JPH083194A - チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質 - Google Patents
チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質Info
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- JPH083194A JPH083194A JP15539394A JP15539394A JPH083194A JP H083194 A JPH083194 A JP H083194A JP 15539394 A JP15539394 A JP 15539394A JP 15539394 A JP15539394 A JP 15539394A JP H083194 A JPH083194 A JP H083194A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｓｔａｔタンパク質と関連する分子を探求す
ることにより上記ＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔ
ファミリータンパク質を利用するシグナル伝達経路を解
明し、併せて該伝達経路によってサイトカインや増殖因
子からの情報が細胞の核内に伝達される機構を明らかに
することによりその医薬用途への応用を検討する。 【構成】 以下の性質： （１）分子量が７２ｋＤである； （２）Ｓｔａｔタンパク質と結合する； （３）各種サイトカインによってチロシンリン酸化され
る；および （４）チロシンキナーゼ活性を有する、を有するタンパ
ク質。
ることにより上記ＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔ
ファミリータンパク質を利用するシグナル伝達経路を解
明し、併せて該伝達経路によってサイトカインや増殖因
子からの情報が細胞の核内に伝達される機構を明らかに
することによりその医薬用途への応用を検討する。 【構成】 以下の性質： （１）分子量が７２ｋＤである； （２）Ｓｔａｔタンパク質と結合する； （３）各種サイトカインによってチロシンリン酸化され
る；および （４）チロシンキナーゼ活性を有する、を有するタンパ
ク質。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はチロシンキナーゼ活性を
有する新規なタンパク質に関する。さらに詳しくは、本
発明は造血系サイトカインのシグナル伝達経路に関与す
るチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質に関する。
有する新規なタンパク質に関する。さらに詳しくは、本
発明は造血系サイトカインのシグナル伝達経路に関与す
るチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質に関する。
【０００２】
【従来技術】造血系サイトカインは造血系細胞の各段階
における増殖および分化を刺激することによって造血に
関与する（Clark, S.C. et al., Science 236:1229, 19
87;Metcalf, D., Nature 339:27, 1989; Metcalf, D.,
Blood 82:3515, 1993）。例えば、インターロイキン−
３（ＩＬ−３）は多能性幹細胞コロニーの分化に必要な
造血系サイトカインである（Suda, T. et al., J. Cell
Physiol. 124:182, 1985; Ihle, J.N., Chem. Immuno
l. 51:65, 1992）。インターロイキン−６（ＩＬ−６）
および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）はＩＬ−
３依存性のネズミ多能性幹細胞コロニー形成を増強する
（Ikebuchi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:9035, 1987; Ikebuchi, K. et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci.USA 85:3445, 1988）。この他にもＩＬ−６は
活性化Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化、巨核球の成
熟化、ならびにある種の骨髄白血病細胞の分化を誘導
し、また骨髄腫細胞の増殖因子として作用するなどの多
様な活性を有している（Hirano, T. et al, Handbook o
f Experimental Pharmacology "Peptide Growth Factor
s and Their Receptors", vol 95 Berlin, Germany, Sp
ringer-Verlag, 1990,p.633; Hirano, T., Chem. Immun
ol. 51:153, 1992）。また、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球の成長
および成熟化に不可欠なサイトカインである（Nagata,
S., Handbookof Experimental Pharmacology "Peptide
Growth Factors and Their Receptors", vol 95 Berli
n, Germany, Springer-Verlag, 1990, p.699; Demetri,
G.D.et al., Blood 78:2791, 1991）。
における増殖および分化を刺激することによって造血に
関与する（Clark, S.C. et al., Science 236:1229, 19
87;Metcalf, D., Nature 339:27, 1989; Metcalf, D.,
Blood 82:3515, 1993）。例えば、インターロイキン−
３（ＩＬ−３）は多能性幹細胞コロニーの分化に必要な
造血系サイトカインである（Suda, T. et al., J. Cell
Physiol. 124:182, 1985; Ihle, J.N., Chem. Immuno
l. 51:65, 1992）。インターロイキン−６（ＩＬ−６）
および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）はＩＬ−
３依存性のネズミ多能性幹細胞コロニー形成を増強する
（Ikebuchi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:9035, 1987; Ikebuchi, K. et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci.USA 85:3445, 1988）。この他にもＩＬ−６は
活性化Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化、巨核球の成
熟化、ならびにある種の骨髄白血病細胞の分化を誘導
し、また骨髄腫細胞の増殖因子として作用するなどの多
様な活性を有している（Hirano, T. et al, Handbook o
f Experimental Pharmacology "Peptide Growth Factor
s and Their Receptors", vol 95 Berlin, Germany, Sp
ringer-Verlag, 1990,p.633; Hirano, T., Chem. Immun
ol. 51:153, 1992）。また、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球の成長
および成熟化に不可欠なサイトカインである（Nagata,
S., Handbookof Experimental Pharmacology "Peptide
Growth Factors and Their Receptors", vol 95 Berli
n, Germany, Springer-Verlag, 1990, p.699; Demetri,
G.D.et al., Blood 78:2791, 1991）。
【０００３】ところで、これらの造血系サイトカインの
レセプターはその細胞外ドメインに共通の特徴をもって
いることが報告されている（Bazan, J.F., Immnol. Tod
ay 11:350, 1990）。さらに、このファミリーの中で
は、Ｇ−ＣＳＦレセプター、白血病増殖阻止因子（ＬＩ
Ｆ）レセプターおよびＩＬ−６シグナルトランスデュー
サーであるｇｐ１３０が高度の類似性を有しており、こ
の類似部分は細胞内ドメインにまで及んでいる（Fukuna
ga, R. et al., Cell 61:341, 1990; Hibi, M. et al.,
Cell 63:1149, 1990; Fukunaga, R. et al., EMBO J.
10:2855, 1991; Geaning, D.P. et al., EMBO J. 10:28
39, 1991）。この類似性は造血系サイトカインレセプタ
ーが類似のシグナル伝達経路をもつことを示唆してお
り、またこのようないくつかのサイトカインレセプター
間におけるレセプターサブユニットの共有によって、サ
イトカイン活性における機能的重複（ｒｅｄｕｎｄａｎ
ｃｙ）の分子メカニズムをある程度説明できるかも知れ
ない。
レセプターはその細胞外ドメインに共通の特徴をもって
いることが報告されている（Bazan, J.F., Immnol. Tod
ay 11:350, 1990）。さらに、このファミリーの中で
は、Ｇ−ＣＳＦレセプター、白血病増殖阻止因子（ＬＩ
Ｆ）レセプターおよびＩＬ−６シグナルトランスデュー
サーであるｇｐ１３０が高度の類似性を有しており、こ
の類似部分は細胞内ドメインにまで及んでいる（Fukuna
ga, R. et al., Cell 61:341, 1990; Hibi, M. et al.,
Cell 63:1149, 1990; Fukunaga, R. et al., EMBO J.
10:2855, 1991; Geaning, D.P. et al., EMBO J. 10:28
39, 1991）。この類似性は造血系サイトカインレセプタ
ーが類似のシグナル伝達経路をもつことを示唆してお
り、またこのようないくつかのサイトカインレセプター
間におけるレセプターサブユニットの共有によって、サ
イトカイン活性における機能的重複（ｒｅｄｕｎｄａｎ
ｃｙ）の分子メカニズムをある程度説明できるかも知れ
ない。
【０００４】最近になって、各種インターフェロン（Ｉ
ＦＮ）がチロシンキナーゼ、および細胞内転写促進因子
であるＳｔａｔファミリータンパク質（シグナルトラン
スデューサーであり、かつ転写因子に対する用語として
用いられる）の活性化を誘導することが示された（Fu,
X.Y. et al., Cell 70:323, 1992; Schindler, C. eta
l., Science 257:809, 1992; Shuai, K. et al., Scien
ce 258:1808, 1992; Shuai, K. et al., Science 261:1
744, 1993）。また、Ｊａｋファミリーチロシンキナー
ゼとＳｔａｔタンパク質はいずれもＩＦＮα／βおよび
ＩＦＮγ媒介性のシグナル伝達経路に不可欠であること
が示された（Valazquez, L. et al., Cell 70:313, 199
2; Muller, M. et al., Nature 366:129, 1993; Watlin
g, D. etal., Nature 366:166, 1993）。さらには、各
種サイトカインならびに増殖因子へのＪａｋ／Ｓｔａｔ
媒介性シグナル伝達経路の関与が示された（Sadowski,
H.B. et al., Science 261:1739, 1993; Larner, A.C.
et al., Science 261:1730, 1993; Ruff-Jamison, S. e
t al., Science 261:1733, 1993; Silvennoinen, O. et
al., Science 1736, 1993; Kotanides, H. et al., Sc
ience 262:1265, 1993; Bonni, A. et al., Science 26
2:1575, 1993; Fu, X.Y. et al., Cell 74:1135, 199
3）ことから、このシグナル伝達経路がこれらのサイト
カインや増殖因子の生物学的活性の発現に重要な役割を
果たしていることが示唆される。Ｓｔａｔファミリータ
ンパク質のチロシンリン酸化がその活性化および核への
移行に不可欠であり（Shuai, K. et al., Science 258:
1808, 1992; Shuai, K. et al.,Science 261:1744, 199
3）、またＪａｋキナーゼがＳｔａｔファミリータンパ
ク質のチロシン残基を直接リン酸化するのかも知れない
ことが示唆された（Schai,K. et al., Nature 366:580,
1993; Silvennoinen, O. et al., Nature 366:583, 19
93）。しかしながら、Ｓｔａｔファミリータンパク質の
正確な活性化機構は解明されていないままであった。
ＦＮ）がチロシンキナーゼ、および細胞内転写促進因子
であるＳｔａｔファミリータンパク質（シグナルトラン
スデューサーであり、かつ転写因子に対する用語として
用いられる）の活性化を誘導することが示された（Fu,
X.Y. et al., Cell 70:323, 1992; Schindler, C. eta
l., Science 257:809, 1992; Shuai, K. et al., Scien
ce 258:1808, 1992; Shuai, K. et al., Science 261:1
744, 1993）。また、Ｊａｋファミリーチロシンキナー
ゼとＳｔａｔタンパク質はいずれもＩＦＮα／βおよび
ＩＦＮγ媒介性のシグナル伝達経路に不可欠であること
が示された（Valazquez, L. et al., Cell 70:313, 199
2; Muller, M. et al., Nature 366:129, 1993; Watlin
g, D. etal., Nature 366:166, 1993）。さらには、各
種サイトカインならびに増殖因子へのＪａｋ／Ｓｔａｔ
媒介性シグナル伝達経路の関与が示された（Sadowski,
H.B. et al., Science 261:1739, 1993; Larner, A.C.
et al., Science 261:1730, 1993; Ruff-Jamison, S. e
t al., Science 261:1733, 1993; Silvennoinen, O. et
al., Science 1736, 1993; Kotanides, H. et al., Sc
ience 262:1265, 1993; Bonni, A. et al., Science 26
2:1575, 1993; Fu, X.Y. et al., Cell 74:1135, 199
3）ことから、このシグナル伝達経路がこれらのサイト
カインや増殖因子の生物学的活性の発現に重要な役割を
果たしていることが示唆される。Ｓｔａｔファミリータ
ンパク質のチロシンリン酸化がその活性化および核への
移行に不可欠であり（Shuai, K. et al., Science 258:
1808, 1992; Shuai, K. et al.,Science 261:1744, 199
3）、またＪａｋキナーゼがＳｔａｔファミリータンパ
ク質のチロシン残基を直接リン酸化するのかも知れない
ことが示唆された（Schai,K. et al., Nature 366:580,
1993; Silvennoinen, O. et al., Nature 366:583, 19
93）。しかしながら、Ｓｔａｔファミリータンパク質の
正確な活性化機構は解明されていないままであった。
【０００５】最近になって本発明者らは、マウス造血系
細胞のＢＡＦｍ１３０およびＹ６細胞において、ＩＬ−
６がＩＬ−６シグナルトランスデューサーであるｇｐ１
３０、細胞質チロシンキナーゼのＪａｋファミリー、な
らびにＳｔａｔタンパク質を含むマウス細胞タンパク質
のチロシンリン酸化を誘導することを見いだして報告
し、ＩＬ−６の刺激伝達について図１に示すような仮想
的なシグナル伝達経路を提示した（Matsuda, T. et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun. 200:821-828, 19
94）。このＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔファミ
リータンパク質を利用するシグナル伝達経路は各種サイ
トカインならびに増殖因子に共通なシグナル伝達経路で
あることが示唆されたが、Ｓｔａｔタンパク質を活性化
するのに必要な分子は依然として不明であった。
細胞のＢＡＦｍ１３０およびＹ６細胞において、ＩＬ−
６がＩＬ−６シグナルトランスデューサーであるｇｐ１
３０、細胞質チロシンキナーゼのＪａｋファミリー、な
らびにＳｔａｔタンパク質を含むマウス細胞タンパク質
のチロシンリン酸化を誘導することを見いだして報告
し、ＩＬ−６の刺激伝達について図１に示すような仮想
的なシグナル伝達経路を提示した（Matsuda, T. et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun. 200:821-828, 19
94）。このＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔファミ
リータンパク質を利用するシグナル伝達経路は各種サイ
トカインならびに増殖因子に共通なシグナル伝達経路で
あることが示唆されたが、Ｓｔａｔタンパク質を活性化
するのに必要な分子は依然として不明であった。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】本発明の目的は、Ｓｔａｔタ
ンパク質と関連する分子を探求することにより上記Ｊａ
ｋファミリーキナーゼとＳｔａｔファミリータンパク質
を利用するシグナル伝達経路を解明し、併せてこの伝達
経路によってサイトカインや増殖因子からの情報が細胞
の核内に伝達される機構を明らかにすることによりその
医薬用途への応用を検討することにある。
ンパク質と関連する分子を探求することにより上記Ｊａ
ｋファミリーキナーゼとＳｔａｔファミリータンパク質
を利用するシグナル伝達経路を解明し、併せてこの伝達
経路によってサイトカインや増殖因子からの情報が細胞
の核内に伝達される機構を明らかにすることによりその
医薬用途への応用を検討することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、Ｓｔａｔタンパク
質と密接に関連するチロシンキナーゼ活性を有する新規
なタンパク質を同定してその性状を明らかにし、また造
血系細胞におけるサイトカインによる刺激との関係を明
らかにすることに成功した。
を解決するために鋭意研究した結果、Ｓｔａｔタンパク
質と密接に関連するチロシンキナーゼ活性を有する新規
なタンパク質を同定してその性状を明らかにし、また造
血系細胞におけるサイトカインによる刺激との関係を明
らかにすることに成功した。
【０００８】すなわち、本発明は以下の性質： （１）分子量が７２ｋＤである； （２）Ｓｔａｔタンパク質と結合する； （３）各種サイトカインによってチロシンリン酸化され
る；および （４）チロシンキナーゼ活性を有する、を有するタンパ
ク質を提供する。
る；および （４）チロシンキナーゼ活性を有する、を有するタンパ
ク質を提供する。
【０００９】本発明のタンパク質は以下の方法によって
得ることができる。まず、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝
達経路を刺激すると考えられるＩＬ−３、ＩＬ−６また
はＧ−ＣＳＦなどのサイトカインを、それらサイトカイ
ンの刺激伝達に関与するレセプターをもつ細胞とともに
インキュベートした後、これから細胞溶解物を得る。
得ることができる。まず、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝
達経路を刺激すると考えられるＩＬ−３、ＩＬ−６また
はＧ−ＣＳＦなどのサイトカインを、それらサイトカイ
ンの刺激伝達に関与するレセプターをもつ細胞とともに
インキュベートした後、これから細胞溶解物を得る。
【００１０】次いで細胞溶解物を抗Ｓｔａｔ抗血清で免
疫沈降させて本発明のタンパク質を抗Ｓｔａｔ抗血清と
共沈させる。これをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、
抗Ｓｔａｔ抗血清および抗リン酸化チロシン抗体に結合
することを指標として本発明タンパク質をゲルから切り
出す。得られたタンパク質画分を、通常のタンパク質に
用いられる各種の分離、精製方法を用いて分離、精製す
る。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩
析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用することが
できる。
疫沈降させて本発明のタンパク質を抗Ｓｔａｔ抗血清と
共沈させる。これをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、
抗Ｓｔａｔ抗血清および抗リン酸化チロシン抗体に結合
することを指標として本発明タンパク質をゲルから切り
出す。得られたタンパク質画分を、通常のタンパク質に
用いられる各種の分離、精製方法を用いて分離、精製す
る。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩
析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用することが
できる。
【００１１】本発明者らは、ＩＬ−６およびＩＬ−６結
合分子である可溶性ＩＬ−６レセプターα鎖（ＩＬ−６
Ｒα）で刺激したＢＡＦｍ１３０細胞からの細胞溶解物
を、抗Ｓｔａｔ抗血清で免疫沈降させることにより、分
子量１５０、９０、および７２ｋＤのチロシンリン酸化
された分子を検出した。ｐ９１ Ｓｔａｔタンパク質の
Ｎ末端領域に対するモノクローナル抗体を用いても実質
的に同じ結果が得られた。また、抗Ｓｔａｔ抗血清は、
Ｓｔａｔファミリータンパク質である９０ｋＤおよび１
００ｋＤタンパク質とも反応したので、上記９０ｋＤ分
子はＳｔａｔタンパク質に由来するものと考えられる。
先にＦｕらは、Ａ４３１細胞中において、ｐ９１ Ｓｔ
ａｔタンパク質のＳＨ２領域に対する抗血清によって７
５ｋＤ分子が認識され免疫沈降されることを報告してい
る（Fu, X.Y. et al., Cell 74:1135, 1993）。しかし
ながら、上記１５０ｋＤおよび７２ｋＤタンパク質はい
ずれも抗Ｓｔａｔ抗血清とも抗ｐ９１のＳＨ２抗体とも
交差反応しなかった。これらの結果から、ＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒαによる刺激がＳｔａｔファミリータン
パク質と、Ｓｔａｔに結合した１５０ｋＤおよび７２ｋ
Ｄ分子のチロシンリン酸化を誘導することを示す。
合分子である可溶性ＩＬ−６レセプターα鎖（ＩＬ−６
Ｒα）で刺激したＢＡＦｍ１３０細胞からの細胞溶解物
を、抗Ｓｔａｔ抗血清で免疫沈降させることにより、分
子量１５０、９０、および７２ｋＤのチロシンリン酸化
された分子を検出した。ｐ９１ Ｓｔａｔタンパク質の
Ｎ末端領域に対するモノクローナル抗体を用いても実質
的に同じ結果が得られた。また、抗Ｓｔａｔ抗血清は、
Ｓｔａｔファミリータンパク質である９０ｋＤおよび１
００ｋＤタンパク質とも反応したので、上記９０ｋＤ分
子はＳｔａｔタンパク質に由来するものと考えられる。
先にＦｕらは、Ａ４３１細胞中において、ｐ９１ Ｓｔ
ａｔタンパク質のＳＨ２領域に対する抗血清によって７
５ｋＤ分子が認識され免疫沈降されることを報告してい
る（Fu, X.Y. et al., Cell 74:1135, 1993）。しかし
ながら、上記１５０ｋＤおよび７２ｋＤタンパク質はい
ずれも抗Ｓｔａｔ抗血清とも抗ｐ９１のＳＨ２抗体とも
交差反応しなかった。これらの結果から、ＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒαによる刺激がＳｔａｔファミリータン
パク質と、Ｓｔａｔに結合した１５０ｋＤおよび７２ｋ
Ｄ分子のチロシンリン酸化を誘導することを示す。
【００１２】ＩＬ−３で刺激したＢＡＦ−Ｂ０３細胞、
およびＧ−ＣＳＦで刺激したＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞を
用いて同様の試験を行ったところ、ＩＬ−３およびＧ−
ＣＳＦのいずれもがそれぞれＢＡＦ−Ｂ０３細胞中およ
びＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞中でＳｔａｔファミリータン
パク質、Ｓｔａｔに結合した１５０ｋＤおよび７２ｋＤ
分子のチロシンリン酸化を誘導した。さらに、Ｓｔａｔ
に結合した７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化は別の造血
系細胞であるＹ６においてもＩＬ−６刺激により誘導さ
れた。
およびＧ−ＣＳＦで刺激したＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞を
用いて同様の試験を行ったところ、ＩＬ−３およびＧ−
ＣＳＦのいずれもがそれぞれＢＡＦ−Ｂ０３細胞中およ
びＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞中でＳｔａｔファミリータン
パク質、Ｓｔａｔに結合した１５０ｋＤおよび７２ｋＤ
分子のチロシンリン酸化を誘導した。さらに、Ｓｔａｔ
に結合した７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化は別の造血
系細胞であるＹ６においてもＩＬ−６刺激により誘導さ
れた。
【００１３】この７２ｋＤ分子はそれ自体インビトロの
キナーゼ活性を有し、自己リン酸化されていることがゲ
ル内リン酸化活性測定によって確認された。また、この
インビトロのキナーゼ活性は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒα
により刺激されたＢＡＦｍ１３０細胞において増強され
ており、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポ
リンによって完全に阻害されたが、Ｈ７によっては阻害
されなかった。
キナーゼ活性を有し、自己リン酸化されていることがゲ
ル内リン酸化活性測定によって確認された。また、この
インビトロのキナーゼ活性は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒα
により刺激されたＢＡＦｍ１３０細胞において増強され
ており、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポ
リンによって完全に阻害されたが、Ｈ７によっては阻害
されなかった。
【００１４】次いで、リン酸化された７２ｋＤ分子のリ
ン酸化アミノ酸分析を行ったところ、チロシン残基のみ
がリン酸化されていた。
ン酸化アミノ酸分析を行ったところ、チロシン残基のみ
がリン酸化されていた。
【００１５】以上から、本発明のタンパク質はＳｔａｔ
タンパク質と結合するチロシンキナーゼであり、ＩＬ−
３、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦなどの造血系サイトカイ
ンによって活性化されることが明らかとなった。
タンパク質と結合するチロシンキナーゼであり、ＩＬ−
３、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦなどの造血系サイトカイ
ンによって活性化されることが明らかとなった。
【００１６】また、分子量が７０〜８０ｋＤの公知のチ
ロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＴｅｃおよびＢｔｋ）に対す
る特異的抗血清とのイムノブロッティングの結果から、
本発明の７２ｋＤのタンパク質はこれら公知のチロシン
キナーゼとは異なる新規なチロシンキナーゼであること
が判明した。
ロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＴｅｃおよびＢｔｋ）に対す
る特異的抗血清とのイムノブロッティングの結果から、
本発明の７２ｋＤのタンパク質はこれら公知のチロシン
キナーゼとは異なる新規なチロシンキナーゼであること
が判明した。
【００１７】本発明のチロシンキナーゼ活性を有するタ
ンパク質はＳｔａｔファミリータンパク質を直接活性化
するか、Ｊａｋファミリーにより活性化されたＳｔａｔ
ファミリータンパク質の機能を修飾する可能性がある。
あるいはＩＬ−３、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦ関連のサ
イトカインサブファミリーのためのＳｔａｔタンパク質
とは別のシグナル伝達分子を活性化するとも考えられ
る。したがって、本発明のチロシンキナーゼ活性を有す
るタンパク質は、ＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔ
ファミリータンパク質を利用するシグナル伝達経路にお
ける阻害剤の探索に利用することができる。この点か
ら、本発明のチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質
は例えば、サイトカインに依存して増殖する癌の治療剤
として、あるいは特定のサイトカインの機能調整剤とし
て利用しうる可能性を有している。
ンパク質はＳｔａｔファミリータンパク質を直接活性化
するか、Ｊａｋファミリーにより活性化されたＳｔａｔ
ファミリータンパク質の機能を修飾する可能性がある。
あるいはＩＬ−３、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦ関連のサ
イトカインサブファミリーのためのＳｔａｔタンパク質
とは別のシグナル伝達分子を活性化するとも考えられ
る。したがって、本発明のチロシンキナーゼ活性を有す
るタンパク質は、ＪａｋファミリーキナーゼとＳｔａｔ
ファミリータンパク質を利用するシグナル伝達経路にお
ける阻害剤の探索に利用することができる。この点か
ら、本発明のチロシンキナーゼ活性を有するタンパク質
は例えば、サイトカインに依存して増殖する癌の治療剤
として、あるいは特定のサイトカインの機能調整剤とし
て利用しうる可能性を有している。
【００１８】
実施例１：細胞系の調製 １０％ウシ胎児血清およびＷＥＨＩ−３Ｂ細胞からの１
０％培養上清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、Ｉ
Ｌ−３依存性マウスプロＢ細胞であるＢＡＦ−Ｂ０３
（Hatakeyama, M. et al., Cell 59:837, 1989; 寄託番
号ＲＣＢ０８０５で理化学研究所に寄託）を培養した。
０％培養上清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、Ｉ
Ｌ−３依存性マウスプロＢ細胞であるＢＡＦ−Ｂ０３
（Hatakeyama, M. et al., Cell 59:837, 1989; 寄託番
号ＲＣＢ０８０５で理化学研究所に寄託）を培養した。
【００１９】マウスｇｐ１３０のｃＤＮＡを含むプラス
ミドｐＢＣＭＧｍ１３０で上記ＢＡＦ−Ｂ０３細胞をト
ランスフェクションすることによって、マウスｇｐ１３
０を発現する安定な形質転換体ＢＡＦｍ１３０を樹立し
た（Matsuda, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Com
mun. 200:821-828, 1994）。マウスｇｐ１３０をコード
するｃＤＮＡを、マウスｇｐ１３０のｃＤＮＡ配列（Sa
ito, M. et al., J. Immunol. 148:4066, 1992）に基づ
いてＰＣＲクローニングすることによって得て、これを
発現ベクターｐＢＣＭＧｎｅｏ（Ｈ．Ｋａｒａｓｕｙａ
ｍａ博士から恵与された；Karasuyama, H. et al., Eu
r. J. Immunol. 18:97, 1988）のＸｈｏＩ部位にサブク
ローニングした。ＢＡＦｍ１３０は１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８の存在下に上記培地中で維持した。同様に、プラス
ミドｐＥＦＢＯＳｈＧＣＳＦＲ（Ｓ．Ｎａｇａｔａ博士
から恵与された；Fukunaga, R. et al., EMBO J. 10:28
55, 1991）でＢＡＦ−Ｂ０３細胞をトランスフェクショ
ンすることによって、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターを発現
する安定な形質転換体ＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞を樹立
し、上記条件下に維持した。
ミドｐＢＣＭＧｍ１３０で上記ＢＡＦ−Ｂ０３細胞をト
ランスフェクションすることによって、マウスｇｐ１３
０を発現する安定な形質転換体ＢＡＦｍ１３０を樹立し
た（Matsuda, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Com
mun. 200:821-828, 1994）。マウスｇｐ１３０をコード
するｃＤＮＡを、マウスｇｐ１３０のｃＤＮＡ配列（Sa
ito, M. et al., J. Immunol. 148:4066, 1992）に基づ
いてＰＣＲクローニングすることによって得て、これを
発現ベクターｐＢＣＭＧｎｅｏ（Ｈ．Ｋａｒａｓｕｙａ
ｍａ博士から恵与された；Karasuyama, H. et al., Eu
r. J. Immunol. 18:97, 1988）のＸｈｏＩ部位にサブク
ローニングした。ＢＡＦｍ１３０は１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８の存在下に上記培地中で維持した。同様に、プラス
ミドｐＥＦＢＯＳｈＧＣＳＦＲ（Ｓ．Ｎａｇａｔａ博士
から恵与された；Fukunaga, R. et al., EMBO J. 10:28
55, 1991）でＢＡＦ−Ｂ０３細胞をトランスフェクショ
ンすることによって、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターを発現
する安定な形質転換体ＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞を樹立
し、上記条件下に維持した。
【００２０】マウス造血系細胞Ｙ６（Oritani, K. et a
l., Blood 80:2298, 1992）は、１０％ウシ胎児血清を
補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。
l., Blood 80:2298, 1992）は、１０％ウシ胎児血清を
補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。
【００２１】実施例２：抗体の調製 Ｓｔａｔファミリータンパク質の間で保存されている特
異的配列（Fu, X.Y.,Cell 70:323, 1992）であるＳｔａ
ｔ９１／８４の領域Ｂ（アミノ酸残基６４６−６６０）
に対応する合成ペプチドでウサギを免疫することによ
り、ウサギ抗Ｓｔａｔ抗血清を作製して免疫沈降試験に
用いた。
異的配列（Fu, X.Y.,Cell 70:323, 1992）であるＳｔａ
ｔ９１／８４の領域Ｂ（アミノ酸残基６４６−６６０）
に対応する合成ペプチドでウサギを免疫することによ
り、ウサギ抗Ｓｔａｔ抗血清を作製して免疫沈降試験に
用いた。
【００２２】ｐ９１ Ｓｔａｔタンパク質のＮ末端領域
に対するモノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ
ｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｐ９１
Ｓｔａｔタンパク質のＳＨ２ドメインに対する抗血清は
Ｘ．Ｙ．Ｆｕ博士から恵与された。
に対するモノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ
ｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ｐ９１
Ｓｔａｔタンパク質のＳＨ２ドメインに対する抗血清は
Ｘ．Ｙ．Ｆｕ博士から恵与された。
【００２３】公知のチロシンキナーゼであるＳｙｋ，Ｔ
ｅｃおよびＢｔｋに対する抗血清はＥ．Ｃｌａｒｋ博
士、Ｈ．Ｍａｎｏ博士およびＳ．Ｔｓｕｋａｄａ博士か
らそれぞれ恵与された。
ｅｃおよびＢｔｋに対する抗血清はＥ．Ｃｌａｒｋ博
士、Ｈ．Ｍａｎｏ博士およびＳ．Ｔｓｕｋａｄａ博士か
らそれぞれ恵与された。
【００２４】実施例３：免疫沈降およびイムノブロット
（ＩＬ−６刺激） ＩＬ−６刺激によるＳｔａｔ関連タンパク質のチロシン
リン酸化を検討するために以下の実験を行った。
（ＩＬ−６刺激） ＩＬ−６刺激によるＳｔａｔ関連タンパク質のチロシン
リン酸化を検討するために以下の実験を行った。
【００２５】ＢＡＦｍ１３０細胞を血清不含培地中で１
〜２時間培養し、次いでＩＬ−６（２００ｎｇ／ｍ
ｌ）、および可溶性ＩＬ−６レセプターα（ＩＬ−６Ｒ
α：０．５μｇ／ｍｌ；Ｋ．Ｙａｓｕｋａｗａ博士より
恵与された）またはマウスＩＬ−６Ｒαの可溶性形をコ
ードするｐＣＤＭｍ８０でトランスフェクションした２
９３Ｔ細胞の培養上清（５％ ｖ／ｖ）とともに１５分
間インキュベートした。ｐＣＤＭｍ８０を構築するには
まず、ＳａｌＩ部位を含む順行プライマーとＢｇｌII部
位を含む逆行プライマーとを用いて、マウスＩＬ−６Ｒ
α ｃＤＮＡの細胞外ドメインをポリメラーゼチェイン
リアクション（ＰＣＲ）によって増幅した。次いでＳａ
ｌＩ−ＢｇｌII断片を、ＣＤ４ＲｇのヒトＣＤ４をコー
ドするｃＤＮＡ（Ｂ．Ｓｅｅｄ博士より恵与された）の
細胞外ドメインから由来するＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片
で置き換えた。
〜２時間培養し、次いでＩＬ−６（２００ｎｇ／ｍ
ｌ）、および可溶性ＩＬ−６レセプターα（ＩＬ−６Ｒ
α：０．５μｇ／ｍｌ；Ｋ．Ｙａｓｕｋａｗａ博士より
恵与された）またはマウスＩＬ−６Ｒαの可溶性形をコ
ードするｐＣＤＭｍ８０でトランスフェクションした２
９３Ｔ細胞の培養上清（５％ ｖ／ｖ）とともに１５分
間インキュベートした。ｐＣＤＭｍ８０を構築するには
まず、ＳａｌＩ部位を含む順行プライマーとＢｇｌII部
位を含む逆行プライマーとを用いて、マウスＩＬ−６Ｒ
α ｃＤＮＡの細胞外ドメインをポリメラーゼチェイン
リアクション（ＰＣＲ）によって増幅した。次いでＳａ
ｌＩ−ＢｇｌII断片を、ＣＤ４ＲｇのヒトＣＤ４をコー
ドするｃＤＮＡ（Ｂ．Ｓｅｅｄ博士より恵与された）の
細胞外ドメインから由来するＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片
で置き換えた。
【００２６】Ｙ６細胞は血清不含培地中で１〜２時間培
養し、次いでＩＬ−６（２００ｎｇ／ｍｌ）とともに１
５分間インキュベートした。
養し、次いでＩＬ−６（２００ｎｇ／ｍｌ）とともに１
５分間インキュベートした。
【００２７】これらの細胞を次に１％ ＮＰ−４０、１
ｍｍｏｌ／ｌ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ｌ フェニルメチルス
ルホニルフロリドおよび各１０μｇ／ｍｌのアプロチニ
ン、ペプスタチンおよびロイペプチンを含む５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏ
ｌ／ｌ ＮａＣｌ中で溶解した。細胞溶解物から得たタ
ンパク質をウサギ抗Ｓｔａｔ抗血清（ａｎｔｉ−Ｓｔａ
ｔ）で免疫沈降させ、４％〜２０％のドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）に付し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎフィルター（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ社製）に移し取った。次いでＩｍｍｏｂｉ
ｌｏｎフィルターを細く切って抗リン酸化チロシン抗体
（ａｎｔｉ−ＰＹ；４Ｇ１０：ＵＢＩ）とウサギ抗Ｓｔ
ａｔ抗血清でイムノブロットした。免疫反応したタンパ
ク質を化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）
で可視化して検出した。
ｍｍｏｌ／ｌ オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍｍ
ｏｌ／ｌ ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ｌ フェニルメチルス
ルホニルフロリドおよび各１０μｇ／ｍｌのアプロチニ
ン、ペプスタチンおよびロイペプチンを含む５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５ｍｏ
ｌ／ｌ ＮａＣｌ中で溶解した。細胞溶解物から得たタ
ンパク質をウサギ抗Ｓｔａｔ抗血清（ａｎｔｉ−Ｓｔａ
ｔ）で免疫沈降させ、４％〜２０％のドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）に付し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎフィルター（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ社製）に移し取った。次いでＩｍｍｏｂｉ
ｌｏｎフィルターを細く切って抗リン酸化チロシン抗体
（ａｎｔｉ−ＰＹ；４Ｇ１０：ＵＢＩ）とウサギ抗Ｓｔ
ａｔ抗血清でイムノブロットした。免疫反応したタンパ
ク質を化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）
で可視化して検出した。
【００２８】ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６Ｒαで刺激
しなかったＢＡＦｍ１３０細胞を同様に処理して対照と
して用いた。
しなかったＢＡＦｍ１３０細胞を同様に処理して対照と
して用いた。
【００２９】得られた結果を図２に示す。図２の左側に
示すのは、ＩＬ−６刺激の存在下および非存在下に抗Ｓ
ｔａｔ抗血清で免疫沈降して抗リン酸化チロシン抗体で
ブロットしたものである。ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−
６Ｒαで刺激したＢＡＦｍ１３０細胞から得られた細胞
溶解物と、抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物には分子量
１５０、９０および７２ｋＤのタンパク質が観察された
（図中、星印で示す）。
示すのは、ＩＬ−６刺激の存在下および非存在下に抗Ｓ
ｔａｔ抗血清で免疫沈降して抗リン酸化チロシン抗体で
ブロットしたものである。ＩＬ−６および可溶性ＩＬ−
６Ｒαで刺激したＢＡＦｍ１３０細胞から得られた細胞
溶解物と、抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物には分子量
１５０、９０および７２ｋＤのタンパク質が観察された
（図中、星印で示す）。
【００３０】また、比較のために抗Ｓｔａｔ抗血清で免
疫沈降して抗Ｓｔａｔ抗血清でブロットしたものを図２
の右側に示す。これより抗Ｓｔａｔ抗血清が９０ｋＤお
よび１００ｋＤタンパク質と反応することが示された
（図中、矢印で示す）。本発明者らはｐ９１ Ｓｔａｔ
タンパク質のＳＨ２領域に対する抗血清がこれらの分子
とも反応することをあらかじめ確かめていたので、これ
らの９０ｋＤおよび１００ｋＤタンパク質はＳｔａｔフ
ァミリータンパク質であると考えられる。
疫沈降して抗Ｓｔａｔ抗血清でブロットしたものを図２
の右側に示す。これより抗Ｓｔａｔ抗血清が９０ｋＤお
よび１００ｋＤタンパク質と反応することが示された
（図中、矢印で示す）。本発明者らはｐ９１ Ｓｔａｔ
タンパク質のＳＨ２領域に対する抗血清がこれらの分子
とも反応することをあらかじめ確かめていたので、これ
らの９０ｋＤおよび１００ｋＤタンパク質はＳｔａｔフ
ァミリータンパク質であると考えられる。
【００３１】さらに、ＩＬ−６で刺激したＹ６細胞を用
いて同様の試験を行ったところ、同様にＳｔａｔ関連の
７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化が誘導された。
いて同様の試験を行ったところ、同様にＳｔａｔ関連の
７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化が誘導された。
【００３２】実施例４：免疫沈降およびイムノブロット
（ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ刺激） ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ刺激によるＳｔａｔ関連タン
パク質のチロシンリン酸化を検討するために以下の実験
を行った。
（ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ刺激） ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ刺激によるＳｔａｔ関連タン
パク質のチロシンリン酸化を検討するために以下の実験
を行った。
【００３３】ＢＡＦ−Ｂ０３細胞およびＢＡＦｈＧＣＳ
ＦＲ細胞を血清不含培地中で１〜２時間培養し、次いで
それぞれＩＬ−３（１０％ ｖ／ｖ ＷＥＨＩ−３Ｂ上
清）およびＧ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１
５分間インキュベートした。次いで実施例３と同様に細
胞溶解物を得て、免疫沈降およびイムノブロットを行っ
た。ＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦで刺激しなかった細胞を
それぞれ同様に調製して対照として用いた。
ＦＲ細胞を血清不含培地中で１〜２時間培養し、次いで
それぞれＩＬ−３（１０％ ｖ／ｖ ＷＥＨＩ−３Ｂ上
清）およびＧ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１
５分間インキュベートした。次いで実施例３と同様に細
胞溶解物を得て、免疫沈降およびイムノブロットを行っ
た。ＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦで刺激しなかった細胞を
それぞれ同様に調製して対照として用いた。
【００３４】得られた結果を図３のａ（ＩＬ−３）およ
びｂ（Ｇ−ＣＳＦ）に示す。図から明らかなように、Ｉ
Ｌ−３およびＧ−ＣＳＦはいずれもそれぞれＢＡＦ−Ｂ
０３細胞およびＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞中において、Ｓ
ｔａｔファミリータンパク質と、Ｓｔａｔ結合１５０ｋ
Ｄおよび７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化を誘導した。
ＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦによって誘導される７２ｋＤ
分子のゲル上での移動度は、同じゲル上でＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒαによって誘導された移動度とほぼ完全
に一致した。同じゲル上でＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、また
はＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαによって誘導された１
５０ｋＤ分子の移動度もほぼ類似していた。
びｂ（Ｇ−ＣＳＦ）に示す。図から明らかなように、Ｉ
Ｌ−３およびＧ−ＣＳＦはいずれもそれぞれＢＡＦ−Ｂ
０３細胞およびＢＡＦｈＧＣＳＦＲ細胞中において、Ｓ
ｔａｔファミリータンパク質と、Ｓｔａｔ結合１５０ｋ
Ｄおよび７２ｋＤ分子のチロシンリン酸化を誘導した。
ＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦによって誘導される７２ｋＤ
分子のゲル上での移動度は、同じゲル上でＩＬ−６と可
溶性ＩＬ−６Ｒαによって誘導された移動度とほぼ完全
に一致した。同じゲル上でＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、また
はＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαによって誘導された１
５０ｋＤ分子の移動度もほぼ類似していた。
【００３５】実施例５：ゲル内リン酸化活性測定 上記実施例で確認した７２ｋＤ分子がキナーゼ活性を有
するか試験するために、文献記載の方法（Kameshita,
I. et al., Anal. Biochem. 183:139, 1989）に従って
以下のようにしてゲル内リン酸化活性を測定した。
するか試験するために、文献記載の方法（Kameshita,
I. et al., Anal. Biochem. 183:139, 1989）に従って
以下のようにしてゲル内リン酸化活性を測定した。
【００３６】実施例３で得たＩＬ−６および可溶性ＩＬ
−６Ｒαで刺激するか、または刺激しなかったＢＡＦｍ
１３０細胞溶解物からの抗Ｓｔａｔ抗体との免疫沈降物
を４％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。電気泳動
の後、ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４、５ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノール
で２回洗浄し、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．４、５ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノー
ル、６ｍｏｌ／ｌ 塩酸グアニジンとともにインキュベ
ートし、０．０４％ Ｔｗｅｅｎ４０を含む５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍｍｏｌ／
ｌ ２−メルカプトエタノールで洗浄した。ついでゲル
を２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０ｍ
ｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣ
ｌ2、２ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ、および５μＣｉ／ｍｌ
γ−32Ｐ−ＡＴＰと３０℃、３０分間インキュベート
した。最後にゲルを５％トリクロロ酢酸および５％ピロ
リン酸ナトリウムで数回洗浄して乾燥しオートラジオグ
ラフィーにかけた。
−６Ｒαで刺激するか、または刺激しなかったＢＡＦｍ
１３０細胞溶解物からの抗Ｓｔａｔ抗体との免疫沈降物
を４％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。電気泳動
の後、ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．４、５ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノール
で２回洗浄し、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．４、５ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノー
ル、６ｍｏｌ／ｌ 塩酸グアニジンとともにインキュベ
ートし、０．０４％ Ｔｗｅｅｎ４０を含む５０ｍｍｏ
ｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍｍｏｌ／
ｌ ２−メルカプトエタノールで洗浄した。ついでゲル
を２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０ｍ
ｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣ
ｌ2、２ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ、および５μＣｉ／ｍｌ
γ−32Ｐ−ＡＴＰと３０℃、３０分間インキュベート
した。最後にゲルを５％トリクロロ酢酸および５％ピロ
リン酸ナトリウムで数回洗浄して乾燥しオートラジオグ
ラフィーにかけた。
【００３７】得られた結果を図４のａに示す。レーン１
はＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαによる刺激をしなかっ
たものであり、レーン２は刺激を行ったものである。図
から明らかなように、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαに
よる刺激がインビトロのキナーゼ活性を増大した。
はＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαによる刺激をしなかっ
たものであり、レーン２は刺激を行ったものである。図
から明らかなように、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６Ｒαに
よる刺激がインビトロのキナーゼ活性を増大した。
【００３８】次に、このようなキナーゼ活性がプロテイ
ンキナーゼＣの阻害剤であるＨ７またはスタウロスポリ
ンの存在によって阻害されるか否かを上記と同様のゲル
内リン酸化測定によって試験した。得られた結果を図４
のｂに示す。レーン１は阻害剤の非存在下、レーン２は
Ｈ７（１００μｍｏｌ／ｌ）の存在下、レーン３はスタ
ウロスポリン（１μｍｏｌ／ｌ）の存在下に、ＩＬ−６
と可溶性ＩＬ−６Ｒαで刺激したＢＡＦｍ１３０細胞溶
解物からの抗Ｓｔａｔ抗体との免疫沈降物について行っ
たものである。矢印は７２ｋＤ分子を示す。図から明ら
かなように、インビトロのキナーゼ活性はスタウロスポ
リンによって完全に阻害されたが、Ｈ７によっては阻害
されなかった。
ンキナーゼＣの阻害剤であるＨ７またはスタウロスポリ
ンの存在によって阻害されるか否かを上記と同様のゲル
内リン酸化測定によって試験した。得られた結果を図４
のｂに示す。レーン１は阻害剤の非存在下、レーン２は
Ｈ７（１００μｍｏｌ／ｌ）の存在下、レーン３はスタ
ウロスポリン（１μｍｏｌ／ｌ）の存在下に、ＩＬ−６
と可溶性ＩＬ−６Ｒαで刺激したＢＡＦｍ１３０細胞溶
解物からの抗Ｓｔａｔ抗体との免疫沈降物について行っ
たものである。矢印は７２ｋＤ分子を示す。図から明ら
かなように、インビトロのキナーゼ活性はスタウロスポ
リンによって完全に阻害されたが、Ｈ７によっては阻害
されなかった。
【００３９】実施例６：リン酸化アミノ酸分析 実施例５で行ったゲル内リン酸化測定の後、リン酸化し
た７２ｋＤのバンドをゲルから切り出して６Ｎ ＨＣｌ
中、１１０℃で２時間加水分解した。ＨＣｌを除去した
後、残渣を非標識のリン酸化セリン、リン酸化スレオニ
ン、およびリン酸化チロシンと混合した。これを二次元
薄層電気泳動にかけてリン酸化アミノ酸を同定した。
た７２ｋＤのバンドをゲルから切り出して６Ｎ ＨＣｌ
中、１１０℃で２時間加水分解した。ＨＣｌを除去した
後、残渣を非標識のリン酸化セリン、リン酸化スレオニ
ン、およびリン酸化チロシンと混合した。これを二次元
薄層電気泳動にかけてリン酸化アミノ酸を同定した。
【００４０】得られた結果を図５に示す。図から明らか
なように、チロシン残基のみがリン酸化されていた。
なように、チロシン残基のみがリン酸化されていた。
【００４１】実施例７：公知のチロシンキナーゼとの比
較 ７２ｋＤ分子が公知のチロシンキナーゼであるか否かを
検討するために、分子量が７０〜８０ｋＤの公知のチロ
シンキナーゼ（Ｓｙｋ、Ｔｅｃ、Ｂｔｋ）に対する特異
的抗血清との免疫反応を試験した。
較 ７２ｋＤ分子が公知のチロシンキナーゼであるか否かを
検討するために、分子量が７０〜８０ｋＤの公知のチロ
シンキナーゼ（Ｓｙｋ、Ｔｅｃ、Ｂｔｋ）に対する特異
的抗血清との免疫反応を試験した。
【００４２】Ｓｙｋ、ＴｅｃおよびＢｔｋは、ＢＡＦｍ
１３０細胞中で特異的抗血清によって免疫沈降した。し
かしながら、抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物はこれら
各チロシンキナーゼに対する特異的抗血清とのイムノブ
ロットによって反応せず、これらのチロシンキナーゼを
含まないことが判った。
１３０細胞中で特異的抗血清によって免疫沈降した。し
かしながら、抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物はこれら
各チロシンキナーゼに対する特異的抗血清とのイムノブ
ロットによって反応せず、これらのチロシンキナーゼを
含まないことが判った。
【００４３】
【発明の効果】本発明により、Ｓｔａｔタンパク質と密
接に関連するチロシンキナーゼ活性を有する新規なタン
パク質を同定してその性状を明らかにし、また造血系細
胞におけるサイトカインによる刺激との関係を明らかに
することに成功した。本発明のチロシンキナーゼ活性を
有するタンパク質は例えば、サイトカインに依存して増
殖する癌の治療剤として、あるいは特定のサイトカイン
の機能調整剤として利用しうる可能性を有している。
接に関連するチロシンキナーゼ活性を有する新規なタン
パク質を同定してその性状を明らかにし、また造血系細
胞におけるサイトカインによる刺激との関係を明らかに
することに成功した。本発明のチロシンキナーゼ活性を
有するタンパク質は例えば、サイトカインに依存して増
殖する癌の治療剤として、あるいは特定のサイトカイン
の機能調整剤として利用しうる可能性を有している。
【図１】ＩＬ−６の刺激伝達についての仮想的なシグナ
ル伝達経路を示す。
ル伝達経路を示す。
【図２】ＩＬ−６刺激によるＳｔａｔ関連タンパク質の
チロシンリン酸化を示す図（電気泳動の写真）である。
分子量マーカーを図の左にキロダルトンで示す。図中、
星印はチロシンリン酸化されたタンパク質を示し、矢印
はＳｔａｔファミリータンパク質を示す。
チロシンリン酸化を示す図（電気泳動の写真）である。
分子量マーカーを図の左にキロダルトンで示す。図中、
星印はチロシンリン酸化されたタンパク質を示し、矢印
はＳｔａｔファミリータンパク質を示す。
【図３】ａは、ＩＬ−３刺激によるＳｔａｔ関連タンパ
ク質のチロシンリン酸化を示し、ｂはＧ−ＣＳＦ刺激に
よるＳｔａｔ関連タンパク質のチロシンリン酸化を示す
図（電気泳動の写真）である。図中の星印および矢印は
図２と同じ意味を表す。
ク質のチロシンリン酸化を示し、ｂはＧ−ＣＳＦ刺激に
よるＳｔａｔ関連タンパク質のチロシンリン酸化を示す
図（電気泳動の写真）である。図中の星印および矢印は
図２と同じ意味を表す。
【図４】Ｓｔａｔ関連タンパク質のゲル内リン酸化測定
の結果を示す図（電気泳動の写真）である。ａは、ＩＬ
−６刺激を行わなかった（レーン１）およびＩＬ−６刺
激を行った（レーン２）ＢＡＦｍ１３０細胞からの細胞
溶解物と抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物のゲル内リン
酸化測定の結果であり、ｂは、阻害剤の非存在下（レー
ン１）、ＩＬ−６刺激を行ったＢＡＦｍ１３０細胞から
の細胞溶解物と抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物のゲル
内リン酸化測定をキナーゼアッセイ阻害剤Ｈ７の存在下
（レーン２）および阻害剤スタウロスポリンの存在下
（レーン３）に行った結果である。
の結果を示す図（電気泳動の写真）である。ａは、ＩＬ
−６刺激を行わなかった（レーン１）およびＩＬ−６刺
激を行った（レーン２）ＢＡＦｍ１３０細胞からの細胞
溶解物と抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物のゲル内リン
酸化測定の結果であり、ｂは、阻害剤の非存在下（レー
ン１）、ＩＬ−６刺激を行ったＢＡＦｍ１３０細胞から
の細胞溶解物と抗Ｓｔａｔ抗血清との免疫沈降物のゲル
内リン酸化測定をキナーゼアッセイ阻害剤Ｈ７の存在下
（レーン２）および阻害剤スタウロスポリンの存在下
（レーン３）に行った結果である。
【図５】本発明のタンパク質のリン酸化アミノ酸分析を
示す図（電気泳動の写真）である。図中、ＰＳはリン酸
化セリンを、ＰＴはリン酸化スレオニンを、ＰＹはリン
酸化チロシンを示す。
示す図（電気泳動の写真）である。図中、ＰＳはリン酸
化セリンを、ＰＴはリン酸化スレオニンを、ＰＹはリン
酸化チロシンを示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の性質： （１）分子量が７２ｋＤである； （２）Ｓｔａｔタンパク質と結合する； （３）各種サイトカインによってチロシンリン酸化され
る；および （４）チロシンキナーゼ活性を有する、を有するタンパ
ク質。 - 【請求項２】 サイトカインがＩＬ−３、ＩＬ−６およ
びＧ−ＣＳＦである請求項１記載のタンパク質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15539394A JPH083194A (ja) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15539394A JPH083194A (ja) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH083194A true JPH083194A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15604980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15539394A Pending JPH083194A (ja) | 1994-06-14 | 1994-06-14 | チロシンキナーゼ活性を有するタンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH083194A (ja) |
-
1994
- 1994-06-14 JP JP15539394A patent/JPH083194A/ja active Pending
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20041022 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041221 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20041221 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050722 |