JPH08211051A

JPH08211051A - ウィレブランド病のための生物検定

Info

Publication number: JPH08211051A
Application number: JP16132992A
Authority: JP
Inventors: Koichi Chitani; 晃一千谷; Yoshihiro Fujimura; 吉博藤村
Original assignee: Fujita Health University; Genzyme Corp
Current assignee: Fujita Health University; Genzyme Corp
Priority date: 1992-06-19
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1996-08-20

Abstract

(57)【要約】【目的】ボトロセチン分子の２鎖のものが、生物検定
道具一式に組み込まれ−それは随意的に精製されたリス
トセチンをも含むが−血小板凝集の割合が血清や血しょ
うのサンプル中のフォン・ウィレブランド因子の存在を
示す指標として検出して、精製されたボトロセチンを利
用してのフォン・ウィレブランド病に対する生物検定法
を提供することを目的とする。【構成】本発明は、ヘビ（ブラジル産響尾蛇）の毒液
中に見つけられた血小板凝集因子である精製ボトロセチ
ンの純粋物質を用い当該ボトロセチンを血清や血小と接
触させ、血清や血しょう中のフォン・ウィレブランド因
子の量を指示するものとして、ボトロセチンと血清や血
しょうとの反応を確認する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ヘビ（ブラジル産響
尾蛇）〔Ｂｏｔｈｒｏｐｓｊａｒａｒａｃａ〕の毒液
中に見つけられた血小板凝集因子であるボトロセチン
〔ｂｏｔｒｏｃｅｔｉｎ〕の純粋物質を用いた、ウィレ
ブランド病の診断の改良方法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】外科手術などによる血管の損傷は、内皮
下の層を循環血液にさらす（露出）ことになる。血液は
ウィレブランド因子（ＶＷＦ）である血しょうグリコプ
ロティンを含んでいるので、血小板を露出した内皮に付
着させ、特に高頻度で動脈や微少血管に付着させる。血
小板付着を媒介する正確なメカニズムはまだ確立されて
いないが、血しょうから出されたＶＷＦが傷ついた血管
壁に結合し、その後血小板膜にうめ込まれているグリコ
プロティンＩｂ−グリコプロティンＩＸ複合体と呼ばれ
ている特殊な受容体と相互作用すると言われている。Ｖ
ＷＦの遺伝的変質をもつ患者はフォン・ウィレブランド
症（ＶＷＦ）と診断される。ＶＷＦは３つのカテゴリに
分けられる。タイプ１は、血しょう中のＶＷＦをもつも
ので血しょう中のＶＷＦの濃度は正常だが構造ではｍｕ
ｌｔｉｍｅｒの数が減少しているものと、タイプ３はＶ
ＷＦ分子がかなり欠けているものに特徴づけられる。

【０００３】抗生物質リストセチンは試験内でＶＷＦの
存在を検定するための診断法として広く用いられてき
た。その検定法は血小板の凝集の割合を視覚あるいは光
学的に測定する。しかしその様な検定の活性成分として
リストセチンを使う事は、いくつかの観点から不十分で
ある。第１に、リストセチン活性は人間の血小板を用い
てのみに論証されてきた。他の種の血小板はこの検定に
おいては余り反応しない。第２に、リストセチン活性は
ＶＷＦｍｕｌｔｉｍｅｒｓの存在に依存し、ＶＷＦ
（タイプ２）の患者からの血小板は、リストセチン−ベ
ースの検定では否定（−）の結果となる。それ故にリス
トセチンはＶＷＦのタイプ１、タイプ２、タイプ３を識
別できない。第３に、リストセチンは試験管内検定では
高濃度を使用するために、いくつかの例では、普通の血
しょうタンパクの沈降を引き起し、血小板凝集の決定を
妨害することがある。

【０００４】ＲｅａｄｅｔａｌがＰｒｏｃｅｅｄｉ
ｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｃａｄｅｍ
ｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ、７５、４５／４（１９７
８）)で、ヘビＢｏｔｈｒｏｐｓｊａｒａｒａｃａの
血しょうから一部精製した物質は、ＶＷＦの存在下で血
小板凝集を強引に押し進めることを述べている。Ｒｅａ
ｄｅｔａｌはこの物質をリストセチンの代用物質と
して使用できることを示唆し、「ボトロセチン」と命名
した。リストセチンとボトロセチンの両者の化合物にい
くつかの機能的差異は見られるけれども、両者ともにＶ
ＷＦを血小板のグリコプロティンＩｂに結合させること
が知られている。更に、リストセチン又はボトロセチン
のどちらかの存在下で起るＶＷＦのグリコプロティンＩ
ｂへの結合は、ＶＷＦ分子の同じ領域によって媒介され
ている。しかしリストセチンとは異なって、ボトロセチ
ンは人間以外の他の動物種の多くに於いても血小板凝集
を促進することができる上に、ボトロセチンは、ＶＷＦ
のタイプ２の患者からの血しょう中の血小板凝集を促進
することができる。又、ボトロセチンは非特異的に血し
ょうタンパク沈降を起さない。ＶＷＦの処置は患者によ
って示されるばらばらのタイプ（タイプ１、２又は３）
に基づくべきなので、これらの３つのタイプを識別する
ことのできる検定試験をもつことが非常に処置を有効に
してくれると思われる。リストセチンテストと共にボト
ロセチンテストを併用することは、ＶＷＦのそれぞれの
タイプの識別を可能にする。臨床応用へのその様なテス
トを発展させる為にボトロセチン試薬をよく知り、精製
する必要がある。

【０００５】ボトロセチンの精製するために数々の試み
がなされてきた。Ｒｅａｄｅｔａｌ. はＢｌｏｏｄ、
ｖｏｌ. ７４、１０３１（１９８９）の中で、陰イオン
クロマトグラフィーで準備された精製されたボトロセチ
ンは硫酸ドデシルナトリウムの存在下でポリアクリルア
ミドゲル電気泳動をさせると２６、５キロダルトン（Ｋ
ＤＡ）に単一帯を示すことを報告した。又、精製ボトロ
セチンは精製されたＶＷＦに結合し、活性複合体を形成
し、次にグリコプロティンＩｂに結合することを述べて
いる。

【０００６】Ａｎｄｒｅｗｓｅｔａｌ. はＢｉｏｃ
ｈｅｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ. ２８、８３１７（１９８９）
の中で、精製されたボトロセチンは１４ＫＤＡと１４，
５ＫＤＡとの明らかな２つのサブユニットを持った２５
ＫＤＡ、２硫酸基でリンクしたｄｉｍｅｒであることを
示した。このｄｉｍｅｒのＮ−末端配列は単一のタンパ
ク配列である。トリプトファン処理したＶＷＦのｆｒａ
ｇｍｅｎｔはボトロセチン精製物で皮膜した玉（ｂｅａ
ｄｓ）に結合するが、一方ＶＷＦを含むグリコプロティ
ンＩｂｆｒａｇｍｅｎｔの結合ｓｉｔｅは判らないの
で、ボトロセチンはＩＷＦを改変することによって血小
板凝集を促進していることを示唆する。それ故に、ここ
では患者の血清や血しょう中に存在するＶＷＦの生物検
定に有用な、十分に高い純度をもったボトロセチン化合
物を供給する為の発明の概要を述べようとするものであ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題及びその手段】本発明
は、フォン・ウィレブランド因子（ＶＷＦ）の改良され
た生物検定は、ボトロセチンの高純度のものを利用す
る。ボトロセチンはヘビ（ブラジル産響尾蛇）からの毒
液の天然の抽出物の精製によって得られる。精製は陰イ
オン交換クラマトグラフィーを利用して有効に進めら
れ、最終的分離は疎水性の相互作用によってなし遂げら
れた。精製された物質は、更に１つ鎖のタンパクと２つ
鎖のタンパクとに分画された。これらの両タンパクがこ
こに「ボトロセチン」として一般的に言われるものであ
るが、２鎖のタンパクは血小板凝集の促進活性に関して
は、１鎖のタンパクよりも非常に重要度が高い。この強
力な活性を示す理由はまだ知られていない。分画の過程
は、逆相クロマトグラフィーと疎水溶剤液の異なる溶解
度とを利用している。一方では、２鎖タンパクはヘビ
（ブラジル産響尾蛇）からの天然の血清を陰イオン交換
クロマトグラフィーによって分画することにより得るこ
とができる。そして得られた物質は不動化されたグリコ
プロティンに吸着させることができる。２鎖化合物は、
ＳＥＱ１ＤＮＯ. １とＳＥＱ１ＤＮＯ. ２に示された
様なアミノ酸のアルファーサブユニットとベーターサブ
ユニットを持っている。

【０００８】精製されたボトロセチンはｖｏｎＷｉｌ
ｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒの生物検定に対する検定
道具の構成要素として有用である。その様な検定方法
は、又は、適切なバッファー試薬とそれらの運用の為の
教示とをも含んでいる。ウィレブランド因子のタイプ２
に特異的な検定道具一式には、付加的に活性成分として
の精製されたリストセチンを含んでいる。検定の過程に
は、精製されたボトロセチンを患者からの血清や血しょ
うサンプルと接触させること、又、サンプル中に存在す
るウィレブランド因子とボトロセチンが反応することに
よって、血清や血しょう中に起る血小板凝集の割合を観
察することも含まれる。凝集の割合は、適当な計器によ
って視覚的又は光学的に記録された。この方法により、
サンプル中のウィレブランド因子のタイプ１とタイプ３
の存在は速やかに決定された。

【０００９】ウィレブランド因子のタイプ２についての
検定は上述の過程に従い、又、付加的に血清や血しょう
の第２の部分（別の部分）とリストセチンとを反応させ
る。それからボトロセチン又は、リストセチン存在下で
の血小板凝集の割合を比較する。

【００１０】

【実施例】ここで述べられた様に精製されたボトロセチ
ンは、ウィレブランド病の生物検定の根本的な要素であ
る。ボトロセチンはヘビ（ブラジル産響尾蛇）の毒液か
ら天然抽出したものを精製して得られる。精製はディエ
チルアミノイクロマトグラフィーの様な陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを用いて分画し、続いてｓｉｚｅ排除
クロマトグラフィーを行い最終的に疎水高性能液体クロ
マトグラフィーにより精製される。この精製工程から得
られた生成物は１鎖と２鎖のボトロセチンの両方を含有
している。１鎖タンパクは、逆相高性能液体クロマトグ
ラフィーを用いて溶出させることにより２鎖タンパクと
は分離することができる。一方、２鎖ボトロセチンは天
然のヘビ毒液から、陰イオン交換クロマトグラフィーを
用いて分画することにより供給でき、ボトロセチンを不
動化したグリコプロテイン上に吸着させ、２鎖ボトロセ
チンを特異的に溶出させることができる。これらの方法
の両者の方法により、分子量２７ＫｄＡで、ＳＥＱ１Ｄ
ＮＯ. １とＳＥＱ１ＤＮＯ. ２とに示されたアミノ酸
配列をもつ２鎖の分子を得る。

【００１１】この発明に有用な精製ボトロセチンは、Ｄ
ＮＡ組換えテクノロジーによっても供給される。この方
法によって、２鎖タンパクを供給することは、２鎖タン
パクが１鎖に比して３０倍も血小板凝集を促進するが故
に、特に有利である。結果として、かなりの量で２鎖タ
ンパクを利用できることは、ウィレブランド病に対する
生物検定標本の感度と精密度とを高めることになる。組
換え技術は、完全なアミノ酸配列の同定によって２鎖タ
ンパクの製造に常に使用されるであろう。この分野に精
通した人は、アミノ酸配列が手に入れば、すぐに既知の
分子生物学手法を使ってこのタンパクを暗号化するＤＮ
Ａ配列を分離することが出来る。このＤＮＡは次に大量
のタンパクを生産させるためにバクテリア、酵母菌、哺
乳類の表現ベクトルへと技術化することができる。

【００１２】例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオタイドは、
特にアルファ,サブユニットのＮＯ.１２からＮＯ. ２３
までの範囲では、このタンパク配列に基づいて合成され
得るだろう。この範囲は、比較的にコドン余分が少ない
アミノ酸から成る。ベーターサブユニットの１６から２
５のアミノ酸も同じ様な理由でオリゴヌクレオタイド作
成によく利用されている。

【００１３】これらのオリゴヌクレオタイドは放射性の
ラベルがつけられ、標準的方法で構成された（ブラジル
産響尾蛇）の遺伝子あるいは補足ＤＮＡライブラリーを
さぐり出す為のプローグとして用いられた。例として、
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒ
ｅｓｓ（１９８９）を参照できる。２鎖タンパクのそれ
ぞれのユニットがそれぞれ別のｇｅｎｅによってコード
付けされた場合では、アルファとベーターの両サブユニ
ットに対応するオリゴヌクレオタイドプローブを遺伝子
あるいは補足ライブラリーをさぐり出す為にそれぞれ独
立的に与えた。

【００１４】ひとたび、アルファ又はベーターサブユニ
ットをコード付けした遺伝子あるいは補足ＤＮＡ配列は
分離されれば、これらの配列はＤＮＡベクトルとして、
バクテリア、酵母、動物細胞系へと発現のために組み込
むことができる。文献中では、多様な発現システムがそ
の様なベクトルの発現媒体としての使用の可能性として
利用されている。

【００１５】組み換え技術を用いたボトロセチンの大量
の生産は診断テスト道具と重要な関係をもってくる。と
いうのは、出発点である物質が多量にあれば高度な精製
を可能にし、更に首尾一貫して多量の最終生産物を得る
ことができるからである。この発明の診断手順は、上述
の様に精製されたボロルセチンを供給すること及びボト
ロセチンを患者の血清あるいは血しょうを接触させるこ
ととを含む。血清あるいは血しょう中のウィレブランド
因子の存在下でボトロセチンは反応して血小板凝集を引
き起こす。血小板凝集の割合は、血清や血しょう中のウ
ィレブランド因子の存在の指示となり、ウィレブランド
因子に関連した数量を示す。それ故に、ウィレブランド
病の指標となり得る。血小板凝集の割合は適切な光学器
械を使って視覚的に決定することができる。ウィリブラ
ンド因子のタイプ２に特異的な検定には、血清や血しょ
うの１部をボトロセチンと接触させ、次に別の１部を精
製リストセチンに接触させ、血小板凝集の割合を両者で
比較することも含まれる。

【００１６】この発明の精製ボトロセチンは、貯蔵や安
定性にすぐれた化合物をつくり出すためのよく知られた
手順を使って一般化できるし、物質の使用やとり扱いを
容易にすることができる。

【００１７】次々にあげる例は、この発明の種々の側面
を制限なしに示そうと試みたものである。この分野にす
ぐれた人々は、数多の同価のものの存在を認めるであろ
うが、それは付帯して出てくるクレームの範囲である。

【００１８】例は、一般的又は個人的ｓｏｕｒｃｅｓか
ら得られた数々の物質や装置を使用した。その様な物質
や装置の詳細は、”ＧｅｎｅｒａｌＭｅｔｈｏｄｓ”
の冒頭に述べられている。

【００１９】

【一般的方法】Ｓｉｇｍａから購入した、天然のブラジ
ル産響尾蛇毒液（ｌｏｔｓ７５Ｆ０３４０９、６８Ｆ
０５５７、９８Ｆ０２６１、１１９Ｆ０５９９）、ウシ
のフィブリノーゲン（タイプ１）とＤＦＰ（ｄｉｉｓｏ
ｐｒｏｐｌｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎから購入した、ＴＰＣＫ（Ｎ−α−
ｔｏｓｙｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｃｈｌｏｒ
ｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）−ｔｒｙｐｓｉｎ，−
α−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、生化学工業から購入し
た、ＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎとＰｅｐｓｉｎ、宝酒造か
ら購入した、ａｒｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓ
ｅ、茨城大学のＤｒ．Ｔ．Ｍａｓａｋｉから贈与され
た、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｅａｓｅ
（アクロモバクター土壌菌）、Ｍｉｌｅｓから購入し
た、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（黄
色ブドウ球菌）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した、
ＢＳＡ（ウシノ血清アルブミン）、ｎｅｕａｍｉｎｉｄ
ａｓｅとｅｎｄＦ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇ
ｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅＦ）、から購入した、
Ｃｙａｎｏｇｅｎｂｒｏｍｉｄｅ，（ＢｒＣＮ臭化
シアノジェン）とｌｏｄｏｇｅｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍか
ら購入は、ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅＮａ¹²⁵Ｉ，Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢから購入した、ＤＥＡＥ（ｄ
ｉｅｔｈｌｙａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅＣＬ−６ＢｇｅｌとＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅＨＲ５／５ｃｏｌｕｍｎ，ＴｏｙｏＳｏｄａ
から購入した、ＴＳＫＧ３０００ｗとＧ２０００ｃ
ｏｌｕｍｎｓ。

【００２０】タンパク濃度は、Ｂｉｏ−ｒａｄからの染
料結合検定道具によって、スタンダードとしてＢＳＡを
使って決定された。高純度ＶＷＦはＦｕｊｉｍｕｒａ
ｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６１，３８１（１９８６）が
述べている方法で凍結沈澱物（奈良赤十字血液センター
からの贈与である）から分離した。

【００２１】タンパクの¹²⁵ＩラベルはＦｒａｋｅｒと
Ｓｐｅａｋ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙとＢｉｏｐｈｙ
ｓｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ８０，８４９（１９７８）に述べられているｌｏｄ
ｏｇｅｎｍｅｔｈｏｄにより行われた。

【００２２】

【例１】１鎖タンパク質の精製ボトロセチンは陰イオン交換クロマトグラフィーによっ
て精製され、ついで大きさ排除（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕ
ｓｉｏｎ）と疎水性の高性能液体クロマトグラフィーに
かけられる。陰イオン交換のステップでの全ての行程は
４℃で行われた。天然の毒液（ｌｏｔｓ７５Ｆ０３４
０９と６８Ｆ０５５７）は５０ｍｌのバッファーＡ
（０，０２％ＮａＮ₂と２ｍＭｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ
ｅ，ｐＨ７．４）に溶解された。不溶性の物質は２５０
０×ｇで１５分間遠心することで除去された。上清液
は、あらかじめバッファーＡで平衡させたＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂの２．６×３．５ｃｍカ
ラムに注がれた。カラムはバッファーＡで流速５０ｍｌ
／ｈｏｕｒ，１８時間洗われた。それから０．１ＭＮ
ａＣｌを含むバッファーＡで１２．５時間洗われた。カ
ラムは、０．１Ｍから０．７ＭＮａＣｌまでの直線勾
配を持ったバッファーＡのそれぞれ１５０ｍｌを使って
展開された。分画９ｍｌが集められ、タンパクやフィブ
リノーゲンの凝固活性に関し、又、１２５_IＶＷＦの血
小板結合を促進する活性に関して調べられた。天然のブ
ラジル産響尾蛇毒液（５００ｍｇ）を、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによってＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒａｓ
ｅＣＬ−６Ｂカラム上に分留した結果は、フィブリノ
ーゲン凝固活性の９０％以上が０．１ＭＮａＣｌでカ
ラムから抽出した初期の物質中に存在していることを示
した。０．１Ｍから０．７ＭＮａＣｌの勾配抽出によっ
て、３つの大きなピークが得られ、そして集められた。
１つのピークは残余のフィブリノーゲン凝固活性のみを
示した。他の２つのピークはＶＷＦの血小板への結合を
生じさせるための活性やＶＷＦ依存の血小板凝集のため
の活性を示し、フィブリノーゲン凝固活性は示さなかっ
た。これらの２つのピークは集められ、０．１ＭＮＨ
₄ ＨＣＯ₃，ｐＨ７．８，４℃で２日間透析されて、凍
結乾燥された。

【００２３】凍結乾燥されたタンパク質は、バッファー
Ｂ（０．０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｅと０．５ＭＮａＣ
ｌ，ｐＨ６．８）に溶かされた。３ミリグラムのタンパ
ク質は、ＴＳＫＧ３０００ＷとＧ２０００ＳＷを縦に
つないだｓｉｚｅ排除ＨＰＬＣで１．０ｍｌ／ｍｉｎの
流速で分離され、１．０ｍｌ分画中に集められた。ＶＷ
ＦがＧＰ（グリコプロティン）Ｉｂに結合するのを促進
する活性に一致する第１のタンパクピークが抽出され
た。ＶＷＦの血小板への結合を促進する活性をもつ分画
は集められ、透析されて、凍結乾燥された。

【００２４】凍結乾燥されたサンプルはバッファーＣ
（１．７Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄）に溶かされ、更に、そ
の各々５００μｇのタンパクは前もってバッファーＣで
平衡されたＰｈｅｎｙｌ−ＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ５
／５カラム上で疎水性ＨＰＬＣによって、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで精製された。５分後に、バッファーＢ中に
１．７〜０Ｍ（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄の濃度勾配をかけ
て、最初と最終のバッファー各々１８ｍｌを用いて開始
された。いくつかのタンパク質ピークがカラムから抽出
され、それらのＶＷＦ結合促進活性は第一のピークに一
致した。ピーク分画は集められ透析され凍結乾燥して−
２０℃に保存された。

【００２５】

【例２】２鎖タンパク質の精製２鎖タンパク質は、出発物質にｌｏｔ９８Ｆ０２６
１，ｌｏｔ１１９Ｆ０５９９の天然毒液を使用した以
外は、例１で述べられた方法により精製された。加え
て、２鎖タンパク質は、逆相ＨＰＬＣのＳｙｎＣｈｒｏ
ｐａｋＲＰ−８（Ｃ８）によって１鎖ボトロセチンは
分離される。本質的には、１鎖と２鎖の混合ボトロセチ
ンがカラムに注がれ、０〜６０％のアセトニトリル勾配
をつけて抽出される。タンパク質の抽出は２８０ｎｍ．
での吸収によって監視される。抽出された２つのピーク
は、最初のものが１鎖ボトロセチンであり、第二のもの
が、２鎖ボトロセチンである。

【００２６】

【例３】親和性クロマトグラフィーを使用してのボト
ロセチン精製２鎖ボトロセチンの精製の第二の方法は、最初発見され
たタンパクのレクチン様活性を利用したものである。ブ
ラジル産響尾蛇毒液の１．５ｇがｐＨ７．５の２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの２０ｍｌに溶かされ、５０ｍｌ
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに注がれる。カラム
は、ｐＨ７．５の２０ｍｌＴｒｉｓ中に０．１〜１．
０ＭＮａＣｌ勾配液で展開され、カラム分画が、ＶＷ
Ｆに対する結合活性と血小板凝集活性について分析され
る。活性分画は集められ、バッファーＤ（２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ）
中に透析される。それからＣａＣｌ₂が最終濃度ｍＭま
で加えられた。

【００２７】１０ｍｌＡｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４ＢカラムがＲｏｆｆ＆Ｗａｎ
ｇ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ２５８，１０６５７（１９８３））
の方法により準備された。カラムは２ｍＭＣａＣｌ₂
を含むバッファーＤで平衡された。プールされていた活
性分画がカラムに注がれ、それからカラムは２ｍＭＣ
ａＣｌ₂を含むバッファーＤで、流出液の２８０ｎｍの
吸光がみられなくなるまで流浄された。それから、２鎖
のボトロセチンは１０ｍＭＥＤＴＡを含むバッファー
Ｄで抽出された。ＥＤＴＡで抽出した分画をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（硫酸ドデシルナトリウムの存在下でのポリアク
リルアミドゲル泳動）で分析した結果、ｂａｎｄ移動は
例２で精製されたボトロセチンと同じであった。

【００２８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％までの勾配
で）分析は、精製されたボトロセチンは２８Ｋｄａの分
子量をもち、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）
還元後に３２Ｋｄａになることを示し、このボトロセチ
ンは単一のポリペプチド鎖から成ることを示した。異な
る６つの実験でほぼ１〜２．５ｍｇの精製１鎖ボトロセ
チンが５００ｍｇの同じ天然毒液から得られた。ｐｌは
等電気焦点法により４．０−４．１で、吸光係数（Ｅ１
％，１ｃｍ）は１０．７５であった。精製ボトロセチン
のＶＷＦに対する蛋白分解活性は、培養混合物がＳＤＳ
−アガロースゲル電気泳動で分析された時に見られなか
った。

【００２９】同様に、２鎖ボトロセチンをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析すると２７Ｋｄａの分子量をもち、ＤＴＴ還元
後は１４．５Ｋｄａと１５Ｋｄａの二重線を生じること
が示され、このことはボトロセチンのこの型は二硫化物
の相互作用でリンクされた２つのポリペプチドから成る
ことを示している。

【００３０】

【例４】１鎖および２鎖ボトロセチンのアミノ酸組成１鎖および２鎖ボトロセチン標本のアミノ酸組成の解明
はそれらがそれぞれ２つの異なったタンパク質であり、
同じタンパクの二つの型ではないという事を確かめるた
めに試みられた。アミノ酸組成は２４時間の酸加水分解
後に、日立アミノ酸分析器ＭｏｄｅｌＬ−８５００又
は、ＷａｔｅｒｓＰｉｃｏｔａｇｓｙｓｔｅｍ（Ｂ
ｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒｅｔａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆｃｈｒｏｍａｔｏｇｒｐｈｙ３３６，９３（１
９８４））を使って決められた。１鎖および２鎖ボトロ
セチンのアミノ酸組成は次の表に示されている。

【００３１】

【表１】

【００３２】

【例５】１鎖及び２鎖ボトロセチンのアミノ酸末端配
列アミノ酸末端配列の解明は、１鎖および２鎖ボトロセチ
ン分子は二つの独立した異なるタンパク質であることを
確かめるために試みられた。アミノ酸配列は、Ｐｏｌｙ
ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ膜上にばらまいた（松平Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ２６２，１００３５（１９８７））後、又は逆相Ｈ
ＰＣＬで分離した後に、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒモデル
４７０Ａで決定した。

【００３３】タンパク質のシステインとシスチンの含有
量が０．３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３と６Ｍグ
アニジン−ＨＣｌとを含むバッファー中にタンパク質を
溶解することにより決定された。ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙ
ｌｐｈｏｓｐｈｉｎで二硫化結合を還元する（Ｒｕｅｇ
ｇａｎｄＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＸＬＶＩＩ，ＩＩＩ（１９７
７））前と後のどちらかで液の部分標本を４−Ｖｉｎｙ
ｌｐｙｒｉｄｉｎｅで処理し、（Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ
ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１２．３１４６（１９７
３））アミノ酸分析によってＳ−ｐｙｒｉｄｙｌｅｔｈ
ｙｌシステインの含有量が計測された。中性ＳＵＧＡＲ
含有量はＤｕｂｏｉｓｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｃｈｅｍ．２８，３５０（１９４６）の方法により概
算された。

【００３４】１鎖ボトロセチンのＮＨ₂末端は遮断され
なかった。そして最初の２５残基のアミノ酸配列はＳＥ
ＱＩＤＮＯ：３に示されるように決定された。ｃｙ
ｃｌｅ２で２つの残基ＩＩｅとＶａｌは殆ど等量と同定
され、この位置で多形性の存材を示した。２鎖ボトロセ
チンは還元され、Ｓ−ｐｙｒｉｄｙｌｅｔｈｙｌａｔｅ
化され、そして逆相ＨＰＬＣを使ってＳｙｎｃｈｒｏｐ
ａｋＲＰカラムで構成サブユニットに分離された。二
つのサブユニットのＮＨ₂末端配列は同類なものである
が、しかし２鎖ボトロセチンは異なる配列をもつ二つの
サブユニットから成る二硫化物のリンクした異種ｄｉｍ
ｅｒである点で異なり、１鎖分子の形とは異なるのであ
る。

【００３５】

【例６】１鎖および２鎖ボトロセチンの生物学活性Ａ．ボトロセチン-ＶＷＦ複合体の形成の測定（１ｍｍｕｌｏｎ１Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌｓｔ
ｒｉｐｓ，ＤｙｍａｔｅｃｈＬａｂ．）製の遊離でき
る平底受け皿をもったポリスチレンの微少滴定皿は室温
で２時間、精製されたモノクローナル抗体２−２−９
１ｇＧ（ｐＨ９．０，０．０５Ｍｂｉｃａｒｂｏｎａ
ｔｅｂｕｆｆｅｒ中に１０μｇ／ｍｌ）の溶液でコート
された。このモノクローナル抗体はＶＷＦのカルボキシ
ル基部に結合し、リストセチン又はボトロセチンの存在
下でのＶＷＦの血小板への結合には何ら影響を与えな
い。コーティング液は除けられ、プラスティック表面は
ＴＢＳ（０．０５ＭＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｄ塩類
液）中の１％ＢＳＡ液２００ｍｌで室温で１時間おお
う。それからＢＳＡ液は除けられ、受け皿は０．０５％
ＮＰ−４０を含むＴＢＳ液（ＴＢＳ−ＮＰ４０）で３回
洗われた。液体相でのボトロセチン-ＶＷＦ複合体は精
製したＶＷＦ（５μｇ／ｍｌ），¹²⁵Ｉ−２２鎖ボトロ
セチン（３．２μｇ／ｍｌ）とＢＳＡ（５ｍｇ／ｍｌ）
を１２０μｌ量入れプラスティック製Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ管で室温でインキュベートして作成した．競争的な阻
害の研究の為にラベルしてない１鎖あるいは２鎖のボト
ロセチンがインキューベーション液に加えられた．３０
分後に各混合物の２つの５０μｌ部分標本が，そのカル
ボキシル末端部によってＶＷＦが結合される様に，２−
２−９ｌｇＧコートされた受け皿に加えられた．（Ｎ
ｉｓｈｉｏｅｔａｌ．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒ
ａｎａｌｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ３３，２６１
（１９９０））更に室温で３０分おいた後，ＴＢＳ−Ｎ
Ｐ４０の５００μｌで５回洗われ，そして受け皿に結合
した放射活性はＶＷＦと複合物を作った放射能をもつボ
トロセチンの量を算出するために測定された．非特異的
な結合はインキュベーション混合物から見落とされたＶ
ＷＦによって決定された．特異的結合は結合全体から非
特異性結合を差し引くことにより決定された。

【００３６】¹²⁵Ｉラベルした２鎖ボトロセチンとＶＷ
Ｆとは溶液中で複合体を作っており，それは，抗ＶＷＦ
モノクロナール抗体がＶＷＦが存在する時にのみボトロ
セチンと結合することができるという観察により示され
る．¹²⁵Ｉ−２鎖ボトロセチンとＶＷＦとの結合は１鎖
あるいは２鎖ボトロセチンの両方で，投与量に依存する
様式で，競争的に阻害される。対応するＩＣ₅₀価（名づ
けて，放射能ラベルしたボトロセチンのＶＷＦへの結合
を５０％阻害するのに必要な放射能ラベルしてないボト
ロセチン濃度）は、１鎖のものに比して３２倍もの高い
ＶＷＦへの親和力をもっている。

【００３７】Ｂ．ＶＷＦを血小板グリコプロティンＩｂ
に結合させるボトロセチンＶＷＦを血小板グリコプロテ
ィンＩｂに結合させるボトロセチンはフォルマリン固定
した血小板（１×１０⁸／ｍｌ）と¹²⁵ＩラベルしたＶＷ
Ｆ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）とをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管
中で、ＴＢＳ１１２．５μｌで最終調整して混合するこ
とにより測定された。各ボトロセチンサンプルの１
２．５μｌの部分標本がＴＢＳで１０倍に希釈されてか
らＶＷＦとグリコプロティンＩｂとの結合を生ぜしめる
ために、この混合物の中に加えられた。室温で３０分イ
ンキュベートした後、この混合物は重複した５０μ部分
標本に分けられ、血小板に結合した放射能活性がＳａｒ
ｓｔｅｄｔマイクロ遠心管を使って、２０％ｓｕｃｒ
ｏｓｅ緩衝液を通して１３０００ｇで５分間遠沈されて
ｆｒｅｅの放射能活性とは分離された．（Ｆｕｊｉｍｕ
ｒａｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ７０．９８５（１９８
７）に述べられている方法で）非特異性結合は、ラベル
されていないＶＷＦの５０倍以上の存在下で測定される
放射能活性の量として定義された．特異的結合は全体か
ら非特異性結合の量を差し引いて算出された。

【００３８】ＶＷＦをグリコプロティンＩｂに結合させ
るに必要な１鎖ボトロセチンの最小濃度は１μｇ／ｍｌ
であった。そして最大結合は１７μｇ／ｍｌで得られ
た。最大結合能力の１／２値（ＢＭ₅₀）は５．５μｇ／
ｍｌに相当すると評価された。これに対して、２鎖分子
に対するＢＭ₅₀は０．１６μｇ／ｍｌで１鎖ボトロセチ
ンよりも３４倍も大きい活性を示した。これは、Ａｎｄ
ｒｅｗｓｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ２８．８３１７
（１９８９）が自分たちで分離した２鎖ボトロセチンで
報告したＢＭ₅₀が６．５μｇ／ｍｌという値より４０倍
も大きな値である。

【００３９】Ｃ．血小板凝集を生じたボトロセチンの測
定血小板凝集は、血小板ｒｉｃｈな血しょう０．３ｍｌを
用い３７℃でＮＫＫａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒを用い
て、Ｍａｒｃｏｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌ
ｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ７７，１
２７２（１９８６）に述べられた方法で測定した。

【００４０】精製ボトロセチンの１０μｇ／ｍｌと５０
μｇ／ｍｌの二つの最終濃度が全てのサンプルで血小板
カウントは１×１０⁸／ｍｌに調整された。というのは
軽い血小板減少症をもつＢｅｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅ
ｒ症候群（０．７−１．４×１０⁸／ｍｌ）をもった二
人の患者で到達できる最大値であったから精製１鎖ボト
ロセチンはＧｌａｎｚｍａｎ血小板無力症の患者からの
血小板ｒｉｃｈな血しょう中で凝集を生じた。このよう
に、ボトロセチンの効果はグリコプロティンＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ複合体の機能とは独立しているが、このことは、
作動薬によって引き起こされた活性化から生じた血小板
凝集にとっては本質的なことである。反対にボトロセチ
ンは、Ｂｅｒｍａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群の二人の
患者からの血小板ｒｉｃｈ血しょうには何ら効果をもた
なかった。これらの患者は、グリコプロティンＩｂ−Ｉ
Ｘ複合体機能的発現が欠けているので、ＶＷＦ-グリコ
プロティンＩｂ相互作用に依存する活性は無効なのであ
る。

【００４１】配列ＩＤＮＯ：１：についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１３３アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸配列（Ｃ）より糸の状態：二重（Ｄ）位相幾何：直線（ｉｉ）分子型：タンパク質（ｉｉｉ）配列の記述：配列ＩＤＮＯ：１： ASP CYS PRO SER GLY TRP SER SER TYR GLU GLY ASN CYS TYR LYS 1 5 10 15 PHE PHE GLN GLN LYS Met ASN TRP ALA ASP ALA GLU ARG PHE CYS 20 25 30 SER GLU GLN ALA LYS GLY GLY HIS LEU VAL SER ILE LYS ILE TYR 35 40 45 SER LYS GLU LYS ASP PHE VAL GLY ASP LEU VAL THR LYS ASN ILE 50 55 60 GLN SER SER ASP LEU TYR ALA TRP ILE GLY LEU ARG VAL GLU ASN 65 70 75 LYS GLU LYS GLN CYS SER SER GLU TRP SER ASP GLY SER SER VAL 80 85 90 SER TYR GLU ASN VAL VAL GLU ARG THR VAL LYS LYS CYS PHE ALA 95 100 105 LEU GLU LYS ASP LEU GLY PHE VAL LEU TRP ILE ASN LEU TYR CYS 110 115 120 ALA GLN LYS ASN PRO PHE VAL CYS LYS SER PRO PRO PRO 125 130 配列ＩＤＮＯ：２：についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２５アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸配列（Ｃ）より糸の状態：二重（Ｄ）位相幾何：直線（ｉｉ）分子型：タンパク質（ｉｉｉ）配列の記述：配列ＩＤＮＯ：２： ASP CYS PRO PRO ASP TRP SER SER TYR GLU GLY HIS CYS TYR ARG 1 5 10 15 PHE PHE LYS GLU TRP MET HIS TRP ASP ASP ALA GLU GLU PHE CYS 20 25 30 THR GLU GLN GLN THR GLY ALA HIS LEU VAL SER PHEGLN SER LYS 35 40 45 GLU GLU ALA ASP PHE VAL ARG SER LEU THR SER GLU MET LEU LYS 50 55 60 GLY ASP VAL VAL TRP ILE GLY LEU SER ASP VAL TRP ASN LYS CYS 65 70 75 ARG PHE GLU TRP THR ASP GLY MET GLU PHE ASP TYR ASP ASP TYR 80 85 90 TYR LEU ILE ALA GLU TYR GLU CYS VAL ALA SER LYS PRO THR ASN 95 100 105 ASN LYS TRP TRP ILE ILE PRO CYS THR ARG PHE LYS ASN PHE VAL 110 115 120 CYS GLU PHE GLN ALA 125 配列ＩＤＮＯ：３：についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３５アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸配列（Ｃ）より糸の状態：二重（Ｄ）位相幾何：直線（ｉｉ）分子型：タンパク質（ｉｉｉ）配列の記述：配列ＩＤＮＯ：３： ILE ILE SER PRO PRO VAL CYS GLY ASN GLU LEU LEU GLU VAL GLY 1 5 10 15 GLU GLU CYS ASP CYS GLY THR PRO GLU ASN CYS GLN ASN GLU CYS 20 25 30 CYS ASP ALA ALA THR 35

【００４２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によるとフ
ォン・ウィレブランド因子（ＶＷＦ）の改良された生物
検定は、ボトロセチンの高純度のものを利用する。ボト
ロセチンはヘビ（ブラジル産響尾蛇）からの毒液の天然
の抽出物の精製によって得られる。精製は陰イオン交換
クラマトグラフィーを利用して有効に進められ、最終的
分離は疎水性の相互作用によってなし遂げられた。精製
された物質は、更に１つ鎖のタンパクと２つ鎖のタンパ
クとに分画された。これらの両タンパクがここに「ボト
ロセチン」として一般的に言われるものであるが、２鎖
のタンパクは血小板凝集の促進活性に関しては、１鎖の
タンパクよりも非常に重要度が高い。この強力な活性を
示す理由はまだ知られていない。分画の過程は、逆相ク
ロマトグラフィーと疎水溶剤液の異なる溶解度とを利用
している。一方では、２鎖タンパクはヘビ（ブラジル産
響尾蛇）からの天然の血清を陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって分画することにより得ることができる。
そして得られた物質は不動化されたグリコプロティンに
吸着させることができる。２鎖化合物は、ＳＥＱ１ＤＮ
Ｏ. １とＳＥＱ１ＤＮＯ. ２に示された様なアミノ酸
のアルファーサブユニットとベーターサブユニットを持
っている。

【００４３】精製されたボトロセチンはｖｏｎＷｉｌ
ｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒの生物検定に対する検定
道具の構成要素として有用である。その様な検定方法
は、又は、適切なバッファー試薬とそれらの運用の為の
教示とをも含んでいる。ウィレブランド因子のタイプ２
に特異的な検定道具一式には、付加的に活性成分として
の精製されたリストセチンを含んでいる。検定の過程に
は、精製されたボトロセチンを患者からの血清や血しょ
うサンプルと接触させること、又、サンプル中に存在す
るウィレブランド因子とボトロセチンが反応することに
よって、血清や血しょう中に起る血小板凝集の割合を観
察することも含まれる。凝集の割合は、適当な計器によ
って視覚的又は光学的に記録された。この方法により、
サンプル中のウィレブランド因子のタイプ１とタイプ３
の存在は速やかに決定された。

【００４４】ウィレブランド因子のタイプ２についての
検定は上述の過程に従い、又、付加的に血清や血しょう
の第２の部分（別の部分）とリストセチンとを反応させ
る。それからボトロセチン又は、リストセチン存在下で
の血小板凝集の割合を比較することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】１鎖ボトロセチンを２鎖ボトロセチンがウィレ
ブランド因子に競合して結合することを図示したもので
ある。

【図２】血小板グリコプロティンＩｂに結合したウィレ
ブランド因子と１鎖及び２鎖ボトロセチン活性¹²⁵Ｉを
比較した図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年２月５日

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】ウィレブランド病のための生物検定

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血清や血しょう中に含まれるフォン・ウ
イレブランド因子の存在を確認するためにａ．精製ボトロセチンの供給してｂ．前記のボトロセチンを血清や血しょうと接触させｃ．血清や血しょう中のフォン・ウィレブランド因子の
量を指示するものとして前記ボトロセチンと血清や血し
ょうとの反応を確認したことを特徴とするウィレブラン
ド病のための生物検定。
【請求項２】当該検定に於いては血清や血しょうは人
間のものを含む請求項１記載のウィレブランド病のため
の生物検定。
【請求項３】当該検定で確認されたフォン・ウィレブ
ランド因子はタイプ１かタイプ３のどちらかの型である
請求項２記載のウィレブランド病のための生物検定。
【請求項４】当該検定ボトロセチンと血清や血しょう
の反応はフォン・ウィレブランド因子の存在下で血小板
凝集を起し、その様な血小板凝集の割合が記録された請
求項２記載のウィレブランド病のための生物検定。
【請求項５】当該検定では精製されたボトロセチンは
２鎖分子である請求項１記載のウィレブランド病のため
の生物検定。
【請求項６】フォン・ウィレブランド因子、タイプ２
を血清や血しょう中からみつけ出すためにａ. 精製ボトロセチンの供給してｂ. 上述のボトロセチンを上述の血清や血しょうの第１
の部分（標本）と接触させｃ. 精製リストセチンの供給してｄ. 上述のリストセチンを上述の血清や血しょうの第２
（別の）部分と接触させｅ. 前記ボトロセチン及びリストセチンと血清や血しょ
うとの反応を発見し、又、前記反応を血清や血しょう中
のフォン・ウィレブランド因子、タイプ２の量の指示と
して比較することを特徴とするウィレブランド病のため
の生物検定。
【請求項７】前記検定では血清や血しょうは人間の血
清や血しょうを含む請求項６記載のウィレブランド病の
ための生物検定。
【請求項８】前記検定では血清や血とボトロセチンの
反応はフォン・ウィレブランド因子、タイプ３の存在下
で血小板凝集をひき起し、その様な血小板凝集の割合が
記録された請求項７記載のウィレブランド病のための生
物検定。
【請求項９】前記検定は精製されたボトロセチンは２
鎮分子である請求項７記載のウィレブランド病のための
生物検定。
【請求項１０】フォン・ウィレブランド因子の生物検
定に対する道具一式には精製されたボトロセチン、随意
に精製されたリストセチン、適切なヴァッファリング試
薬及び使用についての教えをも含んでいることを特徴と
するウィレブランド病のための生物検定。