JPH0772059A - Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the method - Google Patents
Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the methodInfo
- Publication number
- JPH0772059A JPH0772059A JP5237203A JP23720393A JPH0772059A JP H0772059 A JPH0772059 A JP H0772059A JP 5237203 A JP5237203 A JP 5237203A JP 23720393 A JP23720393 A JP 23720393A JP H0772059 A JPH0772059 A JP H0772059A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- frequency conversion
- conversion element
- probe
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、生化学物質検出方法お
よび該方法に用いられる生化学物質検出センサーに関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a biochemical substance detection method and a biochemical substance detection sensor used in the method.
【０００２】[0002]
【従来の技術およびその課題】従来、例えば、特開平３
−２１０１９８号公報に記載されているように、ＤＮＡ
ハイブリッド形成反応後、電気泳動によって分離した
り、放射性同位元素でラベルして定量する方法によるＤ
ＮＡハイブリッドの形成反応の解析および分離定量が行
われている。しかしこれらの方法は、ラベル化するため
に限られた場所でしか行うことができないこと、放射性
同位元素を扱うために特殊技術を要すること、ラベル化
などのための操作、処理、測定に時間がかかることなど
の欠点があった。2. Description of the Related Art Conventionally, for example, Japanese Unexamined Patent Publication No.
-210198, as described in
After the hybridization reaction, it is separated by electrophoresis or labeled with a radioactive isotope to quantify D
The analysis and separation / quantification of the NA hybrid formation reaction have been performed. However, these methods can be performed only in a limited place for labeling, require special technology to handle radioisotopes, and require time for operation, processing, and measurement for labeling. There are drawbacks such as this.
【０００３】例えば、特開平３−２１０１９８号公報に
は、目的ＤＮＡに相補的塩基配列を有する抗原で修飾さ
れたＤＮＡがハイブリッド形成した後に酵素修飾抗体を
反応させ酵素反応による産生物を検出する方法が記載さ
れている。しかしながら、これらの方法では、酵素活性
の失活などにより定量性に乏しいこと、酵素修飾抗体作
製などのための操作、処理、測定に時間がかかることな
どの欠点があった。従来、生化学物質のＤＮＡのハイブ
リダイゼーションやＤＮＡへの化学物質のインターカー
レーションなどといったＤＮＡに特有な諸現象を解析す
るためのＤＮＡ加水分解酵素によるＤＮＡ加水分解反応
の追跡や加水分解率の算出などは、紫外スペクトルの吸
光度の変化や円二色性スペクトルを測定するなど分光学
的手法を用いて行っているが、機器が高価であったり定
量性に乏しいなどの問題があった。For example, Japanese Patent Laid-Open No. 3-210198 discloses a method of detecting a product of an enzymatic reaction by reacting an enzyme-modified antibody after hybridizing a DNA modified with an antigen having a complementary base sequence to a target DNA. Is listed. However, these methods have drawbacks such as poor quantification due to inactivation of enzyme activity, and time-consuming operations, treatments, and measurements for producing enzyme-modified antibodies. Conventionally, tracking of DNA hydrolysis reaction by DNA hydrolase and calculation of hydrolysis rate for analyzing various phenomena peculiar to DNA, such as hybridization of biochemical DNA with DNA and intercalation of chemical into DNA. Etc. are performed by using a spectroscopic method such as a change in absorbance of an ultraviolet spectrum or a circular dichroism spectrum, but there are problems such as expensive equipment and poor quantitativeness.
【０００４】本発明は、特殊技術を要すること、定量性
に乏しいこと、長時間の測定を要することなどの従来技
術における欠点がなく、簡便にしかも直接ＤＮＡハイブ
リッドの形成反応を解析し、かつ形成されたＤＮＡハイ
ブリッドを分離定量できる方法であって、ＤＮＡハイブ
リッドの形成を高精度にかつ定量的にしかも簡便にする
ことにより生化学物質を検出する方法および該方法に用
いられる生化学物質検出センサーを提供することを目的
とするものである。The present invention does not have the drawbacks of the prior art such as the need for special techniques, the lack of quantification, and the need for long-term measurement. The method for separating and quantifying the formed DNA hybrids, the method for detecting a biochemical substance by facilitating the formation of the DNA hybrids with high accuracy, quantitatively and easily, and the biochemical substance detection sensor used in the method. It is intended to be provided.
【０００５】[0005]
【目的を達成するための手段】本発明は、第１の実施態
様において、生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列と相
補的な塩基配列よりなるプローブＤＮＡを周波数変換素
子の電極上に化学的に結合・固定化し、固定化された周
波数変換素子上に、気相中で、該ＤＮＡを検出する試料
の水溶液を滴下し、該ＤＮＡを検出する試料を、該プロ
ーブＤＮＡに特異的な塩基配列を有するターゲットＤＮ
Ａとして該プローブＤＮＡとハイブリッドを形成させ、
該ハイブリッド形成による重量変化に伴う周波数変換素
子の周波数変化を測定して該ハイブリッド形成を検出・
識別することを特徴とする生化学物質検出方法を提供す
る。In the first embodiment of the present invention, a probe DNA having a base sequence complementary to a base sequence peculiar to DNA of a biochemical substance is chemically attached to an electrode of a frequency conversion element. Is immobilized on the immobilized frequency conversion element, and an aqueous solution of the sample for detecting the DNA is dropped in the gas phase on the immobilized frequency conversion element, and the sample for detecting the DNA is used as a base sequence specific to the probe DNA. Target DN with
A as a hybrid with the probe DNA,
The frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the hybrid formation is measured to detect the hybrid formation.
Provided is a biochemical substance detection method characterized by identifying.
【０００６】本発明は、第２の実施態様において、生化
学物質の三本鎖ＤＮＡに特有な塩基配列と相補的な塩基
配列よりなるプローブＤＮＡを周波数変換素子の電極上
に化学的に結合・固定化し、固定化された周波数変換素
子を水中に浸漬し、該ＤＮＡを検出する試料を該水中に
注入し、該試料を、該プローブＤＮＡに特異的な塩基配
列を有するターゲットＤＮＡとして該プローブＤＮＡと
ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッド形成による重
量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定して、
該ハイブリッド形成を検出・識別することを特徴とする
生化学物質検出方法を提供する。In the second embodiment of the present invention, a probe DNA having a base sequence complementary to the base sequence unique to the triple-stranded DNA of the biochemical substance is chemically bonded to the electrode of the frequency conversion element. The probe DNA is immobilized and the immobilized frequency conversion element is immersed in water, a sample for detecting the DNA is injected into the water, and the sample is used as the target DNA having a base sequence specific to the probe DNA. And a hybrid is formed, and the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the formation of the hybrid is measured,
Provided is a biochemical substance detection method characterized by detecting and discriminating the hybrid formation.
【０００７】本発明は、第３の実施態様において、生化
学物質の二本鎖ＤＮＡに特有な塩基配列と相補的な塩基
配列よりなる一本鎖プローブＤＮＡを周波数変換素子の
電極上に化学的に結合・固定化し、固定化された周波数
変換素子を水中に浸漬し、該ＤＮＡを検出する試料を該
水中に注入し、該試料を、該プローブＤＮＡに特異的な
塩基配列を有するターゲットＤＮＡとして該プローブＤ
ＮＡとハイブリッドを形成させ、該ハイブリッド形成に
よる重量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定
して、該ハイブリッド形成を検出・識別することよりな
り、該電極が金電極であって、該プローブＤＮＡが、そ
の塩基配列の末端にチオール基を導入したものを合成
し、さらにそれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡをハ
イブリッドさせて二本鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮ
Ａの水溶液中に周波数変換素子を浸漬・反応させ、次い
で該二本鎖ＤＮＡの融解点以上に加熱して電極上に固定
化されていない一本鎖を脱着させ、次いで該水溶液から
周波数変換素子を取り出し、乾燥することにより電極上
に化学的に結合・固定化されることを特徴とする生化学
物質検出方法を提供するものである。In the third embodiment of the present invention, a single-stranded probe DNA having a base sequence complementary to the base sequence unique to the double-stranded DNA of the biochemical substance is chemically attached to the electrode of the frequency conversion element. To the target DNA having a nucleotide sequence specific to the probe DNA, the sample for detecting the DNA is injected into the water, and the immobilized frequency conversion element is immersed in the water. The probe D
Forming a hybrid with NA, measuring the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the hybrid formation, and detecting / identifying the hybrid formation, wherein the electrode is a gold electrode, and the probe DNA is , A thiol group introduced at the end of its base sequence is synthesized, and a DNA having a complementary base sequence is hybridized to synthesize a double-stranded DNA.
The frequency conversion element is immersed in and reacted with the aqueous solution of A, and then heated above the melting point of the double-stranded DNA to desorb single strands not immobilized on the electrode, and then from the aqueous solution. The present invention provides a method for detecting a biochemical substance, characterized in that it is chemically bound and immobilized on an electrode by taking out and drying.
【０００８】本発明は、第４の実施態様において、周波
数変換素子と、該周波数変換素子の電極上に化学的に結
合・固定化された、生化学物質のＤＮＡに特有な塩基配
列と相補的な塩基配列よりなるプローブＤＮＡとよりな
り、前記実施態様１〜３の方法に用いられる生化学物質
検出センサーを提供するものである。In the fourth embodiment, the present invention is complementary to a frequency conversion element and a base sequence peculiar to DNA of a biochemical substance, which is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element. The present invention provides a biochemical substance detection sensor for use in the methods according to the first to third embodiments, which comprises a probe DNA having a different base sequence.
【０００９】本発明は、第５の実施態様において、生化
学物質としてのタンパクを特異的に吸着する生化学物質
のＤＮＡを周波数変換素子の電極上に化学的に結合・固
定化し、固定化された周波数変換素子を水中に浸漬し、
該タンパクを検出する試料を該水中に注入し、吸着さ
せ、吸着による重量変化に伴う周波数変換素子の周波数
変化を測定して該タンパクを検出することを特徴とする
生化学物質検出方法を提供するものである。In a fifth embodiment of the present invention, DNA of a biochemical substance that specifically adsorbs a protein as a biochemical substance is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element to be immobilized. The frequency conversion element is immersed in water,
Provided is a method for detecting a biochemical substance, which comprises injecting a sample for detecting the protein into the water, causing the sample to adsorb, and measuring the frequency change of a frequency conversion element due to a weight change due to the adsorption to detect the protein. It is a thing.
【００１０】本発明は、第６の実施態様において、生化
学物質としてのタンパクを特異的に吸着する生化学物質
のＤＮＡを周波数変換素子の電極上に化学的に結合・固
定化し、固定化された周波数変換素子上に、該タンパク
を検出する水溶液の試料を気相中で滴下し、吸着させ、
吸着による重量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化
を測定して該タンパクを検出することを特徴とする生化
学物質検出方法を提供するものである。In a sixth embodiment of the present invention, DNA of a biochemical substance that specifically adsorbs a protein as a biochemical substance is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element to be immobilized. On the frequency conversion element, a sample of an aqueous solution for detecting the protein is dropped in the gas phase and adsorbed,
The present invention provides a biochemical substance detection method characterized in that the protein is detected by measuring the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to adsorption.
【００１１】本発明は、第７の実施態様において、周波
数変換素子と、該周波数変換素子の電極上に化学的に結
合・固定化された、生化学物質としてのタンパクを特異
的に吸着する生化学物質のＤＮＡとよりなり、前記実施
態様５〜６の方法に用いられる生化学物質検出センサー
を提供するものである。According to a seventh aspect of the present invention, a frequency conversion element and a raw material for chemically adsorbing a protein as a biochemical substance, which is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element. The present invention provides a biochemical substance detection sensor, which is composed of DNA as a chemical substance and is used in the methods of the above-mentioned fifth to sixth embodiments.
【００１２】本発明方法により検出される生化学物質
は、特異的な塩基配列を有するものおよびそれを構成す
る特異的な塩基を有するものを包含することができる
が、生物、特に各種菌類、各種ウィルスなどの微生物を
構成し、特異的な塩基配列を有する核酸および、該核酸
を構成する塩基もしくは塩基を含む成分を包含すること
ができる。このような核酸の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ
があげられる。前記核酸を構成する塩基もしくは塩基を
含む成分の例として、アデニン、グアニン、シトシン、
チミン、ウラシルなどの塩基、シチジン、ウリジン、デ
オキシアデノシン、デオキシグアノシン、アデノシン、
グアノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンなど
のヌクレオシド；アデノシンモノリン酸、アデノシンジ
リン酸、アデノシントリリン酸、デオキシシチジンモノ
リン酸、デオキシグアノシントリリン酸、デオキシチミ
ジンモノリン酸、ウリジンモノリン酸などのヌクレオチ
ド；などがあげられる。これらのうちＤＮＡ、ＲＮＡな
どが好ましい。上記ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ、二重構
造を形成する二本鎖ＤＮＡおよび三重構造を形成する三
本鎖ＤＮＡが包含される。The biochemical substance detected by the method of the present invention can include those having a specific base sequence and those having a specific base constituting the biochemical substance. A nucleic acid that constitutes a microorganism such as a virus and has a specific base sequence, and a base or a component containing the base that constitutes the nucleic acid can be included. Examples of such nucleic acids include DNA and RNA
Can be given. Examples of bases or components containing bases that compose the nucleic acid include adenine, guanine, cytosine,
Bases such as thymine and uracil, cytidine, uridine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, adenosine,
Nucleosides such as guanosine, deoxythymidine, and deoxycytidine; nucleotides such as adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, deoxycytidine monophosphate, deoxyguanosine triphosphate, deoxythymidine monophosphate, and uridine monophosphate; and the like. Of these, DNA and RNA are preferred. The above DNA includes single-stranded DNA, double-stranded DNA forming a double structure, and triple-stranded DNA forming a triple structure.
【００１３】本発明において、生化学物質のＤＮＡに特
異的に吸着し、検出されるタンパク質の例として、ＤＮ
Ａ螺旋不安化タンパク質として知られているラクトース
リプレッサタンパク、サルウィルスが作り出すＴ抗原な
どのタンパク質などがあげられる。In the present invention, DN is used as an example of a protein that is specifically adsorbed to DNA of a biochemical substance and detected.
Examples thereof include lactose repressor protein known as A-helix instability protein and proteins such as T antigen produced by simian virus.
【００１４】本発明に用いられる周波数変換素子は、例
えば水晶発振子、表面弾性波素子（ＳＡＷ）などを包含
することができる。The frequency conversion element used in the present invention can include, for example, a crystal oscillator and a surface acoustic wave element (SAW).
【００１５】本発明におけるプローブＤＮＡは、前記生
化学物質のＤＮＡに特有な塩基配列と相補的な塩基配列
より構成されるものであり、ホスホルアミダイド法によ
るＤＮＡ合成機により得られる。該プローブＤＮＡとし
て、一本鎖または二本鎖のものを用いることができる。The probe DNA in the present invention is composed of a base sequence complementary to the base sequence peculiar to the biochemical substance DNA, and can be obtained by a DNA synthesizer by the phosphoramidide method. As the probe DNA, single-stranded or double-stranded one can be used.
【００１６】本発明におけるターゲットＤＮＡは、前記
生化学物質のＤＮＡであって、前記のプローブＤＮＡに
特異的な塩基配列を有するものであり、該プローブＤＮ
Ａの塩基配列と相補的な特有の塩基配列を有する。該タ
ーゲットＤＮＡとして、一本鎖または二本鎖のものを用
いることができる。The target DNA in the present invention is a DNA of the above-mentioned biochemical substance and has a base sequence specific to the above-mentioned probe DNA, and the probe DN
It has a unique base sequence complementary to the base sequence of A. As the target DNA, single-stranded or double-stranded one can be used.
【００１７】本発明におけるプローブＤＮＡを周波数変
換素子の電極上に化学的に結合・固定化する方法として
は、例えば、周波数変換素子が水晶発振子であり電極が
金電極の場合、該プローブＤＮＡの相補的な塩基配列の
末端にチオール基を導入したものを合成し、（ｉ）その
水溶液中に水晶発振子を一定時間浸漬・反応させ、次い
で該水溶液から水晶発振子を取り出し、乾燥させる方
法、（ii）その水溶液を周波数変換素子上に滴下・反応
させ、次いで純水または該プローブＤＮＡとハイブリッ
ドを形成するＤＮＡを含まない水溶液で洗浄し、乾燥さ
せる方法などがあげられる。該チオール基としてはＳ−
トリチル−３−メルカプトプロピルオキシ−β−シアノ
エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダ
イドなどが包含され、該プローブＤＮＡの相補的な塩基
配列の末端へのチオール基の導入はホスホルアミダイド
法により行うことができる。As a method of chemically binding and immobilizing the probe DNA on the electrode of the frequency conversion element in the present invention, for example, when the frequency conversion element is a crystal oscillator and the electrode is a gold electrode, the probe DNA A method in which a thiol group is introduced at the end of a complementary base sequence, (i) a crystal oscillator is immersed and reacted in the aqueous solution for a certain period of time, and then the crystal oscillator is taken out from the aqueous solution and dried. (Ii) A method in which the aqueous solution is dropped and reacted on the frequency conversion element, and then washed with pure water or an aqueous solution containing no DNA that forms a hybrid with the probe DNA and dried. The thiol group is S-
Trityl-3-mercaptopropyloxy-β-cyanoethyl-N, N-diisopropylaminophosphoramidite and the like are included, and the introduction of a thiol group at the terminal of the complementary base sequence of the probe DNA is carried out by the phosphoramidide method. Can be done by.
【００１８】本発明において、周波数変換素子の電極上
に化学的に結合・固定化されるプローブＤＮＡの量は、
それとＤＮＡハイブリッドを形成するターゲットＤＮＡ
の大きさによって変動するが通常１〜１５００ｎｇの範
囲、好ましくは１００〜２００ｎｇの範囲にある。In the present invention, the amount of probe DNA chemically bound and immobilized on the electrode of the frequency conversion element is
Target DNA that forms a DNA hybrid with it
However, it is usually in the range of 1 to 1500 ng, preferably in the range of 100 to 200 ng.
【００１９】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極上への固定化方法の第１の好ましい態様
によれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが二本鎖で
あり、該プローブＤＮＡが一本鎖であって、その塩基配
列の末端にチオール基を導入したものを合成し、その水
溶液を周波数変換素子上に滴下・反応させ、次いで純水
または該プローブＤＮＡとハイブリッドを形成するＤＮ
Ａを含まない水溶液で洗浄し、乾燥させることにより化
学的に結合・固定化される。In the first embodiment of the present invention, according to the first preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode and the DNA is double-stranded. The probe DNA is single-stranded, and a thiol group is introduced at the end of its base sequence is synthesized, and the aqueous solution is dropped and reacted on the frequency conversion element, and then pure water or a hybrid with the probe DNA is prepared. DN to form
It is chemically bound and immobilized by washing with an aqueous solution containing no A and drying.
【００２０】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第２の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが二本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが一本鎖であって、相補的な塩基
配列の末端にチオール基を導入したものを合成し、その
水溶液中に周波数変換素子を一定時間浸漬・反応させ、
ついで該水溶液から周波数変換素子を取り出し、乾燥さ
せることにより化学的に結合・固定化される。In a first preferred embodiment of the present invention, according to a second preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, said electrode is a gold electrode and said DNA is double-stranded. The probe DNA is single-stranded, and a thiol group is introduced at the end of the complementary base sequence is synthesized, and the frequency conversion element is immersed and reacted in the aqueous solution for a certain period of time.
Then, the frequency conversion element is taken out of the aqueous solution and dried to be chemically bound and immobilized.
【００２１】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第３の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが三本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが、一本鎖であってその塩基配列
の末端にチオール基を導入したものを合成し、さらにそ
れと相補的な塩基配列を有するＤＮＡをハイブリッドさ
せて二本鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡの水溶液中
に周波数変換素子を浸漬・反応させ、次いで該二本鎖Ｄ
ＮＡの融解点以上に加熱して電極上に固定化されていな
い一本鎖を脱着させ、次いで該水溶液から周波数変換素
子を取り出し、乾燥することにより電極上に化学的に結
合固定化される。この固定化方法によれば、プローブＤ
ＮＡを電極上に均一に固定化することが可能となると共
に、ターゲットＤＮＡとのハイブリッドの形成の効率を
向上させることができる。In the first embodiment of the present invention, according to a third preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode and the DNA is triple-stranded. A probe DNA which is single-stranded and has a thiol group introduced at the end of its base sequence is synthesized, and a DNA having a complementary base sequence is hybridized to synthesize a double-stranded DNA. The frequency conversion element is dipped and reacted in an aqueous solution of double-stranded DNA, and then the double-stranded DNA
The single strand that has not been immobilized on the electrode is desorbed by heating above the melting point of NA, and then the frequency conversion element is taken out from the aqueous solution and dried to chemically bond and immobilize on the electrode. According to this immobilization method, the probe D
NA can be uniformly immobilized on the electrode, and the efficiency of hybrid formation with the target DNA can be improved.
【００２２】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第４の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが二本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが、一本鎖であってその塩基配列
の末端にチオール基を導入したものを合成し、さらにそ
れと相補的な塩基配列を有するＤＮＡをハイブリッドさ
せて二本鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡの水溶液を
該周波数変換素子上に滴下・反応させ、次いで該二本鎖
ＤＮＡの融解点以上に加熱して電極上に固定化されてい
ない一本鎖を脱着させ、次いで純水または該プローブＤ
ＮＡと、ハイブリッドを形成するＤＮＡを含まない水溶
液で洗浄・乾燥させることにより電極上に化学的に結合
・固定化される。この固定化方法によれば、プローブＤ
ＮＡを電極上に均一に固定化することが可能となると共
にターゲットＤＮＡとのハイブリッド形成の効率を向上
させることができる。In the first embodiment of the present invention, according to the fourth preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode, the DNA is double-stranded, and A probe DNA which is single-stranded and has a thiol group introduced at the end of its base sequence is synthesized, and a DNA having a complementary base sequence is hybridized to synthesize a double-stranded DNA. An aqueous solution of double-stranded DNA is dropped and allowed to react on the frequency conversion element, and then heated above the melting point of the double-stranded DNA to desorb single strands not immobilized on the electrode, and then pure water or The probe D
NA is chemically bound and immobilized on the electrode by washing and drying with an aqueous solution containing no DNA forming a hybrid. According to this immobilization method, the probe D
NA can be uniformly immobilized on the electrode, and the efficiency of hybridization with the target DNA can be improved.
【００２３】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第５の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが三本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが、二本鎖であってその塩基配列
の末端にチオール基を導入したものを合成し、さらにそ
れと相補的な塩基配列を有するＤＮＡをハイブリッドさ
せて二本鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡの水溶液中
に周波数変換素子を浸漬・反応させ、次いで該水溶液か
ら周波数変換素子を取り出し、乾燥させることにより化
学的に結合・固定化される。In the first embodiment of the present invention, according to the fifth preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode, the DNA is triple-stranded, and A double-stranded probe DNA having a thiol group introduced at the end of its base sequence is synthesized, and a DNA having a complementary base sequence is hybridized to synthesize a double-stranded DNA. The frequency conversion element is immersed in and reacted in an aqueous solution of the single-stranded DNA, and then the frequency conversion element is taken out from the aqueous solution and dried to chemically bond and immobilize it.
【００２４】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第６の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが三本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが、二本鎖であって、その塩基配
列の末端にチオール基を導入したものを合成し、さらに
それと相補的な塩基配列を有するＤＮＡをハイブリッド
させて二本鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡの水溶液
を周波数変換素子上に滴下・反応させ、次いで純水また
は該プローブＤＮＡとハイブリッドを形成するＤＮＡを
含まない水溶液で洗浄し、乾燥させることにより化学的
に結合・固定化される。In the first embodiment of the present invention, according to the sixth preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode and the DNA is triple-stranded. The probe DNA is double-stranded and is synthesized by introducing a thiol group into the end of its base sequence, and further hybridized with a DNA having a complementary base sequence to synthesize a double-stranded DNA, An aqueous solution of double-stranded DNA is dropped and reacted on the frequency conversion element, then washed with pure water or an aqueous solution containing no DNA that hybridizes with the probe DNA, and dried to chemically bond and immobilize. It
【００２５】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第７の好ましい態様に
よれば、該電極が金電極であり、該ＤＮＡが三本鎖であ
り、該プローブＤＮＡが、一本鎖であって、相補的な塩
基配列の末端にチオール基を導入したものを合成し、そ
の水溶液中に周波数変換素子を一定時間浸漬・反応さ
せ、ついで該水溶液から周波数変換素子を取り出し、乾
燥させることにより化学的に結合・固定化される。In the first embodiment of the present invention, according to the seventh preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on an electrode, the electrode is a gold electrode and the DNA is triple-stranded. The probe DNA is single-stranded and is synthesized by introducing a thiol group at the end of the complementary base sequence, and the frequency conversion element is immersed and reacted in the aqueous solution for a certain period of time, and then the frequency conversion is performed from the aqueous solution. The element is taken out and dried to be chemically bound and immobilized.
【００２６】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第８の好ましい態様
は、該ＤＮＡが三本鎖である以外、前記第３の好ましい
態様と同様である。In the first embodiment of the present invention, the eighth preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on the electrode is the same as the third preferred embodiment except that the DNA is triple-stranded. .
【００２７】本発明の第１の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の第９の好ましい態様
は、該ＤＮＡが三本鎖である以外、前記第４の好ましい
態様と同様である。In the first embodiment of the present invention, the ninth preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on the electrode is the same as the fourth preferred embodiment except that the DNA is triple-stranded. .
【００２８】本発明の第２の実施態様において、プロー
ブＤＮＡの電極への固定化方法の好ましい態様は、第１
の実施態様において該ＤＮＡが三本鎖である場合とそれ
ぞれ同様である。In the second embodiment of the present invention, the preferred embodiment of the method for immobilizing probe DNA on the electrode is the first embodiment.
In each of the above embodiments, it is the same as when the DNA is triple-stranded.
【００２９】本発明に用いられるプローブＤＮＡは、例
えば式（Ｉ）：The probe DNA used in the present invention has, for example, the formula (I):
【化１】 （式中、ｎは４、６または８の整数である）で表わされ
るカチオン性脂質（以下、それぞれ２Ｃ4 Ｎ+ 、２Ｃ6
Ｎ+ および２Ｃ8 Ｎ+ と略記する）との複合体（以下Ｄ
ＮＡ−脂質複合体という）として電極上に化学的に結合
・固定化することができる。該ＤＮＡ−脂質複合体は該
ＤＮＡと該脂質とを水中で混合することにより得られ
る。該ＤＮＡ−脂質複合体を用いるとＤＮＡのリン酸基
が保護されていることからＤＮａｓｅによる加水分解が
抑制され、またＤＮＡの表面が疎水性化されることで脂
質膜との相互作用が向上する。[Chemical 1] (In the formula, n is an integer of 4, 6 or 8) and a cationic lipid (hereinafter, 2C 4 N + and 2C 6 respectively).
Complex with N + and 2C 8 N + (hereinafter D)
It can be chemically bound and immobilized on the electrode as an NA-lipid complex). The DNA-lipid complex is obtained by mixing the DNA and the lipid in water. When the DNA-lipid complex is used, the phosphate group of the DNA is protected and thus hydrolysis by DNase is suppressed, and the surface of the DNA is made hydrophobic so that the interaction with the lipid membrane is improved. .
【００３０】本発明の第１〜３の実施態様において、周
波数変化の測定方法の第１の好ましい態様によれば、周
波数変化の測定が、ハイブリッド形成後、気相中で純水
またはターゲットＤＮＡを含まない溶液で洗浄し、乾燥
することにより行なわれる。In the first to third embodiments of the present invention, according to the first preferred embodiment of the method for measuring frequency change, the frequency change is measured by pure water or target DNA in the gas phase after hybridization. It is carried out by washing with a solution not containing it and drying.
【００３１】本発明の第２〜３の実施態様において、周
波数変化の測定方法の好ましい態様によれば、該周波数
変化の測定が、ハイブリッド形成後、水中で周波数変化
を測定し、周波数変化が飽和状態に達した後、該固定化
周波数変換素子をターゲットＤＮＡを含まない水溶液ま
たは純水に移して洗浄し、さらに周波数変化を測定する
ことにより行われる。In the second to third embodiments of the present invention, according to a preferred aspect of the method for measuring frequency change, the frequency change is measured by measuring the frequency change in water after hybridization, and the frequency change is saturated. After reaching the state, the immobilization frequency conversion element is transferred to an aqueous solution or pure water containing no target DNA, washed, and the frequency change is measured.
【００３２】[0032]
【発明の効果】本発明によれば、特殊技術を要するこ
と、定量性に乏しいこと、長時間の測定を要することな
どの従来技術における欠点がなく、水相または気相中
で、簡便にしかも直接ＤＮＡハイブリッドの形成反応を
解析し、かつ形成されたＤＮＡハイブリッドを分離定量
できる方法であって、ＤＮＡハイブリッドの形成を高精
度にかつ定量的にしかも簡便に検出できることにより生
化学的物質を検出する方法および該方法に用いられる生
化学物質検出センサーが提供される。例えば、生化学物
質としてのサルモネラ菌のＤＮＡに特有な塩基配列と相
補的な塩基配列よりなるプローブＤＮＡとハイブリッド
を形成しうる塩基配列はサルモネラ菌のＤＮＡに特有な
塩基配列のみであることから、ハイブリッドの形成にと
もなう周波数変化からハイブリッドの形成を検出するこ
とにより生化学物質としてのサルモネラ菌を検出するこ
とができることになる。本発明は、結核菌などの細菌、
ＡＩＤＳ（エイズ）ウィルスなどのウィルス、白血病、
ガン、遺伝病などに特有なＤＮＡの検出による臨床検査
および病気の診断、食物中に存在するサルモネラ菌など
の菌類に特有なＤＮＡの検出、同定などによる食物検
査、クローニングなどにより増殖した目的ＤＮＡ断片の
純度測定および目的ＤＮＡ断片の精製、ＤＮＡ螺旋不安
化タンパク質として知られているラクトースリプレッサ
タンパク質、サルウィルスが作り出すＴ抗原などのタン
パク質の検出、三重構造を形成するＤＮＡの検出などに
利用しうる生化学物質検出用センサーを提供することが
できる。本発明は、ＤＮＡ加水分解反応の追跡、加水分
解抑制効果の判定、加水分解の加水分解酵素の濃度効
果、測定溶液の塩濃度効果の解析、医薬品などとして注
目されている遺伝子、リボザイムおよびアンチセンスな
どの核酸化合物の核酸の細胞内への移行効率を高めるこ
と、細胞内の分布制御することなどに利用しうる方法を
提供することができる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, there are no drawbacks in the prior art such as requiring a special technique, lacking in quantitativeness, and requiring a long-time measurement, and it is possible to easily and easily in a water phase or a gas phase. A method for directly analyzing the formation reaction of a DNA hybrid and separating and quantifying the formed DNA hybrid, and detecting a biochemical substance by detecting the formation of the DNA hybrid with high accuracy, quantitatively and easily. Methods and biochemical detection sensors for use in the methods are provided. For example, since a base sequence that can form a hybrid with a probe DNA consisting of a base sequence complementary to a salmonella bacterium DNA as a biochemical substance is a base sequence unique to salmonella bacterium DNA, By detecting the formation of the hybrid from the frequency change associated with the formation, it is possible to detect Salmonella as a biochemical substance. The present invention is a bacterium such as Mycobacterium tuberculosis,
Viruses such as AIDS virus, leukemia,
Clinical examination and disease diagnosis by detection of DNA specific to cancer, genetic disease, etc., detection of DNA specific to fungi such as Salmonella present in food, food inspection by identification, etc. Purity measurement and purification of target DNA fragment, lactose repressor protein known as DNA helix destabilizing protein, detection of proteins such as T antigen produced by simian virus, detection of DNA forming triple structure, etc. A sensor for detecting a chemical substance can be provided. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is directed to tracking of DNA hydrolysis reaction, determination of hydrolysis inhibitory effect, analysis of hydrolytic enzyme concentration effect, analysis of salt concentration effect of measurement solution, gene, ribozyme and antisense, which are attracting attention as pharmaceuticals. It is possible to provide a method that can be used for enhancing the efficiency of transfer of a nucleic acid compound such as a nucleic acid into a cell and controlling the distribution in the cell.
【００３３】[0033]
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
【００３４】実施例１ プローブＤＮＡとして（５′−ｄＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴ
−３′）１０ｍｅｒの塩基を持つＤＮＡオリゴマーをホ
スホルアミダイド法によるＤＮＡ合成機を用いて合成
し、５′末端に水晶発振子の金電極板に固定するための
チオール基を導入した。このプローブＤＮＡの金電極へ
の固定化は、５ｎＭのプローブＤＮＡ水溶液を振動子上
に気相中で滴下し、所定時間反応後、金電極上の水溶液
を純水で洗浄し、乾燥することによって行い、振動数変
化から固定化量を定量した。その結果表１に見られるよ
うに１時間では２００ｎｇ、１０時間では７５０ｎｇが
固定化された。別途、同様にして１５０〜２００ｎｇの
上記プローブＤＮＡを固定化した発振子を用いて、ター
ゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションによる水晶振動
子の振動数変化量を測定した。プローブＤＮＡを固定化
した水晶発振子上に、気相中でターゲットＤＮＡとして
プローブＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＥｃｏｌｉ
ＪＭ１０９由来の環状一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ（分子量２
４０万：７２４９塩基）を６ｐｍｏｌ滴下、反応させた
後、水晶発振子を蒸留水で洗浄し、空気中で乾燥した。
次いでハイブリッド形成による重量変化に伴う水晶発振
子の周波数変化量を測定した。表２に乾燥後の振動数変
化量とターゲットＤＮＡのハイブリッド形成による吸着
量を示した。測定には１ｎｇのターゲットＤＮＡが吸着
することにより１Ｈｚ振動数が変化する水晶振動子を用
いているので、振動数変化量からターゲットＤＮＡのハ
イブリッド形成による吸着重量を求めたところ、表２に
示されるように６００ｎｇであった。Example 1 (5'-dGGGAATTCGT as a probe DNA
-3 ') A DNA oligomer having a base of 10 mer was synthesized using a DNA synthesizer by the phosphoramidide method, and a thiol group for fixing to a gold electrode plate of a quartz oscillator was introduced at the 5'end. Immobilization of this probe DNA on the gold electrode is carried out by dropping 5 nM aqueous solution of the probe DNA on the oscillator in the gas phase, reacting for a predetermined time, washing the aqueous solution on the gold electrode with pure water, and drying. The amount of immobilization was quantified from the change in frequency. As a result, as shown in Table 1, 200 ng was immobilized at 1 hour and 750 ng was immobilized at 10 hours. Separately, similarly, an oscillator having 150 to 200 ng of the probe DNA immobilized thereon was used to measure the amount of change in the frequency of the crystal oscillator due to the hybridization of the target DNA. Ecoli having a base sequence complementary to the probe DNA as a target DNA in a gas phase on a crystal oscillator on which the probe DNA is immobilized
Circular single-stranded M13 DNA derived from JM109 (molecular weight 2
(400,000: 7249 bases) was added dropwise in an amount of 6 pmol to cause reaction, and then the crystal oscillator was washed with distilled water and dried in air.
Next, the amount of frequency change of the crystal oscillator due to the weight change due to hybridization was measured. Table 2 shows the amount of change in frequency after drying and the amount of adsorption due to hybridization of the target DNA. Since a crystal oscillator whose 1 Hz frequency changes by adsorbing 1 ng of target DNA is used for the measurement, the adsorbed weight due to hybridization of the target DNA was determined from the frequency change amount, and it is shown in Table 2. So it was 600 ng.
【００３５】比較例１ ターゲットＤＮＡとして、実施例１のターゲットＤＮＡ
から、プローブＤＮＡと相補的な塩基配列部分を切りと
った非相補的なターゲットＤＮＡを用いる以外、実施例
１と同様の実験を行なったところ、表２に示されるよう
に周波数変化は全く認められず、ハイブリッドの形成を
検出することができなかった。Comparative Example 1 The target DNA of Example 1 was used as the target DNA.
From the above, the same experiment as in Example 1 was carried out except that the non-complementary target DNA in which the base sequence portion complementary to the probe DNA was cut off was used, and no frequency change was observed as shown in Table 2. , Formation of hybrids could not be detected.
【００３６】実施例１および比較例１の結果から、水晶
振動子の振動数変化からプローブＤＮＡに相補的な塩基
配列を持つＭ１３ＤＮＡだけを、特異的に検出できるこ
とがわかる。From the results of Example 1 and Comparative Example 1, it can be seen that only M13 DNA having a base sequence complementary to the probe DNA can be specifically detected from the change in the frequency of the crystal oscillator.
【００３７】[0037]
【表１】 [Table 1]
【００３８】[0038]
【表２】 [Table 2]
【００３９】実施例２ 図１に示されるチオール基導入一本鎖プローブＤＮＡを
下記の通り作製した。５′−ｄＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴ−
３′の配列を持ち、５′側リン酸基にＳＨ基を導入した
合成１０−ｍｅｒプローブＤＮＡ（分子量１４８０) を
（株）日本バイオサービスより購入（購入時は乾燥状
態）し、０．５ｍｌの蒸留水を加えて水溶液にした後、
窒素雰囲気下で少量ずつ冷凍保存した。ターゲット鎖と
して、プローブと相補的な５′−ｄＡＣＧＡＡＴＴＣＣ
Ｃ−３′の配列を持つ合成１０−ｍｅｒＤＮＡ（分子量
１３６２）を（株）日本バイオサービスより購入し、水
溶液にした後、少量ずつ冷凍保存した。これを室温で溶
液に戻した後、プローブ、ターゲットともに３μｇが溶
液中に含まれるように、両者を混ぜ合わせ、５．５ｍｌ
とした。この溶液を窒素雰囲気下、完全に二重鎖を巻か
せるために４℃で一晩保存した。ＳＨ基が水中の酸素に
酸化されるのを防ぐため、溶液の調整には、超音波をか
けながらアスピレーターで吸引して気泡を除いた脱気水
を用いた。実施例１で用いた水晶発振子を、１７℃にお
いて、上記水溶液に浸漬し、プローブＤＮＡの固定化量
の経時変化を測定したところ、浸漬時間３時間について
図２に示されるように、プローブＤＮＡの固定化量が約
９００ｎｇで飽和に達した。浸漬時間４時間の時点で、
上記二本鎖プローブＤＮＡの融解点以上であって８０℃
の蒸留水中に、二本鎖プローブＤＮＡ固定化水晶発振子
を浸漬したところ、図２に示されるように、浸漬時間５
時間の時点で水晶発振子への固定化量が約５００ｎｇま
で減少し、上記二本鎖プローブＤＮＡのうち水晶発振子
の全電極に化学的に結合されていない相補鎖が脱離した
ことがわかった。Example 2 The thiol group-introduced single-stranded probe DNA shown in FIG. 1 was prepared as follows. 5'-dGGGAATTCGT-
A synthetic 10-mer probe DNA (molecular weight 1480) having a 3'sequence and an SH group introduced into the 5'-side phosphate group was purchased from Nippon Bio Service Co., Ltd. (dry state at the time of purchase), and 0.5 ml was purchased. After adding distilled water to make an aqueous solution,
It was frozen and stored little by little under a nitrogen atmosphere. 5'-dACGAATTCC complementary to the probe as the target strand
A synthetic 10-mer DNA (molecular weight: 1362) having a C-3 ′ sequence was purchased from Nippon Bioservice Co., Ltd., made into an aqueous solution, and then frozen and stored in small portions. After returning this to the solution at room temperature, both were mixed so that 3 μg of both probe and target were contained in the solution, and 5.5 ml
And This solution was stored under a nitrogen atmosphere at 4 ° C. overnight in order to completely wind the double strands. In order to prevent the SH group from being oxidized to oxygen in water, degassed water was used for the preparation of the solution, in which bubbles were removed by suction with an aspirator while applying ultrasonic waves. The crystal oscillator used in Example 1 was immersed in the above aqueous solution at 17 ° C., and the time-dependent change in the immobilized amount of the probe DNA was measured. As shown in FIG. The amount of immobilization was about 900 ng, and the saturation was reached. When the immersion time is 4 hours,
80 ° C. above the melting point of the double-stranded probe DNA
When the double-stranded probe DNA-immobilized crystal oscillator was immersed in the distilled water of Example 1, as shown in FIG.
It was found that the immobilization amount on the crystal oscillator decreased to about 500 ng at the time point, and the complementary strand that was not chemically bound to all electrodes of the crystal oscillator was detached from the double-stranded probe DNA. It was
【００４０】実施例３ サケ精子由来ＤＮＡにホスホルアミダイド法によって、
チオール基を導入したＤＮＡ水溶液に水晶発振動子を浸
漬し金電極上に該ＤＮＡを５０ｎｇ固定化した。炭素鎖
長の異なる合成カチオン性脂質２Ｃ4 Ｎ+ 、２Ｃ6 Ｎ+
および２Ｃ8 Ｎ+ と金電極上に固定化したＤＮＡとの複
合体をそれぞれ作製した。３種のＤＮＡ−複合体を固定
化した水晶発振動子のそれぞれを２５℃の溶液に浸漬
し、加水分解酵素ＤＮａｓｅｌを注入し、ＤＮａｓｅｌ
による水晶発振動子固定化ＤＮＡの加水分解による重量
変化にともなう水晶発振動子の周波数の経時変化を測定
し、周波数の経時変化から加水分解量を求め、測定前の
重量との比をとって加水分解率を求めた。得られた結果
を図３に示す。カチエン性脂質との複合体ではないＤＮ
Ａは２時間程度で完全に加水分解されてしまい、カチオ
ン性脂質とＤＮＡとの複合体では、いづれも加水分解の
抑制がみられ、特に２Ｃ8 Ｎ+ とＤＮＡとの複合体にお
いては、加水分解は観察されなかった。Example 3 Salmon sperm-derived DNA was analyzed by the phosphoramidide method.
A quartz oscillator was immersed in an aqueous DNA solution containing a thiol group to immobilize 50 ng of the DNA on the gold electrode. Synthetic cationic lipids with different carbon chain lengths 2C 4 N + , 2C 6 N +
And 2C 8 N + and DNA immobilized on a gold electrode were prepared. Each of the quartz oscillators on which the three kinds of DNA-complexes are immobilized is immersed in a solution at 25 ° C., and the hydrolase DNasel is injected to the DNasel.
The time-dependent change in the frequency of the crystal oscillator due to the weight change due to the hydrolysis of the crystal oscillator-immobilized DNA was measured, and the amount of hydrolysis was calculated from the time-dependent change in the frequency, and the ratio with the weight before measurement was taken. The hydrolysis rate was calculated. The obtained results are shown in FIG. DN not a complex with a cationic lipid
A was completely hydrolyzed in about 2 hours, and in the complex of the cationic lipid and DNA, hydrolysis was suppressed in all cases, and especially in the complex of 2C 8 N + and DNA. No decomposition was observed.
【図１】本発明に用いられるチオール基導入二本鎖プロ
ーブＤＮＡの略図である。FIG. 1 is a schematic view of a thiol group-introduced double-stranded probe DNA used in the present invention.
【図２】本発明に用いられるプローブＤＮＡの電極への
固定化方法の１例を説明するためのグラフである。FIG. 2 is a graph for explaining an example of a method for immobilizing a probe DNA on an electrode used in the present invention.
【図３】本発明に用いられるＤＮＡの加水分解率の経時
変化の１例を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing an example of changes over time in the hydrolysis rate of DNA used in the present invention.
Claims (16)
相補的な塩基配列よりなるプローブＤＮＡを周波数変換
素子の電極上に化学的に結合・固定化し、固定化された
周波数変換素子上に、気相中で、該ＤＮＡを検出する試
料の水溶液を滴下し、該試料を、該プローブＤＮＡに特
異的な塩基配列を有するターゲットＤＮＡとして該プロ
ーブＤＮＡとハイブリッドを形成させ、該ハイブリッド
形成による重量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化
を測定して該ハイブリッド形成を検出・識別することを
特徴とする生化学物質検出方法。1. A probe DNA having a base sequence complementary to a base sequence peculiar to DNA of a biochemical substance is chemically bonded and immobilized on an electrode of a frequency conversion element, and the probe DNA is fixed on the immobilized frequency conversion element. In a gas phase, an aqueous solution of a sample for detecting the DNA is dropped, and the sample is used as a target DNA having a base sequence specific to the probe DNA to form a hybrid with the probe DNA. A method for detecting a biochemical substance, which comprises detecting a change in frequency of a frequency conversion element due to a change and detecting / identifying the hybrid formation.
ＮＡが該二本鎖ＤＮＡを構成する一本鎖であり、該ター
ゲットＤＮＡが該プローブＤＮＡと相補的で、該二本鎖
ＤＮＡを構成する他の一本鎖である請求項１記載の方
法。2. The DNA is double-stranded and the probe D
The method according to claim 1, wherein NA is a single strand that constitutes the double-stranded DNA, and the target DNA is a single strand that is complementary to the probe DNA and that constitutes the double-stranded DNA.
ＮＡが該三本鎖ＤＮＡを構成する二本鎖であり、該ター
ゲットＤＮＡが該プローブＤＮＡと相補的で、該三本鎖
ＤＮＡを構成する他の一本鎖である請求項１記載の方
法。3. The probe D, wherein the DNA is triple-stranded.
The method according to claim 1, wherein NA is a double strand constituting the triple stranded DNA, and the target DNA is a single strand complementary to the probe DNA and constituting the triple stranded DNA.
ＮＡが該三本鎖ＤＮＡを構成する一本鎖であり、該ター
ゲットＤＮＡが該プローブＤＮＡと相補的で、該三本鎖
ＤＮＡを構成する他の二本鎖である請求項１記載の方
法。4. The probe D, wherein the DNA is triple-stranded.
The method according to claim 1, wherein NA is a single strand that constitutes the triple-stranded DNA, and the target DNA is complementary to the probe DNA and is another double strand that constitutes the triple-stranded DNA.
配列と相補的な塩基配列よりなるプローブＤＮＡを周波
数変換素子の電極上に化学的に結合・固定化し、固定化
された周波数変換素子を水中に浸漬し、該ＤＮＡを検出
する試料を該水中に注入し、該試料を、該プローブＤＮ
Ａに特異的な塩基配列を有するターゲットＤＮＡとして
該プローブＤＮＡとハイブリッドを形成させ、該ハイブ
リッド形成による重量変化に伴う周波数変換素子の周波
数変化を測定して、該ハイブリッド形成を検出・識別す
ることを特徴とする生化学物質検出方法。5. A frequency conversion that is immobilized by chemically bonding and immobilizing a probe DNA having a base sequence complementary to the unique base sequence of the triple-stranded DNA of a biochemical substance on the electrode of the frequency conversion element. The element is immersed in water, a sample for detecting the DNA is injected into the water, and the sample is attached to the probe DN.
A method of forming a hybrid with the probe DNA as a target DNA having a base sequence specific to A, measuring the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the hybrid formation, and detecting / identifying the hybrid formation. Characteristic biochemical detection method.
成する一本鎖であり、該ターゲットＤＮＡが、該三本鎖
ＤＮＡを構成する他の二本鎖である請求項５記載の方
法。6. The method according to claim 5, wherein the probe DNA is a single strand that constitutes the triple-stranded DNA, and the target DNA is another double strand that constitutes the triple-stranded DNA.
成する二本鎖であり、該ターゲットＤＮＡが、該三本鎖
ＤＮＡを構成する他の一本鎖である請求項５記載の方
法。7. The method according to claim 5, wherein the probe DNA is a double strand that constitutes the triple-stranded DNA, and the target DNA is another single strand that constitutes the triple-stranded DNA.
配列と相補的な塩基配列よりなる一本鎖プローブＤＮＡ
を周波数変換素子の電極上に化学的に結合・固定化し、
固定化された周波数変換素子を水中に浸漬し、該ＤＮＡ
を検出する試料を該水中に注入し、該試料を、該プロー
ブＤＮＡに特異的な塩基配列を有するターゲットＤＮＡ
として該プローブＤＮＡとハイブリッドを形成させ、該
ハイブリッド形成による重量変化に伴う周波数変換素子
の周波数変化を測定して、該ハイブリッド形成を検出・
識別することよりなり、該電極が金電極であって、該プ
ローブＤＮＡが、その塩基配列の末端にチオール基を導
入したものを合成し、さらにそれと相補的な塩基配列を
有するＤＮＡをハイブリッドさせて二本鎖ＤＮＡを合成
し、該二本鎖ＤＮＡの水溶液中に周波数変換素子を浸漬
・反応させ、次いで該二本鎖ＤＮＡの融解点以上に加熱
して電極上に固定化されていない一本鎖を脱着させ、次
いで該水溶液から周波数変換素子を取り出し、乾燥する
ことにより電極上に化学的に結合・固定化されることを
特徴とする生化学物質検出方法。8. A single-stranded probe DNA having a base sequence complementary to a base sequence unique to a biochemical double-stranded DNA.
Is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element,
The immobilized frequency conversion element is immersed in water to obtain the DNA
Target DNA having a base sequence specific to the probe DNA is injected into the water.
As a result, a hybrid is formed with the probe DNA, and the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the hybrid formation is measured to detect the hybrid formation.
Identification, the electrode is a gold electrode, the probe DNA is synthesized by introducing a thiol group at the end of its base sequence, and the DNA having a base sequence complementary thereto is hybridized. A double-stranded DNA is synthesized, a frequency conversion element is immersed in and reacted in an aqueous solution of the double-stranded DNA, and then heated to a temperature above the melting point of the double-stranded DNA so that the double-stranded DNA is not immobilized on the electrode. A method for detecting a biochemical substance, characterized in that the chain is desorbed, then the frequency conversion element is taken out of the aqueous solution and dried to be chemically bound and immobilized on the electrode.
吸着する生化学物質のＤＮＡを周波数変換素子の電極上
に化学的に結合・固定化し、固定化された周波数変換素
子を水中に浸漬し、該タンパクを検出する試料を該水中
に注入し、吸着させ、吸着による重量変化に伴う周波数
変換素子の周波数変化を測定して該タンパクを検出する
ことを特徴とする生化学物質検出方法。9. A biochemical substance DNA that specifically adsorbs a protein as a biochemical substance is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element, and the immobilized frequency conversion element is immersed in water. A method for detecting a biochemical substance, comprising injecting a sample for detecting the protein into the water, causing the sample to adsorb, and measuring the frequency change of the frequency conversion element due to the weight change due to the adsorption to detect the protein.
に吸着する生化学物質のＤＮＡを周波数変換素子の電極
上に化学的に結合・固定化し、固定化された周波数変換
素子上に、該タンパクを検出する水溶液の試料を気相中
で滴下し、吸着させ、吸着による重量変化に伴う周波数
変換素子の周波数変化を測定して該タンパクを検出する
ことを特徴とする生化学物質検出方法。10. A biochemical substance DNA that specifically adsorbs a protein as a biochemical substance is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element, and the protein is immobilized on the immobilized frequency conversion element. A method for detecting a biochemical substance, which comprises: dropping a sample of an aqueous solution for detection of a protein in a gas phase, allowing the sample to adsorb, and measuring a frequency change of a frequency conversion element due to a weight change due to the adsorption to detect the protein.
ン性脂質との複合体として存在する請求項１〜１０のい
ずれかに記載の方法。11. The method according to claim 1, wherein the DNA immobilized on the electrode is present as a complex with a cationic lipid.
前記請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。12. The method according to claim 1, wherein the frequency conversion element is a crystal oscillator.
の電極上に化学的に結合・固定化された、生化学物質の
ＤＮＡに特有な塩基配列と相補的な塩基配列よりなるプ
ローブＤＮＡとよりなり、前記請求項１〜８のいずれか
に記載の方法に用いられる生化学物質検出センサー。13. A frequency conversion element and a probe DNA, which is chemically bonded and immobilized on the electrode of the frequency conversion element and has a base sequence complementary to the base sequence unique to the DNA of the biochemical substance. The biochemical substance detection sensor used in the method according to any one of claims 1 to 8.
の電極上に化学的に結合・固定化された、生化学物質と
してのタンパクを特異的に吸着する生化学物質のＤＮＡ
とよりなり、請求項９または１０のいずれかに記載の方
法に用いられる生化学物質検出センサー。14. A frequency conversion element and a DNA of a biochemical substance, which is chemically bonded and immobilized on an electrode of the frequency conversion element and which specifically adsorbs a protein as a biochemical substance.
And a biochemical substance detection sensor used in the method according to claim 9 or 10.
ン性脂質との複合体である請求項１３または１４に記載
のセンサー。15. The sensor according to claim 13 or 14, wherein the DNA immobilized on the electrode is a complex with a cationic lipid.
請求項１２または１３記載のセンサー。16. The sensor according to claim 12, wherein the frequency conversion element is a crystal oscillator.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5237203A JPH0772059A (en) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the method |
| EP93307198A EP0589600A3 (en) | 1992-09-14 | 1993-09-13 | Method of detecting biochemical substances and sensor for use in said method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5237203A JPH0772059A (en) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0772059A true JPH0772059A (en) | 1995-03-17 |
Family
ID=17011908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5237203A Pending JPH0772059A (en) | 1992-09-14 | 1993-08-31 | Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0772059A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004506872A (en) * | 1999-11-03 | 2004-03-04 | インターナショナル・ビジネス・マシーンズ・コーポレーション | Cantilever sensors and transducers |
| KR100487758B1 (en) * | 2003-08-06 | 2005-05-06 | 엘지전자 주식회사 | Bio-chip and system for measuring the characteristic of bio-material using the same |
| US7402381B2 (en) | 2003-09-11 | 2008-07-22 | Seiko Epson Corporation | Method of immobilizing molecules onto a solid phase substrate and method of fabricating a biosensor using the method |
| US7562746B2 (en) | 2005-05-06 | 2009-07-21 | Hitachi, Ltd. | Method, system, and display for elevator allocation using multi-dimensional coordinates |
-
1993
- 1993-08-31 JP JP5237203A patent/JPH0772059A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004506872A (en) * | 1999-11-03 | 2004-03-04 | インターナショナル・ビジネス・マシーンズ・コーポレーション | Cantilever sensors and transducers |
| KR100487758B1 (en) * | 2003-08-06 | 2005-05-06 | 엘지전자 주식회사 | Bio-chip and system for measuring the characteristic of bio-material using the same |
| US7402381B2 (en) | 2003-09-11 | 2008-07-22 | Seiko Epson Corporation | Method of immobilizing molecules onto a solid phase substrate and method of fabricating a biosensor using the method |
| US7562746B2 (en) | 2005-05-06 | 2009-07-21 | Hitachi, Ltd. | Method, system, and display for elevator allocation using multi-dimensional coordinates |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Erdem et al. | Electrochemical genomagnetic assay for the detection of hepatitis B virus DNA in polymerase chain reaction amplicons by using disposable sensor technology | |
| Mikkelsen | Electrochecmical biosensors for DNA sequence detection | |
| Paleček et al. | Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors | |
| Paleček et al. | DNA hybridization at microbeads with cathodic stripping voltammetric detection | |
| Zhai et al. | DNA based biosensors | |
| US8247197B2 (en) | Method of detecting target molecule by using aptamer | |
| JP3086255B2 (en) | Denaturation method by electrochemical treatment of nucleic acid-containing solution, and amplification method, replication method, detection method and kit using such denaturation method | |
| Kim et al. | Fabrication of MERS-nanovesicle biosensor composed of multi-functional DNA aptamer/graphene-MoS2 nanocomposite based on electrochemical and surface-enhanced Raman spectroscopy | |
| US8465926B2 (en) | Method and system for real time quantification and monitoring of nucleic acid amplification using electroconductive or electrochemically active labels | |
| JP2007523627A (en) | Methods for amplifying and sequencing nucleic acids | |
| JP2002536981A (en) | Method for measuring the presence of a nucleic acid target sequence and its application | |
| Zatsepin et al. | Ferrocene-containing nucleic acids. Synthesis and electrochemical properties | |
| Song et al. | A sensitive quartz crystal microbalance assay of adenosine triphosphate via DNAzyme-activated and aptamer-based target-triggering circular amplification | |
| JP3591653B2 (en) | Methods for processing nucleic acids | |
| Song et al. | A novel assay strategy based on isothermal amplification and cascade signal amplified electrochemical DNA sensor for sensitive detection of Helicobacter pylori | |
| JPWO2006095550A1 (en) | PCR primer, PCR method and PCR amplification product using the same, device and DNA-protein complex using PCR amplification product | |
| Palchetti et al. | Biosensor technology: a brief history | |
| Zari et al. | Label-free DNA biosensor for electrochemical detection of short DNA sequences related to human papilloma virus | |
| Mannelli et al. | Bulk acoustic wave affinity biosensor for genetically modified organisms detection | |
| JPH0772059A (en) | Method for detecting biochemical material and biochemical-material detecting sensor used in the method | |
| JP3648258B2 (en) | Nucleic acid chain detection method | |
| Xu et al. | Development of chemiluminescent biosensing of nucleic acids based on oligonucleotide-immobilized gold surfaces | |
| JP2005500855A5 (en) | ||
| JP2010524459A (en) | Nucleic acid chip for generating binding profile of unknown biomolecule and single-stranded nucleic acid, method for producing nucleic acid chip, and method for analyzing unknown biomolecule using nucleic acid chip | |
| JP2012501174A (en) | DNA measurement using impedance spectroscopy |