertion of a foreign gene in the absence of infectious helper virus is limited to 3475 nucleotides; and (iii) the vector during vector preparation. Due to the recombination between the and helper virus, it is contaminated with wild type infectious virus. Influenza virus A A virus in which the NS gene is replaced with an exogenous indicator gene is described. When mammalian cells are transfected with a foreign gene, purified influenza virus polymerase complex and helper virus, and recombinant viral particles are formed. Similar to the Sindbis vector, the above recombinant influenza virus vector has the disadvantage that the vector retains the ability to express influenza protein in the target cells and can be returned to virulence by recombination with live virus. Have. Pattnaik and Wertz (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 88, 1379-1383 (1991), Described are protein infectious defect interfering (DI) vesicular stomatitis virus particles produced by infecting cells with a vector for expressing all five stomatitis viruses. Other recombinant (-) sense RNA virus particles are described in park et al. (Proceedings of National Academy of Sciences USA 88: 5537-5541 (1991)) and Collins (1991). Collins' et al. (Proceedings of National Academy of Sciences USA 88, 9663-9667 (1991)). These publications describe Sendai virus particles and respiratory syncytial virus (RSV) particles, respectively, which encapsulate foreign genes. However, in both cases, the formation of recombinant viral particles was dependent on co-transfection with live Sendai virus or RSV particles, which causes the production of infectious viral particles. Thus, due to the risk of viral infection, the method described by Park et al. And Collins et al. Is not suitable for delivering foreign genes to target cells. Delivery of therapeutic proteins to keratinocytes in vivo using retroviral vectors is known as well as viral particles for drug delivery in retroviral mantle containing protein drug sequences useful as anti-leukemia and anti-tumor agents. There is. Poxyvirus expression systems for vaccine antigen delivery and systems for delivering genetic material into brain cells using viral vectors have also been described. Although the above prior art reveals that viral vector delivery systems for foreign genes encoding proteinaceous therapeutic or prophylactic agents are not new, there remains difficulty with their use in vivo. ing. Live viral vectors can revert to virulence, cause undesired effects in the host, or spread into non-target hosts. Non-replicating retroviral vectors carry the risks associated with changes to the host chromosomes, which can cause tumors and limit the applicability of other RNA viral delivery systems available and There is also the disadvantage that not only genes but also certain viral products are expressed. A description of particles called virus-like particles (VLPs) is included in the prior art, the particles being constructed by expressing viral structural genes in cultured eukaryotic cells. The method has been used to construct synthetic VLPs of several animal and human viruses. For example, insertion of the complete polycistronic mRNA of poliovirus into the baculovirus polyhedral gene has been reported. Insect cells infected with recombinant baculovirus synthesized and processed the poliovirus polyprotein and produced "empty" poliovirus-like particles. These synthetic "empty" capsids, which had no RNA and were not infectious, were similar in some respects to the whole virus. Similar methods have been used to construct core-like particles (CLPs) and VLPs of several other viruses including bluetongue, hepatitis B virus and bovine immunodeficiency virus. To date, particles made by this method are produced only by protein-protein interactions and do not contain certain nucleic acid molecules (RNA or DNA). Therefore, the method has not been used to form VLPs of (-) sense RNA viruses that appear to require the RNA genome or genomic fragments to initiate the particle assembly process. It has also been shown that infectious viral particles can be recovered from cDNA clones representing the entire genome of certain viruses. In this method, the cDNA is inserted into a plasmid vector having a promoter operable in eukaryotic cells. Transfection of eukaryotic cells with such a vector results in production of infectious virus. This general approach has been used for many human, animal and plant viruses including poliovirus, Sindbis virus and Brome mosaic virus. However, the method has only been used for certain DNA and sense (+) RNA viruses with a genome that functions directly as mRNA. SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide an effective and completely non-infectious system for delivering foreign genes to animal or human cells. The foreign gene will be in the form of the (-) sense RNA. According to the first embodiment of the present invention, there is provided a vector for delivering a foreign gene to a target cell for expressing the foreign gene, comprising a virus-like particle constructed from a structural protein of (-) sense RNA virus. A (-) sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex, which contains one or more foreign genes, but does not contain a gene related to replication of the (-) sense RNA virus (- ) A vector comprising a sense RNA genome is provided. According to the second aspect of the present invention, there is provided a vector for delivering a foreign gene to a target cell for expressing the foreign gene, comprising a ribo in a virus-like particle constructed from a structural protein of (-) sense RNA virus. A (-) sense RNA genome contained in a nucleoprotein complex, wherein the (-) sense RNA genome contains one or more foreign genes, but replication of the (-) sense RNA virus A method for producing a vector consisting of a (-) sense RNA genome which does not contain a gene relating to the following steps: i) Expression comprising a DNA molecule containing a DNA corresponding to the (-) sense RNA genome Ii) Eukaryotic host cells together with the expression vector produced in step (i) together with DNA for expressing proteins for the formation of virus-like particles Iii) culturing a eukaryotic cell under conditions capable of expressing the (-) sense RNA genome and the protein, incorporating the (-) sense RNA genome into a virus-like particle, and then; iv) There is provided a manufacturing method comprising collecting the virus-like particles from the eukaryotic cell culture of step (iii). According to a third embodiment of the present invention, there is provided a vector for delivering a foreign gene to a target cell for expressing the foreign gene, comprising a virus-like particle constructed from a structural protein of (-) sense RNA virus. A (-) sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex, which contains one or more foreign genes, but does not contain a gene related to replication of the (-) sense RNA virus (- ) A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, adjuvant and / or excipient with a vector comprising the sense RNA genome is provided. According to a fourth embodiment of the present invention, there is provided a method of delivering an exogenous gene expression product to a target cell, which comprises contacting the target cell with a vector according to the first embodiment to provide RNA-dependent RNA polymerase activity. There is provided a method comprising co-transforming or co-transfecting the cells with a vector. According to a fifth embodiment of the present invention, there is provided a method for delivering a foreign gene expression product to a target cell, which further comprises a ribonucleoprotein for synthesizing (+) sense RNA from the (-) sense RNA genome. There is provided a method comprising contacting the target cell with a vector according to the first embodiment consisting of a polymerase in a complex. According to a sixth embodiment of the present invention, there is provided a method for delivering a foreign gene expression product to a target cell of a tissue of a mammalian subject, further comprising synthesizing (+) sense RNA from the (-) sense RNA genome. A vector according to the first embodiment, which comprises a polymerase in a ribonucleoprotein complex, or a pharmaceutical composition according to the third embodiment, is provided to the subject. To facilitate encapsulation of the genome in virus-like particles (VLPs), the (-) sense RNA genome of the first embodiment comprises a terminal fragment of the (-) sense RNA virus genome. VLPs contain the viral proteins required to target and invade specific cells, and preferably contain the proteins for synthesizing (+) sense RNA (ie, mRNA) transcripts of foreign genes. I'm out. Peptide expression products are biologically active molecules and may be specific drugs or immunogens. Similarly, VLP vectors also enable delivery of antisense or catalytic RNA to target cells. Brief Description of the Drawings Figure 1 is a schematic representation of the use of VLP vectors for the production of VLP vectors of the invention and delivery of gene products to target cells. Figure 2 is a DNA consisting of 5'and 3'domains, ribozyme domains R1 and R2, and preferably a filler domain into which a foreign gene can be inserted at a single restriction endonuclease site such as the NcoI site shown. It is a figure which shows a structure. FIG. 3 is a diagram showing a method for producing a genomic structure composed of 5 ′ and 3 ′ domains, a ribozyme domain and a filler domain. FIG. 4 is a diagram showing a method for producing VLP particles from the genomic structure obtained from the process of FIG. The following abbreviations are used to indicate restriction endonuclease sites: B, BamHI; E, EcoRI; and S, SmaI. Figures 5a to 5d show typical steps in the construction and cloning of chimeric G protein genes. 5a shows the construction of the "anchor" gene fragment; FIG. 5b shows the construction of the "donor" gene fragment; FIG. 5c shows the construction of the chimeric G protein gene; and FIG. 5d shows the chimeric G protein gene. Shows cloning of. FIG. 6 is a diagram showing a scheme for constructing a baculovirus transfer vector having a TB2-CAT genomic structure. The position of the polyhedron gene promoter and the transcription direction from the promoter in pAc YM1 and its derivatives are indicated by the symbol "P" and the adjacent arrow, respectively. The following abbreviations are used to indicate restriction endonuclease sites: B, BamHI; N, NcoI; and V, EcoRV. FIG. 7 shows the sequences of CAT and CAT3 PCR products along with the terminal and internal Nco I restriction enzyme sites. The entire CAT3 sequence is shown along with the nucleotide differences in the CAT sequence shown above. The CAT sequence has: a nucleotide modification at position 357 (T instead of A) that causes an amino acid change from Ile to Leu; rabies virus transcription termination / polyadenylation adjacent to the CAT3 gene translation stop codon (TAA). It does not have the sequence CATG [A]. BEST MODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION AND OTHER MODES In the following description of the invention, the following abbreviations are used: CAT chloramphenicol acetyltransferase DIG digoxigenin EDTA ethylenediaminetetraacetate IPTG isopropylthio-β-D-galactoside LMT low Melting temperature PCR Polymer chain reaction TD 0.8 mM tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM KCl and 0.7 mM Na 2 HPO Four Which is a solution consisting of VLP virus-like particles X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside "foreign gene" Expression is normally not present in the specific cells targeted by the VLP vector or, if present in the specific cells, to the level obtained after delivery of the foreign gene by the VLP vector of the invention. Used in the following description and claims to refer to genes that are not. In another nomenclature for the (−) sense RNA virus, the M1, P and N genes and their respective expression products are equivalent, as are the M2 and M genes and their respective expression products. A preferred method of the invention that can be used to produce a VLP vector and deliver a foreign gene expression product to a target cell comprises the following steps: (i) to a modified genome or genomic fragment of a (-) sense RNA virus. Constructing a corresponding DNA molecule comprising a coding region of one foreign gene or a sequence corresponding to the coding region of two or more foreign genes; (ii) the DNA produced in step (i) The molecule is inserted into an expression vector suitable for transfection of eukaryotic cells; (iii) transfection of eukaryotic cells with the recombinant expression vector produced in step (ii), and at the same time (-) sense RNA virus. Expressing the structural protein of Escherichia coli and optionally a vector for expressing a protein having RNA-dependent RNA polymerase activity (Iv) virus-like particles (VLPs) consisting of modified genomes or genomic fragments transcribed from the DNA molecule constructed in step (i) from the cells transfected in step (iii); VLPs complexed with a viral protein to form a ribonucleoprotein complex encapsulated in a lipid mantle, and then (v) target cells with VLPs obtained in step (iv) Contacting to deliver the foreign gene expression product to cells, or producing a composition for delivering VLPs to target cells of animal tissue to deliver the foreign gene expression product to those cells. Advantageously, the structural protein and the protein having RNA-dependent RNA polymerase activity referred to in step (iii) include proteins having the same functions as L protein, G protein, N protein, M1 protein and M2 protein of rabies. It shall be. The G protein may be a chimeric G protein containing a modified ectodomain. Therefore, the VLP formed in step (iv) consists of a modified genome or genomic fragment transcribed from the DNA molecule constructed in step (i), is complexed with L protein and M1 protein, and further, It is surrounded by the sheath of the N protein in the ribonucleoprotein complex which is surrounded by an inner matrix which is composed of the M2 protein and which contains a G protein and which contains a lipid mantle. The method is not limited to rabies virus, but has structural proteins, proteins with RNA-dependent RNA polymerase activity and subgenomic (-) sense RNA fragments, either in a split or unsplit genome. It can be obtained from any (-) sense RNA virus. Such viruses include, but are not limited to, viruses from the following families: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae and Filoviridae. Preferred viruses are from the Rhabdovirus and Paramyxovirus genera. The scheme of the method described in the paragraph above is shown in FIG. The DNA molecule described in step (i) above typically comprises, in addition to the sequence corresponding to the coding region of one or more foreign genes, the 5'end of the special (-) sense RNA viral genome and It is composed of a domain containing a DNA sequence corresponding to the 3'terminal non-coding region. Preferably, the 5'and 3'domains are derived from the sequences of the 5'and 3'noncoding regions of the Rhabdovirus or Paramyxovirus genome. Advantageously, the DNA molecule comprises a domain encoding a ribozyme. Construction of ribozyme domains from any of the known ribozyme structures, some of which are described by Haseloff and Gerlach, (Narture 334, 585-591 (1988)). can do. The ribozyme domain will be active during step (iii) of the above method and ensures that the (-) RNA transcript expressed in eukaryotic cells has a structure suitable for assembly of VLPs. Will. The foreign gene contained in the DNA structure may be the complete coding region of a selected foreign polypeptide with start and stop codons, or it may be a fragment of the gene corresponding to the functional domain or the domain of the polypeptide. Good. The polypeptide encoded by the foreign gene may be an immunogen, a therapeutically or biologically active peptide or polypeptide, or an engineered protein such as an antibody-like molecule. Alternatively, the foreign gene may encode antisense RNA or catalytic RNA directed against intracellular RNA molecules. In order to facilitate the insertion of the selection gene or genes to form the DNA molecule, for example the restriction enzyme site NcoI is advantageously included in the normal DNA structure. To elongate the structure sufficiently to be effectively entrapped in VLPs, DNA molecules may include a filler domain consisting of viral or other sequences of origin. The filler domain can constitute any nucleotide sequence that has the property of allowing the formation of VLPs. Preferably, the filler domain will constitute a fragment derived from a portion of the R protein coding region of the rhabdovirus or paramyxovirus flanked by the 5'non-coding region of the (-) RNA genome. The filler domain will ensure that the genome expressed in step (iii) is of sufficient size to form VLPs. Its size is preferably greater than about 1000 nucleotides. Advantageously, the DNA molecule has cohesive ends suitable for insertion into the selective restriction enzyme sites of the plasmid vector. A typical DNA structure for step (i) of the method is shown in FIG. DNA structures suitable for carrying foreign genes are described in International Application No. PCT / AU92 / 00363 (WIPO Publication No. WO93 / 01833), the entire disclosure of which is hereby incorporated by reference. Take in. Its structure, TB2, allows the formation of VLPs after being incorporated into a eukaryotic expression vector as described in step (ii) above and used as described in steps (iii) through (v) above. To do. The above-mentioned steps (i) to (v) of rabies VLP which can be used as a vector for foreign gene delivery for expression of foreign gene in eukaryotic cell by incorporating foreign gene or gene into NcoI site of TB-2 structure It is possible to build by. In TB-2, the 5'and 3'domains are derived from the known nucleotide sequences of the 5'and 3'terminal regions of the rabies virus (PV and CVS strains) genome. The R1 domain is designed to target a site in the (−) RNA transcript of the TB-2 DNA structure. The R1 ribozyme in the transcript cleaves the RNA to remove the outer portion of the transcript, thus ensuring that the 5'end of the transcript corresponds to or nearly corresponds to the 5'end of the rabies virus genome. Will. Similarly, the R2 ribozyme domain is designed to target a site in the (−) RNA transcript of the TB-2 DNA structure. The R2 ribozyme cleaves the RNA to remove the outer portion of the transcript (including the R2 domain) so that the 3'end of the transcript corresponds to or nearly corresponds to the 3'end of the rabies virus genome. Will guarantee. The filler domain in the TB-2 structure is derived from a known nucleotide sequence consisting of 1167 nucleotides at the 5'end of the L protein gene of rabies virus (PV strain). In addition, the TB-2 structure has an NcoI site into which any selected foreign gene or gene can be inserted. The production of a DNA molecule consisting of the modified genome of the (−) sense RNA virus is shown in FIG. 3 using the TB-2 DNA molecule from the rabies virus genome as an example. The use of such molecules for the production of VLPs is shown in Figure 4. According to the method shown in FIG. 3, TB-2 DNA is constructed from three fragments (Fragment A, Fragment B and Fragment C in FIG. 3). Fragment A contains the 5 ′ domain of TB-2 and the R1 domain and is prepared from overlapping complementary oligonucleotides. Suitable oligonucleotides are described in PJW. 5 R1A and PJW. It is 5R1B. The sequences are shown below along with other oligonucleotides suitable for use in other steps of the method. Oligonucleotide PJW. 5R1A and PJW. 5R1B can be annealed and end-filled with T4 DNA polymerase to obtain a blunt-ended double-stranded DNA sequence of the desired sequence, which can then be cloned by incorporating it into the SmaI site of a suitable plasmid vector, such as pBluescriptIIKS +. it can. The DNA can then be excised from the vector using appropriate restriction enzymes such as BamHI and EcoRI to obtain the desired fragment with the cohesive ends in the desired orientation (fragment A in Figure 3). Fragment C has the 3 ′ domain of TB-2, the R2 domain and the foreign gene insertion site (NcoI site), and is an overlapping complementary oligonucleotide primer P JW. 3R2A and PJW. Constructed from 3R2B. By a method similar to that described for the construction of Fragment A, the oligonucleotides were annealed and the ends were filled in with T4 DNA polymerase to give the desired sequence double-stranded DNA molecule at the blunt end, followed by, for example, pBluescriptIIKS +. As such, it can be cloned by incorporating it into the SmaI site of a suitable plasmid vector. The DNA can then be excised from the vector using appropriate restriction enzymes such as BamHI and PstI to obtain the desired fragment with the cohesive ends in the desired orientation (fragment C in Figure 3). Fragment B contains a filler domain, which is used as primer PJW. L2R (top) and reverse transcriptase are used to prepare a single-stranded cDNA copy of the desired portion of the L protein gene, for example, constructed from the genome of rabies virus (PV strain) and then the primer PJW. L2R and PJW. L4R (top) as well as the polymerase chain reaction (PCR) can be used to amplify double-stranded DNA molecules of the desired nucleotide sequence. The DNA molecule can then be integrated and cloned into the SmaI site of a suitable plasmid vector such as pUC8. The DNA can then be excised from the vector using appropriate restriction enzymes such as EcoRI and PSTI to obtain the desired fragment with the cohesive ends in the desired orientation (fragment B in Figure 3). The TB-2 DNA structure is then assembled by ligating Fragment A, Fragment B and Fragment C with T4 DNA ligase and joining the cohesive ends in the desired orientation (FIG. 3). To produce rabies VLPs, the TB-2 DNA structure is inserted into a vector for the synthesis of (-) sense RNA. Advantageously, the baculovirus expression vector is used to synthesize (-) sense RNA in insect cells. As shown in FIG. 4, the TB-2 structure was inserted into the BamHI site of a baculovirus transfer vector such as pAcUW31 to construct pAcUW31. Obtain TB2. Recombinant baculovirus capable of expressing TB-2 (-) sense RNA was transformed into pAcUW3 1. Formed by recombination of baculovirus such as TB2 and AcNPV to form AcNPV. Obtain TB2. However, the transfer vector may be any transfer vector containing a baculovirus promoter such as Pol and p10. Rabies virus VLPs containing (-) sense RNA modified genomes or genomic fragments were transformed into recombinant baculovirus AcNPV. It is prepared by co-infection of insect cells with TB2 and other recombinant baculoviruses expressing L, G, N, M1 and M2 proteins of TB2 and rabies virus. A method for producing a recombinant baculovirus expressing G and N proteins of rabies virus is described in Prehaud et al., (1989) Virology 173, 390-399, and Prehaud et al. (1990) Willology 178, 186-497, and baculovirus expression of N, M1, M2 and G proteins of rabies virus is described in Prehaud et al. (1992) Willology 189, 766-. It is disclosed on page 770. The entire disclosures of these are incorporated herein by cross-reference. A similar method can be used to produce a recombinant baculovirus expressing the L protein of rabies virus in insect cells. The sequence of the L gene is disclosed in Tordo et al., (1988) Willology 165, 565-576. Those skilled in the art can easily produce a vector for expressing a protein derived from another (-) sense RNA virus from the known gene sequence. As indicated in step (i) above of the method of the invention, one or more foreign genes are included in the DNA molecule. Using the TB-2 structure as an example, the structure may be modified to incorporate any selected foreign gene or genes by inserting the selection gene or genes into the NcoI site. By using the NcoI site, a selection gene or genes can be placed in the structure so that the initiation codon replaces the initiation codon of the viral nucleoprotein (N) gene from which the terminal domain is derived. However, the foreign gene or genes are inserted at any suitable site in the filler domain, if present, or near the DNA sequence corresponding to the 5'or 3'domain of the (-) sense RNA genome. May be. Preferably, the DNA consisting of a foreign gene comprises a start codon, a stop codon and a coding region of a selected foreign gene, all or part of a 3'non-coding region containing a polyadenylation site of N protein mRNA of rabies virus, and a DNA molecule in a DNA molecule. It contains cohesive ends suitable for inserting DNA into. As an example of the last-mentioned feature, the DNA has NcoI restriction ends for DNA insertion into the NcoI site of the TB-2 structure. It will be understood by those skilled in the art that when a DNA consisting of a foreign gene is inserted into a DNA molecule, the (+) sense RNA formed in the target cell comes to have the sense strand of the foreign gene. Will be done. The foreign gene can be obtained by established methods for molecular cloning well known in the art. Addition of 3'non-coding regions, polyadenylation sites and sticky ends can be done, for example, using PCR and appropriate oligonucleotide primers with the desired sequence. Other modification methods known in the art can also be used, such as ligation of oligonucleotide linkers to DNA consisting of genes. It will be appreciated that the above method for the production of rabies VLPs can be applied to any other (-) sense unsegmented RNA virus, especially rhabdovirus and paramyxovirus. Inevitably, the desired VLP has an appropriately modified genome or genomic fragment containing a foreign gene or genes containing transcriptional signals provided by the 5'and 3'domains of the required assembly and DNA structure. Will. Ribosome domains R1 and R2 can be provided to ensure that the RNA transcript has the appropriate terminal sequences. The selected foreign gene can be inserted at any suitable site in the DNA structure. RNA transcripts of DNA structure are incorporated into VLPs when co-expressed in eukaryotic cells with structural proteins of the cognate (-) sense RNA virus. As described in step (v) of the method of the present invention, a foreign gene is delivered to a eukaryotic cell using a VLP vector consisting of a (-) sense genome containing the foreign gene, and the polypeptide of the foreign gene is expressed in the target cell. The product or RNA can be expressed. It will be appreciated that delivery and expression of foreign genes in eukaryotic cells will occur by adsorption of VLPs to specific receptors on the cell surface and subsequent entry of VLPs into the cytoplasm. Advantageously, expression of the foreign gene occurs by a component of the ribonucleoprotein complex of VLPs that is activated in the target cell. In particular, the ribonucleoprotein complex has an RNA-dependent RNA polymerase such as the L protein of rabies virus. However, the presence of RNA-dependent RNA polymerase in the ribonucleoprotein complex is not essential and the activity is provided by co-transfecting target cells with a vector in which the RNA-dependent RNA polymerase is expressed. To be done. The vector may be a plasmid or virus. Typically, the vector is a homologous (-) sense RNA virus. Cell recognition and entry into cells by viruses are known to be the function of mantle glycoproteins on the surface of viruses. In the case of rabies virus and other (-) sense RNA viruses, this function is conserved by the G protein. Therefore, the target cell specificity of the VLP vector of the present invention can be altered by modifying the structure of the mantle glycoprotein. This can be done by constructing a chimeric mantle protein gene that can replace the mantle glycoprotein gene (genes) during step (iii) of the above method. Methods for constructing and expressing chimeric viral glycoproteins are known and are described, for example, in Paddington et al., Proceedings of National Academy of Sciences Vol. 84, 2756-2760 (1987), Shu. Schubert et al., Journal of Willology (J. Virol.) Volume 66, pp. 1579-1589 (1992) and Owens and Rose, Journal of Willology Volume 67, 360-365 (1993). A method for constructing a chimeric glycoprotein gene is shown in FIGS. 5a to 5d. In this illustration, for example, a nucleotide sequence of a chimeric glycoprotein gene is constructed from the mantle glycoprotein genes of rabies virus, rhabdovirus, and vesicular stomatitis virus (VSV). The chimeric gene shown retains the internal and transmembrane domains of the rabies virus glycoprotein, but contains the ectodomain of VSV. The chimeric gene component is advantageously synthesized by PCR amplification of template DNA with oligonucleotide primers. Such primers are shown in Figures 5a and 5b as "oligo 21" and "oligo 24". The chimeric glycoprotein gene can be replaced in the expression vector with the rabies G protein gene, eg recombinant baculovirus can be used to construct the rabies VLP vector. VLPs formed using such a chimeric structure will adsorb and enter cells recognized by the VSV glycoprotein. Such methods can be used to construct chimeric mantle proteins that contain any selected ectodomains that may be contained in the surface structure of VLPs. Chimeric structures can be chosen to allow VLPs to adsorb, enter, and express foreign genes in specific cells that have receptors for the modified ectodomain. Ectodomains that can be used to alter the target cell specificity of the VLP vectors of the invention are influenza virus hemagglutinin, human immunodeficiency virus (HIV) gp160, and paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase. However, it is not limited to these. Alternatively, the chimeric mantle protein may consist of a viral-derived ectodomain fused to the transmembrane and interior domains of the VLP-based virus. Here, the former virus is different from the latter virus. It will be understood by those skilled in the art that, in connection with step (ii) of the above method, any suitable vector-host cell system may be used to express the modified genome or genomic fragment and the viral proteins for VLP formation. Will be done. Suitable host cells include higher eukaryotic cells such as plant cells using poxyvirus, papilloma virus or retroviral vectors, or lower eukaryotic cells such as yeast cells. However, a preferred expression system is an insect host cell such as Spodoptera frugiperda carrying a recombinant baculovirus vector. Other (-) sense RNA genes can be expressed in cells using the baculovirus vector according to methods similar to those described for expression of rabies VLPs based on TB-2 structure. Co-expression of the (-) sense RNA transcript and the genomic structure as a homologous (-) sense RNA viral structural protein in insect cells allows VLPs formation. For delivery of foreign genes to target cells of interest, the VLP vector of the invention is administered as follows: by local treatment of the mucosa; by intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal or intravenous injection into tissue; or , Or by delivery to the intestinal mucosa neat or in acid and pepsin resistant capsules. Examples of topical treatments of mucous membranes are oral, intranasal, ocular, respiratory, anal, vaginal or urethral. Alternatively, the VLP vector may be administered to cells or tissues in vitro by contacting the cells or tissues directly with the VLPs. A pharmaceutical composition of the VLP vector of the present invention is produced by mixing VLPs with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, adjuvant or excipient or a mixture thereof. The number of VLPs administered to target cells or tissue target cells depends on the expression product of the foreign gene. In some cases, one VLP per cell may be sufficient, or in many cases multiple VLPs may be required in one cell, for example when the foreign gene expression product is antisense RNA. One of ordinary skill in the art can determine the number of VLPs to administer, taking into account the expression remnants of the foreign gene. By the method described in the present invention and described using the rhabdovirus TB-2 genome, synthetic (-) sense RNA virus VLPs can be produced without the helper virus, defective interfering particles or transcript complexes. . VLPs synthesized by this method can be modified to have a foreign gene that can be delivered and expressed in eukaryotic cells. The VLP vectors of the invention can be modified to have an ectodomain that allows them to adsorb and enter selected types of cells. Since VLPs do not contain the complete gene from the cognate (-) sense RNA virus, synthetic particles are non-infectious. The invention is illustrated by the following non-limiting examples. Unless otherwise specified, isolation and handling of the nucleic acids described is described in, for example, Sambrook et al., "A Laboratory Manual" (2nd Edition), Cold Spring, New York. Standard methods were used by the Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) in Cold Spring Harbor. Example 1 Preparation of Recombinant Plasmid Having VLP Genomic Structure Containing Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) Receptor Gene In this example, a subgenomic fragment of rabies virus carrying a foreign gene is described. The TB-2 structure described in International Application No. PCT / AU92 / 00363 is used as a fragment of the rabies virus subgenome, and the CAT receptor gene used is used as a foreign gene. The plasmid used to construct the recombinant plasmid was obtained from the following sources: pSVL-CAT (Cameron and Jennings (1989) Proceedings of National Academy of Sciences USA). 86, 9139) from the CRISO division of Biomolecular Engineering in North Rye, NSW, Australia, and pBluescript KSII + in Madison, Wisconsin, USA. ), PAcYM1 (Matsuura et al., (1978) Journal of General Virology, Vol. 68, p. 1223). It was obtained from the UK Oxford Institute of Uiroroji-and-end bio Ron mental Microbiology of (Oxford) (Institute of Virology and Envir onmental Microbiology)). Plasmid pTB2 is described in International Application No. PCT / AU92 / 00363. The BamHI TB-2 insert of pTB2 is also included in the pAcTB2 vector described in International Application No. PCT / AU92 / 00363. pAcTB2 has been deposited with Australian Government Analytical Laboratories, NSW2073, Pymble, Australia, Suakin Street 1, under accession number 92/32 588. Oligonucleotide primers were synthesized for PCR amplification of the desired DNA fragments (CPR1, CPR2 and CPR3) as well as the DNA sequences (Bac1 and Bac2). CPR1, CPR2 and CPR3 had a terminal sequence of the CAT gene and an NcoI restriction endonuclease site to facilitate subcloning into the NcoI site of pTB2. In the case of CPR3, the rabies virus N-gene transcription termination / polyadenylation sequence (CATA [A] 7 ) Had. The sequence of each oligonucleotide primer is as follows: A. Construction of plasmids pAcTB2-CAT and pAcTB2-CAT-R Primer CPR1 and CPR2 and PCR using pSVL-CAT DNA as a template for amplification gave a full length copy of the CAT gene. Taq buffer, 3.5 mM MgC1 2 , 0.25 mM of each dNTP, 5 units of Taq polymerase (manufactured by Promega Corporation), 1 μg of each primer and 7.5 ng of pSVL-CAL plasmid DNA. After heating the reaction mixture at 85 ° C. for 3 minutes, Taq DNA polymerase was added thereto, and the mixture was subjected to 40 cycles of reaction at 95 ° C. for 90 seconds, 51 ° C. for 90 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds, and then at 72 ° C. After incubation for 5 minutes, the temperature was maintained at 25 ° C. to obtain a DNA product. The CAT DNA product was applied to a 0.8% LMT agarose gel and the separated approximately 0.7 kb DNA band was excised. An equal volume of TE buffer (pH 7.6) was added and the mixture was incubated at 68 ° C. for 5-8 hours with occasional vortexing. The DNA was extracted once with phenol and twice with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), followed by 0.3 M sodium acetate (pH 5.2), glycogen 20 mg as carrier (Boehringer Mannheim). (Boehringer Mannheim) and 2.5 times volume of ethanol was added to precipitate the DNA. After 30 minutes incubation at -20 ° C, DNA was collected by microcentrifugation, washed with 70% ethanol, then vacuum dried. The 3'-terminal adenosine overhang resulting from Taq DNA polymerase extension was removed using the 3 '→ 5' exonuclease activity associated with the Klenow fragment of DNA polymerase 1. The purified DNA product is reacted with 2.5 units of Klenow fragment in restriction enzyme buffer H (Boehringer Mannheim) for 15 minutes at 22 ° C., extracted with phenol: chloroform: isoamyl alcohol as described above, and precipitated. Let The CAT gene DNA was blunted and ligated into the dephosphorylated EcoRV site of Bluescript KSII + (Stratagene), and then transformed into XLI-Blue E. coli host cells. Then, ampicillin-resistant white colonies on agar plates containing TYM medium and ampicillin, X-gal and IPTG were selected. After confirming the plasmid having the CAT gene, the sequence of the insert in pBlue-CAT was determined using the primers for T3 and T7 sequences (Promega Corp.) and sequenase. TM Sequencing was performed using a sequencing reagent (manufactured by United States Biochemicals). The plasmid pB1ue-CAT was partially digested with NcoI and the resulting DNA fragment was dissolved in 1.2% LMT agarose gel. The entire CAT gene of approximately 0.7 kb was isolated, purified and subcloned into the dephosphorylated NcoI site of the pTB2 structure as described above for the inability to use the blue / white selection system. Two clones in which the CAT gene was inserted in the forward direction (pTB2-CAT) and the reverse direction (pTB2-CAT-R) were selected as shown in FIG. Pla-pTB2-CAT and pTB2-CAT-R were digested with BamHI to obtain an insert containing the TB2 DNA structure with the CAT gene in both directions. About 2. The 1 kb insert was isolated, purified as described above and subcloned into the dephosphorylated BamHI site of the baculovirus transfer vector pAcYM1. The recombinant plasmid was identified and sequenced as described above with the primers Bac1 and Bac2, which allow extension of the chain beyond the two reconstructed BamHI sites of the recombinant pAcYM1 vector. I confirmed the direction. The sequences of the Bac1 and Bac2 primers are shown above. Clones pAcTB2-CAT and pAcTB2-CAT-R with inserts in the desired orientation were selected and plasmid DNA was purified by CsCl gradient centrifugation. The construction of pAcTB2-CAT and pAcTB2-CAT-R is shown schematically in FIG. B. Construction of plasmids pAcTB2-CAT3 and pAcTB2-CAT3-R As described above for plasmids pAcTB2-CAT and pAcTB2-CAT-R, except that the CAT gene is obtained from plasmid pSVL-CAT DNA by PCR amplification with primers CPR1 and CPR3. Plasmids pAcTB2-CAT3 and pAcTB2-CAT3-R were prepared in exactly the same manner as in. As a result, in addition to the polyadenylation sequence in TB-2, immediately after the CAT gene termination codon, the rabies virus polyadenylation sequence (CA TG [A] 7 ) Will be included. The sequence of the CAT gene insert in plasmids pTB2-CAT and pTB2-CAT3 is shown in Figure 7. The primer sequences outside the plasmid and the terminal NcoI restriction endonuclease site are not shown. Example 2 Construction of Recombinant Baculovirus Containing TB2-CAT Genomic Structure Baculovirus AcPAK6 was grown in Spodoptera frugiperda (Sf9) cells and purified by sucrose gradient centrifugation. DNA was isolated, purified by CsCl gradient centrifugation and digested to completion with Bsu36I. Lipofection TM (Manufactured by Gibco / BRL), 100 ng of AcPAK6 DNA linearized with Bsu3 6I and four types of plasmid structures (pAcTB2-CAT, pAcTB2-CAT-R, pAcTB2-CAT3 and pAcTB2-CAT3-R) Sf9 at 1 μg each. Cells were co-transfected. Cells were incubated at 28 ° C for 4 days and recombinant baculovirus was identified by plaque selection. Cells were treated with X-gal to distinguish wild type (blue) from recombinant baculovirus colonies (white) and visualized by staining plaques with neutral red. Clearly identifiable white plaques were selected and Sf9 cells were grown at 28 ° C. for 3-6 days in 96 well plates of 2 lines. After 3 days, cell lysates were prepared from a set of two-line cultures and used for hybridization analysis to confirm integration of the four TB2-CAT genomic structures. 12 ng gel purified CAT3 PCR product as template, 0.5 μg CPRI and CPR3 primers, 4 mM MgCl 2 2 , 0.5 mM dATP, dCTP and dGTP, 0.32 mM dTTP, 8 nmol DIG-11-dUTP (Boehringer Mannheim), Taq polymerase 2.5 units (Promega Corporation), and PCR using the above cycling temperature, A probe labeled with digoxigenin (DIG) was prepared. Dot hybridization with a CAT probe labeled with DIG identified recombinant baculoviruses with TB2-CAT, TB2-CAT-R, TB2-CAT3 and TB2-CAT3-R genomic structures. After 4 days, a portion of the medium from the recombinant baculovirus-infected 2 line cultures confirmed to have the desired genomic structure was used to infect 24-well plate cultures of Sf9 cells, and A seed stock of virus was obtained for subsequent infection of the culture. Sf9 cell cultures were infected as a source of DNA for PCR amplification and confirmed that the complete DNA structure, rather than the truncated one, was incorporated into the recombinant baculovirus. DNA obtained from cell lysates was used as a template for PCR amplification with the Bac1 and Bac2 primers described above. Amplification product was reduced to 0. Dissolved in an 8% agarose gel and identified a fragment of the appropriate size (about 2.1 kb), recombinant baculovirus full-length TB2-CAT, TB2-CAT-R, TB2-CAT3 and TB2-CAT-R. It was confirmed to have a structure. To obtain a cloned virus stock, virus seed stocks from 24-well cultures were subjected to the next round of plaque purification on Sf9 cells. Well separated plaques were selected and isolated and used to make cloned recombinant baculovirus stocks for subsequent manipulations. Example 3 Production of Rabies VLPs with TB2-CAT genomic structure Recombinant baculovirus expressing genomic proteins of rabies virus (N / M1 and M2 / G in dual expression vector) and genomic structures TB2-CAT, TB2. Each of four recombinant baculoviruses expressing -CAT-R, TB2-CAT3 and TB2-CAT3-R was used to infect agitated cultures of Sf9 cells. Cultivation was carried out at 28 ° C. for 3 days, the culture solution was collected, clarified by centrifugation, and VLPs were collected by ultracentrifugation at 27,000 rpm for 1 hour at 4 ° C. in a Beckman SW28 rotor. VLPs were resuspended in TD buffer containing 1 mM EDTA and TD buffered 40% (w / w) TD buffered 10% (w) on a cushion of sucrose in a Beckman SW40Ti rotor at 4 ° C. for 30 min at 35000 rpm. / W) Centrifuge by passing through sucrose. Bands at the interface were collected, diluted, and centrifuged in a Beckman SW40Ti rotor at 4 ° C. for 90 minutes at 30,000 rpm to obtain semi-purified V LPs. VDS formation was shown by SDS-PAGE of the ground pellet and Western blot with polyclonal rabies virus antiserum. Rabies virus structural proteins G, N, M1 and M2 in VLPs with all four TB2 genomic structures including the CAT gene-TB2-CAT, TB2-CAT-R, TB2-CAT3 and TB2-CAT3-R Identified in. Sf 9 cells were used by visually comparing the intensity of structural proteins in VLPs obtained with the four TB2-CAT genomic structures with the intensity for VLPs obtained with the TB2 genome. It was shown to produce comparable amounts of VLPs regardless of the nature of the TB2 genome. Example 4 Detection of CAT Gene Expression This example illustrates expression of the CAT reporter gene in target cells transfected with the VLPs prepared in Example 3. Since VLPs do not contain the L gene product, cells were transfected with live rabies virus to provide RNA-dependent RNA polymerase activity. Thus, the (−) sense RNA of VLPs was converted to (+) sense RNA, allowing CAT expression. Experiment 1 Infant hamster kidney cells (BHK-21, BSR clone) 5x10 Five 8 x 10 single layers 6 Plaque forming units of rabies virus (CVS strain) were infected. At 4 hours post-infection, infected monolayers and uninfected BHK-21 cell monolayers were transformed into 2x10 5 with the following genomic structure. 9 (A) TB2-CAT; (b) TB2-CAT3; (c) TB2-CAT-R; (d) TB2-CAT3-R; or (e) no VLPs. Two days after infection, all monolayers were collected and assayed for the CAT gene by using CAT-ELISA (Boehringer Mannheim). Experiment 2 In the next experiment, BHK cell monolayers were treated as described in Example 1, except that rabies virus infection and VLP treatment were carried out simultaneously: 4 hours between infection and VLP treatment. I couldn't. The results of both experiments are shown in Table I. The results shown in Table I show that the foreign gene (CAT in this case) can be expressed with the information of the sequences contained in the (-) sense VLP genome. Expression was dependent on the correct orientation of the foreign gene with CAT detectable only in cells transfected with the TB2-CAT and TB2-CAT3 VLP genomes. Also, expression was dependent on the RNA's RNA-dependent RNA polymerase activity (left column of each experiment in Table I), as CAT was only detectable in cells infected with rabies virus. Administration of VLPs of the present invention capable of expressing immunogenic proteins to animals or humans at risk of disease, infection or invasion is immunized in the same manner as vaccines containing inactivated or attenuated viruses. Will cause sex. However, since the VLPs of the present invention use only fragments of the viral genome, there is no advantage in the presence of infectious virus or the possibility of reversion to virulence. Similarly, the VLPs of the invention can be used to deliver therapeutic agents to affected or infected tissue. However, unlike other currently used delivery systems, VLPs are capable of targeting specific cells or tissues, allowing the synthesis and amplification of therapeutic agents in target tissues, and more fully It is non-infectious and typically does not carry the gene for the infectious agent. Moreover, since VLPs do not contain DNA, integration elements and enzymes capable of synthesizing DNA, there is no risk of modification of the host genome which can cause tumors or related diseases. It will also be appreciated that many variations can be made to the above invention without departing from the broad scope of the invention. A sample of the deposited plasmid pAcTB2 of the material relating to the present invention was submitted to the Australian Government Analytical Laboratories of Suakin Street 1, Pymble, NSW2073, Australia, September 1992. It was deposited on the 15th and was given accession number 92/3 2588.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 プレハウド，クリストフ・ジーン オーストラリア連邦 4067 クイーンズラ ンド、セント・ルチア、サンドフォード・ ストリート７／82番 (72)発明者 カウリー，ジェフ・アレクサンダー オーストラリア連邦 4105 クイーンズラ ンド、ムールーカ、ホームステッド・スト リート112番─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, H U, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV, MG , MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Prehaud, Christoph Jean             Australian Federation 4067 Queensla             Sandwich, St. Lucia, Sandford             Street 7/82 (72) Inventor Cowley, Jeff Alexander             Australian Commonwealth 4105 Queensla             Nd, Mouruka, Homestead Strike             REIT 112

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．外来遺伝子を発現させるために該外来遺伝子を標的細胞に送達するための ベクターであって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白より構成されるウイ ルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれる（−）センスＲＮＡゲノムであっ て１種またはそれ以上の外来遺伝子を含んでいるが該（−）センスＲＮＡウイル スの複製のための遺伝子を含んでいない（−）センスＲＮＡゲノムからなるベク ター。 ２．さらに、該リボ核蛋白複合体中の、（−）センスＲＮＡゲノムからの（＋ ）センスＲＮＡの合成のためのポリメラーゼからなる請求項１記載のベクター。 ３．該（−）センスＲＮＡウイルスが、ラブドウイルス（rhabdovirus）また はパラミクソウイルス（paramyxovirus）である請求項２記載のベクター。 ４．該（−）センスＲＮＡウイルスが、狂犬病ウイルスである請求項３記載の ベクター。 ５．該（−）センスＲＮＡゲノムが、狂犬病ウイルスのゲノム由来の５’ドメ イン、狂犬病ゲノムＲＮＡからなるフィラードメイン（filler domain）、該１ 種またはそれ以上の外来遺伝子および狂犬病ウイルスのゲノム由来の３’ドメイ ンからなり、 該リボ核蛋白複合体が、狂犬病ウイルスのＮ蛋白のさやにより囲まれている狂 犬病ウイルスのＭ１およびＬ蛋白と一緒になった該（−）センスＲＮＡゲノムか らなり、 該リボ核蛋白複合体が、狂犬病ウイルスのＭ２蛋白からなるマトリックスによ り囲まれており、かつ、狂犬病ウイルスのＧ蛋白を含んでいる脂質外套中に封じ 込まれている請求項４記載のベクター。 ６．該ウイルス様粒子が、該ウイルス様粒子に選択細胞タイプを標的とさせる 外部ドメインからなる修飾糖蛋白を含んでいる請求項１記載のベクター。 ７．該修飾糖蛋白が、該選択細胞タイプの表面上の受容体に対するポリペプチ ドリガンドからなる外部ドメインに融合した狂犬病ウイルスのＧ蛋白の内部およ びトランスメンブランドメインからなる請求項６記載のベクター。 ８．該外来遺伝子の発現産物が、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンスＲＮ Ａおよび触媒的ＲＮＡからなる群より選択される請求項１記載のベクター。 ９．以下のステップ： ｉ）該（−）センスＲＮＡゲノムに対応するＤＮＡを含んでいるＤＮＡ分子を 含んでいる発現ベクターを製造し； ii）ステップ（ｉ）で製造された発現ベクターを、ウイルス様粒子の形成のた めの蛋白を発現させるためのＤＮＡと一緒に真核宿主細胞中に導入し； iii）該（−）センスＲＮＡゲノムおよび該蛋白を発現しうる条件下で真核細 胞を培養し、該（−）センスＲＮＡゲノムをウイルス様粒子中に取り込ませ、つ いで； iv）該ウイルス様粒子をステップ（iii）の該真核細胞培養物から収集する からなる外来遺伝子を発現させるために該外来遺伝子を標的細胞に送達するため のベクター、であって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白より構成される ウイルス様粒子中のリボ核蛋白複合体中に含まれる（−）センスＲＮＡゲノムで あって１種またはそれ以上の外来遺伝子を含んでいるが該（−）センスＲＮＡウ イルスの複製のための遺伝子を含んでいない（−）センスＲＮＡゲノムからなる ベクターの製造方法。 １０．該ウイルス様粒子中に取り込まれうる分子を提供するために、該ＤＮＡ 分子が、ステップ（iii）において得られた最初の（−）センスＲＮＡ転写物を 開裂する少なくとも１個のリボザイムドメインを有している請求項９記載の方法 。 １１．該ＤＮＡ分子が、該（−）センスＲＮＡウイルスのゲノムの５’および ３’末端に近似した５’および３’末端を有する分子を提供するために、該ＤＮ Ａ分子が、最初の（−）センスＲＮＡ転写物を開裂する２個のリボザイムドメイ ンを有している請求項１０記載の方法。 １２．該発現ベクターがバキュロウイルス由来である請求項９記載の方法。 １３．該バキュロウイルスがＡｃＮＰＶまたはＡｃＰＡＫ６である請求項１２ 記載の方法。 １４．該真核細胞宿主細胞が昆虫細胞である請求項９記載の方法。 １５．該昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda） である請求項１４記載の方法。 １６．外来遺伝子を該外来遺伝子発現用標的細胞に送達するためのベクターで あって、（−）センスＲＮＡウイルスの構造蛋白から構築されたウイルス様粒子 中のリボ核蛋白複合体中に含まれている（−）センスＲＮＡゲノムであって１種 またはそれ以上の外来遺伝子を含んでいるが該（−）センスＲＮＡウイルスの複 製に関する遺伝子を含んでいない（−）センスＲＮＡゲノムからなるベクターと 一緒になった医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形 剤からなる医薬組成物。 １７．外来遺伝子の発現産物を標的細胞に送達する方法であって、該標的細胞 を請求項１記載のベクターと接触させ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を 提供するベクターで該細胞を同時形質転換または同時トランスフェクションする ことからなる方法。 １８．外来遺伝子の発現産物を標的細胞に送達する方法であって、該標的細胞 を請求項２記載のベクターと接触させることからなる方法。 １９．外来遺伝子の発現産物を哺乳動物対象の組織の細胞に送達する方法であ って、請求項２記載のベクターまたは請求項１６記載の医薬組成物。 ２０．外来遺伝子の発現産物の該送達が、病状または病理学的状態の治療のた めのものである請求項１９記載の方法。 ２１．該ウイルス様粒子が、該ウイルス様粒子に選択細胞タイプを標的とさせ る外部ドメインからなる修飾糖蛋白を含んでいる請求項１９記載の方法。 ２２．該修飾糖蛋白が、該選択細胞タイプの表面上の受容体に対するポリペプ チドリガンドからなる外部ドメインに融合した狂犬病ウイルスのＧ蛋白の内部お よびトランスメンブランドメインからなる請求項２１記載の方法。[Claims]   1. For delivering a foreign gene to a target cell to express the foreign gene A vector comprising a structural protein of (-) sense RNA virus. It is the (-) sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex in the loose-like particle. (-) Sense RNA virus containing one or more foreign genes Vector consisting of (-) sense RNA genome containing no gene for replication Tar.   2. Furthermore, (+) from the (-) sense RNA genome in the ribonucleoprotein complex 2.) The vector of claim 1 which comprises a polymerase for the synthesis of sense RNA.   3. The (-) sense RNA virus is a rhabdovirus or The vector according to claim 2, wherein is a paramyxovirus.   4. The rabies virus according to claim 3, wherein the (-) sense RNA virus is rabies virus. vector.   5. The (-) sense RNA genome is a 5'domain derived from the rabies virus genome. In, a filler domain consisting of rabies genomic RNA, 1 3'domain from a rabies virus genome and one or more foreign genes Consists of   The ribonucleoprotein complex is surrounded by a rabies virus N protein pod. Is the (-) sense RNA genome combined with the M1 and L proteins of canine virus? It consists of   The ribonucleoprotein complex is based on a matrix composed of the rabies virus M2 protein. Enclosed and sealed in a lipid mantle containing the G protein of rabies virus The vector according to claim 4, which is integrated.   6. The virus-like particle targets the virus-like particle to a selected cell type The vector according to claim 1, which contains a modified glycoprotein comprising an ectodomain.   7. The modified glycoprotein is a polypeptide that binds to a receptor on the surface of the selected cell type. Inside and outside of the G protein of rabies virus fused to the ectodomain of doligand 7. The vector according to claim 6, which consists of transmembrane and main.   8. The expression product of the foreign gene is a peptide, a polypeptide or an antisense RN. The vector of claim 1 selected from the group consisting of A and catalytic RNA.   9. Following steps:   i) a DNA molecule containing a DNA corresponding to the (-) sense RNA genome Producing an expression vector containing;   ii) The expression vector produced in step (i) is used for the formation of virus-like particles. Is introduced into a eukaryotic host cell together with DNA for expressing the protein for   iii) eukaryotic cells under conditions capable of expressing the (-) sense RNA genome and the protein. The cells are cultured and the (-) sense RNA genome is incorporated into virus-like particles. Come on;   iv) collecting the virus-like particles from the eukaryotic cell culture of step (iii) To deliver a foreign gene to a target cell to express the foreign gene Which is composed of (-) sense RNA virus structural protein In the (-) sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex in the virus-like particle Of the (-) sense RNA clone containing one or more foreign genes. Consists of a (-) sense RNA genome that does not contain the gene for replication of Ils Vector manufacturing method.   10. To provide a molecule that can be incorporated into the virus-like particle, the DNA The molecule is labeled with the first (−) sense RNA transcript obtained in step (iii). 10. The method of claim 9 having at least one ribozyme domain that is cleaved. .   11. The DNA molecule is 5'of the genome of the (-) sense RNA virus and The DN is provided to provide a molecule with 5'and 3'ends close to the 3'end. The A molecule cleaves the first (-) sense RNA transcript into two ribozyme domains. 11. The method of claim 10, wherein the method comprises:   12. The method according to claim 9, wherein the expression vector is derived from baculovirus.   13. 13. The baculovirus is AcNPV or AcPAK6. The method described.   14. The method according to claim 9, wherein the eukaryotic host cell is an insect cell.   15. The insect cells are Spodoptera frugiperda 15. The method according to claim 14, wherein   16. A vector for delivering a foreign gene to a target cell for expressing the foreign gene And virus-like particles constructed from (-) sense RNA virus structural proteins (-) Sense RNA genome contained in the ribonucleoprotein complex in Or containing more than one foreign gene, A vector consisting of a (-) sense RNA genome which does not contain a gene for production Pharmaceutically acceptable carrier, diluent, adjuvant and / or excipient together A pharmaceutical composition comprising an agent.   17． A method of delivering an expression product of a foreign gene to a target cell, the method comprising: By contacting the vector with the vector according to claim 1 with RNA-dependent RNA polymerase activity. Co-transform or co-transfect the cells with the provided vector A method consisting of things.   18. A method of delivering an expression product of a foreign gene to a target cell, the method comprising: A method comprising contacting with a vector according to claim 2.   19. A method for delivering an expression product of a foreign gene to cells of a tissue of a mammalian subject. Therefore, the vector according to claim 2 or the pharmaceutical composition according to claim 16.   20. Said delivery of the expression product of the foreign gene is useful for the treatment of medical conditions or pathological conditions. 20. The method of claim 19, which is for   21. The virus-like particle targets the virus-like particle to a selected cell type 20. The method of claim 19, which comprises a modified glycoprotein consisting of an ectodomain.   22. The modified glycoprotein binds a polypeptide to a receptor on the surface of the selected cell type. The internal and internal domains of the G protein of rabies virus fused to an external domain consisting of a tide ligand 22. The method of claim 21, which comprises and transmembrane brand mains.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE257175T1 (en) * 1994-07-18 2004-01-15 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr RECOMBINANT INFECTIOUS NON-SEGMENTED, NEGATIVE STRAND RNA VIRUS
DE19503082A1 (en) * 1995-02-01 1996-08-08 Univ Ludwigs Albert Subject and method for preferentially transient expression and possible translation of specific RNA in the cytoplasmic region of higher eukaryotic cells
JPH11512609A (en) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequence
EP0864645B9 (en) * 1995-10-31 2006-03-22 Dnavec Research Inc. Negative-strand rna virus vector having autonomously replicating activity
EP0863202B1 (en) 1995-11-01 2010-06-09 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
AU2749297A (en) * 1996-05-01 1997-11-19 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Generation of viral transfectants using recombinant DNA-derived nucleoc apsid proteins
US6818209B1 (en) 1998-05-22 2004-11-16 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral delivery system
AU7350798A (en) * 1997-04-29 1998-11-24 Universiteit Utrecht Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy
CA2328491A1 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral delivery system
WO2002098457A2 (en) * 2001-01-17 2002-12-12 Thomas Jefferson University Recombinant rhabdoviruses as live-viral vaccines for immunodeficiency viruses
GB0119852D0 (en) 2001-08-15 2001-10-10 Univ York Baculovirus

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7007491A (en) * 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
WO1993001833A1 (en) * 1991-07-17 1993-02-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vaccine
AU2366592A (en) * 1991-07-17 1993-02-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vaccine

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Publication number Publication date
EP0672153A4 (en) 1997-05-07
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ZA937164B (en) 1994-05-23
IL107139A0 (en) 1993-12-28
EP0672153A1 (en) 1995-09-20

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