JPH08308586A - プロテインキナーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体内で多様な役割を担っていることが予測
される新規プロテインキナーゼのｃＤＮＡをクローニン
グすること。 【構成】 新規プロテインキナーゼをコードするアミノ
酸配列をコードする塩基配列、またはこの一部に挿入、
欠失若しくは置換を加えた塩基配列、あるいはこれらに
ハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡを
有するプラスミド、該プラスミドを有する形質転換体、
該ＤＮＡの製造方法、並びに、上記アミノ酸配列をコー
ドする塩基配列と特異的にハイブリダイズし得るオリゴ
ヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プロテインキナーゼの
触媒ドメインコンセンサス配列を含む新規ＤＮＡに関す
る。さらに詳細には、本発明は、セリン／トレオニンキ
ナーゼに特徴的である触媒ドメインコンセンサス配列を
含む新規ＤＮＡに関する。本発明はまた、該ＤＮＡを有
するプラスミド、該プラスミドを有する形質転換体、該
ＤＮＡの製造方法、および該ＤＮＡと特異的にハイブリ
ダイズし得るオリゴヌクレオチドにも関する。

【０００２】

【従来の技術】真核細胞における外界からの刺激に対す
る細胞内への情報伝達機構に関する研究は、近年急速に
進んでいる。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）または上
皮増殖因子（ＥＧＦ）のような増殖因子による刺激にお
いては、複雑なキナーゼカスケード系による情報伝達系
によって細胞内への情報伝達が行われていることが解明
されつつあり、そこではチロシンキナーゼの１種である
増殖因子の受容体、およびセリン／トレオニンキナーゼ
の１種であるＭＡＰキナーゼファミリーが関与している
ことが知られている（Williams L.T.,他、Annu. Rev. B
iochem., 1993, 62, 453-481；Boleu J.B., Oncogene,
1993, 8, 2025-2031；Davis R.J., J. Biol. Chem. 26
8, 1993, 14553-14556）。また、細胞周期の調節におい
ても、セリン／トレオニンキナーゼの１種であるサイク
リン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーに属する酵素
によるタンパク質のリン酸化および脱リン酸化が関与し
ていることが知られており、その詳細な機構についての
研究が進んでいる（Nurse P., Nature, 344, 503-508,
1990；Pines J., Trends Biochem. Sci., 19, 143-145,
1994）。

【０００３】さらに、酵母細胞における糖の代謝におい
て重要な役割を果たしていると考えられている遺伝子の
一つとしてＳＮＦ１遺伝子が知られている。

【０００４】さらにまた、最近ラット肝臓よりクローニ
ングされたＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ
Ｋ）遺伝子は、そのアミノ酸配列においてＳＮＦ１遺伝
子と高い相同性を示すことが報告されている（Carling
D.他、J. Biol. Chem., 1994,269, 11442-11448）。Ａ
ＭＰＫは、脂肪酸合成の第一工程を触媒するアセチルＣ
ｏＡカルボキシラーゼ、コレステロールおよび他のイソ
プレノイド化合物の生合成における鍵となる酵素である
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡリダクタ
ーゼ、およびホルモン感受性リパーゼなどをリン酸化す
ることによって不活性化していることが分かっており、
トリグリセリドまたはコレステロールエステルの代謝を
含む脂質代謝における重要な調節因子の一つであると考
えられている（Clarke P.R.他、EMBO J., 1990, 9, 243
9-2446）。以上のように、ＳＮＦ１ファミリーは、真核
細胞における糖または脂質のような炭素化合物の代謝調
節に深く関与していることが示唆されている。

【０００５】上記したように、タンパク質のリン酸化お
よび脱リン酸化が、細胞の各種機能の調節において重要
な役割を有していることを示唆する報告が多数なされて
おり、これに関与するプロテインキナーゼの触媒ドメイ
ンの構造中には類似性が存在することもまた報告されて
いる（Steven K. Hanks他、Science, 1988, Vol. 241,
p.42-52）。近年、プロテインキナーゼのこの構造の類
似性を利用した方法によって、新規なプロテインキナー
ゼのｃＤＮＡが多数クローニングされている（例えば、
Holtzman, D.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 8
4, 8325-8329；Hanks., S.K.、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1987, 84, 388-393；およびAndrew F. Wilks、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol.86, p.1603-160
7などを参照）。この分野における研究の進歩ととも
に、新規プロテインキナーゼ遺伝子の機能の解析が進
み、幾つかの重要な細胞内情報伝達の機構が明らかにさ
れつつあるが、未だ全てのものが解明されたとは到底言
えない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにプロテイ
ンキナーゼが細胞内で多様な役割を担っていることは明
らかである。従って、新規なプロテインキナーゼ遺伝子
を単離同定することは、細胞内における情報伝達機構の
解明およびそのプロテインキナーゼの活性異常などを原
因とする疾患の治療薬の開発等に役立つことが期待され
る。本発明の目的の一つは、新規なプロテインキナーゼ
をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有するプラスミド、該
プラスミドを宿主に形質転換して成る形質転換体を提供
することである。さらに、本発明の目的の一つは、該Ｄ
ＮＡの製造方法を提供することである。さらに、本発明
の目的の一つは、該ＤＮＡのＤＮＡ配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドを合成することによって、該ＤＮＡ配列
と特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスＤＮＡを
提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ある種の
プロテインキナーゼに共通して保存されている領域のア
ミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いるＰＣＲ法を使用して、ヒト胎児肝
臓由来のｃＤＮＡをスクリーニングすることによって、
新規なプロテインキナーゼをコードするｃＤＮＡを単離
することに成功し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、プロテインキナーゼをコードする新規ＤＮＡを提供
する。さらに詳細には、本発明は、配列表の配列番号２
に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはこ
の一部に挿入、欠失若しくは置換を加えた塩基配列、あ
るいはこれらにハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮ
Ａを提供する。

【０００８】本発明の一つの態様によれば、本発明は、
配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むＤＮＡを提
供する。さらに本発明は、上記のプロテインキナーゼを
コードするＤＮＡを有するプラスミドを提供する。さら
に本発明は、上記のプロテインキナーゼをコードするＤ
ＮＡを有するプラスミドにより形質転換された、原核ま
たは真核細胞の形質転換体を提供する。

【０００９】さらに本発明は、（１）ヒト由来のｍＲＮ
Ａより逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成すること、
（２）鋳型として上記（１）で得たｃＤＮＡを使用し、
プライマーとしてある種のプロテインキナーゼに共通し
て保存されている領域のアミノ酸配列に基づくオリゴヌ
クレオチドを使用して、ＰＣＲを行うこと、（３）上記
（２）で得たクローンをプローブとして使用し、長鎖の
ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
することによって陽性クローンを単離すること、という
各工程を含む、上記のプロテインキナーゼをコードする
ＤＮＡの製造方法を提供する。さらに本発明は、配列表
の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配
列と特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド
を提供する。

【００１０】本発明のプロテインキナーゼ遺伝子は、４
３３個のアミノ酸配列をコードしており、ストップコド
ンを含めて１３０２ｂｐの塩基配列を有する。配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を
含有するＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造する
ことができる。まず、単離を試みようとする特定の臓器
から、ポリＡ⁺ＲＮＡを単離する。以下に述べる実施例
ではヒト胎児肝臓を使用したが、本遺伝子が発現されて
いる限りにおいては、材料は特に限定されない。臓器か
らのＲＮＡの単離は、当業者に知られている通常の方法
によって行えばよく、例えば、グアニジンチオシアネー
ト／ホットフェノール法、グアニジン／塩化セシウム
法、グアニジン塩酸塩法などを使用すればよい。かくし
て得られたＲＮＡ画分はその大部分がタンパク質をコー
ドしないｒＲＮＡおよびｔＲＮＡであり、また真核細胞
の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くはその３’末端にポ
リＡ配列を有することが知られているため、オリゴｄＴ
セルロースカラムにポリＡ⁺ＲＮＡのみを吸着させ、次
いでこれを溶出することによってポリＡ⁺ＲＮＡを単離
精製する。また、現在においては各種の臓器由来のポリ
Ａ⁺ＲＮＡが市販されており（例えば、CLONTECH社など
から）、それらを使用することもできる。

【００１１】次いで、上記で得たポリＡ⁺ＲＮＡを鋳型
として、ＰＣＲにおいて鋳型として使用するためのｃＤ
ＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成方法は、ｃＤＮＡライ
ブラリー作製のために当業者に知られている通常の方法
を使用すればよい。一般的には、ポリＡ⁺ＲＮＡ、逆転
写酵素、プライマー（オリゴｄＴプライマー、ランダム
プライマーなど）および緩衝液を含む混合液を適温でイ
ンキュベートすることによってfirst-strandの合成を行
った後、ＲＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼを添加
し、適温でインキュベートすることによりsecond-stran
dを合成する。通常は、この二本鎖ｃＤＮＡを適当なベ
クターにクローニングすることによりｃＤＮＡライブラ
リーを作製するが、本発明では上記で得られたｃＤＮＡ
をそのまま鋳型として使用して、ＰＣＲによるスクリー
ニングを行えばよい。

【００１２】ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）と
は、鋳型ＤＮＡの変性、一本鎖となった鋳型ＤＮＡへの
プライマーのアニーリング、およびアニールしたプライ
マーを起点とする一本鎖鋳型ＤＮＡの相補鎖の伸長とい
う３工程から成るサイクルを繰り返すことにより、２種
のプライマーに挟まれた領域のＤＮＡ断片を増幅する方
法である。上記の原理から明らかなように、ＰＣＲによ
って得られる（増幅される）ＤＮＡ配列は、使用するプ
ライマーに大きく依存するため、プライマーの配列を如
何に決定するかは重要な問題である。本発明の目的の一
つは、新規なプロテインキナーゼ遺伝子を単離すること
であることに鑑み、本発明者らはある種のプロテインキ
ナーゼに共通して保存されている領域のアミノ酸配列に
着目した。このアミノ酸配列に対応する全てのコドンを
含む混合プライマーＴ１およびＴ２を合成し、以下の実
施例において使用した。

【００１３】ＰＣＲは、通常の方法に従って行えばよ
い。具体的には、鋳型ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ
混合物、緩衝液およびＴａｑポリメラーゼを含む混合溶
液を、変性温度（一般的には９４〜９６℃）に０．５〜
１分、アニーリング温度（一般的には３７〜６０℃）に
０．５〜２分および伸長温度（一般的には６０〜７２
℃）に０．５〜３分インキュベートするというサイクル
を２０〜４０回程度繰り返せばよい。必要に応じ、異な
るサイクルを組み合わせて行うこともできる。ＰＣＲに
より増幅されるクローンは使用したプライマーの配列を
その末端に含むクローンであることが予測される。そこ
で得られたクローンが新規なクローンであるかどうかを
確認するためには、ＰＣＲ産物を適当なベクターにサブ
クローニングした後にその塩基配列を決定すればよい。
本発明においては、下記の配列表の配列番号（SEQ ID N
O）：１に記載するような新規なＤＮＡ配列を有するク
ローンが得られた。このクローンは全長で１８６ｂｐを
有し、このＤＮＡ配列から６２アミノ酸残基から成るオ
ープンリーディングフレームを取ることができた。

【００１４】さらに、本発明においては、より完全な遺
伝子の構造を調べるためにより長いｃＤＮＡのクローニ
ングを試みた。この方法は以下に述べる。より長いｃＤ
ＮＡをクローニングするためには、スクリーニングの対
象とされるｃＤＮＡライブラリーから短い断片のｃＤＮ
Ａを除去しておくことがスクリーニングの効率の面から
好ましい。そこで、本発明では、上記と同様にして、ヒ
ト胎児肝臓ポリＡ⁺ＲＮＡより二本鎖ｃＤＮＡを合成し
た後に、これをアガロースゲル電気泳動によってサイズ
分画することにより約１Ｋｂｐ以上のｃＤＮＡのみを回
収し、これをスクリーニングの対象とすべきｃＤＮＡラ
イブラリーの作製のために使用した。サイズ分画は、二
本鎖ｃＤＮＡを合成する前、即ち、ポリＡ⁺ＲＮＡの段
階で行ってもよく、この場合は、電気泳動による方法、
スクロース密度こう配による沈降法などによって一定以
上の長さを有するＲＮＡのみを回収することができる。
上記のように分画した二本鎖ｃＤＮＡから、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する方法は、当業者に知られている各
種の方法を使用することができる。以下に述べる実施例
においては、以後のシークエンスなどにおける手順の便
宜などの観点から、Lambda ZAP^RＩＩベクターシステム
（STRATAGENE社製）を使用したが、無論これに限定され
るわけではない。

【００１５】次いで、先のＰＣＲによって得られた新規
ＤＮＡ配列を含むクローンをプローブとして使用して上
記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることに
より、より完全な遺伝子をコードするクローンの単離を
試みればよい。スクリーニングは、当業者によく知られ
ている通常のプラークハイブリダイゼーション法を使用
すればよい。さらに、このプラークハイブリダイゼーシ
ョン（一次スクリーニング）において取得される可能性
がある偽陽性プラークを除去するために、二次スクリー
ニングを行ってもよい。二次スクリーニングは再度プラ
ークハイブリダイゼーションすることにより行ってよい
し、作業の簡便さなどの観点からＰＣＲを使用して行う
こともできる。次いで、得られた陽性クローン中のイン
サート（目的とする遺伝子を含む部分）を適当なプラス
ミドベクター中にサブクローニングすることによりプラ
スミドとして保存しておくことができる。クローニング
のためのベクターはここでは特に限定されず、以後の目
的に応じて適宜選択すればよい。さらに上記のプラスミ
ドを適当な宿主に形質転換することによって形質転換体
を作製し、これを保存しておくこともできる。形質転換
のための宿主は、プラスミドが安定に保持されるもので
あれば特には限定されず、真核細胞および原核細胞の中
から以後の目的に応じて適宜選択すればよい。宿主とし
ては一般的には、大腸菌などが使用される。

【００１６】一つのアミノ酸をコードする３塩基対から
成るコドンは原則として複数存在するものがあることか
ら、あるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は多数存
在する。本発明者らにより明らかにされた新規なプロテ
インキナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の場合
についても、本発明により明らかにされたヒト胎児肝臓
由来の天然の遺伝子ＤＮＡ配列以外にも多数の可能性が
あることに留意すべきである。即ち本発明のＤＮＡ配列
は、ヒト由来の天然のＤＮＡ配列のみに限定されるもの
ではなく、本発明により、明らかにされた新規プロテイ
ンキナーゼのアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列
をも含むものである。また、あるＤＮＡ配列に対して、
そのＤＮＡ配列がコードするタンパク質の本質的な特性
（本発明に関して言えば、プロテインキナーゼ活性）を
大きく変化させることなくあるいはその特性を改善する
ように変異を施すことは、遺伝子組み換え技術の分野に
おいてよく知られている。従って、当業者であれば、本
発明により提供されるＤＮＡに対して、その本質的特性
を大きく変化させることなしに、あるいはその特性を改
善するように、人為的に挿入、欠失、置換を行うことが
可能である場合がある。本発明はそのような変異遺伝子
をも含むものである。

【００１７】さらに、本発明は、配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、または上記
したようにこの一部に挿入、欠失若しくは置換を加えた
塩基配列にハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡを
も含有する。ハイブリダイゼーションの条件は、通常使
用されるプラークハイブリダーゼーションの条件を適用
することができる（例えば、Maniatis T.他、Molecular
Cloning，Cold Spring Harbor Lab., 1989に記載）。

【００１８】さらにまた、本発明による配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づ
いて、アンチセンスＤＮＡを作製することができる。ア
ンチセンスＤＮＡとは、本発明によるＤＮＡ配列から転
写されて生成するｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列を
有するＤＮＡのことを言う。アンチセンスＤＮＡを細胞
内に導入すると、ｍＲＮＡとハイブリッドを形成するこ
とによって、最終産物であるタンパク質の合成を抑制す
ることができる場合がある。本発明は、配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と特
異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドをも提
供する。上記で使用される「オリゴヌクレオチド」なる
用語は、その最も広い意味で理解されるべきである。即
ち、それは、（１）天然に存在する塩基およびホスホジ
エステル結合によって結合した糖部分を含むオリゴヌク
レオチド、並びに、（２）上記のオリゴヌクレオチドと
同様に機能するが、天然に存在しない部分を有するオリ
ゴヌクレオチド類似体、の両方を含むものである。オリ
ゴヌクレオチド類似体の例としては、安定性の向上など
を目的として、リン酸基、糖部分、３’末端および５’
末端に化学修飾を施したオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。また、ホスホジエステル結合は、非イオン性かつ非
キラル性である他の構造で置換されていてもよい。さら
に、修飾された塩基、即ち、天然に存在する以外のプリ
ンまたはピリミジンを含むものも、オリゴヌクレオチド
類似体の中に含まれる。

【００１９】本発明によるオリゴヌクレオチドの長さは
特には限定されないが、好ましくは８〜４０個、特に好
ましくは１５〜３０個のサブユニット（塩基−糖の一つ
の組み合わせのことを言い、隣接するサブユニット同士
はホスホジエステル結合などにより結合している）を有
する。本発明によるオリゴヌクレオチドがハイブリダイ
ズするｍＲＮＡの標的部位としては、転写開始部位、翻
訳開始部位、イントロン／エクソン結合部位、または
５’キャップ部位などが一般的には好ましいが、ｍＲＮ
Ａの二次構造を考慮に入れて立体障害がない（少ない）
部位を選択することがさらに好ましい。

【００２０】本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に
既知の合成法、例えばApplied Biosystems社製のＤＮＡ
合成装置などを使用して、固相合成法により製造するこ
とができる。他のオリゴヌクレオチド類似体も同様の方
法に従って製造することができる（村上章他、「機能性
アンチセンスＤＮＡの合成」、有機合成化学、48(3)：1
80-193、1990）。

【００２１】

【実施例】以下において実施例によって本発明をさらに
詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定される
ものではない。 （Ａ）ヒト胎児肝臓ポリＡ⁺ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳
型とするＰＣＲによる新規クローンの検索；Ａ−１．ＰＣＲプライマーの合成： ある種のプロテイン
キナーゼに共通して保存されている領域のアミノ酸配列
に基づいて決定した下記の配列を有するＴ１およびＴ２
のオリゴヌクレオチドの合成をサワディー・テクノロジ
ー株式会社に依頼し、入手したＴ１およびＴ２プライマ
ーの混合物をＰＣＲにおけるプライマーとして使用し
た。また、Ｔ１プライマーの塩基配列は配列表の配列番
号（SEQ ID NO）：３に、Ｔ２プライマーの塩基配列は
配列表の配列番号（SEQ ID NO）：４に、各々記載され
ている。 Ｔ１： ５’末端−ＧＴ（ＡＧＴＣ）ＧＣ（ＡＧＴＣ）
ＧＴ（ＡＧＴＣ）ＡＡ（ＡＧ）ＡＴＧ（ＴＣ）Ｔ（ＡＧ
ＴＣ）ＡＡ−３’末端 Ｔ２： ５’末端−ＴＣ（ＡＧＴＣ）ＣＣ（ＡＧ）ＴＡ
（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＴＡ（ＴＣ）ＴＣ−
３’末端

【００２２】Ａ−２．ＰＣＲ用の鋳型の調製：ヒト胎児
肝臓のポリＡ⁺ＲＮＡ（CLONTECH社製）より、TimeSaver
^TM ｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia社製）を使用して、
添付の説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ用の鋳
型として使用した。即ち、６５℃で１０分間加温するこ
とにより予め熱変性させたヒト胎児肝臓のポリＡ⁺ＲＮ
Ａ（５μｇ）を、Murine Reverse Transcriptase、ラン
ダムヘキサマープライマーおよび反応緩衝液から成るFi
rst-Strand合成反応液に添加し、３７℃で１時間インキ
ュベートすることによってFirst-Strandの合成を行っ
た。次いで、この反応液をＥ．ｃｏｌｉ由来のＲＮａｓ
ｅＨ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩおよび
反応緩衝液から成るSecond-Strand合成反応液に添加
し、１２℃で３０分間、次いで２２℃で１時間インキュ
ベートすることによってSecond-Strandの合成を行っ
た。この反応混合液をフェノール／クロロホルム抽出に
付することによってタンパク質を除去し、次いで、エタ
ノール沈殿に付することによって合成されたｃＤＮＡを
回収し、５０μｌのＴＥ緩衝液（トリス塩酸１０ｍＭ、
ＥＤＴＡ１ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解し、ＰＣＲ用の鋳
型ＤＮＡとして使用した。

【００２３】Ａ−３．ＰＣＲによる新規ＤＮＡの検索：
上記Ａ−１で合成したプライマーおよびＡ−２で作製し
た鋳型ＤＮＡを使用する以下の組成の反応混合液を用い
て、ＰＣＲを行った。 反応液の組成； 鋳型ＤＮＡ ：２．５μｌ（Ａ−２で得た５０μ
ｌのＤＮＡ溶液から） Ｔ１プライマー ： ２００ｐｍｏｌ Ｔ２プライマー ： ２００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰｓ ： 各々の最終濃度０．２ｍＭ Ｔａｑポリメラーゼ： ２．５Ｕ １０×緩衝液 ： １０μｌ 滅菌水にて全量を１００μｌにする。

【００２４】ＰＣＲは、９４℃で６分変性させた後、９
４℃で１分（変性）、４８℃で１分（アニーリング）、
７２℃で２分（伸長）というサイクルを４０サイクル行
った。

【００２５】Ａ−４．ＰＣＲ産物のサブクローニングお
よび塩基配列の決定：上記のＰＣＲ産物をアガロースゲ
ル電気泳動後に、予想されるサイズのバンド（約１８０
ｂｐ）を切り取り、ＤＮＡをSephaglas^TMBandPrep キッ
ト（Pharmacia社製）を使用してガラスビーズ法によっ
て回収した。このＤＮＡを、SureClone^TMライゲーショ
ンキット（Pharmacia社製）を使用して、キットに添付
の説明書に従って以下のようにプラスミドベクター中へ
サブクローニングした。先ず、回収したＤＮＡ（約１０
０ｎｇ）に、Klenowフラグメント、ポリヌクレオチドキ
ナーゼ、１０×反応緩衝液（２μｌ）を添加し、滅菌水
にて全量を２０μｌとし、３７℃で３０分間インキュベ
ートすることにより、ＤＮＡ末端の平滑化と５’末端の
リン酸化を行った。

【００２６】上記で得たＤＮＡに、SmaＩにより切断し
脱リン酸化処理したｐＵＣ１８ベクター（５０ｎｇ）、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＴＴ、２×反応緩衝液（１０μ
ｌ）を添加し、滅菌水にて全量を２０μｌとし、１６℃
で２時間インキュベートすることによりライゲーション
を行った。この反応液の１／４量（５μｌ）を当業者に
知られている通常の方法（例えば、Maniatis T.他、Mol
ecular Cloning, ColdSpring Harbor Lab., 1989 に記
載）に従って、コンピテントＪＭ１０９大腸菌株（和光
純薬工業社より入手）に形質転換した。この大腸菌を、
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
ドシド）（４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（０．１ｍ
Ｍ）を含む、ＬＢプレート上にまき、３７℃で一晩イン
キュベートした。現れたコロニーからインサートを含む
プラスミドＤＮＡを有していると考えられる白色コロニ
ーを４４個選択し、以下に述べるようにプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、インサートの塩基配列を決定した。

【００２７】白色コロニーからのプラスミドＤＮＡの抽
出は、QIAprep-spinキット（フナコシ社製）を使用し、
キットに添付の説明書に記載されている一般的なアルカ
リ−ＳＤＳ法に従って行った。これを鋳型として、PRIS
M^TM Terminator Mix（Applied Biosystems社製）を使用
したサイクル塩基配列決定法（Cycle sequencing）によ
って下記のように塩基配列を決定した。ＤＮＡ約１μｇ
に、シークエンス用プライマー（３．３ｐｍｏｌ）、PR
ISM^TMTermination Mix （９．５μｌ）を添加し、全量
を２０μｌとし、９６℃３０秒、５０℃１５秒および６
０℃４分の反応を２５サイクル行った。この反応液中の
過剰のプライマーおよび蛍光色素を、MicroSpin^TM S-20
0 HRカラム（Pharmacia社製）を使用したゲルろ過法、
またはフェノール／クロロホルム抽出を数回行うことに
よって除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収し
た。これを、Applied Biosystems社製のModel ３７３Ａ
シークエンサーを使用して、電気泳動および解析を行い
塩基配列を決定した。

【００２８】Ａ−５．クローンの解析：選択した４４個
のクローンのうち、３０個は、既に構造が報告されてい
る既知のプロテインキナーゼと同一の配列を有していた
が、残りの１４個のクローンは全て同一のこれまでに報
告されていない新規配列を有していることが確認され
た。このクローンの内の一つをＬＫＢ−１と命名した。
このクローンの配列は配列表の配列番号（SEQ ID N
O）：１に記載する。ＬＫＢ−１の塩基配列は、１８６
塩基のオープンリーディングフレーム領域を有し、６２
個のアミノ酸をコードしていた。次に、ヒト胎児肝臓ポ
リＡ⁺ＲＮＡより作成したｃＤＮＡライブラリーより、
より長いクローンの単離を試みた。

【００２９】（Ｂ）ＬＫＢ−１の長鎖クローンの単離お
よび構造解析；Ｂ−１．ヒト胎児肝臓ポリＡ⁺ＲＮＡ由来のｃＤＮＡラ
イブラリーの作製： ヒト胎児肝臓ポリＡ⁺ＲＮＡより、
上記のＡ−２と同様に、TimeSaver^TMｃＤＮＡ合成キッ
トを使用して二本鎖ｃＤＮＡを合成した。但し、ポリＡ
⁺ＲＮＡは２μｇを使用し、first strand合成用のプラ
イマーとしてはオリゴ（ｄＴ）_12-18を使用した。これ
を、アガロース電気泳動によってサイズ分画し、約１ｋ
ｂｐ以上のサイズを有するｃＤＮＡのみを回収した。こ
の末端に、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結し、
反応溶液中の未反応の該アダプターをスパンカラムによ
り除去した後、予めＥｃｏＲＩで切断し、脱リン酸化処
理を施してある LambdaZAP^R IIベクター（STRATAGENE社
製）中に組み込んだ。宿主大腸菌としては、ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ株を使用した。ベクターに組み込んだｃＤＮＡ
を、GIGAPACK^R IIPACKAGING EXTRACT（STRATAGENE社
製）を使用し、添付の説明書に従ってパッケージングし
た。即ち、Freeze／Thaw extract、 Sonic extractおよ
び上記のｃＤＮＡを混合し、２２℃で２時間インキュベ
ートすることによってパッケージングを行い、ｃＤＮＡ
ライブラリーを得た。

【００３０】Ｂ−２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニング：一次スクリーニングは、文献（例えば、Maniat
is T.他、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor La
b., 1989）に記載されている通常の方法によるプラーク
ハイブリダイゼーションにより行った。即ち、ＬＢ寒天
プレートに約２×１０⁵個のファージをまき、生じたプ
ラークをHybond−Nフィルター(Amersham社製）に移し、
アルカリ変性させた後、紫外線照射によってＤＮＡをフ
ィルター上に固定化した。このフィルターを、ハイブリ
ダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、４×ＳＳ
Ｃ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０×Denhar
dt's溶液、１００μｇ／ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡ）
中で、４２℃で３時間インキュベートすることによって
プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、予め³²
Ｐで標識した後に熱変性したプローブ（ＬＫＢ−１のイ
ンサート）とともに４２℃で１６時間以上インキュベー
トすることによりハイブリダイゼーションを行った。プ
ローブの標識は、Random Primer ＤＮＡ標識キット（Ve
r.2）（宝酒造社製）を使用し、キットに添付の説明書
に従って行った。即ち、アガロースゲル電気泳動により
単離精製したインサート約１００ｎｇを熱変性し、次い
で、Ｔ１およびＴ２プライマー（各々２０ｐｍｏｌず
つ）、Klenowフラグメントおよび５０μＣｉの［α−³²
Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ミリモル)を上記の熱変
性したＬＫＢ−１インサートＤＮＡを含む溶液に添加
し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより標
識ブローブを作製した。

【００３１】ハイブリダイゼーション後、フィルター
を、洗浄溶液Ａ（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を使用
して室温で１５分２回洗浄し、次いで洗浄溶液Ｂ（０．
５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を使用して５０℃で２０
分間および５５℃で２０分間順次洗浄し、さらに、洗浄
溶液Ｃ（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を使用して
６０℃で２０分間洗浄した。洗浄後、フィルターを乾燥
し、オートラジオグラフィーを行った。上記のようにし
て、約２×１０⁵ｐｆｕのファージクローンをスクリー
ニングした結果、３個の陽性シグナルを得た。

【００３２】上記の一次スクリーニングで得られた陽性
クローンを含むファージの懸濁液より、単一プラーク由
来のファージ懸濁液を調製し、これを使用して以下の条
件に従ってＰＣＲによる二次スクリーニングを行った。
ＰＣＲにおけるプライマーとして、以下の２本のプライ
マーを作製した。これらの配列は、ＬＫＢ−１のインサ
ート中のＤＮＡ配列に基づくものである。また、Ｓ２プ
ライマーの塩基配列は配列表の配列番号（SEQ ID N
O）：５に、Ａ１プライマーの塩基配列は配列表の配列
番号（SEQ ID NO）：６に、各々記載されている。 Ｓ２： ５’−ＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡ −３’ Ａ１： ５’−ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＴ −３’ 反応液の組成； ファージ懸濁液 ： ２μｌ Ｓ２プライマー ： ５０ｐｍｏｌ Ａ１プライマー ： ５０ｐｍｏｌ ｄＮＴＰｓ ： 各々の最終濃度０．２ｍＭ Ｔａｑポリメラーゼ： １．２５Ｕ １０×緩衝液 ： ５μｌ 滅菌水にて全量を５０μｌにする；

【００３３】ＰＣＲは、９４℃で６分変性させた後、９
４℃で１分（変性）、５０℃で１分（アニーリング）、
７２℃で２分（伸長）というサイクルを４０サイクル行
った。ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行
い、予想されるサイズのバンド（約１００ｂｐ）が現れ
た２個のファージクローンを陽性ファージクローンとし
た。

【００３４】Ｂ−３．陽性ファージクローンからプラス
ミドベクターへのサブクローニング：陽性ファージクロ
ーンから、ExAssistヘルパーファージと大腸菌ＳＯＬＲ
株を使用する、ExAssist^TM／SOLR^TMシステムによるプラ
スミド（pBluescript^R SK(-)ベクター）への切り出しを
行った。PREDIGESTED LAMBDA ZAP^R II／EcoRI／CIAPク
ローニングキット（STRATAGENE社製）に添付された説明
書に従って、陽性ファージとヘルパーファージを大腸菌
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に感染させた後、３７℃で２．５時
間培養し、培養液中に切り出されたプラスミドを大腸菌
ＳＯＬＲ株に取り込ませた。これらのクローンをｐＬＫ
Ｂ１−１およびｐＬＫＢ１−２と命名した。

【００３５】ｐＬＫＢ１−１およびｐＬＫＢ１−２のイ
ンサートの塩基配列をＡ−４と同様にして解析し、本発
明の新規プロテインキナーゼ（ｐＬＫＢ−１）の塩基配
列を決定した。この配列を配列表の配列番号（SEQ ID N
O）：２に記載する。

【００３６】Ｂ−４．ｐＬＫＢ−１の構造解析：ｐＬＫ
Ｂ−１の塩基配列中には４３３個のアミノ酸をコードす
るオープンリーディングフレームが存在していた。ま
た、この中には下記に示すように、ＡＴＰ結合ドメイン
およびプロテインキナーゼ触媒ドメインのコンセンサス
配列と一致する配列が存在していた。ＡＴＰ結合ドメインコンセンサス配列との相同性； ＡＴＰ結合ドメインコンセンサス配列： [Leu,Ile,Val]−Gly−Xaa−Gly−Xaa−[Phe,Tyr,Met]−[Ser,Gly]−Xaa−Val ｐＬＫＢ−１配列（アミノ酸；５５〜６３）： Leu−Gly−Glu−Gly−Ser−Tyr−Gly−Lys−Val

【００３７】プロテインキナーゼ触媒ドメインコンセン
サス配列との相同性； プロテインキナーゼ触媒ドメインコンセンサス配列： [1]−Xaa−[His, Tyr]−Xaa−Asp−[2]−Lys−Xaa−Xaa−Asn−[1]−[1]−[1] ｐＬＫＢ−１配列（アミノ酸；１７２〜１８４）： Ile−Val−His−Lys−Asp−Ile−Lys−Pro−Gly−Asn−Leu−Leu−Leu （上記の式中、[1]は[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr,
Cys]を表し、[2]は[Leu,Ile, Val, Met, Phe, Tyr]を表
す。またXaaは随意のアミノ酸を表す。）

【００３８】さらに上記で得られた配列表の配列番号
（SEQ ID NO）：２に記載の配列に関して、ホモロジー
検索［ＧｅｎＢａｎｋ^Rのデータベースを使用して、Lip
man−Pearson法による検索（Lipman, D.J.他、Science
227, 1985, 1435-1441）］を行った結果、最も高い相同
性（３０％台）を有するタンパク質として、ＳＮＦ１遺
伝子ファミリーに属するＡＭＰＫ、およびＭＡＰキナー
ゼなどが見いだされた。

【００３９】上述したように、ｐＬＫＢ−１中には、各
種の既知のコンセンサス配列と一致する配列が存在する
こと、並びに、それ以外の部分においても既知のプロテ
インキナーゼにおいて高度に保存されている配列と一致
する領域が存在することから考えて、ｐＬＫＢ−１がコ
ードするタンパク質は新規なプロテインキナーゼと言え
る。また、上記のプロテインキナーゼ触媒ドメインコン
センサス配列の７番目にリシン（Lys）を有すること
は、セリン／トレオニンキナーゼに特徴的であることが
よく知られており、また、チロシンキナーゼの特徴は、
この位置にアルギニン、セリン、トレオニン、アラニ
ン、システインの何れかを有することであることが知ら
れている。そのため、ｐＬＫＢ−１がコードするタンパ
ク質はセリン／トレオニンプロテインキナーゼであると
考えられる。

【００４０】上記で得た配列表の配列番号（SEQ ID N
O）：２に記載の配列を含むクローンを有する大腸菌
は、１９９５年３月７日に、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０
３５の下、国際寄託された。

【００４１】（Ｃ）ｐＬＫＢ−１のノーザンブロット解
析 ヒトの各種臓器や培養細胞株より調製したpolyＡ⁺ＲＮ
Ａを、ナイロンメンブレンに転写し固定したものが、CL
ONTECH社より購入可能であり、ある遺伝子のヒトにおけ
る発現分布を調べる際広く用いられている。そこで、CL
ONTECH社よりこのようなメンブランである Human Multi
ple Tissue Northern Blot・Human, Human II, Human F
etal II, Human cancer Cell Line を購入し、マニュア
ルに記載されている標準的な方法によりノーザンブロッ
ト解析を行った。

【００４２】すなわち、ｐＬＫＢ−１のコーディング領
域を含む部分を制限酵素により切り出し、アガロースゲ
ル電気泳動法により精製した。これを Pharmacia社より
購入したReady to Go DNA labelling beads を用いた標
準的なランダムヘキサマー法により、［α−³²Ｐ］ｄＣ
ＴＰでラベルした。これを熱変成した後、ExpressHybHy
bridization Solution（CLONTECH社より購入）中で、６
８℃でメンブランと保温することによりハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で数回洗浄した後、０．
１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて５０℃、２０分の洗浄
を２回行った。メンブランを乾燥させた後、オートラジ
オグラフィーを行った。その結果を図１に示す。その結
果、調べたほとんどの組織において、約３ｋｂｐほどの
弱い発現が見られた。ただし、ＨＬ−６０細胞にはそれ
よりも強い発現が見られ、また成人精巣、成人骨格筋、
胎児肝臓及びＫ５６２細胞にはかなり強い発現が観察さ
れた。

【００４３】

【発明の効果】本発明のプロテインキナーゼをコードす
るＤＮＡは従来知られていない新規なクローンである。
本発明のＤＮＡは、プロテインキナーゼ、特には、セリ
ン／トレオニンプロテインキナーゼをコードしていると
考えられ、また上記の実施例に記載したホモロジー検索
の結果に示されるようにＡＭＰＫおよびＭＡＰキナーゼ
と比較的高い相同性を有していることが判明している。
ＡＭＰＫは、脂質または糖などの代謝の調節に関与する
キナーゼであることが知られており、本発明の新規ＤＮ
Ａ配列がコードするプロテインキナーゼもこのような代
謝調節に関与する因子である可能性がある。また、ＭＡ
Ｐキナーゼは、細胞増殖因子などの受容体からの細胞内
シグナル伝達におけるキナーゼカスケードにおいて重要
な役割を担う因子であることが知られており、本発明の
新規ＤＮＡ配列がコードするプロテインキナーゼもこの
ようなキナーゼカスケードに関与している可能性があ
る。

【００４４】このように、本発明の新規ＤＮＡがコード
するプロテインキナーゼは何らかの細胞機能の調節に関
与しているものと考えられる。そこで、例えば、（１）
本遺伝子の生体内での発現を、本遺伝子の配列に基づく
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡなどの投与により抑制
する、（２）本遺伝子をレトロウイルスベクターなどの
適当なベクターに組み込み生体内に導入する、（３）本
遺伝子の生体内での発現を調節する転写調節因子類およ
び／または本遺伝子のプロモーターなどに作用する薬剤
を開発する、（４）本遺伝子がコードするプロテインキ
ナーゼの活性を抑制あるいは促進する薬剤を開発する、
ことなどによって本発明のプロテインキナーゼの活性異
常に基づく疾患に対する有効な治療法を提供することが
できる可能性がある。

【００４５】また、図１で示したように、特に強い発現
が見られた組織には、例えば胎児肝臓における血液幹細
胞のような自己複製が可能である非常に未分化な細胞が
存在し、いわゆる幹細胞システムをとっていることがよ
く知られている。また、ＨＬ−６０細胞やＫ５６２細胞
は白血病細胞であるが、比較的未分化な状態を維持して
いると考えられており、ある種の刺激剤に応じて分化誘
導を行えることはよく知られた事実である。一方、同じ
血液細胞であるが、分化後の状態であると考えられる抹
消血の白血球画分におけるこの遺伝子の発現は非常に弱
い。このようにこの遺伝子の発現パターンには、未分化
な細胞、あるいは未分化な細胞を多く含む組織に非常に
強く、分化した細胞では非常に弱いという特徴が認めら
れる。このことから、このキナーゼが何らかの基質蛋白
質をリン酸化することにより、細胞の分化の制御を行っ
ている可能性が考えられる。さらには、未分化な細胞に
高発現しているこのキナーゼの活性を阻害することによ
り、分化を誘導することが可能かもしれない。ある種の
ガン細胞では、レチノイン酸などにより分化を誘導する
療法により治療することが可能であることがよく知られ
ている。よって、このキナーゼの阻害剤を開発できるな
らば、それによるガン治療が可能であるかもしれない。

【００４６】

【配列表】

【００４７】配列番号（SEQ ID NO）：１ 配列の長さ：１８６塩基 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： GTT GCG GTT AAG ATG TTG AAG AAG AAG AAG TTG CGA AGG ATC CCC AAC 48 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Lys Lys Lys Leu Arg Arg Ile Pro Asn 1 5 10 15 GGG GAG GCC AAC GTG AAG AAG GAA ATT CAA CTA CTG AGG AGG TTA CGG 96 Gly Glu Ala Asn Val Lys Lys Glu Ile Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg 20 25 30 CAC AAA AAT GTC ATC CAG CTG GTG GAT GTG TTA TAC AAC GAA GAG AAG 144 His Lys Asn Val Ile Gln Leu Val Asp Val Leu Tyr Asn Glu Glu Lys 35 40 45 CAG AAA ATG TAT ATG GTG ATG GAA TAC TGC TGC TAC GGC GAG 186 Gln Lys Met Tyr Met Val Met Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Glu 50 55 60

【００４８】配列番号（SEQ ID NO）：２ 配列の長さ：１３０２塩基 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATG GAG GTG GTG GAC CCG CAG CAG CTG GGC ATG TTC ACG GAG GGC GAG 48 Met Glu Val Val Asp Pro Gln Gln Leu Gly Met Phe Thr Glu Gly Glu 1 5 10 15 CTG ATG TCG GTG GGT ATG GAC ACG TTC ATC CAC CGC ATC GAC TCC ACC 96 Leu Met Ser Val Gly Met Asp Thr Phe Ile His Arg Ile Asp Ser Thr 20 25 30 GAG GTC ATC TAC CAG CCG CGC CGC AAG CGG GCC AAG CTC ATC GGC AAG 144 Glu Val Ile Tyr Gln Pro Arg Arg Lys Arg Ala Lys Leu Ile Gly Lys 35 40 45 TAC CTG ATG GGG GAC CTG CTG GGG GAA GGC TCT TAC GGC AAG GTG AAG 192 Tyr Leu Met Gly Asp Leu Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Lys Val Lys 50 55 60 GAG GTG CTG GAC TCG GAG ACG CTG TGC AGG AGG GCC GTC AAG ATC CTC 240 Glu Val Leu Asp Ser Glu Thr Leu Cys Arg Arg Ala Val Lys Ile Leu 65 70 75 80 AAG AAG AAG AAG TTG CGA AGG ATC CCC AAC GGG GAG GCC AAC GTG AAG 288 Lys Lys Lys Lys Leu Arg Arg Ile Pro Asn Gly Glu Ala Asn Val Lys 85 90 95 AAG GAA ATT CAA CTA CTG AGG AGG TTA CGG CAC AAA AAT GTC ATC CAG 336 Lys Glu Ile Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg His Lys Asn Val Ile Gln 100 105 110 CTG GTG GAT GTG TTA TAC AAC GAA GAG AAG CAG AAA ATG TAT ATG GTG 384 Leu Val Asp Val Leu Tyr Asn Glu Glu Lys Gln Lys Met Tyr Met Val 115 120 125 ATG GAG TAC TGC GTG TGT GGC ATG CAG GAA ATG CTG GAC AGC GTG CCG 432 Met Glu Tyr Cys Val Cys Gly Met Gln Glu Met Leu Asp Ser Val Pro 130 135 140 GAG AAG CGT TTC CCA GTG TGC CAG GCC CAC GGG TAC TTC TGT CAG CTG 480 Glu Lys Arg Phe Pro Val Cys Gln Ala His Gly Tyr Phe Cys Gln Leu 145 150 155 160 ATT GAC GGC CTG GAG TAC CTG CAT AGC CAG GGC ATT GTG CAC AAG GAC 528 Ile Asp Gly Leu Glu Tyr Leu His Ser Gln Gly Ile Val His Lys Asp 165 170 175 ATC AAG CCG GGG AAC CTG CTG CTC ACC ACC GGT GGC ACC CTC AAA ATC 576 Ile Lys Pro Gly Asn Leu Leu Leu Thr Thr Gly Gly Thr Leu Lys Ile 180 185 190 TCC GAC CTG GGC GTG GCC GAG GCA CTG CAC CCG TTC GCG GCG GAC GAC 624 Ser Asp Leu Gly Val Ala Glu Ala Leu His Pro Phe Ala Ala Asp Asp 195 200 205 ACC TGC CGG ACC AGC CAG GGC TCC CCG GCT TTC CAG CCG CCC GAG ATT 672 Thr Cys Arg Thr Ser Gln Gly Ser Pro Ala Phe Gln Pro Pro Glu Ile 210 215 220 GCC AAC GGC CTG GAC ACC TTC TCC GGC TTC AAG GTG GAC ATC TGG TCG 720 Ala Asn Gly Leu Asp Thr Phe Ser Gly Phe Lys Val Asp Ile Trp Ser 225 230 235 240 GCT GGG GTC ACC CTC TAC AAC ATC ACC ACG GGT CTG TAC CCC TTC GAA 768 Ala Gly Val Thr Leu Tyr Asn Ile Thr Thr Gly Leu Tyr Pro Phe Glu 245 250 255 GGG GAC AAC ATC TAC AAG TTG TTT GAG AAC ATC GGG AAG GGG AGC TAC 816 Gly Asp Asn Ile Tyr Lys Leu Phe Glu Asn Ile Gly Lys Gly Ser Tyr 260 265 270 GCC ATC CCG GGC GAC TGT GGC CCC CCG CTC TCT GAC CTG CTG AAA GGG 864 Ala Ile Pro Gly Asp Cys Gly Pro Pro Leu Ser Asp Leu Leu Lys Gly 275 280 285 ATG CTT GAG TAC GAA CCG GCC AAG AGG TTC TCC ATC CGG CAG ATC CGG 912 Met Leu Glu Tyr Glu Pro Ala Lys Arg Phe Ser Ile Arg Gln Ile Arg 290 295 300 CAG CAC AGC TGG TTC CGG AAG AAA CAT CCT CCG GCT GAA GCA CCA GTG 960 Gln His Ser Trp Phe Arg Lys Lys His Pro Pro Ala Glu Ala Pro Val 305 310 315 320 CCC ATC CCA CCG AGC CCA GAC ACC AAG GAC CGG TGG CGC AGC ATG ACT 1008 Pro Ile Pro Pro Ser Pro Asp Thr Lys Asp Arg Trp Arg Ser Met Thr 325 330 335 GTG GTG CCG TAC TTG GAG GAC CTG CAC GGC GCG GAC GAG GAC GAG GAC 1056 Val Val Pro Tyr Leu Glu Asp Leu His Gly Ala Asp Glu Asp Glu Asp 340 345 350 CTC TTC GAC ATC GAG GAT GAC ATC ATC TAC ACT CAG GAC TTC ACG GTG 1104 Leu Phe Asp Ile Glu Asp Asp Ile Ile Tyr Thr Gln Asp Phe Thr Val 355 360 365 CCC GGA CAG GTC CCA GAA GAG GAG GCC AGT CAC AAT GGA CAG CGC CGG 1152 Pro Gly Gln Val Pro Glu Glu Glu Ala Ser His Asn Gly Gln Arg Arg 370 375 380 GGC CTC CCC AAG GCC GTG TGT ATG AAC GGC ACA GAG GCG GCG CAG CTG 1200 Gly Leu Pro Lys Ala Val Cys Met Asn Gly Thr Glu Ala Ala Gln Leu 385 390 395 400 AGC ACC AAA TCC AGG GCG GAG GGC CGG GCC CCC AAC CCT GCC CGC AAG 1248 Ser Thr Lys Ser Arg Ala Glu Gly Arg Ala Pro Asn Pro Ala Arg Lys 405 410 415 GCC TGC TCC GCC AGC AGC AAG ATC CGC CGG CTG TCG GCC TGC AAG CAG 1296 Ala Cys Ser Ala Ser Ser Lys Ile Arg Arg Leu Ser Ala Cys Lys Gln 420 425 430 CAG TGA 1302 Gln

【００４９】配列番号（SEQ ID NO）：３ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列： GTNGCNGTNA ARATGYTNAA 20

【００５０】配列番号（SEQ ID NO）：４ 配列の長さ：２０塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列： TCNCCRTARC ARCARTAYTC 20

【００５１】配列番号（SEQ ID NO）：５ 配列の長さ：２４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列： TGAAGAAGAA GAAGTTGCGA AGGA 24

【００５２】配列番号（SEQ ID NO）：６ 配列の長さ：２４塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列： CCACCAGCTG GATGACATTT TTGT 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はｐＬＫＢ−１のノーザンブロット解析
の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 14/47 8517−4Ｈ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列をコードする塩基配列、またはこの一部に挿入、欠失
   若しくは置換を加えた塩基配列、あるいはこれらにハイ
   ブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
   含む請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のＤＮＡを有するプラス
   ミド。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のプラスミドにより形質
   転換された、原核または真核細胞の形質転換体。
5. 【請求項５】 （１）ヒト由来のｍＲＮＡより逆転写酵
   素を使用してｃＤＮＡを合成すること、（２）鋳型とし
   て上記（１）で得たｃＤＮＡを使用し、プライマーとし
   てある種のプロテインキナーゼに共通して保存されてい
   る領域のアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドを使
   用して、ＰＣＲを行うこと、（３）上記（２）で得たク
   ローンをプローブとして使用し、長鎖のｃＤＮＡを含む
   ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっ
   て陽性クローンを単離すること、という各工程を含む、
   請求項１に記載のＤＮＡの製造方法。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列をコードする塩基配列と特異的にハイブリダイズし得
   るオリゴヌクレオチド。