【発明の詳細な説明】哺乳動物の血液の検体の抗原に対する アレルギー誘発応答を決定する方法
本発明は、抗原、特に食物抗原に対する咄乳動物の血液の検体のアレルギー誘
発応答を決定する方法に関する。本発明は、また、患者における抗原に対するア
レルギー誘発応答を決定するためのin vitroにおける診断の方法も含む。
ある患者は特定の食物に対してアレルギーである。この特定の食物は、患者に
よって異なる。そして、食物アレルゲンに対するアレルギー誘発応答の機序は完
全には理解されていないが、食物に対するアレルギー誘発反応は、ある患者にお
いて、少くとも一部は、片頭痛、喘息、湿疹ならびに関節炎のような広範な症状
の原因となっていると考えられている。
食物過敏症が関与している可能性がある特殊な疾患は、肥満である。ある患者
においては、肥満は、体液が保持される結果である。ある患者においては、ある
食物に対するアレルギー誘発応答は、彼等の毛細血管の透過性の増加を起し、毛
細血管が漏洩性となり、血管中の水分が、毛細血管に隣接した組織に逸出する。
その結果、該患者は、喉が乾き、埋合せのために常人よりも多くの水を飲むと考
えられる。しかし、さらに消費された液体も結局は毛細血管から逸出し、患者は
「液体保持性」となり、体重が増加する。
ある患者において、一度特定の食物に対するアレルギー誘発応答が診断された
ならば、効果的な治療法は、患者の献立からその食物を除くことである。しかし
、典型的な日常の献立は、多数の異なる種類の食物を含んでいるので、特定の患
者において、アレルギー応答をひき起す食物、したがって避けなければならない
食物を決定することは、相当に難かしいことになる。
その上、医学の専門家および公共的に同様な人々のなかでは、上に述べた症状
とアレルギー性過敏症の間の原因的関連の認識に対しては、一般的な偏見がある
。
その結果、これまで食物の過敏症についての試験は、主流である一般的医学手
順からはずれたものに限られ、科学的根據が首尾よく説明されていない技術を含
んでいた。
食物の過敏症に対する試験は、慣習的に、患者を小量の食物抗原をになってい
る無菌の針先で突き刺すことからなる「皮膚の突き刺し」試験によって行われた
。食物抗原に対する患者の応答は、目視によってモニターされ、過敏症が顕現さ
れるか否かが決定される。患者は、異なる皮膚の部位において、複数の突き刺し
にかけることによって、５つ以上の抗原に対して同時に過敏症の試験にかけるこ
とができるけれども、「突き剌し」試験は時間がかかり、一人の患者に対する数
十の食物を試験するのに何週間もかかることがある。突き剌し試験は、また、目
視によるモニターリングが必要であるという不利をこうむる。したがって、そし
て／または、一過性の反応は見逃されることがある。
アレルギー誘発反応を示す患者に対して、検体を抗原でチャレンジするならば
、患者からの血液の検体中の白血球の総数は減少することが観察された。
ＵＳ−Ａ−４，６１４，７２２には、懸念されたアレルゲンと血液検体の間の
反応の程度を決定するための方法と装置が開示されている。該方法は、懸念され
たアレルゲンとの反応の前後における検体中に存在する白血球の総数を比較する
ことからなる。
１患者における１つ以上の食物に対するアレルギー誘発応答から生ずると思わ
れる種々の症状は、患者の血流への顆粒球の１つ以上の集団、典型的には、好中
球からの顆粒の放出によって生ずることが考えられる。特にある種の食物アレル
ゲンは、患者の血液中の顆粒球と相互作用し、顆粒球の一部を破裂させ、血流中
へ顆粒を放出すると考えられる。本技術分野に熟達した人々によって、原形質中
の顆粒球の顆粒によって、正常の場合に放出される化学物質は、患者の血流に直
接放出されるならは、炎症や、もしくは組織に対する破壊をひき起し、順次、食
物に対する過敏症によって起ると考えられる医学的状態に関連した症状へと導か
れることが認識されるであろう。
したがって、本発明の１面によれば、抗原に対する哺乳動物の血液の検体のア
レルギー誘発応答を決定する方法が提供される。該方法は、以下からなる：すな
わち、
ａ）血液検体中において、白血球に対してチャレンジを行うために、血液検体
に対して抗原を添加する；
ｂ）血液検体／抗原の混合物をインキュベートする；
ｃ）その後、インキュベートした抗原を加えない対照血液検体と比較して、上
記血液検体中の１つ以上の顆粒球の脱顆粒の量を決定するために、該混合物を精
査する；そして、
ｄ）複数の他の血液の検体を試験することによって導かれた統計的平均脱顆粒
と脱顆粒の量を比較し、そうすることによって、該平均脱顆粒と比較して脱顆粒
の量が有意であるかどうかを決定する。
本発明はまた、患者におけるアレルギーを診断するin vitroの方法も含み、該
方法は、患者から血液検体を採取し、本発明にしたがった方法を利用して、抗原
に対する検体のアレルギー誘発応答を決定することからなる。
本発明の別の面においては、咄乳動物の血液検体の抗体に対するアレルギー誘
発応答を決定するための装置も提供されている。
該装置は、血液検体に対して抗原を加える手段；
抗原の存在しない対照血液検体と比較した血液検体中の１つ以上の顆粒球の集
団の脱顆粒の量を決定するために、検体／抗原の混合物を精査するための手段；
及び、
複数の他の血液検体から導かれた統計的平均脱顆粒と該脱顆粒を比較し、そう
することによって、該顆粒の量が、該平均脱顆粒の量に較べて有意であるか否か
を決定する手段からなる。
典型的には、検体／抗体混合物は、脱顆粒の量を、好中球の集団において決定
すべく精査されることがある。
ある態様においては、脱顆粒の量は、検体中の顆粒球から血漿中に漏洩した顆
粒の数を直接測定することによって決定されることもある。もしくは、脱顆粒の
量は、検体中の顆粒の喪失を測定することによって、間接的に決定することがあ
る。
ある態様においては、脱顆粒の量は、ヘマトロジーアナライザーを使用して決
定することができる。ヘマトロジーアナライザーは、無線周波数の交流と直流の
組合せを使用して血液検体の白血球の集団を精査することができる。典型的には
、
Messrs. 東亜、日本から商品名、ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００の下に市販されて
いる型のヘマトロジーアナライザーを使用することができる。このヘマトロジー
アナライザーの原理と操作法は、東亜から入手できる付属マニュアル、参照コー
ドＮＥ−８０００／１１．８８（改訂、０８．８９，１２．８９）中に分り易く
記述されている；とりわけ、第４節、「操作の原理」を参照のこと。
血液の検体は、複数の部分に分けることができる。最初の部分は、白血球を除
き、その中のすべての細胞を溶解させるため溶解剤で処理することができる。２
番目の部分は、好塩基球を除くすべての細胞を溶解させるために、溶解剤で処理
することができる。そして３番目の部分は、好酸球を除くすべての細胞を溶解す
るために、溶解剤で処理することができる。各部分を電解質希釈剤中に懸濁させ
、トランスデューサーチェンバーを２つの領域に分ける仕切りがついたトランス
デューサー室中に配置された。仕切りは、２つの領域の間に、そこを通って広が
っている小さい開口部をもつことができる。各領域には電極が用意してある。開
口部の大きさは、血液の検体中の白血球と同程度の大きさにすることができる；
電解質の希釈剤は、該白血球とは有意に異なる電気伝導度をもつように選択され
ることができる。
各部分における白血球細胞は、開口部を通って、トランスデューサーチェンバ
ーの１つの領域から他の領域に吸引されることができる。実質的に一定の電流を
電極から電極へ加えることができる。白血球細胞が開口部を通過するときに、電
極の間の電圧は、一過性に検出できる量だけ変化することができる。該電圧を、
細胞の吸引中に連続的にモニターすることができ、開口部を通過している細胞数
を計測することができる。
２番目と３番目の部分の場合においては、適用された電流は一定の直流であっ
てよい；開口部を通過する各細胞の全容積は該電圧の一過性の変化に比例すると
考えられる。このようにして、２番目と３番目の部分における好塩基球と好酸球
の数は、それぞれ計数できると考えられる。
最初の部分における白血球を吸引する際に、一定の直流と一定の無線周波数の
交流を電極間に適用することができる；前の如く、ｄ．ｃ．シグナルにおける一
過性の変化は、白血球細胞が開口部を通過するとき白血球細胞の全容量に比例す
ると考えられる。細胞の全核と細胞質の顆粒の容量は、それが、開口部を通過す
るとき、ｒ．ｆ．シグナルにおける一過性の変化に比例していると考えられる。
したがって、開口部を通過する各白血球の位置が（ｉ）全細胞容量軸（ｄ．ｃ．
パルス）と（ii）核と顆粒の容量軸（ｒ．ｆ．パルス）に対してプロットされる
最初の部分の吸引から分散グラムを生ずる。無傷のリンパ球、顆粒球、単球が、
それらの全体の容量の核／顆粒容積に対する比が異なる結果として分散グラムの
異なる領域に出現することは、本技術分野に熟達した人々によって評価されるで
あろう。したがって、経験に基いて分散グラム中の「リンパ球」、「顆粒球」、
および「単球」の領域を、計算された「弁別」線を適用することによって描くこ
とができる。各領域を代表する全細胞数を次に計数することができる。
血液検体中の明らかな好中球の集団は、最初の部分における計算された明らか
な顆粒球集団から、２番目と３番目の部分における好塩基球と好酸球の計数を差
し引くことによって計算できる。
本発明にしたがって、脱顆粒された顆粒球が、ｄ．ｃ．とｒ．ｆ．分析の下で
は、上に記述したように、「単球」または「リンパ球」として現れるということ
が評価されるであろう。したがって、本発明の１つの面においては、血液検体中
の１つ以上の顆粒球の集団における脱顆粒は、単球、またはリンパ球の数の明ら
かな増加、そして典型的には好中球である顆粒球の数の明らかな減少として検出
できると考えられる。
分散グラムにおいては、これは、リンパ球集団の「顆粒球」の領域からの単球
の領域への明らかなシフトとして現れると考えられる。
抗原を含まない対照検体を精査することができ、抗原でチャレンジされた血液
検体中の脱顆粒の量を対照と比較した単球／リンパ球および顆粒球の集団におけ
る明らかな増加、または減少を、それぞれ計算することによって決定することが
できる。
典型的には、複数の血液検体を調製し、各血液検体を異なる抗原でチャレンジ
することができる。
本発明の特別な面では、該抗原は食物抗原であってよい。
ある態様においては、完全な、バランスのとれた献立を構成する十分な食物を
含む複数の食物抗原が選択されてよい。
食物抗原は、血液検体に対して懸濁物として提供される。懸濁媒体は、グリセ
ロールまたはベンゾイル溶媒である。１つの態様においては、Messrs. Dome／Ho
llister-Stierから得た食品の抗原が使用されることがある。抗原の懸濁液は、
因襲的な「皮膚突き剌し」試験において典型的に使用される型である。
食物抗原／グリセロール懸濁物はさらに希釈されることがある。希釈剤は、典
型的には、食塩水ＢＰである食塩水を用いることがある。
食物抗原懸濁物には、小量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれているこ
とがある；約０．０１％から０．０５％のＨＳＡが使用されることがあるが、典
型的には０．０３％である。
Messrs. Hollister-Stierから得られた食物抗原が使用される場合では、グリ
セロール懸濁物が、約１：９の比率で食塩水ＢＰで希釈されることがあるが、本
発明は、Hollister-Stier食物抗原の食塩水に対する希釈比の、１：５から１：
１５の範囲を含むことが理解されるであろう。
グリセロール中の希釈食物抗原が、非希釈の血液検体に加えられることがある
。食物抗原に対する血液の適切な比が重要であると考えられる。血液の使用量が
少なすぎると、分折は特異性がなくなることがある。ある態様においては、Mess
rs. Hollister-Stierから得られた食物抗原は、９部の食塩水ＢＰで希釈され、
０．０３％のＨＳＡを含み、非希釈の血液と５０：５０の比で混合する。この食
物抗原の希釈グリセロール懸濁物を使用するとき、血液に対する抗原の比は、４
０：６０から６０：４０が成功すると考えられる。
血液検体へ食物抗原の導入の後、混合物をインキュベートする。首尾よい結果
を得るためには、インキュベーションの期間が重要であると考えられる。混合物
があまりにも長くインキュベートされると、食物抗原に対する顆粒球の反応は非
特異的になる。混合物は、３０分から９０分の範囲で、典型的には６０分間イン
キュベートすることができる。
与えられた食物抗原についての血液検体のそれぞれ明らかな単球／リンパ球の
集団の増加と、顆粒球集団の減少が、複数血液検体から得られたそれぞれの平均
増加と減少と比較されることができる。得られた平均値を背景として比較して、
それぞれ有意な増加と減少は、懸念された抗原に対する過敏症を示唆すると考え
られる。それぞれ、単球／リンパ球集団の平均の上昇および顆粒球集団の減少は
、食物抗原から食物抗原へと変動することがあるが、典型的には、例えば好中球
の集団における約５％から１０％の減少は、過敏症を示唆すると考えられる。
一度び特定の食物抗原に対する過敏症が、与えられた血液検体について決定さ
れたならば、患者の治療は、彼または彼女の献立からその食物を除くように忠告
することによって行うことができる。
さもなければ、本発明の１つの面にしたがって、患者は、彼または彼女の食事
を、明らかにアレルギー誘発反応を引き起さない食物に限ることができる。試験
されていない食物は、献立に１つずつ、ある期間にわたって再導入し、患者の経
時的反応に注意する。
本発明は、１つ以上の食物抗原に対してのアレルギー誘発反応について、血液
の検体を試験する方法を提供する。本法は、ヘマトロジーアナライザーと結果を
解析するためのマイクロプロセッサーを使用して、実質的に自動化することがで
きる。多数の抗原を、比較的短い期間に旧来の技術において知られている「皮膚
−突き刺し」試験と比較して、短期間に試験することができる。本発明は、食物
抗原によるチャレンジに応答した白血球集団における比較的小さい変化を測定す
る方法を提供し、また、該変化を複数の試験に基いた平均応答と比較する手段を
提供する。したがって、本発明は、特定の抗原に対する与えられた血液検体のア
レルギー誘発応答を決定するためのより正確な、そしてより感度の高い方法を提
供することができる。
以下は、例をあげるということのみのために、そして、本発明を効果的に行う
方法の添付した図を参照とした記載である。図の簡単な説明
図１は、抗原が存在しない対照血液検体の分散グラムである。
図２は、図１の血液検体のヒストグラムである。
図３は、図１の検体と同じ供血者からの食物抗原でチャレンジした後の血液検
体の分散グラムである。
図４は、図３における分散グラムに相当するヒストグラムである。
図５は、その異なる検体が、異なる食物抗原でチャレンジされた図１と３と同
じ供血者からの異なる血液の検体の分散グラムである。
図６は、図５の分散グラムに相当するヒストグラムである。
旧来法の「皮膚−突き刺し」食物過敏症の試験に使用するのに適当な種類の食
物抗原は、Messrs. Dome／Hollisterから得られた。各食物抗原は、グリセロー
ル懸濁物として供給され、その後、９部の食塩水ＢＰと０．０３％のヒトアルブ
ミン（ＨＳＡ）で希釈した。食物抗原は以下の通りである：−
血液の検体を患者から採取し、１００の部分に分けた。それぞれの部分を食物
抗原混合物の１つと１部の血液対１部の抗原混合物の比で混合した。１部の血液
を、１部のグリセロール、９部の食塩水ＢＰを０．０３％ＨＳＡを含む抗原不在
の混合物と混合して対照とした。
次に血液／食物抗原と対照検体を室温で約１時間インキュベートした。
対照と血液食物抗原混合物をMessrs. 東亜、日本から得られたＳＹＳＭＥＸＮ
Ｅ８０００の商品名のヘマトロジーアナライザーを使用して分析した。
ヘマトロジーアナライザーは、血液検体を複数の部分にわけ、最初の部分を、
白血球細胞を除く、部分中の実質的にすべての細胞を溶解させるために溶解剤で
処理し、２番目の部分は、好塩基球を除く実質上すべての細胞を溶解させるため
に溶解剤で処理し、３番目の部分を好酸球を除く実質的にすべての細胞を溶解さ
せるために溶解剤で処理する。次に各部分を、白血球細胞とは電導度が有意に異
なる電解質希釈剤中に懸濁させ、トランスデューサーチェンバーの最初の領域中
に配置される。細胞は、次にチェンバー中の仕切り中に作られた小さな開口部を
通って、チェンバーの第２の領域に吸引され、そして、実質的に一定な電流が、
トランスデューサーチェンバーの最初と２番目の領域にそれぞれ配置された最初
と２番目の電極の間に適用される。開口部は、該部分における白血球細胞と同程
度の大きさの直径をもっている。したがって、血球細胞が開口部を通過するとき
、チェンバー中の電極の間の電気的通路の抵抗が有意に増加する。その結果、電
極間の電圧の低下は検出できる量だけ一過性に増加する。
２番目と３番目の部分を吸引するときに、実質的に一定の直流（ｄ．ｃ．）が
電極間に適用され、血球細胞が開口部を通過するときのｄ．ｃ．電圧の一過性の
変化は、全細胞の容量に比例している。最初の部分を吸引するときには、実質上
一定な直流と実質的に一定の無線周波数の交流（ｒ．ｆ．）が適用される。白血
球か開口部を通過するときのｒ．ｆ．電圧の一過性の変化は、全核および原形質
性顆粒と白血球の密度に比例している。
最初の部分において吸引された白血球の位置が添付されている図のうち、図１
、３と５において示されている型の分散グラム上に最初のｄ．ｃ．パルス（全細
胞容量）軸と第２のｒ．ｆ．パルス（全核および顆粒容量）軸に対してプロット
される。無傷の顆粒球、単球およびリンパ球は、それらの異なる全容量および核
／顆粒の組成が異なる結果として分散グラムの異なる領域に表れる。そのため、
分散グラムは、計算された「弁別」線を分散グラムに対して用いることによって
、「顆粒球」、「単球」および「リンパ球」の領域に分けることができ、各領域
においてプロットされた全細胞数を次に計算することができる。図１を参照して
、顆粒球は、一般的に１０と印された領域に現れ、単球はボックス１２に示され
る。
血液検体の明らかな好中球集団は、最初の部分において計数された明らかな全
顆粒球の集団から、２番目と３番目の部分を吸入するときに計数された好塩基球
と好酸球の数を差し引くことによって計算できる。束亜から得たヘマトロジーア
ナライザーも、各細胞集団中において計数されたか／計算された白血球細胞の相
対的な数を示すヒストグラム（例えば、これまでの図のうち図２、４と６を参照
のこと）を生ずる。
食物抗原が存在しない対照検体をヘマトロジーアナライザーに供給し、対照に
おけるそれぞれの白血球集団の相対的濃度は、下記の表に示してある。
対照血液検体についての相当する分散グラムとヒストグラムは、それぞれ図１
と２に示してある。
各血液／食物抗原の混合物を、順次ヘマトロジーアナライザーにかけ、食物抗
原のうちの２つに対する結果が、それぞれ図３と４および図５と６に相当する表
２と３に示されている。
表１と図１と２を、それぞれ表２と図３と４とを比較するとき、それぞれの白
血球集団の相対濃度において、明らかな変化は殆んどないことが分る。しかし、
表３と図５と６においても、好中球の集団の明らかな減少と単球の集団における
明らかな増加が検出できる。
理諭によって規定されているわけではないが、単球の数の明らかな増加と、好
中球数の明らかな減少、および同時に起る白血球細胞の分散グラムの顆粒球領域
から単球領域（ボックス１２）への明らかなシフトは、好中球を含む顆粒球の脱
顆粒によって生ずる。その結果、破裂した顆粒球は、最初の部分を吸引するとき
、顆粒を含まない単球、またはリンパ球として分散グラムに現れる。血清中に放
出される顆粒それ自体は、in vivoで体内に輸送され、例えば、偏頭痛やリュー
マチのようなアレルギー症状をひき起す。他方、表２および図３と図４の結果は
、明らかな反応がないことを示し、該患者は、その特定の食物抗原に対して有意
に過敏でないことが示唆される。
血液中の種々の白血球集団は、自然に経時的に変化するということが認識され
るであろう。したがって、血液／食物抗原混合物と対照混合物は、ヘマトロジー
アナライザーを使用して、可能な限り同時に近い状態で精査することが重要であ
る。その上、食物抗原と使用された懸濁媒体の濃度に依存して、顆粒球／単球集
団における小さな変化が、いずれの食物抗原についても検出されることがある。
したがって、どの変化が特定の食物抗原に対して陽性反応を示すかを決定するこ
とが重要である。したがって、ある患者について得られた結果を、異なる患者か
ら採取した複数の血液検体から導かれた特定の食物抗原についての平均白血球集
団の変化と比較する。各食物抗原について、平均値と比較して、白血球集団の１
つにおける著しい変化があれば、食物抗原に対する過敏症を示唆する可能性があ
る。したがって、例えば、与えられた食物抗原に応答した患者についての好中球
集団におけるその抗原についての平均値と比較しての統計的に有意な減少は、同
じ抗原に対する過敏症を示唆するものと考えられる。
上に概略を述べた方法を使用して、与えられた食物抗原に対する過敏症が示唆
される場合には、患者は勇気づけられて、明らかに反応なしが示唆されている食
物のみを含む献立を使用することになる。試験に含まれていない食物は、患者の
食事に１つずつある期間にわたって民すことができる。
例えば、ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００商標下に手に入るヘマトロジーアナライ
ザーを使用して、患者は、４５分プラス約１時間のインキュベーション時間で９
９の食物物質に対する過敏症について試験することができる。したがって、本発
明の方法は、例えば「皮膚突き刺し」試験のような従来の技術において知られて
いる方法と比較して複数の食物抗原に対する血液検体のアレルギー誘発応答を試
験するためのかなりより早い方法を提供する。
本発明のある態様においては、ヘマトロジーアナライザーからのデータのアウ
トプットの分析手順をさらに自動化するためにコンピューターによって処理でき
るということは、本技術分野に熟達した人によって評価されるであろう。The present invention relates to a method for determining an allergenic response of a mammalian blood specimen to an antigen, the present invention relates to a method of determining an allergenic response of a mammalian blood specimen to an antigen, in particular a food antigen. The present invention also includes diagnostic methods of definitive to in vitro for determining the allergenic response to the antigen in the patient. Some patients are allergic to certain foods. This particular food varies from patient to patient. And although the mechanism of the allergenic response to food allergens is not fully understood, the allergic response to food is, in some patients, at least partly widespread, such as migraine, asthma, eczema and arthritis. It is thought to be the cause of various symptoms. A special disease in which food hypersensitivity may be involved is obesity. In some patients, obesity is the result of fluid retention. In some patients, the allergenic response to certain foods causes increased permeability of their capillaries, makes the capillaries leaky, and water in the blood vessels escapes to the tissues adjacent to the capillaries. . As a result, the patient is likely to have a dry throat and drink more water than normal to compensate. However, the further consumed fluid eventually escapes from the capillaries, becoming "fluid-retaining" and gaining weight in the patient. Once an allergenic response to a particular food has been diagnosed in a patient, an effective treatment is to remove that food from the patient's diet. However, since a typical daily menu contains many different types of food, it is considerably more difficult to determine in a particular patient what food provokes an allergic response and, therefore, should be avoided. It will be. Moreover, among medical professionals and publicly similar people, there is a general prejudice to the recognition of the causal link between the above-mentioned symptoms and allergic hypersensitivity. As a result, to date, studies on food hypersensitivity have been limited to those that deviate from mainstream, general medical procedures, and include techniques whose scientific roots have not been successfully explained. Testing for food hypersensitivity has traditionally been performed by the "skin piercing" test, which consists of piercing a patient with a small amount of food antigen into a sterile needle tip. The patient's response to food antigens is visually monitored to determine if hypersensitivity is manifested. Patients can be tested for hypersensitivity to five or more antigens simultaneously by multiple punctures at different skin sites, but the "prick" test is time consuming and It can take weeks to test dozens of foods for a patient. The ramming test also suffers from the need for visual monitoring. Therefore, and / or transient responses may be missed. It has been observed that if a sample is challenged with an antigen for a patient exhibiting an allergic reaction, the total number of white blood cells in the sample of blood from the patient is reduced. US-A-4,614,722 discloses methods and devices for determining the extent of reaction between an allergen of concern and a blood sample. The method consists of comparing the total number of white blood cells present in the sample before and after reaction with the allergen of concern. Various symptoms that may result from an allergic response to one or more foods in a patient are the release of granules from one or more populations of granulocytes into the patient's bloodstream, typically neutrophils. It can be caused by. In particular, certain food allergens are believed to interact with granulocytes in the patient's blood, rupture some of the granulocytes and release the granules into the bloodstream. Chemicals normally released by granules of cytoplasmic granulocytes by those skilled in the art, if released directly into the patient's bloodstream, may cause inflammation or destruction to tissues. It will be appreciated that it is caused by, and in turn leads to symptoms associated with the medical condition believed to be caused by food hypersensitivity. Thus, according to one aspect of the invention, there is provided a method of determining an allergenic response of a mammalian blood specimen to an antigen. The method consists of: a) adding an antigen to the blood sample to challenge the white blood cells in the blood sample; b) incubating the blood sample / antigen mixture; c ) Thereafter, the mixture is probed to determine the amount of degranulation of one or more granulocytes in said blood sample relative to a control blood sample without the addition of incubated antigen; and d) multiple Comparing the statistical mean degranulation with the amount of degranulation derived by testing other blood specimens of, and in doing so, is the amount of degranulation significant compared to the mean degranulation? Decide whether The invention also includes an in vitro method for diagnosing allergy in a patient, which method comprises collecting a blood sample from the patient and utilizing the method according to the invention to determine the allergenic response of the sample to an antigen. Consists of doing. In another aspect of the invention, there is also provided a device for determining the allergenic response of a mammalian blood sample to an antibody. The apparatus is a means for adding an antigen to a blood sample; an analyte / antigen for determining the amount of degranulation of a population of one or more granulocytes in a blood sample compared to a control blood sample in the absence of antigen Comparing the degranulation with a statistical mean degranulation derived from a plurality of other blood samples, whereby the amount of the granules is greater than the mean degranulation of the mean degranulation. It consists of means to determine whether it is significant compared to the quantity. Typically, the analyte / antibody mixture may be probed to determine the amount of degranulation in the neutrophil population. In some embodiments, the amount of degranulation may be determined by directly measuring the number of granules that have leaked into plasma from granulocytes in the sample. Alternatively, the amount of degranulation may be determined indirectly by measuring the loss of granules in the sample. In some embodiments, the amount of degranulation can be determined using a hematology analyzer. The hematology analyzer can probe the white blood cell population of a blood sample using a combination of radio frequency AC and DC. Typically, a hematology analyzer of the type commercially available under the trade name SYSMEX NE8000 from Messrs. Toa, Japan can be used. The principle and operating method of this hematology analyzer are clearly described in the attached manual, reference code NE-8000 / 11.88 (revised, 08.89, 12.89), available from Toa; See Section 4, “Principles of Operation”. The blood sample can be divided into a plurality of parts. The first portion can be treated with a lysing agent to lyse all cells in it except white blood cells. The second part can be treated with a lysing agent to lyse all cells except basophils. And the third part can be treated with a lysing agent to lyse all cells except eosinophils. Each section was suspended in electrolyte diluent and placed in a transducer chamber with a compartment dividing the transducer chamber into two regions. The partition can have a small opening between the two regions that extends through it. An electrode is prepared in each area. The size of the opening can be as large as the white blood cells in the blood sample; the electrolyte diluent can be selected to have a significantly different electrical conductivity than the white blood cells. it can. White blood cells in each section can be aspirated from one area of the transducer chamber to another through the openings. A substantially constant current can be applied from electrode to electrode. As the white blood cells pass through the opening, the voltage across the electrodes can transiently change by a detectable amount. The voltage can be continuously monitored during aspiration of cells and the number of cells passing through the opening can be counted. In the case of the second and third parts, the applied current may be a constant direct current; the total volume of each cell passing through the opening is considered to be proportional to the transient change in the voltage. In this way, it is considered that the numbers of basophils and eosinophils in the second and third parts can be counted respectively. A constant direct current and a constant radio frequency alternating current may be applied between the electrodes when aspirating the white blood cells in the first portion; as before, d. c. The transient change in the signal is believed to be proportional to the total volume of white blood cells as they pass through the opening. The volume of whole nuclei and cytoplasmic granules of the cell is r.p.m. f. It is believed to be proportional to the transient change in signal. Thus, the position of each leukocyte passing through the opening is first plotted against (i) the whole cell volume axis (dc pulse) and (ii) the nucleus and granule volume axis (rf pulse). The dispersion gram results from the aspiration of the part. The appearance of intact lymphocytes, granulocytes, and monocytes in different regions of the dispersed gram as a result of their different ratios of total volume to nuclear / granular volume is appreciated by those skilled in the art. Will. Thus, empirically, the "lymphocyte", "granulocyte", and "monocyte" regions in the scattergram can be drawn by applying the calculated "discrimination" line. The total number of cells representative of each region can then be counted. The apparent population of neutrophils in a blood sample can be calculated by subtracting the basophil and eosinophil counts in the second and third parts from the calculated apparent granulocyte population in the first part. . According to the invention, the degranulated granulocytes are d. c. And r. f. Under analysis, it will be appreciated that they appear as "monocytes" or "lymphocytes", as described above. Thus, in one aspect of the invention, degranulation in a population of one or more granulocytes in a blood sample results in an apparent increase in the number of monocytes, or lymphocytes, and typically neutrophils. It is believed that it can be detected as a clear decrease in the number of certain granulocytes. In the scattergram, this is thought to appear as a clear shift from the "granulocyte" region of the lymphocyte population to the monocyte region. Control specimens without antigen can be probed for a clear increase or decrease in the monocyte / lymphocyte and granulocyte population compared to the control in the amount of degranulation in blood specimens challenged with antigen, It can be determined by calculating each. Typically, multiple blood samples will be prepared and each blood sample can be challenged with a different antigen. In a particular aspect of the invention, the antigen may be a food antigen. In some embodiments, multiple food antigens may be selected that include sufficient food to make up a complete, balanced diet. The food antigen is provided as a suspension to the blood sample. The suspension medium is a glycerol or benzoyl solvent. In one embodiment, food antigens obtained from Messrs. Dome / Hollister-Stier may be used. Antigen suspensions are the type typically used in the invasive "skin bumping" test. The food antigen / glycerol suspension may be further diluted. The diluent may be saline, which is typically saline BP. Food antigen suspensions may contain small amounts of human serum albumin (HSA); about 0.01% to 0.05% HSA may be used, but typically Is 0.03%. Where food antigens obtained from Messrs. Hollister-Stier are used, the glycerol suspension may be diluted with saline BP in a ratio of about 1: 9, but the present invention provides a Hollister-Stier. It will be understood that it includes a dilution ratio of food antigen to saline in the range of 1: 5 to 1:15. Diluted food antigen in glycerol may be added to undiluted blood samples. An appropriate ratio of blood to food antigens is considered important. If the amount of blood used is too low, the fraction may lose its specificity. In one embodiment, the food antigen obtained from Mess rs. Hollister-Stier was diluted with 9 parts saline BP and contained 0.03% HSA, mixed with undiluted blood in a 50:50 ratio. To do. An antigen to blood ratio of 40:60 to 60:40 is believed to be successful when using this dilute glycerol suspension of food antigens. After the introduction of food antigen into the blood sample, the mixture is incubated. The duration of incubation is believed to be important for successful results. If the mixture is incubated for too long, the granulocyte response to food antigens becomes non-specific. The mixture can be incubated in the range of 30 minutes to 90 minutes, typically 60 minutes. An increase in each apparent monocyte / lymphocyte population and a decrease in granulocyte population of a blood sample for a given food antigen can be compared to the respective average increase and decrease obtained from multiple blood samples. it can. The significant increase and decrease, respectively, in comparison with the average value obtained, are considered to indicate hypersensitivity to the antigen of concern. The mean increase in monocyte / lymphocyte population and decrease in granulocyte population, respectively, can vary from food antigen to food antigen, but typically, for example, from about 5% in a population of neutrophils. A 10% decrease is believed to indicate hypersensitivity. Once hypersensitivity to a particular food antigen has been determined for a given blood sample, treatment of the patient can be done by advising him or her to remove that food from his diet. Otherwise, according to one aspect of the invention, the patient may limit his or her diet to foods that clearly do not provoke an allergenic reaction. Untested food is reintroduced, one at a time, over a period of time, paying attention to the patient's response over time. The present invention provides a method of testing a blood sample for an allergenic response to one or more food antigens. The method can be substantially automated using a hematology analyzer and a microprocessor to analyze the results. Large numbers of antigens can be tested in a short period of time, compared to the "skin-piercing" test known in the prior art for relatively short periods of time. The present invention provides a method of measuring relatively small changes in a leukocyte population in response to a challenge with a food antigen, and also provides a means of comparing the changes to a mean response based on multiple tests. Thus, the present invention can provide a more accurate and more sensitive method for determining the allergenic response of a given blood sample to a particular antigen. The following is a description by way of example only and with reference to the accompanying figures of methods of effectively carrying out the invention. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a dispersion gram of a control blood sample in the absence of antigen. FIG. 2 is a histogram of the blood sample shown in FIG. FIG. 3 is a dispersion gram of a blood sample after challenge with a food antigen from the same donor as the sample of FIG. FIG. 4 is a histogram corresponding to the dispersion gram in FIG. Figure 5 is a scattergram of different blood specimens from the same donor as in Figures 1 and 3, the different specimens being challenged with different food antigens. FIG. 6 is a histogram corresponding to the dispersion gram of FIG. A suitable class of food antigens for use in the conventional "skin-piercing" food hypersensitivity test was obtained from Messrs. Dome / Hollister. Each food antigen was supplied as a glycerol suspension and then diluted with 9 parts saline BP and 0.03% human albumin (HSA). Food antigens are as follows:- Blood samples were taken from the patient and divided into 100 parts. Each part was mixed with one of the food antigen mixtures in a ratio of 1 part blood to 1 part antigen mixture. 1 part blood was mixed with 1 part glycerol, 9 parts saline BP with an antigen-free mixture containing 0.03% HSA to serve as a control. The blood / food antigen and control specimens were then incubated at room temperature for approximately 1 hour. The control and blood food antigen mixture was analyzed using a hematology analyzer under the trade name SYSMEXN E8000 obtained from Messrs. Toa, Japan. The hematology analyzer divides the blood sample into multiple parts, the first part is treated with a lysing agent to lyse substantially all cells in the part except white blood cells, and the second part is A lysing agent is used to lyse substantially all cells except basophils, and a third portion is treated with a lysing agent to lyse substantially all cells except eosinophils. Each section is then suspended in an electrolyte diluent that is significantly different in conductivity from the white blood cells and placed in the first region of the transducer chamber. The cells are then drawn through a small opening made in the compartment in the chamber into the second region of the chamber, and a substantially constant current is applied to the first and second transducer chambers. It is applied between the first and second electrodes respectively arranged in the area. The opening has a diameter similar to that of the white blood cells in the opening. Therefore, as blood cells pass through the opening, the resistance of the electrical pathway between the electrodes in the chamber increases significantly. As a result, the voltage drop across the electrodes transiently increases by a detectable amount. When aspirating the second and third parts, a substantially constant direct current (dc) is applied between the electrodes, d. As the blood cells pass through the opening. c. The transient change in voltage is proportional to the volume of whole cells. When aspirating the first portion, a substantially constant direct current and a substantially constant radio frequency alternating current (rf) are applied. R. When passing white blood cells or openings. f. Transient changes in voltage are proportional to the density of whole nuclear and protoplasmic granules and leukocytes. Of the figures with the locations of the aspirated leukocytes in the first part attached, the first d. c. Pulse (total cell volume) axis and second r. f. Plotted against pulse (total nuclei and granule volume) axis. Intact granulocytes, monocytes and lymphocytes appear in different regions of the dispersed gram as a result of their different total volume and different nuclear / granular composition. Therefore, the scattergram can be divided into “granulocyte”, “monocyte” and “lymphocyte” regions by using the calculated “discrimination” line for the scattergram and plotted in each region. The total cell count can then be calculated. With reference to FIG. 1, granulocytes appear generally in the area marked 10 and monocytes are shown in box 12. The apparent population of neutrophils in the blood sample was calculated from the apparent population of total granulocytes counted in the first part of the basophils and eosinophils counted when inhaling the second and third parts. It can be calculated by subtracting the numbers. A hematology analyzer obtained from K. L. also showed a histogram showing the relative number of white blood cells counted / calculated in each cell population (see, eg, Figures 2, 4 and 6 of the previous figures). Thing). Control specimens in the absence of food antigen were fed to the hematology analyzer and the relative concentrations of each leukocyte population in the controls are shown in the table below. The corresponding scattergrams and histograms for control blood samples are shown in Figures 1 and 2, respectively. Each blood / food antigen mixture was sequentially subjected to a hematology analyzer and the results for two of the food antigens are shown in Tables 2 and 3, corresponding to Figures 3 and 4 and Figures 5 and 6, respectively. When comparing Table 1 and FIGS. 1 and 2 with Table 2 and FIGS. 3 and 4, respectively, it can be seen that there is almost no apparent change in the relative concentration of each leukocyte population. However, also in Table 3 and Figures 5 and 6, a clear decrease in the neutrophil population and a clear increase in the monocyte population can be detected. Although not defined by the rationale, there is a clear increase in the number of monocytes, a clear decrease in the number of neutrophils, and a concomitant dispersion of white blood cells from the granulocyte to monocyte region (box The apparent shift to 12) is caused by degranulation of granulocytes, including neutrophils. As a result, ruptured granulocytes appear in the dispersed gram as granule-free monocytes, or lymphocytes when the first part is aspirated. The granules themselves, which are released into the serum, are transported into the body in vivo and cause allergic symptoms such as migraine and rheumatism. On the other hand, the results in Table 2 and Figures 3 and 4 show no apparent response, suggesting that the patient is not significantly hypersensitive to that particular food antigen. It will be appreciated that the various leukocyte populations in blood naturally change over time. Therefore, it is important that the blood / food antigen mixture and the control mixture be probed as closely as possible using a hematology analyzer. Moreover, small changes in granulocyte / monocyte populations may be detected for any food antigen depending on the concentration of the food antigen and the suspension medium used. Therefore, it is important to determine which changes are positive for a particular food antigen. Therefore, the results obtained for one patient are compared to changes in the mean leukocyte population for a particular food antigen derived from multiple blood samples taken from different patients. For each food antigen, a significant change in one of the white blood cell populations compared to the mean value may indicate hypersensitivity to the food antigen. Thus, for example, a statistically significant decrease in the neutrophil population for patients who responded to a given food antigen compared to the mean value for that antigen is considered to be indicative of hypersensitivity to the same antigen. To be If hypersensitivity to a given food antigen is indicated using the method outlined above, the patient should be encouraged to use a menu containing only food that is clearly indicated to be unresponsive. Will be done. Food not included in the study can be populated over a period of time, one in the patient's diet. For example, using a hematology analyzer available under the SYSMEX NE8000 brand, patients can be tested for hypersensitivity to 99 food substances at 45 minutes plus an incubation time of about 1 hour. Thus, the method of the present invention is a much faster method for testing the allergenic response of blood specimens to multiple food antigens as compared to methods known in the art, such as the "skin stab" test. I will provide a. It will be appreciated by those skilled in the art that in some embodiments of the present invention, the output of data from the hematology analyzer can be processed by a computer to further automate the analytical procedure.
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９４年７月１９日
【補正内容】３４条補正明細書
フランス特許明細書No.２４６７４０１には、脱顆粒剤の作用を受けた血液好
塩基性顆粒球の差別計数のための過程が開示されている。その過程には、Alcian
Blueで染色した後、フローサイトメトリーの方法にしたがって作業するためのサ
イトグラフの使用が含まれる。本発明は、血漿と赤血球の溶解物から血液中の白
血球の集団を分離することを特徴とする。
本過程は、血液の好塩基集団が小さく、明細から明らかなように、各試験には
多量の血液を必要とするという不利をこうむっている。その上、血液の他の成分
から白血球集団を分離することの必要性は、少くとも一部には、やはり偶然的な
結果の不確かさに寄与している試験にとってかなり厄介である。
したがって、血液検体から白血球を分離しないで、また染色の使用に頼らない
で脱顆粒を明確に示す試験が必要である。
本出願者は、食物不耐性原に関する限り、血液検体の好中球集団の変化の測定
からよりよい結果か得られることが見出された。
本発明の１つの面においては、白血球細胞が好中球であり、抗原が血液検体に
加えられることを特徴とする懸念された抗原との反応の前後に、血液検体中に存
在する白血球細胞の数、および／または大きさの分布を比較することにより、哺
乳動物の血液の検体の抗原に対する不耐性誘発応答を決定する方法が提供されて
いる。検体／抗原混合物をインキュベートし、結果を抗原不含の対照検体と比較
することによって明らかな好中球集団を決定するために精査する。その場合、明
らかな好中球の集団の大きさにおける対照と較べて有意な変化は抗原に対する不
耐性誘発応答を示唆する。
本発明の別の面からは、ある患者に対して不耐性原を含まない食事を決定する
方法が提供されている。その方法は、患者の血液の検体を複数の部分に分け、そ
の複数の食物試料がバランスのとれた食事を構成する複数の食物試料を調製し、
血液の部分に各食物試料の測定した量を加え、材料／部分の混合物をインキュべ
ートし、明らかな好中球集団を決定するために、各混合物をヘマトロジーアナラ
イザーで分折し、そして、食物不含の対照の明らかな好中球の集団と比較する。
この際、混合物と対照の間の明らかな好中球の差は、その特定の食物試料が、そ
の患者に対して不耐性誘発反応を有することを示唆する。
本発明のさらなる一面において、本発明は、ある患者において、アレルギーを
診断するin vitroの方法を含んでいる。本方法は、その患者から血液の検体を採
取し、本発明にしたがった方法を利用して、抗原に対する検体のアレルギー誘発
応答を決定することからなる。
本発明の別の面においては、抗原に対する哺乳動物の血液のアレルギー誘発反
応を決定するための装置が提供されており、その装置は、以下の手段からなる：
すなわち、
血液検体に対して抗原を加える手段；
抗原不含の対照血液検体と比較して、血液検体中の脱顆粒の量を決定するため
に、血液検体／抗原混合物を精査する手段、そして、
脱顆粒の量を、複数の他の血液検体から導かれた統計的平均脱顆粒と比較し、
脱顆粒の量が、該平均脱顆粒と比較して有意であるか否かを決定する手段。
もっと具体的な面において、抗原に対する哺乳動物の血液の検体の不耐性誘発
応答を決定するための装置が提供されていて、その装置は以下を含む。すなわち
、
血液検体に対して抗原を加え、混合するための混合手段
該検体を細別するための手段
該検体の該細別からの血液細胞群を選択的に溶解するための手段
該検体の各々の細分において溶解しない明らかな集団を決定するための精査手
段、および検体中の明らかな溶解しない細胞集団を抗原不含の対照と比較するた
めの手段、
検体中の明らかな細胞集団を、抗原不含対照物のそれと共に計算するための計
算手段、その場合、検体と対照の間の好中球細胞集団における有意差は、抗原に
対する不耐性誘発応答を示唆する。
脱顆粒の量は、ある態様においては、検体中の好中球から血漿中に漏洩した顆
粒の数を直接測定することによって決定することができる。さもなければ、脱顆
粒の量は、検体中の好中球顆粒の喪失を測定することによって間接的に決定する
ことができる。
ある態様においては、脱顆粒の量は、ヘマトロジーアナライザーを使用して決
定することができる。ヘマトロジーアナライザーは、無線周波数交流と直流の組
み合せを使用して、血液の検体の白血球集団を精査することができる。典型的に
は、Messrs. 東亜、日本から商品名ＳＹＳＭＥＸ ＮＥ８０００の下に市販され
ている型のヘマトロジーアナライザーを使用することができる。このヘマトロジ
ーアナライザーの原理と操作法は、東亜から参照番号ＮＥ−８０００／１１．８
８の下に入手できるその添付マニュアル（改訂、０８．８９，１２．８９）にわ
かりやすく記述されている。特に、第４節「操作の原理」を参照のこと。３４条補正クレーム
請求の範囲
１．白血球細胞が好中球であり、該抗原が血液検体に加えられることを特徴と
する懸念されている抗原との反応の前後の血液検体中に存在する白血球細胞の数
、そして／または、大きさの分布を比較することによる哺乳動物の血液の検体の
抗原に対する不耐性誘発応答を決定する方法であって、検体／抗原混合物をイン
キュベートし、明らかな好中球集団を決定するために精査し、そして、次に、そ
の結果を、抗原を含まない対照検体と比較し、その際、対照に較べて、明らかな
好中球集団の大きさにおける有意な変化は、該抗原に対する不耐性誘発応答を示
唆する上記方法。
２．患者の血液の検体を、複数の部分に分け、複数の食物の試料が、バランス
のとれた食事を構成する複数の食物の試料を調製し、測定した量の各食物の試料
を血液の部分に加え、試料／検体の部分をインキュベートし、明らかな好中球集
団を決定するために、ヘマトロジーアナライザーで分析し、そして、食物を含ま
ない対照の好中球の明らかな集団と比較することを含む患者についての不耐性原
性のない食事を決定する方法であって、比較の際、混合物と対照の間の明らかな
好中球集団における差は、該特定の食物試料が、その患者に対する不耐性誘発反
応を生じたことを示唆する上記方法。
３．明らかな好中球の集団の決定が、以下によって行なわれることを特徴とす
る請求項１または２に記載の方法、すなわち、
インキュベートした各試料／検体の部分の混合物を多数の小試料に分ける、
白血球を除くすべての細胞を溶解させるために、最初の小試料をある溶解剤で
処理する、
好酸球を除くすべての細胞を溶解させるために、２番目の小試料をある溶解剤
で処理する、
好塩基球を除くすべての細胞を溶解するために、３番目の小試料をある溶解剤
て処理する、
その際、明らかな好中球集団を決定するために、明らかな細胞集団を決定する
ために、各小試料を精査する。
４．明らかな好中球集団の精査に、ヘマトロジーアナライザーが使用される検
体の分折を含むことを特徴とするすべての先行請求項に記載の方法。
５．ヘマトロジーアナライザーが、Messrs. 東亜、日本から入手できるSismex
ＮＥ８０００であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
６．不耐性原が全血液検体に添加されるすべての先行請求項に記載の方法。
７．混合物が、無線周波数交流電流と直流電流の組み合せを使用して精査され
るすべての先行請求項に記載の方法。
８．各血液検体が、検体の白血球と有意に異なる電気伝導度を有する電解質の
希釈剤中に懸濁されることがある請求項５から７のいずれか１つに記載の方法。
９．各検体が、小さい開口部を有する仕切りによってへだてられた少くとも２
つの領域をもつトランスデューサーチェンバー中に配置され、該開口部の大きさ
は、該細胞がその開口部を通って１つの領域から他の領域へと通過することがで
きるように、白血球細胞の大きさに近いことを特徴とする請求項８に記載の方法
。
10．電極が各領域に用意され、該電極間に事実上一定の電流が適用され、該電
極間の電圧をモニターする手段が提供され、検体の１つのチェンバーから他のチ
ェンバーへの吸引は、各細胞が、該開口部を通過するときに、電圧の変化を生じ
、その経時的変化の数は、検体の明らかな細胞集団を示唆している請求項９に記
載の方法。
11．懸濁状態にある血液検体に対して不耐性原が提出されることを特徴とする
すべての先行請求項に記載の方法。
12．懸濁媒体がグリセロール、またはベンゾイル溶剤であることを特徴とする
請求項１１に記載の方法。
13．不耐性原の懸濁物が、さらに希釈剤及び／又はヒト血清アルブミンの比率
を、重量に基いて０．０１％から０．０５％含むことを特徴とする請求項１２に
記載の方法。
14．希釈剤が、食塩水ＢＰであり、そして重量に基いて１：５から１：１５の
量比で使用されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15．不耐性原の懸濁物の非希釈血液検体に対する比率が４０：６０から６０：
４０の範囲にあるすべての先行請求項に記載の方法。
16．インキュベーション期間か環境温度において３０分から９０分であるすべ
ての先行請求項に記載の方法。
17．哺乳動物の血液検定の抗原に対する不耐性誘発応答を決定するための装置
であって、
以下を含む装置：
不耐性原を血液検体に加え、混合するための混合手段、
該検体を細分する手段、
該検体の該細分からの血液細胞の群を選択的に溶解するための溶解手段、
該検体の各細分部分における溶解されない細胞の明らかな集団を決定するため
の精査手段、
検体中の好中球の明らかな細胞集団を計算するための計算手段、そして、
検体中の好中球の明らかな細胞集団を不耐性原不含のそれと比較するための比
較手段、その際、検体と対照の間の細胞集団における有意差は、すべて、不耐性
原による不耐性誘発反応を示唆する。[Procedure Amendment] Patent Act Article 184-8 [Submission date] July 19, 1994 [Amendment content] Article 34 Amendment specification French patent specification No. 2467401 describes blood that has been affected by degranulation A process for differential counting of basophilic granulocytes is disclosed. The process involves the use of cytographs to work according to the method of flow cytometry after staining with Alcian Blue. The invention is characterized by separating a population of white blood cells in blood from plasma and red blood cell lysates. This process suffers from the disadvantage that the basophil population of blood is small and each test requires a large amount of blood, as is apparent from the description. Moreover, the need to separate leukocyte populations from other components of blood is, at least in part, a significant complication for tests that also contribute to the uncertainty of the accidental results. Therefore, there is a need for a test that demonstrates degranulation without separating leukocytes from blood samples and without resorting to the use of stains. The Applicant has found that, as far as food intolerant is concerned, better results are obtained from measuring changes in the neutrophil population of blood samples. In one aspect of the present invention, the white blood cells are neutrophils and the white blood cells present in the blood sample before and after the reaction with the concerned antigen characterized in that the antigen is added to the blood sample. By comparing the number and / or size distribution, a method is provided for determining the intolerance-evoked response of a mammalian blood specimen to an antigen. The specimen / antigen mixture is incubated and probed to determine the apparent neutrophil population by comparing the results to the antigen-free control specimen. In that case, a significant change in apparent neutrophil population size as compared to the control is indicative of an intolerance-induced response to the antigen. Another aspect of the invention provides a method for determining a diet free of intolerance sources for a patient. The method divides a sample of a patient's blood into multiple parts, prepares multiple food samples that make up a balanced diet, and places the measured amount of each food sample in the blood part. In addition, incubating the mixture of materials / portions, splitting each mixture with a hematology analyzer to determine the apparent population of neutrophils, and the apparent neutrophils of the food-free control. Compare with the population of. Here, the apparent difference in neutrophils between the mixture and the control suggests that the particular food sample has an intolerance-inducing response to the patient. In a further aspect of the invention, the invention comprises an in vitro method of diagnosing allergy in a patient. The method comprises taking a blood sample from the patient and utilizing the method according to the invention to determine the allergenic response of the sample to the antigen. In another aspect of the invention, there is provided a device for determining an allergenic response of mammalian blood to an antigen, the device comprising the following means: Means for adding; means for probing the blood sample / antigen mixture to determine the amount of degranulation in the blood sample as compared to a control blood sample without antigen; Means for determining whether the amount of degranulation is significant compared to the statistical mean degranulation derived from the blood sample of. In a more specific aspect, there is provided a device for determining an intolerance-inducing response of a mammalian blood specimen to an antigen, the device comprising: That is, mixing means for adding and mixing an antigen to a blood sample, means for subdividing the sample, means for selectively lysing blood cell groups from the subdivision of the sample, subdividing each of the samples A means for scrutiny to determine the apparent population that does not lyse in, and a means for comparing the apparent population of non-lysed cells in the specimen to a control without antigen, the apparent population of cells in the specimen to the antigen-free control Computational means for calculating with that of the product, where a significant difference in the neutrophil cell population between the specimen and control is indicative of an intolerance-evoked response to the antigen. The amount of degranulation can, in some embodiments, be determined by directly measuring the number of granules that have leaked from the neutrophils in the sample into the plasma. Otherwise, the amount of degranulation can be indirectly determined by measuring the loss of neutrophil granules in the sample. In some embodiments, the amount of degranulation can be determined using a hematology analyzer. The hematology analyzer can use a combination of radio frequency alternating current and direct current to probe the white blood cell population of a blood sample. Typically, a hematology analyzer of the type commercially available under the trade name SYSMEX NE8000 from Messrs. Toa, Japan can be used. The principles and operation of this hematology analyzer are described intelligibly in its accompanying manual (revised, 08.89, 12.89) available from Toa under the reference number NE-8000 / 11.88. In particular, see Section 4 "Principles of Operation". Article 34 Amended Claim Claims 1. The number and / or size of white blood cells present in the blood sample before and after reaction with the antigen of concern, characterized in that the white blood cells are neutrophils and the antigen is added to the blood sample. A method of determining an intolerance-induced response of a specimen of mammalian blood to an antigen by comparing the distribution of the specimens, wherein the specimen / antigen mixture is incubated and probed to determine a clear neutrophil population, Then, the results are then compared to a control sample containing no antigen, where a significant change in the size of the apparent neutrophil population compared to the control indicates an intolerance-inducing response to the antigen. The above method to suggest. 2. A sample of a patient's blood is divided into multiple parts, multiple food samples are prepared to form a balanced diet, multiple food samples are prepared, and a measured amount of each food sample is divided into blood parts. In addition, a portion of the sample / specimen was incubated, analyzed with a hematology analyzer to determine the apparent population of neutrophils, and compared to the apparent population of control neutrophils without food. A method of determining an intolerance-free diet for a patient comprising, when comparing, the apparent difference in the neutrophil population between the mixture and the control is due to the fact that the particular food sample is intolerant to that patient. The above method suggesting that a tolerance-evoked response has occurred. 3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the determination of the apparent population of neutrophils is performed by dividing the mixture of each sample / analyte part incubated into a number of small samples. Treat the first small sample with a lysing agent to lyse all cells except leukocytes, treat the second small sample with a lysing agent to lyse all cells except eosinophils , A third small sample is treated with a lysing agent to lyse all cells except basophils, in order to determine a clear neutrophil population, a clear cell population is determined In order to inspect each small sample. 4. The method according to all preceding claims, characterized in that the examination of the apparent neutrophil population comprises the analysis of the specimen for which a hematology analyzer is used. 5. Method according to claim 4, characterized in that the hematology analyzer is a Sismex NE8000 available from Messrs. Toa, Japan. 6. The method of any preceding claim, wherein the intolerant source is added to a whole blood sample. 7. The method according to all preceding claims, wherein the mixture is probed using a combination of radio frequency alternating current and direct current. 8. 8. The method of any one of claims 5-7, wherein each blood sample may be suspended in an electrolyte diluent having an electrical conductivity that is significantly different from the white blood cells of the sample. 9. Each specimen is placed in a transducer chamber with at least two regions that are indexed by a partition with a small opening, the size of the opening being such that the cells pass through the opening from one region. 9. The method of claim 8, wherein the method is close to the size of white blood cells so that it can pass to other areas. Ten. Electrodes are provided in each region, a substantially constant current is applied between the electrodes, a means is provided for monitoring the voltage across the electrodes, and aspiration of analyte from one chamber to the other is performed by each cell. 10. The method of claim 9, wherein a change in voltage occurs as it passes through the opening, the number of changes over time being indicative of a clear cell population of the analyte. 11. The method according to all preceding claims, characterized in that an intolerant source is submitted for a blood sample in suspension. 12. The method according to claim 11, wherein the suspension medium is glycerol or a benzoyl solvent. 13. 13. Process according to claim 12, characterized in that the suspension of the intolerant stock further comprises a proportion of diluent and / or human serum albumin of 0.01% to 0.05% by weight. 14. 14. Process according to claim 13, characterized in that the diluent is saline BP and is used in a weight ratio of 1: 5 to 1:15 by weight. 15. A method according to all preceding claims, wherein the ratio of the intolerant stock suspension to the undiluted blood sample is in the range of 40:60 to 60:40. 16． A method according to any preceding claim, which is 30 to 90 minutes at the incubation period or at ambient temperature. 17. A device for determining an intolerance-induced response to an antigen in a mammalian blood assay, comprising: mixing means for adding and mixing an intolerant source to a blood sample, means for subdividing the sample, A lysis means for selectively lysing a group of blood cells from the subdivision of the specimen, a probe means for determining a clear population of unlysed cells in each subdivision of the specimen, neutrophils in the specimen And a comparison means for comparing the apparent cell population of neutrophils in a sample with that of the intolerant source-free, wherein All significant differences in cell populations indicate an intolerance-evoked response by the intolerant source.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
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Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，
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Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ
，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，
ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ
(72)発明者 プライス，トマス ガードナー
イギリス国アールエイチ３ ７エイチエイ
チ サーレー，ベッチワース，ウエル ホ
ール レーン，キーパーズ コッティッジ
（番地なし)
(72)発明者 ストエイクス，イアン
イギリス国ジーユー５ ９キューエイチ
サーレー，シアー，フック レーン，シア
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