JPH08126498A - Ｄｎａ解析法 - Google Patents
Ｄｎａ解析法Info
- Publication number
- JPH08126498A JPH08126498A JP26855194A JP26855194A JPH08126498A JP H08126498 A JPH08126498 A JP H08126498A JP 26855194 A JP26855194 A JP 26855194A JP 26855194 A JP26855194 A JP 26855194A JP H08126498 A JPH08126498 A JP H08126498A
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- JP
- Japan
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- dna
- primer
- amount
- concentration
- reaction
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- Pending
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】試料試薬量を最適化し、微量の試料を効率良く
調製する技術を提供する。 【構成】ハイブリダイズの様式を式化しそれを使用して
いくつかの実験データから、ハイブリダイズ速度定数を
求め、あらゆる濃度における鋳型ＤＮＡ１の量とプライ
マ５の量を、ハイブリダイズ式から求めこれを基に、各
試薬量を最適化する。
調製する技術を提供する。 【構成】ハイブリダイズの様式を式化しそれを使用して
いくつかの実験データから、ハイブリダイズ速度定数を
求め、あらゆる濃度における鋳型ＤＮＡ１の量とプライ
マ５の量を、ハイブリダイズ式から求めこれを基に、各
試薬量を最適化する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ等の核酸の解析法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来のＤＮＡのシーケンシングでは、鋳
型ＤＮＡ量を０.５〜３pmol 、プライマ量は０.５〜３p
mol 酵素を１〜２ｕ使用していた。この範囲は、鋳型Ｄ
ＮＡ量に対して、プライマ量および酵素量が、充分量で
あり鋳型に相当する反応プロダクツが得られる。従来の
装置の感度は、この量で難点があった。シーケンシング
を行っていたため、試料量が多く必要で、ランニングコ
ストが高くなる難点があった。このような、従来技術に
関しては、TaKaRaバイオテクノロジーカタログ遺伝子工
学製品ガイド(P130〜P145)に記載がある。
型ＤＮＡ量を０.５〜３pmol 、プライマ量は０.５〜３p
mol 酵素を１〜２ｕ使用していた。この範囲は、鋳型Ｄ
ＮＡ量に対して、プライマ量および酵素量が、充分量で
あり鋳型に相当する反応プロダクツが得られる。従来の
装置の感度は、この量で難点があった。シーケンシング
を行っていたため、試料量が多く必要で、ランニングコ
ストが高くなる難点があった。このような、従来技術に
関しては、TaKaRaバイオテクノロジーカタログ遺伝子工
学製品ガイド(P130〜P145)に記載がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このように多量に試薬
を消耗する従来法でゲノム解析など多量のＤＮＡを解析
しようとすると試薬コストが膨大になり実用的でない。
試薬コストを下げるには、微量の試料で計測できる高感
度装置の開発と微量の試料で試料調製する技術の開発が
課題である。そこで、高感度を達成する最適化を行い従
来を二桁上まわる装置を開発したが（Electrophoresis
1992,13,542−546）、微量の試料を、効率良く調製する
技術の開発が課題であった。
を消耗する従来法でゲノム解析など多量のＤＮＡを解析
しようとすると試薬コストが膨大になり実用的でない。
試薬コストを下げるには、微量の試料で計測できる高感
度装置の開発と微量の試料で試料調製する技術の開発が
課題である。そこで、高感度を達成する最適化を行い従
来を二桁上まわる装置を開発したが（Electrophoresis
1992,13,542−546）、微量の試料を、効率良く調製する
技術の開発が課題であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】微量の試料を調製するた
めには、（１）ＤＮＡが容器の壁に吸着することを防止
すること、（２）反応を最適化し、試薬の無駄を省くこ
とが必要である。第１の点については、Tween20，Trito
nXなどの界面活性剤を加えれば良い。第２の点について
は、ＤＮＡ相補鎖合成反応に関与している諸因子を明確
にすると共に反応速度定数を求め、これを基に各試薬量
を最適化することにより試薬量の低減を行う。
めには、（１）ＤＮＡが容器の壁に吸着することを防止
すること、（２）反応を最適化し、試薬の無駄を省くこ
とが必要である。第１の点については、Tween20，Trito
nXなどの界面活性剤を加えれば良い。第２の点について
は、ＤＮＡ相補鎖合成反応に関与している諸因子を明確
にすると共に反応速度定数を求め、これを基に各試薬量
を最適化することにより試薬量の低減を行う。
【０００５】微量ＤＮＡとの反応を、進行させるには、
多量のプライマあるいは、酵素を加えれば良いが、試薬
コストがかかる上、余剰プライマが測定を妨害してしま
う。そこで、反応の律速が、プライマがＤＮＡにハイブ
リダイズする速度であることを確かめ、その速度定数
(７.５×１０5Ｍ-1sec-1）を求め、これを用いて条件を
最適化した。
多量のプライマあるいは、酵素を加えれば良いが、試薬
コストがかかる上、余剰プライマが測定を妨害してしま
う。そこで、反応の律速が、プライマがＤＮＡにハイブ
リダイズする速度であることを確かめ、その速度定数
(７.５×１０5Ｍ-1sec-1）を求め、これを用いて条件を
最適化した。
【０００６】ハイブリダイゼーション産物の量Ｙ(ｔ)
は、数１と表せる。
は、数１と表せる。
【０００７】
【数１】
【０００８】ここで、Ｄ(０)，Ｐ(０)は、鋳型ＤＮＡお
よび、プライマの初期濃度であり、ｋは、ハイブリダイ
ゼーションの反応速度定数、ｔは反応時間である。プラ
イマ濃度は、通常鋳型濃度より大きいので、これは近似
的に数２と表せる。
よび、プライマの初期濃度であり、ｋは、ハイブリダイ
ゼーションの反応速度定数、ｔは反応時間である。プラ
イマ濃度は、通常鋳型濃度より大きいので、これは近似
的に数２と表せる。
【０００９】
【数２】 Ｙ(ｔ)〜ｋＤ(０)・Ｐ(０)ｔ …（数２） ｋＰ(０)ｔ≧１の条件下では、Ｙ(ｔ)は、ほぼ、鋳型濃
度に等しくできる。すなわち、Ｐ(０)≧ｋｔ-1の条件下
でできるだけ、低いプライマ濃度を用いれば良い。反応
時間を５分（３００秒）とし、反応体積を１〜３μｌと
することにより、必要なプライマおよび酵素量を小さく
できる。
度に等しくできる。すなわち、Ｐ(０)≧ｋｔ-1の条件下
でできるだけ、低いプライマ濃度を用いれば良い。反応
時間を５分（３００秒）とし、反応体積を１〜３μｌと
することにより、必要なプライマおよび酵素量を小さく
できる。
【００１０】
【作用】プライマ濃度を、１０-7〜１０-8Ｍとし反応体
積を、１〜３μｌとすることにより、従来より、二桁少
ないプライマ消費と、これに対応して、二桁少ない酵素
を用いて、試料調製（相補鎖合成反応）を行うことがで
き、試薬のコスト低減を実現できる。
積を、１〜３μｌとすることにより、従来より、二桁少
ないプライマ消費と、これに対応して、二桁少ない酵素
を用いて、試料調製（相補鎖合成反応）を行うことがで
き、試薬のコスト低減を実現できる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明の第１の実施例を図１ないし図
６を用いて説明する。図１は、ハイブリダイズ反応図で
ある。図２は、本発明の基本となるハイブリダイズ速度
定数を求めるためのデータをグラフ化したものである。
図３は、ＤＮＡシーケンサの説明図である。図４（ａ）
は、鋳型ＤＮＡ量とプライマ量を、最適化しない場合の
シーケンシングパターンである。同図（ｂ）は、鋳型Ｄ
ＮＡ量とプライマ量を、最適化した場合のシーケンシン
グパターンである。図５は、鋳型ＤＮＡ量が従来よりも
三桁少ない５×１０-15mol使用した時に酵素量の少量化
を行った図である。図６（ａ）は、鋳型ＤＮＡ量とプラ
イマ量を最適化しない場合のプローブ法データである。
（ｂ）は、鋳型ＤＮＡ量とプライマ量を、最適化した場
合のプローブ法データである。
６を用いて説明する。図１は、ハイブリダイズ反応図で
ある。図２は、本発明の基本となるハイブリダイズ速度
定数を求めるためのデータをグラフ化したものである。
図３は、ＤＮＡシーケンサの説明図である。図４（ａ）
は、鋳型ＤＮＡ量とプライマ量を、最適化しない場合の
シーケンシングパターンである。同図（ｂ）は、鋳型Ｄ
ＮＡ量とプライマ量を、最適化した場合のシーケンシン
グパターンである。図５は、鋳型ＤＮＡ量が従来よりも
三桁少ない５×１０-15mol使用した時に酵素量の少量化
を行った図である。図６（ａ）は、鋳型ＤＮＡ量とプラ
イマ量を最適化しない場合のプローブ法データである。
（ｂ）は、鋳型ＤＮＡ量とプライマ量を、最適化した場
合のプローブ法データである。
【００１２】図１に示す鋳型となるＤＮＡ１を、プライ
マ４を加えた状態でアルカリ変性またはヒートショック
で１本鎖にする。これを、３７℃で２０min 加温するこ
とにより、鋳型ＤＮＡ１にプライマ４をハイブリダイズ
させる。ハイブリダイズ効率は、鋳型ＤＮＡ１とプライ
マ４の衝突効率に比例するので、鋳型ＤＮＡ１の濃度が
小さい場合、プライマ４がある一定量以上ないと下がっ
てしまう。
マ４を加えた状態でアルカリ変性またはヒートショック
で１本鎖にする。これを、３７℃で２０min 加温するこ
とにより、鋳型ＤＮＡ１にプライマ４をハイブリダイズ
させる。ハイブリダイズ効率は、鋳型ＤＮＡ１とプライ
マ４の衝突効率に比例するので、鋳型ＤＮＡ１の濃度が
小さい場合、プライマ４がある一定量以上ないと下がっ
てしまう。
【００１３】高感度のＤＮＡシーケンサ（検出限界３×
１０-20mol／band）を使用し、鋳型ＤＮＡ１として、５
×１０-15molを用いた、ハイブリダイズする時の反応体
積は、５μｌなので鋳型ＤＮＡ１の濃度は１×１０-15m
ol／μｌである。ハイブリダイゼーション反応は、数１
に従う。
１０-20mol／band）を使用し、鋳型ＤＮＡ１として、５
×１０-15molを用いた、ハイブリダイズする時の反応体
積は、５μｌなので鋳型ＤＮＡ１の濃度は１×１０-15m
ol／μｌである。ハイブリダイゼーション反応は、数１
に従う。
【００１４】図４に示したハイブリダイズ速度定数(７.
５×１０5Ｍ-1sec-1）を用いて必要なプローブ濃度を算
出すると５×１０-15mol／μｌ以上となる。ハイブリダ
イズする時の反応体積は、５μｌであるからプローブ量
は、２.５×１０-14mol 以上である。その間に、０.１
ｍＭ デオキシヌクレオチドmix と、１ｍＭダイデオキ
シヌクレオチド（ｄＮＴＰ／ｄｄＡＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄ
ｄＣＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＧＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＴＴ
Ｐの４種）溶液をそれぞれ４本のチューブに０.８μｌ
分注する。ハイブリダイズの終了した試料に、蒸留水２
μｌ，酵素希釈液２.１μｌ を加えｄＮＴＰ／ｄｄＡＴ
Ｐ，ｄＮＴＰ／ｄｄＣＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＧＴＰ，ｄ
ＮＴＰ／ｄｄＴＴＰを分注したチューブに２.１μｌ ず
つ分注し、３７℃，１０min で伸長反応を行う。
５×１０5Ｍ-1sec-1）を用いて必要なプローブ濃度を算
出すると５×１０-15mol／μｌ以上となる。ハイブリダ
イズする時の反応体積は、５μｌであるからプローブ量
は、２.５×１０-14mol 以上である。その間に、０.１
ｍＭ デオキシヌクレオチドmix と、１ｍＭダイデオキ
シヌクレオチド（ｄＮＴＰ／ｄｄＡＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄ
ｄＣＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＧＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＴＴ
Ｐの４種）溶液をそれぞれ４本のチューブに０.８μｌ
分注する。ハイブリダイズの終了した試料に、蒸留水２
μｌ，酵素希釈液２.１μｌ を加えｄＮＴＰ／ｄｄＡＴ
Ｐ，ｄＮＴＰ／ｄｄＣＴＰ，ｄＮＴＰ／ｄｄＧＴＰ，ｄ
ＮＴＰ／ｄｄＴＴＰを分注したチューブに２.１μｌ ず
つ分注し、３７℃，１０min で伸長反応を行う。
【００１５】この時、酵素量は鋳型量に応じていなくて
もよく、図５に示したように、従来の１００分の１量か
ら１０００分の１量ですむ。実際これらの条件下で反応
してもピーク強度は変わらない。反応後、チューブに２
μｌのホルムアミドを加えて反応を停止する。高感度装
置にセットした５％アクリルアミドゲル１３に２μｌず
つアプライする。４０cmの泳動板１２に１４００Ｖの印
加電圧をかけて、DNAを分離する。
もよく、図５に示したように、従来の１００分の１量か
ら１０００分の１量ですむ。実際これらの条件下で反応
してもピーク強度は変わらない。反応後、チューブに２
μｌのホルムアミドを加えて反応を停止する。高感度装
置にセットした５％アクリルアミドゲル１３に２μｌず
つアプライする。４０cmの泳動板１２に１４００Ｖの印
加電圧をかけて、DNAを分離する。
【００１６】泳動されてきたＤＮＡ断片１５は、泳動板
下部１０cmに照射されたレーザ１７により励起され、カ
メラ２１により検出される。検出されたデータは、コン
ピュータ２２により処理され、図４（ａ）に示すような
データを出す。
下部１０cmに照射されたレーザ１７により励起され、カ
メラ２１により検出される。検出されたデータは、コン
ピュータ２２により処理され、図４（ａ）に示すような
データを出す。
【００１７】図４（ｂ）は、プローブ量を最適化せず鋳
型ＤＮＡ量に対してプライマ量を１００〜１０００倍使
用した時に得られるシーケンシングパターンである。使
用されるプライマは、１００〜１０００分の１なのでほ
とんどが未反応のプライマである。従って、泳動されて
きた大量の未反応のプライマの蛍光が裾をひいてしま
い、初めの数塩基のシーケンシングピークに蛍光がかぶ
って検出されなかった。未反応のプライマピーク２３が
大量に泳動され蛍光を発するため、カメラの素子を壊し
てしまう。また、長く伸びた塩基領域でもプライマ不純
物由来のゴーストピーク２４が検出される。
型ＤＮＡ量に対してプライマ量を１００〜１０００倍使
用した時に得られるシーケンシングパターンである。使
用されるプライマは、１００〜１０００分の１なのでほ
とんどが未反応のプライマである。従って、泳動されて
きた大量の未反応のプライマの蛍光が裾をひいてしま
い、初めの数塩基のシーケンシングピークに蛍光がかぶ
って検出されなかった。未反応のプライマピーク２３が
大量に泳動され蛍光を発するため、カメラの素子を壊し
てしまう。また、長く伸びた塩基領域でもプライマ不純
物由来のゴーストピーク２４が検出される。
【００１８】本発明の第２の実施例を図１ないし図４を
用いて説明する。プローブ法により、検出したいＤＮＡ
試料量を決定する。例えば、第１の実施例と同様に高感
度のＤＮＡシーケンサ（検出限界３×１０-20mol／ban
d）を使用する場合には、１×１０-16molとした。これ
に対して、ハイブリダイズ速度定数7.5×105Ｍ-1sec-1
を使用して必要なプローブ量を求めると、１×１０-15m
olである。５×バッファ−０.５μｌ を加えて１.５μ
ｌ のアニール溶液とする。これを、６５℃，１０min
で加温し３７℃，２０min でハイブリダイズする。
用いて説明する。プローブ法により、検出したいＤＮＡ
試料量を決定する。例えば、第１の実施例と同様に高感
度のＤＮＡシーケンサ（検出限界３×１０-20mol／ban
d）を使用する場合には、１×１０-16molとした。これ
に対して、ハイブリダイズ速度定数7.5×105Ｍ-1sec-1
を使用して必要なプローブ量を求めると、１×１０-15m
olである。５×バッファ−０.５μｌ を加えて１.５μ
ｌ のアニール溶液とする。これを、６５℃，１０min
で加温し３７℃，２０min でハイブリダイズする。
【００１９】ハイブリダイズが終了した試料に、０.１
ｍＭデオキシヌクレオチドmix と、1ｍＭダイデオキシ
ヌクレオチド(３種の塩基から構成されるデオキシヌク
レオチドと残りの１塩基から構成されるダイデオキシヌ
クレオチド）溶液０.５μｌ 分注する。これに酵素希釈
液０.７μｌ を加え、３７℃，１０min で伸長反応を行
う。
ｍＭデオキシヌクレオチドmix と、1ｍＭダイデオキシ
ヌクレオチド(３種の塩基から構成されるデオキシヌク
レオチドと残りの１塩基から構成されるダイデオキシヌ
クレオチド）溶液０.５μｌ 分注する。これに酵素希釈
液０.７μｌ を加え、３７℃，１０min で伸長反応を行
う。
【００２０】この時、酵素量は図５に示したように、従
来の１００分の１量から１０００分の１量で反応しても
ピーク強度は変わらない。反応後、チューブに１μｌの
ホルムアミドを加えて反応を停止する。高感度装置に、
セットしたゲルに２μｌ，８％（アクリルアミド／ビス
＝２９：１）アクリルアミドゲル１３にアプライする。
３５cmの泳動板に１４００Ｖの印加電圧をかけてＤＮＡ
を分離する。泳動されてきたＤＮＡ断片１５は、泳動板
下部６.５cm に照射されたレーザ１７により励起され、
カメラ２２により検出される。検出されたデータは、コ
ンピュータ２３により処理され、図６に示すようなデー
タを出す。
来の１００分の１量から１０００分の１量で反応しても
ピーク強度は変わらない。反応後、チューブに１μｌの
ホルムアミドを加えて反応を停止する。高感度装置に、
セットしたゲルに２μｌ，８％（アクリルアミド／ビス
＝２９：１）アクリルアミドゲル１３にアプライする。
３５cmの泳動板に１４００Ｖの印加電圧をかけてＤＮＡ
を分離する。泳動されてきたＤＮＡ断片１５は、泳動板
下部６.５cm に照射されたレーザ１７により励起され、
カメラ２２により検出される。検出されたデータは、コ
ンピュータ２３により処理され、図６に示すようなデー
タを出す。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、非常に少ないプライマ
量と酵素の量を用いて効率良く相補鎖合成できるのでラ
ンニングコストの低減をできる。さらに、大過剰のプラ
イマを使用したときに生じる、難点、読みたいピークの
上に蛍光がかぶってしまう、プライマ不純物由来のゴー
ストピークが検出されるなどの問題が解消される、ある
いは低減される。
量と酵素の量を用いて効率良く相補鎖合成できるのでラ
ンニングコストの低減をできる。さらに、大過剰のプラ
イマを使用したときに生じる、難点、読みたいピークの
上に蛍光がかぶってしまう、プライマ不純物由来のゴー
ストピークが検出されるなどの問題が解消される、ある
いは低減される。
【図１】ハイブリダイゼーションの反応の説明図。
【図２】鋳型ＤＮＡ量とプライマ量のハイブリダイズ反
応効率の特性図。
応効率の特性図。
【図３】高感度ＤＮＡシーケンサの説明図。
【図４】鋳型ＤＮＡ量とプライマ量を変えた場合の検出
結果の特性図。
結果の特性図。
【図５】酵素量と反応効率の特性図。
【図６】プローブ法の検出結果の特性図。
１…２本鎖鋳型ＤＮＡ、２…１本鎖鋳型ＤＮＡ＋鎖、３
…１本鎖鋳型ＤＮＡ−鎖、４…フリーのプライマ、５…
ハイブリダイズしたプライマ。
…１本鎖鋳型ＤＮＡ−鎖、４…フリーのプライマ、５…
ハイブリダイズしたプライマ。
Claims (1)
- 【請求項１】使用する目的ＤＮＡ濃度が、１０-8Ｍで、
目的ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識ＤＮＡプライ
マの濃度が、１０-7Ｍ〜１０-8Ｍの範囲にあり、使用す
る相補鎖合成酵素濃度が、０.１ ユニット以下で、反応
に用いる酵素量が、５μｌ以下であることを特徴とする
ＤＮＡ解析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26855194A JPH08126498A (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | Ｄｎａ解析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26855194A JPH08126498A (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | Ｄｎａ解析法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08126498A true JPH08126498A (ja) | 1996-05-21 |
Family
ID=17460110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26855194A Pending JPH08126498A (ja) | 1994-11-01 | 1994-11-01 | Ｄｎａ解析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08126498A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009204448A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-10 | Hitachi High-Technologies Corp | 自動分析装置 |
-
1994
- 1994-11-01 JP JP26855194A patent/JPH08126498A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009204448A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-10 | Hitachi High-Technologies Corp | 自動分析装置 |
| JP4654256B2 (ja) * | 2008-02-28 | 2011-03-16 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 自動分析装置 |
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