JPH08160038A - ケトン体の分別定量方法及び装置 - Google Patents
ケトン体の分別定量方法及び装置Info
- Publication number
- JPH08160038A JPH08160038A JP32959394A JP32959394A JPH08160038A JP H08160038 A JPH08160038 A JP H08160038A JP 32959394 A JP32959394 A JP 32959394A JP 32959394 A JP32959394 A JP 32959394A JP H08160038 A JPH08160038 A JP H08160038A
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- acetone
- acetoacetic acid
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- acid
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】 少量の体液試料、殊に全血中のケトン体を、
血清分離や除蛋白等の煩雑な前処理を施すことなく、迅
速、容易且つ確実に分別定量する方法を提供する。 【構成】 ケトン体含む液体試料の一定量を加熱するこ
とにより、試料中のアセト酢酸を気化させてアセトンに
分解し、試料ガス中のアセトンをガス分析器で分析する
ことによりアセト酢酸濃度を求める。一方、液体試料中
の3−ヒドロキシ酪酸を、酵素的或いは非酵素的(化学
的)にアセト酢酸或いはアセトンに変換し、同様にして
アセトンを分析して全ケトン体(アセト酢酸と3−ヒド
ロキシ酪酸)の濃度を求め、差演算により3−ヒドロキ
シ酪酸の濃度を求める。
血清分離や除蛋白等の煩雑な前処理を施すことなく、迅
速、容易且つ確実に分別定量する方法を提供する。 【構成】 ケトン体含む液体試料の一定量を加熱するこ
とにより、試料中のアセト酢酸を気化させてアセトンに
分解し、試料ガス中のアセトンをガス分析器で分析する
ことによりアセト酢酸濃度を求める。一方、液体試料中
の3−ヒドロキシ酪酸を、酵素的或いは非酵素的(化学
的)にアセト酢酸或いはアセトンに変換し、同様にして
アセトンを分析して全ケトン体(アセト酢酸と3−ヒド
ロキシ酪酸)の濃度を求め、差演算により3−ヒドロキ
シ酪酸の濃度を求める。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血液や尿等の液体試料
中に含まれる、ケトン体の分別定量方法及び装置に関す
る。
中に含まれる、ケトン体の分別定量方法及び装置に関す
る。
【0002】
【従来の技術】体液(主に血液及び尿)中に存在するケ
トン体は肝での遊離脂肪酸(FFA)の代謝産物であ
り、アセト酢酸、3−ヒドロキシ酪酸及びアセトンの総
称名である。これは、栄養の3要素(炭水化物、脂肪、
蛋白質)のうち、炭水化物(グルコース)が何等かの理
由で代謝系に取り込まれなくなった状態において、その
代謝エネルギー源として脂肪が利用されることによって
生成される。
トン体は肝での遊離脂肪酸(FFA)の代謝産物であ
り、アセト酢酸、3−ヒドロキシ酪酸及びアセトンの総
称名である。これは、栄養の3要素(炭水化物、脂肪、
蛋白質)のうち、炭水化物(グルコース)が何等かの理
由で代謝系に取り込まれなくなった状態において、その
代謝エネルギー源として脂肪が利用されることによって
生成される。
【0003】上記現象は、糖尿病、飢餓、栄養不良(嘔
吐症等による)などにより生起され、ケトン体の過剰生
成或いはそのアンバランストなって表れる。尚、FFA
が酸化されてアセチルCoAになり、アセチルCoAが
アセト酢酸になり、その大部分が酵素(3-OH-BADH)によ
り3−ヒドロキシ酪酸に変化する。またアセト酢酸の一
部が脱炭酸(脱CO2 )してアセトンに変化する。即
ち、これらケトン体は生体内(血中)で、アセト酢酸
(AcAc)を中心に図1で示すように平衡反応或いは
分解反応により相互に関係している。しかし、アセトン
は量も少なく(ケトン体中で約2%程度)不安定である
ので、臨床的には重要視されず測定もなされていない。
一方、アセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸は、これらが
伴う患者の病態生理の把握や、治療のモニターとして重
要な測定成分となっている。
吐症等による)などにより生起され、ケトン体の過剰生
成或いはそのアンバランストなって表れる。尚、FFA
が酸化されてアセチルCoAになり、アセチルCoAが
アセト酢酸になり、その大部分が酵素(3-OH-BADH)によ
り3−ヒドロキシ酪酸に変化する。またアセト酢酸の一
部が脱炭酸(脱CO2 )してアセトンに変化する。即
ち、これらケトン体は生体内(血中)で、アセト酢酸
(AcAc)を中心に図1で示すように平衡反応或いは
分解反応により相互に関係している。しかし、アセトン
は量も少なく(ケトン体中で約2%程度)不安定である
ので、臨床的には重要視されず測定もなされていない。
一方、アセト酢酸及び3−ヒドロキシ酪酸は、これらが
伴う患者の病態生理の把握や、治療のモニターとして重
要な測定成分となっている。
【0004】従って、ケトン体の測定については様々な
手法が従来から開発されているが、現在実用化されてい
るのは、1962年にWilliamsonが開発、実用化された酵素
法である。また、ケトン体専用測定器としてはKETO
−340(三和化学)や自動分析装置(COBAS−B
IOなど)が標準化され、日常検査化されている。
手法が従来から開発されているが、現在実用化されてい
るのは、1962年にWilliamsonが開発、実用化された酵素
法である。また、ケトン体専用測定器としてはKETO
−340(三和化学)や自動分析装置(COBAS−B
IOなど)が標準化され、日常検査化されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ケトン体の測
定を必要とする臨床の場では、次の条件(因子)がクリ
アされることが望ましい。測定手技が簡単である(専
門技能者を必要としない)、短時間で測定が完了する
(手間がかからない、すぐに臨床に活用できる)、測
定値の信頼性(性格である)、測定システムが経済的
である(機器が安価でランニングコストが安くつく)な
どである。従来法は、特に及びに関して問題があ
る。
定を必要とする臨床の場では、次の条件(因子)がクリ
アされることが望ましい。測定手技が簡単である(専
門技能者を必要としない)、短時間で測定が完了する
(手間がかからない、すぐに臨床に活用できる)、測
定値の信頼性(性格である)、測定システムが経済的
である(機器が安価でランニングコストが安くつく)な
どである。従来法は、特に及びに関して問題があ
る。
【0006】また、尿ケトン体測定法は、試験紙(テス
トストリップ)法で、殆どの場合日常化されているが、
この方法は簡便な方法であるが半定量的な判定法であ
り、スクリーニングの域をでない。また、検出原理がニ
トロプルヒッド法であることから、ケトン体3成分の内
殆どアセト酢酸にしか感度をもっていない。更に、尿ケ
トン体の場合、腎の排泄閾値の関係から血中ケトン体動
態を正しく反映するものではない。−血中ケトン体が比
較的高濃度、異常血にならないと尿に排泄されない−こ
とは良く知られていることである。このような状況から
鑑みれば、一滴の全血からケトン体レベルが把握できる
ことは大変重要で、必要とされるものである。
トストリップ)法で、殆どの場合日常化されているが、
この方法は簡便な方法であるが半定量的な判定法であ
り、スクリーニングの域をでない。また、検出原理がニ
トロプルヒッド法であることから、ケトン体3成分の内
殆どアセト酢酸にしか感度をもっていない。更に、尿ケ
トン体の場合、腎の排泄閾値の関係から血中ケトン体動
態を正しく反映するものではない。−血中ケトン体が比
較的高濃度、異常血にならないと尿に排泄されない−こ
とは良く知られていることである。このような状況から
鑑みれば、一滴の全血からケトン体レベルが把握できる
ことは大変重要で、必要とされるものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明は、血中ケトン体
のアセト酢酸(AcAc)及びヒドロキシ酪酸(3−O
HBA)をそれぞれアセトン(Ac)に変換し、ガス分
析器(アセトン検出器)にてそれぞれ由来のアセトン量
を求め、アセト酢酸及びヒドロキシ酪酸量を産出するこ
とを基本概念とする。まず、第一ステップとして、酵素
的反応により、 3−OHBA → AcAc+H+ (1) (詳しい反応のメカニズムは図1による) 次いで、非酵素的(加熱による気化)により、 AcAc →Ac+CO2 (2) これは、熱エネルギーによる単なる分解(脱炭酸)反応
で容易に起こる。或いは、次の反応により、3−OHB
Aを一挙にAcまで分解する反応を用いてもよい。 3−OHBA → Ac+CO2 +H+ (3) この場合は非酵素的で、酸化剤として、H2SO4 −K2Cr2O
7 などを用いる(吉川春寿:臨床医化学−実験編、195
5、共同医書など)。
のアセト酢酸(AcAc)及びヒドロキシ酪酸(3−O
HBA)をそれぞれアセトン(Ac)に変換し、ガス分
析器(アセトン検出器)にてそれぞれ由来のアセトン量
を求め、アセト酢酸及びヒドロキシ酪酸量を産出するこ
とを基本概念とする。まず、第一ステップとして、酵素
的反応により、 3−OHBA → AcAc+H+ (1) (詳しい反応のメカニズムは図1による) 次いで、非酵素的(加熱による気化)により、 AcAc →Ac+CO2 (2) これは、熱エネルギーによる単なる分解(脱炭酸)反応
で容易に起こる。或いは、次の反応により、3−OHB
Aを一挙にAcまで分解する反応を用いてもよい。 3−OHBA → Ac+CO2 +H+ (3) この場合は非酵素的で、酸化剤として、H2SO4 −K2Cr2O
7 などを用いる(吉川春寿:臨床医化学−実験編、195
5、共同医書など)。
【0008】血中ケトン体とは、AcAc、3−OHB
A及びAcの三成分を総称して言うが、血中(静脈血)
成分比は、それぞれAcAc20%、3−OHBA78
%、及びAc2%と言われている。本発明においては、
最終的にAcAc、3−OHBAをAcに変換して軽量
するわけであるが、もともと血中に存在するAcの含有
分は、AcAc、3−OHBAに合算する形となる。し
かし、Acは常にその存在率が少ないことから、臨床的
に差異がないと考えられる(図2参照)。
A及びAcの三成分を総称して言うが、血中(静脈血)
成分比は、それぞれAcAc20%、3−OHBA78
%、及びAc2%と言われている。本発明においては、
最終的にAcAc、3−OHBAをAcに変換して軽量
するわけであるが、もともと血中に存在するAcの含有
分は、AcAc、3−OHBAに合算する形となる。し
かし、Acは常にその存在率が少ないことから、臨床的
に差異がないと考えられる(図2参照)。
【0009】
【実施例】具体的には、次の通りである(図3参照)。 1 AcAc測定方法(酵素変換前処理なし、1系統検
出システム) 採血直後の全血0.5mlを、恒温槽1で37℃に保温し
た生理食塩水4.5ml(バイアル)に入れ、手で3〜4
回転混和話する。その後、ピペットにて100μlを秤
量し、ガス分析装置2の試料注入口3から一気にヒード
ブロック部4へ中に注入する。これにより、液体試料中
のAcAcは反応(2)に基づき脱炭酸されてAcに変
化(変換)される。ここでは、もともとAcとして存在
するものと、変換して新たに生じたAcとは合わさって
ガス化され、これがクロマトカラム5、検出器6により
濃度に比例した電気信号に変換される。この信号レベル
を〔M〕とする。尚、図3中符号7はキャリアガスボン
ベ、符号8はCPU、符号9はキーボード、符号10は
プリンターである。
出システム) 採血直後の全血0.5mlを、恒温槽1で37℃に保温し
た生理食塩水4.5ml(バイアル)に入れ、手で3〜4
回転混和話する。その後、ピペットにて100μlを秤
量し、ガス分析装置2の試料注入口3から一気にヒード
ブロック部4へ中に注入する。これにより、液体試料中
のAcAcは反応(2)に基づき脱炭酸されてAcに変
化(変換)される。ここでは、もともとAcとして存在
するものと、変換して新たに生じたAcとは合わさって
ガス化され、これがクロマトカラム5、検出器6により
濃度に比例した電気信号に変換される。この信号レベル
を〔M〕とする。尚、図3中符号7はキャリアガスボン
ベ、符号8はCPU、符号9はキーボード、符号10は
プリンターである。
【0010】一方、液体試料中に存在する3−OHBA
は、ヒートブロック温度(60〜150℃、より好まし
くは80〜100℃)程度では分解せずAcの発生は起
こらないので、AcAcと3−OHBAは分別できるこ
とになる。ヒードブロック温度がより高温(例えば、1
50℃以上)になったり、ヒードブロック部4の材質に
よってはその触媒作用でAcを生成する可能性があるの
で、温度管理、材質管理を正しくする必要がある。 2 全ケトン体測定方法(酵素的或いは化学的−非酵素
的−変換処理・1系統検出システム) 酵素的変換方法 採血直後の全血0.5mlを、恒温槽1で37℃に保温し
た酵素液(3−OHBA、NAD、ピルビン酸、LD
H、リン酸バッファ、pH8.0を含む)4.5mlの入っ
たバイアルに入れ、手で3〜4回転倒混和た後、恒温槽
1に10分間静置する。これにより、反応(1)が進行
し、バイアル内のケトン体(3−OHBA)はAcAc
に変換される。この液を、ピペットにて100μlで秤
量し、上記1と同様に操作する。この信号レベルを
〔N〕とする。
は、ヒートブロック温度(60〜150℃、より好まし
くは80〜100℃)程度では分解せずAcの発生は起
こらないので、AcAcと3−OHBAは分別できるこ
とになる。ヒードブロック温度がより高温(例えば、1
50℃以上)になったり、ヒードブロック部4の材質に
よってはその触媒作用でAcを生成する可能性があるの
で、温度管理、材質管理を正しくする必要がある。 2 全ケトン体測定方法(酵素的或いは化学的−非酵素
的−変換処理・1系統検出システム) 酵素的変換方法 採血直後の全血0.5mlを、恒温槽1で37℃に保温し
た酵素液(3−OHBA、NAD、ピルビン酸、LD
H、リン酸バッファ、pH8.0を含む)4.5mlの入っ
たバイアルに入れ、手で3〜4回転倒混和た後、恒温槽
1に10分間静置する。これにより、反応(1)が進行
し、バイアル内のケトン体(3−OHBA)はAcAc
に変換される。この液を、ピペットにて100μlで秤
量し、上記1と同様に操作する。この信号レベルを
〔N〕とする。
【0011】化学的(非酵素的)変換方法 反応液(1M−H2SO4 −K2Cr2O7 )4.5mlの入ったバ
イアルに全血を0.5ml注入し、手で3〜4回転倒混和
た後、室温で10分間静置する。これにより、反応
(3)が進み、3−OHBAは全に変換される。この液
を用いて、上記1と同様に操作する。この場合、恒温槽
1は不要である。このときの信号レベルを〔N〕とす
る。
イアルに全血を0.5ml注入し、手で3〜4回転倒混和
た後、室温で10分間静置する。これにより、反応
(3)が進み、3−OHBAは全に変換される。この液
を用いて、上記1と同様に操作する。この場合、恒温槽
1は不要である。このときの信号レベルを〔N〕とす
る。
【0012】3 AcAc/3−OHBA 2成分同時
(分別又は比率)測定方法 (変換処理、及び前処理なし、2系統検出システム) −3−OHBAの測定(算出)方法− 3−OHBA信号レベル〔O〕は、上記1及び2の操作
から得られた信号〔M〕及び〔N〕から、次式(4)に
より求める。 〔O〕=〔N〕−〔M〕 (4) (ケトン体濃度の求め方) ここで得られた信号レベル〔M〕、〔N〕及び〔O〕
に、係数fを乗じた値が、それぞれのケトン体濃度(μ
M)となる。係数fは、標準溶液の測定(標準液の信号
レベル〔Q〕)から求められる。 (標準溶液の作り方−係数fの求め方−) 標準溶液は、生理食塩水をベースにしたアセトン1mM
溶液である。この標準溶液の信号レベルを〔Q〕とした
とき、f=1000/〔Q〕である。
(分別又は比率)測定方法 (変換処理、及び前処理なし、2系統検出システム) −3−OHBAの測定(算出)方法− 3−OHBA信号レベル〔O〕は、上記1及び2の操作
から得られた信号〔M〕及び〔N〕から、次式(4)に
より求める。 〔O〕=〔N〕−〔M〕 (4) (ケトン体濃度の求め方) ここで得られた信号レベル〔M〕、〔N〕及び〔O〕
に、係数fを乗じた値が、それぞれのケトン体濃度(μ
M)となる。係数fは、標準溶液の測定(標準液の信号
レベル〔Q〕)から求められる。 (標準溶液の作り方−係数fの求め方−) 標準溶液は、生理食塩水をベースにしたアセトン1mM
溶液である。この標準溶液の信号レベルを〔Q〕とした
とき、f=1000/〔Q〕である。
【0013】
【発明の効果】生体中のケトン体動態を1滴程度の僅か
な全血で把握できることは、本検査が持つ臨床的意義と
その適用範囲の拡がりから考えれば、計り知れないもの
がある。即ち、 1)従来法は、血清分離や除蛋白などのためにの器具や
時間と労力を要するが、本発明方法によれば時間と技術
の必要とする検体の前処理は全く不要となる。 2)本発明によるガス分析装置は、高感度で極低濃度の
検出が可能であるから、採血(液体処理:検体)量は少
量であり、そのため、被検者(患者)は勿論、採血者側
の負担も極めて軽くなる。 3)検体を保存、処理、移動するための容器、器具を必
要としない。即ち、単に少量の血液を採取するための器
具だけでよい。結果として、経済的である。 4)検体を採取してから、結果が判明するまで、最大で
も15分程度であるから、すぐに臨床、診断に活用する
ことができる。 5)被検者及び検査者側に、肉体的、精神的及び時間的
な負担がかからないので、精密な病態生理を把握するた
め、繰り返し測定することも容易である。結果として、
正確な診療ができる。 6)更に、本発明(技術)を他の測定成分に適用するこ
とにより、従来困難とされていた検査項目(例えば、乳
酸とピルビン酸)が、簡便に測定可能となる。そのた
め、臨床上意義深い、必要な新規検査項目の発掘(開
発)にも効果を奏するものと考えられる。 このように、本発明方法は体液(血液、尿)中のケトン
体測定を大幅に合理化するだけでなく、本発明の基本技
術を応用することにより、計り知れない実用的効果をも
たらすものと考えられる。
な全血で把握できることは、本検査が持つ臨床的意義と
その適用範囲の拡がりから考えれば、計り知れないもの
がある。即ち、 1)従来法は、血清分離や除蛋白などのためにの器具や
時間と労力を要するが、本発明方法によれば時間と技術
の必要とする検体の前処理は全く不要となる。 2)本発明によるガス分析装置は、高感度で極低濃度の
検出が可能であるから、採血(液体処理:検体)量は少
量であり、そのため、被検者(患者)は勿論、採血者側
の負担も極めて軽くなる。 3)検体を保存、処理、移動するための容器、器具を必
要としない。即ち、単に少量の血液を採取するための器
具だけでよい。結果として、経済的である。 4)検体を採取してから、結果が判明するまで、最大で
も15分程度であるから、すぐに臨床、診断に活用する
ことができる。 5)被検者及び検査者側に、肉体的、精神的及び時間的
な負担がかからないので、精密な病態生理を把握するた
め、繰り返し測定することも容易である。結果として、
正確な診療ができる。 6)更に、本発明(技術)を他の測定成分に適用するこ
とにより、従来困難とされていた検査項目(例えば、乳
酸とピルビン酸)が、簡便に測定可能となる。そのた
め、臨床上意義深い、必要な新規検査項目の発掘(開
発)にも効果を奏するものと考えられる。 このように、本発明方法は体液(血液、尿)中のケトン
体測定を大幅に合理化するだけでなく、本発明の基本技
術を応用することにより、計り知れない実用的効果をも
たらすものと考えられる。
【図1】ケトン体の相互関係を示す説明図である。
【図2】アセト酢酸(AcAc)について、従来法(酵
素法)と本発明方法の相関関係を示すグラフである。
素法)と本発明方法の相関関係を示すグラフである。
【図3】本発明に使用するガス分析装置の一例を示す概
略図である。
略図である。
1 恒温部 2 ガス分析装置 3 試料注入口 4 ヒードブロック部 5 クロマトカラム 6 検出器
Claims (6)
- 【請求項1】 ケトン体を含む液体試料の一定量を秤量
し、該秤量した液体試料を加熱することにより試料中の
アセト酢酸を気化分解してアセトンに変換し、試料ガス
中のアセトンをガス分析器で分析することを特徴とする
アセト酢酸の分別定量方法。 - 【請求項2】 ケトン体を含む液体試料中のヒドロキシ
酪酸を、酵素的或いは非酵素的にアセト酢酸に変換し、
該アセト酢酸を含む一定量の試料を加熱することにより
試料中のアセト酢酸を気化分解してアセトンに変換し、
試料ガス中のアセトンをガス分析器で分析することを特
徴とする全ケトン体の定量方法。 - 【請求項3】 ケトン体を含む液体試料中のヒドロキシ
酪酸及びアセト酢酸を、酵素的或いは非酵素的にアセト
ンに変換し、該アセトンを含む一定量の試料を加熱する
ことにより気化し、試料ガス中のアセトンをガス分析器
で分析することを特徴とする全ケトン体の定量方法。 - 【請求項4】 ケトン体を含む液体試料中のヒドロキシ
酪酸を酵素的或いは非酵素的にアセト酢酸に変換した場
合と、アセト酢酸に変換しない場合において、いずれも
試料を加熱してアセト酢酸をアセトンに変換して分析
し、後者からアセト酢酸の値を求め、両者の差からヒド
ロキシ酪酸の値を求めることを特徴とするケトン体の分
別定量方法。 - 【請求項5】 ケトン体を含む液体試料中のヒドロキシ
酪酸を酵素的或いは非酵素的にアセトンに変換した場合
と、アセトンに変換しない場合において、いずれも試料
を加熱してガス分析によりアセトンを分析し、後者から
アセト酢酸の値を求め、両者の差からヒドロキシ酪酸の
値を求めることを特徴とするケトン体の分別定量方法。 - 【請求項6】 ガス成分を分画するクロマトカラム部の
前に、注入された液体試料を中のアセト酢酸を気化分解
してアセトンに変換するための60℃〜150℃に加熱
されたヒートブロックを組み込んだことを特徴とするケ
トン体の分別測定装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32959394A JPH08160038A (ja) | 1994-12-01 | 1994-12-01 | ケトン体の分別定量方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32959394A JPH08160038A (ja) | 1994-12-01 | 1994-12-01 | ケトン体の分別定量方法及び装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08160038A true JPH08160038A (ja) | 1996-06-21 |
Family
ID=18223087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32959394A Pending JPH08160038A (ja) | 1994-12-01 | 1994-12-01 | ケトン体の分別定量方法及び装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH08160038A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111448458A (zh) * | 2017-09-07 | 2020-07-24 | 力保科学公司 | 多参数代谢脆弱性指数评估 |
-
1994
- 1994-12-01 JP JP32959394A patent/JPH08160038A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111448458A (zh) * | 2017-09-07 | 2020-07-24 | 力保科学公司 | 多参数代谢脆弱性指数评估 |
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