JPH08168382A - ウイルス不含タンパクを生産する為の不死化リンパ球 - Google Patents
ウイルス不含タンパクを生産する為の不死化リンパ球Info
- Publication number
- JPH08168382A JPH08168382A JP7224475A JP22447595A JPH08168382A JP H08168382 A JPH08168382 A JP H08168382A JP 7224475 A JP7224475 A JP 7224475A JP 22447595 A JP22447595 A JP 22447595A JP H08168382 A JPH08168382 A JP H08168382A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ebv
- plasmid
- recombinant plasmid
- immortalized
- human
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- Pending
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトリンパ球の不死化を達成する手段を提供
する。 【解決手段】 ヒトリンパ球の不死化に関与するエプス
タイン−バールウイルス(ＥＢＶ)の遺伝情報を有する
が、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子を有
さない組換えプラスミドを構築する。その組換えプラス
ミドは、感染性ＥＢＶ粒子を作ることが不可能でありな
がら、ヒトリンパ球を不死化することができるという利
点を有する。本発明はその組換えプラスミドが首尾よく
感染した、不死化したヒトリンパ球をも提供する。これ
らのヒトリンパ球のクローンは所望のタンパク質を作る
細胞工場として、および遺伝子治療用の運搬ビークルと
して使用できる。さらに、本発明は感染性ＥＢＶ粒子を
作ることなく、所望のタンパク質を不死化した細胞工場
で製造する方法を確立する。
する。 【解決手段】 ヒトリンパ球の不死化に関与するエプス
タイン−バールウイルス(ＥＢＶ)の遺伝情報を有する
が、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子を有
さない組換えプラスミドを構築する。その組換えプラス
ミドは、感染性ＥＢＶ粒子を作ることが不可能でありな
がら、ヒトリンパ球を不死化することができるという利
点を有する。本発明はその組換えプラスミドが首尾よく
感染した、不死化したヒトリンパ球をも提供する。これ
らのヒトリンパ球のクローンは所望のタンパク質を作る
細胞工場として、および遺伝子治療用の運搬ビークルと
して使用できる。さらに、本発明は感染性ＥＢＶ粒子を
作ることなく、所望のタンパク質を不死化した細胞工場
で製造する方法を確立する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換えＤＮＡ技術に
関する。本発明は、ヒトリンパ球を不死化する（immort
alize）ことはできるが感染性ウイルス粒子を産生でき
ないエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）から誘導
される組換えプラスミドを提供する。その不死化したリ
ンパ球クローンは、ウイルスを含まないタンパク質を産
生する細胞工場として、またはヒト遺伝子治療のための
運搬ビークルとして用いることができる。
関する。本発明は、ヒトリンパ球を不死化する（immort
alize）ことはできるが感染性ウイルス粒子を産生でき
ないエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）から誘導
される組換えプラスミドを提供する。その不死化したリ
ンパ球クローンは、ウイルスを含まないタンパク質を産
生する細胞工場として、またはヒト遺伝子治療のための
運搬ビークルとして用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】最近の１０年に真核生物の組換えＤＮＡ
技術の開発および応用における進歩が見られている。例
えば外来遺伝子を或る真核生物宿主に運ぶレトロウイル
スベクターが開発された。ヒトのＢリンパ球に用いるに
適したベクター系の開発においても進歩があった。それ
らの純粋な研究における利用とは別に、これらの進歩は
治療上の利用可能性を有する。しかし更なる進歩が必要
である。特にヒトのリンパ球を不死化できるベクターを
開発するのが望ましい。そのような不死化細胞系は、望
ましいタンパク質の製造のための細胞工場として、およ
びヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとして用いる
ことができるであろう。
技術の開発および応用における進歩が見られている。例
えば外来遺伝子を或る真核生物宿主に運ぶレトロウイル
スベクターが開発された。ヒトのＢリンパ球に用いるに
適したベクター系の開発においても進歩があった。それ
らの純粋な研究における利用とは別に、これらの進歩は
治療上の利用可能性を有する。しかし更なる進歩が必要
である。特にヒトのリンパ球を不死化できるベクターを
開発するのが望ましい。そのような不死化細胞系は、望
ましいタンパク質の製造のための細胞工場として、およ
びヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとして用いる
ことができるであろう。
【０００３】ＥＢＶはヒトのリンパ球を、培養中に無限
に増殖する細胞系に転換する能力を有する。しかしなが
ら、ＥＢＶは潜在性および溶菌性の複製サイクルを有す
るので、ＥＢＶにより不死化されたヒトリンパ球は、内
在する潜在性ＥＢＶが溶菌的複製に入る場合にはいつも
感染性のＥＢＶ粒子を作り得る。感染性粒子を作るとい
うこの危険性のために、ＥＢＶにより不死化された細胞
を治療的に利用するのが不適切になる。したがって、ヒ
トのリンパ球の不死化に関与するＥＢＶ遺伝子情報を有
するが、ＥＢＶの溶菌的複製に必要な１以上の遺伝子を
欠いている組換えプラスミドを開発する必要がある。感
染性ＥＢＶ粒子により汚染されていない所望のタンパク
質を産生できる、不死化したヒトリンパ球を作る為にそ
のようなプラスミドを用いるという必要性もある。
に増殖する細胞系に転換する能力を有する。しかしなが
ら、ＥＢＶは潜在性および溶菌性の複製サイクルを有す
るので、ＥＢＶにより不死化されたヒトリンパ球は、内
在する潜在性ＥＢＶが溶菌的複製に入る場合にはいつも
感染性のＥＢＶ粒子を作り得る。感染性粒子を作るとい
うこの危険性のために、ＥＢＶにより不死化された細胞
を治療的に利用するのが不適切になる。したがって、ヒ
トのリンパ球の不死化に関与するＥＢＶ遺伝子情報を有
するが、ＥＢＶの溶菌的複製に必要な１以上の遺伝子を
欠いている組換えプラスミドを開発する必要がある。感
染性ＥＢＶ粒子により汚染されていない所望のタンパク
質を産生できる、不死化したヒトリンパ球を作る為にそ
のようなプラスミドを用いるという必要性もある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は組換えプラス
ミド、その組換えプラスミドにより不死化されたヒトリ
ンパ球、および様々な治療上の利用に役立つウイルスを
含まないタンパク質を製造する方法に関する。この組換
えプラスミドは、もとのウイルスの溶菌性の複製を許す
ことなくヒトリンパ球を不死化することができるウイル
スＤＮＡを含んでいる。
ミド、その組換えプラスミドにより不死化されたヒトリ
ンパ球、および様々な治療上の利用に役立つウイルスを
含まないタンパク質を製造する方法に関する。この組換
えプラスミドは、もとのウイルスの溶菌性の複製を許す
ことなくヒトリンパ球を不死化することができるウイル
スＤＮＡを含んでいる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】その組換えプラスミド
は、選択したエプスタイン−バールウイルス(「ＥＢＶ」)
ＤＮＡセグメントを、原核生物プラスミド骨格にクロー
ンすることにより形成される。その組換えプラスミド
は、ヒトリンパ球の不死化またはＥＢＶの潜在的複製に
関与する遺伝子およびシス作用性エレメントを含む。一
方、その組換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与
する１以上の遺伝子を欠く。その結果、そのプラスミド
はヒトリンパ球を不死化させる能力を保持する一方、Ｅ
ＢＶの溶菌的複製に入りそのため感染性のＥＢＶを作る
能力を欠いている。従って、そのプラスミドはヒトのリ
ンパ球を形質転換するための、および所望のタンパク質
をコードする外来遺伝子を導入するための有用なベクタ
ーである。
は、選択したエプスタイン−バールウイルス(「ＥＢＶ」)
ＤＮＡセグメントを、原核生物プラスミド骨格にクロー
ンすることにより形成される。その組換えプラスミド
は、ヒトリンパ球の不死化またはＥＢＶの潜在的複製に
関与する遺伝子およびシス作用性エレメントを含む。一
方、その組換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与
する１以上の遺伝子を欠く。その結果、そのプラスミド
はヒトリンパ球を不死化させる能力を保持する一方、Ｅ
ＢＶの溶菌的複製に入りそのため感染性のＥＢＶを作る
能力を欠いている。従って、そのプラスミドはヒトのリ
ンパ球を形質転換するための、および所望のタンパク質
をコードする外来遺伝子を導入するための有用なベクタ
ーである。
【０００６】本発明の第２の態様は、本発明の組換えプ
ラスミドによって首尾よく感染され、不死化されたヒト
リンパ球を提供する。そのプラスミドにより感染された
ヒトリンパ球のクローンは、ＥＢＶの溶菌的複製に関与
する遺伝子情報のいくつかを欠いているので、そのクロ
ーンは感染性のＥＢＶ粒子を作り、放出することが本来
的に出来ない。そのヒトリンパ球クローンはそれ故、所
望のタンパク質の製造のための細胞工場として、および
ヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとして用いるこ
とができる。
ラスミドによって首尾よく感染され、不死化されたヒト
リンパ球を提供する。そのプラスミドにより感染された
ヒトリンパ球のクローンは、ＥＢＶの溶菌的複製に関与
する遺伝子情報のいくつかを欠いているので、そのクロ
ーンは感染性のＥＢＶ粒子を作り、放出することが本来
的に出来ない。そのヒトリンパ球クローンはそれ故、所
望のタンパク質の製造のための細胞工場として、および
ヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとして用いるこ
とができる。
【０００７】本発明の第３の態様は、感染性のＥＢＶ粒
子により汚染されていない所望のタンパク質を製造する
方法に関する。この方法にはいくつかの変型がある。１
つの変型では、不死化ヒトリンパ球を、タンパク質生成
物、すなわち抗体またはリンホカインを製造するための
細胞工場として単に用いる。所望の特異性を有する抗体
を製造するためには、Ｂリンパ球を病人または抗原を投
与（チャレンジ）した人から得なければならない。生じ
たＢ細胞クローンを、よく確立された免疫技術を用いて
次にスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を産
生するクローンを同定する。これらの抗体は、受動免疫
を促進するために用いることができる。
子により汚染されていない所望のタンパク質を製造する
方法に関する。この方法にはいくつかの変型がある。１
つの変型では、不死化ヒトリンパ球を、タンパク質生成
物、すなわち抗体またはリンホカインを製造するための
細胞工場として単に用いる。所望の特異性を有する抗体
を製造するためには、Ｂリンパ球を病人または抗原を投
与（チャレンジ）した人から得なければならない。生じ
たＢ細胞クローンを、よく確立された免疫技術を用いて
次にスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を産
生するクローンを同定する。これらの抗体は、受動免疫
を促進するために用いることができる。
【０００８】該方法の他の変型は、所望のタンパク質生
成物をコードする遺伝子を、本発明に開示する組換えプ
ラスミドに、またはヒトのリンパ球クローンのゲノムに
クローンすることを含む。その組換えプラスミドが首尾
よく感染することにより、不死化したヒトリンパ球は、
感染性のＥＢＶ粒子を作ることなく、コードされたタン
パク質を製造できるであろう。
成物をコードする遺伝子を、本発明に開示する組換えプ
ラスミドに、またはヒトのリンパ球クローンのゲノムに
クローンすることを含む。その組換えプラスミドが首尾
よく感染することにより、不死化したヒトリンパ球は、
感染性のＥＢＶ粒子を作ることなく、コードされたタン
パク質を製造できるであろう。
【０００９】本発明で開示される方法の第３の変型は、
ヒト遺伝子治療のためのビークルとして、不死化したリ
ンパ球を用いることを含む。このアプローチは不死化し
た細胞を、ヒト受容体（レシピエント）に注入すること
を必然的に伴う。所望のタンパク質が抗体、リンホカイ
ンであるか、またはプラスミドにクローンされた外来遺
伝子の産物であるかに拘わらず、その不死化ヒトリンパ
球は所望のタンパク質を本来の場所で産生するであろ
う。ヒトリンパ球は、通常、リンパ球クローンを後に受
け取る同じ人から取り出されるので、注入された細胞の
ヒト受容体の免疫的な認識から生ずる複雑さは回避され
るであろう。
ヒト遺伝子治療のためのビークルとして、不死化したリ
ンパ球を用いることを含む。このアプローチは不死化し
た細胞を、ヒト受容体（レシピエント）に注入すること
を必然的に伴う。所望のタンパク質が抗体、リンホカイ
ンであるか、またはプラスミドにクローンされた外来遺
伝子の産物であるかに拘わらず、その不死化ヒトリンパ
球は所望のタンパク質を本来の場所で産生するであろ
う。ヒトリンパ球は、通常、リンパ球クローンを後に受
け取る同じ人から取り出されるので、注入された細胞の
ヒト受容体の免疫的な認識から生ずる複雑さは回避され
るであろう。
【００１０】一般的記述 本発明は、ヒトリンパ球の不死化に関与するＥＢＶの遺
伝子情報を含むが、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以
上の遺伝子を欠いている組換えプラスミドを包含する。
その組換えプラスミドは溶菌的複製ができないので、感
染性のＥＢＶ粒子を作ることができない。本発明はま
た、本発明の組換えプラスミドによって首尾よく感染さ
れた不死化リンパ球クローンをも包含する。本発明はさ
らにＥＢＶの感染性粒子を含まない所望のタンパク質を
製造する方法をも提供する。
伝子情報を含むが、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以
上の遺伝子を欠いている組換えプラスミドを包含する。
その組換えプラスミドは溶菌的複製ができないので、感
染性のＥＢＶ粒子を作ることができない。本発明はま
た、本発明の組換えプラスミドによって首尾よく感染さ
れた不死化リンパ球クローンをも包含する。本発明はさ
らにＥＢＶの感染性粒子を含まない所望のタンパク質を
製造する方法をも提供する。
【００１１】組換えプラスミド 本発明は、ヒトリンパ球の不死化に、およびプラスミド
の潜在的複製に関与するＥＢＶ遺伝子およびシス作用性
エレメントを含む組換えプラスミドを提供する。その組
換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上
のＥＢＶ遺伝子を欠いている。その組換えプラスミドは
ＥＢＶゲノムの一部分のみを含むので、ミニＥＢＶと呼
ばれる。
の潜在的複製に関与するＥＢＶ遺伝子およびシス作用性
エレメントを含む組換えプラスミドを提供する。その組
換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上
のＥＢＶ遺伝子を欠いている。その組換えプラスミドは
ＥＢＶゲノムの一部分のみを含むので、ミニＥＢＶと呼
ばれる。
【００１２】その組換えプラスミドに含まれるリンパ球
を不死化するＥＢＶ遺伝子は、ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ２、
ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３cおよびＥＢＮＡ１である。こ
れらの遺伝子の開示およびさらなる記述については、Be
ttina Kempkes等の Immortalization of Human B Lymp
hocytes by a Plasmid Containing 71 Kilobase Pairs
of Epstein-Barr Virus DNA、 J. of Virol. ６１巻、２
３１〜３８頁（１９５５）（以下「Kempkes等」とい
う）；Panl J. Farrell、 Tumorigenic DNA Viruses、Adv
ances in Viral Oncology、第８巻、１０３〜２７頁（G
eorge Klein編、１９８９）、およびElliot Kieff およ
び David Liebowitz、 Epstein-Barr Virusand lts Repl
ication、 Fields Virology、第２巻、１９８９〜１９２
０頁（Bernard. N. Fields 等編、第２版、１９９０）
を参照。これらの論文のすべては本明細書の一部を構成
する。ＬＭＰ２a、ＬＭＰ２b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ
２、ＥＢＮＡ−ＬＰおよびＥＢＮＡ３b遺伝子は同様に
組換えプラスミド中に含まれ得るが、ヒトリンパ球はそ
れらがなくても不死化できる。
を不死化するＥＢＶ遺伝子は、ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ２、
ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３cおよびＥＢＮＡ１である。こ
れらの遺伝子の開示およびさらなる記述については、Be
ttina Kempkes等の Immortalization of Human B Lymp
hocytes by a Plasmid Containing 71 Kilobase Pairs
of Epstein-Barr Virus DNA、 J. of Virol. ６１巻、２
３１〜３８頁（１９５５）（以下「Kempkes等」とい
う）；Panl J. Farrell、 Tumorigenic DNA Viruses、Adv
ances in Viral Oncology、第８巻、１０３〜２７頁（G
eorge Klein編、１９８９）、およびElliot Kieff およ
び David Liebowitz、 Epstein-Barr Virusand lts Repl
ication、 Fields Virology、第２巻、１９８９〜１９２
０頁（Bernard. N. Fields 等編、第２版、１９９０）
を参照。これらの論文のすべては本明細書の一部を構成
する。ＬＭＰ２a、ＬＭＰ２b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ
２、ＥＢＮＡ−ＬＰおよびＥＢＮＡ３b遺伝子は同様に
組換えプラスミド中に含まれ得るが、ヒトリンパ球はそ
れらがなくても不死化できる。
【００１３】組換えプラスミド中に存在するシス作用性
エレメントは、ＴＲ、oriＰおよびoriＬytである。ori
Ｌytは、組換えプラスミドがヘルパー細胞の助けによ
り、ヒトリンパ球に容易に感染できるウイルス粒子中に
パッケージされるのを可能にする。上に引用したＫempk
es等はこれらの遺伝子エレメントを同定し、記載してお
り、その開示は本明細書の一部を構成する。本発明の組
換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上
の遺伝子を欠いている。それらの遺伝子はＢＡＬＦ５、
ＢＡＬＦ２、ＢＭＲＦ１、ＢＳＬＦ１、ＢＢＬＦ４、Ｂ
ＢＬＦ２／３、ＢcＬＦ１、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１お
よびＢＭＬＦ１である。これらの遺伝子のいずれか一つ
が存在しない結果として組換えプラスミドは溶菌的複製
が本来的に不可能となる。Elizabeth D. Fixman等、tra
ms−Acting Requirements for Replication of Epstein
−Barr Vivrus OriLyt、 J. of Virol、 ６６巻、５０３
０頁（１９９２年８月）は、それらの機能および位置を
含めこれらの遺伝子を詳細に記載しており、この開示は
本明細書の一部を構成する。ある意味では、その存在ま
たは不存在によって本発明が定義される、上に述べた様
々なＥＢＶ遺伝子は、この先行技術において議論されて
おり、よくキャラクタライズされている。同書、Paul
J. Farrell、 Tumorigenic DNA Viruses、 Advance in Vi
ral Oncology、８巻、１０３〜２７頁（George Klein
編、１９８９年）およびElliot Kieff および David Li
ebowitz、 Epstein-Barr Virus and lts Replication. F
ields Virology、 ２巻、１８８９〜１９２０頁（Bernar
d N. Fields 等編、第２版、１９９０年）参照。これら
は本明細書の一部を構成する。
エレメントは、ＴＲ、oriＰおよびoriＬytである。ori
Ｌytは、組換えプラスミドがヘルパー細胞の助けによ
り、ヒトリンパ球に容易に感染できるウイルス粒子中に
パッケージされるのを可能にする。上に引用したＫempk
es等はこれらの遺伝子エレメントを同定し、記載してお
り、その開示は本明細書の一部を構成する。本発明の組
換えプラスミドはＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上
の遺伝子を欠いている。それらの遺伝子はＢＡＬＦ５、
ＢＡＬＦ２、ＢＭＲＦ１、ＢＳＬＦ１、ＢＢＬＦ４、Ｂ
ＢＬＦ２／３、ＢcＬＦ１、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１お
よびＢＭＬＦ１である。これらの遺伝子のいずれか一つ
が存在しない結果として組換えプラスミドは溶菌的複製
が本来的に不可能となる。Elizabeth D. Fixman等、tra
ms−Acting Requirements for Replication of Epstein
−Barr Vivrus OriLyt、 J. of Virol、 ６６巻、５０３
０頁（１９９２年８月）は、それらの機能および位置を
含めこれらの遺伝子を詳細に記載しており、この開示は
本明細書の一部を構成する。ある意味では、その存在ま
たは不存在によって本発明が定義される、上に述べた様
々なＥＢＶ遺伝子は、この先行技術において議論されて
おり、よくキャラクタライズされている。同書、Paul
J. Farrell、 Tumorigenic DNA Viruses、 Advance in Vi
ral Oncology、８巻、１０３〜２７頁（George Klein
編、１９８９年）およびElliot Kieff および David Li
ebowitz、 Epstein-Barr Virus and lts Replication. F
ields Virology、 ２巻、１８８９〜１９２０頁（Bernar
d N. Fields 等編、第２版、１９９０年）参照。これら
は本明細書の一部を構成する。
【００１４】Ａ．組換えプラスミドの調製 組換えプラスミドを構築するのに用いるすべての材料は
特記しない限り商業的に入手し得る。組換えプラスミド
は、潜在的（latent）複製およびヒトリンパ球不死化に
関与するＥＢＶ遺伝子およびシス作用性エレメントを、
原核生物のプラスミド骨格に良く知られたクローニング
技術を用いてクローニングすることにより構築される。
原核生物プラスミド骨格は、すべての機能的に有意な遺
伝子を取り除いた原核生物プラスミドを含んでなり、残
りのＤＮＡはその原核生物プラスミドにクローンされる
他のＤＮＡ配列の受け皿として働く。多段階染色体構築
（マルチステップクロモソーマルビルディング）と呼ば
れるクローニング技術が特に好ましい。何故なら、その
技術は、大きいが慎重に選択されたＥＢＶセグメントが
原核生物骨格に付加されることを可能にするからであ
る。この技術の詳細について O'Connor 等、Constructi
on of Large DNA Segments in Escherichia coli、 Scie
nce、 ２４４巻、１３０７〜１３１２頁参照。その開示
は本明細書の一部を構成する。その技術は部分的に重複
したＤＮＡセグメントの最初のプラスミドへの逐次付加
（sequential addition）を含み、そのセグメントのそ
れぞれは異なったシャトルベクタープラスミドにより付
加される。上書およびＫempkes等、J. of Virol.、６１
巻、２３２〜２３３頁参照。これらの文献は本明細書の
一部を構成する。染色体構築技術はかくして一定の組成
を有する組換えプラスミドの段階的構築を可能にする。
特記しない限り商業的に入手し得る。組換えプラスミド
は、潜在的（latent）複製およびヒトリンパ球不死化に
関与するＥＢＶ遺伝子およびシス作用性エレメントを、
原核生物のプラスミド骨格に良く知られたクローニング
技術を用いてクローニングすることにより構築される。
原核生物プラスミド骨格は、すべての機能的に有意な遺
伝子を取り除いた原核生物プラスミドを含んでなり、残
りのＤＮＡはその原核生物プラスミドにクローンされる
他のＤＮＡ配列の受け皿として働く。多段階染色体構築
（マルチステップクロモソーマルビルディング）と呼ば
れるクローニング技術が特に好ましい。何故なら、その
技術は、大きいが慎重に選択されたＥＢＶセグメントが
原核生物骨格に付加されることを可能にするからであ
る。この技術の詳細について O'Connor 等、Constructi
on of Large DNA Segments in Escherichia coli、 Scie
nce、 ２４４巻、１３０７〜１３１２頁参照。その開示
は本明細書の一部を構成する。その技術は部分的に重複
したＤＮＡセグメントの最初のプラスミドへの逐次付加
（sequential addition）を含み、そのセグメントのそ
れぞれは異なったシャトルベクタープラスミドにより付
加される。上書およびＫempkes等、J. of Virol.、６１
巻、２３２〜２３３頁参照。これらの文献は本明細書の
一部を構成する。染色体構築技術はかくして一定の組成
を有する組換えプラスミドの段階的構築を可能にする。
【００１５】その好ましい染色体構築技術を用いて、Ｅ
ＢＶゲノムの大きいが慎重に選択した領域をＦ因子Ｅ．
Ｃoliをベースにしたプラスミドにクローニングするこ
とにより組換えプラスミドを構築する。ＥＢＶの不死化
したコンピテントＢ９５−８株からの９つのプラスミド
をＥ．Ｃoliにおいて確立する。そのＦ因子プラスミドp
９３１.１２は、次のシャトルプラスミド、すなわちp９
３５.１と共にＥ．Ｃoliにおける相同的組換えについて
の受容体として働く。
ＢＶゲノムの大きいが慎重に選択した領域をＦ因子Ｅ．
Ｃoliをベースにしたプラスミドにクローニングするこ
とにより組換えプラスミドを構築する。ＥＢＶの不死化
したコンピテントＢ９５−８株からの９つのプラスミド
をＥ．Ｃoliにおいて確立する。そのＦ因子プラスミドp
９３１.１２は、次のシャトルプラスミド、すなわちp９
３５.１と共にＥ．Ｃoliにおける相同的組換えについて
の受容体として働く。
【００１６】好ましい態様においてp９３５.１プラスミ
ドおよび他のすべての組換えプラスミドは、pＭＢＯ９
６クローニングベクターを用いて作られる。相同的組換
えは、recＡアンバー対立遺伝子および温度感受性アン
バーサプレッサーを有するrecＡ＋Ｅ．Ｃoli ＲＶsmc
中、またはrecＡアンバー対立遺伝子並びに温度感受性
アンバーサプレッサーを有するrecＡ Ｅ．Ｃoli ＣＢ
ＴＳ中で行われる。中間のプラスミドはresＤ発現プラ
スミドを用いることにより、コインデクレート（共挿
入）中に存在する２つのrfsＦ部位を介してリゾルブ（r
esolve）され、Ｆ因子原核生物骨格はＥＢＶ組換え挿入
物と共に保持される。部分的に重複したプラスミドを連
続した工程で付加すると、各プラスミドは、相同的組換
えにより生長中の組換え骨格構造に結合するＤＮＡセグ
メントを付加する。
ドおよび他のすべての組換えプラスミドは、pＭＢＯ９
６クローニングベクターを用いて作られる。相同的組換
えは、recＡアンバー対立遺伝子および温度感受性アン
バーサプレッサーを有するrecＡ＋Ｅ．Ｃoli ＲＶsmc
中、またはrecＡアンバー対立遺伝子並びに温度感受性
アンバーサプレッサーを有するrecＡ Ｅ．Ｃoli ＣＢ
ＴＳ中で行われる。中間のプラスミドはresＤ発現プラ
スミドを用いることにより、コインデクレート（共挿
入）中に存在する２つのrfsＦ部位を介してリゾルブ（r
esolve）され、Ｆ因子原核生物骨格はＥＢＶ組換え挿入
物と共に保持される。部分的に重複したプラスミドを連
続した工程で付加すると、各プラスミドは、相同的組換
えにより生長中の組換え骨格構造に結合するＤＮＡセグ
メントを付加する。
【００１７】好ましいアプローチから生ずるp１２４４.
８組換えプラスミドはＬＭＰ１、ＬＭＰ２a、ＬＭＰ２
b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＥＢＮ
Ａ２、ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３b、ＥＢＮＡ３cおよび
ＥＮＮＡ１遺伝子およびＴＲ、oriＰおよびＯriＬytシ
ス作用性エレメントを含む。しかし、p１２４４.８aプ
ラスミドは、ＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＢＬＦ２／３
およびＢcＬＦ１遺伝子を欠いている。これらの４つの
遺伝子のそれぞれはＥＢＶの溶菌的複製に関与するの
で、プラスミドp１２４４.８aは溶菌的複製をすること
ができず、従って、感染性ＥＢＶ粒子を作ることができ
ない。しかしながら、ＥＢＶの溶菌的複製ができないこ
とは、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子の
どのようなセットを省略しても成し遂げ得るであろう。
８組換えプラスミドはＬＭＰ１、ＬＭＰ２a、ＬＭＰ２
b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−ＬＰ、ＥＢＮ
Ａ２、ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３b、ＥＢＮＡ３cおよび
ＥＮＮＡ１遺伝子およびＴＲ、oriＰおよびＯriＬytシ
ス作用性エレメントを含む。しかし、p１２４４.８aプ
ラスミドは、ＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＢＬＦ２／３
およびＢcＬＦ１遺伝子を欠いている。これらの４つの
遺伝子のそれぞれはＥＢＶの溶菌的複製に関与するの
で、プラスミドp１２４４.８aは溶菌的複製をすること
ができず、従って、感染性ＥＢＶ粒子を作ることができ
ない。しかしながら、ＥＢＶの溶菌的複製ができないこ
とは、ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子の
どのようなセットを省略しても成し遂げ得るであろう。
【００１８】ヘルパーウイルスの助けなしにヒトリンパ
球の不死化を開始し、維持することができる組換えプラ
スミドは、ヘルパーウイルスの検出可能な根痕を欠いて
いるリンパ球クローンから組換えプラスミドを救出（re
scue）することにより創出することができる。より詳細
についてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol．６１巻、２３
３頁を参照。同文献は本明細書の一部を構成する。ヒト
のリンパ球の不死化を開始し、維持する救出されたプラ
スミドの能力は、リンパ球をウイルスストックの連続的
な希釈物にさらし、感染した細胞を半固体の培地にプレ
ーティングし、増殖したコロニーの数をウイルスストッ
クの連続的な希釈の関数としてプロットすることにより
試験できる。得られる「ワンヒットカイネティックス」
により単独の組換えプラスミドがヘルパウイルスの助け
なしに不死化を行い得るか否かが明らかになる。詳細に
ついてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol、６１巻、２３３
頁参照。同文献は本明細書の一部を構成する。
球の不死化を開始し、維持することができる組換えプラ
スミドは、ヘルパーウイルスの検出可能な根痕を欠いて
いるリンパ球クローンから組換えプラスミドを救出（re
scue）することにより創出することができる。より詳細
についてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol．６１巻、２３
３頁を参照。同文献は本明細書の一部を構成する。ヒト
のリンパ球の不死化を開始し、維持する救出されたプラ
スミドの能力は、リンパ球をウイルスストックの連続的
な希釈物にさらし、感染した細胞を半固体の培地にプレ
ーティングし、増殖したコロニーの数をウイルスストッ
クの連続的な希釈の関数としてプロットすることにより
試験できる。得られる「ワンヒットカイネティックス」
により単独の組換えプラスミドがヘルパウイルスの助け
なしに不死化を行い得るか否かが明らかになる。詳細に
ついてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol、６１巻、２３３
頁参照。同文献は本明細書の一部を構成する。
【００１９】根痕のＰ３ＨＲ１ヘルパーウイルスも有し
ないＢリンパ球のクローンを、それらのそれぞれのミニ
ＥＢＶを、Ｅ．Ｃoliに救出し、それらの配列を決定す
ることにより研究した。これらの救出されたプラスミド
を広範囲に分析することにより、それらの構造がＥＢＮ
Ａ３の遺伝子座を除きもとのp１２４４.８の組換えプラ
スミドと同じであることが明らかになる。変化したプラ
スミドはＢ細胞の不死化を開始することができ、野性型
のＥＢＮＡ３遺伝子がそのような開始に必要であること
を示す。これらの組換えプラスミドは、ヒトリンパ球の
不死化を開始する固有の能力、および維持する固有の能
力を有するので好ましい。野性型ＥＮＢＡ３は標準的な
クローニング技術によってp１２４４.８aに挿入された
が、このアプローチは特に好ましい。
ないＢリンパ球のクローンを、それらのそれぞれのミニ
ＥＢＶを、Ｅ．Ｃoliに救出し、それらの配列を決定す
ることにより研究した。これらの救出されたプラスミド
を広範囲に分析することにより、それらの構造がＥＢＮ
Ａ３の遺伝子座を除きもとのp１２４４.８の組換えプラ
スミドと同じであることが明らかになる。変化したプラ
スミドはＢ細胞の不死化を開始することができ、野性型
のＥＢＮＡ３遺伝子がそのような開始に必要であること
を示す。これらの組換えプラスミドは、ヒトリンパ球の
不死化を開始する固有の能力、および維持する固有の能
力を有するので好ましい。野性型ＥＮＢＡ３は標準的な
クローニング技術によってp１２４４.８aに挿入された
が、このアプローチは特に好ましい。
【００２０】要約すると、ヒトのリンパ球の不死化の開
始および維持に関与するＥＢＶ遺伝子は含んでいるが、
ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子を欠いて
いる組換えプラスミドは、他のいかなる遺伝情報の存在
とは関係なしに、本発明の範囲内にある。本発明を、好
ましい態様において使用するＦ−因子プラスミド系およ
びシャトルベクターにより例示するが、これらに限定さ
れない。適当なシャトルプラスミドが確立される限り、
事実上いかなる原核生物プラスミドも用い得る。
始および維持に関与するＥＢＶ遺伝子は含んでいるが、
ＥＢＶの溶菌的複製に関与する１以上の遺伝子を欠いて
いる組換えプラスミドは、他のいかなる遺伝情報の存在
とは関係なしに、本発明の範囲内にある。本発明を、好
ましい態様において使用するＦ−因子プラスミド系およ
びシャトルベクターにより例示するが、これらに限定さ
れない。適当なシャトルプラスミドが確立される限り、
事実上いかなる原核生物プラスミドも用い得る。
【００２１】Ｂ．組換えプラスミドの使用 本発明により提供される組換えプラスミドは、以下に議
論するようにヒトリンパ球を不死化するのに用いること
ができる。そのプラスミドは外来遺伝子をヒトリンパ球
に運ぶベクターとしても用いることができる。その組換
えプラスミドは、不死化の過程並びにＥＢＶの潜在的お
よび溶菌的複製サイクルを明らかにする研究手段として
も用いることができる。
論するようにヒトリンパ球を不死化するのに用いること
ができる。そのプラスミドは外来遺伝子をヒトリンパ球
に運ぶベクターとしても用いることができる。その組換
えプラスミドは、不死化の過程並びにＥＢＶの潜在的お
よび溶菌的複製サイクルを明らかにする研究手段として
も用いることができる。
【００２２】不死化したヒトリンパ球 本発明の第２の態様は、上に議論し、本発明において開
示する組換えプラスミドに感染し、不死化したヒトリン
パ球クローンを提供する。そのクローンはＥＢＶの溶菌
的複製に関与する遺伝的情報のいくつかを欠いているの
で、それらは感染性のＥＢＶ粒子を産生し、放出するこ
とが本来的にできない。それ故、そのヒトリンパ球クロ
ーンは、所望のタンパク質製造のための細胞工場とし
て、およびヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとし
て用いることができる。
示する組換えプラスミドに感染し、不死化したヒトリン
パ球クローンを提供する。そのクローンはＥＢＶの溶菌
的複製に関与する遺伝的情報のいくつかを欠いているの
で、それらは感染性のＥＢＶ粒子を産生し、放出するこ
とが本来的にできない。それ故、そのヒトリンパ球クロ
ーンは、所望のタンパク質製造のための細胞工場とし
て、およびヒトの遺伝子治療のための運搬ビークルとし
て用いることができる。
【００２３】Ａ．不死化ヒトリンパ球の調製 ヒトリンパ球はＤＮＡの取り込みおよび発現に一般に抵
抗性である。使用を容易にするため、組換えプラスミド
をウイルス粒子にパッケージし、即ち「キャプシドに入
れ」て、ヒトリンパ球に感染させる。oriＬytおよびＴ
Ｒ（ターミナルリピート）シス作用性エレメントを組換
えプラスミドに入れることにより、プラスミドの増幅と
次のパッケージングが可能になる。
抗性である。使用を容易にするため、組換えプラスミド
をウイルス粒子にパッケージし、即ち「キャプシドに入
れ」て、ヒトリンパ球に感染させる。oriＬytおよびＴ
Ｒ（ターミナルリピート）シス作用性エレメントを組換
えプラスミドに入れることにより、プラスミドの増幅と
次のパッケージングが可能になる。
【００２４】oriＬytは溶菌的複製のためのＥＢＶの起
点である。Lytic Origin of Replication for Epstein-
Barr Virus（EBV）、 米国特許第５,１９４,６０１号
（１９９３年３月１６日発行）を参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。組換えプラスミド中に oriＬyt
が存在すると、プラスミドが増幅されるのを可能にす
る。ＴＲ（ターミナルリピート）エレメントが存在する
と増幅したプラスミドが解裂し、内在（endogeneous）
ヘルパーウイルスを有するリンパ芽球状ヘルパー細胞に
より、ウイルス粒子にパッケージされる。詳細について
はＷ．Ｈammerschmidtおよび Ｂ．Ｓugden、Ｎature、
３４０巻、３９３頁を参照。その開示は本明細書の一部
を構成する。一度キャプシドに入れられると、組換えプ
ラスミドはヒトのリンパ球に容易に感染する。
点である。Lytic Origin of Replication for Epstein-
Barr Virus（EBV）、 米国特許第５,１９４,６０１号
（１９９３年３月１６日発行）を参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。組換えプラスミド中に oriＬyt
が存在すると、プラスミドが増幅されるのを可能にす
る。ＴＲ（ターミナルリピート）エレメントが存在する
と増幅したプラスミドが解裂し、内在（endogeneous）
ヘルパーウイルスを有するリンパ芽球状ヘルパー細胞に
より、ウイルス粒子にパッケージされる。詳細について
はＷ．Ｈammerschmidtおよび Ｂ．Ｓugden、Ｎature、
３４０巻、３９３頁を参照。その開示は本明細書の一部
を構成する。一度キャプシドに入れられると、組換えプ
ラスミドはヒトのリンパ球に容易に感染する。
【００２５】ヘルパー細胞系は、組換えプラスミドを複
製し、パッケージするのに必要なすべてのトランス作用
性遺伝子を有するＥＢＶの非不死化株に潜在的に感染し
た細胞のクローンである。Ｋempkes等、Ｊ．of Ｖiro
l、６１巻、２３２〜３３頁参照。その開示は本明細書
の一部を構成する。好ましい態様において、ＨＨ５１４
ヘルパー細胞クローンと呼ぶ、Ｐ３ＨＲ１の感染したバ
ーキットリンパ腫のヘット（het）を含まない細胞クロ
ーンを用いる。L.Hesten、New Epstein-Barr Virus Vav
iants from Cellnlar Subclones of Ｐ３Ｊ−ＨＲ−１
Burkitt Lymphoma、Nature、 ２９５巻、１６０〜１６３
頁（１９８２参照）。その開示は本明細書の一部を構成
する。これらのＨＨ５１４細胞は１０％のウシ胎児血清
を補ったＲＰＭＩ培地中で増殖する。
製し、パッケージするのに必要なすべてのトランス作用
性遺伝子を有するＥＢＶの非不死化株に潜在的に感染し
た細胞のクローンである。Ｋempkes等、Ｊ．of Ｖiro
l、６１巻、２３２〜３３頁参照。その開示は本明細書
の一部を構成する。好ましい態様において、ＨＨ５１４
ヘルパー細胞クローンと呼ぶ、Ｐ３ＨＲ１の感染したバ
ーキットリンパ腫のヘット（het）を含まない細胞クロ
ーンを用いる。L.Hesten、New Epstein-Barr Virus Vav
iants from Cellnlar Subclones of Ｐ３Ｊ−ＨＲ−１
Burkitt Lymphoma、Nature、 ２９５巻、１６０〜１６３
頁（１９８２参照）。その開示は本明細書の一部を構成
する。これらのＨＨ５１４細胞は１０％のウシ胎児血清
を補ったＲＰＭＩ培地中で増殖する。
【００２６】組換えプラスミドは電気穿孔法または他の
適当な技術により適当なヘルパー細胞に導入する。更な
る詳細についてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol、６１
巻、２３２〜３３頁参照。その開示は本明細書の一部を
構成する。プラスミドは好ましくはウイルストランス作
用性遺伝子ＢＺＬＦ１と共に導入して、ＥＢＶライフサ
イクルの溶菌相を誘発する。数日後、溶菌した細胞から
遊離されたウイルス粒子を収穫する。上書。各ウイルス
粒子はゲノム性ヘルパーウイルスＤＮＡ、組換えプラス
ミドのキャプシドに入ったコピー、または両者の間の可
能な組換え物を含む。ウイルスのストックを濾過して細
胞を除き、ヒトリンパ球、好ましくは一次ヒトＢリンパ
球に感染させるのに用いる。Ｂ細胞をコード血液、成人
の末梢血液のバフィーコート画分または他のよく知られ
た源から収穫する。
適当な技術により適当なヘルパー細胞に導入する。更な
る詳細についてはＫempkes等、Ｊ．of Ｖirol、６１
巻、２３２〜３３頁参照。その開示は本明細書の一部を
構成する。プラスミドは好ましくはウイルストランス作
用性遺伝子ＢＺＬＦ１と共に導入して、ＥＢＶライフサ
イクルの溶菌相を誘発する。数日後、溶菌した細胞から
遊離されたウイルス粒子を収穫する。上書。各ウイルス
粒子はゲノム性ヘルパーウイルスＤＮＡ、組換えプラス
ミドのキャプシドに入ったコピー、または両者の間の可
能な組換え物を含む。ウイルスのストックを濾過して細
胞を除き、ヒトリンパ球、好ましくは一次ヒトＢリンパ
球に感染させるのに用いる。Ｂ細胞をコード血液、成人
の末梢血液のバフィーコート画分または他のよく知られ
た源から収穫する。
【００２７】ウイルス粒子にさらした後、ヒトリンパ球
を致死的に照射した（irradiated）ヒトの繊維芽細胞支
持細胞層上に限界希釈でプレートする。不死化したリン
パ球のクローンは、組換えプラスミドが単独で、または
ヘルパーウイルスと共に感染したリンパ球から発生する
が、ヘルパーウイルスのみが感染した細胞からは発生し
ない。不死化リンパ球のクローンが組換えプラスミドを
単独で有するのか、ヘルパーウイルスＤＮＡと一緒に有
するのかを決定するために、標準的なサザーンブロット
およびＰＣＲ分析を用いてクローンをスクリーニングす
る。これらのよく知られた分析に関する詳細については
Ｋempkes、Ｊ．of Ｖirol、６１巻、２３２〜３３頁を
参照。その開示は、本明細書の一部を構成する。３０,
０００細胞ゲノム当たり５分子未満のヘルパーウイルス
ＤＮＡというＰＣＲ分析を用いる感度レベルで、検出可
能なヘルパーウイルスの根痕を含まないクローンを見い
出すことができる。そのクローンは安定的に不死化して
いる。
を致死的に照射した（irradiated）ヒトの繊維芽細胞支
持細胞層上に限界希釈でプレートする。不死化したリン
パ球のクローンは、組換えプラスミドが単独で、または
ヘルパーウイルスと共に感染したリンパ球から発生する
が、ヘルパーウイルスのみが感染した細胞からは発生し
ない。不死化リンパ球のクローンが組換えプラスミドを
単独で有するのか、ヘルパーウイルスＤＮＡと一緒に有
するのかを決定するために、標準的なサザーンブロット
およびＰＣＲ分析を用いてクローンをスクリーニングす
る。これらのよく知られた分析に関する詳細については
Ｋempkes、Ｊ．of Ｖirol、６１巻、２３２〜３３頁を
参照。その開示は、本明細書の一部を構成する。３０,
０００細胞ゲノム当たり５分子未満のヘルパーウイルス
ＤＮＡというＰＣＲ分析を用いる感度レベルで、検出可
能なヘルパーウイルスの根痕を含まないクローンを見い
出すことができる。そのクローンは安定的に不死化して
いる。
【００２８】キャプシドに入っていない組換えプラスミ
ドも、電気穿孔法または他の適当な技術によりＢリンパ
球中に直接導入できる。Ｂ細胞クローンの増殖は、裸の
プラスミドＤＮＡの導入後に培養において起こるが、Ｂ
細胞に感染させるのに用いる前に組換えプラスミドをパ
ッケージし、またキャプシドに入れる場合より効率が悪
い。従って、パッケージング工程を含めるのが好まし
い。
ドも、電気穿孔法または他の適当な技術によりＢリンパ
球中に直接導入できる。Ｂ細胞クローンの増殖は、裸の
プラスミドＤＮＡの導入後に培養において起こるが、Ｂ
細胞に感染させるのに用いる前に組換えプラスミドをパ
ッケージし、またキャプシドに入れる場合より効率が悪
い。従って、パッケージング工程を含めるのが好まし
い。
【００２９】どのように注入しても、組換えプラスミド
は予期されるように、感染したリンパ球内部で染色体外
で複製する。これはＧardellaのゲル技術を用いればわ
かる。一般的に、T．Gardella等、Detection of Circul
ar and Linear HerpesvirusDNA Molecule in Mammalian
Cells by Gel Electrophoresis、 J. of Virol、５０
巻、２４８〜５４頁（１９８４）参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。
は予期されるように、感染したリンパ球内部で染色体外
で複製する。これはＧardellaのゲル技術を用いればわ
かる。一般的に、T．Gardella等、Detection of Circul
ar and Linear HerpesvirusDNA Molecule in Mammalian
Cells by Gel Electrophoresis、 J. of Virol、５０
巻、２４８〜５４頁（１９８４）参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。
【００３０】Ｂ．不死化ヒトリンパ球の使用 本発明は組換えプラスミドにより首尾よく感染され、不
死化したヒトリンパ球を提供する。そのクローンは組換
えプラスミド上のＥＢＶ遺伝子の存在により安定に不死
化しているが、その細胞はＥＢＶ溶菌相に入り、感染性
ＥＢＶ粒子を作る能力を本質的に欠いている。従って、
その不死化ヒトリンパ球は有用な、ＥＢＶを含まないタ
ンパク質の製造に、およびヒトの遺伝子治療における運
搬ビークルとして著しく適している。
死化したヒトリンパ球を提供する。そのクローンは組換
えプラスミド上のＥＢＶ遺伝子の存在により安定に不死
化しているが、その細胞はＥＢＶ溶菌相に入り、感染性
ＥＢＶ粒子を作る能力を本質的に欠いている。従って、
その不死化ヒトリンパ球は有用な、ＥＢＶを含まないタ
ンパク質の製造に、およびヒトの遺伝子治療における運
搬ビークルとして著しく適している。
【００３１】ＥＢＶ汚染のない所望のタンパク質を製造
する方法 本発明の第３の態様は、ＥＢＶの感染性粒子を含まない
所望のタンパク質を製造する方法に関する。その方法は
いくつかの変型を含む。 （１）ヒトリンパ球本来の所望のタンパク質−一般的に
は抗体またはリンホカインの製造、（２）ヒトリンパ球
に導入された外来遺伝子によりコードされた所望のタン
パク質の製造、および（３）不死化された宿主リンパ球
がヒト受容体に実際に挿入されタンパク質がその場で製
造され、運搬される、所望のタンパク質(本来または外
来の)の製造。
する方法 本発明の第３の態様は、ＥＢＶの感染性粒子を含まない
所望のタンパク質を製造する方法に関する。その方法は
いくつかの変型を含む。 （１）ヒトリンパ球本来の所望のタンパク質−一般的に
は抗体またはリンホカインの製造、（２）ヒトリンパ球
に導入された外来遺伝子によりコードされた所望のタン
パク質の製造、および（３）不死化された宿主リンパ球
がヒト受容体に実際に挿入されタンパク質がその場で製
造され、運搬される、所望のタンパク質(本来または外
来の)の製造。
【００３２】３つの変型のすべては、ヒトのリンパ球の
不死化に関与するＥＢＶの遺伝情報を有するが、ＥＢＶ
の溶菌的複製に関係する１以上遺伝子を欠いている組換
えプラスミドにヒトリンパ球が感染することを必要とす
る。従って、３つの変型のすべては上に議論した技術ま
たは他のよく知られたクローニング技術による組換えプ
ラスミドの構築を必要とする。あるいは組換えプラスミ
ドは商業的に入手し得る。
不死化に関与するＥＢＶの遺伝情報を有するが、ＥＢＶ
の溶菌的複製に関係する１以上遺伝子を欠いている組換
えプラスミドにヒトリンパ球が感染することを必要とす
る。従って、３つの変型のすべては上に議論した技術ま
たは他のよく知られたクローニング技術による組換えプ
ラスミドの構築を必要とする。あるいは組換えプラスミ
ドは商業的に入手し得る。
【００３３】どんな方法で得ても、その組換えプラスミ
ドは次に電気穿孔法または上に議論した他の適当な技術
により、ヘルパー細胞に導入し、ＥＢＶ複製の溶菌相を
誘発する。数日後、キャプシドに入ったＥＢＶウイルス
粒子を収穫し、ヒトのリンパ球に感染させるのに用い
る。３つの変型方法は重要な点でも異なる。
ドは次に電気穿孔法または上に議論した他の適当な技術
により、ヘルパー細胞に導入し、ＥＢＶ複製の溶菌相を
誘発する。数日後、キャプシドに入ったＥＢＶウイルス
粒子を収穫し、ヒトのリンパ球に感染させるのに用い
る。３つの変型方法は重要な点でも異なる。
【００３４】第１の変型は、不死化リンパ球を用いて大
量のそれらの共通のタンパク質生成物、すなわち、抗体
またはリンホカインを製造することを含む。抗体の場合
には、所望の特異性を有する抗体を製造し得る様に、抗
原をチャレンジしたそれぞれの個体からヒトＢ細胞を取
り出すことが要求され、かつそれが好ましい。例えば、
ＨＩＶウイルスの抗原に特異的な抗体をつくるために
は、Ｂ細胞をＨＩＶ陽性の人から取り出す。次にこれら
のＢ細胞を、上に議論したように本発明の組換えプラス
ミドの感染により不死化させる。
量のそれらの共通のタンパク質生成物、すなわち、抗体
またはリンホカインを製造することを含む。抗体の場合
には、所望の特異性を有する抗体を製造し得る様に、抗
原をチャレンジしたそれぞれの個体からヒトＢ細胞を取
り出すことが要求され、かつそれが好ましい。例えば、
ＨＩＶウイルスの抗原に特異的な抗体をつくるために
は、Ｂ細胞をＨＩＶ陽性の人から取り出す。次にこれら
のＢ細胞を、上に議論したように本発明の組換えプラス
ミドの感染により不死化させる。
【００３５】生じた不死化Ｂ細胞をよく知られた免疫的
技術を用いて次にスクリーニングし、関係するＨＩＶエ
ピトープに特異的な抗体を産生するクローンを同定す
る。E．Harlowおよび D．Lanp、Antibodies、１３９〜
２４１頁（Cold Spring HarlorLaboratory、 １９８８）
参照。その開示は本明細書の一部を構成する。所望のＢ
細胞クローンを限界希釈および繰り返すサザーンブロッ
トおよびＰＣＲ分析に供し、ＨＩＶ ＤＮＡが完全にな
いことを確認する。同書を参照。これらの分析を行うた
めにＨＩＶウイルスに由来するＤＮＡ断片を利用しなけ
ればならないだろう。この変型方法は一般化できる。す
なわち、その方法は事実上すべてのよく知られた病原体
のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を製造する
手段を提供する。その抗体はヒトの患者におけるまたは
実験目的のための受動免疫を確立するのに用いることが
できる。
技術を用いて次にスクリーニングし、関係するＨＩＶエ
ピトープに特異的な抗体を産生するクローンを同定す
る。E．Harlowおよび D．Lanp、Antibodies、１３９〜
２４１頁（Cold Spring HarlorLaboratory、 １９８８）
参照。その開示は本明細書の一部を構成する。所望のＢ
細胞クローンを限界希釈および繰り返すサザーンブロッ
トおよびＰＣＲ分析に供し、ＨＩＶ ＤＮＡが完全にな
いことを確認する。同書を参照。これらの分析を行うた
めにＨＩＶウイルスに由来するＤＮＡ断片を利用しなけ
ればならないだろう。この変型方法は一般化できる。す
なわち、その方法は事実上すべてのよく知られた病原体
のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を製造する
手段を提供する。その抗体はヒトの患者におけるまたは
実験目的のための受動免疫を確立するのに用いることが
できる。
【００３６】第２の変型方法は、所望のタンパク質生産
物をコードする外来遺伝子を上述の組換えプラスミドま
たは宿主のリンパ球のゲノムにクローニングすることを
含む。どのようなよく知られた技術も所望の遺伝子を挿
入するのに用いることができる。J. Sambrook等、 Molec
ular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory、 １９
８９）参照。その開示は本明細書の一部を構成する。こ
の変型方法はクローンされた遺伝子によりコードされた
タンパク質の不死化ヒトリンパ球による大量生産を可能
にする。詳細については以下の実施例５参照。
物をコードする外来遺伝子を上述の組換えプラスミドま
たは宿主のリンパ球のゲノムにクローニングすることを
含む。どのようなよく知られた技術も所望の遺伝子を挿
入するのに用いることができる。J. Sambrook等、 Molec
ular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory、 １９
８９）参照。その開示は本明細書の一部を構成する。こ
の変型方法はクローンされた遺伝子によりコードされた
タンパク質の不死化ヒトリンパ球による大量生産を可能
にする。詳細については以下の実施例５参照。
【００３７】第３の変型方法は不死化ヒトリンパ球をヒ
トレシピエント（受容体）に注入することを含む。不死
化ヒトリンパ球は、所望のタンパク質を、 それが抗体、
リンホカインであれ、クローン化された遺伝子の生産物
であれ、その場で産生できる。その方法で用いる主なヒ
トリンパ球は、不死化したリンパ球クローンを後に受け
取る同じ人から一般的に得られるであろうから、レシピ
エントの免疫系による免疫的な認識は回避される。詳細
についてはK. W. Culver、 Gene Therapy、４章（Mary A
nn Liebart、 １９９４）参照。その開示は本明細書の一
部を構成する。以下の実施例６も参照。
トレシピエント（受容体）に注入することを含む。不死
化ヒトリンパ球は、所望のタンパク質を、 それが抗体、
リンホカインであれ、クローン化された遺伝子の生産物
であれ、その場で産生できる。その方法で用いる主なヒ
トリンパ球は、不死化したリンパ球クローンを後に受け
取る同じ人から一般的に得られるであろうから、レシピ
エントの免疫系による免疫的な認識は回避される。詳細
についてはK. W. Culver、 Gene Therapy、４章（Mary A
nn Liebart、 １９９４）参照。その開示は本明細書の一
部を構成する。以下の実施例６も参照。
【００３８】本発明においてはヒトリンパ球の不死化に
関与するすべてのＥＢＶ遺伝子要素は含むが、ＥＢＶの
溶菌的複製に必須の１以上の遺伝子を欠いている組換え
プラスミドが作られた。これらの組換えプラスミドは、
ヒトリンパ球の不死化を開始し、維持する能力を有する
が、溶菌的複製サイクルに入り、感染性のＥＢＶ粒子を
作る能力を本質的に欠いている。本発明はそのような組
換えプラスミドが首尾よく感染した不死化ヒトＢリンパ
球をも提供する。さらに、本発明はＥＢＶの感染性粒子
を含まない所望のタンパク質を製造する方法を提供す
る。
関与するすべてのＥＢＶ遺伝子要素は含むが、ＥＢＶの
溶菌的複製に必須の１以上の遺伝子を欠いている組換え
プラスミドが作られた。これらの組換えプラスミドは、
ヒトリンパ球の不死化を開始し、維持する能力を有する
が、溶菌的複製サイクルに入り、感染性のＥＢＶ粒子を
作る能力を本質的に欠いている。本発明はそのような組
換えプラスミドが首尾よく感染した不死化ヒトＢリンパ
球をも提供する。さらに、本発明はＥＢＶの感染性粒子
を含まない所望のタンパク質を製造する方法を提供す
る。
【００３９】本発明は好ましい態様において記述した特
定の種の組換えプラスミドに限定されない。むしろ、付
加的な遺伝情報の存在または組換えプラスミド中に含ま
れる遺伝子の空間的な順序とは関係なく、不死化の開始
および維持に必要なＥＢＶ遺伝子を含むが、溶菌的複製
に必要な１以上の遺伝子を欠いているすべての組換え遺
伝子を含む。特許請求の範囲に記載された組換えプラス
ミドに関してなされたこれらの観察および制限は、特許
請求の範囲に記載された不死化されたヒトリンパ球およ
び方法に必然的にあてはまる。
定の種の組換えプラスミドに限定されない。むしろ、付
加的な遺伝情報の存在または組換えプラスミド中に含ま
れる遺伝子の空間的な順序とは関係なく、不死化の開始
および維持に必要なＥＢＶ遺伝子を含むが、溶菌的複製
に必要な１以上の遺伝子を欠いているすべての組換え遺
伝子を含む。特許請求の範囲に記載された組換えプラス
ミドに関してなされたこれらの観察および制限は、特許
請求の範囲に記載された不死化されたヒトリンパ球およ
び方法に必然的にあてはまる。
【００４０】
実施例１p１２４４.８aプラスミドの構築 プラスミドp１２４４.８aを、ＥＢＶゲノムの大きいが
慎重に選択した部分をＦ因子プラスミドに、染色体構築
技術を用いてクローニングすることにより構築した。Ｅ
ＢＶの不死化−コンピテントＢ９５−８株からの９つの
プラスミドをＥ．coliで確立した。Ｆ因子プラスミドp
９３１.１２は、次のシャトルプラスミド、すなわちp９
３５.１による、Ｅ．coli中の相同的組換えのための受
容体として働いた。p９３５.１プラスミドおよび他のす
べての組換えプラスミドはpＭＢＯ９６クローニングベ
クターを用いて作った。
慎重に選択した部分をＦ因子プラスミドに、染色体構築
技術を用いてクローニングすることにより構築した。Ｅ
ＢＶの不死化−コンピテントＢ９５−８株からの９つの
プラスミドをＥ．coliで確立した。Ｆ因子プラスミドp
９３１.１２は、次のシャトルプラスミド、すなわちp９
３５.１による、Ｅ．coli中の相同的組換えのための受
容体として働いた。p９３５.１プラスミドおよび他のす
べての組換えプラスミドはpＭＢＯ９６クローニングベ
クターを用いて作った。
【００４１】相同的組換えは、recＡアンバー対立遺伝
子および温度感受性アンバーサプレッサーを有するrec
Ａ+Ｅ．coli ＲＶsmc中またはrecＡ Ｅ．coli ＣＢ
ＴＳ中で行った。一緒にしたプラスミドをコインテグレ
ート中に存在する２つのrfsＦ部位を介してrecＤ発現プ
ラスミドを用いて分け（resolve）、Ｆ因子原核生物骨
格は、ＥＢＶの組換えた挿入物と共に保持された。隣接
し、部分的に重複したプラスミドを逐次工程で加えた。
加えたプラスミドは相同的組換えにより生長している組
換え骨格構造に連続的に結合し、生じたプラスミドを次
に分けた。
子および温度感受性アンバーサプレッサーを有するrec
Ａ+Ｅ．coli ＲＶsmc中またはrecＡ Ｅ．coli ＣＢ
ＴＳ中で行った。一緒にしたプラスミドをコインテグレ
ート中に存在する２つのrfsＦ部位を介してrecＤ発現プ
ラスミドを用いて分け（resolve）、Ｆ因子原核生物骨
格は、ＥＢＶの組換えた挿入物と共に保持された。隣接
し、部分的に重複したプラスミドを逐次工程で加えた。
加えたプラスミドは相同的組換えにより生長している組
換え骨格構造に連続的に結合し、生じたプラスミドを次
に分けた。
【００４２】多段階染色体構築技術から究極的に生じた
p１２４４.８プラスミドは８３,８５１bpの長さであ
り、原核細胞骨格と本発明では役割を果たさないマーカ
ー遺伝子を含む。加えた全ＥＢＶ ＤＮＡはそれ自体は
約１６５kpbの長さであるＥＢＶゲノムのうちの７１kbp
に達する。プラスミドp１２４４.８はＬＭＰ１、ＬＭＰ
２a、ＬＭＰ２b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−
ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３b、ＥＢＮ
Ａ３cおよびＥＢＮＡ１遺伝子、並びにＴＲ、oriＰ、お
よびＯriＬytシス作用性エレメントを含む。p１２４４.
８aプラスミドはＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＡＬＦ２
／３およびＢcＬＦ１遺伝子を有さない。従って、プラ
スミドp１２４４.８aはＥＢＶの溶菌的複製を支持する
ことが本来的に不可能である。しかし、それはＢ細胞の
不死化を維持することができる。
p１２４４.８プラスミドは８３,８５１bpの長さであ
り、原核細胞骨格と本発明では役割を果たさないマーカ
ー遺伝子を含む。加えた全ＥＢＶ ＤＮＡはそれ自体は
約１６５kpbの長さであるＥＢＶゲノムのうちの７１kbp
に達する。プラスミドp１２４４.８はＬＭＰ１、ＬＭＰ
２a、ＬＭＰ２b、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−
ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３a、ＥＢＮＡ３b、ＥＢＮ
Ａ３cおよびＥＢＮＡ１遺伝子、並びにＴＲ、oriＰ、お
よびＯriＬytシス作用性エレメントを含む。p１２４４.
８aプラスミドはＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＡＬＦ２
／３およびＢcＬＦ１遺伝子を有さない。従って、プラ
スミドp１２４４.８aはＥＢＶの溶菌的複製を支持する
ことが本来的に不可能である。しかし、それはＢ細胞の
不死化を維持することができる。
【００４３】実施例２ヒトＢリンパ球の不死化 p１２４４.８aプラスミドは実施例１および本明細書の
他の個所で詳述したようにして構築した。ＨＨ５１４ヘ
ルパー細胞クローンのサンプルを購入した。それはＰ３
ＨＲ１バーキットリンパ腫細胞系のhet−不含細胞クロ
ーンである。プラスミドp１２４４.８a ＤＮＡ １０
μgを、１０μgのpＣＭＶ−ＢＺＬＦ１と共に電気穿孔
法によりＨＨ５１４細胞中に一時的に導入し、溶菌的ラ
イフサイクルを誘発した。ＨＨ５１４ヘルパー細胞を、
１０％胎児牛血清を補ったＲＰＭ１培地中で増殖させ
た。放出されたウイルス粒子を５日後収穫した。
他の個所で詳述したようにして構築した。ＨＨ５１４ヘ
ルパー細胞クローンのサンプルを購入した。それはＰ３
ＨＲ１バーキットリンパ腫細胞系のhet−不含細胞クロ
ーンである。プラスミドp１２４４.８a ＤＮＡ １０
μgを、１０μgのpＣＭＶ−ＢＺＬＦ１と共に電気穿孔
法によりＨＨ５１４細胞中に一時的に導入し、溶菌的ラ
イフサイクルを誘発した。ＨＨ５１４ヘルパー細胞を、
１０％胎児牛血清を補ったＲＰＭ１培地中で増殖させ
た。放出されたウイルス粒子を５日後収穫した。
【００４４】溶菌したヘルパー細胞から放出されたウイ
ルス粒子はゲノムＰ３ＨＲ１ヘルパーウイルスＤＮＡ、
p１２４４.８aのキャプシドに入ったコピー、またはそ
れらの間の可能な組換え物のいずれかを含んでいた。こ
のウイルスストックを次に滅菌し、濾過し、コード血
液、または成人の末梢血液のバフィーコート画分に由来
する一次ヒトＢ細胞に感染させるのに用いた。
ルス粒子はゲノムＰ３ＨＲ１ヘルパーウイルスＤＮＡ、
p１２４４.８aのキャプシドに入ったコピー、またはそ
れらの間の可能な組換え物のいずれかを含んでいた。こ
のウイルスストックを次に滅菌し、濾過し、コード血
液、または成人の末梢血液のバフィーコート画分に由来
する一次ヒトＢ細胞に感染させるのに用いた。
【００４５】感染させたＢ細胞を、９６−ウエルクラス
タープレート中、致死的に照射した（irradiated）ヒト
の繊維芽細胞支持細胞層上に限界希釈でプレートした。
不死化Ｂ細胞クローンはp１２４４.８aプラスミドが感
染したＢ細胞からは生じたが、Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイ
ルスのみが感染した細胞からは生じなかった。
タープレート中、致死的に照射した（irradiated）ヒト
の繊維芽細胞支持細胞層上に限界希釈でプレートした。
不死化Ｂ細胞クローンはp１２４４.８aプラスミドが感
染したＢ細胞からは生じたが、Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイ
ルスのみが感染した細胞からは生じなかった。
【００４６】実施例３p１２４４.８a−６.６およびp１２４４.８a−８.４プラ
スミドの救出 最初の実験において、４７の不死化Ｂ細胞クローンのう
ちの７つは、Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイルスの検出可能な
根痕をも有さないことが見い出された。さらに、p１２
４４.８aおよびＰ３ＨＲ１ ＤＮＡの両方が２重に感染
した１つのクローンは時間がたつと徐々にヘルパーウイ
ルスＤＮＡを喪失した。これらの観察によりp１２４４.
８aはＰ３ＨＲ１の不存在下において不死化を開始する
ことができる可能性を生じた。
スミドの救出 最初の実験において、４７の不死化Ｂ細胞クローンのう
ちの７つは、Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイルスの検出可能な
根痕をも有さないことが見い出された。さらに、p１２
４４.８aおよびＰ３ＨＲ１ ＤＮＡの両方が２重に感染
した１つのクローンは時間がたつと徐々にヘルパーウイ
ルスＤＮＡを喪失した。これらの観察によりp１２４４.
８aはＰ３ＨＲ１の不存在下において不死化を開始する
ことができる可能性を生じた。
【００４７】成人のＢリンパ球を、p１２４４.８aを有
するウイルス粒子を含むウイルスストックの連続的な希
釈物にさらした。感染した細胞を半固体培地にプレート
し、増殖しているコロニーの数をウイルスストック連続
希釈物の函数としてプロットした。結果は「ツーヒット
カイネティックス（two−hit Kinetics)」であり、これ
は単独のp１２４４.８aプラスミドは不死化を開始でき
ないことを示した。Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイルスはp１
２４４.８aを伴わなければＢリンパ球の増殖を開始する
ことができない。
するウイルス粒子を含むウイルスストックの連続的な希
釈物にさらした。感染した細胞を半固体培地にプレート
し、増殖しているコロニーの数をウイルスストック連続
希釈物の函数としてプロットした。結果は「ツーヒット
カイネティックス（two−hit Kinetics)」であり、これ
は単独のp１２４４.８aプラスミドは不死化を開始でき
ないことを示した。Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイルスはp１
２４４.８aを伴わなければＢリンパ球の増殖を開始する
ことができない。
【００４８】Ｐ３ＨＲ１ヘルパーウイルスの検出可能な
根痕をも有しないＢ細胞クローンの２つを、それらのそ
れぞれのミニ−ＥＢＶをＥ．coliに救出し、それらの配
列を決定することによりさらに研究した。これらのプラ
スミドの広範な分析により、それらの構造はＥＢＮＡ３
遺伝子座での構造を除き、p１２４４.８a親プラスミド
と同じであることがわかる。その２つの改変したプラス
ミドをＢe２５３.３０およびＢe２５３.３３細胞クロー
ンから救出し、それぞれp１２４４.８a−６.６およびp
１２４４.８a−８.４と名付けた。これらの改変プラス
ミドはＢ細胞不死化を開始し維持することができるとわ
かり、野性型のＥＢＮＡ３遺伝子がそのような開始に非
常に関与していることを示した。Ｂ細胞不死化を開始
し、維持できるプラスミドは、野性型のＥＢＮＡ３遺伝
子をp１２４４.８aにクローニングすることによっても
調製される。
根痕をも有しないＢ細胞クローンの２つを、それらのそ
れぞれのミニ−ＥＢＶをＥ．coliに救出し、それらの配
列を決定することによりさらに研究した。これらのプラ
スミドの広範な分析により、それらの構造はＥＢＮＡ３
遺伝子座での構造を除き、p１２４４.８a親プラスミド
と同じであることがわかる。その２つの改変したプラス
ミドをＢe２５３.３０およびＢe２５３.３３細胞クロー
ンから救出し、それぞれp１２４４.８a−６.６およびp
１２４４.８a−８.４と名付けた。これらの改変プラス
ミドはＢ細胞不死化を開始し維持することができるとわ
かり、野性型のＥＢＮＡ３遺伝子がそのような開始に非
常に関与していることを示した。Ｂ細胞不死化を開始
し、維持できるプラスミドは、野性型のＥＢＮＡ３遺伝
子をp１２４４.８aにクローニングすることによっても
調製される。
【００４９】実施例４不死化Ｂ細胞を用いたＨＩＶエンベロープタンパク質に
特異的な抗体の発生 ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的な抗体を分泌す
る不死化Ｂ細胞を発生させるために、ＨＩＶ陽性のドナ
ーからのＢ細胞を本発明のパッケージされた組換えプラ
スミドで感染させる。感染した細胞を限界希釈条件下、
マイクロリッターディッシュ中、照射した支持細胞層上
にプレートする。増殖しているＢ細胞クローンを有する
各ウエルを、ＥＬＩＳＡまたは他の適当な免疫的分析を
用いて、ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的な抗体
について試験する。
特異的な抗体の発生 ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的な抗体を分泌す
る不死化Ｂ細胞を発生させるために、ＨＩＶ陽性のドナ
ーからのＢ細胞を本発明のパッケージされた組換えプラ
スミドで感染させる。感染した細胞を限界希釈条件下、
マイクロリッターディッシュ中、照射した支持細胞層上
にプレートする。増殖しているＢ細胞クローンを有する
各ウエルを、ＥＬＩＳＡまたは他の適当な免疫的分析を
用いて、ＨＩＶエンベロープタンパク質に特異的な抗体
について試験する。
【００５０】陽性であるとわかったクローンを有するウ
エルをマイクロリッターディッシュにサブクローンし、
適当な特異性を有する抗体の存在につき再試験する。同
定したウエルからのすべてのクローン化した子孫がＨＩ
Ｖエンベロープタンパク質に対する抗体を分泌すること
が見い出されるまでのこの方法を繰り返す。有用なクロ
ーンをＰＣＲにより次にスクリーニングし、不要なＥＢ
Ｖの溶菌性遺伝子およびＨＩＶの存在を検出する。これ
らの不純物を含まない細胞のみを更に用いる。本実施例
で引用した技術は十分確立されている。E. Harlow およ
び D. Lane、 Antibodies、 １３９〜２４１頁（Cold Spr
ing Harbor Laboratory、 １９８８）参照。その開示は
本明細書の一部を構成する。
エルをマイクロリッターディッシュにサブクローンし、
適当な特異性を有する抗体の存在につき再試験する。同
定したウエルからのすべてのクローン化した子孫がＨＩ
Ｖエンベロープタンパク質に対する抗体を分泌すること
が見い出されるまでのこの方法を繰り返す。有用なクロ
ーンをＰＣＲにより次にスクリーニングし、不要なＥＢ
Ｖの溶菌性遺伝子およびＨＩＶの存在を検出する。これ
らの不純物を含まない細胞のみを更に用いる。本実施例
で引用した技術は十分確立されている。E. Harlow およ
び D. Lane、 Antibodies、 １３９〜２４１頁（Cold Spr
ing Harbor Laboratory、 １９８８）参照。その開示は
本明細書の一部を構成する。
【００５１】実施例５p１２４４.８aを用いる外来遺伝子のヒトＢリンパ球へ
のクローニング その翻訳ターミネーターを有する組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）遺伝子を、組換えプラスミドを構
築するのに用いるプラスミド誘導体にクローンすること
ができるであろう。ＴＰＡ遺伝子は有効なプロモーター
の後部にクローンされねばならない: ヒトのサイトメガ
ロウイルスの即時の初期プロモーターが有効であろう。
のクローニング その翻訳ターミネーターを有する組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）遺伝子を、組換えプラスミドを構
築するのに用いるプラスミド誘導体にクローンすること
ができるであろう。ＴＰＡ遺伝子は有効なプロモーター
の後部にクローンされねばならない: ヒトのサイトメガ
ロウイルスの即時の初期プロモーターが有効であろう。
【００５２】外来の発現遺伝子を収容できる組換えプラ
スミド内部の１つの可能な部位はＥＢＮＡ−１およびＬ
ＰＭについての読み取り枠（オープン・リーディング・
フレーム）の間にある。約５０kpのＥＢＶ ＤＮＡを組
換えプラスミド中のこの領域から除去し、必要な転写は
野性タイプＥＢＶのこの領域をトラバースしない。ＴＰ
Ａを含み発現するプラスミド誘導体（例えば、p１２４
２.１の）が構築できるであろう。この誘導体を多段階
染色体構築技術に用い、ＴＰＡ遺伝子はp１２４４.８a
プラスミドのＥＢＮＡ−１およびＬＭＰ間の領域に導入
されるであろう。外来遺伝子を含む組換えプラスミド誘
導体を構築し、試験するのに用いる技術の詳細について
は、J. Sambrook等、 Molecular Cloning（Cold Spring
Harbor Laboratory、 １９８９）参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。
スミド内部の１つの可能な部位はＥＢＮＡ−１およびＬ
ＰＭについての読み取り枠（オープン・リーディング・
フレーム）の間にある。約５０kpのＥＢＶ ＤＮＡを組
換えプラスミド中のこの領域から除去し、必要な転写は
野性タイプＥＢＶのこの領域をトラバースしない。ＴＰ
Ａを含み発現するプラスミド誘導体（例えば、p１２４
２.１の）が構築できるであろう。この誘導体を多段階
染色体構築技術に用い、ＴＰＡ遺伝子はp１２４４.８a
プラスミドのＥＢＮＡ−１およびＬＭＰ間の領域に導入
されるであろう。外来遺伝子を含む組換えプラスミド誘
導体を構築し、試験するのに用いる技術の詳細について
は、J. Sambrook等、 Molecular Cloning（Cold Spring
Harbor Laboratory、 １９８９）参照。その開示は本明
細書の一部を構成する。
【００５３】実施例６ヒトの遺伝子治療用ベクターとしての不死化ヒトＢリン
パ球の使用 アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損の患者からのＢリ
ンパ球に、実施例５に記載の技術に従い、ＡＤＡのヒト
遺伝子がクローンされ、それが有効に発現する組換えプ
ラスミドを感染させる。J. Sambrook等、 Molecular Clo
ning（Cold Spring Harbor Laboratory、 １９８９）に
記載のタンパク質およびＲＮＡについての試験によるＡ
ＤＡ発現レベルについて不死化細胞を分析する。上記開
示は本明細書の一部を構成する。ヘルパーウイルスを有
さず、所望のレベルのＡＤＡを発現するＢ細胞クローン
を患者に再導入して、治療的レベルのＡＤＡをその場で
提供する。詳細については、K.,W. Culver、 Gene Thera
py、 第４章（Mary Ann Liebart、 １９９４）参照。その
開示は本明細書の一部を構成する。
パ球の使用 アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損の患者からのＢリ
ンパ球に、実施例５に記載の技術に従い、ＡＤＡのヒト
遺伝子がクローンされ、それが有効に発現する組換えプ
ラスミドを感染させる。J. Sambrook等、 Molecular Clo
ning（Cold Spring Harbor Laboratory、 １９８９）に
記載のタンパク質およびＲＮＡについての試験によるＡ
ＤＡ発現レベルについて不死化細胞を分析する。上記開
示は本明細書の一部を構成する。ヘルパーウイルスを有
さず、所望のレベルのＡＤＡを発現するＢ細胞クローン
を患者に再導入して、治療的レベルのＡＤＡをその場で
提供する。詳細については、K.,W. Culver、 Gene Thera
py、 第４章（Mary Ann Liebart、 １９９４）参照。その
開示は本明細書の一部を構成する。
【００５４】本発明のこれらのおよび他の目的並びに利
点は、実施例および好ましい態様を含む、上述の概要お
よび詳細な記述の部で議論され、説明され、サポートさ
れている。しかしながら、その態様は本発明の全範囲を
定義するものではなく、本発明は特許請求の範囲によっ
て主に定義される。
点は、実施例および好ましい態様を含む、上述の概要お
よび詳細な記述の部で議論され、説明され、サポートさ
れている。しかしながら、その態様は本発明の全範囲を
定義するものではなく、本発明は特許請求の範囲によっ
て主に定義される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9452−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 48/00 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウィリアム・エム・サグデン アメリカ合衆国53711ウィスコンシン州マ ディソン、フォックス・アベニュー2130番 (72)発明者 ヴォルフガング・エフ・ハンマーシュミッ ト ドイツ連邦共和国デー−81377ミュンヘン、 シュレーメル・シュトラーセ４番
Claims (10)
- 【請求項１】 ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３ａ、
ＥＢＮＡ３ｃおよびＥＢＮＡ１を含む一組のＥＢＶ遺伝
子、並びにＴＲ、oriＰおよびoriＬytを含む一組のＥＢ
Ｖシス作用性エレメントを含んでなるＤＮＡセグメント
に結合した原核生物のプラスミド骨核を含んでなる、組
換えプラスミドであって；該組換えプラスミドは、ＢＡ
ＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＭＲＦ１、ＢＳＬＦ１、ＢＢＬ
Ｆ４、ＢＢＬＦ２／３、ＢｃＬＦ１、ＢＺＬＦ１、ＢＲ
ＬＦ１およびＢＭＬＦ１またはそれらの組合せよりなる
群から選択される少なくとも１つのＥＢＶの溶菌遺伝子
を含まない組換えプラスミド。 - 【請求項２】 それぞれの含まれるＥＢＶ遺伝子がその
野生型のＥＢＶプロモーターと関連している請求項１に
記載の組換えプラスミド。 - 【請求項３】 ＬＭＰ２ａ、ＬＭＰ２ｂ、ＥＢＥＲ１、
ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−ＬＰ、およびＥＢＮＡ３ｂ、ま
たはそれらの組み合わせを含む群より選択されるＥＢＶ
遺伝子をさらに含んでなる、請求項１に記載の組換えプ
ラスミド。 - 【請求項４】 ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３ａ、
ＥＢＮＡ３ｃおよびＥＢＮＡ１を含む一組のＥＢＶ遺伝
子、並びにＴＲ、oriＰおよびoriＬytを含む一組のＥＢ
Ｖシス作用性エレメントを含んでなるＤＮＡセグメント
に結合した原核生物のプラスミド骨核を含んでなる組換
えプラスミドが感染したヒトリンパ球を含んでなる不死
化ヒトリンパ球であって、 該組換えプラスミドは、ＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＭ
ＲＦ１、ＢＳＬＦ１、ＢＢＬＦ４、ＢＢＬＦ２／３、Ｂ
ｃＬＦ１、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１およびＢＭＬＦ１ま
たはそれらの組合せよりなる群から選択される少なくと
も１つのＥＢＶの溶菌遺伝子を含まない不死化ヒトリン
パ球。 - 【請求項５】 該組換えプラスミドが、ＬＭＰ２ａ、Ｌ
ＭＰ２ｂ、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−ＬＰお
よびＥＢＮＡ３ｂまたはそれらの組み合わせから選択さ
れるＥＢＶ遺伝子をさらに含んでなる請求項４に記載の
不死化ヒトリンパ球。 - 【請求項６】 不死化ヒトリンパ球を用いてＥＢＶの感
染性粒子を含まない所望のタンパク質を製造する方法で
あって、該方法は、（ａ）ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ２、ＥＢ
ＮＡ３ａ、ＥＢＮＡ３ｃおよびＥＢＮＡ１を含む一組の
ＥＢＶ遺伝子、並びにＴＲ、oriＰおよびoriＬytを含む
一組のＥＢＶシス作用性エレメントを含んでなるＤＮＡ
セグメントに結合した原核生物のプラスミド骨格を含ん
でなる組換えプラスミドを得て（該組換えプラスミド
は、ＢＡＬＦ５、ＢＡＬＦ２、ＢＭＲＦ１、ＢＳＬＦ
１、ＢＢＬＦ４、ＢＢＬＦ２／３、ＢｃＬＦ１、ＢＺＬ
Ｆ１、ＢＲＬＦ１およびＢＭＬＦ１またはそれらの組合
せよりなる群から選択される少なくとも１つのＥＢＶの
溶菌遺伝子を含まない。)、（ｂ）ヘルパー細胞を得
て、（ｃ）該組換えプラスミドを該ヘルパー細胞中に導
入し、（ｄ）ヘルパー細胞内部でＥＢＶライフサイクル
の溶菌相を誘発し、（ｅ）溶菌したヘルパー細胞から放
出されたウイルス粒子の集団を採集し、（ｆ）ヒトリン
パ球を得て、（ｇ）該ヒトリンパ球にウイルス粒子の集
団を感染させて、ヒトリンパ球の不死化したクローンを
形成し、（ｈ）ヒトリンパ球の該不死化したクローンを
培養し、そして（ｉ）所望のタンパク質を産生する該不
死化クローンを選択する、ことを含んでなる方法。 - 【請求項７】 組換えプラスミドが、ＬＭＰ２ａ、ＬＭ
Ｐ２ｂ、ＥＢＥＲ１、ＥＢＥＲ２、ＥＢＮＡ−ＬＰ、お
よびＥＢＮＡ３ｂまたはそれらの組合せよりなる群から
選択されるＥＢＶ遺伝子をさらに含んでなる請求項６に
記載の方法。 - 【請求項８】 所望のタンパク質生成物をコードする遺
伝子が、工程（ａ）の組換えプラスミドにクローンされ
ている請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 不死化ヒトリンパ球をヒト受容体に挿入
して所望のタンパク質をそこで製造する請求項６に記載
の方法。 - 【請求項１０】 不死化ヒトリンパ球をヒト受容体に挿
入して所望のタンパク質をそこで製造する請求項８に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4427117A DE4427117C1 (de) | 1994-07-30 | 1994-07-30 | Plasmid und damit transfizierte Zellen |
| US504494 | 1995-07-20 | ||
| US08/504,494 US5716845A (en) | 1995-07-20 | 1995-07-20 | Immortalized lymphocytes for production of viral-free proteins |
| US4427117-4 | 1995-07-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08168382A true JPH08168382A (ja) | 1996-07-02 |
Family
ID=25938843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7224475A Pending JPH08168382A (ja) | 1994-07-30 | 1995-07-28 | ウイルス不含タンパクを生産する為の不死化リンパ球 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08168382A (ja) |
| CA (1) | CA2154854C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021507712A (ja) * | 2017-12-20 | 2021-02-25 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | エプスタインバールウイルス抗原構築物 |
-
1995
- 1995-07-27 CA CA002154854A patent/CA2154854C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-28 JP JP7224475A patent/JPH08168382A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021507712A (ja) * | 2017-12-20 | 2021-02-25 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | エプスタインバールウイルス抗原構築物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2154854C (en) | 2006-03-14 |
| CA2154854A1 (en) | 1996-01-31 |
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