JPH08298999A - ジャガイモやせいも病ウイロイドの検出方法及び検出用プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ジャガイモやせいも病ウイロイドを選択的か
つ高感度に検出する方法を提供する。 【構成】 ジャガイモやせいも病ウイロイドに対してそ
のＲＮＡにおける配列と相補性を有する塩基配列の合成
オリゴヌクレオチドプローブ５種類を混合物として用い
て、ジャガイモやせいも病ウイロイドを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる、ジャガイ
モやせいも病ウイロイド（ＰＳＴＶｄと略す）の検出方
法及び検出用プローブに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＳＴＶｄは環状一本鎖ＲＮＡ分子から
なる病原体であり、世界各地で発生が報告されている。
ＰＳＴＶｄのジャガイモにおける病徴は栽培品種や環境
条件によって異なるが、感染すると、塊茎が紡錘状にな
ったり、ひび割れが生じたり、収量が低下し、外観によ
る損傷も甚大となる。現在、日本ではＰＳＴＶｄの発生
は報告されていないが、その診断法を確立し、海外から
の侵入を未然に防ぐ手段を講じておかなくてはならな
い。ウイロイドを検出する方法としては、指標植物とし
てラトガース種のトマトにＰＳＴＶｄを接種して被検体
の感染の有無を判定する生物検定法や、電気泳動による
検定法、ハイブリダイゼーションを用いた遺伝子診断法
などがある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生物検
定法は感度が高いものの、１〜２か月の検定期間を要
し、特に弱毒系統では病徴が弱く、温度、日照条件によ
っては病徴判定が困難であるという問題点がある。ま
た、電気泳動による検定法は感度的に充分ではない。遺
伝子診断法としては、ウイロイドの遺伝子を鋳型として
酵素的に調製したｃＤＮＡプローブを用いる方法［平成
４年度農林水産省特別試験研究費助成金による研究報告
書：合成ＤＮＡプローブ法による植物ウイルス病及びウ
イロイド病、病原同定法に関する研究］がある。この方
法では、ｃＤＮＡプローブの調製にウイロイドが必要で
あるが、日本ではＰＳＴＶｄが植物防疫法に定める輸入
禁止品に該当し、クローン化ｃＤＮＡも同様に輸入禁止
品に該当するため、その入手が困難であるという問題点
がある。

【０００４】また取り扱いの容易さからは、本出願人が
先に特願昭６３−２３７４７号（特開平２−２３８９４
号公報）として出願した合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを用いてウイロイドを検出する方法があるが、ｃＤＮ
Ａプローブを用いる方法と比較すると検出感度が劣ると
いう問題点がある。更に１つのプローブでは標的とする
ウイロイドの結合部分に変異がある場合、検出感度が低
下することが懸念される。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の問
題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、複数の合成オ
リゴヌクレオチドプローブを混合物として用いることに
より、ｃＤＮＡプローブと同等の検出感度でＰＳＴＶｄ
を選択的に検出できることを見いだし本発明を完成する
に至った。

【０００６】すなわち、本発明は、ＰＳＴＶｄに対し
て、そのＲＮＡにおける配列と相補性を有する下記の塩
基配列（１）〜（５）の合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを混合物として用いることからなるジャガイモやせい
も病ウイロイドの検出方法及びその検出用プローブを提
供するものである。 （１）5'- ＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＣ
ＣＧＡＧＧ-3' （２）5'- ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ
ＣＴＧＣＴＣ-3' （３）5'- ＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＧＣＴＣ
ＣＡＧＧＴ-3' （４）5'- ＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧ
ＧＴＡＧＴ-3' （５）5'- ＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＡＣＡＣＣＣＴ
ＣＧＣＣ-3'

【０００７】以下に本発明を詳細に説明する。一般に、
標識合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる検出はｃ
ＤＮＡプローブよりも検出感度が低い。即ち合成オリゴ
ヌクレオチドプローブの標識数は１つであり、ウイロイ
ドとハイブリダイズする時にはウイロイド１分子に１つ
の標識物が対応することになる。一方、全長又は多量体
のｃＤＮＡを標識してプローブとすると、ｃＤＮＡ中に
複数個の標識物が取り込まれるため、全長のｃＤＮＡの
場合はウイロイド１分子に複数個の標識物が対応するこ
とになる。このため、標識物の多いｃＤＮＡプローブを
用いた方の感度が数倍優れると考えられる。そこで、本
発明者らは、複数の合成オリゴヌクレオチドプローブを
混合して用いる手法を種々検討した。

【０００８】本発明における合成オリゴヌクレオチドプ
ローブの塩基配列については、次の点を考慮して選定し
た。ウイロイドは分子内相補結合を取った構造をしてお
り、ハイブリダイゼーションにおいては、標的とするウ
イロイドＲＮＡの分子数よりも過剰のプローブ量が入っ
ているため、プローブ同士がミスアニーリングを起こす
ことも考えられるので、二次構造上で相補結合を取らな
い領域を選択した。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）との併用も考慮して、ＰＣＲ増幅断片にハイブリダ
イゼーションする領域を設計できるようにした。その結
果、前述の塩基配列（１）〜（５）の５種類の合成オリ
ゴヌクレオチドプローブを検出用プローブとして選定し
た。

【０００９】本発明におけるＰＳＴＶｄの検出方法の概
略を示す。まず、ＰＳＴＶｄに感染した植物からウイロ
イドを含む核酸を抽出して検体を調製する。この操作
は、通常の方法により、例えば、日本植物病理学会報、
５０巻、３３１〜３３８頁（１９８４）の方法により行
うことができる。

【００１０】抽出した核酸は固定化させてハイブリダイ
ゼーションを行う。例えば、ナイロン又はニトロセルロ
ース膜などの固相に核酸を直接スポットして吸着させて
ハイブリダイゼーションを行う（ドットブロットハイブ
リダイゼーションと略す）方法や、逆転写酵素でｃＤＮ
Ａ合成後にＰＣＲ増幅した産物（ＲＴ−ＰＣＲ産物と略
す）をマイクロプレートに吸着させてハイブリダイゼー
ションを行う（ＰＣＲ−マイクロプレートハイブリダイ
ゼーションと略す）方法により行うことができる。

【００１１】本発明における合成オリゴヌクレオチドプ
ローブのハイブリッドでは、ホルムアミドを含まないハ
イブリダイゼーション溶液中で計算した融解温度のＴｍ
値が約６５℃であることから、ハイブリダイゼーション
の温度条件を６０℃又は５５℃で行うことが好ましい。

【００１２】本発明で用いられる合成オリゴヌクレオチ
ドプローブは、市販のＤＮＡ合成機を用いて容易に調製
できる。例えば、ＤＮＡ合成機によって、アミノ基、チ
オール基などで官能基修飾したオリゴマーを調製して、
その官能基に対応する官能基指向性の標識化剤で標識化
する方法、天然型のオリゴヌクレオチドを合成して酵素
的に標識する方法などが利用できる。

【００１３】標識物質は、放射性同位元素、蛍光物質な
どのエネルギ−放射体、ビオチン、ジゴキシゲニンなど
の二次標識可能な物質、アルカリホスファターゼなどの
酵素が利用できる。標識物質の種類、標識位置、標識数
は、必要な検出感度及び用いる検出方法により選択する
ことができるが、検体中の妨害物質の影響を受けにくい
もの、またプローブの相補鎖形成能を損なわないものを
選ぶことが好ましい。

【００１４】ハイブリダイゼーション後の検出方法とし
ては、オートラジオグラフィー検出、可視吸収などの吸
収エネルギー検出、蛍光、化学発光などの発光エネルギ
ー検出が利用できる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例にて本発明を更に説明する。な
お、実施例及び比較例においてＰＰＳＴＶ−１Ｍプライ
マーは5'- ＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴ-3'
を、ＰＰＳＴＶ−１Ｐプライマーは5'- ＧＣＧＣＧＧＧ
ＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧ-3'の塩基配列を持つ。

【００１６】実施例１および比較例１〜５ ＰＣＲ−マイクロプレートハイブリダイゼーションによ
る方法 （１）．検体の調製 ＰＳＴＶｄ感染トマト（ラトガース種）及び健全トマト
（ラトガース種）の生葉０．１〜０．２ｇから常法に従
い、１．５ｍｌ容マイクロチューブ中で磨砕して２Ｍ−
塩化リチウム可溶性核酸を抽出し、０．１〜０．４ｍｌ
の滅菌蒸留水に溶解させ検体とした。

【００１７】（２）．ＲＴ−ＰＣＲ産物 検体８μｌに、ｃＤＮＡ合成プライマーとしてＰＰＳＴ
Ｖ−１Ｍプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、緩
衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製：５×逆転写酵素緩衝液）
８μｌ、滅菌蒸留水１３μｌ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各５ｍＭ）４μｌ、
０．１Ｍ−ＤＴＴ４μｌ、逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ Ｂ
ＲＬ製：Ｍ−ＭＬＶ・ＲＴａｓｅ ２００Ｕ／μｌ）１
μｌを加え混合し、３７℃１時間静置し、検体のｃＤＮ
Ａを得た。

【００１８】次に、ｃＤＮＡ２μｌに緩衝液（東洋紡績
製：１０×Ｔｔｈ緩衝液）５μｌ、ＰＣＲプライマーと
してＰＰＳＴＶ−１ＭプライマーとＰＰＳＴＶ−１Ｐプ
ライマーを各１μｌ（各５０ｐｍｏｌ／μｌ）、ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各５
ｍＭ）２μｌ、滅菌蒸留水３８μｌ、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ（東洋紡績製：Ｔｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
１Ｕ／μｌ）１μｌを加え混合し、更に、ミネラルラ
イトオイル３０μｌを混合液上に重層した。次いで、プ
ログラマブルインキュベータ（ＡＳＴＥＣ製：Ｐｒｏｇ
ｒａｍａｂｌｅＴｅｍｐ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＰＣ−７０
０）を用い、３０サイクル（１サイクル目：９４℃５分
→５７℃１分→７２℃２分、２〜２９サイクル目：９４
℃３０秒→５７℃１分→７２℃２分、３０サイクル目：
７２℃８分→１５℃）のＰＣＲを行い、ＲＴ−ＰＣＲ産
物を得た。

【００１９】（３）．ＲＴ−ＰＣＲ産物のマイクロプレ
ートへの固定化 ＲＴ−ＰＣＲ産物を１００℃５分熱変性させた後氷冷
し、ＤＮＡ固定化液（１０×ＳＳＣ、１０ｍＭ−ＥＤＴ
Ａ［ｐＨ７．０］）で２５倍、１２５倍、６２５倍及び
３１２５倍に希釈した。この１００μｌをマイクロプレ
ート（Ｎｕｎｃ社：Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ II Ｍａ
ｘｉｓｏｒｐ）のウエルに入れ、３７℃で２時間静置し
た。

【００２０】（４）．ビオチン標識合成オリゴヌクレオ
チドプローブの調製 ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ製：３９２型ＰＣＲ ｍａｔｅ）
によって１μｍｏｌスケ−ル、５’−アミノヘキシル修
飾型で合成することにより、前述の塩基配列（１）〜
（５）の５’末端にアミノヘキシル基が付いた下記の対
応するアルキルアミノオリゴマー（１）〜（５）を得
た。

【００２１】＜アルキルアミノオリゴマー（１）＞5'-
Ｈ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）₆ −Ｏ−ＰＯ₃ −ＡＧＧＡＡＣＣＡ
ＣＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＧＡＧＧ-3' ＜アルキルアミノオリゴマー（２）＞5'- Ｈ₂ Ｎ−（Ｃ
Ｈ₂ ）₆ −Ｏ−ＰＯ₃ −ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴ
ＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣ-3' ＜アルキルアミノオリゴマー（３）＞5'- Ｈ₂ Ｎ−（Ｃ
Ｈ₂ ）₆ −Ｏ−ＰＯ₃ −ＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴ
ＴＣＧＣＴＣＣＡＧＧＴ-3' ＜アルキルアミノオリゴマー（４）＞5'- Ｈ₂ Ｎ−（Ｃ
Ｈ₂ ）₆ −Ｏ−ＰＯ₃ −ＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣ
ＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧＴ-3' ＜アルキルアミノオリゴマー（５）＞5'- Ｈ₂ Ｎ−（Ｃ
Ｈ₂ ）₆ −Ｏ−ＰＯ₃ −ＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＡ
ＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣ-3'

【００２２】次に、アルキルアミノオリゴマー（１）〜
（５）それぞれ１ｍｇを１．５ｍｌ容エッペンドルフチ
ューブに取り、０．１Ｍ−炭酸水素ナトリウム３００μ
ｌ、１０％ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルのジメチルホルムアミド溶液１５０μｌを加
え、数秒混合し、室温で２時間反応させた。その後、反
応混合物を精製水１ｍｌで希釈し、同量のｎ−ブタノー
ルを加え、分液し、ブタノール層を除去した。この操作
を５回繰り返すことにより、下層の水層を約０．１ｍｌ
まで濃縮した。

【００２３】残渣を弱アニオン交換カラムに通液した。
流速を１ｍｌ／分とし、溶離液として、Ａ液（２０ｍＭ
−トリス塩酸［ｐＨ８．０］）、Ｂ液（Ａ液＋１Ｍ−塩
化ナトリウム）を用いて、Ｂ液濃度を０％から１００％
まで連続的に上昇させた。カラム出口を紫外検出器で連
続的にモニターし、紫外吸収最大の溶出液を主留分とし
て得た。主留分を脱塩カラムで脱塩することにより、前
述の塩基配列（１）〜（５）の５’末端にビオチンが標
識された５種類の対応するビオチン標識合成オリゴヌク
レオチドプローブ（１）〜（５）（Ｂｉｏ−ＰＳ−１〜
５と略す）を得た。

【００２４】（５）．Ｂｉｏ−ＰＳのハイブリダイゼー
ション Ｂｉｏ−ＰＳ−１〜５をそれぞれ単独で、及び５種類の
Ｂｉｏ−ＰＳの等量混合物をハイブリダイゼーション液
（６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０ｍＭ−
リン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ６．７］、２５μｇ／ｍ
ｌ サケ精子ＤＮＡ）で１０ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈し、
マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、プレー
トに専用粘着テープを張って、５５℃及び６０℃で１２
時間静置した。

【００２５】（６）．アルカリホスファターゼ標識アビ
ジンとの反応 アルカリホスファターゼ標識アビジン（Ｔｒｏｐｉｘ
製：ＡＶＩＤＸ−ＡＰ０．２５ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ−
Ｔ（１３７ｍＭ−塩化ナトリウム、２．７ｍＭ−塩化カ
リウム、１．４７ｍＭ−リン酸二水素カリウム、８．１
ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０）で１，０００倍希釈し、マイクロプレートに１０
０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間静置した。

【００２６】（７）．発色反応 基質（１０％ジエタノールアミン緩衝液［ｐＨ９．
８］、１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナト
リウム）をマイクロプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌ加
え、室温で静置し、１時間後に４１５ｎｍの吸光度を測
定して感度を評価した。結果は表１のとおりである。

【００２７】比較例６ （１）．ビオチン標識ｃＤＮＡプローブの調製 ０．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに緩衝液（東洋紡
績製：１０×Ｔｔｈ緩衝液）５μｌ、滅菌蒸留水３０．
２５μｌ、ｄＮＴＰ溶液（ｄＡＴＰ５ｍＭ、ｄＣＴＰ５
ｍＭ、ｄＧＴＰ５ｍＭ、ｄＴＴＰ３．５ｍＭ）２μｌ、
０．３ｍＭ−ビオチン化−１１−ｄＵＴＰ（Ｅｎｚｏ
製、Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰ）８．３μｌ、ＰＰＳＴＶ
−１Ｍプライマー及びＰＰＳＴＶ−１Ｐプライマー（各
５０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌ、耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（東洋紡績製：Ｔｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ４
Ｕ／μｌ）０．５μｌを加え混合し、ミネラルライトオ
イル３０μｌを重層し、更に、実施例１の（２）で得た
ｃＤＮＡ２μｌを加えて、実施例１の（２）と同様にＰ
ＣＲを行うことにより、ビオチン標識ｃＤＮＡプローブ
（Ｂｉｏ−ｃＤＮＡと略す）を得た。

【００２８】（２）．Ｂｉｏ−ｃＤＮＡのハイブリダイ
ゼーション Ｂｉｏ−ｃＤＮＡを１００℃で５分間熱変性した後、ハ
イブリダイゼイション液（５×ＳＳＣ［ｐＨ７．０］、
１０ｍＭ−ＥＤＴＡ［ｐＨ７．０］、５０％ホルムアミ
ド、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２５μｇ／ｍｌ サケ精
子ＤＮＡ）で５００倍又は１，０００倍に希釈し、マイ
クロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、プレートに
専用粘着テープを張って、４２℃で１２時間静置した。

【００２９】（３）．アルカリフォスファターゼ標識ア
ビジンとの反応及び発色反応 実施例１と同様にアルカリフォスファターゼ標識アビジ
ンとの反応および発色反応操作を行い、４１５ｎｍの吸
光度を測定して感度を評価した。結果は表１のとおりで
ある。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１より、Ｂｉｏ−ＰＳ−１〜５の混合物
（実施例１）を用いた場合の吸光度は各々を単独で用い
た場合（比較例１〜５）に比べ高い値を示しており、Ｂ
ｉｏ−ＰＳ−１〜５を混合物として用いることの有効性
が認められる。また、Ｂｉｏ−ＰＳ−１〜５の混合物
（実施例１）はｃＤＮＡプローブを用いた場合（比較例
６）に比べ実用上遜色のない値を示した。

【００３２】実施例２ ドットブロットハイブリダイゼーションによる方法 （１）．検体の調製 ＰＳＴＶｄ感染ジャガイモ（メイクイーン種）（ＰＰと
略す）、健全ジャガイモ（メイクイーン種）（ＨＰと略
す）、ＰＳＴＶｄ感染トマト（ラトガース種）（ＰＴと
略す）及び健全トマト（ラトガース種）（ＨＴと略す）
の各生葉５ｇから実施例１と同様にして核酸を抽出して
調製し検体とした。また、ＰＴから抽出した核酸試料を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ＰＳＴＶｄ
を溶出し、標品として精製ＰＳＴＶｄを得た。２６０ｎ
ｍの吸光度を測定し、２０ＯＤを核酸量１ｍｇ／ｍｌと
して各検体の核酸量を測定した。

【００３３】（２）．メンブレンフィルターへの固定化 各検体１０μｌ（抽出核酸 ０．４μｇ／μｌまたは精
製ＰＳＴＶｄ ０．００４μｇ／μｌ）を０．５ｍｌ容
エッペンドルフチューブに取り、これに変性液（３７％
ホルムアルデヒド／ホルムアミド／１０×ＭＯＰＳ緩衝
液／滅菌蒸留水＝１６２／５００／１００／２３８［容
量比］）３０μｌを加え、６５℃で１５分熱変性し急冷
した後、４０μｌの２０×ＳＳＣを加えた。更に、希釈
液（変性液３ｍｌ、２０×ＳＳＣ４ｍｌ、滅菌蒸留水１
ｍｌ）で２倍ずつ１１段階（２¹，２² ，２³ ，２⁴ ，
２⁵ ，２⁶ ，２⁷ ，２⁸ ，２⁹ ，２¹⁰及び２¹¹倍）に希
釈し、希釈した液２μｌずつを、予め１０×ＳＳＣに浸
水後、風乾したメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ製：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ ｎｙｌｏｎ ４×１２．５ｃ
ｍ）にスポットした。メンブレンフィルターにＵＶ ｃ
ｒｏｓｓ ｌｉｎｋｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で１５０
ｍＪの紫外線を照射した後にろ紙上で風乾した。

【００３４】（３）．Ｂｉｏ−ＰＳのハイブリダイゼー
ション 検体を固定化したメンブレンフィルターをポリエチレン
バックに入れ、ハイブリダイゼーション液（６×ＳＳ
Ｃ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、２０
ｍＭ−リン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ６．７］、１００
μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ）４ｍｌを加え、６０℃で
２時間静置した。その後、実施例１の（４）で調製した
Ｂｉｏ−ＰＳ−１〜５の等量混合物４０ｐｍｏｌを加
え、更に、６０℃で１３時間静置した。ハイブリダイゼ
ーション液を除き、メンブレンフィルターを容器（ポリ
プロピレン製）に移し、洗浄液（６×ＳＳＣ）１００ｍ
ｌで室温５分間３回振とうし、更に、洗浄液（６×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ）１００ｍｌで６０℃３０分２回振
とうして洗浄した。

【００３５】（４）．検出前処理 メンブレンフィルターを容器に入れ、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ２０（０．１Ｍ−トリス塩酸［ｐＨ７．５］、０．１
５Ｍ−塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）２
０ｍｌ中で室温２分間振とうし、メンブレンフィルター
をポリエチレンバックに移し換え、ブロッキング液（３
％ブロッキング試薬［ベーリンガー製］のＴＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ２０溶液）３ｍｌを加え、室温で３０分間静置し
た。ブロッキング液を除き、アビジン−アルカリホスフ
ァターゼ希釈液（アビジン−アルカリホスファターゼ液
［Ｔｒｏｐｉｘ製：０．２５ｍｇ／ｍｌ］をブロッキン
グ液で２，０００倍に希釈した溶液）３ｍｌを加え、室
温で１０分間静置した。メンブレンフィルターを容器に
移し、１００ｍｌのＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で室温１５
分間２回振とうし、次いで、検出用緩衝液（０．１Ｍ−
トリス塩酸、０．１Ｍ−塩化ナトリウム、５０ｍＭ−塩
化マグネシウム［ｐＨ９．５］）２０ｍｌを加え、室温
で５分間静置した。

【００３６】（５）−１．発光反応 メンブレンフィルターをポリエチレンバッグに移し、発
光液（ＰＰＤ保存液［Ｌｕｍｉｇｅｎ製：１０ｍｇ／ｍ
ｌ ２３．５ｍＭ］を検出用緩衝液で１００倍に希釈し
た溶液）３ｍｌを加え、室温で５分間静置した。ろ紙上
で数分乾燥した後、ポリエチレンラップで包み、Ｘ線フ
ィルムに１時間露光させて発光の度合いを肉眼観察し
た。その後、同メンブレンフィルターを検出用緩衝液で
洗浄して、次の発色操作に移った。

【００３７】（５）−２．発色反応 発色液（５％ＮＢＴ［Ｅｎｚｏ製：ニトロブルーテトラ
ゾリウム］２５μｌ、５％ＢＣＩＰ［Ｅｎｚｏ製：５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩］１００
μｌ、検出用緩衝液１０ｍｌ）３ｍｌを加え、遮光し室
温で２時間静置した。発色液を除き、メンブレンフィル
ターを精製水で洗浄し、ろ紙上で風乾した後、発色の度
合いを肉眼観察した。

【００３８】検出感度は希釈倍率の増加に従い発光、発
色の度合い（シグナル）の円形が小さくなり、色も薄く
なるが、発光が発色よりも高い感度を示した。発光では
ＰＰ、ＰＴともに２¹⁰倍に希釈しても明確なシグナルが
認められ、発色ではＰＰ、ＰＴともに２⁹ 倍希釈までシ
グナルが確認された。精製ＰＳＴＶｄでは７．８ｐｇま
で検出可能であった。なお、ＨＰ、ＨＴはいずれも希釈
しない状態においても発光、発色ともにシグナルは全く
認められなかった。

【００３９】比較例７ 実施例２のＢｉｏ−ＰＳ−１〜５の混合物の代りに、実
施例１の（４）で調製したＢｉｏ−ＰＳ−１ないし５を
それぞれ単独で用いた他は、実施例２と同様の操作で発
光及び発色させた。希釈倍率の増加とともにシグナルの
形は小さくなり、色も薄くなる。僅かでもシグナルが認
められる希釈倍率を検出限界とし、表２に示す。なお、
Ｂｉｏ−ＰＳ単独使用では、ＨＰ、ＨＴはいずれも希釈
しない状態で、発色、発光ともにシグナルは全く認めら
れなかった。

【００４０】

【表２】

【００４１】比較例８ （１）．Ｂｉｏ−ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション 実施例２の（２）で得た検体を固定化したメンブレンフ
ィルターをポリエチレンバックに入れ、ハイブリダイゼ
ーション液（５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ、２０ｍＭ−リン
酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ６．７］、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡ）４ｍｌを加え、４２℃で２時間静置
し、予め１００℃で５分間熱変性したＢｉｏ−ｃＤＮＡ
（比較例６の（１）における調製物）４μｌを加え、更
に、４２℃で１３時間静置した。次に、ハイブリダイゼ
ーション液を除き、メンブレンフィルターを容器に移
し、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００ｍｌ
で室温１０分間３回振とうし、更に、洗浄液（０．１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）１００ｍｌで５５℃１５分３
回振とうして洗浄した。

【００４２】（２）検出前処理及び発色反応又は発光反
応 メンブレンフィルターを容器に入れ、実施例２と同様に
検出前処理を行ったのち、発光反応（１時間露光）及び
発色反応（室温で１時間静置）操作を行った。発光では
ＰＰ、ＰＴともに２⁸ 倍希釈でもシグナルが認められ、
発色ではＰＰ、ＰＴともに２⁷ 倍までシグナルが認めら
れた。なお、ＨＰ、ＨＴはいずれも、希釈しない状態で
も発光、発色ともにシグナルは全く認められなかった。

【００４３】

【発明の効果】ＰＳＴＶｄに対してそのＲＮＡにおける
配列と相補性を有する合成オリゴヌクレオチドプローブ
５種類を混合物として用いることにより、ＰＳＴＶｄを
選択的かつ高感度に検出することができる。したがっ
て、本発明は、ＰＳＴＶｄ感染によるジャガイモやせい
も病の早期診断、ウイロイド伝染の防止、無病種いも生
産に大きな効果を発揮するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉本 宣敬 東京都千代田区平河町２丁目３番24号 有 機合成薬品工業株式会社内 (72)発明者 木村 郁夫 北海道札幌市手稲区星置１条３丁目５番 イトーピア中央２−1207号 (72)発明者 四方 英四郎 北海道札幌市白石区本通13丁目南２番22号

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジャガイモやせいも病ウイロイドに対し
   て、そのＲＮＡにおける配列と相補性を有する下記の塩
   基配列（１）〜（５）の合成オリゴヌクレオチドプロー
   ブを混合物として用いることを特徴とするジャガイモや
   せいも病ウイロイドの検出方法。 （１）5'- ＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＣ
   ＣＧＡＧＧ-3' （２）5'- ＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ
   ＣＴＧＣＴＣ-3' （３）5'- ＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＧＣＴＣ
   ＣＡＧＧＴ-3' （４）5'- ＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧ
   ＧＴＡＧＴ-3' （５）5'- ＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＡＣＡＣＣＣＴ
   ＣＧＣＣ-3'
2. 【請求項２】 請求項１において、混合物として用いる
   合成オリゴヌクレオチドプローブが、塩基配列（１）〜
   （５）の合成オリゴヌクレオチドプローブであるジャガ
   イモやせいも病ウイロイド検出用プローブ。