JPH08220055A - 電気化学的酵素バイオセンサ - Google Patents
電気化学的酵素バイオセンサInfo
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- JPH08220055A JPH08220055A JP7307233A JP30723395A JPH08220055A JP H08220055 A JPH08220055 A JP H08220055A JP 7307233 A JP7307233 A JP 7307233A JP 30723395 A JP30723395 A JP 30723395A JP H08220055 A JPH08220055 A JP H08220055A
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Abstract
気化学的に酸化させ得る電極を有する電気化学的バイオ
センサの提供。 【解決手段】 貴金属電極を含み、それによりピリジン
ヌクレオチド、特にNADHが電気化学的に酸化され
る、電気化学的酵素バイオセンサにおいて、貴金属電極
が、表面細孔を多く含み、触媒特性を有する微細組織を
有し、その結果として、ピリジンヌクレオチドの電気化
学的酸化を要する過電圧が減少することを特徴とする電
気化学的酵素バイオセンサ。
Description
れによりピリジンヌクレオシド、特にNADHが電気化
学的に酸化される、電気化学的酵素バイオセンサに関す
る。
食品の分析における数多くの酵素分析法が、デヒドロゲ
ナーゼ類の酵素により触媒される反応に基づく。これ
は、一方では分析される基質の濃度と、他方では生成ま
たは消費される補酵素NADHの濃度との間の正比例関
係を利用することを含む。これらの方法の大部分は、3
60nmの波長を有する光の特徴的な吸収により、相当す
る酸化形態NAD+ とは異なるNADH分子の光学特性
を利用する。着色した被検体または濁った被検体の場
合、これらの分光測光法は、たいていは支障をきたす
か、少なくとも、労力および時間のかかる試料の前処理
を必要とする。これは、NADHの電気化学的検出によ
って回避することができる。そのうえ、電極と酵素とを
直接かつ安定にカップリングすると、電気化学的バイオ
センサを形成することが可能である。これまで、電気化
学的方法の欠点は、NADHを酸化するのに要する高い
過電圧であった。これはまた、被検体中に同様に存在す
る多数のさらなる物質を検出してしまう結果を招き、そ
れにより、通常、後で修正しなければならない異常に高
い分析値が得られる。そのうえ、高い過電圧でのNAD
Hの電気化学的酸化が、ラジカル中間体を経て、電極面
を永久的に被覆し、継続的な損傷(いわゆる電極汚損、
W. J. Blaedel & R. A. Jenkins の Study of the elec
trochemical oxidation of reduced nicotinamide aden
ine dinucleotide, Anal. Chem. 47 (1975) 1337-1343
を参照)を引き起こすNADHのダイマーおよびオリゴ
マーを生成してしまう。この現象を回避するために、被
検体にしばしば、酸化還元反応を受けることができ、N
ADHから電極への電子の移動を生じさせる触媒量の低
分子量分子を添加混合する(とりわけ、L. Gorton の C
hemically modified electrodesfor the electrocataly
tic oxidation of nicotinamide coenzymes, J. Chem.
Soc. Faraday Trans. 82 (1986) 1245-1258を参照)。
これらのいわゆる媒介物質は、部分的に電極上に固定化
される。しかし、媒介物質が効果を示すためには可動性
を維持しなくてはならないという制限を考慮すると、電
極に対する媒介物質の安定な結合が可能でないことがし
ばしばある。媒介物質は被検体中に拡散して、センサの
安定性を相当損ねる。
記載の方法は、酸化還元反応を受けることができるカッ
プリング試薬を用いる。この試薬は、被検体に加えられ
ると、NADHとで、低い過電圧で酸化される電気活性
化合物を形成する。米国特許第5,122,457号明
細書は、多孔質の炭素電極および白金またはパラジウム
で被覆された黒鉛電極上でNADHを定量的に酸化しう
ることを開示している。ただし、用いる電位を指定して
はいない。
属電極を含む電気化学的酵素バイオセンサを、被検体に
媒介物質を加えることなく、電極にいかなる化学的改変
をも加えることなく、被検体中に存在するおそれのあ
る、同様に電気化学的に酸化されうる干渉物質がいかな
る電極反応にもほとんど関与しないように改良すること
にある。このようにして得られるより高い選択性に加え
て、トランスダクタ電極の安定性、ひいてはそれから製
造されたセンサの作動安定性を高めなければならない。
ると、貴金属を含み、それによりピリジンヌクレオチド
が電気化学的に酸化される電気化学的酵素バイオセンサ
をベースにして、表面細孔を多く含み、触媒特性を有す
る微細組織を有する貴金属電極を用いた結果として、ピ
リジンヌクレオチドの電気化学的酸化に要する過電圧が
減少することによって達成される。表面細孔を多く含む
微細組織は、電極の表面積が相当に増大するよう、極微
的に小さな無数の山(ピーク)およびくぼみによっても
たらされる。山は、電極面から突出する、0.05μm
〜4μm 、好ましくは0.5μm〜2μm の平均曲率半
径を有する貴金属粒子または粒子群からなる。この微細
な荒れがおおよそ電極の表面積を3〜10倍、好ましく
は4〜7倍に増す(幾何学的表面積と比較した場合)。
これは、電子顕微鏡検査およびインピーダンス分光測定
によって実証することができる。
電極の特別な微細組織は、結果的に、ピリジンヌクレオ
チド、特にNADHの酸化のための過電圧の大幅な減少
を示す触媒特性を有する電極をもたらす。NADHのN
AD+ への陽極酸化に要する過電圧が、SCEに対して
0〜200mV、好ましくは100〜150mVに減少し、
したがって、通常に見られる値を少なくとも50%下回
ることが見いだされた。
る場合に、特に良好な結果が得られる。
る膜を作用電極に適用することにより行うことが好まし
い。平面電極に対する膜の付着は、上述した電極の微細
な荒れによって促進される。例えばドイツ国特許第40
27728号明細書に記載されているような、特にポリ
(酢酸ビニル)水性分散液から形成される膜の使用が、
安定かつ選択性で高感度のバイオセンサを得ることを可
能にする。
金属電極を電気重合性の導電性ポリマー、特にポリピロ
ールおよびポリ(メチレンブルー)で被覆することによ
り、そのような電極を改変する。このような改変は、酵
素および他の選択性付与バイオ成分の固定化に用いるこ
とができる。処理の間に、巨視的電極面全体に一様に分
布した多数の反応性部位が形成されるため、貴金属電極
の分散面が電気重合の間のポリマーの均質な成長を可能
にする。
ならば、その酵素は、電極の前面でポリマーが成長する
間にポリマー中に物理的に捕らえられることによって固
定化される。ポリマー骨格は、第一には、酵素を固定化
するように働くが、巨大分子、例えばタンパク質が電極
面に達してそれを被覆し、ひいては少なくとも可逆的に
それを損傷することを防ぐふるいの機能をも有してい
る。さらに、ポリマーは、酸化還元部位を有しているな
らば、酵素または補酵素から金属電極への電子の移動の
ための接触媒介物質として作用することができる。した
がって、ポリ(メチレンブルー)の場合、電流測定信号
の大きさを顕著に(10倍に)増すことができ、これ
は、SN比に対して有利な効果を及ぼし、結果的に、検
出限界の引下げおよび測定すべき物質に対する選択性の
改善をもたらす。
は、反応性の側鎖基を介して、電極に対して直接固定化
される。これは、膜バイオセンサと比較すると、測定す
べき成分が膜中に拡散する必要がないため、きわめて短
い応答時間を有するバイオセンサの構築を可能にする。
ある種の酵素、例えばグルコースオキシダーゼは、その
多糖包膜が二官能性スペーサ分子への化学連鎖に適して
いる糖タンパク質である。これらのスペーサは、それら
の2個の官能基の一方、例えばアミノ官能基を介して糖
タンパク質の糖残基に結合している。もう一方の末端官
能基、例えばチオール基は、金電極の表面との安定な結
合状態に入る。グルコースオキシダーゼの場合、凍結乾
燥した酵素(enzyme lyophilisate)を炭酸系緩衝液(pH
8.1)に溶解し、濃度1%の2,4−ジニトロフルオ
ロベンゼンのエタノール溶液を加えたのち、過ヨウ素酸
ナトリウム溶液(60mM)と添加混合すると、酵素の糖
成分のいわゆる過ヨウ素酸塩開裂が起こる。そして、こ
の処理で形成された反応性カルボニル基を、透析精製工
程ののち、二官能性チオ、例えばシスタミンと、そのア
ミノ基を介してカップリングさせる。得られる改変酵素
は、そのシスタミン部分のチオール基を介して金表面に
安定に結合している。
マー結合剤を含むペーストを用いてスクリーン印刷によ
り化学的に不活性な基材を被覆したのち、その被覆した
基材を、第一の焼成区域の温度が300℃〜400℃で
あり、最後の焼成区域の温度が800℃〜950℃であ
る段階的に上昇する焼成温度区域を有する炉に通すこと
により、表面細孔を多く含む上述の微細組織が生成され
る。この処理における被覆した基材の滞留時間は、約3
分〜8分であることが好ましい。
製造された貴金属電極上でのNADHのNAD+ への陽
極酸化のための過電圧が、+600mVの過電圧を要する
従来の貴金属電極とは対照的に、NADH濃度の電流測
定の場合、KCl飽和水性カロメル基準電極(SCE)
に対して+200mV未満の過電圧で足りる程度にまで減
少することが見いだされた。過電圧の減少は、液状被検
体中に存在するおそれのある、高い過電圧で共に酸化し
うる干渉物質が、もはや電気化学反応を起こさず、分析
結果を誤らせなくなるという結果を招く。記載した貴金
属電極は、特に、デヒドロゲナーゼに基づく電気化学的
酵素バイオセンサのトランスダクタとして用いられる。
これらのセンサの主な応用分野は、臨床診断ならびに環
境、プロセスおよび食品の分析である。
例を参照しながら本発明をさらに詳述する。
分布を有する金粉末を、ニトロセルロース含有ポリマー
結合剤と密に混合した。次に、このようにして調製した
金ペーストを、スクリーン印刷により、41mm×41mm
×0.5mm3 のセラミック基板に塗布した。そして、そ
の被覆した基板を、8cm/minの速度で、それぞれが長さ
60cmの6個の焼成区域を含む炉に通した。温度の分布
は次のとおりであった。
の粒径分布およびそれらの半径が、金電極のその後の表
面特性および多孔度を決定する。さらには、ポリマー画
分の熱分解の際に起こる微小な爆発が、金表面に鋭利な
くぼみを形成する結果を招く。これらのくぼみも同様に
表面特性に影響を及ぼす。微小な爆発は、下方に位置す
るポリマー層が急速に熱分解したとき、それらの上方に
位置する層の気体拡散が、その熱分解によって生じた圧
力を下げるのに十分でないことによって起こる。従来の
研磨された金電極の実表面積と、厚膜技術によって調製
された金電極の実表面積とを比較するインピーダンス分
光測定により、後者が、同一の幾何学的表面積を与えら
れるならば、実表面積の6倍の表面積を有することが示
された。
発明による電極の触媒活性を示す。サイクリックボルタ
ンメトリー図中、厚膜金電極(a)の場合、NADHの
存在下(1)には、約+100mV(SCEに対して)か
ら出発して、NADHの酸化によって発生する顕著な陽
極電流が見られる。NADHを含まない緩衝剤を用いる
と(2)、この電流は存在しない。従来の電極を用いた
場合(b)には、同一の実験条件の下でこのような挙動
を確認することはできない〔(3)、(4)〕。これら
のサイクリックボルタンメトリー図は、支持電解質とし
て0.1M 過塩素酸ナトリウムを含有する0.1M リン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中で記録した。電圧速
度は10mV/secであった。NADH濃度はそれぞれ0mM
〔(2)、(4)〕および5mM〔(1)、(3)〕であ
った。
ADHを検出するために、フローインジェクション系に
組み込み、SCEに対して+145mVで作動させた。図
2は、NADHの酸化の場合の陽極電流の変化を時間に
対して示す。矢印は、いずれの場合にも、調製したての
NADH溶液を使用した時点を示す。したがって、新鮮
な溶液を導入した直後の電流の低下は、主に、溶液
(0.1M 過塩素酸ナトリウムを含む、0.1M リン酸
ナトリウム緩衝液、室温でpH7.0)中のNADHの熱
分解の結果として起こったものであり、電極の汚損が原
因ではないか、そうであるとしても、影響はわずかな程
度である。
確に示すため、潜在的に干渉性の物質(1および2mMの
過酸化水素、1および2mMのアセトアミノフェン〔=パ
ラセタモール(paracetamol)〕、血清で1:1に希釈し
たものおよび希釈していないもの)をNADH(1およ
び2mM)とともにフローインジェクション系に入れて実
験した(図3)。その際、本発明による電極を使用し
て、(b)の場合、従来もっとも一般的である+555
mVの電圧を電極に印加し、(a)の場合、NADHを酸
化するのに十分である+145mVの低めの電位を印加し
た(いずれもSCEに対して)。NADH以外には、こ
の低い電位では、わずかな程度の血清成分を除いて何も
示されなかった。
センサは、本発明による電極が適用可能であることを示
す。酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼは、ポリ
(酢酸ビニル)膜中へのマトリックス包含により、金表
面上に固定化した。検量線は、0.1M リン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.0)を用いて作動させた、そのインジ
ェクション容量が0.6ml/minの流量で100μl であ
るフローインジェクション系において記録した。
び(b)鏡面輝度に研磨された市販の平面金電極(EG
&G)のサイクリックボルタンメトリー図であり、NA
DHを加えた場合(1)と加えない場合(2)とを示す
グラフである。
定性を示すグラフである。
よび本発明によって可能になる電位(a)での干渉物質
の影響を示すグラフである。
ている、低い分極電圧で作動するグルコースバイオセン
サの濃度−電流特性を示すグラフである。
Claims (10)
- 【請求項1】 貴金属電極を含み、それによりピリジン
ヌクレオチド、特にNADHが電気化学的に酸化される
電気化学的酵素バイオセンサにおいて、貴金属電極が、
表面細孔を多く含み、触媒特性を有する微細組織を有
し、その結果として、ピリジンヌクレオチドの電気化学
的酸化に要する過電圧が減少することを特徴とする電気
化学的酵素バイオセンサ。 - 【請求項2】 該微細組織により、電極の表面積がその
幾何学的表面積の3〜10倍、好ましくは4〜7倍であ
る、請求項1記載の電気化学的酵素バイオセンサ。 - 【請求項3】 電極表面が、0.05μm 〜4μm 、好
ましくは0.5μm〜2μm の平均曲率半径を有する貴
金属粒子又は粒子の塊を含む、請求項2記載の電気化学
的酵素バイオセンサ。 - 【請求項4】 NADHのNAD+ への陽極酸化に要す
る過電圧が、SCEに対して0〜200mV、好ましくは
100〜150mVに減少する、請求項1〜3のいずれか
1項記載の電気化学的酵素バイオセンサ。 - 【請求項5】 電極が金からなるものである、請求項1
〜4のいずれか1項記載の電気化学的酵素バイオセン
サ。 - 【請求項6】 電極が膜で被覆され、その膜中に、選択
性決定バイオ成分、特に酵素が固定化されている、請求
項1〜5のいずれか1項記載の電気化学的酵素バイオセ
ンサ。 - 【請求項7】 電極が、特にピロールとメチレンブルー
との電気重合によって改変されたものである、請求項1
〜6のいずれか1項記載の電気化学的酵素バイオセン
サ。 - 【請求項8】 酵素または他のバイオ成分が、反応性の
側鎖(ペンダント)基を介して電極上に直接固定化され
ている、請求項1〜7のいずれか1項記載の電気化学的
酵素バイオセンサ。 - 【請求項9】 請求項1〜6記載の電気化学的バイオセ
ンサに用いるための貴金属電極を製造する方法におい
て、金粉末およびポリマー結合剤を含むペーストを用い
て、スクリーン印刷により化学的に不活性な基材を被覆
し、その被覆した基材を、第一の焼成区域の温度が30
0℃〜400℃であり、最後の焼成区域の温度が800
℃〜1100℃である段階的に上昇する焼成温度区域を
有する炉に通すことを特徴とする方法。 - 【請求項10】 滞留時間、すなわち被覆した基材を炉
の1の焼成区域に通す各時間が、3分〜8分である、請
求項9記載の方法。
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