JPH08191693A - ＩＬ−１βによる軟骨細胞の刺激によって調節された遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＩＬ−１βでの軟骨細胞の刺激による調節さ
れた遺伝子。 【解決手段】 本発明は、ＩＬ−１βが介在した結合組
織の疾患の診断、予防または治療における、オステオポ
ンチン、カルネキシンおよびＴＳＧ−６遺伝子生成物の
新規な使用、およびＩＬ−１βで軟骨細胞を刺激するこ
とによって誘導または抑制された新規な遺伝子、および
ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患の診断、予防また
は治療におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患の診
断、予防または治療における、オステオポンチンおよび
カルネキシンの新規な使用、およびＩＬ−１βで軟骨細
胞を刺激することによって誘導または抑制される新規な
遺伝子およびＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患の診
断、予防または治療におけるそれらの使用に関する。

【０００２】背景技術 インターロイキン−１（ＩＬ−１）の広汎な生物学的作
用には、関節の軟骨細胞などの多くの種類の結合組織細
胞の代謝に対するその作用がある。ＩＬ−１は、軟骨細
胞によるプロテオグリカン（ＰＧ）の合成を阻害し、プ
ロスタグランジンＥ２およびマトリックス高分子を分解
することができる金属プロテイナーゼの生産を刺激す
る。実験結果、および炎症の起きた関節におけるＩＬ−
１、ＰＧフラグメントおよびタンパク質分解酵素の知見
から、ＩＬ−１は変形性関節症または慢性関節リウマチ
における軟骨の分解において役割を果たしていることが
推定された（Benton HP & Tyler JA., 1988, Biochem.
Biophys. Res. Comm., 154,421-428; Aydelotte MB
ら、Conn. Tiss. Res., 28, 143-159; Wood DDら、Arth
rithis Rheum., 26, 975-983; Lohmander LSら、Trans
Orthrop. Res., 17,273）。マトリックス金属プロテイ
ナーゼは酵素レベルでの薬剤相互作用の有力な候補であ
るが、軟骨の分解を生じる初期のプロセスを阻害する適
切な分子標的は未だ知られていない。

【０００３】

【発明の概要】従って、本発明の一つの目的は、変形性
関節症の軟骨由来のヒト関節軟骨細胞のＲＮＡレベルで
のＩＬ−１βによって誘発される軟骨の分解の薬剤によ
る改良のための有力な標的を同定することである。罹患
した軟骨において特異的に発現された(differentially
expressed)遺伝子を検討する最初の試みとして、ＩＬ−
１βで刺激したおよび刺激していないヒト軟骨細胞由来
の総ＲＮＡについて、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反
応によるｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ(d
ifferential display)（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）を施した。
この方法は、２種類の細胞集団で特異的に発現される遺
伝子を同定して単離するのに用いることができる（Lian
g P & Pardee AB, 1992, Science, 257, 967-971; Lian
g P ら、AB 1993, Nucl. Acids Res., 21, 3269-3275;
Bauer D ら、1993, Nucl. Acids Res., 21, 4272-428
0)。重要な要素は、一組のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いることであり、一つはｍＲＮＡのポリアデニル
化テイルにハイブリダイゼーションするものであり、他
方は最初のプライマーとは異なる位置でアニーリングす
る任意のデカマー(decamer) である。これらのプライマ
ー対によって画定されるｍＲＮＡの下位集団を逆転写の
後に増幅して、ＤＮＡ配列決定ゲル上で分析する。検討
を行う細胞集団から抽出したそれぞれのＲＮＡ集団に特
徴的なバンドパターンが形成される。例えば、１００種
類のプライマーを組み合わせると、それぞれの集団につ
いて総数で約１０，０００のＰＣＲ生成物が生成され、
この数は発現した細胞遺伝子の総数の約半数に当たる。
２種類の細胞集団から得られたバンドパターンを比較す
ると、特異的に発現した遺伝子に相当する特異的に表わ
された(differentially displayed)バンドが明らかにな
る。従って、特異的に表わされたバンドをゲルから抽出
し、再増幅し、サブクローニングし、そして配列決定す
ることができる。

【０００４】その感度が極めて高いため、人工的(artif
actual) バンドの出現は本発明で用いられるＤＤＲＴ−
ＰＣＲ法に固有の問題である。もう一つの問題点は、複
雑な遺伝子発現パターンの評価でもある。本発明の更に
もう一つの問題点は、ごく少量のＲＮＡしか利用できな
いことである。

【０００５】それ故、配列 TAU1/1(1) ACATCACCTC ACACATGGAA AGCGAGGAGT TGAATGGTGC ATACAAGGCC ATCCCCGTTT 60 CCCAGGACCT GAACCCGCCT TCTGATTGGG ACAGCCGTGG GAAGGACAGT TATGAAACGA 120 GTCAGCTGGA TGACCAGAGT GCTGAAACCC ACAGCCACAA GCAGTCCAGA TTATATAAGC 180 GGAAA 185 および TAU1/1(2) CTAAATGCAA AGTGAGAAAT TGTATTTTTT CTCCTTTTAA TTGACCTCAG AAGATGCACT 60 ATCTAATTCA TGAGAAATAC GAAATTTCAG GTGTTTATCT TCTTCCTTAC TTTTGGGG 118 を有するＤＮＡ ＴＡＵ１／１、および配列 AACCAGTATT TCAAAACTAT TATCTGGATT CAAGATTAGT GTGTAAAGAT TGTTTTCTTA 60 TCAGTAAAAT AGGTCTTCAG ATCTGCATCT GGCCTCTTAG CATGTTTTTC TTCATAGATA 120 CCCGTTTTGG GGTTTTTGCG TCGGAAGATG AATGGCATTT ATAGTCCTCT CCACATTTAT 180 CTG 183 を有するＤＮＡ ＴＴＵ２／２は、それぞれヒトオステ
オポンチンｃＤＮＡに１００％、およびヒトカルネキシ
ンに９７．２％一致することは特に意外なことであっ
た。このことは、本発明の実験的手法が効率的に作用
し、すなわち１００種類の異なるプライマーの組み合わ
せ（２５オリゴデカマープライマー、４Ｔ₁₂ＭＮ−プラ
イマー）を用いると、それぞれの集団について総数が約
１０，０００個のＰＣＲ生成物を生じ、これは発現した
細胞遺伝子の５３％である。１０，０００個のうち１２
３個のＰＣＲバンドは、特異的に発現したバンドとして
現れた。元の１２３個のＰＣＲバンドのうち５３個は、
２名の患者からのＰＣＲバンドパターンを比較すること
によって再現性よく表わされ、その内の６８％はＩＬ−
１βで刺激した軟骨細胞から生じた。

【０００６】

【発明の具体的説明】オステオポンチンおよびカルネキシン ３２ｋｄの分泌された酸性の高いリンタンパク質である
オステオポンチン(Denhardt およびGuo (1993) FASEB
J. 7, 1475-1482) は、ＩＬ−１βで刺激されたヒト軟
骨細胞では著しくダウンレギュレーションされることも
判った。これは、オステオポンチンがＩＬ−１βが関係
した結合組織の疾患、特に変形性関節症に関与している
ことを意味する。

【０００７】変形性関節症は、コラーゲンおよびプロテ
オグリカンの連続的分解とそれに続くマトリックスフラ
グメントの滑液への放出とを伴う徐々に進行するマトリ
ックスの変性を特徴とする。例えば、オステオポンチン
の喪失による正常な軟骨細胞マトリックス相互作用の障
害によって、インテグリンアルファ_ｖベーター_１による
シグナリング(signalling)の変化を引き起こし、これに
より細胞応答が変化して、早い段階でのマトリックスの
分解を引き起こすことがある。従って、本発明の一つの
態様は、ＩＬ−１βが関係した結合組織の疾患、特に変
形性関節症の診断、予防または治療における、オステオ
ポンチン自身またはその部分、それに対する抗体、また
はオステオポンチンまたはその部分をコードするＤＮＡ
またはＲＮＡのような核酸またはその部分の使用であ
る。

【０００８】本願によれば、「部分」という用語は、タ
ンパク質の場合には少なくとも８個、好ましくは１２
個、特に１５個のアミノ酸、またはハイブリダイゼーシ
ョンプローブとしてのＤＮＡまたはＲＮＡの場合には、
６〜１００個、好ましくは１０〜４０個、特に１２〜２
５個の核酸を意味する。上記疾患を診断する方法は後述
する。また、タンパク質濃度は、免疫化学、ＦＡＣＳ分
析またはＥＬＩＳＡに基づく分析系におけるウェスター
ンブロットで、オステオポンチン特異抗体を用いて定量
することができる。

【０００９】本発明は、このような使用のための診断助
剤または医薬にも関する。オステオポンチンは、例えば
Ausubel ら、 1994 [Current protocols in molecular
biology, Chapter 16, John Wiley & Sons, Inc]に詳述
されているようにVacciniaを用いる原核生物、哺乳類細
胞中の昆虫細胞、または哺乳類細胞での発現によって組
換え的に生成させることができる。オステオポンチンの
ｃＤＮＡは、例えばYoung ら (1990), Genomics, 7, 49
1-502 に開示されている。

【００１０】オステオポンチンに対する抗体は、通常は
Neil GA & Urnovitz HB (Trends inBiotechnology, 6,
209-213, 1988) またはKoehler G & Milstein C (Natur
e,256, 52-53, 1975) などの方法により産生させること
ができる。

【００１１】また、８８ｋｄの一体性膜タンパク質であ
るカルネキシン(Bergeron et al.(1994) TIBS 19, 124-
128)も、ＩＬ−１βで刺激されていない軟骨細胞と比較
してＩＬ−１βで刺激されたヒト軟骨細胞では顕著にダ
ウンレギュレーションされている。このことは、カルネ
キシンがＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患、特に変
形性関節症に関与していることを意味している。また、
カルネキシンはプロテオグリカンのような不完全に折り
畳まれたタンパク質と関連する新規な型の分子状チャペ
ロン(chaperone) であるため、カルネキシン合成のダウ
ンレギュレーションにより、少量の精確かつ完全に折り
畳まれたプロテオグリカンを生じる。プロテオグリカン
は、関節組織の一体性を維持する上で最も重要な高度に
グリコシル化された糖タンパク質である。従って、本発
明のもう一つの態様は、ＩＬ−１βが関係した結合組織
の疾患、特に変形性関節症の診断、予防または治療にお
ける、カルネキシン自身またはその部分、それに対する
抗体、またはカルネキシンまたはその部分をコードする
ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸またはそのフラグメン
トの使用である。上記疾患を診断する方法は、既に上記
されている。本発明は、このような使用のための診断助
剤または医薬にも関する。

【００１２】カルネキシンは、オステオポンチンについ
て前記したのと同様に組換えなどで産生させることがで
きる。カルネキシンのｃＤＮＡは、例えばGalvinら(199
2),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8452-8456に開示
されている。前記抗体の産生も、前記に総括的に記載さ
れている。

【００１３】ＩＬ−１が介在した細胞工程ＴＳＧ−６に
おいて同定されたｃＤＮＡフラグメントの潜在的役割 GenBank およびEMBLのデーターベースでの相同性の検討
の結果、フラグメントＴＡＵ７／２（ｃ）の配列がヒト
ＴＳＧ−６をコードする遺伝子と９９．５％同一である
ことが明らかになった。ＴＳＧ−６（ＴＮＦで刺激した
遺伝子６）は、ヒト線維芽細胞由来のＴＮＦによって誘
導された遺伝子配列として、ディファレンシャル(diffe
rential)ｃＤＮＡライブラリースクリーニングによって
最初に単離された(Leeら、1990) 。これは、更にLee ら
(1992)によって、軟骨リンクタンパク質、プロテオグリ
カンコアタンパク質および接着レセプターＣＤ４４に存
在するヒアルロン酸結合に関連した領域と広汎な配列相
同性を有するＴＮＦおよびＩＬ−１によって誘導可能な
３９ｋＤａの分泌糖タンパク質として特性決定された。
ＴＳＧ−６は、ＨＡと結合する能力を有し、ＣＤ４４と
極めて広汎な配列相同性を有するため、ヒアラドヘリン
ファミリーに属する。Wisniewskiら(1993)は、各種形態
の関節症の患者の滑液に高濃度のＴＳＧ−６タンパク質
を検出した。６名の正常なコントロール患者では、関節
液にはＴＳＧ−６タンパク質は検出されなかったが、９
名の慢性関節リウマチ患者からの関節液には、高、中ま
たは低濃度のＴＳＧ−６が含まれていた。変形性関節症
の２名の患者の関節液には、高濃度のＴＳＧ−６が含ま
れていた。関節におけるＴＳＧ−６の見掛けの局所的供
給源は、滑膜細胞(synoviocytes)および軟骨細胞である
(Wisniewski ら、1993)。 Leeら(1992)は、ＴＳＧ−６
がＣＤ４４とそのリガンドとの間の相互作用の拮抗阻害
剤として作用することができ、従って結合組織の細胞外
マトリックスの構造の組織化に影響を与えることがあ
り、その結果プロテオグリカン凝集体を不安定にする、
と推定した。

【００１４】従って、本発明のもう一つの態様は、ＩＬ
−１βが関係した結合組織の疾患、特に変形性関節症の
診断、予防または治療における、ＴＳＧ−６遺伝子産物
自身またはその部分、またはそれに対する抗体、または
ＴＳＧ−６遺伝子生成物またはその部分をコードするＤ
ＮＡまたはＲＮＡのような核酸またはそのフラグメント
の使用である。上記疾患を診断する方法は、既に上記さ
れている。本発明は、このような使用のための診断助剤
または医薬にも関する。

【００１５】フィブロネクチン GenBank およびEMBLのデーターベースでの相同性の検討
の結果、フラグメントＴＴＯ２０／１（ｃ）の配列がヒ
トフィブロネクチンをコードする遺伝子と１００％同一
であることが明らかになった。

【００１６】フィブロネクチンは、様々な機能を有する
４５０ｋｄの糖タンパク質である。これは、接着リガン
ドとして、成長または分化因子として作用し、走化性を
有する。これは、ほとんどの種類の細胞の細胞外マトリ
ックスに見出されている(Hynes, R 1993, フィブロネク
チン、細胞外マトリックスおよび接着タンパク質のガイ
ドブック(Fibronectins, In: Guidebook to the extrac
ellular matrix and adhesion proteins) 監修者: Krei
s T, Vale R. Oxford University Press. 56-58)。フィ
ブロネクチンおよびそれから誘導されるフラグメントの
蓄積増加が、慢性関節リウマチ患者の膝関節における滑
液中および炎症を起こした滑膜およびパンヌス表面上に
見られる (Dutu A, Vlaicu-Rus V, Bolosiu HD, Parasc
a I, Cristea A. 1986. リウマチ性疾患の患者の血漿お
よび滑液中のフィブロネクチン(Fibronectin in plasma
and synovial fluid of patients with rheumatic dis
eases), Med. Interne 24, 61-68) 。変形性関節症の患
者でも同様に、滑液中および軟骨表面上のフィブロネク
チンの濃度が著しく増加している(Xie D-L, MeyersR, H
omandberg GA. 1992.変形性関節症の滑液中のフィブロ
ネクチンフラグメント(Fibronectin fragments in oste
oarthritic synovial fluid) J. Rheumatology 19, 144
8-1452).フィブロネクチンフラグメントを関節内に注射
すると、イン・ビボでの軟骨プロテオグリカンが著しく
消耗され（Homandberg GA, Meyers R,Williams JM. 199
3. フィブロネクチンフラグメントを関節内に注射する
と、イン・ビボでの軟骨プロテオグリカンが著しく消耗
される(Intraarticular injection of fibronectin fra
gments causes severe depletion of cartilage proteo
glycans in vivo), J. of Rheumatology 20, 1378-138
2）、これはストロメリシンなどの数種類のプロテイナ
ーゼの放出が誘導されることによって説明される（Xie
D-L, Hui F, Meyers R, Homandberg GA. 1994. フィブ
ロネクチンフラグメントによる軟骨融解は、数種類のプ
ロテイナーゼの放出を伴う：ストロメリシンは軟骨融解
において主要な役割を果たす(Cartilage chondrolysis
by fibronectin fragments is associated with releas
e of several proteinases: Stromelysin plays a majo
r role in chondrolysis), Arch. Biochem. and Biophy
sics 311, 205-212 ）。高濃度では、フィブロネクチン
フラグメントは、ＩＬ−１などのサイトカインの放出に
よる軟骨の異化作用を促進する(Homandberg et al., 私
信）。

【００１７】これらの公表されたデーターに関して、フ
ィブロネクチンのＩＬ−１によるアップレギュレーショ
ンは、軟骨細胞および滑膜細胞の自己破壊力を増進する
正のフィードバック調節と考えることができる。この場
合には、フィブロネクチンの発現は、直接的薬理学的標
的である。

【００１８】また、特異的に表わされたＰＣＲ生成物の
配列決定により、軟骨細胞をＩＬ−１βで刺激しまたは
刺激しないことにより特異的に発現した遺伝子に対応す
る未知のＤＮＡフラグメントも発見した。

【００１９】従って、本発明のもう一つの態様は、下記
の配列からなる群から選択されたＤＮＡを含むＤＮＡ、
またはその類似体である： TA08/2(2) 1 CCAAGTTTTT CCAGCAACCC CAAGGGAATA CAGGGAGATC AATGCACCA 51 AAATGGGAAA AGAAAAATAC TTCGATGCAA TGAAACAAAG CCTTTTTCCG 101 TTCAGTTTCC ATAATTCAGT GGTCAGTTTT AAGGCTGCCA CTTGGG TA016/1(2) 1 GACACGAACA CCACATATTT TTATTGGAGG CCCCATGGCT CCTTGGAAGC 51 CATTTTGGAA CCAAGGGGAC CCACCTTTTT TA016/2(2) 1 CTAAATATAT TCTCTAACAA GTTAATCTCT TTCAAATCTA TAGATAAAAC 51 TAAAAGGATA AGGAACCAAG GTTTAACCGA CCTAGCCAAT TATGGCAATC 101 ATACTTGCTT TTTAG TA017(C) 1 CATGAAATAT TTCTTGAGGT AATAAGCTTT TACCAAGCTT ATATTTTTGG 51 GCAATTCAGT TACAATGAGA AAAAAACACA CCAAAAGACC AAAAATTTTA 101 AAAACTCACT TTTCTTGCAA TCATAGACAT TTGCATTATT ATAGAACATT 151 CAAACAAGTT AGGTGGATAA TTATTGTCTA TAGATAAATA CGATGCAATT 201 TTTTTAATGT ATGACCGATA CTCCGTATAT ACTTAGATAA CTTATCCAGA 301 AACCTCAACT GTATTGAACA TTGCTGAGAG AAATCAACAA TAATTTTAAC 351 AGATATGATG ACAGNAAAAA TTGATTGCAT ATCTTTTTGC ACTAAAACTT 401 TTATATTTAT TT TA019(C) 1 AGAGCAGGGG TATTTCNCGG TTCATACCGC CATGGCTTAA GAAGCAAAAG 51 TCATATACCT TAGTAGTGGC AAAGATNGAG GAGATAAAAA AGAGCCTACC 101 CAAGCTGTTG TTGAAGAACA GGTCTTAGAT AAAGAGGAAC CCTTCCAGAA 151 GNACAGAGAC AGGCTAAGGG TGATGCTGAG GAAATGGCTC AGAAGAAACA 201 AGAGATTAA TAU 1/1(2) 1 CTAAATGCAA AGTGAGAAAT TGTATTTTTT CTCCTTTTAA TTGACCTCAG 51 AAGATGCACT ATCTAATTCA TGAGAAATAC GAAATTTCAG GTGTTTATCT 101 TCTTCCTTAC TTTTGGGG TAU 1/1(1) 1 ACATCACCTC ACACATGGAA AGCGAGGAGT TGAATGGTGC ATACAAGGCC 51 ATCCCCGTTT CCCAGGACCT GAACCCGCCT TCTGATTGGG ACAGCCGTGG 101 GAAGGACAGT TATGAAACGA GTCAGCTGGA TGACCAGAGT GCTGAAACCC 151 ACAGCCACAA GCAGTCCAGA TTATATAAGC GGAAA TAU1/2(2) 1 CCGGAATGGG GAGCAAACTA TAAGAACCGG GACCAGTTTC CTCTCTTTGT 51 GCCCTAGTTC CCCCTCCTTT GTATACACCC TCCATCCTGA ATAGACTCTG 101 GTTCTCAGCG TAACACCGAC AACATTCAAT CCTGTAGAGA AACAAATGTT 151 AGCTCAGAAG GACACAGCCT TTGAATCATC AGAGAGTT TAU 7/1(2) 1 GTTAAGAATA ACTAAATAAA AGTTTTAATT AATTTAGGAA TATAAAAAAC 51 TATTAACATT TAATTTTATA ACTGTATCTG CCAAGCAACT TTAAATATAA 101 TTTATTTACC TAU 7/1(1) 1 CACGCAATGT GAAATAGGCA CATAGGAAGA ATGGGGAAAC CATCCCCTCA 51 AGCATTTATC CTTTGAGTTA CAAGCAATCC AATTACACTC TTTTAGTTAT 101 TTTTAAATGT ACAGTTAGGT TATTA TAU 7/2(C) 1 CCTTGAAGAT GACCCAGGTT NCTTGGCTGA TTATGTTGAA ATATAGACA 51 GTTACGATGA TGTCCATGGC TTTGTGGGAA GATACTGTGG AGATGAGCTT 101 CCAGATGACA TCATCAGTAC AGGAAATGTC ATGACCTTGA AGTTTCTAAG 151 TGATGCTTCA GTGACAGCTG GAGGTTTCCA AATCAAATAT GTTGCAATGG 201 AT TAU10(1) 1 GGAGATGACA TTTGCTTTGG GCAGAGGCAG CTAGCCAGGA CACATTTCCA 51 CTATAATTTT ACAAAGTTAA ATTTATAAGC TAGCATTAAG TAAAGTGAAG 101 TTCCAGCTCC CTTGCTAAAA ATAACTAGAG GTAATAATTG GTATTCAGGT 151 AACTCATTTA CATCATAATG TGTTGTGAAA A TAU12/1(2) 1 TATAAAATAT AAATTATATT ATAAATCATG TATTATTTAT AAAATTATAT 51 TATAAATTTA TAAAAATATA AATTATATTT TAGGCTTAAT GTATAAGGAA 101 TATAAATTAT TAATAAGCAT ATGA TAU 12/1(1) 1 TGTAATTAAC TGTNCTTGTA GGTCTGTCTT TTATACATGT GTGAGTTTTT 51 CTTTACAATA GATTCCTAGC ATTGGGATTG CTAGGTCAGA TGGTATGCAC 101 ATTTGACATT TTGATTGATA GCACCAGATT GCTTTGTTAA AAAATTTTNN 151 TTTATAGTTT ACATTATCTT TGTACAATAG ATGTTCTCTT TCGAC TAU 12/2(1) 1 GGGAAGTGAA TTGAAAATAC TTCTTTNTCA ACATAATTTT NGGGTTTTGA 51 AATTGTGTTT GGGTTTTCAG GAAATTGGTG GTAATCTTGT ATTAGACTGAA 101 AAAAAGTGAA TTTTAAAATT CTCAGTGAAG AAGCAAATGA TTTATTTTTC 151 ATAGA TAU12/3(2) 1 TGTTCTGGTA ACTGTTCTAA TTGTGTCTTT GTTACTTCCA GTGCAACCCT 51 TTCAGGTAAG TAU12/3(1) 1 CTAAAGAACT TGGTATCTCT ATTAAAGCAC ACGAACCTCC AAGGAAAATA 51 GAGCGATTTA CTCTTCTCAT ATCAGTGCAT ATTTATAAGA AGCACGGAGT 101 CA TAU13/1(1) 1 AGTCATCAAT TCCTTTTTAT CTGTAATTAC ACATTTGTTT TTATTTCAAA 51 GTAATTATAA GGTGTTATAT TGCATATAAT CAGAAAACTA AATGGAAATA 101 AAATTTTAGT AAGCCCGGCC CCTTTGACCG ATACAGAAAA CTTGA TAU 13/3(2) 1 TATATGGCAG TCTAAAGCAT CAAAGATTTG CATCAACATC TTTCATTTTA 51 GACATCTCCT TGCAATGTAA AATATCATGT ATCAACAACA TCTGGTGCAA 101 ATCCATGAGT CTAACTCGAC ATTCATCTTA GCTCGATTAT TATTCCTTCG 151 TACAGTCGAT GTAAACAATA CAGAAAGAGG ATTATTAAGA ACAGTTT TAU 13/3(1) 1 ATTCATGAAA TGGTCTATAT GCATGATATT GTAAATTCGG ACTCGAAACC 51 GAAACCAAGG ATTCCGTTAC AAAAATTCCT TAATGCTGAG AATGTTCTCA 101 CGCAAACAAC ATCATGGACA TTAAATTCAA GATATGTGAA TGTTAATTCT 151 GTCAATAAAG TCAACGTAAA GAGTAAAGTT AAAAACAGTT ATATCTNNNC 201 TGTCAATGAT GAGTTTAGTT TAACAGATGA TGAATCAATT CT TCO 16/1(C) 1 CAAAGTGTTT TTGGTTTTGA GAGAGAGAGA GATTGAGAGA CAGAGAGAGA 51 GAGAGAAACC AAGGGATCAT GATAGTTATA GTCAAATACG AGGTTGGATT 101 ATCTTTTGAA AATGTGTTGG TTCTGTGATA CAAGAGGAAG CTAAGACATA 151 TCGTGGAAAC ATCTCCCCCC TCCACCTTAA TATCAAGAAC AAATTGTGGA 201 ATCTAATGTT AATGAGAAGT AGTTCCCCAC TGTGTCAGAT G TCO16/2(C) 1 NCATCTGACA CAGTGGGGAA CTACTTCTCA TTAACATTAG ATTCCACAAT 51 TTNNNCTTGA TATTAAGGNN NNNNNGGGAG ATCGTTTCAC GATATCGTCT 101 TAGCTTCCTC TTGTATCACA GAACCAACAC ATTTCAAAAG ATAATCCTTC 151 CTCNNTTTGA CTATAACTAT CATGATCCCT TGGTTCTCTC TCTCTCTCTG 201 CTCTCTCATC TCTCTCTCTC TNAAAACNAA TCO17(C) 1 ACAGTAGTTA GGAGTTTCTT TACTTACAAA ATCACTGGAA ATGATTAAAT 51 TGCTTTTCCC CCTCCCCAGA GGTGCATTTT TCTTATTTCC ATATAGTAAA 101 GTTGAGCTTT TACAGTGCAT AATGTGACAT TTGGAATGCT TATCAACTGC 151 ATGTAAACAT TAATAACCT TCO18(C) 1 GTAAATGGTA TTANNNGCTG AAGAAAAAAA ATTTTTCAAG ACCTCTGTTT 51 TTTAACTGAA CTTTATCATT GGCATTGTGG GCTTTGAAGT TGCTGGGATA 101 AATTAATATA ATTAAATAAA AGACTGAATT TAATTGCAAA AAAAAAAAAA 151 AACAATAAGT GTGGTGAT TCU2/1(1) 1 AAGAAATTAT CCAGTTATTT ACAAGGCCAC TGATATTTTA AACGTCCAAA 51 AGTTTGTTTA AATGGGCTGT TACCGCTGAG AATGATGAGG ATGAGAATGA 101 TGGTTGAAGG TTACATTTTA GGAAATGAAG AAACTTAGAA AATTAATATA 151 AAGACAGTGA TAAATACAAA GAAGATTT TCU2/2(1) 1 CGGGTTAATA TTATCCTCTA GTATAAGTGA ATTACTAGTT TCTCTTTATT 51 TAGACAAACA CACACACACC AGATAATATA AACTTAATAA ATTATCTGTT 101 AATGTAGATT TTATTTAAAA AACTATATTT GAACATTGGT CTTTCTTGGA 151 C TCU9/1(2) 1 ACATAACAGC TTTTATACAA TGATAAGGAC ATATCATTTG TTTACAAAGA 51 AAGTCTAAAA TTTCAAGAAC ATTCAAAGAG CTAACACAGT AAAGGTCATG 101 CAAGTTCTAG AATAGTGAAT CATGACAGAA CTCATTCATT TTATCCTTTA 151 TCTCC TCU9/2(2) 1 AAGTATGGGT AGCTAAATTT GCATTAAATT AAAAGTACAT ATAATGCAAC 51 ACCACTCTAC ATCTGTATAC CTACGAATGT ATGTGTACTA CACACCCTTA 101 AAATGTTTTT CAAAGTCTTA ATATATTAGA ACATGTTTTC ATTTTTTCAT 151 GGGATGTTAA TACTATTCTA TGATTAAGAA AATACTAG TCU10(2) 1 AATACAGTTA TTCTAGCTTT TCATATTCAA TTTGAATGAT CAGAAAAGTA 51 TATTAGTCAC ACAGAATTAA ATATTTTAGA TAGTAAGAAT C TCU14(2) 1 GAAGTGAAAG TCAGCCCTTT AGCTATTATT TATTGCTTTA TTAGAGCAGA 51 GGGAAGTGAC ACTCATTGCC TTCACAGAGC TCTGCAGAAA TATATGCACA 101 GAGTGGTCAA TGCCAACATC TGAGTAAGTC TTCCAAA TGO20(2) 1 CAGAACATTA GGATTTATTC CTTGATTAGT TCAAATGATT TCAACAGCTG 51 AATTCCTTGA GATGTGTAAG GCAGGTTGGT CCTTTGGATG GACTGTAGAC 101 TGAAACTTCC TATAACTGTA GTGATATGTA CACAGCTACA TAGCAAAGTG 151 CTTCATTATG AAAATGAAGA A TGO20(1) 1 CAGTGTGAGA GTCTCATTTC TATGCACAGT GTTTCTCAGG AGGATGGAGC 51 TAGTTAGCTG TCTGTTGTCT GTAGCCCAGC TTGATAATGG AACTATACAG 101 CGAAGAGACA ATCTCTGGCA AGTTTTTGTA GAA TGU5(C) 1 TTAGAGTAAA ATTCCAAATA AATGCTTTGC TCCAAAATTA CACTAACCAG 51 GCTGGGTCTC TATCATACAT CTTCAATACC CTCAAACCTA GATTGTAAAG 101 TGAAAAAAGT GATTAGCNNT TCCATTTGTT CATTCTGTCA CTCACATTCT 151 TAGGCATTTT AAGGATGAGC AACCTTTGTT TCAGAAAGGG TAAGTAATTA 201 GCCCCCTGGA GGTTACATAG TTATAATTTA GTCTTCAGAA TCCGTTCGAA 251 GGGNNNNGTT ACTATTTTTA AGATAATTAG AACCCACCTT GTAGCAATAA 301 AAGTTTTCTT GTCTTTG TGU8(2) 1 GCGAAAGACT AATCGAACCA TCTAGTAGCT GGTTCCCTCC GAAGTTTCCC 51 TCAGGATA TGU9/1(2) 1 TTAATGTTTA AATACTACTT TTTTTTCAAG CTTGCCCTAG ATACCAACTG 51 TTTATCTAAC ACACAATTCC AGTGTTGCCA AGCCTCATGC CAATTTGAAG 101 GGAACAGCCA AAACTTATGC ATTCATATAA AAAGAGTCTC TAGGCTCTTA 151 TATCTACATT ATAATTTTT TGU9/2(2) 1 GGAATAACAT TTTTTTATGA GGGAACCCTT TAAAATGGAT GCACACAGTG 51 GCATTTTCTC CTAGGCTCAA AGCTGAGTAC ACTCCCGTAA TTTTAATAAT 101 ATTTTAGGCA AGTCCTATGA CAATTATACC AACAAGTTTC TTCAACCCCA 151 CCACCACCCC ACCATCTCTA TGC TGU12(C) 1 GGAGGAAGCT TTATTTGGGA AGAGTGCGGT TCNNTCGGCC CTGATCAGCT 51 CTAGCCTGCC CACCCCATCT CAGCCAGGCG GCTTTACTTC TTCCTGAGCT 101 TCAGGTCTTT CTTCTTCCTG ATTTCCTTGG CCAGCTCCCC AATCAATCTC 151 CAGTACTCAT TGAACTTGAG CTCCGAGNCC TGATTCACAT CCAAGCTCTT 201 CATCTTCT TGU13/1(C) 1 GGATGTGGTA GTTGATCTTT AATGCCCATT CTAGGTCGGA AAAATCCATG 51 ATCCTAACTT TTAAGAGAAG GTTGGTAACT CTACTTAGGA CTTTTTTTTG 101 TAAGAGGAAT AATGTAGCCT CACCCTTATC TTTCTGGAAA TGTTTAAACC 151 ACTGAAATAT GGAGATCAAA TCCAGCTTAC ACACTGGTAA CTCAAATACT 201 ATTTTTTTTT TAAACTATCT TTTCTAAACT AATCACCCCT CTTGTACATA 251 GAACTTTCTA TCTCAGTGCC AATTCTTAGA GGTTGATGCA AACAGCTCTC 301 CAGAGAGCCT GTGCTATTGT TC TGU13/2(2) 1 GGGGTGTACA TTTTATTGGA AACCTTAAAT ACTGTTCAGA AAGAATATAT 51 CTTCAATCAA GGTCTTGCCG AGCCTACACA GAAAAATGAA GCTTTTTGGG 101 TTAGGGGCAA GGATATATAC AGTACAGAGG ACAAAGA TTO16/2(C) 1 ACATTCATTA AAGATGAACT TTCAGCATCT TCACTTGAAG ATCCATCAGA 51 TGATTCTGAG AGGCAGGTCT CCCCCAAAAA TCCACCGCAT GTATTCTTTC 101 GTTTAGAATC TGAAAGCCTC TTTCTTTTCA GGCTTGATGA CTCTTCTAAG 151 GTATTTGTTA TGCCTCTCTT CTGGGTTTTT CGTTTTGCCT TATCAAGTAG 201 CTNAAATTCA AACACCATGG CAANAGAAAC TGCTTCTAT TTO20/1(C) 1 CCACCAGCCT ACTGATCAGC TGGGATGCTC CTGCTGTCAC AGTGAGATAT 51 TACAGGATCA CTTACGGAGA AACAGGAGGA AATAGCCCTG TCCAGGAGTT 101 CACTGTGCCT GGGAGCAAGT CTACAGCTAC CATCAGCGGC CTTAAACCTG 151 GAGTTGATTA TACCATCACT GTGTATGCTG TCACTGGCCG TGGAGACAGC 201 CCCGCAAGCA GCAAGCCAAT TTCCATTAAT TACCGAACAG AAATTGACAA 251 ACCATCCCAG ATGCAAGTGA CCGATGTTCA AGACAACTGT TTTAATAAAA 301 GATTTACATT CCAC TTO20/2(2) 1 TTGGTACCAC AGTCACAGAA CTGGGGGTCA TTTTCTAGAT GAAACAAACG 51 GAACAAGTTC TCTTCCAACA AAGAAATGTA CTGTAGAAAT TAATTTCCTC 101 CATGAATTTT ATATATTGTG TACAAATATA AGGTATGTAT CTGAATACAA 151 AG TTU2/1(2) 1 CTAGAACTTC CAAAGGCTGC TTGTCATAGA AGCCATTGCA TCTATAAAGC 51 AACGGCTCCT GTTAAATGGT ATCTCCTTTC TGAGGCTCCT ACTAAAAGTC 101 ATTTGTTACC TAAACCTTAT GTGCCTTAAC AGGCCAATGC TTCTCG TTU 2/2(C) 1 AACCAGTATT TCAAAACTAT TATCTGGATT CAAGATTAGT GTGTAAAGAT 51 TGTTTTCTTA TCAGTAAAAT AGGTCTTCAG ATCTGCATCT GGCCTCTTAG 101 CATGTTTTTC TTCATAGATA CCCGTTTTGG GGTTTTTGCG TCGGAAGATG 151 AAGTGCAGTT TATAGTCCTC TCCACATTTA TCTG TTU3(1) 1 GGGTAGAAAG CTGAATAATT TATGAAGGAG AGGGGTCAGG GTTGATTCGG 51 GAGGACCTAT TGGTGCGGGG GCTTTGTATG ATTATGGGCG TTGATTAGTA 101 GTAGTTACTG GTTGAACATT GTTTGTTGGT GTATATATTG TAATTGAGAT 151 TGCTCGGGGG AATAGGTTAT GTGATTAGGA GTAGGGTTAG GATGAGTGGG 201 AAG TTU 5/1(2) 1 GACAAAAAAA AAAAAACAGG TTTTAAAGCT AGAAATGAAA AGCTACTTAA 51 GTATCTTAAA GGATAAGTTA CTTTATTATA CACTAGAAAC ATACACAATA 101 GCTGAAAACT TAAAAAATCT CACACTGCTG AATGTCTCTG CTGGCTG TTU5/2(2) 1 GCATCCATTG TACATTGTTT GGTTTGAGGT TACCATGAGG CCTGTAAATA 51 CTATCTTATA ATTTATTATT TCAACCTGAT AAAACTTAAC ACTATTTGCA 101 TAAACAAACA AACGAAAA TTU9/1(1) 1 TAAAATACTG GTTCTTTTAT TCTGCAATAT TTTTAAAAAT CACATTTTCA 51 GCCAGGCGCA GTTTCCCACA CCTGTAATCC GGCACTTTGG GAGGCTGAGA 101 TGGGTGGATC ACAAGGTAGG AGATCAAACA TCCTGGCCAA CATGGTGAAC 151 CTGTTTACT TTU9/2(2) 1 CAAGTATGGG TAGCTAAATT TGCATTAAAT TAAAAGTACA TATAATGCAA 51 CACCACTCTA CATCTGTATA CCTACGAATG TATGTGTACT ACACACCCTT 101 AAATGTTTCA AAGCTTAATA TATTAGAACA TGTTTTCATT TTCAGGGAG TTU13(2) 1 GGAAATACAC TAGCATGTGA GCACTGTATA TAAAGCTTGA GGTTAGGAGG 51 TAAAATGAAA GAAATCATTT TTAACTCCTA AGATGT および TTU13(1) 1 TGAATTAAAT GGACTCGTTG AAAGGACAAG GAGATCGGTA ATATCTCTCT 51 AAAGAACTTA TATACTAAAA TCTGTAATTG CCTGTACCAA AAGTTTTAGT 101 CTTCTTTT。

【００２０】本発明によれば、「類似体」という用語
は、そのタンパク質の特徴を消去しない保存的なアミノ
酸置換または欠失を有するタンパク質、または少なくと
も約８５％、更に有利には少なくとも約９０％、特に９
５％のアミノ酸配列の相同性を有するタンパク質につい
て、遺伝子コードの縮重による同じタンパク質配列をコ
ードする核酸を包含する。

【００２１】本発明の他の態様では、このＤＮＡを含む
ベクターおよびこのベクターを含む宿主細胞が提供され
る。

【００２２】一般的知識によれば、当業者は、本発明の
この核酸をハイブリダイゼーションプローブとして用い
て、生物中の、または生物若しくはその遺伝子突然変異
体からの試料中の対応する遺伝子を検出することもでき
る。

【００２３】従って、もう一つの態様は、ＩＬ−１βに
よってその遺伝子を含む軟骨細胞を処理することによっ
て誘導しまたは抑制することができる遺伝子の単離法で
あって、(a) ストリンジェント、好ましくは高ストリン
ジェント条件下で、この遺伝子を含むＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、好ましくは軟骨細胞、特にヒト軟骨細胞から最初に
単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに対して本発明のＤＮＡ
をハイブリダイゼーションし、(b) この遺伝子を、当業
者に知られている方法によって単離する工程を含む方法
である。

【００２４】本発明によれば、「ストリンジェント条件
(stringent conditions)」という用語は、６２〜６６℃
における塩濃度４×ＳＳＣ（ＮａＣｌ−クエン酸緩衝
液）を含んでなるハイブリダイゼーション条件を意味
し、「高ストリンジェント条件」とは、６８℃における
塩濃度０．１×ＳＳＣを含んでなるハイブリダイゼーシ
ョン条件を意味する。プローブの長さは、６〜１００、
好ましくは１０〜４０、特に１２〜２５核酸の長さであ
る。

【００２５】更にもう一つの態様は、前記方法によって
単離した遺伝子を発現する方法であって、(a) この遺伝
子を、原核生物での発現のためのｐＥＴシリーズ(Studi
er et al.,1990. Methods in Enzymology 185, 60)のよ
うな好適な発現ベクターまたは哺乳類での発現のための
ベクターＣＤＭ８(Aruffo and Seed, 1987. Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA 84, 8573)、または当業者に知られて
いる任意の他の発現系にクローニングし、(b) この遺伝
子を、適当な宿主細胞、例えば原核生物での発現のため
のＢＬ２１シリーズ (Studier et al., 1990, supra)ま
たは哺乳類での発現のためのＣＯＳ細胞 (Aruffo and S
eed, 1987, supra) 、または当業者に知られている任意
の他の発現系で発現させる工程を含む方法、または(a)
適当な宿主細胞、特にベクター、特に本発明のＤＮＡま
たは遺伝子を含む前記のベクターのような発現ベクター
を含むもの、を培養し、(b) 発現したタンパク質を、限
外濾過、尿素などのカオトロピック剤による沈澱、また
はAusubel ら、1994（上記）に詳述されているようなイ
オン交換クロマトグラフィカラム上でのカラムクロマト
グラフィによって単離する、工程を含むタンパク質の製
造法である。

【００２６】もう一つの態様は、本発明によるＤＮＡま
たはその部分、または遺伝子またはその部分を含む診断
助剤である。特に、遺伝子は、ＲＮＡ濃度について本発
明の遺伝子に特異的なプローブを用いるまたはＰＣＲ反
応における遺伝子に特異的なプライマーを用いるノザン
ブロット法によって定量することができる。このような
プライマーは、本発明のＤＮＡ配列または対応する遺伝
子の配列を用いて合成的に生成することができる。従っ
て、前記核酸は、結合組織のＩＬ−１βが関連した疾
患、特に変形性関節症または慢性関節リウマチの診断に
有用である。

【００２７】これらの核酸は、小さな軟骨の生検におけ
るある種の遺伝子の発現の評価および究極的に疾患に特
異的なマーカーとしておよび／または変形性関節症など
の疾患の進行についての予測的マーカーとしてこれらを
用いることもできる。ハイブリダイゼーション条件は、
前記と同じである。しかしながら、これらの核酸は、前
記疾患に対する治療または医薬の製造に用いることもで
きる。

【００２８】従って、本発明のもう一つの態様は、医薬
の製造を目的とする前記核酸の使用でもある。例えば、
Uhlmann & Peyman (Chem. Rev. (1990), 90, 543), Mil
ligan et al. (J. Med. Chem. (1993), 36, 1923) また
は Stein & Cheng (Science(1993), 261, 1004)に記載
されているように、これらの核酸は、遺伝学発現の抑制
を目的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは三
重螺旋形成オリゴヌクレオチドとして用いることができ
る。このような疾患が、軟骨細胞中のＩＬ−１βによっ
て直接または間接的に制御される遺伝子生成物の過剰生
産によって引き起こされる場合には、これは特に有用で
ある。また、これらの核酸を改質して、例えば上記文献
に記載されているようなヌクレアーゼに対する安定性な
どを増加させることができる。

【００２９】最後に、本発明の方法によって産生される
遺伝子生成物自身を、医薬として用いることもできる。

【００３０】本発明を下記の実施例によって具体的に説
明する。

【００３１】

【実施例】実施例１ 特異的に発現した遺伝子の同定 （１）細胞培養 関節の軟骨標本は、変形性関節症の全関節交換手術を受
けている２名の患者（男性６５歳および女性７３歳）か
ら得た。これらの患者は両名とも、放射線治療または化
学療法を受けていなかった。関節の軟骨スライスを両大
腿顆、脛骨プラトーおよび膝蓋骨から無菌的に切除し、
文献記載の方法でプロナーゼおよびコラゲナーゼで順次
酵素的に消化した(Haeuselmann HJ et al. 1992, Matri
x 12, 116-129)。アルギン酸ゲル懸濁液系は軟骨形成性
の表現型を保持することが知られているので [Lohmande
r LS et al. 1992, Trans. Orthop. Res. Soc. 17, 27
3.]、４×１０^６個の軟骨細胞を低粘度アルギン酸塩に
懸濁し（４×１０^６個の細胞／１．２５％（重量／容
量）アルギン酸塩を等張緩衝液に溶解したもの１ｍ
ｌ)、２２ゴーシェ針(22 gauche needle)で１０２ｍＭ
ＣａＣｌ溶液中に発現させ、直径が１．５〜３ｍｍで
球状をした細胞捕捉ビーズを形成した。総数が２×１０
^７個の細胞を含むアルギン酸塩ビーズを、最初の３日間
は毎日、媒質Ｆ１２／ＤＭＥＭ（５０／５０）、および
２５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩および５０μｇ／ｍ
ｌのゲンタマイシンを含む１０％ウシ胎児血清(Sigma)
を用いて供給した後、５Ｕ／ｍｌ ｒｈ ＩＬ−１βの
存在下または非存在下にて更に３日間培養して２群に再
分した。細胞の回収には、アルギン酸塩ビーズを最終的
に溶解緩衝液（５５ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１５ＭＮａＣｌ）に溶解し、１０分間
室温で放置した。生育力をエオシン−レッド排除法によ
ってチェックし、細胞数を計測した。

【００３２】（２）プライマー合成 任意のオリゴデカマーＯＰＡ６〜ＯＰＡ１０、ＯＰＡ１
６〜ＯＰＡ２０および変質して付着したオリゴ−ｄＴプ
ライマー（Ｔ₁₂ＶＮ）を３９２ＤＮＡ合成装置(Applied
Biosystems)を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を変性させることによって精製した。幾つかの
オリゴデカマープライマーＵ１〜Ｕ１５は、Biometra
(Goettingen、ドイツ連邦共和国）から購入した。ＤＤ
ＲＴ−ＰＣＲに用いた総ての縮重３′オリゴｄＴ−プラ
イマー［Ｔ₁₂ＶＮ］は下記の通りであった。 プライマー 配列５′〜３′ Ｔ₁₂ＶＡ ５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＡ−３′ Ｔ₁₂ＶＡ ５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＴ−３′ Ｔ₁₂ＶＡ ５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＧ−３′ Ｔ₁₂ＶＡ ５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＣ−３′ Ｖ＝ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ； Ｎ＝ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ

【００３３】ＤＤＲＴ−ＰＣＲに用いた総ての任意５′
オリゴデカマープライマーは下記の通りであった。 プライマー 配列５′〜３′ ＯＰＡ６ ＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣ ＯＰＡ７ ＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧ ＯＰＡ８ ＧＴＧＡＣＧＧＧＴＧ ＯＰＡ９ ＧＣＧＴＡＡＣＧＣＣ ＯＰＡ１０ ＧＴＧＡＴＣＧＣＡＧ ＯＰＡ１６ ＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡ ＯＰＡ１７ ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ ＯＰＡ１８ ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ ＯＰＡ１９ ＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧ ＯＰＡ２０ ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ Ｕ１ ＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧ Ｕ２ ＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣ Ｕ３ ＣＴＴＴＣＴＡＣＣＣ Ｕ４ ＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣ Ｕ５ ＧＧＡＡＣＣＡＡＴＣ Ｕ６ ＡＡＡＣＴＣＣＧＴＣ Ｕ７ ＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧ Ｕ８ ＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧ Ｕ９ ＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧ Ｕ１０ ＧＧＴＡＣＴＡＡＧＧ Ｕ１１ ＴＡＣＣＴＡＡＧＣＧ Ｕ１２ ＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧ Ｕ１３ ＧＴＴＴＴＣＧＣＡＧ Ｕ１４ ＧＡＴＣＡＡＧＴＣＣ Ｕ１５ ＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣ

【００３４】（３）ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ合成 培養した関節の軟骨細胞からの全ＲＮＡを、Chomczynsk
i およびSacchiの一段階法に準じて調製し (Chomczynsk
i P & Sacchi N, 1987, Anal. Biochem. 162,156-15
9)、１０ＵのＲＮアーゼを含まないＤＮＡアーゼＩ(Gib
co, Eggenstein,ドイツ連邦共和国）を用いて３７℃で
３０分間インキュベーションし、ＲＮＡの染色体ＤＮＡ
混入物を除去した。フェノール／クロロホルム（３：
１）で抽出した後、上清を０．３Ｍ ＮａＯＡｃの存在
下にてエタノールで沈澱させ、ＲＮＡをＤＥＰＣ処理し
た水に再溶解した。次いで、０．４μｇの総ＲＮＡを、
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、それ
ぞれ２００μＭずつのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４０ＵのＲＮアーゼ阻害
剤(Boehringer Mannheim, ドイツ連邦共和国）および
２．５ｍＭの縮重したオリゴ−ｄＴプライマー（Ｔ₁₂Ｖ
Ｎ）を含む４０μｌの反応容積中で２００Ｕ Ｍ−ＭＬ
Ｖ（Moloney ネズミ白血病ウイルス）逆転写酵素(Gibc
o, Eggenstein, ドイツ連邦共和国）を用いて３７℃で
１時間逆転写した。反応は、９５℃で５分間加熱するこ
とによって停止した。

【００３５】（４）ＰＣＲ増幅 ｃＤＮＡを、ＤＮＡ熱サイクル装置（Perkin Elmer, ４
８０型）中でｃＤＮＡ合成に用いた元のＴ₁₂ＭＮ−プラ
イマー２．５μＭを、０．５μＭの任意の上流のプライ
マー、それぞれ０．５μＭのｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０μＣｉのα−［³⁵Ｓ］
ｄＡＴＰ（１０００Ｃｉ／ミリモル、１０ｍＣｉ／ｍ
ｌ）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００１％ゼ
ラチン、および２．５ＵのAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ
と組み合わせて含む２０μｌのＰＣＲ反応物中で増幅し
た。軽質鉱油で被覆して、熱サイクリングを下記のよう
にして行った。４０サイクルについては、９４℃で３０
秒間、４０℃で２分間、７２℃で３０秒間行った後、７
２℃で５分間後延長した。AmliTaq ＤＮＡポリメラーゼ
は、Perkin-Elmer (Weiterstadt,ドイツ連邦共和国) か
ら購入し、α−［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰは、Amersham-Buchler
(Braunschweig, ドイツ連邦共和国）から得た。５μｌ
の停止緩衝液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５
％キシレンシアノール）を加えたところ、放射能標識し
たＰＣＲ−フラグメントが、大きさが３５×４３ｃｍの
６％アクリルアミド／７Ｍ尿素高分解能配列決定ゲル上
に現れ、乾燥したゲルをＸ線フィルム (Kodak X-OMAT)
に４８時間露出し、これによってＤＤＲＴ−ＰＣＲバン
ドパターンを並べて比較することによって特異的に発現
した遺伝子を迅速に同定することができる。結果は第１
表に示される通りであった。

【００３６】第１表は、使用したプライマー、および発
現で検出された特異性の複雑さについての概要を示した
ものである。

【００３７】

【表１】

【００３８】（第１表に関する理論的考察）任意の上流
プライマーにより総ＲＮＡの３％が検出され、従って総
ｍＲＮＡの９７％は検出されないことを示しており、す
なわち２５任意オリゴデカマープライマーおよび４個の
縮重Ｔ₁₂ＶＮプライマーでは、ｍＲＮＡの約半数が高分
解能配列決定ゲルの１００レーンに見られる（Ｐ＝１−
（０．９７）^ｎ＝１−（０．９７）²⁵＝５３．３％）。

【００３９】実施例２ 特異的に発現した遺伝子の配列
決定および配列分析 （１）ＰＣＲフラグメントの溶出、再増幅およびクロー
ニング 特異的に発現したバンドとして同定されたＰＣＲフラグ
メントをアクリルアミドゲルから切り出し、エッペンド
ルフ試験管に移し、１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて室温で１０分間再水
和した。ゲルスライスを１５分間煮沸した後、ＰＣＲフ
ラグメントを、０．３Ｍ ＮａＡｃおよびキャリヤーと
しての２０μｇのグリコーゲンの存在下にてエタノール
沈澱により回収し、１０μｌの滅菌水に再溶解した。こ
の容積の５μｌを、ｄＮＴＰ濃度を２０μＭとし、かつ
放射性同位体を用いないことを除き、適当なプライマー
および前記条件を用いて、ＰＣＲによる再増幅に用い
た。再増幅したＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル上
で電気泳動によって可視化し、 Ultrafree MC-フィルタ
ー(Millipore) を用いて限外濾過によってゲルから溶出
した。精製したＰＣＲフラグメントを、次にプラスミド
からイン・ビトロで転写して配列決定することができる
ＴＡクローニング法(Kovalic D et al. 1991, Nucleic
Acids Research19, 4640)によってｐＣＲＩＩ−ベクタ
ー (Invitrogen, De Schelp,オランダ国）にクローニン
グした。

【００４０】（２）配列決定 ＳＰ６（２）またはＴ７（１）プライマーを用いたサブ
クローニングＰＣＲフラグメントのプラスミドＤＮＡの
配列決定は、Sangerら(Sanger F et al. 1977,Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)によって記載され
たチェインターミネーションＤＮＡ配列決定法を用いて
行った。

【００４１】（３）配列分析 配列分析の結果、本明細書に開示したｃＤＮＡクロー
ン、TAO8/2(2), TAO16/1(2), TAO16/2(2), TAO17(c), T
AO19(c), TAU1/1(2), TAU1/1(1), TAU1/2(2), TAU7/1
(2), TAU7/1(1), TAU7/2(c), TAU10(1), TAU12/1(2), T
AU12/1(1), TAU12/2(1), TAU12/3(2), TAU12/3(1), TAU
13/1(1),TAU13/3(2), TAU13/3(1), TCO16/1(c),TCO16/2
(c), TCO17(c), TCO18(C), TCU2/1(1), TCU2/2(1), TCU
9/1(2), TCU9/2(2), TCU10(2), TCU10(2), TCU14(1), T
CU14(2), TGO20(2), TGO20(1), TGU5(c), TGU8(2), TGU
9/1(2), TGU9/2(2), TGU12(C), TGU13/1(c), TGU13/2
(2), TTO16/2(c), TTO20/1(c), TTO20/2(2), TTU2/1
(2), TTU2/2(c), TTU3(1), TTU5/1(2), TTU5/2(2), TTU
9/1(1), TTU9/2(2),9 TTU13(2), TTU13(1) の配列が明
らかになった。サブクローニングＰＣＲフラグメントと
ＤＮＡデーターベース (GenBank または EMBL データー
ベース) の一つに既に記載されている配列との間の相同
性の検索は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ (Genetics
Computer Group, Madison, アメリカ合衆国）に包含さ
れるPearson およびLipman (Pearson W & Lipman DJ 19
88, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448) によ
って開発されたＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った。
配列分析の結果は第２表に示される通りであった。

【００４２】第２表は、ＰＣＲ生成物を配列決定ゲルか
ら溶出し、再増幅し、ｐＣＲＩＩベクターへサブクロー
ニングした後の特異的に表わされたＰＣＲ生成物の配列
決定の結果を要約したものである。

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】

【００４５】

【表４】

【００４６】ＴＡＵ１／１（１）およびＴＡＵ１／１
（２）の配列はヒトオステオポンチンｃＤＮＡと１００
％同一であり、TTU2/2の配列はヒトカルネキシンと９
７．２％同一である。ｂｐ＝塩基対、ＩＬ−１＝インタ
ーロイキン１の刺激、Stat. sig.score＝統計学的有意
差得点：ＢＬＡＳＴデーターベース検索プログラムの特
徴。この得点は、gram. This score is determined usi
ng an implementation ofKarlinの有意差式の方法を用
いて決定され(Karlin, S. およびAltschul, S.F. 1990.
一般的得点方式を用いる分子配列の特徴の統計学的有意
性の評価法(Methodsfor assessing the statistical si
gnificance of molecular sequence features by using
general scoring schemes)、 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87:2264-2268)、これは、観察される配列の類似
性が、配列データーベースのサイズおよび組成並びにそ
の対となるもののサイズおよび品質に基づいて偶然に起
こるポアソン確率を計算するものである。この数値が小
さくなればなるほど、配列の類似性が高くなるものと思
われる。

【００４７】従って、４４種類の同定したフラグメント
は、下記のように細分することができる。 １） ＩＬ−１が介在した工程で既知の役割を有する既
知のヒト遺伝子と配列相同性を有する２種類のフラグメ
ント： ＴＡＵ７／２ ヒトＴＮＦで刺激した遺伝子−６と
同一。 ＴＴＯ２０／１ ヒトフィブロネクチンと同一。

【００４８】２） 既知のヒト遺伝子と配列相同性を有
する６種類のフラグメントであって、ＩＬ−１が介在し
た工程でのその機能を推定することができるもの： ＴＡＵ１／１ ヒトオステオポンチンと同一。 ＴＧＵ８ ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
と同一。 ＴＧＵ１３／２ ヒトＦ１ ＡＴＰアーゼβ−サブユ
ニットと同一。 ＴＴＯ１６／２ ヒトＥＲＣＣ５と同一。 ＴＴＵ２／２ ヒトカルネキシンと同一。 ＴＴＵ３ ヒトＮＡＤＨ−ＤＨｍｔＤＮＡサブ
ユニットと同一。

【００４９】３） ヒトゲノム配列決定プロジェクトで
同定されたヒト遺伝子と配列相同性を有する９種類のフ
ラグメント： ＴＡＵ７／１ ヒトｃＤＮＡクローンｃ−１ｓｄ０
２と同一。 ＴＡＵ１２／３ ヒトｃＤＮＡクローンＨＲＢＢＡ２
１と同一。 ＴＣＵ９／１ ヒトｃＤＮＡクローン１３１０３６
３′と同一。 ＴＣＵ１０ ヒトｃＤＮＡクローン２６５１８
３′と同一。 ＴＣＵ１４ ヒトｃＤＮＡクローンＨＬ６０
３′指向性Ｍｂｏｌ（ＨＬ６０ ３′directed Ｍｂｏ
ｌ）と同一。 ＴＧＵ９／２ ヒトｃＤＮＡクローン１２Ａ１０Ｂ
と同一。 ＴＧＵ１２ ヒトｃＤＮＡクローン１１３４４２
３′と同一。 ＴＴＵ２／１ ヒトｃＤＮＡクローン１１８４７０
５′と同一。 ＴＴＵ９／１ ヒトｃＤＮＡクローン８３７６４
３′と同一

【００５０】４） 既知のヒト遺伝子と配列相同性のな
い２７種類のフラグメント：ＴＳＧ−６およびフィブロ
ネクチン、ＩＬ−１によってアップレギュレーションさ
れることが知られている両方の遺伝子の検出により、Ｉ
Ｌ−１が介在した工程を考慮すれば、他のｃＤＮＡフラ
グメントの重要性が指摘される。これらの遺伝子は、リ
ウマチおよび変形性関節症などの変質した関節疾患にお
いて役割を果たしていると思われ、このため、臨床研究
のためのマーカーとしてまたは薬理学的介在のための薬
剤標的としての興味深い候補である。

【００５１】実施例３ 特異的に発現した遺伝子の発現量の測定 （１）ノーザンブロット分析 細胞培養およびＲＮＡの単離は、前記とちょうど同じ方
法で行った。ＩＬ−１βで刺激したまたは刺激していな
い両方の軟骨細胞から得た総ＲＮＡの１０μｇを５０％
ホルムアミド、２０ｍＭ ＭＯＰＳおよび２．２Ｍホル
ムアルデヒドの溶液中で６５℃で１０分間加熱すること
によって変性し、１×ＭＯＰＳに２．２Ｍホルムアルデ
ヒドを含む１％アガロースゲルによって分離し、標準的
なブロット法[Maniatis et. al 1992]によって正に帯電
したナイロン膜(Amersham)に移した。ＵＶ架橋の後、ブ
ロットをラピッド・ハイブ・バッファー(Amersham)中で
６５℃で１時間予備ハイブリダイゼーションを行った。
ヒトオステオポンチンｃＤＮＡ(GenBank J04765)のｎｔ
ｓ６１〜３９０に対応する３３０ｂｐのｃＤＮＡおよび
ヒトカルネキシン(GenBank M94859)からのｎｔｓ８８１
〜１２２０に対応する３４０ｂｐのｃＤＮＡを、ランダ
ム・ノナマー・プライマー(Amersham)を用いてα
［³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ミリモル、１０ｍＣ
ｉ／ｍｌ）によって、ハイブリダイゼーション用に、約
１．５×１０^９ｄｐｍ／μｇＤＮＡの比活性まで放射能
標識した。ハイブリダイゼーションは、標識したプロー
ブ２ｎｇ／ｍｌを添加した予備ハイブリダイゼーション
溶液中で６５℃で２．５時間行った。ブロットを、２×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで順次３７℃で１５分間洗浄し
た後（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳでそれぞれ６５℃で１０分間洗浄した。
必要ならば、最後の高ストリンジェント洗浄を０．１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で１５分間行った。次
いで、ブロットを、強化スクリーン(inensifying scree
n)を用い−８０℃でKodak X-Omatフィルムを用いて２〜
７日間オートラジオグラフィーによって分析し、バンド
の強度をホスホルイメージャー(phsphorimager) （Bior
ad, ＧＳ２５０型）を用いて定量した。総てのブロット
を、沸騰している０．５％ＳＤＳ溶液でストリップし、
標識したβ−アクチンを用いて再プローブし、それぞれ
のレーンにおけるＲＮＡの均等ローディング(equal loa
ding)を示した。

【００５２】（２）ノーザンハイブリダイゼーションの
結果 ＴＳＧ−６と同一のフラグメントＴＡＵ７／２（ｃ）
を、ＩＬ−１で刺激した細胞中で特異的にアップレギュ
レーションした。これは、ＴＳＧ−６について、ＴＮＦ
−αおよびＩＬ−１が介在したアップレギュレーション
についてのLee ら(1992)の報告と一致している。ヒトオ
ステオポンチンと同一のフラグメントＴＡＵ１／１およ
びヒトカルネキシンと同一のＴＴＵ２／２は、両者と
も、ＩＬ−１で刺激していない細胞と比較してＩＬ−１
で刺激した軟骨細胞での発現は弱かった。本発明者らの
ディファレンシャルディスプレーデーターを立証するた
め、第三の患者から得たＩＬ−１で刺激したおよび刺激
していない軟骨細胞でのオステオポンチンおよびカルネ
キシンのノザーン分析を行った。両方のメッセージも、
ダウンレギュレーションした。ホスホルイメージャーで
定量したところ、第三の患者の軟骨細胞からのＲＮＡ個
体群ではオステオポンチンのダウンレギュレーションは
７９％であり、カルネキシンのダウンレギュレーション
は４０％であった。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 16/18 8517−4Ｈ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患、特
   に変形性関節症の診断、予防または治療における、オス
   テオポンチン自身もしくはその部分、オステオポンチン
   もしくはその部分に対する抗体、またはオステオポンチ
   ンもしくはその部分をコードする核酸もしくはその部分
   の使用。
2. 【請求項２】オステオポンチン自身もしくはその部分、
   オステオポンチンもしくはその部分に対する抗体、また
   はオステオポンチンもしくはその部分をコードする核酸
   もしくはその部分を含んでなる、ＩＬ−１βが介在した
   結合組織の疾患、特に変形性関節症の診断のための診断
   助剤。
3. 【請求項３】オステオポンチン自身もしくはその部分、
   オステオポンチンもしくはその部分に対する抗体、また
   はオステオポンチンもしくはその部分をコードする核酸
   もしくはその部分を含んでなる、ＩＬ−１βが介在した
   結合組織の疾患、特に変形性関節症の予防または治療の
   ための医薬。
4. 【請求項４】ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患、特
   に変形性関節症の診断、予防または治療における、カル
   ネキシン自身もしくはその部分、カルネキシンもしくは
   その部分に対する抗体、またはカルネキシンもしくはそ
   の部分をコードする核酸もしくはその部分の使用。
5. 【請求項５】カルネキシン自身もしくはその部分、カル
   ネキシンもしくはその部分に対する抗体、またはカルネ
   キシンもしくはその部分をコードする核酸もしくはその
   部分を含んでなる、ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾
   患、特に変形性関節症の診断のための診断助剤。
6. 【請求項６】カルネキシン自身もしくはその部分、カル
   ネキシンもしくはその部分に対する抗体、またはカルネ
   キシンもしくはその部分をコードする核酸もしくはその
   部分を含んでなる、ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾
   患、特に変形性関節症の予防または治療のための医薬。
7. 【請求項７】ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患、特
   に変形性関節症の診断、予防または治療における、ＴＳ
   Ｇ−６遺伝子生成物自身もしくはその部分、ＴＳＧ−６
   遺伝子生成物もしくはその部分に対する抗体、またはＴ
   ＳＧ−６遺伝子生成物もしくはその部分をコードする核
   酸もしくはその部分の使用。
8. 【請求項８】ＴＳＧ−６遺伝子生成物自身もしくはその
   部分、ＴＳＧ−６遺伝子生成物もしくはその部分に対す
   る抗体、またはＴＳＧ−６遺伝子生成物もしくはその部
   分をコードする核酸もしくはその部分を含んでなる、Ｉ
   Ｌ−１βが介在した結合組織の疾患、特に変形性関節症
   の診断のための診断助剤。
9. 【請求項９】ＴＳＧ−６遺伝子生成物自身もしくはその
   部分、ＴＳＧ−６遺伝子生成物もしくはその部分に対す
   る抗体、またはＴＳＧ−６遺伝子生成物もしくはその部
   分をコードする核酸もしくはその部分を含んでなる、Ｉ
   Ｌ−１βが介在した結合組織の疾患、特に変形性関節症
   の予防または治療のための医薬。
10. 【請求項１０】下記の群から選択されるＤＮＡを含むＤ
    ＮＡ、またはその類似体： TA08/2(2) 1 CCAAGTTTTT CCAGCAACCC CAAGGGAATA CAGGGAGATC AATGCACCA 51 AAATGGGAAA AGAAAAATAC TTCGATGCAA TGAAACAAAG CCTTTTTCCG 101 TTCAGTTTCC ATAATTCAGT GGTCAGTTTT AAGGCTGCCA CTTGGG TA016/1(2) 1 GACACGAACA CCACATATTT TTATTGGAGG CCCCATGGCT CCTTGGAAGC 51 CATTTTGGAA CCAAGGGGAC CCACCTTTTT TA016/2(2) 1 CTAAATATAT TCTCTAACAA GTTAATCTCT TTCAAATCTA TAGATAAAAC 51 TAAAAGGATA AGGAACCAAG GTTTAACCGA CCTAGCCAAT TATGGCAATC 101 ATACTTGCTT TTTAG TA017(C) 1 CATGAAATAT TTCTTGAGGT AATAAGCTTT TACCAAGCTT ATATTTTTGG 51 GCAATTCAGT TACAATGAGA AAAAAACACA CCAAAAGACC AAAAATTTTA 101 AAAACTCACT TTTCTTGCAA TCATAGACAT TTGCATTATT ATAGAACATT 151 CAAACAAGTT AGGTGGATAA TTATTGTCTA TAGATAAATA CGATGCAATT 201 TTTTTAATGT ATGACCGATA CTCCGTATAT ACTTAGATAA CTTATCCAGA 301 AACCTCAACT GTATTGAACA TTGCTGAGAG AAATCAACAA TAATTTTAAC 351 AGATATGATG ACAGNAAAAA TTGATTGCAT ATCTTTTTGC ACTAAAACTT 401 TTATATTTAT TT TA019(C) 1 AGAGCAGGGG TATTTCNCGG TTCATACCGC CATGGCTTAA GAAGCAAAAG 51 TCATATACCT TAGTAGTGGC AAAGATNGAG GAGATAAAAA AGAGCCTACC 101 CAAGCTGTTG TTGAAGAACA GGTCTTAGAT AAAGAGGAAC CCTTCCAGAA 151 GNACAGAGAC AGGCTAAGGG TGATGCTGAG GAAATGGCTC AGAAGAAACA 201 AGAGATTAA TAU 1/1(2) 1 CTAAATGCAA AGTGAGAAAT TGTATTTTTT CTCCTTTTAA TTGACCTCAG 51 AAGATGCACT ATCTAATTCA TGAGAAATAC GAAATTTCAG GTGTTTATCT 101 TCTTCCTTAC TTTTGGGG TAU 1/1(1) 1 ACATCACCTC ACACATGGAA AGCGAGGAGT TGAATGGTGC ATACAAGGCC 51 ATCCCCGTTT CCCAGGACCT GAACCCGCCT TCTGATTGGG ACAGCCGTGG 101 GAAGGACAGT TATGAAACGA GTCAGCTGGA TGACCAGAGT GCTGAAACCC 151 ACAGCCACAA GCAGTCCAGA TTATATAAGC GGAAA TAU1/2(2) 1 CCGGAATGGG GAGCAAACTA TAAGAACCGG GACCAGTTTC CTCTCTTTGT 51 GCCCTAGTTC CCCCTCCTTT GTATACACCC TCCATCCTGA ATAGACTCTG 101 GTTCTCAGCG TAACACCGAC AACATTCAAT CCTGTAGAGA AACAAATGTT 151 AGCTCAGAAG GACACAGCCT TTGAATCATC AGAGAGTT TAU 7/1(2) 1 GTTAAGAATA ACTAAATAAA AGTTTTAATT AATTTAGGAA TATAAAAAAC 51 TATTAACATT TAATTTTATA ACTGTATCTG CCAAGCAACT TTAAATATAA 101 TTTATTTACC TAU 7/1(1) 1 CACGCAATGT GAAATAGGCA CATAGGAAGA ATGGGGAAAC CATCCCCTCA 51 AGCATTTATC CTTTGAGTTA CAAGCAATCC AATTACACTC TTTTAGTTAT 101 TTTTAAATGT ACAGTTAGGT TATTA TAU 7/2(C) 1 CCTTGAAGAT GACCCAGGTT NCTTGGCTGA TTATGTTGAA ATATAGACA 51 GTTACGATGA TGTCCATGGC TTTGTGGGAA GATACTGTGG AGATGAGCTT 101 CCAGATGACA TCATCAGTAC AGGAAATGTC ATGACCTTGA AGTTTCTAAG 151 TGATGCTTCA GTGACAGCTG GAGGTTTCCA AATCAAATAT GTTGCAATGG 201 AT TAU10(1) 1 GGAGATGACA TTTGCTTTGG GCAGAGGCAG CTAGCCAGGA CACATTTCCA 51 CTATAATTTT ACAAAGTTAA ATTTATAAGC TAGCATTAAG TAAAGTGAAG 101 TTCCAGCTCC CTTGCTAAAA ATAACTAGAG GTAATAATTG GTATTCAGGT 151 AACTCATTTA CATCATAATG TGTTGTGAAA A TAU12/1(2) 1 TATAAAATAT AAATTATATT ATAAATCATG TATTATTTAT AAAATTATAT 51 TATAAATTTA TAAAAATATA AATTATATTT TAGGCTTAAT GTATAAGGAA 101 TATAAATTAT TAATAAGCAT ATGA TAU 12/1(1) 1 TGTAATTAAC TGTNCTTGTA GGTCTGTCTT TTATACATGT GTGAGTTTTT 51 CTTTACAATA GATTCCTAGC ATTGGGATTG CTAGGTCAGA TGGTATGCAC 101 ATTTGACATT TTGATTGATA GCACCAGATT GCTTTGTTAA AAAATTTTNN 151 TTTATAGTTT ACATTATCTT TGTACAATAG ATGTTCTCTT TCGAC TAU 12/2(1) 1 GGGAAGTGAA TTGAAAATAC TTCTTTNTCA ACATAATTTT NGGGTTTTGA 51 AATTGTGTTT GGGTTTTCAG GAAATTGGTG GTAATCTTGT ATTAGACTGAA 101 AAAAAGTGAA TTTTAAAATT CTCAGTGAAG AAGCAAATGA TTTATTTTTC 151 ATAGA TAU12/3(2) 1 TGTTCTGGTA ACTGTTCTAA TTGTGTCTTT GTTACTTCCA GTGCAACCCT 51 TTCAGGTAAG TAU12/3(1) 1 CTAAAGAACT TGGTATCTCT ATTAAAGCAC ACGAACCTCC AAGGAAAATA 51 GAGCGATTTA CTCTTCTCAT ATCAGTGCAT ATTTATAAGA AGCACGGAGT 101 CA TAU13/1(1) 1 AGTCATCAAT TCCTTTTTAT CTGTAATTAC ACATTTGTTT TTATTTCAAA 51 GTAATTATAA GGTGTTATAT TGCATATAAT CAGAAAACTA AATGGAAATA 101 AAATTTTAGT AAGCCCGGCC CCTTTGACCG ATACAGAAAA CTTGA TAU 13/3(2) 1 TATATGGCAG TCTAAAGCAT CAAAGATTTG CATCAACATC TTTCATTTTA 51 GACATCTCCT TGCAATGTAA AATATCATGT ATCAACAACA TCTGGTGCAA 101 ATCCATGAGT CTAACTCGAC ATTCATCTTA GCTCGATTAT TATTCCTTCG 151 TACAGTCGAT GTAAACAATA CAGAAAGAGG ATTATTAAGA ACAGTTT TAU 13/3(1) 1 ATTCATGAAA TGGTCTATAT GCATGATATT GTAAATTCGG ACTCGAAACC 51 GAAACCAAGG ATTCCGTTAC AAAAATTCCT TAATGCTGAG AATGTTCTCA 101 CGCAAACAAC ATCATGGACA TTAAATTCAA GATATGTGAA TGTTAATTCT 151 GTCAATAAAG TCAACGTAAA GAGTAAAGTT AAAAACAGTT ATATCTNNNC 201 TGTCAATGAT GAGTTTAGTT TAACAGATGA TGAATCAATT CT TCO 16/1(C) 1 CAAAGTGTTT TTGGTTTTGA GAGAGAGAGA GATTGAGAGA CAGAGAGAGA 51 GAGAGAAACC AAGGGATCAT GATAGTTATA GTCAAATACG AGGTTGGATT 101 ATCTTTTGAA AATGTGTTGG TTCTGTGATA CAAGAGGAAG CTAAGACATA 151 TCGTGGAAAC ATCTCCCCCC TCCACCTTAA TATCAAGAAC AAATTGTGGA 201 ATCTAATGTT AATGAGAAGT AGTTCCCCAC TGTGTCAGAT G TCO16/2(C) 1 NCATCTGACA CAGTGGGGAA CTACTTCTCA TTAACATTAG ATTCCACAAT 51 TTNNNCTTGA TATTAAGGNN NNNNNGGGAG ATCGTTTCAC GATATCGTCT 101 TAGCTTCCTC TTGTATCACA GAACCAACAC ATTTCAAAAG ATAATCCTTC 151 CTCNNTTTGA CTATAACTAT CATGATCCCT TGGTTCTCTC TCTCTCTCTG 201 CTCTCTCATC TCTCTCTCTC TNAAAACNAA TCO17(C) 1 ACAGTAGTTA GGAGTTTCTT TACTTACAAA ATCACTGGAA ATGATTAAAT 51 TGCTTTTCCC CCTCCCCAGA GGTGCATTTT TCTTATTTCC ATATAGTAAA 101 GTTGAGCTTT TACAGTGCAT AATGTGACAT TTGGAATGCT TATCAACTGC 151 ATGTAAACAT TAATAACCT TCO18(C) 1 GTAAATGGTA TTANNNGCTG AAGAAAAAAA ATTTTTCAAG ACCTCTGTTT 51 TTTAACTGAA CTTTATCATT GGCATTGTGG GCTTTGAAGT TGCTGGGATA 101 AATTAATATA ATTAAATAAA AGACTGAATT TAATTGCAAA AAAAAAAAAA 151 AACAATAAGT GTGGTGAT TCU2/1(1) 1 AAGAAATTAT CCAGTTATTT ACAAGGCCAC TGATATTTTA AACGTCCAAA 51 AGTTTGTTTA AATGGGCTGT TACCGCTGAG AATGATGAGG ATGAGAATGA 101 TGGTTGAAGG TTACATTTTA GGAAATGAAG AAACTTAGAA AATTAATATA 151 AAGACAGTGA TAAATACAAA GAAGATTT TCU2/2(1) 1 CGGGTTAATA TTATCCTCTA GTATAAGTGA ATTACTAGTT TCTCTTTATT 51 TAGACAAACA CACACACACC AGATAATATA AACTTAATAA ATTATCTGTT 101 AATGTAGATT TTATTTAAAA AACTATATTT GAACATTGGT CTTTCTTGGA 151 C TCU9/1(2) 1 ACATAACAGC TTTTATACAA TGATAAGGAC ATATCATTTG TTTACAAAGA 51 AAGTCTAAAA TTTCAAGAAC ATTCAAAGAG CTAACACAGT AAAGGTCATG 101 CAAGTTCTAG AATAGTGAAT CATGACAGAA CTCATTCATT TTATCCTTTA 151 TCTCC TCU9/2(2) 1 AAGTATGGGT AGCTAAATTT GCATTAAATT AAAAGTACAT ATAATGCAAC 51 ACCACTCTAC ATCTGTATAC CTACGAATGT ATGTGTACTA CACACCCTTA 101 AAATGTTTTT CAAAGTCTTA ATATATTAGA ACATGTTTTC ATTTTTTCAT 151 GGGATGTTAA TACTATTCTA TGATTAAGAA AATACTAG TCU10(2) 1 AATACAGTTA TTCTAGCTTT TCATATTCAA TTTGAATGAT CAGAAAAGTA 51 TATTAGTCAC ACAGAATTAA ATATTTTAGA TAGTAAGAAT C TCU14(1) 1 ATCCTTAGTA AGTGGATTTT GGGGAAAAAA GCACCTGGGC TTCTGGTTCT 51 TTTTGATAAT ATATAAAATT ATTCATTATG AGGTTGCAGT TGTTTGCAAA TCU14(2) 1 GAAGTGAAAG TCAGCCCTTT AGCTATTATT TATTGCTTTA TTAGAGCAGA 51 GGGAAGTGAC ACTCATTGCC TTCACAGAGC TCTGCAGAAA TATATGCACA 101 GAGTGGTCAA TGCCAACATC TGAGTAAGTC TTCCAAA TGO20(2) 1 CAGAACATTA GGATTTATTC CTTGATTAGT TCAAATGATT TCAACAGCTG 51 AATTCCTTGA GATGTGTAAG GCAGGTTGGT CCTTTGGATG GACTGTAGAC 101 TGAAACTTCC TATAACTGTA GTGATATGTA CACAGCTACA TAGCAAAGTG 151 CTTCATTATG AAAATGAAGA A TGO20(1) 1 CAGTGTGAGA GTCTCATTTC TATGCACAGT GTTTCTCAGG AGGATGGAGC 51 TAGTTAGCTG TCTGTTGTCT GTAGCCCAGC TTGATAATGG AACTATACAG 101 CGAAGAGACA ATCTCTGGCA AGTTTTTGTA GAA TGU5(C) 1 TTAGAGTAAA ATTCCAAATA AATGCTTTGC TCCAAAATTA CACTAACCAG 51 GCTGGGTCTC TATCATACAT CTTCAATACC CTCAAACCTA GATTGTAAAG 101 TGAAAAAAGT GATTAGCNNT TCCATTTGTT CATTCTGTCA CTCACATTCT 151 TAGGCATTTT AAGGATGAGC AACCTTTGTT TCAGAAAGGG TAAGTAATTA 201 GCCCCCTGGA GGTTACATAG TTATAATTTA GTCTTCAGAA TCCGTTCGAA 251 GGGNNNNGTT ACTATTTTTA AGATAATTAG AACCCACCTT GTAGCAATAA 301 AAGTTTTCTT GTCTTTG TGU8(2) 1 GCGAAAGACT AATCGAACCA TCTAGTAGCT GGTTCCCTCC GAAGTTTCCC 51 TCAGGATA TGU9/1(2) 1 TTAATGTTTA AATACTACTT TTTTTTCAAG CTTGCCCTAG ATACCAACTG 51 TTTATCTAAC ACACAATTCC AGTGTTGCCA AGCCTCATGC CAATTTGAAG 101 GGAACAGCCA AAACTTATGC ATTCATATAA AAAGAGTCTC TAGGCTCTTA 151 TATCTACATT ATAATTTTT TGU9/2(2) 1 GGAATAACAT TTTTTTATGA GGGAACCCTT TAAAATGGAT GCACACAGTG 51 GCATTTTCTC CTAGGCTCAA AGCTGAGTAC ACTCCCGTAA TTTTAATAAT 101 ATTTTAGGCA AGTCCTATGA CAATTATACC AACAAGTTTC TTCAACCCCA 151 CCACCACCCC ACCATCTCTA TGC TGU12(C) 1 GGAGGAAGCT TTATTTGGGA AGAGTGCGGT TCNNTCGGCC CTGATCAGCT 51 CTAGCCTGCC CACCCCATCT CAGCCAGGCG GCTTTACTTC TTCCTGAGCT 101 TCAGGTCTTT CTTCTTCCTG ATTTCCTTGG CCAGCTCCCC AATCAATCTC 151 CAGTACTCAT TGAACTTGAG CTCCGAGNCC TGATTCACAT CCAAGCTCTT 201 CATCTTCT TGU13/1(C) 1 GGATGTGGTA GTTGATCTTT AATGCCCATT CTAGGTCGGA AAAATCCATG 51 ATCCTAACTT TTAAGAGAAG GTTGGTAACT CTACTTAGGA CTTTTTTTTG 101 TAAGAGGAAT AATGTAGCCT CACCCTTATC TTTCTGGAAA TGTTTAAACC 151 ACTGAAATAT GGAGATCAAA TCCAGCTTAC ACACTGGTAA CTCAAATACT 201 ATTTTTTTTT TAAACTATCT TTTCTAAACT AATCACCCCT CTTGTACATA 251 GAACTTTCTA TCTCAGTGCC AATTCTTAGA GGTTGATGCA AACAGCTCTC 301 CAGAGAGCCT GTGCTATTGT TC TGU13/2(2) 1 GGGGTGTACA TTTTATTGGA AACCTTAAAT ACTGTTCAGA AAGAATATAT 51 CTTCAATCAA GGTCTTGCCG AGCCTACACA GAAAAATGAA GCTTTTTGGG 101 TTAGGGGCAA GGATATATAC AGTACAGAGG ACAAAGA TTO16/2(C) 1 ACATTCATTA AAGATGAACT TTCAGCATCT TCACTTGAAG ATCCATCAGA 51 TGATTCTGAG AGGCAGGTCT CCCCCAAAAA TCCACCGCAT GTATTCTTTC 101 GTTTAGAATC TGAAAGCCTC TTTCTTTTCA GGCTTGATGA CTCTTCTAAG 151 GTATTTGTTA TGCCTCTCTT CTGGGTTTTT CGTTTTGCCT TATCAAGTAG 201 CTNAAATTCA AACACCATGG CAANAGAAAC TGCTTCTAT TTO20/1(C) 1 CCACCAGCCT ACTGATCAGC TGGGATGCTC CTGCTGTCAC AGTGAGATAT 51 TACAGGATCA CTTACGGAGA AACAGGAGGA AATAGCCCTG TCCAGGAGTT 101 CACTGTGCCT GGGAGCAAGT CTACAGCTAC CATCAGCGGC CTTAAACCTG 151 GAGTTGATTA TACCATCACT GTGTATGCTG TCACTGGCCG TGGAGACAGC 201 CCCGCAAGCA GCAAGCCAAT TTCCATTAAT TACCGAACAG AAATTGACAA 251 ACCATCCCAG ATGCAAGTGA CCGATGTTCA AGACAACTGT TTTAATAAAA 301 GATTTACATT CCAC TTO20/2(2) 1 TTGGTACCAC AGTCACAGAA CTGGGGGTCA TTTTCTAGAT GAAACAAACG 51 GAACAAGTTC TCTTCCAACA AAGAAATGTA CTGTAGAAAT TAATTTCCTC 101 CATGAATTTT ATATATTGTG TACAAATATA AGGTATGTAT CTGAATACAA 151 AG TTU2/1(2) 1 CTAGAACTTC CAAAGGCTGC TTGTCATAGA AGCCATTGCA TCTATAAAGC 51 AACGGCTCCT GTTAAATGGT ATCTCCTTTC TGAGGCTCCT ACTAAAAGTC 101 ATTTGTTACC TAAACCTTAT GTGCCTTAAC AGGCCAATGC TTCTCG TTU 2/2(C) 1 AACCAGTATT TCAAAACTAT TATCTGGATT CAAGATTAGT GTGTAAAGAT 51 TGTTTTCTTA TCAGTAAAAT AGGTCTTCAG ATCTGCATCT GGCCTCTTAG 101 CATGTTTTTC TTCATAGATA CCCGTTTTGG GGTTTTTGCG TCGGAAGATG 151 AAGTGCAGTT TATAGTCCTC TCCACATTTA TCTG TTU3(1) 1 GGGTAGAAAG CTGAATAATT TATGAAGGAG AGGGGTCAGG GTTGATTCGG 51 GAGGACCTAT TGGTGCGGGG GCTTTGTATG ATTATGGGCG TTGATTAGTA 101 GTAGTTACTG GTTGAACATT GTTTGTTGGT GTATATATTG TAATTGAGAT 151 TGCTCGGGGG AATAGGTTAT GTGATTAGGA GTAGGGTTAG GATGAGTGGG 201 AAG TTU 5/1(2) 1 GACAAAAAAA AAAAAACAGG TTTTAAAGCT AGAAATGAAA AGCTACTTAA 51 GTATCTTAAA GGATAAGTTA CTTTATTATA CACTAGAAAC ATACACAATA 101 GCTGAAAACT TAAAAAATCT CACACTGCTG AATGTCTCTG CTGGCTG TTU5/2(2) 1 GCATCCATTG TACATTGTTT GGTTTGAGGT TACCATGAGG CCTGTAAATA 51 CTATCTTATA ATTTATTATT TCAACCTGAT AAAACTTAAC ACTATTTGCA 101 TAAACAAACA AACGAAAA TTU9/1(1) 1 TAAAATACTG GTTCTTTTAT TCTGCAATAT TTTTAAAAAT CACATTTTCA 51 GCCAGGCGCA GTTTCCCACA CCTGTAATCC GGCACTTTGG GAGGCTGAGA 101 TGGGTGGATC ACAAGGTAGG AGATCAAACA TCCTGGCCAA CATGGTGAAC 151 CTGTTTACT TTU9/2(2) 1 CAAGTATGGG TAGCTAAATT TGCATTAAAT TAAAAGTACA TATAATGCAA 51 CACCACTCTA CATCTGTATA CCTACGAATG TATGTGTACT ACACACCCTT 101 AAATGTTTCA AAGCTTAATA TATTAGAACA TGTTTTCATT TTCAGGGAG TTU13(2) 1 GGAAATACAC TAGCATGTGA GCACTGTATA TAAAGCTTGA GGTTAGGAGG 51 TAAAATGAAA GAAATCATTT TTAACTCCTA AGATGT および TTU13(1) 1 TGAATTAAAT GGACTCGTTG AAAGGACAAG GAGATCGGTA ATATCTCTCT 51 AAAGAACTTA TATACTAAAA TCTGTAATTG CCTGTACCAA AAGTTTTAGT 101 CTTCTTTT。
11. 【請求項１１】請求項１０に記載のＤＮＡを含んでな
    る、ベクター。
12. 【請求項１２】請求項１１に記載のベクターを含んでな
    る、宿主細胞。
13. 【請求項１３】下記の工程を含んでなる、ＩＬ−１βで
    軟骨細胞を処理することによって誘導可能な遺伝子の単
    離法： (a) 目的遺伝子を含むＤＮＡまたはＲＮＡに対してス
    トリンジェント条件下で請求項１０に記載のＤＮＡをハ
    イブリダイゼーションし、そして (b) 目的遺伝子を単離する。
14. 【請求項１４】前記ＤＮＡまたはＲＮＡをＩＬ−１βで
    処理した軟骨細胞、特にヒト軟骨細胞、から単離する、
    請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】下記の工程を含んでなる、請求項１３ま
    たは１４に記載の方法によって単離した遺伝子の発現
    法： (a) 前記遺伝子を好適な発現ベクター中にクローニン
    グし、そして (b) この遺伝子を好適な宿主細胞で発現させる。
16. 【請求項１６】下記の工程を含むタンパク質の産生法。 (a) 請求項１０に記載のＤＮＡまたは請求項１３また
    は１４に記載の方法によって産生される遺伝子を含む好
    適な宿主細胞を培養し、そして (b) 発現したタンパク質を単離する。
17. 【請求項１７】請求項１０に記載のＤＮＡもしくはその
    部分、または請求項１３もしくは１４に記載の方法によ
    って単離された遺伝子もしくはその部分を含む、診断助
    剤。
18. 【請求項１８】ＩＬ−１βが介在した結合組織の疾患、
    特に変形性関節症または慢性関節リウマチの診断、予防
    または治療のための、請求項１０に記載のＤＮＡもしく
    はその部分、または請求項１３もしくは１４に記載の方
    法によって単離された遺伝子もしくはその部分の使用。
19. 【請求項１９】医薬の製造のための、請求項１３または
    １４に記載の方法によって単離された遺伝子の使用。