JPH0774236B2 - Novel hexapeptide and angiotensin converting enzyme inhibitors - Google Patents

Novel hexapeptide and angiotensin converting enzyme inhibitors

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JPH0774236B2
JPH0774236B2 JP4159954A JP15995492A JPH0774236B2 JP H0774236 B2 JPH0774236 B2 JP H0774236B2 JP 4159954 A JP4159954 A JP 4159954A JP 15995492 A JP15995492 A JP 15995492A JP H0774236 B2 JPH0774236 B2 JP H0774236B2
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peptide
leu
amino acid
pro
acid sequence
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邦男 末綱
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末綱 陽子
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Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用性を有
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプ
チドならびにそのペプチドを有効成分とするアンジオテ
ンシン変換酵素阻害剤に関する。 Leu−Val−His−Pro−Glu−Glu Leu−Val−Leu−His−Pro−Lys Leu−Val−Lys−His−Pro−Gly Leu−Val−Tyr−Pro−Ile−Glu Leu−Lys−Tyr−Pro−Ile−Glu (式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。)
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a peptide having a peptide structure having the following amino acid sequence, which has utility as a medicine, and an angiotensin converting enzyme inhibitor containing the peptide as an active ingredient. Leu-Val-His-Pro-Glu-Glu Leu-Val-Leu-His-Pro-Lys Leu-Val-Lys-His-Pro-Gly Leu-Val-Tyr-Pro-Ile-Glu Leu-Lys-Tyr-. Pro-Ile-Glu (In the formula, each symbol representing an amino acid residue is based on a conventional notation in amino acid chemistry.)

【0002】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】高血圧
は、病因的に血圧上昇の明かなもの(病候性高血圧)と
不明なもの(本態性高血圧)とに大別されている。病候
性高血圧は原因となる疾患を治癒させることで高血圧を
治癒させることができるが、本態性高血圧では原因に対
する直接的な治療法は困難である。従来、レニン−アン
ジオテンシン系(以下、R・A系と略記する。)は、本
態性高血圧の重要な要因の一つであると考えられてお
り、ここ10年来、R・A系で中心的な役割を果してい
るアンジオテンシン変換酵素(以下、ACEと略記す
る。)の活性を阻害することによって、R・A系を調節
して本態性高血圧を調節する試みが行われてきた。その
ようなACE活性阻害を有する物質としては、合成化合
物の場合には、L−プロリン誘導体[M.A.Onde
tti,b.Rubin et al;Scienc
e,196,441(1977)]やそれをベースにし
た化合物が知られており、天然物由来の物質の場合には
蛇毒由来のブラジキニン増強因子(C末端がPro)
〔S.H.Ferreia.et al.:Bioch
emistry,9.3583(1970)〕、ゼラチ
ンのコラゲナーゼ消化物由来の6種類のペプチド(いず
れもC末端がGly−Lys)[G.Oshima,
H.Shimabukuro etal.:Bioch
im.Biophys.Acta.,556,128
(1979)〕、牛カゼインのトリプシン消化物由来の
ペプチド(C末端がGly−Lys)〔S.Maruy
ama,et aL.:Agric.Biol.Cha
m.,46,1393(1982)〕等が知られてい
る。しかし、これら天然物由来の物質は、いずれも静脈
内投与で降圧効果が確認されているのみであり、経口投
与による薬理効果は不明であり、発見されてから長期間
経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んでいる
との報告はない。
2. Description of the Related Art Hypertension is broadly classified into two types, that is, the cause of hypertension, which is etiologically obvious (hypertensive hypertension) and the unknown (hypertensive hypertension). Although symptomatic hypertension can cure the hypertension by curing the causative disease, it is difficult to treat the cause directly with essential hypertension. Conventionally, the renin-angiotensin system (hereinafter, abbreviated as RA system) is considered to be one of the important factors of essential hypertension, and it has been a major factor in the RA system for the last 10 years. Attempts have been made to regulate essential hypertension by regulating the RA system by inhibiting the activity of angiotensin converting enzyme (hereinafter abbreviated as ACE) that plays a role. As the substance having such ACE activity inhibition, in the case of a synthetic compound, an L-proline derivative [M. A. Onde
tti, b. Rubin et al; Science
e, 196, 441 (1977)] and compounds based thereon are known, and in the case of a substance derived from a natural product, a snake venom-derived bradykinin enhancer (C-terminal is Pro).
[S. H. Ferria. et al. : Bioch
chemistry, 9.3583 (1970)], 6 types of peptides derived from collagenase digestion products of gelatin (all have C-terminal Gly-Lys) [G. Oshima,
H. Shimabukuro et al. : Bioch
im. Biophys. Acta. , 556,128
(1979)], a peptide derived from a tryptic digest of bovine casein (C-terminal is Gly-Lys) [S. Maruy
ama, et aL. : Agric. Biol. Cha
m. , 46, 1393 (1982)] and the like are known. However, all of these substances derived from natural products have only been confirmed to have an antihypertensive effect by intravenous administration, and the pharmacological effect by oral administration is unknown, and it has been a long time since they were discovered, but they are still unknown. There is no report that the drug development is progressing.

【0003】[0003]

【課題を解決するための手段】本発明者は、イワシ筋肉
のタンパク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物
質を検索し、新規な5種類のヘクサペプチドが強いアン
ジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出し
た。そして、これら5種類のヘクサペプチドを医薬とし
て実用化するための研究を鋭意行った。その結果、この
5類種のヘクサペプチドが血圧降下作用を有し、天然物
由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性
を見い出した。本発明は係る知見に基づくものである。
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明に係る新規な
ペプチドは、次式(1)、(2)、(3)、(4)およ
び(5) (1) Leu−Val−His−Pro−Glu−G
lu (2) Leu−Val−Leu−His−Pro−L
ys (3) Leu−Val−Lys−His−Pro−G
ly (4) Leu−Val−Tyr−Pro−Ile−G
lu (5) Leu−Lys−Tyr−Pro−Ile−G
lu の式で示されるL体のアミノ酸の配列を有する新規なヘ
クサペプチドであり、常温における性状は白色の粉末で
ある。
Means for Solving the Problems The present inventor searched for substances having a pharmacological action from a degradation solution of proteolytic enzymes of sardine muscle, and found that five novel hexapeptides have a strong angiotensin converting enzyme inhibitory action. Found. Then, they have diligently studied for putting these five kinds of hexapeptides into practical use as medicines. As a result, they have found that these five kinds of hexapeptides have a hypotensive action and are useful as an angiotensin converting enzyme inhibitor derived from a natural product. The present invention is based on such findings.
The present invention will be described in detail below. The novel peptide according to the present invention has the following formulas (1), (2), (3), (4) and (5) (1) Leu-Val-His-Pro-Glu-G.
lu (2) Leu-Val-Leu-His-Pro-L
ys (3) Leu-Val-Lys-His-Pro-G
ly (4) Leu-Val-Tyr-Pro-Ile-G
lu (5) Leu-Lys-Tyr-Pro-Ile-G
It is a novel hexapeptide having an L-amino acid sequence represented by the formula of lu, and is a white powder at room temperature.

【0004】前記の5種類のヘクサペプチドは、化学的
に合成する方法またはイワシ筋肉のタンパク質分解酵素
の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。
本発明に係る新規なペプチドを化学的に合成する場合に
は、液相法または固相法等の通常のペプチド合成方法に
よって行うことができるが、好ましくは、固相法によっ
てポリマー性の固相支持体へ前記ペプチドのC末端(カ
ルボキシル末端側)からそのアミノ酸残基に対応したL
体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行く
のがよい。そして、そのようにして得られた合成ペプチ
ドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を
用いてポリマー性の固相支持体から切断した後、アミノ
酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速
液体クロマトグラフィー(以下、HPLCと略記す
る。)等を用いた通常の方法で精製することができる。
The above-mentioned five kinds of hexapeptides can be chemically synthesized or separated and purified from a decomposition solution of sardine muscle proteolytic enzyme.
In the case of chemically synthesizing the novel peptide according to the present invention, it can be carried out by an ordinary peptide synthesis method such as a liquid phase method or a solid phase method, but preferably, a solid phase of a polymer phase is prepared by the solid phase method. From the C-terminal (carboxyl terminal side) of the peptide to the support, L corresponding to the amino acid residue
The amino acids of the body should be linked sequentially by peptide bonds. Then, the synthetic peptide thus obtained is cleaved from the polymeric solid-phase support with trifluoromethanesulfonic acid, hydrogen fluoride, etc., and then the protecting group of the amino acid side chain is removed to give a reverse phase system. It can be purified by a usual method using high performance liquid chromatography (hereinafter abbreviated as HPLC) using a column of No.

【0005】上記したように、本発明に係る新規なペプ
チドはイワシ筋肉のタンパク質分解酵素の分解液から分
離精製することができるが、その場合には、例えば、以
下のようにして行うことができる。上記の新規なペプチ
ドを含有しているイワシ筋肉部分を取り出し加水分解す
る。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等
のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、イワシ筋
肉を必要とあれば更に加水分癖した後、酵素の至適値に
調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要
に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得
る。その加水分解液を濾紙および/またはセライト等を
用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、得ら
れた瀘液をセロファン等の半透膜を用いて適当な溶媒
(例えば、トリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の
緩衝液等)中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透
膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂
(例えば、ダウケミカル社製のDowex 50W等)
にかけ、その吸着溶出画分からACE(アンジオテンシ
ン変換酵素)阻害活性を有する成分を含有する画分を
得、得られたACE阻害活性画分をゲル濾過(例えば,
フアルマシア社製のSephadex G−25等)に
よって分画し、得られたACE阻害活性画分を陽イオン
交換ゲル瀘過(例えば、フアルマシア社製の SP−S
ephadex C−25等)によって分画し、得られ
たACE阻害活性画分を更に逆相HPLCによって分画
する。
As described above, the novel peptide according to the present invention can be separated and purified from the degradation solution of proteolytic enzyme of sardine muscle. In that case, for example, it can be performed as follows. . The sardine muscle part containing the above novel peptide is removed and hydrolyzed. Hydrolysis is performed according to a conventional method. For example, when hydrolyzing with a proteolytic enzyme such as pepsin, the sardine muscle is further hydrolyzed if necessary, then adjusted to the optimum value of the enzyme, and the enzyme is added and incubated. Then, after neutralizing as necessary, the enzyme is deactivated to obtain a hydrolyzed solution. The hydrolyzed solution is filtered with filter paper and / or Celite to remove insoluble components, and the resulting filtrate is used with a semipermeable membrane such as cellophane to prepare an appropriate solvent (for example, Tris-HCl buffer, A solution containing a component that has passed through the semipermeable membrane among the components in the filtrate is sufficiently dialyzed in a neutral buffer such as a phosphate buffer solution, and a strong acidic cation exchange resin (for example, manufactured by Dow Chemical Co.) is used. Dowex 50W etc.)
Then, a fraction containing a component having ACE (angiotensin converting enzyme) inhibitory activity is obtained from the adsorbed and eluted fraction, and the obtained ACE inhibitory activity fraction is subjected to gel filtration (for example,
It was fractionated by Sephadex G-25 manufactured by Falmatia Co., Ltd., and the obtained ACE inhibitory activity fraction was filtered through a cation exchange gel (for example, SP-S manufactured by Falmatia Co., Ltd.).
ephadex C-25, etc.), and the obtained ACE inhibitory activity fraction is further fractionated by reverse phase HPLC.

【0006】この新規なペプチドは、静脈内への繰返し
投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフイラキ
シーショックを起こさない。また、このペプチドはL−
アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプ
ロテアーゼにより徐々に分解される為,毒性は極めて低
く安全性は極めて高い(LD50>5000mg/K
g:ラット経口投与)。本発明に係る新規なペプチド
は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することがで
きる。投与法としては、通常は、ACEを有している哺
乳類(例えば、ヒト、イヌ、ラット等)に注射するこ
と、あるいは経口投与することがあげられる。投与量
は、例えば、動物体1kg当りこのペプチドを0.01
〜10mgの量である。投与回数は、通常、1日1〜4
回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整するこ
とができる。上記の各種製剤において用いられる賦形
剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定されず、通常の
注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用い
られるものを使用することができる。
This novel peptide does not induce antibody production or anaphylactic shock when repeatedly administered intravenously. Also, this peptide is L-
It has a sequence structure consisting of only amino acids, and is gradually degraded by proteases in the body after administration, so its toxicity is extremely low and its safety is extremely high (LD 50 > 5000 mg / K).
g: Oral administration to rat). The novel peptide according to the present invention is an injection using an additive such as a commonly used excipient,
It can be adjusted into tablets, capsules, granules, powders and the like. The administration method usually includes injection into a mammal having ACE (eg, human, dog, rat, etc.) or oral administration. For example, the dose is 0.01
The amount is -10 mg. The number of administrations is usually 1 to 4 per day
Although it is about once, it can be appropriately adjusted depending on the administration route. The kinds of excipients, binders and lubricants used in the above-mentioned various preparations are not particularly limited, and those used for ordinary injections, powders, granules, tablets or capsules can be used. .

【0007】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等;結合剤としてはでんぶん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等;崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカリウム塩類;滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩類、タルク、ワツクス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては必要に
応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の矯
臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常
法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用水、
生理食塩液およびキシリトールやマンニトールなどの糖
アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレ
ングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させて注
射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸
化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発
明の新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品または
乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水また
は生理食塩液にて溶解して用いることもできる。
The following may be mentioned as additives used for tablets, capsules, granules and powders. Excipients include sugars such as crystalline cellulose, sugar alcohols such as mannitol, starches, anhydrous calcium phosphate and the like; binders such as starch and hydroxypropylmethylcellulose; and disintegrants such as carboxymethylcellulose and its potassium salts; Examples of lubricants include stearic acid and its salts, talc, waxes. In preparation of the preparation, menthol, citric acid and its salts, and flavoring agents such as fragrances can be used if necessary. Aseptic composition for injection, the conventional method, the novel peptide according to the present invention, water for injection,
An injection can be prepared by dissolving or suspending in a physiological saline solution, a sugar alcohol injection solution such as xylitol or mannitol, or a glycol such as propylene glycol or polyethylene glycol. At this time, a buffer solution, a preservative, an antioxidant and the like can be added as required. The preparation containing the novel peptide of the present invention may be in the form of a lyophilized product or a dry powder, and may be dissolved in an ordinary solubilizer such as water or physiological saline before use.

【0008】本発明に係る新規なペプチドは、優れたア
ンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作
用、ブラジキニン不活性抑制作用を示す。したがって、
本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症
の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態に
おいて用いられる血圧降下剤として有用であり、更にう
つ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改
善(延命効果)作用を有し、心不全の治療剤として有用
である。
The novel peptide according to the present invention has an excellent angiotensin converting enzyme inhibitory action, and exhibits a blood pressure lowering action and a bradykinin inactivity suppressing action. Therefore,
Essential hypertension, renal hypertension, prophylactic and therapeutic agents for hypertension such as adrenal hypertension, useful as a diagnostic agent for these diseases and as a blood pressure lowering agent used in various pathological conditions, and further for organ circulation in congestive heart failure. It has the effects of normalizing and improving the long-term prognosis (life-prolonging effect), and is useful as a therapeutic agent for heart failure.

【0009】[0009]

【実施例】以下に実施例として、製造例及び試験例を記
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例1 新鮮イワシをデボーナーで処理して筋肉を採肉した。採
肉した筋肉500gに脱イオン水1lを加えてホモジナ
イズした。得られたイワシ筋肉ホモジネイトにペプシン
10gを加え、pH2.0に調製して37℃で20時間
インキュベイトした。このようにして調製したイワシ筋
肉ホモジネイトのペプシン分解液をDiaflow膜
(アミコン社製、YM10型膜、分画分子量1万)を用
いて限外濾過した。得られた濾過液をDowex 50
WX4(H)を充填したカラムを用いてクロマトグラ
フ処理した。脱イオン水で水洗し、溶出は2N−NH
OHで行い溶出液を濃縮した。この液体Sephade
x G−25カラムによりカラムクロマトグラフ処理し
てペプチド画分(分画番号59〜69番)を分離した。
そのカラムクロマトグラムを図1に示した。このペプチ
ド画分を濃縮してイワシペプチド液を得た。さらにこの
ペプチド液をSP−Sephadex C−25
(H)カラムによりカラムクロマトグラム処理してペ
プチド画分(分画番号47〜51番)を分離した。その
カラムクロマトグラムを図2に示した。このペプチド画
分を凍結乾燥してペプチドパウダー(以下、イワシペプ
チドと称す。)を得た。このようにして分画したイワシ
ペプチドパウダーを脱イオン水に溶解した後HPLCを
行った。条件はカラムとして野村化学(株)製Deve
losil ODS−5(φ4.6mm IDX25c
mL)を使用し、移動相として0.05%トリフルオロ
酢酸(以下、TFAと略記する。)から25%アセトニ
トリル/0.05%TFAの濃度勾配法により、流速
1.0ml/min、検出波長220nmでクロマトグ
ラフ処理し、ACE阻害作用を有するペプチドフラグメ
ントを得た。その結果は図3に示すとおりである。{溶
出時間;(1)のペプチド100.25分、(2)のペ
プチド104.52分、(3)のペプチF105.62
分、(4)のペプチド109.79分、(5)のペプチ
ド116.36分} このようにして得られたACE阻害作用を有するペプチ
ドのアミノ酸配列は、アプイドバイオシステム(AB
I)社製のプロテインシーケンサー477A型を用いて
決定された。その結果、5種類のペプチドは、それぞ
れ、 次式、 (1)Leu−Val−His−Pro−Gl
u−Glu (2)Leu−Val−Leu−His−Pro−Ly
s (3)Leu−Val−Lys−His−Pro−Gl
y (4)Leu−Val−Tyr−Pro−Ile−Gl
u (5)Leu−Lys−Tyr−Pro−Ile−Gl
u 示されるL体のアミノ酸残基からなる配列を有するヘク
サペプチドであることが確認された。なお本発明におい
て、SP−Sephadex C−25(H)カラム
クロマトグラフ中のペプチド画分(分画番号47〜51
番)のイワシペプチド含量とACE阻害率との関係とし
ては図4のような結果が得られた。又、イワシペプチド
のキャリブレーションプロットとしては図5のような結
果が得られ、この場合の、分子量の決定はHPLCを用
い以下の条件のもとで行った。すなわちカラムとしてA
sahipak GS−320(7.6mmID×50
cmL)を、移動相として6M塩酸グアニジン、流量
0.5ml/min、検出波長220nmで行った。本
発明に係わるイワシペプチドをACE阻害剤として例え
ば錠剤に製剤する場合には、常法にしたがって例えば次
のように処理すればよい:(1)ペプチド13g、
(2)乳糖87g、(3)コーンスターチ29g,
(4)ステアリン酸マグネシウム1gを原料とし、先ず
(1)、(2)及び17gのコーンスターチを混和し、
7gのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒
化し、この顆粒に5gのコーンスターチと(4)とを加
え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤100
0個を製造する。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail by describing production examples and test examples as examples. Production Example 1 Fresh sardines were treated with a deboner to extract muscle. 1 liter of deionized water was added to 500 g of the minced muscle and homogenized. 10 g of pepsin was added to the obtained sardine muscle homogenate to adjust the pH to 2.0 and incubated at 37 ° C. for 20 hours. The pepsin-decomposed solution of the sardine muscle homogenate thus prepared was subjected to ultrafiltration using a Diaflow membrane (YM10 type membrane manufactured by Amicon, molecular weight cut off 10,000). The resulting filtrate is Dowex 50
Chromatography was performed using a column packed with WX4 (H + ). Washed with deionized water, elution 2N-NH 4
The eluate was concentrated with OH. This liquid Sephade
Column chromatography was performed using an x G-25 column to separate peptide fractions (fraction numbers 59 to 69).
The column chromatogram is shown in FIG. This peptide fraction was concentrated to obtain a sardine peptide solution. Furthermore, this peptide solution was added to SP-Sephadex C-25.
Column chromatography was performed using an (H + ) column to separate peptide fractions (fraction numbers 47 to 51). The column chromatogram is shown in FIG. This peptide fraction was freeze-dried to obtain a peptide powder (hereinafter referred to as sardine peptide). The sardine peptide powder fractionated in this way was dissolved in deionized water and then subjected to HPLC. The condition is as a column Deve manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.
losil ODS-5 (φ4.6mm IDX25c
flow rate of 1.0 ml / min at a detection wavelength by a concentration gradient method of 0.05% trifluoroacetic acid (hereinafter abbreviated as TFA) to 25% acetonitrile / 0.05% TFA as a mobile phase. It was chromatographed at 220 nm to obtain a peptide fragment having an ACE inhibitory action. The result is as shown in FIG. {Elution time: (1) peptide 100.25 minutes, (2) peptide 104.52 minutes, (3) Pepti F105.62
Min, the peptide of (4) 109.79 min, the peptide of (5) 116.36 min} The amino acid sequence of the thus obtained peptide having an ACE inhibitory action is the same as that of the apid biosystem (AB
I) Determined using a Protein Sequencer Model 477A manufactured by the company. As a result, the five types of peptides were respectively represented by the following formula: (1) Leu-Val-His-Pro-Gl
u-Glu (2) Leu-Val-Leu-His-Pro-Ly
s (3) Leu-Val-Lys-His-Pro-Gl
y (4) Leu-Val-Tyr-Pro-Ile-Gl
u (5) Leu-Lys-Tyr-Pro-Ile-Gl
It was confirmed to be a hexapeptide having a sequence consisting of the L-amino acid residue shown by u. In the present invention, the peptide fraction (fraction numbers 47 to 51) in the SP-Sephadex C-25 (H + ) column chromatograph is used.
The result as shown in FIG. 4 was obtained as the relationship between the sardine peptide content of No. 2) and the ACE inhibition rate. As a calibration plot of the sardine peptide, the results shown in FIG. 5 were obtained. In this case, the molecular weight was determined by using HPLC under the following conditions. That is, A as a column
sahipak GS-320 (7.6 mm ID x 50)
cmL) was used as a mobile phase with 6 M guanidine hydrochloride, a flow rate of 0.5 ml / min, and a detection wavelength of 220 nm. When the sardine peptide according to the present invention is formulated as an ACE inhibitor into, for example, a tablet, it may be treated according to a conventional method, for example, as follows: (1) Peptide 13 g,
(2) Lactose 87 g, (3) Corn starch 29 g,
(4) Using 1 g of magnesium stearate as a raw material, first, (1), (2) and 17 g of corn starch were mixed,
Granulate with a paste made from 7 g cornstarch, add 5 g cornstarch and (4) to the granules, tablet the mixture obtained with a compression tableting machine to give tablets 100
0 is manufactured.

【00011】製造例2 本例は、合成法による製造例である。 Leu−Val−His−Pro−Glu−Gluの合
成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
430A型用いた固相法によって当該ペプチドを合成し
た。固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼン共
重合体(ポリスチレン樹脂)をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該ヘクサペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのC末端側のGluからクロ
ロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を得た。こ
のときのアミノ酸は、t−ブトキシカルボニル(以下t
−Bocと略記す。)基で保護されたt−Bocアミノ
酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチ
オールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温
で10分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、
さらに10分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメ
タンスルホン酸を滴下し、室温で30分間撹拌した後、
無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、
その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で
乾燥した。このようにして得られた末精製の合成ペプチ
ドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムC18(5
μ)を用いたHPLCにより精製した。移動相として
(A)0.1%TFA含有蒸留水、(B)0.1%TF
A含有アセトニトリル溶液を使用し、(A)液が20分
間で98%→78%の濃度勾配法により流速1.5ml
/minでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長2
15nmで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取
し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペ
プチドを得た。
Production Example 2 This example is an example of production by a synthesis method. Method for synthesizing Leu-Val-His-Pro-Glu-Glu The peptide was synthesized by a solid phase method using an automated peptide synthesizer 430A manufactured by Applied Biosystems. A resin obtained by chloromethylating a styrene-divinylbenzene copolymer (polystyrene resin) was used as the solid phase carrier. First, according to the amino acid sequence of the hexapeptide, Glu on the C-terminal side was reacted with chloromethyl resin according to a conventional method to obtain a peptide-bonded resin. The amino acid at this time is t-butoxycarbonyl (hereinafter referred to as t
-Abbreviated as Boc. ) Group protected t-Boc amino acid was used. Next, this peptide-bonded resin was suspended in a mixed solution of ethanedithiol and thioanisole, stirred at room temperature for 10 minutes, and trifluoroacetic acid was added under ice cooling,
Stir for a further 10 minutes. Trifluoromethanesulfonic acid was added dropwise to this mixed solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes,
Anhydrous ether was added to precipitate and separate the product,
The precipitate was washed several times with anhydrous ether and then dried under reduced pressure. The thus-purified synthetic peptide thus obtained was dissolved in distilled water and then subjected to reverse phase column C 18 (5
μ) was used for purification by HPLC. (A) distilled water containing 0.1% TFA as mobile phase, (B) 0.1% TF
Using the A-containing acetonitrile solution, the (A) solution was flowed for 1.5 minutes by a gradient method of 98% → 78% in 20 minutes.
Chromatography was performed at / min. UV wavelength 2
The elution fraction showing the maximum absorption at 15 nm was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic peptide.

【0012】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列構造を有するヘクサペプチ
ドであることが確認された。このマススペクトルの結果
は図6に示すとおりである。他の4つのヘクサペプチド
についても上記合成方法に準じ固相法によりそれぞれ末
端側から反応させ合成した。末精製の合成ペプチドは以
下に示すとおり精製した。 Leu−Val−Leu−His−Pro−Lysの精
製法 逆相系のカラムC18(5μ)を用いたHPLCにより
精製した。移動相として(A)0.1%TFA含有蒸留
水、(B)0.1%TFA含有アセトニトリル溶液を使
用し、(A)液が20分間で90%→60%の濃度勾配
法により流速1.5ml/−minでクロマトグラィー
を行った。紫外部波長215nmで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。
As a result of mass spectrum analysis of this synthetic peptide, it was confirmed to be a hexapeptide having an amino acid sequence structure. The result of this mass spectrum is as shown in FIG. The other four hexapeptides were also synthesized by reacting from the terminal side by the solid phase method according to the above-mentioned synthesis method. The unpurified synthetic peptide was purified as shown below. Purification method of Leu-Val-Leu-His-Pro-Lys It was purified by HPLC using a reverse phase column C 18 (5 μ). As a mobile phase, (A) 0.1% TFA-containing distilled water and (B) 0.1% TFA-containing acetonitrile solution were used, and (A) solution was flow-rate 1 by a concentration gradient method of 90% → 60% in 20 minutes. Chromatography was performed at 0.5 ml / -min. The elution fraction showing the maximum absorption, which was detected at an ultraviolet wavelength of 215 nm, was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic peptide.

【0013】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列およびアミノ酸組成が前記
式で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドで
あることが確認された。このマススペクトルの結果は図
7に示すとおりである。 Leu−Val−Lys−His−Pro−Glyの精
製法 逆相系のカラムC18(5μ)を用いたHPLCにより
精製した。移動相として(A)0.1%TFA含有蒸留
水、(B)0.1%TFA含有アセトニトリル溶液を使
用し、(A)液が20分間で98%→78%の濃度勾配
法により流速1.5ml/minでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長215nmで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するヘクサペプチドであることが確認された。この
マススペクトルの結果は図8に示すとおりである。 Leu−Val−Tyr−Pro−Ile−GIuの精
製法 逆相系のカラムC18(5μ)を用いたHPLCにより
精製した。移動相として(A)0.1%TFA含有蒸留
水、(B)0.1%TFA含有アセトニトリル溶液を使
用し、(A)液が20分間で98%→78%の濃度勾配
法により流速1.5ml/minでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長215nmで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するヘクサペプチドであることが確認された。この
マススペクトルの結果は図9に示すとおりである。 Leu−Val−Lys−His−Pro−Glyの精
製法 逆相系のカラムC18(5μ)を用いたHPLCにより
精製した。移動相として(A)0.1%TFA含有蒸留
水、(B)0.1%TFA含有アセトニトリル溶液を使
用し、(A)液が20分間で98%→78%の濃度勾配
法により流速1.5ml/minでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長215nmで検出し、最大の吸収
を示した溶出分画を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ペプチドを得た。この合成ペプチ
ドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列
およびアミノ酸組成が前記式で示したアミノ酸配列構造
を有するヘクサペプチドであることが確認された。この
マススペクトルの結果は図10に示すとおりである。合
成によって得られた本発明の5種類のヘクサペプチド
は、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
As a result of mass spectrum analysis of this synthetic peptide, it was confirmed that the amino acid sequence and amino acid composition were hexapeptides having the amino acid sequence structure represented by the above formula. The result of this mass spectrum is as shown in FIG. Purification method of Leu-Val-Lys-His-Pro-Gly It was purified by HPLC using a reversed phase column C 18 (5 μ). As a mobile phase, (A) 0.1% TFA-containing distilled water and (B) 0.1% TFA-containing acetonitrile solution were used, and (A) solution was flow-rate 1 by a concentration gradient method of 98% → 78% in 20 minutes. Chromatography was performed at 0.5 ml / min. The elution fraction showing the maximum absorption, which was detected at an ultraviolet wavelength of 215 nm, was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic peptide. As a result of mass spectrum analysis of this synthetic peptide, it was confirmed that the amino acid sequence and amino acid composition are hexapeptides having the amino acid sequence structure represented by the above formula. The result of this mass spectrum is as shown in FIG. Purification method of Leu-Val-Tyr-Pro-Ile-GIu Purified by HPLC using a reverse phase column C 18 (5 μ). As a mobile phase, (A) 0.1% TFA-containing distilled water and (B) 0.1% TFA-containing acetonitrile solution were used, and (A) solution was flow-rate 1 by a concentration gradient method of 98% → 78% in 20 minutes. Chromatography was performed at 0.5 ml / min. The elution fraction showing the maximum absorption, which was detected at an ultraviolet wavelength of 215 nm, was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic peptide. As a result of mass spectrum analysis of this synthetic peptide, it was confirmed that the amino acid sequence and amino acid composition are hexapeptides having the amino acid sequence structure represented by the above formula. The result of this mass spectrum is as shown in FIG. Purification method of Leu-Val-Lys-His-Pro-Gly It was purified by HPLC using a reversed phase column C 18 (5 μ). As a mobile phase, (A) 0.1% TFA-containing distilled water and (B) 0.1% TFA-containing acetonitrile solution were used, and (A) solution was flow-rate 1 by a concentration gradient method of 98% → 78% in 20 minutes. Chromatography was performed at 0.5 ml / min. The elution fraction showing the maximum absorption, which was detected at an ultraviolet wavelength of 215 nm, was collected and freeze-dried to obtain the target synthetic peptide. As a result of mass spectrum analysis of this synthetic peptide, it was confirmed that the amino acid sequence and amino acid composition are hexapeptides having the amino acid sequence structure represented by the above formula. The result of this mass spectrum is as shown in FIG. The pharmacological effects of the five kinds of hexapeptides of the present invention obtained by synthesis were confirmed by the following tests.

【0014】試験例1 (アンジオテンシン変換酵素阻害活性)ACE(シグマ
社製、酵素番号 EC3.4.15.1)2.5mU、
合成基質Hippuryl−L−histidyl−L
−leucine(ペプチド研究所製)12.5mMを
用いLiebermanの測定方法を改良した山本等の
方法(日胸疾会誌,18,297−302(198
9))に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を
酢酸エチルにて抽出し、225nmの吸光度で測定し
た。被検液での吸光度をEs、被検液の代わりに緩衝液
を加えた時の値をEc、予め反応停止液を加えて反応さ
せた時の値をEbとして次式から阻害率を求めた。 阻害率(%)=(Ec−Es)/(Ec−Eb)×10
0 ACE阻害剤の阻害活性IC50値は、ACEの酵素活
性を50%(阻害率)阻害するために必要な試料の濃度
(M)で示した。本発明に係る5種類のヘクサペプチド
の牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活
性は表10とおりである。
Test Example 1 (Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity) ACE (manufactured by Sigma, enzyme number EC3.4.5.1) 2.5 mU,
Synthetic substrate Hippuryl-L-histidyl-L
-Leucine (manufactured by Peptide Institute) 12.5 mM and improved method for measuring Lieberman Yamamoto et al. (Nippon Chinkai, 18, 297-302 (198)
9)) was measured. That is, the produced hippuric acid was extracted with ethyl acetate and the absorbance was measured at 225 nm. The absorbance in the test solution was Es, the value when the buffer solution was added instead of the test solution was Ec, and the value when the reaction stop solution was added in advance and the reaction was Eb, and the inhibition rate was calculated from the following equation. . Inhibition rate (%) = (Ec−Es) / (Ec−Eb) × 10
0 The inhibitory activity IC 50 value of the ACE inhibitor was shown as the concentration (M) of the sample required to inhibit the enzyme activity of ACE by 50% (inhibition rate). Table 10 shows the inhibitory activities of five types of hexapeptides according to the present invention against angiotensin converting enzyme in bovine lung serum.

【0015】[0015]

【表1】 阻害活性 I▲C50▼値 [Table 1] Inhibitory activity I C50 value

【0016】試験例2 (ラットへ投与時の降圧効果)実験動物は日本チャール
ズ・リバー(株)より15週令雄性高血圧自然発症ラッ
ト(SHR)を購入し、1週間の予備飼育後、収縮期血
圧が160mmHg以上(体重280〜330g)の動
物3匹1群として用いた。血圧は非観血的尾動脈血圧測
定装置((株)理研開発製、PS−100)を用いta
il−cuff法により、投与前、投与後1時間、2時
間、3時間、4時間、5時間のSHR尾動脈の収縮期血
圧(SBP)、平均血圧(MBP)および心拍数(H
R)の測定を測定時間毎に5回おこない、得られた測定
値の最高値と最低値を棄却し、3回の平均値をもって各
時間の測定値とした。それぞれの変動値は、投与直前の
平均値を0時間の測定値とし、各時間の平均値より0時
間の平均値を減じその差を求めて算出した。5種類の合
成ヘクサペプチド50mg/kgをSHRに静脈投与し
た時の血圧値および心拍数への作用についての結果は、
図11、図12、図13、図14および図15に示すと
おりである。以上の試験の結果、本発明に係る5種頬の
ヘクサペプチドはアンジオテンシン変換酵素阻害活性を
有し、in vivoにおいても有意な血圧降下作用を
示すことが確認された。したがって、本発明に係る5種
類のヘクサペプチドは高血圧症の治療または予防薬とし
て有用である。なお、本発明に係る5種類のヘクサペプ
チドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペ
プチドにおいて、構造中に採用することもできる。
Test Example 2 (Hypotensive effect when administered to rats) As a test animal, 15-week-old male spontaneously hypertensive rats (SHR) were purchased from Japan Charles River Co., Ltd. The animals were used as a group of 3 animals having a blood pressure of 160 mmHg or more (body weight 280 to 330 g). Blood pressure was measured using a non-invasive caudal arterial blood pressure measuring device (PS-100, manufactured by Riken Development Co., Ltd.)
By il-cuff method, systolic blood pressure (SBP), mean blood pressure (MBP) and heart rate (H) of the SHR tail artery before administration and 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours and 5 hours after administration.
The measurement of R) was performed 5 times every measurement time, the highest value and the lowest value of the obtained measurement values were rejected, and the average value of 3 times was taken as the measurement value of each time. Each variation value was calculated by taking the average value immediately before administration as the measured value at 0 hours, subtracting the average value at 0 hours from the average value at each time, and calculating the difference. The results on the effects on blood pressure and heart rate when 5 synthetic hexapeptides 50 mg / kg were intravenously administered to SHR were as follows:
This is as shown in FIGS. 11, 12, 13, 14, and 15. As a result of the above test, it was confirmed that the five kinds of cheek hexapeptides according to the present invention have angiotensin converting enzyme inhibitory activity and exhibit a significant blood pressure lowering action in vivo. Therefore, the five kinds of hexapeptides according to the present invention are useful as therapeutic or preventive agents for hypertension. The five types of hexapeptides according to the present invention can also be adopted in the structure of a peptide whose amino acid sequence is a partial structure structurally.

【0017】[0017]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】本発明に係わるイワシ筋肉ペプシン分解液の、
製造例1におけるSepadexG−25カラムクロマ
トグラフィーによるACE阻害ペプチドの分離精製の結
果を示す図である。
FIG. 1 shows a sardine muscle pepsin decomposition solution according to the present invention,
It is a figure which shows the result of isolation and purification of the ACE inhibitory peptide by Sepadex G-25 column chromatography in manufacture example 1.

【図2】本発明に係るイワシペプチドの、製造例1にお
けるSP−SepahdexC−25(H)カラムク
ロマトグラフィーによるACE阻害ペプチドの分離精製
の結果を示す図である。
FIG. 2 shows the results of separation and purification of the ACE inhibitory peptide of the sardine peptide according to the present invention by SP-Sepadex C-25 (H + ) column chromatography in Production Example 1.

【図3】本発明に係わる5種類のヘクサペプチドの、製
造例1における逆相HPLCによるACE阻害ペプチド
の分離精製の結果を示す図である。
FIG. 3 is a diagram showing the results of separation and purification of ACE-inhibiting peptides by reverse phase HPLC in Production Example 1 of five types of hexapeptides according to the present invention.

【図4】本発明に係わるイワシペプチドの、製造例1に
おけるペプチド含量とACE阻害能との関係を示す図で
ある。
FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the peptide content and the ACE inhibitory ability of Production Example 1 of the sardine peptide according to the present invention.

【図5】本発明に係わるイワシペプチドの、製造例1に
おけるペプチドと各標準ペプチドのキャリブレーション
プロットによる分子量測定を示す図である。
FIG. 5 is a diagram showing the molecular weight measurement of the sardine peptide according to the present invention by a calibration plot of the peptide in Production Example 1 and each standard peptide.

【図6、図7、図8、図9、図10】本発明係わる5種
類のヘクサペプチドの、製造例2で得られた5種類のヘ
クサペプチドのマススペクトルを示す図である。
FIG. 6, FIG. 7, FIG. 8, FIG. 9, and FIG. 10 are mass spectra of the five kinds of hexapeptides obtained in Production Example 2 of the five kinds of hexapeptides according to the present invention.

【図11、図12、図13、図14、図15】それぞ
れ、同、製造例2で得られた5種類のヘクサペプチド
を、それぞれSHRに投与した場合の血圧値(収縮期血
圧、平均血圧)および心拍数の経時的変化を示す図であ
る。
FIG. 11, FIG. 12, FIG. 13, FIG. 14, and FIG. 15 are blood pressure values (systolic blood pressure, mean blood pressure) when the five kinds of hexapeptides obtained in Production Example 2 were administered to SHR, respectively. ) And heart rate changes over time.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C07K 123:00 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display area // C07K 123: 00

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 次式; Leu−Val−His−
Pro−Glu−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチド。
1. The following formula: Leu-Val-His-
A novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by Pro-Glu-Glu.
【請求項2】 次式; Leu−Val−His−
Pro−Glu−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
2. The following formula: Leu-Val-His-
An angiotensin-converting enzyme inhibitor, which comprises, as an active ingredient, a novel hexapeptide having a peptide structure represented by the L-amino acid sequence represented by Pro-Glu-Glu.
【請求項3】 次式; Leu−Val−Leu−
His−Pro−Lys で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチド。
3. The following formula: Leu-Val-Leu-
A novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by His-Pro-Lys.
【請求項4】 次式; Leu−Val−Leu−
His−Pro−Lys で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
4. The following formula: Leu-Val-Leu-
An angiotensin converting enzyme inhibitor, comprising a novel hexapeptide having a peptide structure having an L-amino acid sequence represented by His-Pro-Lys as an active ingredient.
【請求項5】 次式; Leu−Val−Lys−
His−Pro−Gly で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチド。
5. The following formula: Leu-Val-Lys-
A novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by His-Pro-Gly.
【請求項6】 次式; Leu−Val−Lys−
His−Pro−Gly で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
6. The following formula: Leu-Val-Lys-
An angiotensin-converting enzyme inhibitor comprising a novel hexapeptide having a peptide structure having an L-amino acid sequence represented by His-Pro-Gly as an active ingredient.
【請求項7】 次式; Leu−Val−Tyr−
Pro−Ile−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチド。
7. The following formula: Leu-Val-Tyr-
A novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by Pro-Ile-Glu.
【請求項8】 次式; Leu−Val−Tyr−
Pro−Ile−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
8. The following formula: Leu-Val-Tyr-
An angiotensin-converting enzyme inhibitor, which comprises, as an active ingredient, a novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by Pro-Ile-Glu.
【請求項9】 次式; Leu−Lys−Tyr−
Pro−Ile−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチド。
9. The following formula: Leu-Lys-Tyr-
A novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by Pro-Ile-Glu.
【請求項10】 次式; Leu−Lys−Tyr−
Pro−Ile−Glu で示されるL体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
10. The following formula: Leu-Lys-Tyr-
An angiotensin-converting enzyme inhibitor, which comprises, as an active ingredient, a novel hexapeptide having a peptide structure based on the L-amino acid sequence represented by Pro-Ile-Glu.
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