JPH0782285A - ポルフィリン・リン酸エステル誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なポルフィリン・リン酸エステル誘導体
を提供する。 【構成】 次式Ｉ： 【化１】 〔式中、φは式II，III 又はIVで表わされる基を表わ
す〕で表わされるポルフィリンアリールリン酸エステル
誘導体又はその金属錯体。 【効果】 アルカリホスファターゼ活性の高感度測定方
法、酵素免疫測定方法、微量金属イオンの定量方法、Ｍ
ＲＩ造影剤、及び動脈硬化巣のＭＲＩ造影方法のために
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なポルフィリンア
リールリン酸エステル誘導体又はその金属錯体、並びに
前記誘導体又はその金属錯体を利用したアルカリホスフ
ァターゼ活性の高感度測定方法、酵素免疫測定方法、微
量金属イオンの定量方法、ＭＲＩ造影剤、及び動脈硬化
巣のＭＲＩ造影方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ポルフィリンは自然界に広く分布し、例
えば植物中にあって光合成を行うクロロフィル（マグネ
シウム錯体）、脊椎動物の赤血球中で酸素と可逆的に結
合し、これを運搬するヘモグロビン（鉄錯体）、軟体動
物の体液中に存在するヘモシアニン等の金属含有酵素類
の活性中心は全て、ポルフィリン又はその類似骨格から
成っている。近年、これらの機能とは別のポルフィリン
の他の種々の機能を利用する研究も盛んに成されてお
り、例えばレーザーを用いる光ホールバーニング素子
〔谷，応用物理，56，1307（1987）〕、蛍光特性を利用
したガンの治療・診断薬〔西坂，化学と工業，41， 311
（1988）〕としてのポルフィリン化合物の応用例が報告
されている。また、水溶性ポルフィリン化合物を金属イ
オンの高感度吸光・蛍光分析試薬〔五十嵐，ぶんせき，
1989， 190〕、或いは動脈硬化症診断ＭＲＩ造影剤
〔金，大阪大学医学雑誌，42， 1（1990）〕等として使
用した例も報告されている。

【０００３】ポルフィリン及びその金属錯体は高感度な
スペクトル特性（例えば、吸光，蛍光，リン光）などの
優れた機能を備えてる反面、例えば水に対して難溶性で
あるなどの欠点も有している。ポルフィリン又はその金
属錯体の特性を分析化学や医学の分野で利用する場合に
は、ポルフィリン又はその金属錯体は水溶性であること
が好ましい。前述の如く、水溶性ポルフィリンに関する
研究も成されており、このような水溶性ポルフィリンを
得るための親水性置換基〔五十嵐，ぶんせき，1989， 1
90〕としては、アニオン性のスルホン基、カルボキシル
基、ヒドロキシル基、カチオン性のトリメチルアンモニ
ウム基、メチルピリジニウム基、両性イオン型のスルホ
ベタイン基〔Igarashi,Yotsuyanagi, Chem.Lett., 198
4，1871〕等が報告されている。

【０００４】一方、酵素を標識とする酵素免疫測定方法
は検体検査技術の一つとして急速に実用化されており、
現在の医療技術を語る上で欠くことのできない存在とな
っている。標識化した酵素の定量法には主に比色法、蛍
光法、発光法の三種があるが、その簡便さなどから比色
法や蛍光法を用いる酵素の高感度定量法の開発に対する
要望が高まっている。前記の如く、ポルフィリン化合物
は高感度吸光・蛍光スペクトル特性を有することが知ら
れており、比色法や蛍光法などにおける定量手段として
酵素免疫測定方法にも応用し得る可能性がある。

【０００５】ポルフィリン化合物は波長400 〜500nm に
ソーレ（Soret ）帯と呼ばれる非常に鋭い吸収帯を持
つ。そのモル吸光係数は数十万と大きい。また、ポルフ
ィリンは幾つかの金属イオンと非常に安定な錯体を形成
し、錯形成反応に伴いソーレ帯のピーク波長がシフトす
る。以上の諸理由により、ポルフィリン化合物を微量金
属イオンの高感度吸光分析試薬として利用した例が数多
く報告されている〔五十嵐，ぶんせき，1989， 190〕。

【０００６】更に、ヘマトポルフィリンをはじめとする
生体由来のポルフィリン化合物は、ガン腫瘍に選択的に
集積することが知られており、その特性を利用して例え
ば、ポルフィリン化合物の蛍光スペクトル特性に基づく
エキシマ励起色素レーザーによる皮膚ガンの診断・治療
或いは放射性金属 ¹⁰⁹Ｐｄ，⁶⁷Ｇａ及び⁶⁴Ｃｕ−ポルフ
ィリンキレートを用いる放射化診断法など種々の診断法
の開発が行われている。

【０００７】また最近、種々の病変部を画像として捉え
るＮＭＲイメージング法（ＭＲＩ）が、非侵襲的・非破
壊的な臨床診断法の一つとして注目されているが、通常
のＭＲＩ測定では病変部と正常部組織との間のコントラ
ストを高める目的で、ＭＲＩ試薬（造影剤）の使用を必
要とする場合が多い。常磁性金属イオン〔Ｍｎ（II
I），Ｆｅ（III ）及びＧｄ（III ）〕の水溶性金属ポ
ルフィリンキレートのガン腫瘍をはじめとする各種生体
組織への集積とＭＲＩ試薬としての可能性が検討された
結果、前記金属ポルフィリンキレートがガン腫瘍に特異
的に集積すること、また組織における水プロトンのＮＭ
Ｒ緩和時間を短縮することが見出され、その有用性が報
告されている〔R.C.Lyon他，Magn. Reson. Med.,４，24
（1987）〕。

【０００８】一方、動脈硬化病変に起因する心臓や脳の
虚血性病変（心臓疾患及び脳溢血）は、その早期発見及
び早期治療の重要性が指摘されている。コレステロール
相やガン腫瘍に選択的に吸着するポルフィリン化合物が
知られており、各種診断法（レーザー蛍光、画像診断法
等）への応用が期待されている。例えば、マンガン（II
I ）−α，β，γ，δ−テトラキス（４−スルホフェニ
ル）ポルフィンキレート（以下、Ｍｎ−ＴＳＰＰと略記
する）を動脈硬化症、特にその早期病変部のＭＲＩ画像
を測定するための造影剤として用いることが提案されて
いる〔金，大阪大学医学雑誌，42， 1（1990）〕。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ポルフィリン化合物の
用途を更に拡大するために、又はポルフィリン化合物を
用いた場合の効果を更に優れたものとするために、合成
が容易で且つ前述の如き種々の用途に好適に使用するこ
とができる新規な水溶性ポルフィリンに対する強い要望
があった。

【００１０】本発明は前記従来技術における問題点を解
決するためのものであり、その目的とするところは、新
規なポルフィリンアリールリン酸エステル誘導体又はそ
の金属錯体、並びに前記誘導体又はその金属錯体を利用
したアルカリホスファターゼ活性の高感度測定方法、酵
素免疫化学的測定方法、微量金属イオンの定量方法、Ｍ
ＲＩ造影剤、及び動脈硬化巣のＭＲＩ造影方法を提供す
ることにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】すなわち本第一の発明の
ポルフィリンアリールリン酸エステル誘導体又はその金
属錯体は、次式Ｉ：

【化３】 〔式中、φは次式II，III 又はIV：

【化４】 で表わされる基を表わす〕で表わされることを特徴とす
る。本第二の発明のアルカリホスファターゼ活性の高感
度測定方法は、前記式Ｉで表わされる化合物の金属錯体
を基質とすることを特徴とする。本第三の発明の酵素免
疫測定方法は、（抗体又は抗原に）標識したアルカリホ
スファターゼの基質として前記式Ｉで表わされる化合物
の金属錯体を用いることを特徴とする。本第四の発明の
微量金属イオンの定量方法は、前記式Ｉで表わされる化
合物と金属イオンとの錯形成反応による吸光度変化を測
定することを特徴とする。本第五の発明のＭＲＩ造影剤
は、前記式Ｉで表わされる化合物の金属錯体を含むこと
を特徴とする。本第六の発明の動脈硬化巣のＭＲＩ造影
方法は、前記式Ｉで表わされる化合物の金属錯体を動脈
硬化巣に蓄積させ、この蓄積した金属錯体を追跡するこ
とを特徴とする。

【００１２】本発明者らは界面活性剤及び生理活性物質
等の親水基として知られるリン酸エステル基に着目し、
リン酸エステル基を有する３種類の新規水溶性ポルフィ
リン化合物｛５，10，15，20−テトラキス（４−ホス
フォノフェニル）ポルフィン、５，10，15，20−テト
ラキス（３，４−ジホスフォノフェニル）ポルフィン及
び５，10，15，20−テトラキス（３，４，５−トリホ
スフォノフェニル）ポルフィン｝を合成した（第一の発
明）。更に、これらのｉ）酵素活性高感度プローブ試薬
（第二及び第三の発明）、ii）金属イオンの分析試薬
（第四の発明）及びiii)動脈硬化症診断試薬への応用
（第五及び第六の発明）について検討を行い、前記各発
明を成すに到った。

【００１３】即ち、本新規ポルフィリン・リン酸エステ
ル誘導体の金属錯体（本第一の発明）を用い、酵素反応
によって外側のリン酸エステル結合を加水分解させたと
ころポルフィン核固有のソーレ帯における吸収スペクト
ルがシフトする現象を見出した。本第二の発明はこの現
象を利用してアルカリホスファターゼ酵素活性の高感度
定量を行うものであり、本第三の発明は同様に酵素免疫
測定方法において標識したアルカリホスファターゼの基
質として本新規ポルフィリン・リン酸エステル誘導体を
利用するものである。また、本新規ポルフィリン・リン
酸エステル誘導体を用いて、微量金属イオン例えば10^-7
ＭレベルのＣｕ（II）イオンの吸光光度定量法を確立し
た（本第四の発明）。更に、本発明者らは動脈硬化症に
ターゲットを絞り、本新規ポルフィリン・リン酸エステ
ル誘導体及びその金属錯体例えばＭｎ錯体を用いて、モ
デル担体への吸着特性の評価を行い、本新規ポルフィリ
ン・リン酸エステル誘導体の金属錯体がＭＲＩ造影剤と
して有用であることを見出した（本第五及び第六の発
明）。

【００１４】

【作用】本発明の新規な水溶性ポルフィリン化合物は、
合成が容易であると共に界面活性剤及び生理活性物質等
の親水基として知られるリン酸エステル基をポルフィリ
ン１分子当たり４〜１２個含んでいるため、水に易溶性
（水溶性）であり且つ生体組織に対する適合性及び安全
性が優れており、それ故、種々の用途に対して好ましく
適用することができる。

【００１５】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明する。

【００１４】実施例１：ポルフィリンアリールリン酸エ
ステル誘導体又はその金属錯体の合成（第一の発明） １−１：試薬の合成法 本発明の化合物（φが式II，III 及びIVで表わされる基
を表わす式Ｉで表わされる化合物）を含む各種ポルフィ
リン誘導体の構造とその略号を以下に示す。

【化５】 これらはアドラーの方法〔A.D.Adler,et.al., J.Org.Ch
em., 32， 476（1967）〕に準拠して合成した。なお、
他の試薬は特に表記されていない限り市販品特級を用
い、水は再蒸留水を使用した。

【００１６】１−１−１ａ：ＴＨＰＰの合成 全還流冷却器をつけた2000mlのセパラブルフラスコに約
1000mlのプロピオン酸（1000g ）を入れ、マントルヒー
ターで加熱した。沸騰後、50g パラヒドロキシベンズア
ルデヒドと等モル量のピロール（27.5g ）を滴下した。
20分間還流後、反応溶液を室温まで放冷し、一晩熟成し
た。紫色の結晶が析出したら、これをＧ３ガラスフィル
ターでろ過した。ろ塊をプロピオン酸、水の順で洗浄し
た後、エタノールに溶かした。ロータリーエバポレータ
で蒸発乾固させた後、真空乾燥した。収量28g （収率36
％）。

【００１７】１−１−１ｂ：ＴＰＰＰｍの合成（φが式
IIで表わされる基を表わす式Ｉで表わされる化合物） 100mlビーカーにピロリン酸12g と五酸化リン３g を入
れ、スターラーで攪拌しながらホットプレート上で 100
℃〜 120℃に加熱する。溶液の粘性が小さくなってきた
ら１−１−１ａの方法で合成したＴＨＰＰを 0.5g 加
え、約２時間加熱を続ける。室温に放冷後、1000mlアセ
トンに攪拌しながら少しずつ滴下する。30分攪拌後、冷
蔵庫で一晩熟成させ、Ｇ４ガラスフィルターでろ過す
る。ろ塊を数回、冷アセトンで洗浄後、乾燥させてから
数滴の水に溶かす。この濃厚溶液を攪拌しながら 500ml
のアセトンに滴下し、更に冷蔵庫で一晩熟成後、Ｇ４ガ
ラスフィルターでろ過し、ろ塊を真空乾燥させた。収量
0.8g（収率95％）。反応式を以下に示す。

【化６】

【００１８】１−１−２ａ：Ｔ（ＣＨ₃ Ｏ）₂ ＰＰの合
成 全還流冷却器をつけた2000mlのセパラブルフラスコに約
1200mlのプロピオン酸（1200g ）を入れ、マントルヒー
ターで加熱した。沸騰後、３，４−ジメトキシベンズア
ルデヒド25g と等モル量のピロール（25g ）を滴下し
た。40分間還流後、反応溶液を室温まで放冷した。溶液
を蒸留水で約３倍に希釈し、約 100mlのクロロホルムを
加えて冷蔵庫で冷却した。充分冷却した溶液を更に氷水
で冷却しながら10Ｍの冷水酸化ナトリウム水溶液を加え
た。クロロホルムが析出してきたら分液漏斗でクロロホ
ルムを分別した。そのクロロホルム溶液を水で数度洗浄
後、攪拌しながら 500mlのメタノールに少しずつ滴下し
た。一晩熟成した後、析出した紫色の結晶をＧ４ガラス
フィルターでろ過し、数回メタノールで洗浄した後、真
空乾燥した。収量30g （収率40％）。

【００１９】１−１−２ｂ：ＴＨ₂ ＰＰの合成 １−１−２ａの方法で合成したＴ（ＣＨ₃ Ｏ）₂ ＰＰ
（５g ）を酢酸25mlに溶かし、47％臭化水素酸水溶液を
75ml加え、 100〜120 ℃で約20時間還流した。反応の終
点はＴＬＣにて確認し、スポットが１点となることを確
認し、反応終了とした。反応終了後、Ｇ４フィルターで
ろ過し、ろ塊を酢酸、水の順でよく洗浄してから乾燥さ
せ、酢酸エチルに溶かした。分液漏斗で酢酸エチル溶液
を水で充分洗浄した後、ロータリーエバポレータで蒸発
乾固した。収量３g （収率70％）。

【００２０】１−１−２ｃ：ＴＰＰＰｄの合成（φが式
III で表わされる基を表わす式Ｉで表わされる化合物） ＴＰＰＰｍの合成法に準拠して、１−１−２ｂの方法で
合成したＴＨ₂ ＰＰをリン酸エステル化した。収率95
％。反応式を以下に示す。

【化７】

【００２１】１−１−３ａ：Ｔ（ＣＨ₃ Ｏ）₃ ＰＰの合
成 Ｔ（ＣＨ₃ Ｏ）₂ ＰＰの合成法に準拠して、アドラーの
方法にて合成した。収率40％。

【００２２】１−１−３ｂ：ＴＨ₃ ＰＰの合成 ＴＨ₂ ＰＰの合成法に準拠して、メトキシ基を加水分解
して水酸基にした。収率70％。

【００２３】１−１−３ｃ：ＴＰＰＰｍの合成 ＴＰＰＰｍの合成法に準拠して、ＴＨ₃ ＰＰをリン酸エ
ステル化した。収率95％。反応式を以下に示す。

【化８】

【００２４】１−２：同定 １−２−１：元素分析 Ｃ，Ｈ，Ｎについて元素分析を行った。結果を下記表１
に示す。なお、理論計算ではポルフィリン１分子に対し
て水和水８分子を持つとして計算したものが実測値に最
も近くなったため、それを理論値として示した。

【表１】

【００２５】１−２−２：紫外可視吸収スペクトル 下記表２に各種リン酸エステル誘導体の紫外可視吸収ス
ペクトル特性を示す。何れの化合物も 400〜500nm にモ
ル吸光係数が10⁵ オーダーのポルフィン核固有のソーレ
吸収帯が観測される。

【表２】 ^*)モル吸光係数εはＣｕ（II）との錯形成反応による検
量線より決定した。フィッティング（FITTING ）におけ
る相関係数は全て0.99以上の高い値を示した。

【００２６】下記表３に各種リン酸エステル誘導体のＱ
吸収帯特性を示す。なお、Ｑ吸収帯は光励起エネルギー
凖位を示すものであり、ポルフィリンでは酸性で一つな
いし二つ、中性で三つないし四つのピークを示す。ソー
レ吸収帯及びこれらの吸収が認められればポルフィリン
骨格が存在する証明となる。

【表３】

【００２７】下記表４に各種リン酸エステル誘導体の酸
塩基平衡定数を示す。

【表４】 ^*)pH- 吸光度曲線の実測データより以下の式を用いて計
算した。なおフィッティングにおける相関係数は全て0.
99以上の高い値を示した。

【数１】 ε₁ ：Ｈ₄ Ｐ²⁺のモル吸光係数 ε₂ ：Ｈ₃ Ｐ⁺ のモル吸光係数 ε₃ ：Ｈ₂ Ｐのモル吸光係数

【００２８】１−２−３：蛍光スペクトル 以下に各種リン酸エステル誘導体の化合物の蛍光スペク
トル特性を示す。

【表５】 ^*)1.33×10^-6Ｍ H ₂ TPPS水溶液の蛍光強度を100 とし
て相対強度を測定した。

【００２９】１−２−４：ＩＲスペクトル 図１ないし３に各化合物のＩＲスペクトル及び特徴的な
吸収帯を示す（図１：ＴＰＰＰｍ，図２：ＴＰＰＰｄ，
図３：ＴＰＰＰｔ）。３種類の化合物のスペクトルを特
性基振動数と照合すると、1040〜910cm ^-1付近にＰ−Ｏ
Ｈ結合とみられる伸縮振動帯、1260〜1160cm^-1及び 994
〜855cm ^-1付近にＰ−Ｏ−φ結合とみられる伸縮振動
帯、1299〜1250cm^-1付近にリン酸エステル特有のＰ＝Ｏ
伸縮振動帯とみられる吸収帯がみられたため、これらは
それぞれフェニル基にリン酸エステル基を持つことが確
認された。

【００３０】実施例２：酵素免疫測定方法（例えばアル
カリホスファターゼ酵素活性高感度プローブ試薬）への
応用（第二及び第三の発明） 実施例１で合成したポルフィリン・リン酸エステル誘導
体を用い、酵素反応によって外側のリン酸エステル結合
を加水分解させたところポルフィン核固有のソーレ帯に
おける吸収スペクトルがシフトする現象を見いだした。
本実施例ではこの現象を利用してアルカリホスファター
ゼ酵素活性の高感度定量を行った。

【００３１】２−１：実験 ２−１−１：吸収スペクトル変化の測定 ＴＰＰＰｍの水溶液に１Ｍジエタノールアミン緩衝液を
加えてｐＨを９とし、アルカリホスファターゼ｛SIGMA
TypeI-S From Bovine Intestinal Mucosa 5.8unit/mg
｝を含む試料水溶液を加え、スペクトルの経時変化を
測定した。

【００３２】２−１−２：ｐＨ及び温度による影響 ＴＰＰＰｍの水溶液に１Ｍジエタノールアミン緩衝液を
加えてｐＨを８〜13とし、アルカリホスファターゼを含
む試料水溶液を加え、37℃あるいは25℃に保ち416nmで
の吸光度変化を測定した。

【００３３】２−１−３：緩衝剤の種類による影響 ＴＰＰＰｍの水溶液にジエタノールアミン、ジエタノー
ルアミン＋（Ｚｎ²⁺・Ｍｇ²⁺）、グリシン、グリシン＋
（Ｚｎ²⁺・Ｍｇ²⁺）、酢酸ナトリウムなどを加えｐＨを
9.0とした。更にそれぞれにアルカリホスファターゼを
含む試料水溶液を加え、37℃に保ち 416nmでの吸光度変
化を測定した。

【００３４】２−１−４：検量線作成 ＴＰＰＰｍの水溶液に１Ｍジエタノールアミン緩衝液を
加えてｐＨを 9.0とした。更に、アルカリホスファター
ゼを含む試料水溶液を加え、37℃に保ち 416nmでの吸光
度変化を測定した。

【００３５】２−２：結果及び考察 ２−２−１：吸収スペクトル変化（酵素反応によるＴＰ
ＰＰｍの吸収スペクトル変化） ［酵素］＝1.0 ×10^-8Ｍ、[TPPPm] ＝ 2.3×10^-6Ｍ、ｐ
Ｈ＝９での２分ごとのスペクトル変化を図４に示す。Ｔ
ＰＰＰｍはアルカリ性で 416nm付近にソーレ帯の鋭いピ
ークを持つが、酵素を加えると時間と共にソーレ帯の吸
光度が減少してゆく様子がわかる。これは下記反応式の
如く、酵素反応によりリン酸エステル基が加水分解され
て生成したヒドロキシル基がアルカリ性にてキノイド構
造をとり、ソーレ帯の吸光度が減少したものと考えられ
る。

【化９】

【００３６】２−２−２：ＴＰＰＰｍの吸収スペクトル
におけるｐＨ及び温度による影響 ＴＰＰＰｍは、図５に示すｐＨ−吸光度曲線よりｐＨ８
〜12ではｐＨの変動等に対してはほぼ安定であり吸光度
の変化がみられないことが確認された。図６の如く酵素
反応による吸光度の減少はｐＨ８〜10.5においてみら
れ、図６から最適ｐＨは９前後であることがわかる。ま
た、温度の影響について行った実験では、図６に示され
るように25℃あるいは37℃で何れも大きな差はみられな
かったので、実験は全て恒温槽を用いて37℃で行った。

【００３７】２−２−３：ＴＰＰＰｍの吸収スペクトル
における緩衝剤の種類による影響 図７に示される如く、緩衝剤としてグリシンを用いた場
合、阻害効果が大きいことがわかる。これは同濃度のジ
エタノールアミンや酢酸ナトリウムを用いた場合の加水
分解速度と比較して20〜50倍の差がある。また、少量の
金属イオンを添加することにより阻害効果がほとんどな
くなることから、グリシンが酵素の活性部位のＺｎ（I
I）を引抜くか遮蔽するなどの影響を及ぼしているので
はないかと推測される。そのため、緩衝剤としてはジエ
タノールアミンを選択した。

【００３８】２−２−４：ＴＰＰＰｍの吸収スペクトル
における経時変化及び検量線 図８に酵素濃度を変えた時の吸光度の経時変化を示す。
図９（〜10^-3g/l の検量線１）の如く、30分間を反応の
終点とした時のアルカリホスファターゼの検量線は、
3.2×10^-2〜 6.4×10^-1mg/lの範囲でほぼ直線性を示
し、Ｓ／Ｎ＝３の検出限界は 8.0×10^-5mg/l（10
^-12 Ｍ）であった。なお、理論的には時間を長くするほ
ど高い感度が得られるものと考えられるため、12時間を
反応の終点とした場合について検討を行った。結果は、
図１０（〜10^-5g/l の検量線２）のようにＳ／Ｎ＝３で
５×10^-15 Ｍの検出限界が得られた。

【００３９】なお、同様の方法により、実施例１で合成
したポルフィリン・リン酸エステル誘導体の金属錯体を
標識したアルカリホスファターゼの基質とする酵素免疫
測定方法を行うことができる。

【００４０】実施例３：金属イオンの高感度吸光分析試
薬としての応用（第四の発明） 本実施例ではポルフィリン・リン酸エステル誘導体を用
い、10^-7ＭレベルのＣｕ（II）イオンの吸光光度定量法
を確立した。

【００４１】３−１：定量操作 4.5×10^-6Ｍ ＴＰＰＰｍ水溶液10mlに１Ｍ酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝4.5 ）２mlを加えた。それに
Ｃｕ²⁺を含む試料溶液を加え、還元剤として１Ｍ Ｌ−
アスコルビン酸水溶液２mlを加え、80℃の水溶液中で20
分間加熱した。室温まで放冷後、１Ｍ ＨＣｌ水溶液
0.5mlを加え、さらに蒸留水を加え25mlにメスアップ
し、 413nmにて吸光度変化を測定した。以下、ＴＰＰＰ
ｄ、ＴＰＰＰｔについても同様の操作で検量線を作成し
た。

【００４２】３−２：結果及び考察 図１１にＴＰＰＰｍを用いた場合の検量線３を、図１２
にＴＰＰＰｄを用いた場合の検量線４を、そして図１３
にＴＰＰＰｔを用いた場合の検量線５を、各々示す。何
れの化合物を用いた場合も10^-7〜10^-6Ｍレベルにおいて
高い直線性が得られた。また、それぞれの図は錯体の組
成を決定するモル比法なっており、いづれの錯体も
［銅］：［リン酸エステルポルフィリン］＝１：１錯体
であることを確認した。これらのポルフィリンはＣｕ
（II）の吸光分析試薬としての応用が可能である。

【００４３】実施例４：動脈硬化症診断試薬としての応
用−動脈硬化症モデル担体への吸着特性 本実施例では動脈硬化症にターゲットを絞り、ポルフィ
リン・リン酸エステル誘導体及びそのＭｎ錯体を用い
て、モデル担体への吸着特性の評価を行った。なお、初
期病変部モデルとしてはデオキシコール酸（ＤＣＡ）、
石灰化病変部モデルとして炭酸カルシウムの２種類を用
いた。このＤＣＡを用いたモデル評価と実際の動物実験
との高い相関性は既に報告されている〔五十嵐，神澤，
川上，四ツ柳，金，小塚，日本化学会誌，2, 184 (199
3) 〕。

【００４４】４−１：実験 ４−１−１：Ｍｎ（II）錯体の合成 各種ポルフィリン・リン酸エステル誘導体の10^-5〜10^-4
Ｍ水溶液50mlに 0.1g酢酸マンガン（10〜20倍過剰）及
び 0.7g 酢酸ナトリウムを溶解した。ポルフィリンが沈
殿した後、 0.1Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を適量加えて
ｐＨを 8.5とした。全還流冷却器付のセパラブルフラス
コに入れ、攪拌しながらマントルヒーターで４〜８時間
加熱を続け、反応物のサンプリングにより遊離のポルフ
ィリンのソーレ帯の吸収が消滅したことを確認して反応
の終点とした。空冷後、冷蔵庫で一晩熟成させた後、沈
殿物をＧ４ガラスフィルターでろ過した。過剰のマンガ
ンイオンを除去するために、得られたろ塊に約50mlの酢
酸を加え２時間スターラーで攪拌してＧ４ガラスフィル
ターろ過し、ろ塊をアセトンで数回洗浄した。この操作
を繰り返した後、真空乾燥した。

【００４５】４−１−２：ＤＣＡ担体に対する吸着評価 50mlビーカーに 0.1Ｍ ＤＣＡ溶液 2.0mlを入れ、再蒸
留水20mlを加えたスターラーでよく攪拌した。１Ｍ塩酸
0.5mlを加えＤＣＡを沈殿させた後、約４×10^-6Ｍの各
種ＴＰＰＰ水溶液を 2.5ml入れ15分攪拌した後、Ｇ４ガ
ラスフィルターでろ過を行い、ろ液を50mlにメスアップ
した後、吸光度を測定して吸着率を求めた。また、ろ塊
に 0.1Ｍホウ砂水溶液10mlを加えて溶かし、同様に吸光
度を測定して吸着率の確認を行った。

【００４６】４−１−３：炭酸カルシウム担体に対する
吸着評価 ＤＣＡへの吸着に準じた方法で行った。50mlビーカーに
沈降型炭酸カルシウム0.02ｇを入れ、再蒸留水20mlを加
えスターラーでよく攪拌した。約４×10^-6Ｍの各種ＴＰ
ＰＰ水溶液を 2.5ml入れ、15分攪拌した後Ｇ４ガラスフ
ィルターでろ過を行い、ろ液を50mlにメスアップした
後、吸光度を測定して吸着率を求めた。また、ろ塊に
0.1Ｍ塩酸２mlを加えて溶かし、同様に吸光度を測定し
て吸着率の確認を行った。

【００４７】４−２：結果と考察 各化学種の吸着特性を下記表６に示す。

【表６】 ^*)五十嵐，神澤，川上，四ツ柳，金，小塚，日本化学会
誌，2, 184 (1993)

【００４８】担体への吸着特性について、ＴＰＰＳとＴ
ＰＰＰｍを比較した。溶解度がＴＰＰＳの１／４程度し
かなく、比較的親水性の小さいＴＰＰＰｍだが、遊離の
試薬での測定ではＤＣＡ担体への吸着に関しては両者の
吸着率に差はなかった。しかし、Ｍｎ錯体ではＴＰＰＰ
ｍのほうがよく吸着した。また、炭酸カルシウムに対し
ては遊離の試薬・Ｍｎ錯体ともにリン酸エステル誘導体
の方がよく吸着した。これはリン酸とカルシウムの結合
力の強さが影響していると考えられる。

【００４９】また、ＴＰＰＰｍ、ＴＰＰＰｄ、ＴＰＰＰ
ｔを比較すると、遊離の試薬・Ｍｎ錯体ともに同様な傾
向が得られた。ＤＣＡ担体に対してはリン酸エステル基
の数が多くなるほどよく吸着する。また、炭酸カルシウ
ムへの吸着率はＴＰＰＰｄが最大となった。

【００５０】ＤＣＡ担体への吸着に関して、ＴＰＰＰｔ
は先に報告したビフェニルスルホ基を有するマンガンポ
ルフィリン錯体（Ｍｎ−ＴＳＢＰ）と同程度の吸着量を
示すことから、動脈硬化症用ＭＲＩ試薬として有用であ
る。

【００５１】

【発明の効果】上述の如く、本発明の新規な水溶性ポル
フィリン化合物｛５，10，15，20−テトラキス（４−ホ
スフォノフェニル）ポルフィン、５，10，15，20−テト
ラキス（３，４−ジホスフォノフェニル）ポルフィン及
び５，10，15，20−テトラキス（３，４，５−トリホス
フォノフェニル）ポルフィン｝又はその金属錯体は、合
成が容易であると共に界面活性剤及び生理活性物質等の
親水基として知られるリン酸エステル基をポルフィリン
１分子当たり４〜１２個含んでおり、水に易溶性（水溶
性）で且つ生体組織に対する適合性及び安全性が優れて
いるため、取り扱いに便利であり適用範囲が広い。

【００５２】それ故、本発明の化合物又はその金属錯体
は、アルカリホスファターゼ活性を高感度で測定するこ
とができ、また、酵素免疫測定方法において標識したア
ルカリホスファターゼの基質として利用することができ
る。本発明の化合物又はその金属錯体を分析化学の分野
で応用すると、微量の金属イオンを簡便迅速且つ高精度
で定量することができる。更に、本発明の化合物又はそ
の金属錯体はＭＲＩ造影剤として有用であり、このＭＲ
Ｉ造影剤は動脈硬化巣のＭＲＩ造影方法に好ましく適用
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＰＰＰｍのＩＲスペクトルを示す図である。

【図２】ＴＰＰＰｄのＩＲスペクトルを示す図である。

【図３】ＴＰＰＰｔのＩＲスペクトルを示す図である。

【図４】ＴＰＰＰｍの吸収スペクトルの経時変化を示す
図である。

【図５】ＴＰＰＰｍのｐＨ−吸光度曲線を示す図であ
る。

【図６】ＴＰＰＰｍの酵素反応曲線における温度の相違
によるｐＨの影響を示す図である。

【図７】ＴＰＰＰｍの酵素反応曲線における緩衝剤の種
類の相違による影響を示す図である。

【図８】ＴＰＰＰｍの酵素反応曲線における酵素濃度を
変えた時の吸光度の経時変化を示す図である。

【図９】ＴＰＰＰｍによる酵素濃度の検量線１を示す図
である。

【図１０】ＴＰＰＰｍによる酵素濃度の検量線２を示す
図である。

【図１１】ＴＰＰＰｍによるＣｕ²⁺イオンの検量線３を
示す図である。

【図１２】ＴＰＰＰｄによるＣｕ²⁺イオンの検量線４を
示す図である。

【図１３】ＴＰＰＰｔによるＣｕ²⁺イオンの検量線５を
示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式Ｉ： 【化１】 〔式中、φは次式II，III 又はIV： 【化２】 で表わされる基を表わす〕で表わされることを特徴とす
   るポルフィリンアリールリン酸エステル誘導体又はその
   金属錯体。
2. 【請求項２】 請求項１記載の式Ｉで表わされる化合物
   の金属錯体を基質とすることを特徴とするアルカリホス
   ファターゼ活性の高感度測定方法。
3. 【請求項３】 標識したアルカリホスファターゼの基質
   として請求項１記載の式Ｉで表わされる化合物の金属錯
   体を用いることを特徴とする酵素免疫測定方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の式Ｉで表わされる化合物
   と金属イオンとの錯形成反応による吸光度変化を測定す
   ることを特徴とする微量金属イオンの定量方法。
5. 【請求項５】 請求項１記載の式Ｉで表わされる化合物
   の金属錯体を含むことを特徴とするＭＲＩ造影剤。
6. 【請求項６】 請求項１記載の式Ｉで表わされる化合物
   の金属錯体を動脈硬化巣に蓄積させ、この蓄積した金属
   錯体を追跡することを特徴とする動脈硬化巣のＭＲＩ造
   影方法。