JPH0768265B2 - Solid-phase peptide synthesis - Google Patents
Solid-phase peptide synthesisInfo
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- JPH0768265B2 JPH0768265B2 JP1245374A JP24537489A JPH0768265B2 JP H0768265 B2 JPH0768265 B2 JP H0768265B2 JP 1245374 A JP1245374 A JP 1245374A JP 24537489 A JP24537489 A JP 24537489A JP H0768265 B2 JPH0768265 B2 JP H0768265B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドの固相合成方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for solid phase synthesis of peptides.
本明細書中で使用されている略号はEur.J.Biochem,138,
9−37（1984）に掲載されるごときIUPAC−IUB Joint Co
mmission on Biochemical Nomenclatureの1983年の提唱
（Recommen dation）に従つたものである。尚、本明細
書中では以下の略号にも使用されている： TFA トリフルオル酢酸 DCM ジクロルメタン DMF ジメチルホルムアミド NMP Ｎ−メチルピロリドン DMAc ジメチルアセトアミド アミノ酸及びその残基は、特に規定されていない限り、
Ｌ−立体配置のもの、例えばAla＝Ｌ−アラニン、DAla
＝Ｄ−アラニンである。“（メタ）アクリル酸”という
用語はアクリル酸又はメタクリル酸を表わすのに使用さ
れている。The abbreviations used herein are Eur. J. Biochem, 138,
As published in 9-37 (1984) IUPAC-IUB Joint Co
This is in accordance with the 1983 recommendation (Recommendation) of the mmission on Biochemical Nomenclature. The following abbreviations are also used in the present specification: TFA trifluoroacetic acid DCM dichloromethane DMF dimethylformamide NMP N-methylpyrrolidone DMAc dimethylacetamide Amino acids and residues thereof, unless otherwise specified.
Of L-configuration, eg Ala = L-alanine, DAla
= D-alanine. The term "(meth) acrylic acid" is used to describe acrylic acid or methacrylic acid.
通常の固相ペプチド合成法は下記の操作工程からなる： １−Boc基の脱保護： ２−洗浄： ３−α−位のNH2の中和： ４−洗浄： ５−カツプリング：及び ６−洗浄 脱保護工程と中和工程は樹脂−ペプチド付加物（resin
−peptide）をDCM中のTFAとジイソプロピルエチルアミ
ンの溶液で処理することにより行われる。これと同一の
溶剤は中間の洗浄工程でも使用される。どのようなカツ
プリング剤（対称的無水物、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール等）が使用され
た場合でも、カツプリング反応はDCM中か又はDMF中で行
われる。A conventional solid phase peptide synthesis method comprises the following operating steps: 1-Boc group deprotection: 2-washing: 3-NH 2 -neutralization of NH 2 : 4-washing: 5-coupling: and 6- Washing Deprotection and neutralization steps are
-Peptide) with a solution of TFA and diisopropylethylamine in DCM. The same solvent is also used in the intermediate washing step. Whatever coupling agent is used (symmetrical anhydride, dicyclohexylcarbodiimide, hydroxybenzotriazole etc.), the coupling reaction is carried out in DCM or in DMF.
従つて、固相ペプチド合成法はTFAのごとき、どちらか
と云えば高価な溶剤及び薬品を多量に使用する：従つ
て、ペプチドの価格は、その合成中に使用されるDCM、N
MP、DMF、DMAc及びTFAの価格により、直接、影響を受け
る。Therefore, the solid phase peptide synthesis method uses large amounts of rather expensive solvents and chemicals such as TFA: thus the price of the peptide depends on the DCM, N
Directly affected by the prices of MP, DMF, DMAc and TFA.
従つて、ペプチドの製造価格を低下させるためには、よ
り安価な溶剤と薬品を見出すことは特に興味のあること
であろう。Therefore, it would be of particular interest to find cheaper solvents and drugs in order to reduce the manufacturing cost of peptides.
本出願人の欧州特許第0,079842号明細書には、下記の３
種の単量体の共重合体、すなわち、 （ｉ） 共重合体のマトリツクスを提供するかつ １−（メタ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン １−（メタ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン N,N−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及び N,N−ジエチル−（メタ）アクリルアミド の１つである第１の単量体： （ii） 共重合体を架橋させるかつ N,N′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び N,N′−ジ（メタ）アクリロイル−1,2−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び （iii） 共重合体を活性化するかつ下記の酸： ２−（メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酪酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−リシン及び Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン又は これらの酸の１つのメチルエステル： の１つである第３の単量体： の共重合体であるポリアクリル酸系樹脂が記載されてい
る。The applicant's European Patent No. 0079842 describes the following 3
A copolymer of certain monomers, i.e. (i) providing the matrix of the copolymer and 1- (meth) acryloylpyrrolidone 1- (meth) acryloylpiperidine 1- (meth) acryloylpa-hydroazepine 1- (Meth) acryloyl-4-methylpiperazine 4- (meth) acryloylmorpholine N, N-dimethyl- (meth) acrylamide and N, N-diethyl- (meth) acrylamide first monomer: ( ii) A second monomer that crosslinks the copolymer and is one of N, N'-di (meth) acryloyldiaminomethane and N, N'-di (meth) acryloyl-1,2-diaminoethane. And (iii) an acid that activates the copolymer and is: 2- (meth) acrylamide acetic acid 3- (meth) acrylamide propionic acid 4- (meth) acrylamide Butyric acid 6- (meth) acrylamidohexanoic acid N- (meth) acryloyl-L-alanine N- (meth) acryloyl-L-valine N- (meth) acryloyl-L-leucine N- (meth) acryloyl-L-phenyl Alanine N- (meth) acryloyl-L-tyrosine N- (meth) acryloyl-L-methionine N- (meth) acryloyl-L-lysine and N- (meth) acryloyl-L-proline or one methyl of these acids A third acrylic monomer, which is one of the following: a polyacrylic acid-based resin that is a copolymer of:
これらの共重合体は第３の単量体から誘導された遊離の
カルボキシ基又はメトキシカルボニル基を有する。本出
願人の欧州特許第81408号明細書には更に、これらの基
がエチレンジアミンでアミノ化（amidify）されている
ポリアクリル酸系樹脂が記載されている。上記欧州特許
明細書には上記ポリアクリル酸系樹脂を固相ペプチド合
成に使用することも記載されているが、この場合、前記
したごとき通常ポリスチレン樹脂と併用される高価な溶
剤と組合せて使用されているに過ぎない。These copolymers have free carboxy or methoxycarbonyl groups derived from the third monomer. Applicant's EP 81408 further describes polyacrylic resins in which these groups are amidified with ethylenediamine. The above-mentioned European patent specification also describes the use of the polyacrylic acid-based resin in solid phase peptide synthesis, but in this case, it is used in combination with an expensive solvent which is usually used in combination with the polystyrene resin as described above. It's just that.
本発明によれば、第１のアミノ酸残基をポリアクリル酸
系樹脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残
基をカツプリングさせて所望のペプチドを形成させつい
でかく形成されたペプチドを前記樹脂から脱離させるこ
とからなるペプチドの固相合成法において、カツプリン
グ工程 （coupling protocal）中に、前記アクリル酸系樹脂を
水及び／又は水性溶液で洗浄する工程を包含させたこと
を特徴とするペプチドの固相合成法が提供される。According to the present invention, a first amino acid residue is bound to a polyacrylic acid-based resin, and one or more other amino acid residues are coupled to form a desired peptide, and then the peptide thus formed is In the solid-phase synthesis method of a peptide, which comprises desorbing from the resin, a step of washing the acrylic acid resin with water and / or an aqueous solution is included in a coupling step (coupling protocal). A solid-phase synthesis method of the peptide is provided.
本発明の方法は、ポリスチレン樹脂と異り、ポリアクリ
ル酸樹脂の有する親水性を利用している。本発明の方法
で使用するためのポリアクリル酸系樹脂は前記欧州特許
第0079842号及び同第0081408号明細書に記載されている
ものであることが好ましい。Unlike the polystyrene resin, the method of the present invention utilizes the hydrophilic property of the polyacrylic acid resin. The polyacrylic acid-based resin used in the method of the present invention is preferably the one described in the above-mentioned European Patent Nos. 0079842 and 0081408.
第１のアミノ酸残基はグリコールアミド部分を介してマ
トリツクス上に固定し得る（B.Calas等、Tetrahedron,1
985,41 5331 参照）。The first amino acid residue may be immobilized on the matrix via the glycolamide moiety (B. Calas et al., Tetrahedron, 1
985, 41 5331).
（Ｘ＝Br,Cl又はOH）のごとき他の不安定な（Iabile）
バインダーを使用する以前の試みは満足すべきものでは
なかつた。 Other unstable (Iabile) such as (X = Br, Cl or OH)
Previous attempts to use binders have been unsatisfactory.
ついで樹脂を水で洗浄し得る。形成させるべきペプチド
配列の次のアミノ酸はつぎの工程に従つて付加し得る
（保護基がBocの場合に適用可能）： １−洗浄工程：蒸留水−２〜４回、各々２分間： ２−脱保護工程：水柱のHCl（6N）を使用−１回目２分
間及び２回目30分間： ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ４−中和工程:1当量硼酸塩緩衝液12.5mM,pH＝8.5−9.0
を使用、１回目、１〜２分間及び２回目１〜２分間： ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間 ６−洗浄工程:DMF−２回、各々１〜２分間： ７−カツプリング工程：対称的無水物を使用（２当量:D
MF中で２回）： ８−洗浄工程:DMF又はNMP−２回、各々２分間：及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間。The resin can then be washed with water. The amino acid next to the peptide sequence to be formed can be added according to the following steps (applicable when the protecting group is Boc): 1-wash step: distilled water-2 to 4 times, 2 minutes each: 2-desorption Protective Step: Using HCl (6N) in Water Column-First 2 minutes and second 30 minutes: 3-Washing step: Distilled water-4 to 6 times, 2 minutes each: 4-Neutralization step: 1 equivalent borate buffer Liquid 12.5mM, pH = 8.5-9.0
1st time, 1-2 minutes and 2nd 1-2 minutes: 5-washing step: distilled water-4-6 times, 1-2 minutes each 6-washing step: DMF-2 times, 1-2 times each Min: 7-Coupling step: using symmetrical anhydride (2 eq: D
2 times in MF): 8-washing step: DMF or NMP-2 times, 2 minutes each: and 9-washing step: distilled water-4 times, 2 minutes each.
また、保護基がFmocである場合には、延長工程（elonga
tion protocol）はつぎのごときものであり得る： １−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
を使用： ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間：
蒸留水、４〜６回、各々、２分間： ４−洗浄工程（必要に応じて実施）:DMF−１回、２分
間： ５−カツプリング工程：対称的無水物を使用（３回、DM
F中で過剰に）：及び ６−洗浄工程:DMF−２回、各々、２分間：蒸留水−６
回、各々、２分間。Also, when the protecting group is Fmoc, the extension step (elonga
tion protocol) may be as follows: 1-washing step: distilled water-4 to 6 times, 2 minutes each: 2-deprotection step: using piperidine or diethylamine in water: 3-washing step: isopropanol, 2 2 minutes each:
Distilled water, 4-6 times, 2 minutes each: 4-washing step (performed as required): DMF-1 time, 2 minutes: 5-coupling step: using symmetrical anhydride (3 times DM
Excess in F): and 6-wash step: DMF-2 times, 2 minutes each: distilled water-6
2 minutes each time.
合成が完了したとき、得られたグリコールアミド結合を
下記の処理： −イソプロパノール中でのNaOHによる処理： −トリフルオルエタノール、メタノール、エタノール又
はイソプロパノール中でのNH3による処理： −DMF中でのN2H4による処理： −トリエチルアミン中でのCH3OHによる処理： の一つにより、選択的破断（breaking）を行うことによ
り、ペプチドをマトリツクスから分離する。When synthesis is complete, the resulting glycol amide bond to the following process: - treatment with NaOH in isopropanol: - trifluoroethanol, methanol, treatment with NH 3 in ethanol or isopropanol: N in a -DMF treatment with 2 H 4: - treatment with of CH 3 OH in triethylamine: by one, by selective breaking (breaking), to separate the peptide from the matrix.
この方法を使用することにより、ドルマンの参照ペプチ
ド（reference peptide）（ロイシン、アラニン、グリ
シン、バリン）とLHRH同族体を約50％の収率で得ること
ができる。Using this method, the Dolman reference peptide (leucine, alanine, glycine, valine) and the LHRH homologue can be obtained in about 50% yield.
本発明の実施例を以下に示す。Examples of the present invention are shown below.
実施例１ DTrP6−LHRH:pyro−Glu−His−TrP−Ser−Tyr−DTrP−L
eu−Arg−Pro−Glyの合成 欧州特許第0079842号明細書の実施例19に記載の方法に
従つて１−アクリロイルピロリドン、N,N′−ジアクリ
ロイル−1,2−ジアミノエタン及びメチル ２−アクリ
ルアミドアセテートを共重合させることにより調製した
ポリアクリル酸樹脂5g（0.55ミリモルNH2/g）を下記の
ごとく処理した： 1.DCMで洗浄（４回：各々、２分間） 2.DCM中で５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（各
々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間） 5.0mlのDCM中の無水ブロム酢酸4.29g（0.0165モル）を
上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過に
より除去しついで臭素化支持体（brominated support）
（樹脂）を下記とごとく洗浄した： 1.DCM（４回：各々、２分間） 2.DMF（４回：各々、２分間） Mery等の方法（Int.J,Protein Peptide Res.1988,31,41
2参照）に従つて調製したBocGlyOHのセシウム塩（4.22
g,0.0137モル）をDMF（75ml）中に溶解し、この溶液を
樹脂に添加した。混合物を２日間、周囲温度で振盪し
た。この時点でDMCを流出させ、重合体を下記の溶剤： 1.DMF（10回、各々２分間） 2.メタノール（４回、各々２分間） 3.DCM（４回、各々２分間） 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）で洗浄し
た。Example 1 DTrP 6 -LHRH: pyro-Glu -His-TrP-Ser-Tyr-DTrP-L
Synthesis of eu-Arg-Pro-Gly 1-acryloylpyrrolidone, N, N′-diacryloyl-1,2-diaminoethane and methyl 2-according to the method described in Example 19 of EP 0079842. 5 g of polyacrylic acid resin (0.55 mmol NH 2 / g) prepared by copolymerizing acrylamide acetate was treated as follows: 1. Wash with DCM (4 times: 2 minutes each) 2. 5 in DCM Neutralized with% diisopropylethylamine (2 min each), 3. Washed with DCM (4 times, 2 min each) 4.29 g (0.0165 mol) of bromoacetic anhydride in 5.0 ml of DCM was added to the above resin. After shaking for 45 minutes, the DCM solution was removed by filtration and then a brominated support.
The (resin) was washed as follows: 1.DCM (4 times: 2 minutes each) DMF (4 times: 2 minutes each) Mery et al. (Int. J, Protein Peptide Res. 1988, 31) , 41
2) BocGlyOH cesium salt (4.22
g, 0.0137 mol) was dissolved in DMF (75 ml) and this solution was added to the resin. The mixture was shaken for 2 days at ambient temperature. At this point, DMC was allowed to flow out, and the polymer was charged with the following solvents: 1.DMF (10 times, 2 minutes each) 2. Methanol (4 times, 2 minutes each) 3.DCM (4 times, 2 minutes each) 4. Wash with diethyl ether (4 times, 2 minutes each).
樹脂をKOHペレットの存在下、高度の真空下で12時間乾
燥させた。混合したGlyの量は、排気しかつ密封したチ
ユーブ中でかつ110℃で24時間、6NHClを使用して加水分
解した後にアミノ酸分析により測定して0.483ミリモル/
gであつた。The resin was dried under high vacuum in the presence of KOH pellets for 12 hours. The amount of Gly mixed was 0.483 mmol / measured by amino acid analysis after hydrolysis using 6N HCl in an evacuated and sealed tube and at 110 ° C. for 24 hours.
It was g.
BocGly−樹脂付加物（4.47g）を水で洗浄し（４回、各
々２分間）ついでBoc基を水中の6NHClを使用して脱離さ
せた（２回、１回目２分間、２回目30分間）。HClを
過により除去しついで樹脂を水で洗浄した（６回、各
々、２分間）。The BocGly-resin adduct (4.47 g) was washed with water (4 times, 2 minutes each) and then the Boc group was eliminated using 6N HCl in water (2 times, 1 minute 2 minutes, 2nd 30 minutes). ). The HCl was removed by excess and then the resin was washed with water (6 times, 2 minutes each).
硼酸塩緩衝液（12.5ミリモル、pH9）を使用して中和を
行つた：この操作では樹脂を50mlの緩衝液で２回処理し
た（各々、１分間）。水で洗浄し（６回、各々２分
間）、更にDMFで洗浄した後（２回、各々、２分間）、D
MF（50ml）中のBocProOHの対称的無水物（symmetrical
anhydride）を樹脂に添加した。Neutralization was performed using borate buffer (12.5 mmol, pH 9): In this procedure the resin was treated twice with 50 ml of buffer (1 min each). After washing with water (6 times, 2 minutes each) and then with DMF (2 times, 2 minutes each), D
Symmetrical anhydride of BocProOH in MF (50 ml)
anhydride) was added to the resin.
対称物無水物の溶液は以下の方法で調製した:BocProOH
（3.55g,0.0165モル）40mlのDMFに溶解し、溶液を０℃
に冷却しついで10mlのDCM中のジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（1.69g,8.25ミリモル）を添加した。０℃で30
分間撹拌しついで過した後、溶液を加熱することなし
に高度の真空下で蒸発させ、残渣をDMF中に溶解しつい
で樹脂を添加した。混合物を30分間振盪した：この時点
でのKaiser等による定性的ニンヒドリン試験（Anal.Bio
chem.1970,34,575）の結果は負であり、カツプリング収
率は99.6％以上であることを示した。DMFを除去した
後、支持体をDMFで２回（各々、２回）及び水（４回、
各々２分間）で洗浄した。A solution of symmetrical anhydride was prepared by the following method: BocProOH
(3.55g, 0.0165mol) Dissolve in 40ml of DMF and put the solution at 0 ° C.
After cooling to 10 mL of dicyclohexylcarbodiimide (1.69 g, 8.25 mmol) in DCM was added. 30 at 0 ° C
After stirring for 1 min and passing, the solution was evaporated under high vacuum without heating, the residue dissolved in DMF and the resin added. The mixture was shaken for 30 minutes: at this point a qualitative ninhydrin test by Kaiser et al. (Anal.Bio
Chem. 1970, 34 , 575) was negative, indicating that the coupling yield was over 99.6%. After removing DMF, the support was washed with DMF twice (2 times each) and water (4 times,
For 2 minutes each).
この操作工程をDTrp6−LHRH配列の他のアミノ酸を導入
するのに使用した。対称的無水物はつぎのものを使用し
て調製した:BocArg（Mts）OH（7.52g,0.0165モル）,Boc
LeuOH（4.11g,0.0165モル）,BocDTrpOH（5.02g,0.0165
モル）,BocTyr（2,6ジクロルベンジル）OH又はBocTyr
（2,6DCB）OH（7.26g,0.0165モル）,BocSer（Bzl）OH
（4.86g,0.0165モル）,BocTrpOH（5.02g,0.0165モル）,
BocHis（ジクロルフエニル）OH又はBocHis（Dnp）OH
（6.94g,0.0165モル）,pyro−GluOH（2.13g,0.0165モ
ル）。Using this operation step to introduce other amino acids DTrp 6 -LHRH sequence. The symmetrical anhydride was prepared using the following: BocArg (Mts) OH (7.52g, 0.0165mol), Boc
LeuOH (4.11g, 0.0165mol), BocDTrpOH (5.02g, 0.0165mol)
Mol), BocTyr (2,6 dichlorobenzyl) OH or BocTyr
(2,6DCB) OH (7.26g, 0.0165mol), BocSer (Bzl) OH
(4.86g, 0.0165mol), BocTrpOH (5.02g, 0.0165mol),
BocHis (dichlorophenyl) OH or BocHis (Dnp) OH
(6.94 g, 0.0165 mol), pyro-GluOH (2.13 g, 0.0165 mol).
pyro−GluOHの導入後、樹脂をメタノール（４回、各
々、２分間）及びジエチルエーテル（４回、各々、２分
間）で洗浄しついで高い真空下、周囲温度で48時間乾燥
した。After the introduction of pyro-GluOH, the resin was washed with methanol (4 times, 2 minutes each) and diethyl ether (4 times, 2 minutes each) and then dried under high vacuum at ambient temperature for 48 hours.
ついでペプチド−樹脂付加物をDMF（50ml）中のチオフ
エノール（10ml）で処理して、ヒスチジン側鎖上のジニ
トロフエニル基を除去した。The peptide-resin adduct was then treated with thiophenol (10 ml) in DMF (50 ml) to remove the dinitrophenyl group on the histidine side chain.
45分間振盪後、チオフエノール溶液を流出させついで樹
脂をDMF（４回、各々、２分間）、DCM（４回、各々２分
間）ついでジエチルエーテル（４回、２分間）で洗浄し
た。樹脂を高度を真空下で12時間乾燥した。ついで樹脂
を０℃で50mlのつぎの溶液の各々で２回（各々30分間）
処理した：トリフルオルメタンスルホン酸（3.6ml）、
アニソール（4ml）、チオアニソール（4ml）、メタクレ
ゾール（4ml）及びトルフルオル酢酸（40ml）。脱保護
の終了後、樹脂をDCM（２回、各々、２分間）、DCM/DMF
（50/50）（２回、各々、２分間）、DCM中の５％ジイソ
プロピルエチレンアミン（２回、各々、１分間）、DMF
（３回、各々、２分間）、イソプロパノール／水（70/3
0）（３回、各々２分間）で洗浄した。ついでペプチド
−樹脂付加物をNH3を飽和させたトリフルオルエタノー
ル溶液（250ml）に懸濁させた。After shaking for 45 minutes, the thiophenol solution was drained and the resin washed with DMF (4 times, 2 minutes each), DCM (4 times, 2 minutes each) and then diethyl ether (4 times, 2 minutes). The resin was dried under vacuum for 12 hours. The resin is then twice at 0 ° C with 50 ml of each of the following solutions (30 minutes each)
Treated: trifluoromethanesulfonic acid (3.6 ml),
Anisole (4 ml), thioanisole (4 ml), metacresol (4 ml) and tolfluoroacetic acid (40 ml). After deprotection, the resin was DCM (2 times, 2 minutes each), DCM / DMF
(50/50) (2 times, 2 minutes each), 5% diisopropylethyleneamine in DCM (2 times, 1 minute each), DMF
(3 times, 2 minutes each), isopropanol / water (70/3
0) (3 times, 2 minutes each). Then peptide - it was suspended in the resin adduct trifluoride saturated with NH 3 Le ethanol solution (250 ml).
混合物を周囲温度で15時間振盪し、脱保護されたDTrp6
−LHRHを含有するトルフルオルエタノール溶液を捕集し
ついで支持体を水（４回、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（６回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、pHをIN塩酸でpHを約４にした：
ついで液を加熱することなしに真空下で濃縮した。残
渣をNaClの直線状勾配（10mM AcONa pH5.0〜10mM AcNa,
0.15M NaCl,pH5.0）を有するカルボキシメチルセルロー
スのカラム（Wathman CM 52,10×2cm）上で分別した。
適当なフラクシヨンを捕集し、凍結乾燥しついで10M HC
l中のSephadex G 10のカラム（100×2.5cm）上でのゲル
過により脱塩した。ついでペプチドフラクシヨンをLi
chrosorb RP 18（10μｍ）のカラム（270×20mm）上で
のHPLCにかけ、かつ水中の0.01％トリフルオル酢酸（TF
A）及びアセトニトリルを溶離剤として使用して精製し
た。The mixture was shaken at ambient temperature for 15 hours and deprotected DTrp 6
-Tolufluoroethanol solution containing LHRH was collected, and the support was placed on water (4 times, 2 minutes), methanol (4
Wash twice with 2 minutes each) and water (6 times with 2 minutes each). The liquor was collected and brought to a pH of about 4 with IN hydrochloric acid:
The liquid was then concentrated under vacuum without heating. The residue was treated with a linear gradient of NaCl (10 mM AcONa pH 5.0-10 mM AcNa,
Fractionation was performed on a carboxymethylcellulose column (Wathman CM 52, 10 x 2 cm) with 0.15 M NaCl, pH 5.0).
Collect the appropriate fractions, freeze-dry and then 10M HC
Desalted by gel filtration on a column (100 x 2.5 cm) of Sephadex G10 in l. Next, the peptide fraction was added to Li.
Chrosorb RP 18 (10 μm) on a column (270 x 20 mm) by HPLC and 0.01% trifluoroacetic acid in water (TF
Purified using A) and acetonitrile as eluents.
収率:51％（支持体の当初のアミノ基に基づく収率）。Yield: 51% (yield based on the original amino groups of the support).
アミノ酸分析:Glu 0.99（１）,Leu 1.0（１）,His 1.0
（１）,TrP 1.89（２）,Ser 0.96（１）,Tyr 0.97
（１）,PrO 0.99（１）,Gly 1.02（１）。Amino acid analysis: Glu 0.99 (1), Leu 1.0 (1), His 1.0
(1), TrP 1.89 (2), Ser 0.96 (1), Tyr 0.97
(1), PrO 0.99 (1), Gly 1.02 (1).
酸性条件下で不安定な幾つかのアミノ酸については、分
析値は該アミノ酸の分解のため、予期した値より低いも
のであり得る。For some amino acids that are unstable under acidic conditions, the analytical value may be lower than expected due to the degradation of the amino acid.
上記と同一の方法を使用して下記のペプチドを調製し
た： −ドルマン（Dorman）ペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.96,Ala＝0.94,Val＝1.05,Leu＝1.04 −ラミニン（Laminine）:Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 収率＝35.6％ Ser＝0.75,Gly＝1.03,Ile＝0.99,Tyr＝1,Arg＝0.99。The following peptides were prepared using the same method as above: -Dorman peptide: Leu Ala Gly ValOH Yield = 46.6% Gly = 0.96, Ala = 0.94, Val = 1.05, Leu = 1.04-Laminin ( Laminine): Tyr Ile Gly Ser ArgNH 2 yield = 35.6% Ser = 0.75, Gly = 1.03, Ile = 0.99, Tyr = 1, Arg = 0.99.
−“ポンビー”（“Pombee"）酵母の細胞周期からのCDC
28キナーゼ蛋白 収率＝44.1％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝1,Gly＝1.08,Ala＝1,Leu＝1.05×2,Try＝0.99,Arg
＝0.99,Lys＝1,pro＝１。-"Pombee" CDC from the cell cycle of yeast
28 Kinase protein yield = 44.1% (crude peptide) Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp = 1, Gly = 1.08, Ala = 1, Leu = 1.05 × 2, Try = 0.99, Arg
= 0.99, Lys = 1, pro = 1.
−チロシン ホスフアターゼ 収率＝58.6％（粗ペプチド） Crs Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp＝0.95×3,Ser＝0.58×3,Glu＝0.67, Ile＝1.1,Leu＝1.1。-Tyrosine phosphatase yield = 58.6% (crude peptide) Crs Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp = 0.95x3, Ser = 0.58x3, Glu = 0.67, Ile = 1.1, Leu = 1.1.
−オンコゲン（Oncogene:Phe Arg Gly Thr Leu Arg 収率＝53.4％ Phe＝0.97,Arg＝２×1.1,Gly＝1.02, Thr＝0.99,Leu＝１。Oncogene (Phe Arg Gly Thr Leu Arg Yield = 53.4% Phe = 0.97, Arg = 2 × 1.1, Gly = 1.02, Thr = 0.99, Leu = 1.
実施例２ Leu−Ala−Gly−Valの合成。Example 2 Synthesis of Leu-Ala-Gly-Val.
実施例１で使用したポリアクリル酸樹脂を下記をごとく
処理した： 1.DCMで洗浄（４回、各々、２分間）、 2.DCM中の５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（２
回、各々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間）。The polyacrylic acid resin used in Example 1 was treated as follows: 1. washed with DCM (4 times, 2 minutes each), 2. neutralized with 5% diisopropylethylamine in DCM (2
Wash 2 times each, 2 minutes), 3. Wash with DCM (4 times, 2 minutes each).
10mlのDCM中の無水ブロム酢酸（0.858g,3.3ミリモル）
を上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過
により除去しついで臭素化支持体を下記のごとく洗浄し
た： 1.DCM（４回、各々、２分間） 2.DMF（４回、各々、２分間） Mery等の方法（Int.J.Peptide Protein Res.1988,31,41
2）に従つて調製したFmoc Val OHのセシウム塩（1.29g,
2.75ミリモル）をDMF（15ml）に溶解しついでこの溶液
を樹脂に添加した。懸濁液を周囲温度で３日間振盪し
た。この時点でDMFを流出させついで樹脂を下記の溶剤
で洗浄した： 1.DMF（10回、各々、２分間）、 2.メタノール（４回、各々、２分間）、 3.DCM（４回、各々、２分間）、 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）。Bromoacetic anhydride (0.858 g, 3.3 mmol) in 10 ml DCM
Was added to the above resin. After shaking for 45 minutes, the DCM solution was removed by filtration and the brominated support was washed as follows: 1.DCM (4 times, 2 minutes each) 2.DMF (4 times, 2 minutes each) Mery et al. Method (Int. J. Peptide Protein Res. 1988, 31 , 41
2) cesium salt of Fmoc Val OH (1.29 g,
2.75 mmol) was dissolved in DMF (15 ml) and this solution was added to the resin. The suspension was shaken at ambient temperature for 3 days. At this point the DMF was drained and the resin washed with the following solvents: 1. DMF (10 times, 2 minutes each), 2. Methanol (4 times, 2 minutes each), 3. DCM (4 times, 2 minutes each), 4. Diethyl ether (4 times, 2 minutes each).
樹脂をKOHペレットの存在下、高度の真空下で12時間乾
燥させた。結合したValの量は、排気し、かつ密封した
チユーブ中で6NHCl中で24時間加水分解した後にアミノ
酸分析により測定して0.492ミリモル/gであつた。The resin was dried under high vacuum in the presence of KOH pellets for 12 hours. The amount of Val bound was 0.492 mmol / g as determined by amino acid analysis after evacuation and hydrolysis in 6N HCl for 24 hours in a sealed tube.
Fmoc Val−樹脂付加物（1.1g）を水で洗浄し（４回、各
々、２分間）ついでFmoc基を水中の10％ピペリジン又は
ジエチルアミンを使用して脱離させた。ついで樹脂をイ
ソプロパノール（２回、各々、２分間）及び水（４回、
各々、２分間）で洗浄した。The Fmoc Val-resin adduct (1.1 g) was washed with water (4 times, 2 min each) and then the Fmoc group was eliminated using 10% piperidine in water or diethylamine. The resin is then treated with isopropanol (2 times, 2 minutes each) and water (4 times,
For 2 minutes each).
DMF（15ml）中のFmocGlyOHの対称的無水物を支持体に添
加した。対照的無水物の溶液は下記の方法で調製した： FmocGly OH（0.981g,3.3ミリモル）をDCM（15ml）に溶
解し、溶液を０℃に冷却しついでDCM（10ml）中のジシ
クロヘキシルカルボジイミド（0.339g,1.65ミリモル）
を添加した。濁つた混合物を０℃で20分間撹拌し、ジシ
クロヘキシル尿素の沈澱を過により除去しついで液
を真空下、室温で濃縮した。油状残基をDMF（15ml）中
に溶解しついで得られた溶液を樹脂に添加した。混合物
を室温で45分間振盪した：この時点でKaiser等の定量的
ニンヒドリン試験（Anal Biochem.1970,34,575参照）の
結果は負であつた。DMFを過により除去し、ついで支
持体をDMF（２回、各々、２分間）及び水（６回各々、
２分間）で洗浄した。Symmetrical anhydride of FmocGlyOH in DMF (15 ml) was added to the support. A solution of the control anhydride was prepared by the following method: FmocGly OH (0.981 g, 3.3 mmol) was dissolved in DCM (15 ml), the solution was cooled to 0 ° C. and then dicyclohexylcarbodiimide (0.339 ml) in DCM (10 ml). g, 1.65 mmol)
Was added. The cloudy mixture was stirred for 20 minutes at 0 ° C., the precipitate of dicyclohexylurea was removed by filtration and the solution was concentrated under vacuum at room temperature. The oily residue was dissolved in DMF (15 ml) and the resulting solution was added to the resin. The mixture was shaken for 45 minutes at room temperature: At this point the result of the quantitative ninhydrin test of Kaiser et al. (See Anal Biochem. 1970, 34 , 575) was negative. DMF was removed by filtration, then the support was added to DMF (2 times, 2 minutes each) and water (6 times each,
For 2 minutes).
この操作工程を使用してつぎのアミノ酸:deu及びAlaを
導入した。対称的無水物は1.16g（3.3ミリモル）のFmoc
LeuOHと1.09g（3.3ミリモル）のFmocAlaOHとから調製し
た。反応の完了後、ペプチド−樹脂付加物をイソプロパ
ノール（４回、各々、２分間）、水（４回、各々、２分
間）及びイソプロパノール／水（70/30）（４回、各
々、２分間）で洗浄した。This procedure was used to introduce the following amino acids: deu and Ala. Symmetrical anhydride is 1.16 g (3.3 mmol) Fmoc
Prepared from LeuOH and 1.09 g (3.3 mmol) FmocAlaOH. After completion of the reaction, the peptide-resin adduct was treated with isopropanol (4 times, 2 minutes each), water (4 times, 2 minutes each) and isopropanol / water (70/30) (4 times, 2 minutes each). Washed with.
ついでペプチド−樹脂付加物をイソプロパノール／水
（70/30）中に懸濁させ、1.1mlの1N NaOHを添加した。
混合物を周囲温度で５時間振盪し、Leu−Ala−Gly−Val
を含有するイソプロパノール／水混合溶液を捕集しつい
で支持体を水（４回、各々、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（４回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、1N HClを使用してpHを４とし、
ついで溶液を真空下、室温で濃縮した。残渣をLichroso
rb RP 18（10μｍ）のカラム（250×20mm）上でのHPLC
にかけ、水中の0.1％TFA及びアセトニトリルを溶離剤と
して使用して精製した。The peptide-resin adduct was then suspended in isopropanol / water (70/30) and 1.1 ml 1N NaOH was added.
The mixture was shaken at ambient temperature for 5 hours, Leu-Ala-Gly-Val
The isopropanol / water mixed solution containing the above was collected, and then the support was treated with water (4 times, 2 minutes each), methanol (4
Wash twice with 2 minutes each) and water (4 times with 2 minutes each). Collect the liquid, adjust the pH to 4 using 1N HCl,
The solution was then concentrated under vacuum at room temperature. Lichroso the residue
HPLC on rb RP 18 (10 μm) column (250 x 20 mm)
And purified using 0.1% TFA in water and acetonitrile as eluents.
収率:54％（支持体の当初のアミノ基に基づく収率）。Yield: 54% (yield based on the original amino groups of the support).
アミノ酸分析:Leu 1.02（１）,Ala 0.99（１）,Gly 1.1
（１）,Val 1.1（１）。Amino acid analysis: Leu 1.02 (1), Ala 0.99 (1), Gly 1.1
(1), Val 1.1 (1).
上記の同一の方法を使用して下記のペプチドを合成し
た： −ドルマンペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.93,Ala＝0.91,Val＝1.01,Leu＝１。The following peptides were synthesized using the same method described above: -Dolman peptide: Leu Ala Gly ValOH Yield = 46.6% Gly = 0.93, Ala = 0.91, Val = 1.01, Leu = 1.
−ラミニン:Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 収率＝46.3％ Ser＝0.79,Gly＝1.01,Ile＝0.96,Tyr＝0.89,Arg＝0.9
3。-Laminin: Tyr Ile Gly Ser ArgNH 2 Yield = 46.3% Ser = 0.79, Gly = 1.01, Ile = 0.96, Tyr = 0.89, Arg = 0.9
3.
−“ポンビー”酵母の細胞周期からのCDC280キナーゼ蛋
白 収率＝48.5％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝0.97,Gly＝1.02,Ala＝0.98,Leu＝1.02×2,Tyr＝0.
98,Arg＝0.96,Lys＝1,Pro＝0.97。-CDC280 kinase protein yield from "Pomby" yeast cell cycle = 48.5% (crude peptide) Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp = 0.97, Gly = 1.02, Ala = 0.98, Leu = 1.02 x 2, Tyr = 0.
98, Arg = 0.96, Lys = 1, Pro = 0.97.
−チロシンホスフアターゼ 収率＝61.6％（粗ペプチド） Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp＝0.99×3,Ser＝0.63×3,Glu＝0.73,Ile＝1.03,Leu
＝１。-Tyrosine phosphatase Yield = 61.6% (crude peptide) Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp = 0.99 × 3, Ser = 0.63 × 3, Glu = 0.73, Ile = 1.03, Leu
= 1.
−オンコゲン:Phe Arg Gly Thr Leu Arg 収率＝49.2％ Phe＝1,Arg＝２×1.04,Gly＝1,Thr＝0.96,Leu＝0.98。Oncogen: Phe Arg Gly Thr Leu Arg Yield = 49.2% Phe = 1, Arg = 2 × 1.04, Gly = 1, Thr = 0.96, Leu = 0.98.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 105:00 (72)発明者 ムル・ナハリソア・ハニトラ フランス国．34075・モンペリエ．リユ・ ド・ラ・シエーネー．192．シテ・ヴエル トヴオワ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07K 14/00 8318-4H // C07K 105: 00 (72) Inventor Mur Naharisoa Hanitra France ． 34075-Montpellier. Lieu de la Siene. 192. Cite Vuel Tovowa
Claims (5)
脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残基を
カツプリングさせて所望のペプチドを形成させついでか
く形成されたペプチドを前記樹脂から脱離させることか
らなるペプチドの固相合成法において、カツプリング工
程中に、前記アクリル酸系樹脂を水及び／又は水性溶液
で洗浄する工程を包含させたことを特徴とするペプチド
の固相合成法。1. A first amino acid residue is bound to a polyacrylic acid-based resin, and one or more other amino acid residues are coupled to form a desired peptide, and then the peptide thus formed is described above. In the solid phase synthesis method of a peptide comprising elimination from a resin, the solid phase of the peptide is characterized by including a step of washing the acrylic acid resin with water and / or an aqueous solution in the coupling step. Synthetic method.
体の共重合体、すなわち、 （ｉ） 共重合体のマトリツクスを提供するかつ １−（メタ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン １−（メタ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン N,N−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及びN,N−ジエ
チル−（メタ）アクリルアミド の１つである第１の単量体： （ii） 共重合体を架橋させるかつ N,N′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び N,N′−ジ（メタ）アクリロイル−1,2−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び （iii） 共重合体を活性化するかつ下記の酸： ２−（メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酪酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−リシン及び Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン又は これらの酸の１つのメチルエステル： の１つである第３の単量体： の共重合体である請求項１記載の方法。2. A polyacrylic acid-based resin is a copolymer of the following three types of monomers, that is, (i) provides the matrix of the copolymer and 1- (meth) acryloylpyrrolidone 1- (meth) Acryloylpiperidine 1- (meth) acryloylpa-hydroazepine 1- (meth) acryloyl-4-methylpiperazine 4- (meth) acryloylmorpholine N, N-dimethyl- (meth) acrylamide and N, N-diethyl- (meth) A first monomer that is one of acrylamide: (ii) Crosslinking the copolymer and N, N'-di (meth) acryloyldiaminomethane and N, N'-di (meth) acryloyl-1,2 A second monomer which is one of diaminoethane: and (iii) an acid which activates the copolymer and which is: 2- (meth) acrylamidoacetic acid 3- (meth) acrylic acid Doppropionic acid 4- (meth) acrylamidobutyric acid 6- (meth) acrylamidohexanoic acid N- (meth) acryloyl-L-alanine N- (meth) acryloyl-L-valine N- (meth) acryloyl-L-leucine N- (Meth) acryloyl-L-phenylalanine N- (meth) acryloyl-L-tyrosine N- (meth) acryloyl-L-methionine N- (meth) acryloyl-L-lysine and N- (meth) acryloyl-L- The process according to claim 1, which is a copolymer of proline or a third monomer of one of the methyl esters of these acids :.
によりアミド化されている請求項２記載の共重合体であ
る請求項１記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the polyacrylic acid-based resin is the copolymer according to claim 2, which is amidated with ethylenediamine.
護基はBocでありそしてカツプリング工程は、 １−洗浄工程：蒸留水−２〜４回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のHCl（6N）を使用−１回目２分
間及び２回目30分間： ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ４−中和工程:1当量硼酸塩緩衝液12.5mM.pH＝8.5−9.0
を使用、１回目、１〜２分間及び２回目１〜２分間： ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間： ６−洗浄工程:DMF−２回、各々１〜２分間： ７−カツプリング工程：対称的無水物を使用（２当量:D
MF中で２回）： ８−洗浄工程:DMF又はNMP−２回、各々２分間：及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間： からなる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。4. The N-protecting group used in amino acid coupling is Boc and the coupling steps are: 1-washing step: distilled water-2 to 4 times, 2 minutes each: 2-deprotection step: HCl in water. Use (6N) -First 2 minutes and second 30 minutes: 3-Washing step: distilled water-4 to 6 times, 2 minutes each: 4-Neutralization step: 1 equivalent borate buffer 12.5 mM.pH = 8.5-9.0
First, 1-2 minutes and second 1-2 minutes: 5-washing step: distilled water-4-6 times, 1-2 minutes each: 6-washing step: DMF-2 times, each 1- 2 minutes: 7-Coupling step: using symmetrical anhydride (2 eq: D
(2 times in MF): 8-washing step: DMF or NMP-2 times, each 2 minutes: and 9-washing step: distilled water-4 times, 2 minutes each: The method described.
護基はFmocでありそしてカツプリング工程は、 １−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
を使用： ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間：
蒸留水、４〜６回、各々、２分間： ４−洗浄工程（必要に応じて実施）:DMF−１回、２分
間： ５−カツプリング工程：対称的無水物を使用（３回、DM
F中で過剰に）：及び ６−洗浄工程:DMF−２回、各々、２分間：蒸留水−６
回、各々、２分間： からなる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。5. The N-protecting group used in amino acid coupling is Fmoc and the coupling steps are: 1-washing step: distilled water-4 to 6 times, 2 minutes each: 2-deprotection step: piperidine in water. Or using diethylamine: 3-Washing step: isopropanol, 2 times, 2 minutes each:
Distilled water, 4-6 times, 2 minutes each: 4-washing step (performed as required): DMF-1 time, 2 minutes: 5-coupling step: using symmetrical anhydride (3 times DM
Excess in F): and 6-wash step: DMF-2 times, 2 minutes each: distilled water-6
The method according to any one of claims 1 to 3, comprising: each time, 2 minutes.
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