JPH08169846A - Ｉｌ−６産生に起因する疾患の治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＩＬ−６産生に起因する疾患の新規な予防・
治療剤の提供。 【構成】 インターロイキン−６レセプターに対する抗
体（ＩＬ−６Ｒ抗体）を含んで成る、インターロイキン
−６の産生に起因する疾患の予防治療剤。ＩＬ−６Ｒ抗
体としては、マウス、ラット等のヒト以外の動物の抗
体、これらとヒト抗体とのキメラ抗体、再構成ヒト抗体
等が使用できる。 【効果】 ＩＬ−６産生に起因する疾患として、例えば
プラズマサイト−シス、抗ＩｇＧ１血症、貧血、腎炎等
の予防・治療のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はインターロイキン−
６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）に対する抗体（抗ＩＬ−６
Ｒ抗体）を含んで成る、インターロイキン−６（ＩＬ−
６）の産生に起因する疾患の予防又は治療剤に対する。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−６は多機能性を有するサイトカイ
ンで、免疫、血液、急性期反応等の様々な段階で作用し
〔Taga, T.ら、Critical Reviews in Immunol.1992;11:
265-280.〕、多発性骨髄種の増殖因子として作用するに
加え種々の疾患、例えば、リウマチ〔Hirano, T.ら、Eu
r J Immunol.1988;18:1797-1801; Houssiau, F.A. らAr
th Rheum.1988;31:784-788. 〕Castleman's disease
〔Yoshizaki, K. らBlood1989;74:1360-1367; Brant,
S.J.らJ Clin Invest.1990;86:592-599.〕のようなプラ
ズマサイト−シスがみられる病気、あるいはメサンギウ
ム細胞増殖性腎炎〔Ohta, K.らClin Nephrol.(Germany)
1992;38:185-189; Fukatsu, A.らLab Invest.1991;65:6
1-66; Horii, Y. らJ Immunol.1989;143:3949-3955.
〕、腫瘍増殖に伴う悪液質〔Strassmann, G.らJ Clin
Invest.1992;89:1681-1684.〕などでも重要な役割をは
たしていると考えられている。

【０００３】遺伝子操作によってｈｕｍａｎ ＩＬ−６
（ｈＩＬ−６）を過剰発現させたＨ−２Ｌ^d ｈＩＬ−６
トランスジェニックマウス（ＩＬ−６ Ｔｇｍ）ではＩ
ｇＧ１プラズマサイト−シス、メサンギウム増殖性腎
炎、貧血、血小板減少症、自己抗体の出現などが観察さ
れ〔宮井達也ら：第２１回日本免疫学会発表「Ｈ−２Ｌ
^d ｈＩＬ−６トランスジェニックマウスの加齢に伴う血
液および血清学的変化」；１９９１〕、ＩＬ−６の多彩
な疾患に対する関与が示唆された。しかしながら、イン
ターロイキン−６レセプターに対する抗体が、インター
ロイキンの生産に対する疾患に対して有効であることは
知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、イン
ターロイキン−６の生産に起因する疾患の予防又は治療
剤を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明はインターロイキン−６レセプターに対する
抗体を含んで成る、インターロイキン−６の生産に起因
する疾患の予防又は治療剤を提供する。インターロイキ
ン−６の生産に起因する疾患としては、例えばプラズマ
サイト−シス、例えばリウマチ、キャスルマン病（Ｃａ
ｓｔｌｅｍａｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）；高イムノグロ
ブリン血症；貧血；腎炎、例えばメサンギウム増殖性腎
炎；悪液質等が挙げられる。

【０００６】本発明で使用されるＩＬ−６レセプター抗
体は、ＩＬ−６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６
の生物学的活性を阻害するものであれば、その由来およ
び種類（モノクローナル、ポリクローナル）を問わない
が、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし
い。この抗体はＩＬ−６Ｒと結合することにより、ＩＬ
−６とＩＬ−６Ｒの結合を阻害して、ＩＬ−６のシグナ
ル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生物学的活性を阻害する抗
体である。

【０００７】モノクローナル抗体の産生細胞の動物種は
哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以
外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由
来のモノクローナル抗体としては、その作成の簡便さか
らウサギあるいはげっ歯類由来のモノクローナル抗体が
好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マ
ウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。

【０００８】このようなＩＬ−６レセプター抗体として
は、ＭＲ１６−１抗体（Tamura, T.ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.90,11924-11928,1993）、ＰＭ−１抗体（H
irata, Y.ら、J.Immunol.143,2900-2906,1989）などが
挙げられる。モノクローナル抗体は、基本的には公知技
術を使用し、以下のようにして作成できる。すなわち、
ＩＬ−６Ｒを感作抗原として使用して、これを通常の免
疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の
細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のス
クリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞
をスクリーニングすることによって作成できる。

【０００９】より具体的には、モノクローナル抗体を作
成するには次のようにすればよい。例えば、前記感作抗
原としては、欧州特許出願公開番号ＥＰ３２５４７４号
に開示されたヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を用いること
によって得られる。ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列を公知
の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換
させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的
のＩＬ−６Ｒタンパク質を精製し、この精製ＩＬ−６Ｒ
タンパク質を感作抗原として用いればよい。また、マウ
ス由来の前記感作抗原としては、日本特許出願公開番号
特開平３−１５５７９５に開示されたマウスＩＬ−６Ｒ
の遺伝子配列を用い、上記ヒトＩＬ−６Ｒの遺伝子配列
を用いたのと同様な方法にしたがえばよい。

【００１０】ＩＬ−６Ｒは細胞膜上に発現しているもの
の他に細胞膜より離脱している可能性のもの（ｓＩＬ−
６Ｒ）が抗原として使用できる。ｓＩＬ−６Ｒは細胞膜
に結合しているＩＬ−６Ｒの主に細胞外領域から構成さ
れており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細
胞内領域が欠損している点で膜結合型ＩＬ−６Ｒと異な
っている。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特
に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細
胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的
にはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用され
る。

【００１１】感作抗原を動物に免疫するには、公知の方
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物に腹腔内または、皮下に注射するこ
とにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日
毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時
に適当な担体を使用することができる。

【００１２】このように免疫し、血清中に所望の抗体レ
ベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細
胞が取り出され、細胞融合に付されるが、好ましい免疫
細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞
と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエロー
マ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３
（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）(J.Immunol.123:1548, 1
978), ｐ３−Ｕ１ (Current Topics in Micro-biology
and Immunology 81:1-7, 1978), ＮＳ−１ (Eur.J.Immu
nol.6:511-519, 1976), ＭＰＣ−１１ (Cell, 8:405-41
5, 1976): ＳＰ２／０ (Nature, 276:269-270, 1978),
ＦＯ (J.Immunol.Meth.35:1-21, 1980),Ｓ１９４ (J.Ex
p.Med.148:313-323,1978), Ｒ２１０ (Nature, 277:131
-133, 1979)等が好適に使用される。

【００１３】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインら
の方法 (Milsteinら、Methods Enzymol.73:3-46, 1981)
等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細
胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養
培養中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（Ｈ
ＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用する
こともできる。

【００１４】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合
は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１
０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液
としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適
なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、この他、そ
の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能で
あり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併
用することもできる。

【００１５】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７
℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０
００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％
（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的
とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続い
て、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去す
る操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好
ましくない細胞融合剤等を除去できる。

【００１６】当該ハイブリドーマは、通常の選択培養
液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノブ
テリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することに
より選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的と
するハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅す
るのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。つい
で、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生
するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クロー
ン化が行われる。

【００１７】このようにして作成されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に移植して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。

【００１８】さらに、前記の方法により得られるモノク
ローナル抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニテイー
クロマトグラフィー法等の通常の精製手段を利用して高
純度に精製することができる。このようにして、作成さ
れるモノクローナル抗体は、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗
体法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）等の通常の免疫学的手段により抗原を高感
度かつ高精度で認識することを確認することができる。

【００１９】本発明に使用されるモノクローナル抗体
は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限
られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下さ
せること等を目的として人為的に改変したものであって
よい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスの
モノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と
からなるキメラ抗体を使用することができ、このような
キメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝
子組換技法を用いて製造することができる。

【００２０】さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）した
ヒト抗体を本発明に用いることができる。これはヒト以
外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域に
よりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、
その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知
方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型抗体を得る
ことができる。

【００２１】なお、必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補
性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体
の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を
置換してもよい（Satoら、Cancer Res.53:1-6, 1993)。
このような再構成ヒト抗体としてヒト型化ＰＭ−１（ｈ
ＰＭ−１）抗体が好ましく例示される（国際特許出願公
開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）。

【００２２】さらには抗原に結合し、ＩＬ−６の活性を
阻害するかぎり抗体の断片、たとえばＦａｂあるいはＦ
ｖ，Ｈ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシ
ングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を
構築し、これを適当な宿主細胞で発現させ、前述の目的
に使用することができる。（例えば、Birdら、TIBTECH,
9:132-137, 1991; Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A, 85, 5879-5883, 1988 を参照) 。さらに、ｓｃＦｖ
を作成するために用いるＨ鎖およびＬ鎖のＦｖには、上
記再構成された抗体のＶ領域を用いることができる。

【００２３】本発明のＩＬ−６レセプター抗体を有効成
分とするＩＬ−６の生産に起因する疾患の予防治療剤
は、ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６の生産
に起因する疾患に有効である限り、本発明において使用
することができる。本発明の予防治療剤は、好ましくは
非経口的に、たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔
内注射、皮下注射等により全身あるいは局部的に投与す
ることができる。さらに、少なくとも一種の医薬用担体
または希釈剤とともに医薬組成物やキットの形態をとる
ことができる。

【００２４】本発明の予防治療剤のヒトに対する投与量
は患者の病態、年齢あるいは投与方法により異なるが、
適宜適当な量を選択することが必要である。例えば、お
よそ１−１０００mg／患者の範囲で４回以下の分割用量
を選択することができる。また、１−１０mg／kg／週の
用量で投与することができる。しかしながら、本発明の
予防治療剤はこれらの投与量に制限されるものではな
い。

【００２５】本発明の予防治療剤は常法にしたがって製
剤化することができる。たとえば、注射用製剤は、精製
されたＩＬ−６Ｒ抗体を溶剤、たとえば、生理食塩水、
緩衝液などに溶解し、それに、吸着防止剤、たとえば、
Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）などを加えたものであり、または、使用前に溶解再
構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結
乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブド
ウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができ
る。

【００２６】

【実施例】以下、参考例、および実施例により本発明を
具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。参考例１． Ｂ６Ｌ^d −ＩＬ−６トランスジェニックマ
ウスの作製 Ｈ−２Ｌ^d プロモーターと連結したヒトＩＬ−６ｃＤＮ
Ａを含有する３．３kbp のＳｐｈＩ−ＸｈｏＩ断片（Ｌ
^d −ＩＬ−６）（Suematsuら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,86,7547,1989）を、Yamamuraら、J.Biochem.96,35
7,1984 に記載されている方法に従ってＣ５７ＢＬ／６
Ｊ（Ｂ６）マウス（日本クレア）からの受精卵の前核に
マイクロインジェクションにより注入した。

【００２７】その受精卵を、疑妊娠処置した雌性ＩＣＲ
マウスの卵管内に移植した。その後、生まれたマウスに
ついて、ヒトＩＬ−６ｃＤＮＡの組込みをＥｃｏＲＩ消
化した尾部ＤＮＡのサザンブロット分析により、プロー
ブとしてヒトＩＬ−６ｃＤＮＡの³²Ｐ−標識ＴａｑＩ−
ＢａｎII断片を用いてスクリーニングした。組込みが認
められた個体とＢ６マウスを交配して同じ遺伝子型を持
つマウスのラインを確立した。

【００２８】参考例２． ラット抗ＩＬ−６Ｒ抗体の調
製 マウス可溶性ＩＬ−６Ｒ生産性ＣＨＯ細胞を Saitoら、
J.Immunol.147,168-173,1991に記載されているようにし
て調製した。この細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
を含有するαＭＥＭ中で３７℃にて、空気中５％ＣＯ₂
の加湿雰囲気下で培養した。馴化 (ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｅｄ）培地を回収し、そしてマウスｓＩＬ−６Ｒ調製物
として使用した。培地中のマウスｓＩＬ−６Ｒの濃度
は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗
マウスＩＬ−６Ｒ抗体ＲＳ１５（Saito ら、J.Immunol.
147,168-173,1991）及びラビットポリクローナル抗−マ
ウスＩＬ−６Ｒ抗体を用いて測定した。

【００２９】マウスｓＩＬ−６ＲをマウスｓＩＬ−６Ｒ
調製物から、モノクローナル抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体
（ＲＳ１２）を吸着させたアフィニテイーカラムにより
精製した。フロインドの完全アジュバント中５０μｇの
精製マウスｓＩＬ−６ＲによりＷｉｓｔｅｒラットを皮
下注射免疫し、次に２週間後から１週間に１回、フロイ
ンドの不完全アジュバント中５０μｇのマウスｓＩＬ−
６Ｒにより４回皮下に追加免疫した。最後の追加免疫か
ら１週間後、ラットに１００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）中５０μｇのマウスｓＩＬ−６Ｒを静脈内投与し
た。

【００３０】３日後にラットより脾臓を摘出し、そして
ポリエチレングリコール（ベーリンガーマンハイム）を
用いて、ラットの脾細胞とマウスｐ３Ｕ１ミエローマ細
胞とを１０：１の比で融合処理した。９６−ウエルプレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ３０７５）のウエル中３７℃にて、
１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地１００μ
ｌ中で一夜インキュベートした後、ヒトＩＬ−６を含有
するヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡ
Ｔ）含有培地１００μｌを各ウエルに添加した。４日間
にわたり毎日、培地の半分をＨＡＴ培地により置換し
た。

【００３１】７日後、抗マウスｓＩＬ−６Ｒを産生する
ハイブリドーマをマウスｓＩＬ−６Ｒ−結合アッセイ
（ＥＬＩＳＡ）により選択した。要約すれば、ハイブリ
ドーマの培養上清１００μｌを６０分間、ラビットポリ
クローナル抗−ラットＩｇＧ抗体を１μｇ／mlでコート
したプレート中でインキュベートした。プレートを洗浄
し、そして１００μｇ／mlのマウスｓＩＬ−６Ｒと共に
インキュベートした。洗浄後、ラビットポリクローナル
抗−マウスＩＬ−６Ｒ抗体を２μｇ／mlで加え、そして
プレートを洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ−
結合ヤギポリクローナル抗−ラビットＩｇＧ抗体（Ｔａ
ｇｏ）と共に６０分間インキュベートした。

【００３２】最後に、洗浄後、プレートを、アルカリホ
スファターゼの基質（Ｓｉｇｍａ１０４；ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート）と共にインキュベートし、そして
４０５nmにてプレートリーダー（東ソー）を用いて読み
取った。マウスｓＩＬ−６Ｒを認識するハイブリドーマ
を限界希釈法により２回クローニングした。腹水の作製
のため、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに０．５mlの
プリスタンを２回注射し、そして３日後に３×１０⁶ 個
の樹立されたハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。１
０〜２０日後に腹水を集め、そして腹水からプロテイン
Ｇカラム（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い
てモノクローナル抗体ＭＲ１６−１を精製した。

【００３３】ＭＲ１６−１により生産された抗体のＩＬ
−６に対する中和効果を、ＭＨ６０．ＢＳＦ２細胞 (Ma
tsuda ら、Eur.J.Immunol.18:951-956, 1988) による ³
Ｈ−チミジンの取り込みにより試験した。ＭＨ６０．Ｂ
ＳＦ２細胞を９６−ウエルプレートに１×１０⁴ 細胞／
２００μｌ／ウエルの量で分配し、マウスＩＬ−６（１
０pg／ml）とＭＲ１６−１又はＲＳ１２抗体とをウエル
に加え、そして細胞を３７℃にて５％ＣＯ₂ 中で４４時
間培養した。次に、各ウエルに ³Ｈ−チミジン（１ mci
／ウエル）を加え、４時間後に ³Ｈ−チミジンの取り込
みを測定した。

【００３４】実施例１．参考例１において作製したＢ６
ＩＬ−６トランスジェニックマウス（Ｂ６ＩＬ−６
Ｔｇｍ）を自家繁殖したヒトＩＬ−６ ｃＤＮＡを持つ
トランスジェニックマウス３１匹及びヒトＩＬ−６ ｃ
ＤＮＡを持たない正常同腹仔１１匹（いずれも４週齢；
雄性）を用いた。Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍは６匹づつ５
群（第１〜５群）に分け、第１群のみ７匹とした。また
正常同腹仔に第６群５匹及び第７群６匹に分けた。

【００３５】投与スケジュールは次の通りとした。 第１群（Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍ）：４週齢（実験第１
日）にラットＩｇＧ１抗体（ＫＨ５）（対照抗体）を２
mg／０．２ml静脈内注射し、５週齢（実験第８日）以
降、週２回づつ（３ないし、４日毎）１００μｇのＫＨ
５抗体を皮下注射した。 第２群（Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍ）：４週齢にＭＲ１６
−１抗体を２mg／０．２ml静脈内注射し、５週齢以後週
２回づつ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射した。

【００３６】第３群（Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍ）：４週
齢にリン酸緩衝液０．２mlを静脈内注射し、そして５週
齢以降週２回づつ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射
した。 第４群（Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍ）：４週齢に２mg／
０．２mlのＭＲ１６−１を静脈内注射し、そして５週齢
以降２週間ごとに４００μｇのＭＲ１６−１を皮下注射
した。

【００３７】第５群（Ｂ６ ＩＬ−６ Ｔｇｍ）：４週
齢に２mg／０．２mlのＭＲ１６−１を静脈内注射し、そ
して５週齢以降２週間ごとに１mgのＭＲ１６−１を皮下
注射した。 第６群（Ｂ６ 同腹仔）：４週齢に対照抗体ＫＨ５を２
mg／０．２ml静脈内注射し、そして５週齢以降週２回づ
つ１００μｇのＫＨ５を皮下注射した。 第７群（Ｂ６ 同腹仔）：４週齢に２mg／０．２mlのＭ
Ｒ１６−１を静脈内注射し、そして５週齢以降週２回づ
つ１００μｇのＭＲ１６−１を皮下投与した。

【００３８】本発明において使用した試験方法は次の通
りである。体重および尿蛋白測定 ：毎週体重測定ならびに尿蛋白試
験紙（Ｃｏｍｂｉｓｔｉｃｓ三共）による尿蛋白測定を
行った。尿蛋白は３＋（１００−３００mg／dl）以上を
陽性とした。採血 ：実験開始時（４週齢）より隔週に眼窩静脈叢より
採血を行い、実験終了時（１８週齢）には後大静脈より
全採血を行った。

【００３９】血球数測定：ｍｉｃｒｏ ｃｅｌｌ ｃｏ
ｕｎｔｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ｆ−８００）により、白血
球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）、血小板数（ＰＬ
Ｔ）ならびにヘモグロビン量（ＨＧＢ）を測定した。ま
た、実験終了時には一部の群（１，２，６，７群）につ
いて血液塗抹標本を作製し、白血球分画を行って百分比
を算出した。

【００４０】血中ＩｇＧ１濃度測定：ｓｔａｎｄａｒｄ
としてｍｙｅｌｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎを用いたマウス
ＩｇＧ１特異的ＥＬＩＳＡで測定を行った。血中ｈＩＬ−６濃度測定 ：ｈＩＬ−６特異的ＥＬＩＳＡ
で測定を行った。血中抗ラットＩｇＧ抗体価（ＩｇＧ ｃｌａｓｓ）測
定 ：投与抗体はマウスにとって異種抗体であるため投与
抗体に対する抗体産生の有無をラットＩｇＧを抗原とし
たＥＬＩＳＡで測定を行った。測定はラット抗体を投与
されたａｄｕｌｔのＩＬ−６ Ｔｇｍ血清をｓｔａｎｄ
ａｒｄとし、ユニット化して表示した。

【００４１】血清生化学値の測定 実験終了時の１，２，３，６および７群のマウスの血清
について、総蛋白質（ＴＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、
グルコース（Ｇｌｕ）、トリグリセライド（ＴＧ）、ク
レアチニン（ＣＲＥ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、カル
シウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）、グルタミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ
（ＧＯＴ）およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（ＧＰＴ）の各値をオートアナライザー（ＣＯ
ＢＡＳ ＦＡＲＡII，Ｒｏｃｈｅ社）で測定した。

【００４２】骨髄および脾細胞のＦＡＣＳによる解析：
実験終了時に１，２，６，７群各１匹づつの骨髄ならび
に脾細胞を採取し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッ
キンソン）による細胞表面抗原の解析を実施した。使用
した抗体は各々Ｇｒ−１（骨髄細胞）、ＣＤ４，ＣＤ
８，Ｂ２２０（脾細胞）に対する抗体（ファーミンジェ
ン社）である。剖検 ：実験終了時に剖検を実施し、脾重量の測定ならび
に主要臓器の肉眼的観察を行った。

【００４３】結果体重 ：各群の体重推移を図１に示した。１群および３群
では体重増加が観察された。他の群には体重変化の違い
は観察されなかった。尿蛋白 ：１群では１３週齢より尿蛋白陽性個体が出現し
（図２）、剖検時までに７匹中４匹（１６週齢で２匹、
１７週齢で２匹）が死亡したが他の群では死亡例は観察
されなかった。３群でも実験終了時までに６例中２例で
尿蛋白陽性個体が出現したが、それ以外の群では認めら
れなかった。

【００４４】血液学的所見：１群では、ヘモグロンビン
量（図３）および赤血球数（図４）の減少が認められ、
加齢とともにその程度は著しいものとなった。血小板数
（図５）は一端増加したのち急激に減少した。３群で
は、１群よりやや遅れて同様の傾向が観察された。一
方、２，４，５群では何れの群においてもヘモグロビン
量、赤血球数の減少、血小板数の増加およびそれに続く
減少は認められなかった。末梢血塗抹による白血球分画
の観察では、１群で好中球および単球の増加、それにと
もなうリンパ球比率の減少が認められたが２群はほぼ正
常値を示した（表１）。また、６群と７群の間には有意
な差は存在しなかった。

【００４５】

【表１】

【００４６】血中ＩｇＧ１濃度：１群では、実験開始直
後より著明な血中ＩｇＧ１濃度の上昇が観察され最終的
には正常マウスの１００倍程度の濃度に達した（図
７）。３群は１群よりやや遅れてＩｇＧ１濃度の上昇が
観察された。これに対し、２，４，５群ではＩｇＧ１濃
度の上昇は観察されず、実験期間中ほぼ一定の濃度であ
った。また、正常マウスでは抗体投与にともなう変化は
観察されなかった。

【００４７】血中ｈＩＬ−６濃度：血中ｈＩＬ−６濃度
（図８）は、ＩｇＧ１と同様に推移し、１群および３群
で血中濃度の上昇が観察されたのに対し、他の群では実
験期間中ほぼ一定であった。血中抗ラットＩｇＧ抗体価 ：１，３および６群ではラッ
トＩｇＧに対する抗体が検出された（表２）。１および
３群では全例高い抗体価を示したが、６群で抗体価が上
昇していたのは５匹中２匹であった。一方、その他の群
では有意の上昇は観察されなかった。

【００４８】

【表２】 血清生化学値の測定 １群と３群は、ＴＰの増加とＡｌｂの減少が認められ
た。ＴＧとＡＬＰは、１群と３群で低下し、１群ではＧ
ｌｕの低下もみられた。２群ではこれらの変化はみられ
なかった。

【００４９】

【表３】 ＦＡＣＳによる解析：１，２，６，７群のＦＡＣＳによ
る骨髄細胞（ＢＭ）および脾細胞（ｓｐ）の解析を行っ
たところ１群のＢＭ細胞では顆粒球系前駆細胞であるＧ
ｒ−１陽性細胞の比率が極端に増加していた（図９、図
１０）が２群では同腹仔と同様の値を示した。また、６
群と７群の間にはほとんど差がなかった。ｓｐ中のＣＤ
４，ＣＤ８，Ｂ２２０陽性細胞の比率は１群で形質細胞
の増加によるＣＤ８およびＢ２２０陽性細胞の減少が認
められた以外は各群間に差は認められなかった（表
４）。

【００５０】

【表４】

【００５１】剖検所見：１群および３群では、全身リン
パ節の腫脹、脾臓の膨張が顕著であり（図１１）、腎臓
の退色も著明であった。一部、肝臓の腫大も観察され
た。これらの変化はその他の群では観察されず、２，
４，５群は同腹仔とくらべて脾臓が軽度に腫脹している
以外は著変はみられなかった。次に、この実験の結果を
説明する。コントロール抗体投与ＩＬ−６ Ｔｇｍ（１
群）では、ＩｇＧ１プラズマサイト−シス、貧血、血小
板増加、血小板減少、腎不全、血清生化学値の異常など
多彩な病態が観察されたが、これらの発症をＭＲ１６−
１はほぼ完全に抑制し得ることが明らかとなった。

【００５２】ＩＬ−６はＢ細胞を形質細胞へ最終分化さ
せることが知られており〔Muraguchi, A. らJ Exp Med.
1988;167:332-344. 〕、ＩＬ−６ ＴｇｍはＩＬ−６産
生により、血中のＩｇＧ１濃度が上昇し、血清中のＴＰ
値の増加およびＡｌｂ値の低下がみられた。これらのこ
とは、ＩｇＧ１プラズマサイト−シスが発症したことを
示している。

【００５３】これに伴い、全身のリンパ節や脾臓などの
リンパ系組織が著明に腫大することが、１および３群で
病状進行により全身状態が悪化しているにも関わらず体
重増加が観察された原因であろう。ＭＲ１６−１はこれ
らの症状を完全に抑制すると同時に血中ＩＬ−６濃度の
増加も抑制した。したがって、ＩＬ−６ Ｔｇｍで認め
られる加齢に伴う血中ＩＬ−６濃度の増加はプラズマサ
イト−シスの進行と直接関係していることが確認され
た。すなわち、増殖した形質細胞自身がＩＬ−６を盛ん
に産生することによってさらに形質細胞が増殖し、結果
的にＩＬ−６が大量に産生されることにあると考えられ
た。

【００５４】ＩＬ−６の血液系に対する作用としては、
血小板増加作用〔Ishibashi, T. らProc Natl Acad Sci
USA 1989;86:5953-5957; Ishibashi, T. らBlood 198
9;74:1241-1244.〕や小球性貧血を引き起こす作用〔Haw
ley, R.G.らJ Exp Med.1992;176:1149-1163. 〕が知ら
れている。ＩＬ−６ Ｔｇｍではこれらに加えて多クロ
ーン性Ｂ細胞活性化（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｂ ｃｅ
ｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）進行に関連した自己免疫
性と考えられる〔宮井達也ら、前掲〕、加齢に伴う血小
板減少が観察される。

【００５５】ＭＲ１６−１はこのようなＩＬ−６の直接
および間接的な血球系に対する作用を完全に抑制したが
同腹仔の血球数には影響しなかった。したがって、正常
状態において抗ＩＬ−６レセプター抗体は血球系になん
ら影響を及ぼさないことが確認できた。また、ＩＬ−６
Ｔｇｍでは骨髄中の顆粒球系前駆細胞と考えられるＧ
ｒ−１陽性細胞比率の増加および末梢好中球比率の増加
が観察された。ＩＬ−６が好中球を増加させることは知
られているもののその詳細な機序は未だ明らかになって
いない。今回の検討でこの作用が骨髄の前駆細胞レベル
ですでに起こっている現象であることが判明した。ここ
でもＭＲ１６−１はＩＬ−６の作用を完全に抑制し、骨
髄と末梢血中の好中球レベルには影響を与えなかった。

【００５６】ＭＲ１６−１はＩＬ−６ Ｔｇｍで観察さ
れる腎炎の発症も抑制した。ＩＬ−６はメサンギウム細
胞のオートクライン増殖因子としてメサンギウム増殖性
腎炎の発症に密接に関与していると報告されており、Ｉ
Ｌ−６ Ｔｇｍの腎炎も組織学的にメサンギウム増殖性
腎炎であることが確認されているが、ＩＬ−６によって
亢進された免疫系の関与も否定できない〔勝目朝夫ら：
第２１回日本免疫学会発表「ＳＣＩＤ×（ＳＣＩＤ×Ｈ
−２Ｌ^d ｈＩＬ−６ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓ
ｅ）マウスの特性」；１９９１〕。いずれにしても今回
の実験で尿蛋白出現および腎炎による死亡の抑制がみら
れたことから、ＩＬ−６産生に起因する腎炎発症の抑制
に抗ＩＬ−６レセプター抗体が有効であることが明らか
となった。

【００５７】ＩＬ−６ Ｔｇｍでは、悪液質の指標であ
る血清中Ｇｌｕ値とＴｇ値の著しい低下が観察された。
今回の実験では、１群ではＧｌｕ値とＴｇ値が低下し、
２群ではこれらの値がほぼ正常と同程度に回復したこと
から、ＭＲ１６−１抗体の投与が悪液質の改善に効果が
あることが示された。ＭＲ１６−１はラットＩｇＧ１
で、マウスにとっては異種蛋白であるため投与抗体に対
する抗体が産生され投与抗体が無効になることが容易に
想像される。

【００５８】今回の実験では初回感作時に大量の抗原に
暴露されることによって免疫学的寛容が誘導されること
を期待して初回に２mg／ｍｏｕｓｅの抗体を静脈内投与
した群を設定した。ＭＲ１６−１投与群の内この処置を
施した群（２，４，５群）では投与間隔、投与量に関係
なく抗ラットＩｇＧ抗体は検出されず、完全な発症抑制
効果が観察されたが、３群は抗ラットＩｇＧ抗体が上昇
しコントロール抗体投与群である１群よりやや発症が遅
れたのみで結局は同様の病態を呈した。

【００５９】したがって、この処置が免疫学的寛容誘導
に有効であったと考えられるが、抗ラットＩｇＧ抗体は
同様のスケジュールでコントロール抗体を投与した１群
の全例および６群の２／５例でも検出された。ＩＬ−６
Ｔｇｍはプラズマサイト−シスが進行するとｐｏｌｙ
ｃｌｏｎａｌ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎが
起こるため、１群および３群で検出された抗ラットＩｇ
Ｇ抗体が投与抗体特異的抗体であると断定はできない
が、２，４，５群では初回感作時に大量の抗原に暴露さ
れたことによる免疫学的寛容誘導効果と大量のＭＲ１６
−１投与による特異抗体産生抑制作用〔斉藤浩之ら、前
掲〕とが相まって完全な寛容が誘導されたのではないか
と考えられた。今回の実験で、抗ＩＬ−６レセプター抗
体が正常レベルには影響を与えずにＩＬ−６産生に起因
する種々の疾患に対して極めて有効であることが明らか
となった。

【００６０】実施例２．ｃｏｌｏｎ２６誘導悪液質モデ
ルに対するマウスＩＬ−６レセプター抗体の効果を検討
した。マウスは６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃを用い、実験
開始日にｃｏｌｏｎ２６の２mm角のブロックをマウスの
側腹部皮下に移植した。マウスＩＬ−６レセプター抗体
ＭＲ１６−１（参考例２参照）は、実験開始日のｃｏｌ
ｏｎ２６移植直前に２mg／マウスを静脈内投与し、それ
以降７，１１，１４，１８日目に０．５mg／マウスを皮
下投与した（ｎ＝７）。

【００６１】この方法では、異種蛋白のラット抗体に対
する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認し
ている。なお、担癌コントロール群には、ラットＩｇＧ
ｌコントロール抗体（ＫＨ５）を同様のスケジュールで
投与した（ｎ＝７）。また、非担癌コントロール群とし
てＰＢＳ投与群を設置した（ｎ＝７）。実験開始後、連
日体重を測定し、実験開始１１および１５日目に血清生
化学的値および血中イオン化カルシウム濃度を測定し
た。

【００６２】担癌コントロール群では、１０日目以降、
非担癌コントロール群に比べ著明な体重減少が観られた
が、ＭＲ１６−１投与群では部分的な体重減少抑制効果
を示した（図１２）。１１日目の血中トリグリセリド濃
度および１５日目の血中グルコース濃度を各々、図１
３、図１４に示す。これらの値は担癌コントロール群で
は非担癌コントロール群に比べ顕著に減少したが、ＭＲ
１６−１投与群では、グルコースについては抑制傾向
が、トリグリセリドについては有意な抑制効果が観察さ
れた。

【００６３】１１日目の血中イオン化カルシウム濃度
は、担癌コントロール群で非担癌コントロール群に比べ
顕著に上昇したが、ＭＲ１６−１投与群では有意な抑制
効果を示した（図１５）。上記実験と同様のスケジュー
ルで延命効果を確認する実験を行った（ｎ＝１０）。そ
の結果、ＭＲ１６−１投与群では、延命効果があること
が認められた（図１６）。

【００６４】実施例３．高カルシウム血症を伴うｏｃｃ
−１誘導悪液質モデルに対するＩＬ−６レセプター抗体
の効果を検討した。マウスは、６週齢の雄性ヌードマウ
スを用い、実験開始日にヒト口腔底癌細胞株ｏｃｃ−１
をマウスの側腹部皮下に移植した。マウスＩＬ−６レセ
プター抗体ＭＲ１６−１（参考例２参照）は、実験開始
日のｏｃｃ−１移植直前に２mg／マウスを静脈内投与
し、それ以降７および１０日目に１００μｇ／マウスを
皮下投与した。（ｎ＝６）。

【００６５】この方法では、異種蛋白のラット抗体に対
する中和抗体が出現しづらいことを以前の実験で確認し
ている。なお、担癌コントロール群には、ラットＩｇＧ
ｌコントロール抗体（ＫＨ５）を同様のスケジュールで
投与した（ｎ＝６）。また、非担癌コントロール群とし
てＰＢＳ投与群を設置した（ｎ＝７）。実験開始１０お
よび１２日目に体重および血中イオン化カルシウム濃度
を測定した。担癌コントロール群では、体重減少が観察
されたが、ＭＲ１６−１投与群では非担癌コントロール
群と同様の体重の推移を示し、体重減少が抑制された
（図１７）。血中イオン化カルシウム濃度は、担癌コン
トロール群で非担癌コントロール群に比べ著明な上昇が
認められたが、ＭＲ１６−１投与群では上昇が強く抑制
された（図１８）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各群の動物の推移の体重の増加を示す
グラフである。

【図２】図２は、各群の尿蛋白質の陽性率の推移を示す
グラフである。１群及び３群以外の群では尿蛋白質の陽
性率は０であった。

【図３】図３は、各群のヘモグロビンレベルの推移を示
すグラフである。

【図４】図４は、各群の赤血球数の推移を示すグラフで
ある。

【図５】図５は、各群の血小板数の推移を示すグラフで
ある。

【図６】図６は、各群の白血球数の推移を示すグラフで
ある。

【図７】図７は、各群の血清ＩｇＧ１濃度の推移を示す
グラフである。

【図８】図８は、１〜５群でのヒトＩＬ−６濃度の推移
を示すグラフである。

【図９】図９は、１群及び２群における、対照抗体Ｉｇ
Ｇ及びＧｒ−１抗体による、蛍光抗体セルソーティング
の結果を示す図である。

【図１０】図１０は、６群及び７群における、対照抗体
ＩｇＧ及びＧｒ−１抗体による、蛍光抗体セルソーティ
ングの結果を示す図である。

【図１１】図１１は、実験終了後の各群の動物の脾臓重
量を示すグラフである。

【図１２】図１２は、各群の動物の体重の推移を示すグ
ラフである。

【図１３】図１３は、実験１１日目のマウスの血中トリ
グリセリド濃度を示すグラフである。

【図１４】図１４は、実験１５日目のマウスの血中グル
コース濃度を示すグラフである。

【図１５】図１５は、実験１１日目のマウスの血中イオ
ン化カルシウム濃度を示すグラフである。

【図１６】図１６は、担癌マウスの生存率を示すグラフ
である。

【図１７】図１７は、実験開始１０および１２日目のマ
ウスの体重を示すグラフである。

【図１８】図１８は、実験開始１０および１２日目のマ
ウスの血中イオン化カルシウム濃度を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＣＶ ＡＧＺ // Ｃ１２Ｎ 15/02 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岸本 忠三 大阪府富田林市中野町３丁目５番31号

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン−６レセプターに対す
   る抗体を含んでなる、インターロイキン−６の産生に起
   因する疾患の予防または治療剤。
2. 【請求項２】 前記インターロイキン−６の産生に起因
   する疾患がプラズマサイト−シスである、請求項１に記
   載の予防または治療剤。
3. 【請求項３】 前記インターロイキン−６の産生に起因
   する疾患が高イムノグロブリン血症である、請求項１に
   記載の予防または治療剤。
4. 【請求項４】 前記インターロイキン−６の産生に起因
   する疾患が貧血である、請求項１に記載の予防または治
   療剤。
5. 【請求項５】 前記インターロイキン−６の産生に起因
   する疾患が腎炎である、請求項１に記載の予防または治
   療剤。
6. 【請求項６】 前記インターロイキン−６の産生に起因
   する疾患が悪液質である、請求項１に記載の予防または
   治療剤。
7. 【請求項７】 前記プラズマサイト−シスがリウマチに
   より惹起される、請求項２に記載の予防または治療剤。
8. 【請求項８】 前記プラズマサイト−シスがキャッスル
   マン病により惹起される、請求項２に記載の予防または
   治療剤。
9. 【請求項９】 前記腎炎がメサンギウム増殖性腎炎であ
   る、請求項５に記載の予防または治療剤。
10. 【請求項１０】 前記抗体が、モノクローナル抗体であ
    る、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の予防また
    は治療剤。
11. 【請求項１１】 前記抗体が、ＰＭ−１抗体である、請
    求項１０に記載の予防または治療剤。
12. 【請求項１２】 前記抗体が、キメラ抗体である、請求
    項１０に記載の予防または治療剤。
13. 【請求項１３】 前記抗体が、再構成ヒト抗体である、
    請求項１０に記載の予防または治療剤。
14. 【請求項１４】 前記抗体が、再構成ヒトＰＭ−１抗体
    である、請求項１３に記載の予防または治療剤。