JPH08205708A - トランスジェニック魚類を用いた変異原物質の検出方法 - Google Patents
トランスジェニック魚類を用いた変異原物質の検出方法Info
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- JPH08205708A JPH08205708A JP7013829A JP1382995A JPH08205708A JP H08205708 A JPH08205708 A JP H08205708A JP 7013829 A JP7013829 A JP 7013829A JP 1382995 A JP1382995 A JP 1382995A JP H08205708 A JPH08205708 A JP H08205708A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 変異原物質検出用モニター遺伝子を有するこ
とを特徴とするトランスジェニック魚類及びその作出
法、並びにトランスジェニック魚類を用いた変異原物質
の検出方法。 【効果】 従来法よりも、簡易な手法で、かつ高い精度
で発癌性物質の検出が可能となる。
とを特徴とするトランスジェニック魚類及びその作出
法、並びにトランスジェニック魚類を用いた変異原物質
の検出方法。 【効果】 従来法よりも、簡易な手法で、かつ高い精度
で発癌性物質の検出が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスジェニック魚
類及びその作出方法、並びに該トランスジェニック魚類
を用いた変異原物質の検出方法に関する。
類及びその作出方法、並びに該トランスジェニック魚類
を用いた変異原物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】我々は、環境中の無数の化学物質に取り
囲まれて生活している。医薬品、洗剤、化粧品、食品添
加物、農薬から、本人の意図とは無関係に曝されてしま
う大気汚染物質、水道水に含まれる塩素化合物などな
ど、その数たるや、日常生活に利用されているものだけ
で７万種を越えると言われている。これらの化学物質、
汚染物質のなかでも最も問題のある発癌物質について
は、現在、主にエイムス試験によって検出されている。
発癌性の検出は、実験動物（ラットやマウス）に化学物
質を投与して癌ができるか否かを調べることが望ましい
が、この方法では一検体につき、３年以上の長い年月と
莫大な費用、設備が必要であるため、実際に実験動物を
用いて調べられている化学物質の数は全世界合わせても
年間せいぜい１００検体である。
囲まれて生活している。医薬品、洗剤、化粧品、食品添
加物、農薬から、本人の意図とは無関係に曝されてしま
う大気汚染物質、水道水に含まれる塩素化合物などな
ど、その数たるや、日常生活に利用されているものだけ
で７万種を越えると言われている。これらの化学物質、
汚染物質のなかでも最も問題のある発癌物質について
は、現在、主にエイムス試験によって検出されている。
発癌性の検出は、実験動物（ラットやマウス）に化学物
質を投与して癌ができるか否かを調べることが望ましい
が、この方法では一検体につき、３年以上の長い年月と
莫大な費用、設備が必要であるため、実際に実験動物を
用いて調べられている化学物質の数は全世界合わせても
年間せいぜい１００検体である。
【０００３】エイムス試験は、１９７３年Amesらによっ
て発表された、サルモネラ菌や大腸菌における突然変異
を検出する方法である（B.N.Ames, F.D.Lee, and W.E.D
urston (1973) Proc. Natl. Acad. Sci., 70,782-786)
。エイムス試験陽性と発癌性とによい相関があること
から、いくつかの改良を経て、８０年代には、動物を使
った発癌試験の簡便法として世界的に最も汎用される方
法となった。しかしながら、その後、多くの化学物質の
データが蓄積するにつれて、エイムス試験陽性とヒトの
発癌とは必ずしも相関しないということがわかり、より
優れた検出法の開発が世界的にも急務となっている。
て発表された、サルモネラ菌や大腸菌における突然変異
を検出する方法である（B.N.Ames, F.D.Lee, and W.E.D
urston (1973) Proc. Natl. Acad. Sci., 70,782-786)
。エイムス試験陽性と発癌性とによい相関があること
から、いくつかの改良を経て、８０年代には、動物を使
った発癌試験の簡便法として世界的に最も汎用される方
法となった。しかしながら、その後、多くの化学物質の
データが蓄積するにつれて、エイムス試験陽性とヒトの
発癌とは必ずしも相関しないということがわかり、より
優れた検出法の開発が世界的にも急務となっている。
【０００４】一方、遺伝子工学技術は、この間に飛躍的
な進歩を遂げ、マウスや魚などでは、体中のすべての細
胞に外来遺伝子を組み込んだトランスジェニック個体を
作出することが可能になった。既に、この手法を用い
て、全身の細胞に変異原物質検出用のモニター遺伝子を
組み込んだトランスジェニックマウスが作出されてい
る。表１に主なものを示す。
な進歩を遂げ、マウスや魚などでは、体中のすべての細
胞に外来遺伝子を組み込んだトランスジェニック個体を
作出することが可能になった。既に、この手法を用い
て、全身の細胞に変異原物質検出用のモニター遺伝子を
組み込んだトランスジェニックマウスが作出されてい
る。表１に主なものを示す。
【０００５】 表１ 変異原物質検出用に開発されたトランスジェニックマウス ─────────────────────────────────── 名称 シャトル モニター 変異後の大腸菌プラーク （開発企業、大学） ベクター 遺伝子 （コロニー）の変化 ─────────────────────────────────── Muta Mouse1) ラムタ゛ファーシ゛ lacZ 青 → 白 (Hazelton) BigBlue Mouse2) ラムタ゛ファーシ゛ lacI 白 → 青 (Stratagene) HITEC Mouse 3) pML4(フ゜ラスミト゛) rpsL なし → あり （九大） ─────────────────────────────────── 1)J.A.Gossen, W.J.F. de Leeuw, C.H.T.Tan, E.C.Zwarthoff, F.Berends, P.H.M.Lohman, D.L.Knook and J.Vijg (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.,86 ,7971-7975. 2)S.W.Kohler, G.S.Provost, A.Fieck, P.L.Kretz, W.O.Bullock, J.A.Sorg e, D.L.Putman, and J.M.Short (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.,88,795 8-7962. 3)Y.Gondo, Y.Ikeda, Y.Motegi, A.Takeshita, M.Takahashi, K.Nakao, and M.Katsuki(1994) Environ. Mut. Res. Commun.,16,53-65.
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のような変異原物
質検出用モニター遺伝子を魚に組み込み、トランスジェ
ニック魚類を作出できれば、水中の変異原物質検出に有
用であると考えられる。本発明の目的は、変異原物質検
出用モニター遺伝子を有するトランスジェニック魚類を
提供することにある。
質検出用モニター遺伝子を魚に組み込み、トランスジェ
ニック魚類を作出できれば、水中の変異原物質検出に有
用であると考えられる。本発明の目的は、変異原物質検
出用モニター遺伝子を有するトランスジェニック魚類を
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ｒｐｓＬ遺伝子と
カナマイシン耐性遺伝子を持つシャトルベクターｐＭＬ
４を、熱帯魚の一種であるゼブラフィッシュに導入する
ことにより変異原物質検出用モニター遺伝子を有するト
ランスジェニック魚類を作出することに成功し、本発明
を完成した。即ち、本発明は、変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子を有することを特徴とするトランスジェニック
魚類である。
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ｒｐｓＬ遺伝子と
カナマイシン耐性遺伝子を持つシャトルベクターｐＭＬ
４を、熱帯魚の一種であるゼブラフィッシュに導入する
ことにより変異原物質検出用モニター遺伝子を有するト
ランスジェニック魚類を作出することに成功し、本発明
を完成した。即ち、本発明は、変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子を有することを特徴とするトランスジェニック
魚類である。
【０００８】また、本発明は、１）変異原物質検出用モ
ニタ遺伝子を含むシャトルベクターを魚類の受精卵に導
入してキメラ魚類を作出し、２）キメラ魚類の中から生
殖細胞に変異原物質検出用モニター遺伝子が導入されて
いるものを選抜し、３）選抜したキメラ魚類と野生型の
魚類を交配し、４）得られるＦ１魚類の中から変異原物
質検出用モニター遺伝子を含む魚類を選抜することを特
徴とする変異原物質検出用モニター遺伝子を有するトラ
ンスジェニック魚類の作出方法である。さらに、本発明
は、変異原物質検出用モニター遺伝子を有するトランス
ジェニック魚類を被検液中で飼育した後、トランスジェ
ニック魚類から変異原物質検出用モニター遺伝子を含む
シャトルベクターを取り出して該遺伝子の変異の有無を
調べることを特徴とする変異原物質の検出方法である。
ニタ遺伝子を含むシャトルベクターを魚類の受精卵に導
入してキメラ魚類を作出し、２）キメラ魚類の中から生
殖細胞に変異原物質検出用モニター遺伝子が導入されて
いるものを選抜し、３）選抜したキメラ魚類と野生型の
魚類を交配し、４）得られるＦ１魚類の中から変異原物
質検出用モニター遺伝子を含む魚類を選抜することを特
徴とする変異原物質検出用モニター遺伝子を有するトラ
ンスジェニック魚類の作出方法である。さらに、本発明
は、変異原物質検出用モニター遺伝子を有するトランス
ジェニック魚類を被検液中で飼育した後、トランスジェ
ニック魚類から変異原物質検出用モニター遺伝子を含む
シャトルベクターを取り出して該遺伝子の変異の有無を
調べることを特徴とする変異原物質の検出方法である。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明のトランスジェニック魚類の作出方法 本発明のトランスジェニック魚類は以下のようにして作
出することができる。最初に、変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子を魚類の受精卵に導入する。
出することができる。最初に、変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子を魚類の受精卵に導入する。
【００１０】本発明において、変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子とは、変異原物質の存在により外観上明確に認
識できる表現型の変化、例えば、増殖能の獲得・喪失、
コロニーの色彩の変化などを生じるような遺伝子をい
い、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｒｐｓＬなどがこれに該当す
る。本発明では、これらの変異原物質検出用モニター遺
伝子の中でもｒｐｓＬを用いるのが好ましい。なお、ｒ
ｐｓＬを有するプラスミドベクターｐＨＳＧ６６４は、
国立予防衛生研究所遺伝子バンクにＶＥ０２５として寄
託されている。魚類としては、外来遺伝子の導入が容易
で、かつ飼育し易いものであればどのようなものでもよ
く、例えば、セブラフィッシュ（Brachydanio rerio）
などを用いることができる。ベクターとしては、変異の
有無を調べる際に大腸菌にも導入することから、シャト
ルベクターを用いるのが好ましい。また、モニター遺伝
子の変異の有無を調べる場合を考慮し、該ベクター中に
は、モニター遺伝子のほかカナマイシン耐性遺伝子など
のマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。好適
なベクターとしては、ラムダファージ、プラスミドｐＭ
Ｌ４などを例示することができる。プラスミドｐＭＬ４
は、プラスミドｐＨＳＧ６６４のアンピシリン耐性遺伝
子（ＡｍｐR ）をカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR ）に
置き換えたベクターであり、その制限酵素地図は図１に
示す通りである。モニター遺伝子を含むシャトルベクタ
ーを導入する受精卵は、外来遺伝子の導入が可能であれ
ばどのような時期でもよいが、１細胞期の受精卵に導入
するのが好ましい。遺伝子の導入法としては、マイクロ
インジェクション法を用いるのが好ましい。マイクロイ
ンジェクション法による場合、注入するベクターＤＮＡ
の量が多いと、注入後の受精卵の生存率が低下し、ま
た、注入量が少ないとトランスジェニック魚類の作出頻
度が低下するため、注入量は、４〜５０ｐｇが適当であ
る。
ー遺伝子とは、変異原物質の存在により外観上明確に認
識できる表現型の変化、例えば、増殖能の獲得・喪失、
コロニーの色彩の変化などを生じるような遺伝子をい
い、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｒｐｓＬなどがこれに該当す
る。本発明では、これらの変異原物質検出用モニター遺
伝子の中でもｒｐｓＬを用いるのが好ましい。なお、ｒ
ｐｓＬを有するプラスミドベクターｐＨＳＧ６６４は、
国立予防衛生研究所遺伝子バンクにＶＥ０２５として寄
託されている。魚類としては、外来遺伝子の導入が容易
で、かつ飼育し易いものであればどのようなものでもよ
く、例えば、セブラフィッシュ（Brachydanio rerio）
などを用いることができる。ベクターとしては、変異の
有無を調べる際に大腸菌にも導入することから、シャト
ルベクターを用いるのが好ましい。また、モニター遺伝
子の変異の有無を調べる場合を考慮し、該ベクター中に
は、モニター遺伝子のほかカナマイシン耐性遺伝子など
のマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。好適
なベクターとしては、ラムダファージ、プラスミドｐＭ
Ｌ４などを例示することができる。プラスミドｐＭＬ４
は、プラスミドｐＨＳＧ６６４のアンピシリン耐性遺伝
子（ＡｍｐR ）をカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR ）に
置き換えたベクターであり、その制限酵素地図は図１に
示す通りである。モニター遺伝子を含むシャトルベクタ
ーを導入する受精卵は、外来遺伝子の導入が可能であれ
ばどのような時期でもよいが、１細胞期の受精卵に導入
するのが好ましい。遺伝子の導入法としては、マイクロ
インジェクション法を用いるのが好ましい。マイクロイ
ンジェクション法による場合、注入するベクターＤＮＡ
の量が多いと、注入後の受精卵の生存率が低下し、ま
た、注入量が少ないとトランスジェニック魚類の作出頻
度が低下するため、注入量は、４〜５０ｐｇが適当であ
る。
【００１１】上述のような遺伝子導入操作を行った受精
卵を成魚になるまで育てる。飼育方法は、野生型の魚類
と同様な方法で飼育すればよく、特別な方法を用いる必
要はない。受精卵にシャトルベクターが導入された個体
は、成長するとキメラ、即ち、シャトルベクターが導入
された細胞と、導入されていない細胞が混ざった状態に
なっている（図２中のＡ）。このようなキメラ魚類の中
からトランスジェニック魚類を産むもの、即ち、生殖細
胞にシャトルベクターが導入されているもの（図２中の
Ｂ）を選抜する。生殖細胞にモニター遺伝子が導入され
ているかどうかは、Ｆ０（図２中のＡ）と野生型の魚を
交配して得られたＦ１の胚からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ
法によりモニター遺伝子が含まれているＤＮＡ断片を特
異的に増幅し、サザンブロッティング法により判定する
ことができる。
卵を成魚になるまで育てる。飼育方法は、野生型の魚類
と同様な方法で飼育すればよく、特別な方法を用いる必
要はない。受精卵にシャトルベクターが導入された個体
は、成長するとキメラ、即ち、シャトルベクターが導入
された細胞と、導入されていない細胞が混ざった状態に
なっている（図２中のＡ）。このようなキメラ魚類の中
からトランスジェニック魚類を産むもの、即ち、生殖細
胞にシャトルベクターが導入されているもの（図２中の
Ｂ）を選抜する。生殖細胞にモニター遺伝子が導入され
ているかどうかは、Ｆ０（図２中のＡ）と野生型の魚を
交配して得られたＦ１の胚からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ
法によりモニター遺伝子が含まれているＤＮＡ断片を特
異的に増幅し、サザンブロッティング法により判定する
ことができる。
【００１２】次に、このように選抜されたキメラ魚類
と、野生型の魚類を交配する。この交配により得られる
Ｆ１魚類（図２中のＣ）の中からトランジェニック個体
のみ（図２中のＤ）を選抜する。トランスジェニック個
体かどうかは、Ｆ１魚類のヒレなどの組織からＤＮＡを
抽出し、上記と同様にＰＣＲ法とサザンブロッティング
法により判定することができる。
と、野生型の魚類を交配する。この交配により得られる
Ｆ１魚類（図２中のＣ）の中からトランジェニック個体
のみ（図２中のＤ）を選抜する。トランスジェニック個
体かどうかは、Ｆ１魚類のヒレなどの組織からＤＮＡを
抽出し、上記と同様にＰＣＲ法とサザンブロッティング
法により判定することができる。
【００１３】（２）本発明のトランスジェニック魚類の
特徴 本発明のトランスジェニック魚の特徴は、変異原物質検
出用モニター遺伝子が含まれていることである。該遺伝
子が含まれているか否かは、魚体の一部よりＤＮＡを抽
出し、ＰＣＲ法により導入遺伝子を特異的に増幅し、サ
ザンブロッティング法により判定することができる。
特徴 本発明のトランスジェニック魚の特徴は、変異原物質検
出用モニター遺伝子が含まれていることである。該遺伝
子が含まれているか否かは、魚体の一部よりＤＮＡを抽
出し、ＰＣＲ法により導入遺伝子を特異的に増幅し、サ
ザンブロッティング法により判定することができる。
【００１４】（３）本発明の変異原物質の検出方法 本発明の検出方法を図３を用いて説明する。まず、トラ
ンスジェニック魚類を被検液中で一定期間飼育する（図
３中の(1) ）。遺伝子に変異が発生する期間は、変異原
物質の種類、魚の種類や臓器により異なるため、ここで
の飼育期間は、変異原物質の種類や用いるトランスジェ
ニック魚類に応じて決めればよい。被検液中で飼育した
魚類は、変異を定着させるため、変異原物質を含まない
水に移し、飼育する（図３中の(2) ）。
ンスジェニック魚類を被検液中で一定期間飼育する（図
３中の(1) ）。遺伝子に変異が発生する期間は、変異原
物質の種類、魚の種類や臓器により異なるため、ここで
の飼育期間は、変異原物質の種類や用いるトランスジェ
ニック魚類に応じて決めればよい。被検液中で飼育した
魚類は、変異を定着させるため、変異原物質を含まない
水に移し、飼育する（図３中の(2) ）。
【００１５】変異が定着した後、魚体の任意の部位より
組織を採取し（図３中の(3) ）、ＤＮＡを抽出する（図
３中の(4) ）。抽出したＤＮＡをシャトルベクターを１
ケ所切断する制限酵素（例えば、シャトルベクターｐＭ
Ｌ４であればＢａｎII）で切断し（図３中の(5) ）、ラ
イゲースにより環状化した後（図３中の(6) ）、宿主と
なる大腸菌に導入し、該大腸菌を形質転換する（図３中
の(7) ）。大腸菌に導入したモニター遺伝子が変異して
いるかどうかは、例えば権藤らの方法（Y.Gondo, Y.Ike
da, Y.Motegi, A.Takeshita, M.Takahashi, K.Nakao, a
nd M.Katsuki(1994) Environ. Mut. Res. Commun.,16,5
3-65. ）により、判定することができる。以下、シャト
ルベクターｐＭＬ４中に含まれるｒｐｓＬ遺伝子の変異
の有無を判定する方法について説明する。モニター遺伝
子導入魚類から回収したプラスミドｐＭＬ４を、ｒｐｓ
Ｌ遺伝子に欠陥があるためストレプトマイシン（Ｓｍ）
に対し耐性となっている大腸菌に導入し、その大腸菌を
形質転換する。この形質転換大腸菌群を２つに分け、そ
れぞれをカナマイシン（Ｋｍ）を含む寒天平板とＫｍと
Ｓｍを含む寒天平板の２種類の平板にまく。プラスミド
ｐＭＬ４はＫｍ耐性遺伝子をもつのでｐＭＬ４の入った
大腸菌は寒天平板上で生えるが、形質転換されなかった
大腸菌は生存できない。また、ｐＭＬ４は野生型のｒｐ
ｓＬ遺伝子を持ち、また、Ｓｍ感受性は耐性に対し優性
なので、ｐＭＬ４がＳｍ耐性の大腸菌に入ると、その大
腸菌をＳｍ感受性に変える。しかし、ｒｐｓＬ遺伝子に
突然変異が起こると、これが入った大腸菌はＳｍ感受性
とはならず、Ｓｍ耐性のままである。従って、次式によ
り突然変異の頻度を計算することができる。
組織を採取し（図３中の(3) ）、ＤＮＡを抽出する（図
３中の(4) ）。抽出したＤＮＡをシャトルベクターを１
ケ所切断する制限酵素（例えば、シャトルベクターｐＭ
Ｌ４であればＢａｎII）で切断し（図３中の(5) ）、ラ
イゲースにより環状化した後（図３中の(6) ）、宿主と
なる大腸菌に導入し、該大腸菌を形質転換する（図３中
の(7) ）。大腸菌に導入したモニター遺伝子が変異して
いるかどうかは、例えば権藤らの方法（Y.Gondo, Y.Ike
da, Y.Motegi, A.Takeshita, M.Takahashi, K.Nakao, a
nd M.Katsuki(1994) Environ. Mut. Res. Commun.,16,5
3-65. ）により、判定することができる。以下、シャト
ルベクターｐＭＬ４中に含まれるｒｐｓＬ遺伝子の変異
の有無を判定する方法について説明する。モニター遺伝
子導入魚類から回収したプラスミドｐＭＬ４を、ｒｐｓ
Ｌ遺伝子に欠陥があるためストレプトマイシン（Ｓｍ）
に対し耐性となっている大腸菌に導入し、その大腸菌を
形質転換する。この形質転換大腸菌群を２つに分け、そ
れぞれをカナマイシン（Ｋｍ）を含む寒天平板とＫｍと
Ｓｍを含む寒天平板の２種類の平板にまく。プラスミド
ｐＭＬ４はＫｍ耐性遺伝子をもつのでｐＭＬ４の入った
大腸菌は寒天平板上で生えるが、形質転換されなかった
大腸菌は生存できない。また、ｐＭＬ４は野生型のｒｐ
ｓＬ遺伝子を持ち、また、Ｓｍ感受性は耐性に対し優性
なので、ｐＭＬ４がＳｍ耐性の大腸菌に入ると、その大
腸菌をＳｍ感受性に変える。しかし、ｒｐｓＬ遺伝子に
突然変異が起こると、これが入った大腸菌はＳｍ感受性
とはならず、Ｓｍ耐性のままである。従って、次式によ
り突然変異の頻度を計算することができる。
【００１６】
【００１７】
〔実施例１〕 トランスジェニック魚類の作出 ゼブラフィッシュ（名古屋大学理学部分子生物学科第５
講座より入手）の１細胞期の受精卵１５００個に、顕微
鏡下にて、三次元マニピュレーター（Ｍ−１５２、株式
会社ナリシゲ製）を用いてシャトルベクターｐＭＬ４
（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科
真木寿治博士より入手）を４〜５０ｐｇを注入した。翌
日まで生き残ったのは、約５７０匹であった。孵化後、
約３日目からはゾウリムシを、約１０日目からはブライ
ンシュリンプを餌として毎日与えて育てた。約６ヶ月飼
育後、２００〜３００匹が成魚（Ｆ０）に育った。
講座より入手）の１細胞期の受精卵１５００個に、顕微
鏡下にて、三次元マニピュレーター（Ｍ−１５２、株式
会社ナリシゲ製）を用いてシャトルベクターｐＭＬ４
（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科
真木寿治博士より入手）を４〜５０ｐｇを注入した。翌
日まで生き残ったのは、約５７０匹であった。孵化後、
約３日目からはゾウリムシを、約１０日目からはブライ
ンシュリンプを餌として毎日与えて育てた。約６ヶ月飼
育後、２００〜３００匹が成魚（Ｆ０）に育った。
【００１８】上記成魚の中から８７匹を任意に選択し、
野生型のゼブラフィッシュと交配し、それらが産んだ受
精卵中にシャトルベクターが含まれているかどうかを以
下のような方法により調べた。まず、受精卵を約２４時
間胚まで飼育後、３〜５容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，
０．２ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加え、室
温で一晩振とうする。等量のフェノール／クロロホルム
（１：１）混合液で一回抽出する。この水相に１／２５
容量の５Ｎ ＮａＣｌと２容量のエタノールを加えて、
ＤＮＡを沈殿として得る。この方法で、１００個の胚か
ら、１００〜２００μｇのＤＮＡが得られた。
野生型のゼブラフィッシュと交配し、それらが産んだ受
精卵中にシャトルベクターが含まれているかどうかを以
下のような方法により調べた。まず、受精卵を約２４時
間胚まで飼育後、３〜５容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，
０．２ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加え、室
温で一晩振とうする。等量のフェノール／クロロホルム
（１：１）混合液で一回抽出する。この水相に１／２５
容量の５Ｎ ＮａＣｌと２容量のエタノールを加えて、
ＤＮＡを沈殿として得る。この方法で、１００個の胚か
ら、１００〜２００μｇのＤＮＡが得られた。
【００１９】シャトルベクターの存在は、このシャトル
ベクターのカンマイシン耐性遺伝子の一部（約５８０塩
基）をＰＣＲで増幅し、サザンハイブリダイゼーション
により、確認した。具体的には、ＰＣＲで増殖したサン
プルを、アガロースゲルにて電気泳動後ナイロンメンブ
レンに移し、ｐＭＬ４プラスミドをアイソトープ標識し
たプローブでハイブリダイゼーションすることにより検
出した。
ベクターのカンマイシン耐性遺伝子の一部（約５８０塩
基）をＰＣＲで増幅し、サザンハイブリダイゼーション
により、確認した。具体的には、ＰＣＲで増殖したサン
プルを、アガロースゲルにて電気泳動後ナイロンメンブ
レンに移し、ｐＭＬ４プラスミドをアイソトープ標識し
たプローブでハイブリダイゼーションすることにより検
出した。
【００２０】この結果、８７系統より得た受精卵のうち
１４系統より得た受精卵にシャトルベクターが含まれて
いるものがあった。この１４系統のＦ０のうち、３系統
のＦ０（それぞれ、ＣＦＩ３系統、ＣＦＭ８系統、ＣＦ
Ｍ５系統と命名した。）については、Ｆ１の選別を行っ
た。その結果、ＣＦＩ３系統については６５匹中１５
匹、ＣＦＭ８系統については１５匹中３匹、ＣＦＭ５系
統については１０匹中１匹、シャトルベクターが導入さ
れていた。
１４系統より得た受精卵にシャトルベクターが含まれて
いるものがあった。この１４系統のＦ０のうち、３系統
のＦ０（それぞれ、ＣＦＩ３系統、ＣＦＭ８系統、ＣＦ
Ｍ５系統と命名した。）については、Ｆ１の選別を行っ
た。その結果、ＣＦＩ３系統については６５匹中１５
匹、ＣＦＭ８系統については１５匹中３匹、ＣＦＭ５系
統については１０匹中１匹、シャトルベクターが導入さ
れていた。
【００２１】〔実施例２〕 トランスジェニック魚類か
らのシャトルベクターの回収 シャトルベクターが導入されていることが確認されたＣ
ＦＩ３系統のＦ１（ＣＦＩ３ｗと命名）について、その
染色体中のシャトルベクターが回収できる状態で組み込
まれているがどうかを調べるために、ＣＦＩ３ｗと野生
型のゼブラフィッシュを交配して得た胚よりＤＮＡを抽
出し、これをシャトルベクターを１ケ所切断する制限酵
素（ＥｃｏＲＩあるいはＢａｎII）で切断し、サザンハ
イブリダイゼイションを行った。
らのシャトルベクターの回収 シャトルベクターが導入されていることが確認されたＣ
ＦＩ３系統のＦ１（ＣＦＩ３ｗと命名）について、その
染色体中のシャトルベクターが回収できる状態で組み込
まれているがどうかを調べるために、ＣＦＩ３ｗと野生
型のゼブラフィッシュを交配して得た胚よりＤＮＡを抽
出し、これをシャトルベクターを１ケ所切断する制限酵
素（ＥｃｏＲＩあるいはＢａｎII）で切断し、サザンハ
イブリダイゼイションを行った。
【００２２】切断断片の中には、注入したシャトルベク
ターと同じ大きさのＤＮＡ断片が検出され、染色体中の
シャトルベクターが回収できる状態で組み込まれている
ことを確認できた。次に、このシャトルベクターと確認
されたＤＮＡ断片を環状化して、カナマイシンに対し耐
性を持たずストレプトマイシンに耐性の大腸菌ＲＲ１に
導入すると、大腸菌ＲＲ１はカナマイシンを含む培地で
生存可能となり、また、このうち約９０％はストレプト
マイシン感受性となった。この結果より、回収されたｐ
ＭＬ４中のｒｐｓＬ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝
子は活性が保たれていることが確認できた。
ターと同じ大きさのＤＮＡ断片が検出され、染色体中の
シャトルベクターが回収できる状態で組み込まれている
ことを確認できた。次に、このシャトルベクターと確認
されたＤＮＡ断片を環状化して、カナマイシンに対し耐
性を持たずストレプトマイシンに耐性の大腸菌ＲＲ１に
導入すると、大腸菌ＲＲ１はカナマイシンを含む培地で
生存可能となり、また、このうち約９０％はストレプト
マイシン感受性となった。この結果より、回収されたｐ
ＭＬ４中のｒｐｓＬ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝
子は活性が保たれていることが確認できた。
【００２３】
【発明の効果】本発明の変異原物質検出法は、エイムス
試験より数多くの優れた特徴を持つ画期的な検出法であ
る。最大の理由は、エイムス試験がサルモネラ菌や大腸
菌といった原核生物の遺伝子に起こる変異を調べている
点で、本発明に用いたゼブラフィッシュは脊椎動物であ
り、サルモネラ菌、大腸菌に比べればはるかにヒトに近
いからである。
試験より数多くの優れた特徴を持つ画期的な検出法であ
る。最大の理由は、エイムス試験がサルモネラ菌や大腸
菌といった原核生物の遺伝子に起こる変異を調べている
点で、本発明に用いたゼブラフィッシュは脊椎動物であ
り、サルモネラ菌、大腸菌に比べればはるかにヒトに近
いからである。
【００２４】また、魚体の異なる臓器からベクターを回
収すれば、魚体のどの臓器に変異を起こしやすいが判定
することができ、更に、被検液中で飼育した魚の次世代
魚について変異の有無を調べることにより、変異原物質
の世代を超えた影響についても判定することができる。
収すれば、魚体のどの臓器に変異を起こしやすいが判定
することができ、更に、被検液中で飼育した魚の次世代
魚について変異の有無を調べることにより、変異原物質
の世代を超えた影響についても判定することができる。
【図１】 プラスミドベクターｐＭＬ４の制限酵素地図
を示す図である。
を示す図である。
【図２】 トランスジェニック魚類作出の概要を示す図
である。
である。
【図３】 変異原物質検出の概要を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 変異原物質検出用モニター遺伝子を有す
ることを特徴とするトランスジェニック魚類。 - 【請求項２】 １）変異原物質検出用モニタ遺伝子を含
むシャトルベクターを魚類の受精卵に導入してキメラ魚
類を作出し、２）キメラ魚類の中から生殖細胞に変異原
物質検出用モニター遺伝子が導入されているものを選抜
し、３）選抜したキメラ魚類と野生型の魚類を交配し、
４）得られるＦ１魚類の中から変異原物質検出用モニタ
ー遺伝子を含む魚類を選抜することを特徴とする変異原
物質検出用モニター遺伝子を有するトランスジェニック
魚類の作出方法。 - 【請求項３】 変異原物質検出用モニター遺伝子を有す
るトランスジェニック魚類を被検液中で飼育した後、ト
ランスジェニック魚類から変異原物質検出用モニター遺
伝子を含むシャトルベクターを取り出して該遺伝子の変
異の有無を調べることを特徴とする変異原物質の検出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7013829A JPH08205708A (ja) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | トランスジェニック魚類を用いた変異原物質の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7013829A JPH08205708A (ja) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | トランスジェニック魚類を用いた変異原物質の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205708A true JPH08205708A (ja) | 1996-08-13 |
Family
ID=11844169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7013829A Pending JPH08205708A (ja) | 1995-01-31 | 1995-01-31 | トランスジェニック魚類を用いた変異原物質の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08205708A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024246A3 (en) * | 1998-10-26 | 2000-07-13 | Univ Georgia Res Found | Transgenic fish carrying plasmid for mutation detection and methods |
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
| US6803232B1 (en) | 1998-06-29 | 2004-10-12 | The Garvan Institute Of Medical Research | NPY-Y7 receptor gene |
| CN107090500A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-25 | 天津科技大学 | 一种利用rpsL基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法 |
-
1995
- 1995-01-31 JP JP7013829A patent/JPH08205708A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6307121B1 (en) | 1998-05-31 | 2001-10-23 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Bacteriophage-based transgenic fish for mutation detection |
| US6803232B1 (en) | 1998-06-29 | 2004-10-12 | The Garvan Institute Of Medical Research | NPY-Y7 receptor gene |
| WO2000024246A3 (en) * | 1998-10-26 | 2000-07-13 | Univ Georgia Res Found | Transgenic fish carrying plasmid for mutation detection and methods |
| US6472583B1 (en) | 1998-10-26 | 2002-10-29 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Plasmid-based mutation detection system in transgenic fish |
| CN107090500A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-25 | 天津科技大学 | 一种利用rpsL基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法 |
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