JPH081661B2

JPH081661B2 - 細胞認識方法

Info

Publication number: JPH081661B2
Application number: JP1116393A
Authority: JP
Inventors: 敏男福田; 勲遠藤; 輝行長棟; 一浅間
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1989-05-10
Filing date: 1989-05-10
Publication date: 1996-01-10
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: JPH02294881A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は細胞の認識方法、更に詳細には、溶液中に浮
遊するマイクロ・キャリア（以下これをビーズという）
に付着する各種生理活性物質の生産媒体である動物細胞
（以下これを細胞という）を自動的に認識する方法に関
する。

（従来の技術およびその問題点）近年、各種生理活性物質に生産媒体である細胞を溶液
中に浮遊するビーズに付着させ、大量に培養する研究が
各方面で行われている。この方法は従来の培養方法に比
べ細胞の培養の効率が高く、新しい細胞培養法として注
目されている。今後この方法により生理活性物質の量産
が可能になり、医学等の分野に大きく貢献することが期
待されている。

ところで現在は上記の方法において細胞の培養状況の
判定は人間が行っているが、そのためには細胞の着色、
薬品処理による細胞の剥離、目視による細胞の認識等の
操作が必要であり非常に時間が掛かっている。そこで今
後細胞の本格的大量培養を図るためには、この過程の自
動化が求められている。

（問題点を解決するための手段）本願では、この要な背景に基づき、ビーズ上の細胞の
培養状況を自動的に判定するための細胞画像認識方法を
提供する。

本発明は、（ａ）細胞が付着しているビーズを原画像から抽出
し、（ｂ）抽出したビーズ上のデータをその濃度値に基づ
いてグループ分けし、（ｃ）このグループ分けされたデータの最も外縁部に
当たる部分の長さ、外縁部の囲む面積量及び中心線の各
点と外形線までの距離を算出し、（ｄ）前記（ｃ）工程により得られた３種類の各算出
値を標準値と比較し、所定の許容値で一致する場合、対
象データを細胞として認識することを特徴とする。

（作用及び効果）本発明によると、細胞の認識の自動化を達成すること
ができ、細胞の培養状況の判定を短時間かつより精密に
行うことができる。

また、本発明によると、細胞の外形が明確な検出でき
ないような種類の細胞においても、その核を検出して、
細胞数を検出することができる。

（実施例） A. 顕微鏡初期設定モード以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

現像処理においては入力される画像は画像入力時の周
囲の環境に大きな影響を受ける。本発明においては特に
顕微鏡下のライトの光量に大きく影響され、場合によっ
ては本細胞認識処理を安定に進めることができない。そ
こで本実施例ではこのライトの光量を一定に保つため
に、処理を始める前に画像処理を用いて自動的に光量を
測定し、必要ならばオペレータに対し光量の調節を促す
モードを設けた。本モードによれば256段階の濃度、値
において±１濃度値までの判定が可能であるが実際には
実用性を考慮して濃度値の差が±３以内であれば設定完
了としている。またオペレータへの出力は、濃度値の差
を出力する他に日本分によっても出力し、オペレータの
理解を助けるようにしている。

B. 細胞認識・計測セキスパートシステム B.1 エキスパートシステムの概要本システムは、P
rolog言語を用いて記述されたエキスパートシステムに
より統合的に運営されている。本システムの構成を第１
図に示す。第１図に示すように本システムは大きく３つ
の部分から成り立っている。第１の部分は画像処理部１
である。ここでは、まずＸ−Ｙステージ２上の対象とす
る細胞の画像をカメラ３から画像処理コンピュータ４に
入力する。次にその画像の処理を行った後、処理後のデ
ータをホスコンピュータに送っている。第２の部分は演
算処理部７である。ここではホストコンピュータ６に送
り込まれた画像データをFortran言語により数値処理
し、細胞の長さ・面積等、後の認識・計測のためのデー
タを算出している。なおこのFortran言語部分はサブル
ーチン化した後にProlog言語とリンクして述語として登
録してあり、Prolog言語上において他の述語と同様に用
いることができる。第３の部分は認識・計測部８であ
る。ここでは先に算出した各種のデータに基づきデータ
ベースとの間で種々のマッチング等を行い、その結果か
ら入力画像の細胞の認識・計測を行っている。各部の処
理過程の詳細は次章に述べる。

B.2 データベース本節では本実施例におけるデー
タベースの構造を示す。本データベースはフレーム構造
の形式を採っており、細胞の基本的形状データが入力さ
れている点に特徴がある。本発明における基本的形状の
定義については後述する。本データベースに入力されて
いるデータ（ピクセル単位）を次に示す：細胞の基本的
形状、細胞の長さ、細胞の面積。

C. 処理の流れ C.1 フローチャート本節では第２図に本エキスポ
ートシステムのフローチャートを示し、また画像の入力
から認識・計測結果の出力に至る過程を前章で述べた３
つの部分毎に処理の順を折って述べる。

C.2 画像処理部 C.2.1 ビーズの位置の検出細胞のビーズ上での培
養状況の判定処理を進めるためには、まず細胞が付着し
ているビーズの画像上における位置を検出する必要があ
る。ただしここでのビーズの位置の検出は後述するウィ
ンドウ設定が目的であるため、大まかなものでよい。以
下にその方法を述べる。

（１）マスクパターンビーズの位置の測定はマスクパターンを用いたパター
ンマッチング法を用いることにより行う。第３図にマス
クパターンを示す。ビーズの大きさのばらつきに対応す
るために、複数の種類の大きさのマスクパターンを用意
することができる。また、ビーズの種類に応じて、マス
クパターンの半径、太さは実験によって経験的に設定す
ればよい。

（２）ビーズの位置の検出第４図にビーズの原画像の例を示す。ビーズの位置の
検出過程を以下に示す。まず入力したビーズの原画像を
ノイズの除去を行った後に最線化する。パターンマッチ
ングはこの画像を用いて行う。第５図はマッチング処理
中の画像である。マッチングパターンは画像の左上方か
ら右下方に移動させる。このときマスクパターンと細線
化されたビーズの画像が重なった領域の面積量により、
両者のマッチング状況の判定を行う。なお、以上の処理
過程は随時画像処理コンピュータの画像上に表示し、オ
ペレータが処理の状況を確認できる（以下の各画像処理
においても同様）。

C.2.2. 大ノイズの除去次に以上のようにして抽出
されたビーズからビーズ上のノイズ（細胞以外の画像）
を除去する。ビーズ上のノイズには第6A図および第6B図
に示すようにいくつかの種類がある。これらのうちある
大きさ以上の面積を持つもの（これを大ノイズと名付け
る）について、その面積量から除去を行う。第７図に大
ノイズを除去する前の画像（ａ）と大ノイズ除去後の画
像（ｂ）を示す。ここで除去された大ノイズの面積量お
よびそれらの画像上における位置はビーズの位置の座標
と共に保存され、後の細胞認識・計測の際に利用する。

上記の過程で除去されなかったノイズ（これを小ノイ
ズと名付ける）は、エキスパートシステムによりその長
さ・面積・形状から細胞と識別された後に除去される。
その詳細については後述する。

C.3 データ処理部 C.3.1 データの転送（１）まず入力した画像を、濃度のしきい値を適当に
設定して５値化する。これによ細胞の影の最も濃い部分
（これわD1する。以下同様）・やや濃い部分（D2）・普
通の濃さの部分（D3）・ビーズの表面が直接見えやや明
るい部分（D4）・ビーズの辺縁の最も明るい部分（D5）
に画像データを分けることができる。これらのしきい値
は顕微鏡初期設定モードで設定したライトの光量に依存
する。

（２）次にＢ章で述べたビーズの抽出を行った後ビー
ズのまわりにウィンドウを第８図に示すように設定す
る。ここでウィンドウのサイズに関してはビーズの大き
さによらずビーズを含む一律の大きさのウィンドウを設
定する。これは後の画像処理コンピュータからミニコン
ピュータ（ホストコンピュータ、エキスパートシステム
が存在）へのデータの転送の際に、ウィンドウのサイズ
が決定されていた方がタイムロスが少なくてすむためで
ある。

（３）（２）で設定されたウィンドウ内のデータをミ
ニコンピュータに転送する。この際、画像データのビッ
トを反転している。これは画像上で影となっている細胞
部分のデータを大きい濃度値で示す方が、データの重要
性をオペレータにアピールしやすいと考えるためであ
る。（なお、第５図、第6A図、第6B図、第７図及び第８
図に於いては、作図上、実際の表示と白黒反転して示さ
れていた。） C.3,2 ビーズの位置の正確な検出及びビーズ上のデー
タのみの抽出さきに原画像における大まかなビーズ
の位置を検出したが、ここではウィンドウ内のビーズの
位置を正確に検出する。検出方法を以下に述べる。

（１）マスクの半径より若干前後する値の半径を持つ
縁を仮想的に考え、第９図に示すようにその円の中心を
ウィンドウの中心から上下左右に若干移動させながら、
その円上にD5が幾つか重なるかを計測する。

（２）（１）の結果データが重なっている数が最も多
いときの中心位置をビーズの中心とする。

（３）ビーズの中心が決定した後、ウィンドウ内のビ
ーズ及びビーズ上のデータのみを抽出する。第10図
（ａ）が抽出前、第10（ｂ）が抽出後 C.3.3 データのナンバリングと面積の計測（１）転送されてきたデータに適当な画素ピクセルサ
イズの正方形のフィルタを用いてフィルタリングする。
これにより、各濃度値ごとにデータのナンバリングを行
う。

（２）ナンバリングされた各データの面積をデータの
ピクセル数を数えることにより計測する。

C.3.4 小ノイズの除去上記の過程を経て得られた
データのうち、D1からD3について各々データの個数を調
べ、さらにその数に応じて各データの面積が実験的に予
め設定した一定の範囲内にあるかどうかを調べる。その
際、表２の範囲内にないデータはノイズとして除去す
る。こればビーズ上に細胞が少ない場合は細胞の画像デ
ータは広い面積値を持ってはっきりと入力されるが、細
胞数が多くなるに従いビーズが細胞に覆われて暗くなる
ために各濃度値のデータの面積が小さくなるためであ
る。

C.4 認識・計測部 C.4.1. 画像データのタイプ別分類以上の過程を経
て得られたデータは第11図に示すような４つのタイプに
分けられる。これらのタイプの設定は実験により得られ
たデータを目視により確認した細胞の画像と比較するこ
とにより行う。ここで中心部・辺円部の境はビーズの縁
から適当な画素数だけ内側に設定する。

C.4.2. データのグループ別分類（１）まずD1に着目し、全てのD1に対しD1のずぐ隣り
に存在するD2のデータを同一のグルーブのデータとす
る。その際同一グループと見なされるD2のデータはいく
つあってもよい。さらにD3のデータでD1かD2のすぐ隣り
に存在するデータも、そのD1からD2と同一のグループと
見なす。

（２）つぎに先の過程でグループ分けされなかったD2
データに着目し、残った全てのD2データに対しD1の場合
と同様にグループ分けを行う。

（３）単独データグループと重複データグループ
（１）・（２）の処理において、グループ内に他のグル
ープとデータを共有しているものがないグループは単独
データグループとする。しかし他のグループとデータを
共有しているグループは、重複データグループとする。

C.4.3. 中心部・辺縁部データの分類以上の過程
に続き、さらにデータを中心部データと辺縁部データに
分類する。分類方法は第12図に示すようにD1及びD2のデ
ータグループのうち、ビーズの辺縁から適当な画素数だ
け内側に存在するグループを辺縁部データとし、それ以
外は中心部データとする。これにより全てのデータグル
ープはC.4.1で分類した４つのタイプのどれかに分類さ
れる。

C.4.4 タイプ別認識方法（１）中心部単独データグループの場合そのまま形状認識モードにはいる。

（２）中心部重複データグループの場合グルーピングサブルーチンにより全てのデータのグル
ープ化を行った後に形状認識モードにはいる。

（３）辺縁部単独データグループの場合形状認識モードにはいるが、その際さらにデータを２
つの段階に分ける。一つはビーズの辺縁に極めて近いデ
ータであり、もう一つはビーズの辺縁から若干離れてい
るデータである。前者においては5.3節で述べる各マッ
チングの正否判定基準値を30％以上とし、後者では50％
以上とする。

（４）辺縁部重複データグループの場合まずグルーピングサブルーチンに入りデータをグルー
プ化する。その後（３）と同様にデータをさらに２段階
に分け、各マッチングの正否判定基準値を段階毎に設定
しなおして認識を行う。

C.4.5 グルーピングサブルーチン本サブルーチン
では、データが重複している場合そのグループ分けを行
う。以下にその方法を示す。

（１）まず重複しているデータに対し小さな画像サイ
ズの正方形のフィルタをかけ、D1、D2のすぐ隣に存在す
るD3のデータをそのD1、D2と同グループのデータとす
る。

（２）（１）の過程を繰り返して行い、第13図に示す
ようにD1、D2データグループのまわりにD3データをちょ
うど木の年輪のように増やして行く。

（３）この際、最終的にちょうど幅１ピクセルのライ
ン上にどちらにも分けられないデータが残る。

これはどちらにも共通のデータとし、形状認識におい
ては、両グループにおいて形状データとして用いる。こ
れを第14図に示す。

以上の様にしてデータのグループ分けを行う。

C.4.6 形状認識モード（１）グループ分けされたデータの最も外縁に当たる
部分の長さを算出する。これは第15図に示されるように
最外縁部の画素i_n-1,i_n,i_n+1間の距離Δlnの総和Ｌ＝Σ
Δlnとして表される。

（２）同じ外縁部の囲む面積量を算出する。（細胞画
像の面積に相当）。

（３）同じく外縁部のデータの基本的形状（後述）を
計測する。基本的形状を第16図に示す。

（４）以上の３つのデータをデータベースの細胞デー
タと比較し、細胞であるかどうかを認識・判定する。な
お、本モードの原理及び認識方法についてはＤ章でさら
に詳しく述べる。

C.5. 認識・計測結果の出力本システムにおける認
識・計測結果のがラインプリンタ或いはディスプレイ上
に表示される。

D. 細胞の形状認識モードについて（画像セグメント化
法の適用） D.1 細胞画像認識における生物の画像セグメント化法
の適用方法細胞などのように固体差が存在するもの
は特定のパターンを設定できないため、従来広く用いら
れてきたパターンマッチング法を適用することは難し
い。そこで生物画像のセグメント化法を適用する。

D.2 細胞の基本的形状の定義本研究においては細
胞の基本的形状というものを定義している。細胞の基本
的形状は第16図に示すように細胞（セグメント）の中心
線Wnをビット化し、各ドットごとの外形線までの距離を
もって表す。これにより細胞をビーズ上での付着状態や
見る方向によらず常に単一のデータをもって表すことが
できる。すなわち本研究における細胞の画像のセグメン
ト化法の適用とは、〔細胞がどの様な状態でビーズ上に存在しようとも、細
胞の長さ・面積・基本的形状は変化しない〕という仮定に基づき、細胞を表現し認識を行うものであ
る。

D.3 認識過程 D.3.1 細胞の長さのマッチング対象細胞データと
データベース中の細胞の長さの値を比較、マッチングす
る。その結果、差が20％以内ならばマッチング成功とす
る。

D.3.2 細胞の面積のマッチング対象細胞データと
データベース中の細胞の面積を比較、マッチングする。
その結果、差が20％以内ならばマッチング成功とする。

D.3.3 細胞の基本的形状のマッチング対象細胞デ
ータとデータベース中の細胞の基本的形状を比較、マッ
チングする。その結果、差が20％以内ならばマッチング
成功とする。

D.3.4 認識方法以上のマッチングのすべてに成功
した場合対象データは細胞と判断するが、マッチングし
ない場合はそのデータはノイズと判断し除去する。

E. 実験及び結果 E.1 実験装置実験は第１図に示す装置を用いて行
った。細胞はXY−ステージ２上のスライドガラス上に乗
っている。ホストコンピュータ６は画像処理コンピュー
タ４を共通メモリ領域５を介してコントロールしてい
る。またXY−ステージ２は同じくホストコンピュータ６
によりコントロールされている。これにより本システム
は人間を介在しない閉ループをなし、ビーズの画像を連
続して自動的に画像処理コンピュータ４に入力・処理す
ることができる。CCD−カメラ３は顕微鏡と接続されて
いる。この顕微鏡の倍率は400倍である。なお入力され
る処理対象画像は白黒画像であるが、画像処理コンピュ
ータの画像上には合成したカラー画像を表示している。

E.2 実験方法実験には細胞を６日間にわたりビー
ズ上で培養した後、人工的に着色したもの（クリスタ
ルバイオレットにより着色）及び、無着色（自然状
態）のものを用いた。実験は細胞のついているビーズの
画像を顕微鏡に接続されたCCDカメラより入力し、その
培養状況を判定させることにより行った。その際、実験
段階をイ．着色細胞をエキスパートシステムを用いず画像処理
のみにより判定ロ．無着色細胞をエキスパートシステムを用いず画像処
理のみにより判定ハ．着色細胞をエキスパートシステムを用いて判定ニ．無着色細胞をエキスパートシステムを用いて判定という４つの段階に分け、相互に比較することとした。
また各実験結果についても、人間が目視により細胞数を
計測・判定した場合（これを正解とする）は比較し評価
した。

E.3 実験結果実験結果を第17図から第20図にまと
める。各図はビーズ上の細胞数の計測結果を、人間が行
った場合と比較したものである。このうち、第17図、第
19図は着色細胞を用いた結果、第18図、第20図は無着色
細胞を用いた結果である。

E.4 まとめ以上の結果、着色細胞と無着色細胞の
視覚認識では着色細胞の視覚認識の方が若干良好な結果
が得られることがわかった。これは着色細胞の方が視覚
的に細胞の画像を捕らえやすいためである。また本発明
のエキスパートシステムを用いる場合と用いない場合で
は、前者は後者に比べ判定を下すまでに約半分の処理時
間（約１時間）で済むことが判明した。これは判定に必
要な処理対象サンプル数が３分の１（ビーズ10個）程度
で済むためである。さらに、本エキスパートシステムを
用いれば細胞が密集している部分においても細胞画像の
数え分けが可能であり、人間が目視により計測した場合
とほぼ等しい精密な計測が可能であることが判明した。

F. 結言本発明においてビーズ及びビーズ上の細胞を画像処理的
に抽出後認識・計測し、細胞の培養状況の判定をエキス
パートシステムを用いて自動的に行うことを試みた。ま
たその有効性を実験により確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を実施するためのシステムの概略図、第２図は本発明の好適な実施例におけるフローチャート
図、第３図はビーズ位置測定に用いるマスクパターンを示す
図、第４図はビース上に付着した状態の生細胞の原画像を示
す写真、第５図はビーズとのパターンマッチングを示す図、第6A図および第6B図はビーズ上のノイズを表す図、第７図はビーズ上の大ノイズの除去の様子を示す図、第８図はウインドウ設定の様子を示す図、第９図は精密なビーズ位置検出を説明する図、第10図はウインドウ内のビーズ及びビーズのデータのみ
を抽出する様子を示す図、第11図は画像データのタイプ
を分類して示す図、第12図は中心部データと辺縁部データを示す図、第13図および第14図はデータのグループ分けを説明する
図、第15図は最も外縁に当たる部分の長さの算出を説明する
図、第16図は基本的形状の測定を説明する図、第17図から第20図は各々ビーズ上の細胞数の計測結果を
示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者浅間一埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (56)参考文献日本機械学会ロボティクス・メカトロニクス講演概要集，1989，Ｐ．22−23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）細胞が付着しているビーズをカメ
ラによって取り込まれた原画像から抽出し、（ｂ）抽出したビーズ上のデータをその濃度値に基づ
いてグループ分けし、（ｃ）このグループ分けされたデータの最も外縁部に
当たる部分の長さ、外縁部の囲む面積量及び中心線の各
点と外形線までの距離を算出し、（ｄ）前記（ｃ）工程により得られた３種類の各算出
値を標準値と比較し、所定の許容値で一致する場合、対
象データを細胞として認識する細胞認識方法。